特開 2018-148930 薬理ゲノミクスバイオマーカーを発見するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2018-148930(P2018-148930A)

(43)【公開日】2018年9月27日

(54)【発明の名称】薬理ゲノミクスバイオマーカーを発見するための方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20180831BHJP

   C12Q 1/6809 20180101ALI20180831BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20180831BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20180831BHJP

   G06F 19/20 20110101ALI20180831BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/11 Z

   C12Q1/6809 Z

   C12N15/09 200

   C12Q1/6869 Z

   G06F19/20

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

【全頁数】33

(21)【出願番号】特願2018-121765(P2018-121765)

(22)【出願日】2018年6月27日

(62)【分割の表示】特願2016-151735(P2016-151735)の分割

【原出願日】2012年1月30日

(31)【優先権主張番号】61/437,788

(32)【優先日】2011年1月31日

(33)【優先権主張国】US

(71)【出願人】

【識別番号】513192591

【氏名又は名称】デノボ バイオマーカーズ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ウェン ルオ

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA05

4B063QA13

4B063QA17

4B063QA18

4B063QQ03

4B063QQ08

4B063QQ42

4B063QR32

4B063QR51

4B063QR82

4B063QS10

4B063QS14

4B063QS24

4B063QS34

4B063QS39

(57)【要約】

【課題】最適以下のゲノムＤＮＡ、例えば保存された臨床試料から抽出されたゲノムＤＮＡを利用して薬物応答を予測するための、ＧＷＡＳによる薬理ゲノミクスバイオマーカーの発見の方法を提供する。
【解決手段】本発明は、治療剤に対する様々な個体応答（効能、有害作用および他のエンドポイント）に相関する薬理ゲノミクスバイオマーカーを発見する方法に関する。本発明は、新規な薬理ゲノミクスバイオマーカーを同定するために、保存された臨床試料を利用してゲノムワイドなアソシエーション研究を実施するための手段を提供する。新たに発見されたバイオマーカーは、次いで、薬物応答を予測することを助け、処置によって利益を受ける者のみに対して薬物を適用するか、または有害作用を有し得る者を除外することができる、コンパニオン診断試験に開発され得る。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

図面に記載の発明。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本願は、２０１１年１月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／４３７，７８８号の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体は、すべての図面、および引用された公報および文献も含めて、本明細書中に参考として援用される。

【0002】

技術分野
本発明は、治療剤に対する様々な個体応答（効能、有害作用など）を予測するためのコンパニオン診断試験へと開発され得る薬理ゲノミクスバイオマーカーを発見する方法に関する。

【背景技術】

【0003】

背景
製薬産業界は、何十年間にもわたり、「１つの薬物が万人に適合する」のパラダイムの下で動いてきている。しかし、全ての患者集団において汎用的な効能を提供する薬物はほんの僅かであり、いくつかは、特定の患者群において深刻な有害作用を引き起こしすらする。これらの障害は、研究開発費用の暴騰および厳しいＦＤＡ審査基準に加えて、市場に出回らない多くの新規開発薬物をもたらしている。したがって、薬物についての潜在的応答者を予測できる薬理ゲノミクスバイオマーカーの同定が、他の方法では失敗であった多くの薬物の秘められた価値を明るみに出すための、理想的な解決法となる。

【0004】

差し当たって、ＨａｐＭａｐプロジェクトの完了およびマイクロアレイ技術の急速な進歩により、遺伝的多型のゲノムワイドな解析は、定型業務となってきており、何百ものゲノムワイド関連研究（ＧＷＡＳ）が、成功裏に行われていて、一般的な疾患（例えば、心血管疾患、糖尿病など）に関連する多数の公知および新規の遺伝的変異体の発見をもたらしている。この技術はまた、薬物応答に関連する遺伝的多型を同定するための強力なツールをも提供する。しかし、Ｇｕｅｓｓｏｕｓらは、３００のＧＷＡＳ研究に関して再調査したが、これらのうち１２のみが、薬理ゲノミクス研究である（非特許文献１）。これらの１２の研究のうち、２つのみが、臨床試験で使用されたＧＷＡＳである。明らかに、製薬会社は、学術研究者と比べると、非常に遅いペースでこの新しい技術を受け入れた。最も一般的な原因の１つは、製薬会社は、臨床試験が終わった後にしかこのような研究を実施する必要性を認識しないことであり、多くの場合、この時点では遅すぎる。何故なら、上記試験の間に適切なサンプルが集められていないからである。この筋書きは、この業界が薬理ゲノミクスの概念を広く受け入れ、臨床試験を開始する前にバイオマーカー設計を組み込むことを始めるまで、すぐには変わらないままであろう。

【0005】

支出の増大および技術の進歩にも関わらず、多数の新規開発薬物が、主に、患者集団全体における有意な効能の欠如または不十分な安全プロファイルゆえに、第３相臨床試験に失敗する。しかし、試験に失敗した薬物の多くは、なお、患者集団のサブセットに利益をもたらし得るか、または小数の患者においてしか有害作用を起こさない。「旧来の」候補遺伝子アプローチと比較して、ＧＷＡＳは仮説なしであり、研究している臨床エンドポイントに関与するメカニズムの先行知識を必要としない。アレイ技術の進歩もまた、ヒトゲノム全体を網羅し得る１００万以上のＳＮＰを、１つのアレイ上でジェノタイピングすることを可能にしている。したがって、ＧＷＡＳは、薬物特異的な薬理ゲノミクスバイオマーカーを探索するための理想的な選択肢である。

【0006】

ＧＷＡＳにおいて一般的に使用されるゲノムＤＮＡの供給源は、充分な量の高品質のゲノムＤＮＡをもたらし得るＤＮＡリッチな組織／細胞、例えば、全血である。しかし、製薬会社のほとんどは、彼らの臨床試験に、薬理ゲノミクス研究を組み込んでいない。したがって、通常、ＧＷＡＳ研究のために集められた専用の試料が存在しない。多くの場合、他の目的のために集められたヒト検体、例えば（病理学のための）生検および（薬物動態研究のための）血漿試料が、存在し得る。これらの残余臨床試料は、ゲノムＤＮＡを得るために使用できる可能性がある。少数の報告が、ゲノムＤＮＡが血漿試料から抽出でき、少数のＳＮＰにおいて成功裏にジェノタイピングをもたらしたことを示している（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。しかし、多くの場合不適切に処理および保管されている、保存された臨床試料に由来するゲノムＤＮＡの量と品質は、特にＧＷＡＳにおける使用のためには、最適から程遠い。実際、高密度ＳＮＰアレイにおいて血漿試料から抽出されたゲノムＤＮＡを用いた報告を公表した数少ない報告者の中では、著者らは、これらの試料からのＤＮＡ品質はあまりに「貧しく」、これらは成功裏にＧＷＡＳをもたらさないかもしれないと示唆した（非特許文献６；非特許文献７）。乾燥血液スポット試料（非特許文献８）または患者の血液（非特許文献９）を用いてのみ、ＧＷＡＳは成功裏に実施された。したがって、本発明者らの知る限り、保存された臨床試料由来のゲノムＤＮＡを用いて、成功裏にＧＷＡＳを実施させることを試みた者はかつてない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄ（２００９）１：４６

【非特許文献2】Ｓｊｏｈｏｌｍら、Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ（２００５）１４：２５１

【非特許文献3】Ｌｕら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２００５）３９：５１１

【非特許文献4】Ｐａｒｋら、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ（２００５）５１：１５２０

【非特許文献5】Ｂｅｒｇｅｎら、Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ（２００５）２６：２６２

【非特許文献6】Ｃｒｏｆｔら、Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ（２００８）１０：２４９

【非特許文献7】Ｂｕｃａｓａｓら、ＢＭＣ Ｇｅｎｅｔ（２００９）１０：８５

【非特許文献8】Ｈｏｌｌｅｇａａｒｄら、ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（２００９）１０：２９７〜３０２

【非特許文献9】Ｓｉｎｇｅｒら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ（２０１０）４２：７１１〜７１４

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

発明の要旨
公表されたＧＷＡＳのほとんどは、充分に計画された研究において、専用の試料（例えば、全血）由来の高品質のＤＮＡを用い、一般的な疾患の原因となる遺伝的変異体を発見することに焦点を当てており、この強力な技術の用途は、新規薬物についての臨床試験に組み込まれることは滅多になく、したがって、薬理ゲノミクス研究においては、非常に限られた成功しか収めていない。現在のコンセンサスは、成功裏のＧＷＡＳは、豊富な高品質ゲノムＤＮＡを用いてのみ実施でき、最適以下のゲノムＤＮＡおよび／または全ゲノムの増幅ＤＮＡは、ＧＷＡＳにおいて非常に望み薄であるかまたは捨てられる。本発明は、最適以下のゲノムＤＮＡ、例えば保存された臨床試料から抽出されたゲノムＤＮＡを利用して薬物応答を予測するための、ＧＷＡＳによる薬理ゲノミクスバイオマーカーの発見の方法を記載する。

【0009】

１つの態様では、本発明は、１つまたは複数の薬理ゲノミクスバイオマーカーを同定する方法を提供し、この方法は、ａ）関連の表現型において異なる値を示す少なくとも２人の患者の保存された臨床試料からＤＮＡを単離する工程と、ｂ）単離された上記ＤＮＡを増幅する工程と、ｃ）増幅された上記ＤＮＡの高密度ジェノタイピングデータを得る工程と、ｄ）上記ジェノタイピングデータおよび上記関連の表現型における上記異なる値に基づいてアソシエーション解析を行う工程とを含み、上記薬理ゲノミクスバイオマーカー（複数可）が同定される。

