特開 2018-143142 アンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチド、前記ポリペプチドをコードする遺伝子、前記遺伝子を含有する発現プラスミド、前記発現プラスミドで形質転換された形質転換体及び前記酵素の製造法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2018-143142(P2018-143142A)

(43)【公開日】2018年9月20日

(54)【発明の名称】アンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチド、前記ポリペプチドをコードする遺伝子、前記遺伝子を含有する発現プラスミド、前記発現プラスミドで形質転換された形質転換体及び前記酵素の製造法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20180824BHJP

   C12N 9/48 20060101ALI20180824BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20180824BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20180824BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20180824BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20180824BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12N9/48

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N1/15

   C12N5/10

【審査請求】未請求

【請求項の数】8

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】11

(21)【出願番号】特願2017-39917(P2017-39917)

(22)【出願日】2017年3月2日

(71)【出願人】

【識別番号】501174550

【氏名又は名称】国立研究開発法人国際農林水産業研究センター

(71)【出願人】

【識別番号】591108178

【氏名又は名称】秋田県

(74)【代理人】

【識別番号】100082876

【弁理士】

【氏名又は名称】平山 一幸

(74)【代理人】

【識別番号】100086807

【弁理士】

【氏名又は名称】柿本 恭成

(72)【発明者】

【氏名】韮澤 悟

(72)【発明者】

【氏名】高橋 砂織

【テーマコード（参考）】

4B050

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B050CC03

4B050DD02

4B050FF11E

4B050FF12E

4B050FF13E

4B050LL01

4B065AA15Y

4B065AA26X

4B065AB01

4B065BA01

4B065CA31

4B065CA44

(57)【要約】

【課題】糖鎖のない可溶性アンジオテンシン変換酵素２活性を有する酵素を提供し、さらに原核微生物により大量生産の可能な遺伝子、前記遺伝子を含有する発現プラスミド及び前記発現プラスミドで形質転換された形質転換体を提供する。
【解決手段】原核微生物由来の糖鎖のない可溶性アンジオテンシン変換酵素２活性を有する酵素のアミノ酸配列及びその遺伝子の塩基配列、前記遺伝子を含有する発現プラスミド及び前記発現プラスミドで形質転換された形質転換体が提供される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１記載のアミノ酸配列を有するアンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチド又は、配列番号１記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位を有するアミノ酸配列であって、アンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチド。

【請求項2】

配列番号６、８及び１０から１７記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドのうち、すくなくとも１種類のポリペプチドのＣ末端アミノ酸残基を１残基切断する活性を有することを特徴とする、請求項１記載のアンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチド。

【請求項3】

請求項１記載のアンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。

【請求項4】

配列番号２記載のアンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子又は、配列番号２記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするアンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。

【請求項5】

請求項３又は４に記載の遺伝子を含有する発現プラスミド。

【請求項6】

請求項５記載の発現プラスミドにより形質転換された形質転換体。

【請求項7】

前記形質転換体の宿主が大腸菌である、請求項６記載の形質転換体。

【請求項8】

請求項６又は請求項７記載の形質転換体を培地に培養し、培養物からアンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチドを採取することを特徴とする、アンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチドの製造法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、微生物由来のヒトアンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチド、前記ポリペプチドをコードする遺伝子、前記遺伝子を含有する発現プラスミド、前記発現プラスミドで形質転換された形質転換体及び原核微生物による前記ヒトアンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチドの大量生産に関する。

【背景技術】

【0002】

アンジオテンシン変換酵素２は、ヒトを含む哺乳類の血圧調整機構であるレニン−アンジオテンシン系において重要な酵素の一つである。図３にレニン−アンジオテンシン系の血圧調整機構を示す。

【0003】

レニンは、主に腎臓の傍糸球体細胞で生合成され、様々な刺激で血中に放出され、肝臓で合成された基質タンパクであるアンジオテンシノーゲンに作用してアンジオテンシンＩを遊離する。
アンジオテンシンＩは、主に肺循環中において、アンジオテンシン変換酵素やキマーゼによりアンジオテンシンＩＩに変換される。生じたアンジオテンシンＩＩは、ＡＴ１受容体に作用し、血管収縮、細胞増殖、肥大などを引き起こす。また、アンジオテンシンＩＩは、ＡＴ２受容体にも作用し、血管拡張、増殖抑制などを引き起こす。
一方、アンジオテンシン変換酵素２は、アンジオテンシンＩまたはアンジオテンシンＩＩに作用して、それぞれアンジオテンシン（１−９）またはアンジオテンシン（１−７）を遊離する。また、アンジオテンシン（１−９）はＡＣＥの働きでアンジオテンシン（１−７）に変換される。
なお、図３において、枠線内の二段表記の上段はホルモンの名称、下段はそのアミノ酸配列、二重枠線内は反応を触媒する酵素の名称を示す。ＡＣＥはアンジオテンシン変換酵素、ＡＣＥ２はアンジオテンシン変換酵素２の略である。
アンジオテンシン（１−７）はＭａｓ受容体に作用し、血管拡張、増殖抑制等の作用を引き起こす。これらの作用は血圧降下を惹起するのみではなく、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）発症時における炎症を抑制する効果ももたらす。例えば、呼吸不全（非特許文献１）や心不全のモデルマウス（非特許文献２及び非特許文献３）にアンジオテンシン変換酵素２を投与すると症状が改善することが報告されている。

【0004】

アンジオテンシン変換酵素２は、多様な糖鎖を持つ糖タンパク質であり、疎水性細胞膜貫通領域を持つ膜タンパク質であることから、大量生産は難しく、遺伝子組換え技術を利用して大量に生産できるものが求められていた。遺伝子組換え技術を用いたアンジオテンシン変換酵素２に関する研究として、昆虫由来のアンジオテンシン変換酵素２が知られている（特許文献１）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特表２０１１−５１９２６４

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Imai et. al., Nature 436, 112-116, 2005

【非特許文献2】Zhong et al., Circulation 122, 717-728, 2010

【非特許文献3】Sato et al., J. Clin. Invest. 123, 5203-5211, 2013

【非特許文献4】Takahashi et al., Biomedical Research, Vol. 36, No. 3, p. 219-224, 2015

【非特許文献5】Vickers et al., J. Biol. Chem. 277, 14838-14843, 2002

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

しかしながら、特許文献１に開示されたアンジオテンシン変換酵素２は、糖タンパク質であり、そのため、宿主として真核細胞微生物又は哺乳動物細胞を用いる必要がある。

【0008】

本発明の目的は、糖鎖のない可溶性アンジオテンシン変換酵素２活性を有する酵素を提供し、原核微生物による大量生産の可能な遺伝子、前記遺伝子を含有する発現プラスミド及び前記発現プラスミドにより形質転換された形質転換体を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明は、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するアンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチド又は、配列番号１記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位を有するアミノ酸配列であって、アンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチドを提供する。

【0010】

本発明は、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するアンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチド又は、配列番号１記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位を有するアミノ酸配列であって、アンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を提供する。

【0011】

本発明は、配列番号２記載のアンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子又は、配列番号２記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするアンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を提供する。

【0012】

また本発明は、前記アンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含有する発現プラスミド及び前記発現プラスミドにより形質転換された形質転換体を提供する。

【0013】

さらに本発明は、前記形質転換体を培地に培養し、培養物からアンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチドを採取することを特徴とする、アンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチドの製造法を提供する。

【発明の効果】

【0014】

本発明によって、糖鎖のない可溶性アンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチドが提供され、又、原核微生物による前記ペプチドを大量に生産することが可能な遺伝子、前記遺伝子を含有する発現プラスミド及び前記発現プラスミドにより形質転換された形質転換体が提供される。