【0010】

いくつかの実施形態では、上記保存された臨床試料は、血漿試料、血清試料、乾燥血液スポット、尿試料、組織試料、腫瘍細胞および口腔スワブからなる群から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、上記保存された臨床試料は、血漿試料であってもよい。いくつかの実施形態では、上記保存された臨床試料は、約２〜１，０００人以上の患者に由来してもよい。

【0011】

いくつかの実施形態では、上記単離されたＤＮＡは、最適以下のゲノムＤＮＡであってもよい。いくつかの実施形態では、上記増幅は、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）であってもよく、得られた上記ＤＮＡは、全ゲノム増幅ＤＮＡ（ｗｇａＤＮＡ）であってもよい。いくつかの実施形態では、上記高密度ジェノタイピングは、全ゲノムジェノタイピングであってよい。いくつかの実施形態では、上記高密度ジェノタイピングは、一塩基多型（ＳＮＰ）によって実施されてもよい。いくつかの実施形態では、約１，０００〜５，０００，０００以上、好ましくは約１，０００，０００のＳＮＰが、上記高密度ジェノタイピングに使用されてもよい。いくつかの実施形態では、上記高密度ジェノタイピングは、アレイベースであってもよい。

【0012】

いくつかの実施形態では、上記ジェノタイピングデータは、ゲノムワイドなジェノタイプコーリングアルゴリズムを使用することによって得られてもよい。いくつかの実施形態では、上記方法はさらに、ｅ）上記ゲノムワイドなジェノタイプコーリングアルゴリズムのコール率カットオフ値を調整する工程を含み得る。いくつかの実施形態では、工程ｄ）および工程ｅ）を複数回繰り返して、試料を含めかつ／または除外し、上記ゲノムワイドなジェノタイプコーリングアルゴリズムを最適化してもよい。いくつかの実施形態では、上記ゲノムワイドなジェノタイプコーリングアルゴリズムの最適な組み入れ基準が同定され得る。いくつかの実施形態では、上記ジェノタイプコールは、高品質ゲノムＤＮＡの全ゲノムジェノタイピングに使用される典型的なコール率カットオフよりも低いコール率カットオフ値を用いて作製され得、ここで、使用される上記コール率カットオフ値は、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％であってもよい。いくつかの実施形態では、上記ジェノタイプコールは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｃｏｎｓｏｌｅ（商標）ソフトウェアを用いて生成され得る。いくつかの実施形態では、上記ジェノタイプコールは、ＢＲＬＭＭアルゴリズムを用いて生成され得る。いくつかの実施形態では、上記ジェノタイプコールは、帰属アルゴリズムを用いて作製され得、ここで、ＨａｐＭａｐが、上記帰属アルゴリズムに使用され得る。

【0013】

いくつかの実施形態では、上記アソシエーション解析は、ＧＷＡＳであってもよい。いくつかの実施形態では、上記アソシエーション解析は、上記関連の表現型との各ＳＮＰの関連ｐ値を計算することによって実施され得る。いくつかの実施形態では、上記計算は、アレル頻度および／またはジェノタイプベースの試験に基づき得る。いくつかの実施形態では、上記関連の表現型は、分類形質、定定量的形質、または他の関連の表現型であってもよい。

【0014】

いくつかの実施形態では、上記方法はさらに、同定された薬理ゲノミクスバイオマーカーを用いて、追加のジェノタイピングデータに基づくアソシエーション解析を実施する工程を含み得る。いくつかの実施形態では、約１〜５００以上の上記同定された薬理ゲノミクスバイオマーカーが、追加のジェノタイピングに使用され得る。いくつかの実施形態では、工程ａ）からのいくつかまたは全ての上記保存された臨床試料および／または追加の臨床試料が、上記追加のジェノタイピングに使用され得る。いくつかの実施形態では、追加のジェノタイピングデータは、検証ジェノタイプコーリングアルゴリズムを使用することによって得ることができる。いくつかの実施形態では、上記方法は、上記検証ジェノタイプコーリングアルゴリズムの上記コール率カットオフ値を調整する工程をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ジェノタイピングおよび上記コール率カットオフの調整を複数回繰り返して、試料を含めかつ／または除外し得る。いくつかの実施形態では、上記検証ジェノタイプコーリングアルゴリズムのための最適な組み入れ基準が同定され得る。いくつかの実施形態では、上記方法は、上記検証ジェノタイプコーリングアルゴリズムを用いて得られた上記追加のジェノタイピングデータを上記ゲノムワイドなジェノタイプコーリングアルゴリズムを用いて得られたジェノタイピングデータと比較する工程をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、工程ｄ）からの上記薬理ゲノミクスバイオマーカーのサブセットが同定され得る。

【0015】

いくつかの実施形態では、上記方法は、以前に行われた臨床試験からの保存された臨床試料の遡及的研究に使用され得る。いくつかの実施形態では、上記方法は、薬理ゲノミクスバイオマーカーのｄｅ ｎｏｖｏ同定に使用され得る。

【0016】

別の態様では、本明細書中で開示される方法によって同定された薬理ゲノミクスバイオマーカーまたは薬理ゲノミクスバイオマーカーの群が本明細書中で提供され、ここで、上記バイオマーカーは、１つまたは複数のＳＮＰであり得る。いくつかの実施形態では、上記薬理ゲノミクスバイオマーカーは、１つまたは複数のさらなる薬理ゲノミクスバイオマーカーを同定するために使用され得る。いくつかの実施形態では、上記薬理ゲノミクスバイオマーカーは、コンパニオン診断試験を開発するために使用され得る。

【0017】

さらなる態様では、本明細書中で開示される方法によって同定される薬理ゲノミクスバイオマーカーを用いたコンパニオン診断試験が、本明細書中で提供される。本明細書中で開示されるコンパニオン診断試験を用いて処置に対する被験体の応答性を予後診断する方法もまた、本明細書中で提供される。さらに、本明細書中で開示される方法によって同定される薬理ゲノミクスバイオマーカーを用いた新規薬物標的を同定する方法も、本明細書中で提供される。本発明の方法は、臨床医にとって、処置についての患者を同定するため、治療の開発の過程の間に患者の選択を補助するため、個々の患者を特定の処置レジメンで処置するときの成功の尤度を予測するため、疾患進行を評価しそしてモニタリングするため、処置効能をモニタリングするため、および個々の患者の予後を決定するために、有用である。これらの実施形態のいずれも、本発明に包含される。

【0018】

さらなる態様では、本明細書中で開示される方法によって同定される薬理ゲノミクスバイオマーカーまたは薬理ゲノミクスバイオマーカーの群を評価するための試薬を含むキットが、本明細書中で提供される。いくつかの実施形態では、上記キットは、薬理ゲノミクスバイオマーカーを使用してコンパニオン診断試験を実施するための指示をさらに含み得る。

【0019】

なお別の態様では、最適以下のゲノムＤＮＡ試料を用いたジェノタイピング方法が、本明細書中で提供され、この方法は、ａ）上記最適以下のゲノムＤＮＡ試料の配列情報を受け取る工程と、ｂ）上記配列情報に基づいて組み入れ基準を最適化する工程と、ｃ）上記配列情報および最適化した上記組み入れ基準に基づいてジェノタイプを計算する工程とを含む。いくつかの実施形態では、上記最適化を複数回繰り返して、試料を含めかつ／または除外することができる。いくつかの実施形態では、最適な組み入れ基準が同定され得る。いくつかの実施形態では、上記ジェノタイピングデータは、ゲノムワイドなジェノタイプコーリングアルゴリズムおよび／または検証ジェノタイプコーリングアルゴリズムを用いることによって得ることができる。いくつかの実施形態では、上記組み入れ基準は、上記ジェノタイプコーリングアルゴリズムのコール率カットオフ値であってもよい。いくつかの実施形態では、上記ジェノタイプコールは、高品質または最適なゲノムＤＮＡの全ゲノムジェノタイピングに使用される典型的なコール率カットオフよりも低いコール率カットオフを使用することによって作製され得、ここで、使用される上記コール率カットオフ値は、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％であってもよい。いくつかの実施形態では、上記ジェノタイピングデータは、複数のジェノタイピングプラットホームを用いることによって得ることができる。いくつかの実施形態では、複数のジェノタイピングプラットホーム由来の上記ジェノタイピングデータは、最適化のために比較され得る。

【0020】

さらに、最適以下のゲノムＤＮＡ試料を用いた上記ジェノタイピング方法を用いてアソシエーション解析を実施する方法も提供され、上記方法は、組み入れ基準を最適化する工程を含む。いくつかの実施形態では、上記アソシエーション解析は、最適化のために複数回繰り返され得る。ａ）上記最適以下のゲノムＤＮＡ試料の配列情報を受け取る工程と、ｂ）上記配列情報に基づいて組み入れ基準を最適化する工程と、ｃ）上記配列情報および最適化した上記組み入れ基準に基づいてジェノタイプを計算する工程とを含む、最適以下のゲノムＤＮＡ試料を用いたジェノタイピング方法についての複数の指示を含むコンピューター読み取り可能媒体もまた、本明細書中で提供される。

【0021】

なお別の態様では、最適以下のゲノムＤＮＡを用いてＧＷＡＳを実施する方法もまた、本明細書中で提供される。いくつかの実施形態では、上記最適以下のゲノムＤＮＡは、保存された試料由来であってもよい。いくつかの実施形態では、上記最適以下のゲノムＤＮＡは、血漿試料由来であってもよい。いくつかの実施形態では、上記最適以下のゲノムＤＮＡは、増幅されていてもよい。いくつかの実施形態では、複数のジェノタイピングプラットホームが、使用され得る。いくつかの実施形態では、同じまたは異なる試料を上記複数のジェノタイピングプラットホームに使用してもよい。いくつかの実施形態では、上記方法は、高品質ゲノムＤＮＡを提供する試料をさらに使用してもよい。
本発明の好ましい実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
１つまたは複数の薬理ゲノミクスバイオマーカーを同定する方法であって、
ａ）関連の表現型において異なる値を示す少なくとも２人の患者の保存された臨床試料からＤＮＡを単離する工程と、
ｂ）該単離されたＤＮＡを増幅する工程と、
ｃ）該増幅されたＤＮＡの高密度ジェノタイピングデータを得る工程と、
ｄ）該ジェノタイピングデータおよび該関連の表現型における該異なる値に基づいてアソシエーション解析を行う工程であって、
ここで、該薬理ゲノミクスバイオマーカー（複数可）が同定される工程とを含む、
方法。
（項目２）
前記保存された臨床試料が、血漿試料、血清試料、乾燥血液スポット、尿試料、組織試料、腫瘍細胞および口腔スワブからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記保存された臨床試料が、血漿試料である、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記単離されたＤＮＡが、最適以下のゲノムＤＮＡである、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５）
前記増幅が、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）であり、得られたＤＮＡが、全ゲノム増幅ＤＮＡ（ｗｇａＤＮＡ）である、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記高密度ジェノタイピングが、全ゲノムジェノタイピングである、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記高密度ジェノタイピングが、一塩基多型（ＳＮＰ）を用いることによる、項目１〜６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
約１，０００〜５，０００，０００以上のＳＮＰが使用される、項目７に記載の方法。
（項目９）
約１，０００，０００のＳＮＰが使用される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記高密度ジェノタイピングが、アレイベース、ビーズベースまたはハイスループット配列決定ベースである、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
前記ジェノタイピングデータが、ゲノムワイドなジェノタイプコーリングアルゴリズムを使用することによって得られる、項目１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
ｅ）前記ゲノムワイドなジェノタイプコーリングアルゴリズムのコール率カットオフ値を調整する工程
をさらに含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
工程ｄ）および工程ｅ）を複数回繰り返して、試料を含めかつ／または除外する、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
最適な組み入れ基準が同定される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記ジェノタイプコールが、高品質ゲノムＤＮＡの全ゲノムジェノタイピングに使用される典型的なコール率カットオフよりも低いコール率カットオフを用いて作製される、項目１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
使用される前記コール率カットオフが、約５０〜９５％である、項目１２に記載の方法。
（項目１７）
使用される前記コール率カットオフが、約８０〜９０％である、項目１３に記載の方法。
（項目１８）
使用される前記コール率カットオフが、約９０％である、項目１４に記載の方法。
（項目１９）
前記ジェノタイプコールが、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｃｏｎｓｏｌｅ（商標）ソフトウェアを用いて生成される、項目１１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
前記ジェノタイプコールが、ＢＲＬＭＭアルゴリズムを用いて生成される、項目１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
（項目２１）
前記ジェノタイプコールが、帰属アルゴリズムを用いて作製される、項目１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
ＨａｐＭａｐが、前記帰属アルゴリズムに使用される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記アソシエーション解析が、ゲノムワイドなアソシエーション研究（ＧＷＡＳ）である、項目１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４）
前記アソシエーション解析が、前記関連の表現型との各ＳＮＰの関連ｐ値を計算することによって実施される、項目１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５）
前記計算が、アレル頻度および／またはジェノタイプベースの試験に基づく、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記関連の表現型が、分類形質、定量的形質、または他の関連の表現型である、項目１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記保存された臨床試料が、約２〜１，０００人以上の患者に由来する、項目１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
前記同定された薬理ゲノミクスバイオマーカーを用いて、追加のジェノタイピングデータに基づくアソシエーション解析を実施する工程をさらに含む、項目１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
約１〜５００以上の前記同定された薬理ゲノミクスバイオマーカーが、前記追加のジェノタイピングに使用される、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
工程ａ）からのいくつかもしくは全ての前記保存された臨床試料および／または追加の臨床試料が、前記追加のジェノタイピングに使用される、項目２８または２９に記載の方法。
（項目３１）
前記追加のジェノタイピングデータが、検証ジェノタイプコーリングアルゴリズムを使用することによって得られる、項目２８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
前記検証ジェノタイプコーリングアルゴリズムの前記コール率カットオフ値を調整する工程をさらに含む、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
ジェノタイピングおよび前記コール率カットオフの調整を複数回繰り返して、試料を含めかつ／または除外する、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
最適な組み入れ基準が同定される、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記検証ジェノタイプコーリングアルゴリズムを用いて得られた前記追加のジェノタイピングデータを前記ゲノムワイドなジェノタイプコーリングアルゴリズムを用いて得られた前記ジェノタイピングデータと比較する工程をさらに含む、項目２８〜３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
工程ｄ）からの前記薬理ゲノミクスバイオマーカーのサブセットが同定される、項目２８〜３５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
項目３６に記載の方法であって、以前に行われた臨床試験からの保存された臨床試料の遡及的研究に使用される、方法。
（項目３８）
薬理ゲノミクスバイオマーカーのｄｅ ｎｏｖｏ同定に使用される、項目３６または３７に記載の方法。
（項目３９）
項目３６〜３８のいずれか１項に記載の方法によって同定される、薬理ゲノミクスバイオマーカー。
（項目４０）
項目３６〜３８のいずれか１項に記載の方法によって同定される、薬理ゲノミクスバイオマーカーの群。
（項目４１）
前記バイオマーカーが、１つまたは複数のＳＮＰである、項目３９または４０に記載の薬理ゲノミクスバイオマーカー。
（項目４２）
１つまたは複数のさらなる薬理ゲノミクスバイオマーカーを同定するために使用される、項目３９〜４１のいずれか１項に記載の薬理ゲノミクスバイオマーカー。
（項目４３）
コンパニオン診断試験を開発するために使用される、項目３９〜４１のいずれか１項に記載の薬理ゲノミクスバイオマーカー。
（項目４４）
項目３９〜４１のいずれか１項に記載の薬理ゲノミクスバイオマーカーを用いるコンパニオン診断試験。
（項目４５）
項目４４に記載のコンパニオン診断試験を用いて処置に対する被験体の応答性を予後診断する方法。
（項目４６）
項目３９〜４１のいずれか１項に記載の薬理ゲノミクスバイオマーカーを用いて新規薬物標的を同定する方法。
（項目４７）
項目３６〜３８のいずれか１項に記載の方法によって同定される薬理ゲノミクスバイオマーカーを評価するための試薬を含むキット。
（項目４８）
前記薬理ゲノミクスバイオマーカーを使用してコンパニオン診断試験を実施するための指示をさらに含む、項目４７に記載のキット。
（項目４９）
前記試薬が、ポリヌクレオチド分子および／またはポリペプチド分子を検出するために使用される、項目４７に記載のキット。
（項目５０）
最適以下のゲノムＤＮＡ試料を用いるジェノタイピング方法であって、
ａ）該最適以下のゲノムＤＮＡ試料の配列情報を受け取る工程と、
ｂ）該配列情報に基づいて組み入れ基準を最適化する工程と、
ｃ）該配列情報および該最適化した組み入れ基準に基づいてジェノタイプを計算する工程と
を含む方法。
（項目５１）
前記最適化を複数回繰り返して、試料を含めかつ／または除外する、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
最適な組み入れ基準が同定される、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記ジェノタイピングデータが、ゲノムワイドなジェノタイプコーリングアルゴリズムおよび／または検証ジェノタイプコーリングアルゴリズムを用いることによって得られる、項目５０〜５２のいずれか１項に記載の方法。
（項目５４）
前記組み入れ基準が、前記ジェノタイプコーリングアルゴリズムのコール率カットオフ値である、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記ジェノタイプコールが、高品質ゲノムＤＮＡの全ゲノムジェノタイピングに使用される典型的なコール率カットオフよりも低いコール率カットオフを用いて作製される、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
使用される前記コール率カットオフが、約５０〜９５％である、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
使用される前記コール率カットオフが、約８０〜９０％である、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
使用される前記コール率カットオフが、約９０％である、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記ジェノタイピングデータが、複数のジェノタイピングプラットホームを用いることによって得られる、項目５０〜５８のいずれか１項に記載の方法。
（項目６０）
複数のジェノタイピングプラットホーム由来の前記ジェノタイピングデータが、前記最適化のために比較される、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
項目５０〜６０のいずれか１項に記載のジェノタイピング方法を用いてアソシエーション解析を実施する方法。
（項目６２）
前記アソシエーション解析が、前記最適化のために複数回繰り返される、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
最適以下のゲノムＤＮＡ試料を用いるジェノタイピング方法のための複数の指示を含むコンピューター読み取り可能媒体であって、以下の工程：
ａ）該最適以下のゲノムＤＮＡ試料の配列情報を受け取る工程と、
ｂ）項目５０〜６２のいずれか１項に記載の方法を用いて、該配列情報に基づいて組み入れ基準を最適化する工程と、
ｃ）該配列情報および該最適化した組み入れ基準に基づいてジェノタイプを計算する工程と
を含む、媒体。
（項目６４）
最適以下のゲノムＤＮＡを用いてＧＷＡＳを実施する方法。
（項目６５）
前記最適以下のゲノムＤＮＡが、保存された試料由来である、項目６４に記載の方法。（項目６６）
前記最適以下のゲノムＤＮＡが、血漿試料由来である、項目６４または６５に記載の方法。
（項目６７）
複数のジェノタイピングプラットホームが使用される、項目６４〜６６のいずれか１項に記載の方法。
（項目６８）
同じ試料を前記複数のジェノタイピングプラットホームに使用する、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
異なる試料を前記複数のジェノタイピングプラットホームに使用する、項目６７に記載の方法。
（項目７０）
高品質ゲノムＤＮＡを提供する試料をさらに含む、項目６４〜６９のいずれか１項に記載の方法。
（項目７１）
項目６１または６２に記載のアソシエーション解析方法を用いる、項目６４〜７０のいずれか１項に記載の方法。
（項目７２）
項目６４〜７１のいずれか１項に記載の方法を用いる、１つまたは複数の薬理ゲノミクスバイオマーカーを同定する方法。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】図１は、ＧＷＡＳを用いた例示的な薬理ゲノミクスバイオマーカー発見方法のフローチャートを示す。ゲノムＤＮＡは、保存された臨床試料から抽出され、ＷＧＡを用いて増幅される。第Ｉ段階、発見相において、症例群由来のＮ１（１から１，０００までまたはそれより多い数）の試料と対照群由来のＭ１（１から１，０００までまたはそれより多い数）の試料とが、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ全ゲノムＳＮＰアレイおよび／またはＩｌｌｕｍｉｎａ全ゲノムＳＮＰアレイを用いてジェノタイピングされる。症例−対照状態（すなわち、応答者対非応答者）に対する各ＳＮＰの関連性が、アレル頻度および／またはジェノタイプベースの試験に基づいて計算される。次に、１〜５００以上の最も有意に関連するＳＮＰが、第ＩＩ段階研究のために選択される。第ＩＩ段階において、第Ｉ段階で使用されたものと同じ試料が、低密度ＳＮＰジェノタイピングプラットホーム（第Ｉ段階で使用されたものと異なる特徴のあるジェノタイピング技術）を用いてジェノタイピングされ、第Ｉ段階で得られた結果が検証される。追加の新しい試料である、症例群由来のＮ２（１から１，０００までまたはそれより多い数）試料および対照群由来のＭ２（１から１，０００までまたはそれより多い数）試料が、この知見を再現するためにジェノタイピングされる。