【0015】

本発明の糖鎖のない可溶性アンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチは、血圧降下剤や急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）発症時における炎症抑制剤などの医薬として利用することが可能である。また、アンジオテンシン変換酵素２の阻害作用や亢進作用を判定する試薬としても利用することが可能である。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】本発明により精製した組換え原核微生物由来アンジオテンシン変換酵素２のＳＤＳ-ポリアクリルアミド電気泳動を示す図である。

【図2】本発明に係る原核微生物由来アンジオテンシン変換酵素２によるアンジオテンシンＩＩの分解を表す図である。

【図3】レニン−アンジオテンシン系による血圧調節機構を説明する図である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本発明の糖鎖のない可溶性アンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチド（以下、本ポリペプチドという）は、糖鎖修飾が起こらない原核微生物由来のタンパク質で、しかも可溶性タンパク質である。本ポリペプチドは、Paenibacillus sp. B38株（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターにARIF-B38（FERM P-20321）として寄託されている）からゲノムＤＮＡを単離して、アミノ酸配列を配列番号１、遺伝子配列を配列番号２として、特定したものである。

【0018】

本ポリペプチドは、ヒトアンジオテンシン変換酵素２と同様の基質特異性と酵素活性を示しており、血圧降下剤や急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）発症時における炎症抑制剤などの医薬として利用することが可能である。
なお、ヒトアンジオテンシン変換酵素２のアミノ酸配列は、他の哺乳類のアンジオテンシン変換酵素２のアミノ酸配列と非常に類似しており、例えば、ゴリラ（Gorilla gorilla gorilla）とは９９％の類似性があり（以下、カッコ内の数字は類似の割合を示す）、チンパンジー（Pan troglodytes、９９％）、オラウータン（Pongo abelii、９８％）、ヤギ（Capra hircus、８２％）、ブタ（Sus scrofa、８１％）、イヌ（Canis lupus familiaris、８４％）、ヒツジ（Ovis aries、８２％）、アライグマ（Procyon lotor、８４％）、ヤク（Bos mutus、８１％）、シャチ（Orcinus orca、８１％）、ハンドウイルカ（Tursiops truncatus、８１％）、ゴールデンハムスター（Mesocricetus auratus、８４％）、ウシ（Bos taurus、８１％）、ウサギ（Oryctolagus cuniculus、８５％）、ウマ（Equus caballus、８７％）、アルパカ（Vicugna pacos、８３％）、ネコ（Felis catus、８５％）、マウス（Mus musculus、８２％）、ラット（Rattus norvegicus、８２％）と８０％以上の高い類似性を示している。したがって、人以外の哺乳動物においても、血圧降下剤や急性呼吸促迫症候群発症時における炎症抑制剤などの動物医薬として利用することが考えられる。

【0019】

また、本ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１に限定されるわけではなく、アンジオテンシン変換酵素２活性を有する範囲で、１以上のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位となっていても良い。

【0020】

ただし、本ポリペプチドの活性中心アミノ酸残基は、His-Glu-Xaa-Xaa-HisあるいはHis-Gluといった特有なアミノ酸配列中に存在するため、このような配列の箇所のアミノ酸残基の変更は好ましくない。具体的には、Hｉｓ（２６９位）−Ｇｌｕ（２７０位）−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｈｉｓ（２７３位）及びＨｉｓ（２９８位）−Ｇｌｕ（２９９位）のアミノ酸残基を変更することは好ましくない。

【0021】

本ポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号１記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子、又は配列番号１記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位を有するアミノ酸配列であって、アンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子である。
具体的な例として、配列番号２の遺伝子配列がある。しかし、本ポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号２の遺伝子配列に限定されるものではなく、配列番号２記載の塩基配列に相補的な塩基配列と、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子配列であれば良い。
また、配列番号２の遺伝子検索によって得られる配列番号２に該当する遺伝子配列または、合成遺伝子配列であっても良い。
遺伝子検索によって得られる遺伝子配列には、例えば、Paenibacillus durus （ATCC 35681）、Paenibacillus polymyxa （ATCC 15970）、Bacillus coagulans DSM1株（ATCC 7050）などの原核微生物の配列番号２に該当する遺伝子配列を挙げることができる。