【図2】図２は、例示的なゲノムワイドな発見段階データ分析のフローチャートを示す。

【図3】図３は、例示的な検証段階データ分析のフローチャートを示す。

【発明を実施するための形態】

【0023】

発明の詳細な説明
本発明は、保存された臨床試料から単離されたゲノムＤＮＡを用いる潜在的に低量であるジェノタイピング結果を、１種を超えるジェノタイピング技術またはプラットホームを適用することによって克服するための新規なアプローチを提供する。

【0024】

Ａ．一般的技術
本発明の実施は、他に示されていない限り、当該分野の技術範囲内の分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を用いる。このような技術は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ． Ｊ． Ｇａｉｔ編、１９８４年）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７年）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７年および定期的な更新物）；「ＰＣＲ： Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４年）などの文献において十分に説明されている。

【0025】

Ｂ．定義
他で定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する当業者に通常理解される意味と同じ意味を有する。本明細書中で引用される全ての特許、出願、公開出願および他の出版物は、その全体が参考によって組み込まれる。この節に示される定義が、本明細書中で参考によって組み込まれる特許、出願、公開出願および他の出版物に示される定義に反するか、または他の点で矛盾する場合、この節に示される定義が、本明細書中で参考として組み込まれる定義より優先される。

【0026】

本明細書中で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、そうでないと示されない限り、複数の言及を含む。例えば、「ａ」ダイマーは、１つまたは複数のダイマーを含む。

【0027】

本明細書中で使用される場合、用語「バイオマーカー」または「マーカー」は、一般に、遺伝子、タンパク質、炭水化物構造または糖脂質を含む分子をいい、哺乳動物組織または細胞または分泌物におけるその発現は、公知の方法（または本明細書中で開示される方法）によって検出され得、そして、処置レジメンに対する哺乳動物細胞のまたは組織の感受性について予測的であるか、またはそれを予測するため（もしくは予測を補助するため）に使用され得、そして、いくつかの実施形態では、処置レジメンに対する個体の応答性を予測するため（もしくは予測を補助するため）に使用され得る。

【0028】

本明細書中で使用される場合、「薬理ゲノミクスバイオマーカー」は、被験体において特定の臨床薬物応答または感受性に相関する目的のバイオマーカーである（例えば、ＭｃＬｅｏｄら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ（１９９９年）３５巻、１６５０〜１６５２頁を参照されたい）。これは、生化学的バイオマーカー、臨床徴候または症状などであってもよい。薬理ゲノミクスマーカーの存在または量は、特定の薬物または薬物のクラスに対する被験体のこの薬物の投与前に予測される応答に関連する。被験体における１つまたは複数の薬理ゲノミクスマーカーの存在または量を評価することにより、その被験体に最も適切であるか、またはより成功度が高いことが予測される薬物治療が選択され得る。例えば、被験体における特定の腫瘍マーカーについてのＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質の存在または量に基づき、上記被験体に存在する可能性がある特定の腫瘍の処置のために最適化される薬物または一連の処置が、選択され得る。同様に、特定の配列変異または多型の存在または非存在は、薬物応答に相関し得る。したがって、薬理ゲノミクスバイオマーカーの使用は、治療の施行を必要とせずに、各被験体のための最も適切な処置の適用を可能とする。

【0029】

用語「試料」は、本明細書中で使用される場合、例えば物理的、生化学的、化学的および／または生理学的特徴に基づいて特徴付けられる、および／または同定される細胞性実体および／または他の分子実体を含む、目的とする被験体から得られるかまたは誘導される組成物をいう。例えば、語句「臨床試料」または「疾患試料」およびその変形は、特徴付けられるべき細胞性の実体および／または分子実体、例えばバイオマーカーを含むことが予測されるかまたは公知である、目的とする被験体から得られた任意の試料をいう。

【0030】

用語「組織または細胞試料」とは、被験体または患者の組織から得られる同様の細胞の採取物をいう。組織または細胞試料の供給源は、新鮮であるか、凍結されたか、および／または保存された器官もしくは組織試料由来の固形組織または生検または吸引物；血液または任意の血液成分；脳脊髄液、羊水、腹水または間質液のような体液；被験体の妊娠または発生の任意の時点からの細胞であってもよい。組織試料はまた、初代または培養された細胞もしくは細胞系であってもよい。必要な場合、組織または細胞試料は、疾患組織／器官から得られる。組織試料は、天然において組織と天然に混ざらない化合物、例えば保存剤、抗凝固剤、緩衝剤、固定剤、栄養剤、抗生物質などを含み得る。

【0031】

「血漿（ｐｌａｓｍａ）」または「血しょう（ｂｌｏｏｄ ｐｌａｓｍａ）」は、本明細書中で使用される場合、細胞外流体（細胞の外側の全ての体液）の血管内流体部分をいう。これはほとんどが水であり、溶解したタンパク質、グルコース、凝固因子、ミネラルイオン、ホルモンおよび二酸化炭素を含む（血漿は、排泄性産物輸送のための主要な媒体である）。血しょうは、抗凝固剤を含む１チューブの新鮮血を、遠心分離機で血球がチューブの底に落ちるまで回転させることによって調製される。次いで、血しょうは、注がれるかまたは引き抜かれる。「血せい（ｂｌｏｏｄ ｓｅｒｕｍ）」は、フィブリノゲンまたは他の凝固因子を含まない血しょうである（すなわち、全血から細胞および凝固因子の両方を引いたもの）。

【0032】

「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書中で相互交換可能に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいい、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらのアナログ、またはＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼによってポリマーに組み込まれ得る任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびそのアナログを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの集合の前または後で付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、例えば、ラベリング構成成分とコンジュゲートすることによって、重合後にさらに修飾されてもよい。他の型の修飾としては、例えば、「キャップ」、１つまたは複数の天然に存在するヌクレオチドのアナログでの置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カバメート（ｃａｂａｍａｔｅ）など）によるものおよび有荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）によるものなど、ペンダント部分を含むもの、例えばタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リジンなど）など、介入物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）によるもの、キレーター（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属など）を含むもの、アルキル化物質（ａｌｋｙｌａｔｏｒ）を含むもの、修飾結合（例えば、アルファアノマー核酸など）によるもの）、ならびに、ポリヌクレオチド（複数可）の非修飾形態が挙げられる。さらに、糖に通常存在しているヒドロキシル基のいずれかが、例えば、ホスホネート基、ホスフェート基によって置き換えられていてもよく、標準的な保護基によって保護されていてもよく、もしくは活性化されてさらなるヌクレオチドへのさらなる結合を作製してもよく、または固体支持体にコンジュゲートされていてもよい。５’および３’末端のＯＨは、リン酸化されていてもよく、または１から２０個までの炭素原子のアミンもしくは有機キャッピング基部分によって置換されていてもよい。他のヒドロキシルはまた、標準的保護基へと誘導体化されてもよい。ポリヌクレオチドはまた、リボース糖またはデオキシリボース糖のアナログ形態をも含み得る。これらのアナログは、当該分野で一般的に公知であり、例えば、２’−Ｏ−メチル−２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−リボースもしくは２’−アジド−リボース、炭素環式糖アナログ、α−アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログおよび脱塩基ヌクレオチドアナログ、例えばメチルリボシドが挙げられる。１以上のホスホジエステル結合が代替の結合基で置き換えられてもよい。これらの代替の結合基としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、“（Ｏ）ＮＲ ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ ２（「ホルムアセタール」）によって置き換えられている実施形態であって、ここで、各ＲまたはＲ’は、独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換のアルキル（１〜２０個のＣ）であって、必要に応じてエーテル（−−Ｏ−−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルディル（ａｒａｌｄｙｌ）を含む、実施形態。ポリヌクレオチド内の全ての結合が同じである必要はない。上の記載は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書中で挙げられる全てのポリヌクレオチドに適用される。