【0022】

本ポリペプチドは、配列番号２記載のアンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子又は、配列番号２記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするアンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現用プラスミドに組み込んで発現プラスミドとしたのち、前記発現プラスミドで原核微生物を形質転換し、得られた形質転換体を培地中で培養することにより製造することができる。

【0023】

本ポリペプチドは、原核微生物由来であるため、糖鎖形成を必要とせず、発現用プラスミド及び宿主を原核微生物の形質転換に適したものを用いれば良く、又は、酵母、麹菌、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞などの異種タンパク質発現系を用いても生産することができる。

【0024】

発現用プラスミドは、特に限定されるものではなく、形質転換する宿主を原核微生物とし、原核微生物の発現用プラスミドとして用いられるものであれば良い。宿主を大腸菌とする場合には、例えば、大腸菌発現プラスミドｐＥＴ−３２aを使用することができる。
大腸菌とｐＥＴ−３２aとの組合せ以外に、例えば以下のものを用いることができる。
宿主として大腸菌を用いる場合：発現プラスミドとしてpETシリーズ、pUCシリーズ、M13mpシリーズ、pCAMBIAシリーズ、pKK223、pACYC184、pBR322、pMALシリーズ、pGEXシリーズ、pColdシリーズなど。
宿主として枯草菌（Bacillus subtilis）を用いる場合：発現プラスミドとしてpHTシリーズ、pALシリーズ、pBE-Sなど。
宿主としてブレビバチルス菌（Brevibacillus）を用いる場合：発現プラスミドとしてpBICシリーズ、pNCシリーズ、pNIシリーズ、pNY326、pNCMO2など。

【実施例】

【0025】

（１）原核微生物由来アンジオテンシン変換酵素２（以下、アンジオテンシン変換酵素２をＡＣＥ２と略記する）のスクリーニング
Paenibacillus sp. B38株（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターにARIF-B38（FERM P-20321）として寄託されている）からゲノムＤＮＡを単離した。つぎに、得られたゲノムＤＮＡの塩基配列をシークエンサーにより解析した。ＡＣＥ２はカルボキシペプチダーゼ活性を有していることから、Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）を用いて、解析したゲノムＤＮＡ塩基配列の中からカルボキシペプチダーゼをコードすると推定される領域（推定領域）を検索した。推定領域の塩基配列から設計したプライマー（塩基配列３及び４）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により推定領域のＤＮＡを増幅した。増幅したＤＮＡの塩基配列を配列番号５に示す。
増幅したＤＮＡを大腸菌用発現プラスミドｐＥＴ−３２aのマルチクローニングサイトに挿入し、推定領域の発現プラスミドを構築した。得られた発現プラスミドにより大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３）株を形質転換し、これをＬＢ培地中で培養することにより、推定領域にコードされたタンパク質を発現させた。
ＡＣＥ２活性の測定は非特許文献４に従って行った。すなわち、消光性蛍光基質２−メチルアミノベンゾイル（Ｎｍａ）−ヒスチジン（Ｈｉｓ）−プロリン（Ｐｒｏ）−［Ｎε−（２， ４−ジニトロフェニル）−リシル］［Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）］を用いて、これを分解する活性を有するタンパク質を、大腸菌により発現したタンパク質からスクリーニングした。その結果、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質を発見した。また、このタンパク質をコードする塩基を配列番号２に示す。