【0033】

「オリゴヌクレオチド」は、本明細書中で使用される場合、一般に、短い、一般的には一本鎖の、一般的には合成のポリヌクレオチドをいい、該ポリヌクレオチドは、一般に、約２００ヌクレオチド長未満であるが、必ずしもそうである必要はない。用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、相互排他的ではない。ポリヌクレオチドについての上の記載は、オリゴヌクレオチドに対して等しくかつ完全に適用可能である。

【0034】

用語「最適以下のゲノムＤＮＡ」は、本明細書中で使用される場合、ＤＮＡ豊富な組織／細胞（例えば、全血）から単離されたゲノムＤＮＡの品質および／または量において劣るゲノムＤＮＡをいう。最適以下のゲノムＤＮＡは、多くの場合不適切に処理および保管された保存された臨床試料、例えば生検または血漿から単離されてもよく、特にＧＷＡＳにおける利用のためには品質および／または量において、最適に程遠い。例えば、最適以下のゲノムＤＮＡの試料は、全ゲノムの完全な有効範囲（ｃｏｖｅｒａｇｅ）を提供しない場合があるか、またはゲノムＤＮＡの短い断片を含む場合がある。いくつかの実施形態では、高密度ジェノタイピングに供される最適以下のゲノムＤＮＡの試料は、約９９％未満、９５％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満またはそれ未満のコール率を有し得る。典型的には、ＧＷＡＳのために有用な最適以下のゲノムＤＮＡは、増幅工程が必要である。

【0035】

「増幅」は、本明細書中で使用される場合、一般に、所望の配列の複数のコピーを生成するプロセスをいう。「複数のコピー」は、少なくとも２コピーを意味する。「コピー」は、鋳型配列に対して完全に相補的な配列または完全に同一な配列を必ずしも意味しない。例えば、コピーは、デオキシイノシンなどのヌクレオチドアナログ、意図的配列改変（例えば、鋳型にハイブリダイズ可能であるが相補的ではない配列を含むプライマーを介して導入された配列改変）および／または増幅の間に起こる配列の誤りを含み得る。

【0036】

用語「アレイ」または「マイクロアレイ」は、本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドプローブ（例えば、オリゴヌクレオチド）または結合試薬（例えば、抗体）などのハイブリダイズ可能なアレイエレメントの、基板上における規則正しい配列をいう。この基板は、固体基板、例えばスライドガラスもしくはシリカスライド、ビーズ、光ファイバーバインダであってもよく、または半固体基板、例えばニトロセルロース膜であってもよい。ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの任意の順列であってもよい。

【0037】

本明細書中で使用される場合、用語「表現型」は、個体間で比較可能な形質、例えば状態の有無、個体間で視覚的に観察可能な外見の相違、代謝変動、生理学的変動、生体分子の機能における変動などをいう。表現型は、定性的であっても定量的であってもよい。表現型の一例は、処置、例えば薬物に対する応答性である。

【0038】

「応答性」は、患者に利益を示す任意のエンドポイントを用いて評価され得る。このエンドポイントとしては、非限定で、（１）疾患進行のある程度の阻害（遅延および完全な阻止を含む）；（２）疾患エピソードおよび／または症状の数の減少；（３）病変サイズの縮小；（４）疾患細胞の隣接周辺器官および／または組織への浸潤の阻害（すなわち、低減、遅延または完全な停止）；（５）疾患拡大の阻害（すなわち、低減、遅延または完全な停止）；（６）障害に関連する１つまたは複数の症状の、ある程度の軽減；（７）処置後の無疾患を示す長さの延長；（８）処置後の所定の時点における死亡率の低下；および／または（９）処置後の有害作用の欠如が挙げられる。応答性はまた、患者に対する副作用および／または毒性を示す任意のエンドポイントを用いて評価されてもよい。

【0039】

「処置する」もしくは「処置」または「緩和」は、標的とする病態または障害が治癒しない場合、対象物を遅延させる（減らす）かまたは状態の再発を防ぐ、治療的処置をいう。治療量の治療剤を受けた後、被験体が特定の疾患の１つまたは複数の徴候および症状の観察可能なおよび／または測定可能な低減または非存在を示した場合、該被験体は、成功裏に「処置」される。例えば、がん細胞の数の有意な減少またはがん細胞の非存在；腫瘍サイズの縮小；腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度の遅延および好ましくは停止）；腫瘍成長のある程度の阻害；特定のがんに関連する１つまたは複数の症状の寛解の長さの延長、および／またはある程度の軽減；疾病率および死亡率の低下ならびに生活問題の質の改善。疾患の徴候または症状の軽減はまた、患者によって感じられてもよい。処置は、がんの全ての徴候の消滅によって定義される完全な応答に達し得、または、好ましくは５０％を超えて、より好ましくは７５％腫瘍のサイズが縮小する、部分的応答に達し得る。患者はまた、患者が安定している疾患を経験する場合にも、処置されたと考えられる。いくつかの実施形態では、治療剤による処置は、有効であり、処置後３ヶ月間、好ましくは処置後６ヶ月間、より好ましくは１年間、直より好ましくは２年間以上の無疾患をもたらす。成功裏な処置および疾患における改善を評価するこれらのパラメータは、当該分野の適切な技術を有する臨床医が精通している慣用的手順によって、容易に測定可能である。

【0040】

用語「予測」または「予後」は、本明細書中で使用される場合、薬物または薬物のセットに対し、患者が好ましい応答をするかまたは好ましからざる応答をするかのいずれかの見込みをいう。１つの実施形態では、予測は、これらの応答の程度に関する。１つの実施形態において、予測は、患者が処置（例えば特定の治療剤による処置）後に、疾患の再発なしに一定期間生存するもしくは改善するか否か、および／またはその確率に関する。本発明の予測方法は、任意の特定の患者についての最も適切な処置法を選択することによって処置決定を行うために臨床的に使用され得る。本発明の予測方法は、処置レジメン（例えば、所定の治療レジメン、例えば所定の治療剤または組み合わせの投与、外科的介入、ステロイド処置など）に対して患者が好ましい応答をする可能性があることを予測する際に、価値のあるツールである。

【0041】

本明細書中で使用される場合、用語「特異的に結合する」は、特異的な結合対の結合特異性をいう。他の潜在的標的の存在下における特定の標的の抗体による認識は、このような結合の１つの特徴である。特異的結合には、分子のうちの１つは、化学的または物理的手段を通して第２の分子と特異的に結合する、２つの異なる分子が包含される。この２つの分子は、お互いへのその結合が、類似の特徴を有する他のアッセイ成分からその結合パートナーを識別し得るものであるという意味で、相関する。結合構成成分対のメンバーは、リガンドおよびレセプター（抗リガンド）、特異的結合対（ＳＢＰ）メンバーおよびＳＢＰパートナー、などと呼ばれる。分子はまた、分子の凝集のためのＳＢＰメンバーであってもよい；例えば、２次抗体およびその対応する抗原の免疫複合体に対して惹起された抗体は、その免疫複合体についてのＳＢＰメンバーと考えられ得る。

【0042】

本明細書中で使用される場合、用語「ホモログ」は、天然に存在する核酸（すなわち、「プロトタイプ」または「野生型」核酸）とは、天然に存在する核酸に対する重要でない修飾によって異なるが、その天然に存在する形態の基本的ヌクレオチド構造を維持している、核酸をいうように使用される。このような変化としては、欠失（例えば核酸の短縮型）、挿入および／または置換を含む、１つまたは数個のヌクレオチドの変化が挙げられるが、これらに限定されない。ホモログは、天然に存在する核酸と比較して、増強された特性、低減された特性、または実質的に類似の特性を有し得る。ホモログは、天然に存在する核酸に相補的であってもよく、または適合してもよい。ホモログは、核酸の生成についての当該分野で公知の技術（組換えＤＮＡ技術、化学的合成などが挙げられるが、これらに限定されない）を用いて生成され得る。

【0043】

本明細書中で使用される場合、「相補的または適合する」は、２つの核酸配列が、少なくとも５０％の配列同一性を有することを意味する。好ましくは、２つの核酸配列が、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。「相補的または適合する」はまた、２つの核酸配列が、低い、中程度のおよび／または高いストリンジェンシー条件（複数可）下でハイブリダイズ可能であることをも意味する。

【0044】

本明細書中で使用される場合、「実質的に相補的または実質的に適合する」は、２つの核酸配列が、少なくとも９０％の配列同一性を有することを意味する。好ましくは、２つの核酸配列が、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。あるいは、「実質的に相補的または実質的に適合する」は、２つの核酸配列が、高いストリンジェンシー条件（複数可）下でハイブリダイズ可能であることを意味する。

【0045】

一般的に、ハイブリッドの安定性は、イオン濃度および温度の関数である。典型的には、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシーの条件下で実施され、その後、変化する、しかしより高いストリンジェンシーの洗浄を行う。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーションとは、プローブなどの核酸分子が相補的核酸分子に結合することを許容する条件をいう。ハイブリダイズした核酸分子は、一般に、少なくとも６０％（例えば、少なくとも、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性のいずれかを含む）の同一性を有する。中程度のストリンジェンシー条件は、５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中４２℃でのハイブリダイゼーションに続く、０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中４２℃での洗浄と、同等の条件である。高いストリンジェンシー条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中４２℃でのハイブリダイゼーションに続く、０．１×ＳＳＰＥ、および０．１％ＳＤＳ中６５℃での洗浄によって提供され得る。

【0046】

低いストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、１０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、６×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中２２℃でのハイブリダイゼーションに続く、１×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中３７℃での洗浄と同等の条件をいう。デンハルト溶液は、１％フィコール、１％ポリビニルピロリドンおよび１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む。２０×ＳＳＰＥ（塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、エチレンジアミド（ｄｉａｍｉｄｅ）四酢酸（ＥＤＴＡ））は、３Ｍ塩化ナトリウム、０．２Ｍリン酸ナトリウム、および０．０２５Ｍ（ＥＤＴＡ）を含む。他の好適な中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション緩衝液および条件、ならびに高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション緩衝液および条件が、当業者に周知である。

【0047】

本明細書中で記載される本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態「からなる」か、および／またはこれらから「本質的になる」ことを含むことが理解される。

【0048】

本発明の他の目的、利点および特徴は、添付の図面と組み合わせた以下の明細書から、明らかとなる。

【0049】

Ｃ．ゲノムＤＮＡをジェノタイピングするための方法
本発明は、種々の供給源、例えば体液、組織、血液または血液の構成成分、例えば血漿由来の保存された臨床試料を用いて薬理ゲノミクスバイオマーカーを同定する新規な方法を提供する。１つの態様では、本発明は、１つまたは複数の薬理ゲノミクスバイオマーカーを同定する方法を提供し、この方法は、ａ）関連の表現型において異なる値を示す少なくとも２人の患者の保存された臨床試料からＤＮＡを単離する工程と、ｂ）上記単離されたＤＮＡを増幅する工程と、ｃ）上記増幅されたＤＮＡの高密度のジェノタイピングデータを得る工程と、ｄ）上記ジェノタイピングデータおよび上記関連の表現型における上記異なる値に基づきアソシエーション解析を行う工程であって、ここで上記薬理ゲノミクスバイオマーカー（複数可）が同定される工程、とを含む。

【0050】

いくつかの実施形態では、上記方法は、以前に行われた臨床試験からの保存された臨床試料の遡及的研究に使用され得る。いくつかの実施形態では、上記方法は、薬理ゲノミクスバイオマーカーのｄｅ ｎｏｖｏ同定に使用され得る。

【0051】

関連の表現型において異なる値を示す少なくとも２人の患者が、１つまたは複数の薬理ゲノミクスバイオマーカーを同定するための方法に必要である。典型的には、アソシエーション解析を実施するためには、かなり多くの患者が必要とされ得る。いくつかの実施形態では、保存された臨床試料は、約２人、５人、１０人、２０人、５０人、１００人、２００人、５００人、１，０００人以上の患者由来であってもよい。任意の関連の表現型、例えば医学的処置に対する応答性が、本発明によって企図される。いくつかの実施形態では、関連の表現型は、分類形質、定量的形質または別の関連の表現型であってもよい。典型的には、患者が、臨床試験に登録され得、患者の表現型データが、利用可能である。あるいは、複数の臨床試験に登録された患者が、アソシエーション解析のためにプールされてもよい。好ましくは、この複数の臨床試験は、類似の医学的処置、例えば同じ治療剤に関連し、関連の表現型に関連するデータは、全ての臨床試験のために利用可能である。

【0052】

試料調製
試料調製のために、哺乳動物（典型的には、ヒト患者）由来の組織試料または細胞試料が、使用され得る。試料の例としては、これらに限定されないが、組織生検、血液、肺吸引物、痰、リンパ液などが挙げられる。この試料は、当該分野で公知の種々の手順（外科的切除、吸引または生検が挙げられるが、これらに限定されない）によって得ることができる。この試料は、新鮮であっても凍結されていてもよく、例えば、保存された臨床試料であってもよい。いくつかの実施形態では、保存された臨床試料は、血漿試料、血清試料、乾燥血液スポット、尿試料、組織試料、腫瘍細胞および口腔スワブからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、保存された臨床試料は、血漿試料であってもよい。いくつかの実施形態では、この試料は、固定されて、パラフィンなどの中に包埋されていてもよい。

【0053】

保存された血漿試料は、本発明を説明する実施例として使用される。患者または健康な志願者から集められた保存された血漿試料が、ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｖｉｒｕｓ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（バレンシア、ＣＡ）のような任意の好適な方法を用いてＤＮＡを抽出するために使用され得る。このキットは、いくらか改変して使用してもよい。例えば、１ｍｌの血漿が、短くボルテックスされ、３０μｇのｔＲＮＡと完全に混合される。この混合物は、２００μｌのアリコートに分配され、これは、溶解緩衝液を添加する前に１時間にわたってインキュベートされる。次いで、この溶解物は、９６℃で５分間煮沸され、各アリコートは、同じカラムを通して濾過される。ＤＮＡは、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）中に溶出され、真空乾燥され、滅菌水中に溶解される。多くの場合、血漿から抽出されるゲノムＤＮＡの量は、その後のジェノタイピングのためには少なすぎて不十分である。したがって、いくつかの実施形態では、単離されたＤＮＡは、最適以下のゲノムＤＮＡであり得る。この単離されたＤＮＡの増幅が、その後のジェノタイピングのために充分なＤＮＡの量を得るために必要であり得る。いくつかの実施形態では、この増幅は、ＷＧＡであってもよく、得られたＤＮＡは、ｗｇａＤＮＡである。例えば、ＤＮＡ試料は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ピスカタウェイ、ＮＪ）または同等の試薬を用いて増幅され得、このプロセスは、典型的には、ジェノタイピングのために充分な数マイクログラムのＤＮＡを生じる。

【0054】

ＳＮＰを用いるジェノタイピング
単離されたゲノムＤＮＡからジェノタイピングデータを得るために、任意の好適な方法が、使用され得る。ジェノタイピングの方法は、１つまたは複数の多型遺伝子座についての１以上の個体に関する情報を同時に得ることができる。いくつかの実施形態では、ジェノタイピングは、一塩基分析（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）において所定の遺伝子座におけるアレルを識別することと定義され得る。遺伝子座は、遺伝子マーカーもしくはＤＮＡマーカーの染色体の位置と定義される。したがって、本発明の方法は、医学的決定のための根拠として使用され得る個体についてのスクリーニングおよび診断の情報を提供するために必要な精度を有する。

【0055】

用語「ジェノタイピングされた」は、本明細書中で使用される場合、１以上の個体のジェノタイプを決定するためのプロセスをいう。ここで、「ジェノタイプ」は、集団における１つまたは複数の多型変異体の表現である。典型的には、ジェノタイピングは、１つまたは複数の多型遺伝子座において多型変異体の有無を評価することを包含する。いくつかの実施形態では、高密度のジェノタイピングが、使用され得る。いくつかの実施形態では、高密度のジェノタイピングは、全ゲノムジェノタイピングである。

【0056】

本明細書中で使用される場合、用語「多型遺伝子型」は、個体の集団由来の有意な数の核酸試料において２つ以上の代替のヌクレオチド配列が観察される核酸における領域をいう。多型遺伝子座は、例えば、２以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列、挿入されたヌクレオチドまたはヌクレオチド配列、欠失したヌクレオチドまたはヌクレオチド配列、またはマイクロサテライトのコピー数における変動であってもよい。２以上のヌクレオチド長の多型遺伝子座は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上、２０以上、３０以上、５０以上、７５以上、１００以上、５００以上、または約１０００のヌクレオチド長であってもよく、全てまたはいくつかのヌクレオチド配列が、この領域内で異なっている。多型遺伝子座は、多くの場合、１ヌクレオチド長であり、これは、本明細書中で、「一塩基多型」または「ＳＮＰ」という。いくつかの実施形態では、高密度ジェノタイピングは、ＳＮＰを用いて実施され得る。いくつかの実施形態では、約１，０００〜５，０００，０００以上、好ましくは約１，０００，０００のＳＮＰが、使用され得る。いくつかの実施形態では、高密度ジェノタイピングは、アレイベースであってもよい。いくつかの実施形態では、高密度ジェノタイピングは、配列決定、例えばハイスループット配列決定によって実施されてもよい。

【0057】

多型遺伝子座において２つ、３つまたは４つの代替のヌクレオチド配列がある場合、各ヌクレオチド配列は、「多型変異体」または「核酸変異体」と呼ばれる。例えば、２つの多型変異体が存在する場合、集団からの少数の試料に提示される多型変異体は、時々、「マイナーアレル」と呼ばれ、より優勢に提示される多型変異体は、時々、「メジャーアレル」と呼ばれる。多くの生物は、１コピーの各染色体を有し（例えば、ヒト）、２つのメジャーアレルまたは２つのマイナーアレルを有する個体は、多くの場合、多型に関して「ホモ接合」であるといわれ、１つのメジャーアレルと１つのマイナーアレルとを有する個体は、多型に関して「ヘテロ接合」であるといわれる。１つのアレルに関してホモ接合である個体は、ヘテロ接合であるかまたは別のアレルに関してホモ接合である個体と比較して、時々、異なる表現型になりやすい。