【0026】

（２）原核微生物由来ＡＣＥ２の精製
大腸菌用発現プラスミドｐＥＴ−３２aのマルチクローニングサイトに配列番号２に示した原核微生物由来ＡＣＥ２をコードするＤＮＡ全長を組み込み、発現プラスミドを構築した。得られた発現プラスミドにより大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３）株を形質転換し、これをＬＢ培地中で培養することにより、原核微生物由来ＡＣＥ２を発現させた。超音波破砕機により大腸菌を破砕し、遠心分離により菌体破砕液上清を取得した。陰イオン交換クロマトグラフィー、並びにゲルろ過クロマトグラフィーにより、単一酵素を取得した（図１）。図１中、符号１は分子量マーカー、符号２は精製タンパク質を電気泳動したレーンである。
精製タンパク質の分子量は約５７ｋＤａであり、アミノ酸配列から計算した分子量５７,５９７と一致した。また、培養液１Ｌ（リットル）あたり約１００ｍｇの原核微生物由来ＡＣＥ２が得られた。

【0027】

（３）原核微生物由来ＡＣＥ２の酵素活性
精製酵素の基質Nma-His-Pro-Lys(Dnp)に対する動力学定数を非特許文献４に基づき測定した。表１にその結果を示す。なお、動力学定数は、実験を３回繰り返して行って得られた平均値である。本実施例で使用したヒトＡＣＥ２はコスモ・バイオ株式会社から購入した。
動力学定数は、ヒトＡＣＥ２と近似な値を示した。
なお、ヒトＡＣＥ２の動力学定数値は、非特許文献４から引用した値である。

【0028】

【表1】

【0029】

（４）原核微生物由来ＡＣＥ２による各種ペプチドの加水分解実験
原核微生物由来ＡＣＥ２によるアンジオテンシンＩＩの加水分解実験を行ったところ、ヒトＡＣＥ２と同様にアンジオテンシンＩＩからアンジオテンシン（１−７）を生成した。結果を図２に示す。

【0030】

図２において、（Ａ）は、アンジオテンシンＩＩのみ、（Ｂ）は、アンジオテンシン（１−７）のみ、（Ｃ）は、アンジオテンシンＩＩにヒトＡＣＥ２を添加し、３７℃で２時間インキュベーションしたもの、（Ｄ）は、アンジオテンシンＩＩに原核微生物由来ＡＣＥ２を添加し、３７℃で２時間インキュベーションしたものである。
ＨＰＬＣの測定条件は、溶媒ＡからＢへのリニアグラジエント（溶媒Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸、溶媒Ｂ：５０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸）、分析時間２０分、検出波長：２１０ｎｍ、カラム：TSKgel Super-ODS（１０ｃｍ）とした。
また、各種ペプチドの加水分解実験の結果を表２に示す。

【0031】

【表2】

↓（下向き矢印）：切断部位、○：切断される、×：切断されない。
なお、ヒトＡＣＥ２のデータは、非特許文献５から引用した値である。
表２中、Neurotensin 1-8のアミノ酸配列に記載されたpEは、ピログルタミン酸残基を表し、配列表１７では、pEを除くアミノ酸配列のみを記載している。
表２に示すように、原核微生物由来ＡＣＥ２、すなわち、本発明のポリペプチドは、ヒトＡＣＥ２と同じ酵素活性を示すことがわかる。

【0032】

（４）ヒトＡＣＥ２阻害剤による原核微生物由来ＡＣＥ２の阻害実験
原核微生物由来ＡＣＥ２も既知のヒトＡＣＥ２阻害剤であるニコチアナミンによる阻害を受けた（IC₅₀: 原核微生物由来ＡＣＥ２ ７４ｎＭ, ヒトＡＣＥ２ ８４ｎＭ）。

【0033】

本発明は、上記実施の形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載した発明の範囲内で種々の変形が可能であり、それらも本発明の範囲内に含まれることはいうまでもない。

【符号の説明】

【0034】

１：分子量マーカーの電気泳動レーン
２：精製タンパク質の電気泳動レーン

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]