【0058】

１つまたは複数の薬理ゲノミクスバイオマーカーを同定する遺伝子解析において、関連の表現型において異なる値を有する個体由来の試料は、多くの場合、アレロタイピングされているか、および／またはジェノタイピングされている。用語「アレロタイピング（ａｌｌｅｌｏｔｙｐｅ）」は、本明細書中で使用される場合、症例および対照由来のプールされたＤＮＡ試料における多型変異体についてのアレル頻度を決定するためのプロセスをいう。各群からＤＮＡをプールすることによって、各群における各遺伝子座についてのアレル頻度が、計算される。したがって、これらのアレル頻度は、互いに比較される。

【0059】

ジェノタイプまたは多型変異体は、「ハプロタイプ」の語で表されてもよく、これは、本明細書中で、一緒に遺伝する傾向のある一組のＤＮＡ変異または多型をいう。ハプロタイプは、アレルの組み合わせを言及しても、同じ染色体上に見出される一組のＳＮＰを言及してもよい。例えば、２つのＳＮＰは、１つの遺伝子内に存在し得、ここで、各ＳＮＰ位置がシトシン変異（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）およびアデニン変異を含む。集団における特定の個体は、各ＳＮＰ位置にシトシンを有する遺伝子を有する１つのアレル（ヘテロ接合）または２つのアレル（ホモ接合）を保持し得る。遺伝子中の各ＳＮＰに対応する２つのシトシンがこれらの個体における１つまたは両方のアレルにおいて一緒に移動する場合、この個体は、遺伝子における２つのＳＮＰに関するシトシン／シトシンハロタイプを有すると特徴付けられ得る。

【0060】

研究者は、時々、多型変異体を、その変異体が集団の有意な割合を代表しているかどうかを決定することなく、データベースにおいて報告する。これらの報告された多型変異体のサブセットが、集団の統計的有意な部分に現れていないので、これらのうちのいくつかは、配列の誤りでありおよび／または生物学的に関連していない。したがって、多くの場合、報告されている多型変異体は、この変異体の存在が個体の集団において検出され、この変異体の頻度が決定されるまで、統計的に有意であるかどうかまたは生物学的に関連性があるかどうかが公知ではない。多型変異体は、集団の１％以上、時には集団の５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、そして多くの場合、集団の２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、または５０％以上に現れている場合、統計的に有意であり、多くの場合、生物学的に関連性がある。

【0061】

多型変異体は、二本鎖核酸のいずれかまたは両方の鎖において検出され得る。また、多型変異体は、遺伝子のイントロンもしくはエキソン内に、プロモーターのような調節領域の部分内に、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、翻訳領域、遺伝子間領域または公知の遺伝子を含まないゲノム領域内に、位置し得る。多型変異体は、遺伝子発現、ポリペプチド構造またはポリペプチド機能において検出可能な相違を有してもよく、または有さなくてもよい。

【0062】

パラメータ最適化
保存した試料からのＤＮＡに由来するジェノタイピング結果は、異なる特徴を示し、標準的実施において使用される高品質のＤＮＡ由来のコール率よりも有意に低いコール率を示し得る。標準的ＧＷＡＳにおいて使用される典型的なコール率カットオフ（典型的には９５％またはなおそれより高い）を適用するのとは対照的に、本発明において使用される解析は、この解析においてより多くの試料を含めるために、得たジェノタイピング結果に基づいてカットオフコール率を調整する、非従来型のアプローチを取り入れる。結果として、使用されるカットオフ値は、供給者によって推奨される標準的カットオフ値よりも実質的に低い場合がある。本発明から得られる結果の別の関連する特徴は、大容量のデータが失われている場合があり、これは、標準的すなわち「公知の」解析アルゴリズムを用いた際には、重大な難問を提示し得ることである。したがって、本発明はまた、失われたデータのいくらかを、ジェノタイピングされた多型遺伝子座における連鎖不平衡（ＬＤ）に基づいて置き換え得る帰属アルゴリズムを使用する。

【0063】

組み入れ基準の最適化は、ジェノタイピングデータを得るために実施され得る（図２）。いくつかの実施形態では、ジェノタイピングデータは、ゲノムワイドなジェノタイプコーリングアルゴリズムを用いることによって得られる。血漿試料およびジェノタイピング前に適用された全ゲノム増幅から生成された最適以下のゲノムＤＮＡの品質ゆえに、試料のいくつかに由来するコール率は、高品質のゲノムＤＮＡを用いた場合の典型的なコール率（９５％を超える）よりも実質的に低い場合がある。本発明では、カットオフコール率は、できる限り多くの試料を含むために、従来の標準よりも有意に低く調整される。いくつかの実施形態では、ゲノムワイドなジェノタイプコーリングアルゴリズムのコール率カットオフ値は、調整され得る。いくつかの実施形態では、ジェノタイプコールは、高品質ゲノムＤＮＡの全ゲノムジェノタイピングに使用される典型的なコール率カットオフ値よりも低いコール率カットオフ値（ここで、使用されるコール率カットオフ値は、約５０〜９５％、約８０〜９０％、または約９０％である）を用いることによって作製され得る。いくつかの実施形態では、ジェノタイプコーリングアルゴリズムのコール率カットオフ値の調整およびこの調整されたコール率カットオフ値に基づくジェノタイプコールの作製は、試料を含めかつ／または除外する基準を同定するために、複数回繰り返し得る。いくつかの実施形態では、最適な組み入れ基準（例えば、コール率カットオフ値）は、調整サイクルの反復後に同定される。いくつかの実施形態では、ジェノタイプコールは、帰属アルゴリズムを用いて作製され、ここで、ＨａｐＭａｐが、帰属アルゴリズムに使用される。

【0064】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（サンタクララ、ＣＡ）および／またはＩｌｌｕｍｉｎａ（サンディエゴ、ＣＡ）によって製造された全ゲノムＳＮＰアレイを用いてジェノタイピングされる。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ５００Ｋアレイは、本発明を説明するために例として使用される。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイに加え、ＩｌｌｕｍｉｎａチップおよびＳｅｑｕｅｎｏｍ ＭａｓｓＡｒｒａｙもまた、１つのプラットホームによって生成された結果を確かめるために使用される。

【0065】

いくつかの実施形態では、ジェノタイプコールは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｃｏｎｓｏｌｅ（商標）ソフトウェアを用いて生成される。いくつかの実施形態では、ジェノタイプコールは、Ｍａｈａｌａｎｏｂｉｓ Ｄｉｓｔａｎｃｅ Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒを用いたＲｏｂｕｓｔ Ｌｉｎｅａｒ Ｍｏｄｅｌ（ＲＬＭＭ）アルゴリズム、Ｂａｙｅｓｉａｎ ｓｔｅｐを用いたＲＬＭＭ（ＢＲＬＭＭ）アルゴリズム、Ａｘｉｏｍ（商標）ＧＴ１アルゴリズム、完全適合プローブを用いたＢＲＬＭＭ（ＢＲＬＭＭ−Ｐ）アルゴリズム、またはＢｉｒｄｓｅｅｄアルゴリズム（Ｒａｂｂｅｅら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２００６年）２２巻、７〜１２頁；Ｋｏｒｎら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ（２００８年）４０巻、１２５３〜６０頁）を使用して生成される。

【0066】

Ｄ．アソシエーション解析による薬理ゲノミクスバイオマーカーの同定
得られたジェノタイピングデータは、関連の表現型に基づいてアソシエーション解析を実施し、薬理ゲノミクスバイオマーカーを同定するために使用される（図１）。分類アルゴリズム（サポートベクターマシン（ＳＶＭ）およびロジスティック回帰が挙げられるがこれらに限定されない）が、データセットに適用され得、最適なバイオマーカーおよびスコアリングアルゴリズムを同定する。いくつかの実施形態では、アソシエーション解析は、ＧＷＡＳである。いくつかの実施形態では、アソシエーション解析は、関連の表現型との各多型遺伝子座、例えばＳＮＰの関連ｐ値を計算することによって実施される。いくつかの実施形態では、この計算は、アレル頻度および／またはジェノタイプベースの試験に基づく。

【0067】

薬理ゲノミクスバイオマーカーを同定するための関連の表現型は、一般に、処置レジメンに対する個体の応答性に関連する。関連の表現型は、定性的であっても、定量的であってもよい。応答性は、一次性、例えば抗がん薬物に対する応答におけるがんの塊の減少であってもよく、または二次性、例えばベキサロテンに対する応答における高トリグリセリド血症（ＨＴＣ）であってもよい。この一次応答および二次応答は、互いに相関していても、していなくてもよい。応答は、陽性であっても陰性であってもよい。陰性応答は、有効な応答の非存在または毒性副作用の存在のいずれかとして定義され得る。１つまたは複数の関連の表現型は、薬理ゲノミクスバイオマーカーを同定するアソシエーション解析に使用され得る。

【0068】

いくつかの実施形態では、アソシエーション解析は、異なるコール率カットオフ値を用いて複数回繰り返され、使用される基準を最適化してもよい（図２）。いくつかの実施形態では、ジェノタイピング結果は、遺伝子データ解析ソフトウェア、例えばＰＬＩＮＫ（Ｐｕｒｃｅｌｌら、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ（２００７年）８１巻、５５９〜５７５２頁）を用いて分析して、関連の表現型との各多型遺伝子座の関連ｐ値を計算し得る。多型遺伝子座は、関連の表現型との計算された関連によって並べられ得る。最も有意に関連する多型遺伝子座は、関連の表現型についての薬理ゲノミクスバイオマーカーとして同定され得る。

【0069】

検証および／または反復
高密度ジェノタイピングによって同定される薬理ゲノミクスバイオマーカーは、さらなるアソシエーション解析、すなわち「第ＩＩ段階」分析に供され得る（図１）。さらなるアソシエーション解析は、高密度ジェノタイピングおよびアソシエーション解析、すなわち第Ｉ段階分析を通して同定された薬理ゲノミクスバイオマーカーの検証および／または反復に使用され得る。第Ｉ段階からの保存された臨床試料のいくつかまたは全て、および／またはさらなる臨床試料は、さらなるジェノタイピングに使用され得る。

【0070】

いくつかの実施形態では、さらなるアソシエーション解析は、同定された薬理ゲノミクスバイオマーカーを用いるさらなるジェノタイピングデータに基づき得る。いくつかの実施形態では、約１、１０、２０、５０、１００、２００、５００以上の同定された薬理ゲノミクスバイオマーカーが、さらなるジェノタイピングに使用され得る。

【0071】

いくつかの実施形態では、第Ｉ段階分析から同定された高度に関連しているＳＮＰは、第Ｉ段階において使用されたものと区別可能な低密度ジェノタイピングプラットホーム（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ ｉＰＬＥＸ ＭａｓｓＡｒｒａｙ技術）によって反復され得る。

【0072】

第ＩＩ段階において、第Ｉ段階において使用されていない新たなＤＮＡ試料が、第Ｉ段階において同定された薬理ゲノミクスバイオマーカーを反復することを目的としてジェノタイピングされ得る。追加の臨床試料は、新たな臨床試験における患者由来であり得、そして新鮮な臨床試料であり得る。したがって、追加の臨床試料から単離されたゲノムＤＮＡは、より高い品質でかつより大量である場合があり、増幅なしでの高密度ジェノタイピングのために好適であり得る。

【0073】

組み入れ基準の最適化が、追加のジェノタイピングデータを得るために実施され得る（図３）。いくつかの実施形態では、追加のジェノタイピングデータは、検証ジェノタイプコーリングアルゴリズムを用いることによって得ることができる。いくつかの実施形態では、さらなるアソシエーション解析は、検証ジェノタイプコーリングアルゴリズムのコール率カットオフ値を調整することを含み得る。いくつかの実施形態では、ジェノタイピングおよびコール率カットオフの調整を複数回繰り返して、試料を含めかつ／または除外し得る。いくつかの実施形態では、最適な組み入れ基準が、同定され得る。いくつかの実施形態では、この方法は、検証ジェノタイプコーリングアルゴリズムを用いることによって得られた追加のジェノタイピングデータを、ゲノムワイドなジェノタイプコーリングアルゴリズムを用いることによって得られたジェノタイピングデータと比較する工程をさらに含み得る（図３）。

【0074】

２段階研究の後、最も有意に関連する薬理ゲノミクスバイオマーカーが、同定され得る。いくつかの実施形態では、アソシエーション解析は、使用される基準を最適化するために異なるコール率カットオフ値を使用して複数回繰り返され得る（図３）。いくつかの実施形態では、薬理ゲノミクスバイオマーカーは、第Ｉ段階で同定された薬理ゲノミクスバイオマーカーの下位集団である。いくつかの実施形態では、薬理ゲノミクスバイオマーカーは、１つまたは複数のＳＮＰを含み得る。同定された複数の薬理ゲノミクスバイオマーカーは、ゲノム上で互いに近接に位置してもよく、そして遺伝子のイントロン／エキソンに、遺伝子間領域に、またはゲノム上の公知でない遺伝子を含む領域に位置してもよい。

【0075】

Ｅ．保存された試料を用いたゲノムワイドなアソシエーション研究
なお別の態様では、最適以下のゲノムＤＮＡを用いてＧＷＡＳを実施する方法が、本明細書中で提供される。いくつかの実施形態では、最適以下のゲノムＤＮＡは、保存された試料に由来し得る。いくつかの実施形態では、最適以下のゲノムＤＮＡは、血漿試料に由来し得る。いくつかの実施形態では、最適以下のゲノムＤＮＡは、増幅されてもよい。最適以下のゲノムＤＮＡを用いてＧＷＡＳを実施する方法を用いて薬理ゲノミクスバイオマーカーを同定するための方法が、本明細書中でさらに提供され得る。この方法は、遡及的方法であってもよい。

【0076】

上に記載された２段階データ分析は、最適以下のゲノムＤＮＡを用いるＧＷＡＳに使用され得る。いくつかの実施形態では、複数のジェノタイピングプラットホームが、使用され得る。いくつかの実施形態では、同じまたは異なる試料を複数のジェノタイピングプラットホームに使用してもよい。いくつかの実施形態では、この方法は、高品質のゲノムＤＮＡを提供する試料をさらに使用してもよい。この試料は、最適以下のゲノムＤＮＡから得られるデータの反復のために使用され得る。いくつかの実施形態では、高品質のゲノムＤＮＡを提供する試料は、全血試料であってもよい。

【0077】

Ｆ．薬理ゲノミクスバイオマーカーの適用
特定の処置レジメンは、被験体のジェノタイプに依存して異なる効果を発揮し得るので、薬理ゲノミクスは、被験体のジェノタイプにしたがって、該被験体に処置を適合させることを含む。例えば、予後試験の結果に基づき、臨床医または医師は、適切な情報および予防的処置もしくは治療的処置を、その情報または処置によって利益を受ける被験体に対し目標とすることができ、利益を受けない被験体（例えば、その処置が治療的効果を有さないか、および／またはその被験体が有害な副作用を経験する）にそのような情報および処置を指向することを避けることができる。本明細書中で記載される方法を用いて薬理ゲノミクスバイオマーカーから生成する情報は、個体のための適切な投薬および処置レジメンを決定するために使用され得る。この知見は、投薬または薬物選択に適用される場合、有害反応または治療不成功を避けることができ、したがって、治療的組成物を投与した際の治療有効性を増強することができる。いくつかの実施形態では、薬理ゲノミクスバイオマーカーは、コンパニオン診断試験を開発するために使用され得る。

【0078】

したがって、さらなる態様では、本明細書中で開示される方法によって同定される薬理ゲノミクスバイオマーカーを用いるコンパニオン診断試験が、本明細書中で提供される。例えば、１つの実施形態では、医師または臨床医は、薬学的組成物を被験体に投与するかどうかを決定する際に、本明細書中で記載される方法を用いて薬理ゲノミクスバイオマーカーにおいて得られた知識を適用することを考慮してもよい。別の実施形態では、医師または臨床医は、患者に投与される治療薬の投与量、例えば処置あたりの量または処置の頻度を決定する際、このような知見を適用することを考慮してもよい。

【0079】

本発明は、被験体の処置に対する応答性を評価するためまたは評価することを補助するための方法を、提供する。本発明はまた、被験体において、処置に対する応答性を予測するか、または処置／処置に対する応答性をモニタリングするための方法も、提供する。本発明は、処置についての被験体を選択しそしてその被験体を処置するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、被験体から得られる試料において１つまたは複数の薬理ゲノミクスバイオマーカーを評価する工程、および上記の１つまたは複数の薬理ゲノミクスバイオマーカーのジェノタイプに基づいて、処置に対する被験体の応答性を予測するか、評価するか、または評価を補助する工程を含む。いくつかの実施形態では、ＳＶＭ、ロジスティック回帰、またはＫ−最近接近傍分析（Ｋ−ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ ａｎａｌｙｓｉｓ）のようなアルゴリズムを用いて、被験体を分類することにより、応答性が、予測されるかまたは評価される。

【0080】

以下は、薬理ゲノミクス実施形態の実施例である。特定の処置レジメンは、被験体のジェノタイプに依存して異なる効果を発揮し得る。候補治療が、主要なアレルとの有意な相互作用と主要でないアレルとの比較的弱い相互作用と（例えば、相互作用において１桁またはそれより大きい相違）を示す場合、このような治療は、典型的には、この主要でないアレルについてのホモ接合であるとジェノタイピングされた被験体には投与せず、時には、この主要でないアレルについてヘテロ接合であるとジェノタイピングされた被験体にも投与しない。別の実施例では、主要ではないアレルについてヘテロ接合またはホモ接合である被験体に投与された際に、候補治療が有意に毒性ではない場合、この候補治療は、典型的には、この主要ではないアレルについてヘテロ接合またはホモ接合であるとジェノタイピングされた被験体に投与されない。

【0081】

本明細書中に記載される方法は、例えば代謝障害、心臓血管疾患、がんなどの状態を予防するか、緩和するかまたは処置するための薬理ゲノミクス方法が適用可能である。例えば、個体由来の核酸試料は、本明細書中で記載される予後試験に供され得る。ＩＩ型糖尿病の危険の増大を伴う１つまたは複数の多型変異体が被験体において同定された場合、それにより、ＩＩ型糖尿病を予防するかもしくは処置するための情報および／または１つ以上のＩＩ型糖尿病処置レジメンが、この被験体に対して処方され得る。

【0082】

特定の実施形態では、処置レジメンは、本明細書中で記載される方法によって評価される処置レジメンに対し個体が応答する可能性（ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ）に基づいて、その処置レジメンから最も利益を受ける個体に対し、具体的に処方および／または投与される。したがって、処置レジメンに対して応答する可能性の高い被験体を同定し、次いで、応答の可能性が高いと同定される個体に対しそのような処置レジメンを処方するための方法が、提供される。したがって、特定の実施形態は、被験体を処置するための方法を対象とし、この方法は、処置レジメンへの応答に関連する薬理ゲノミクスバイオマーカーの有無を、被験体由来の核酸試料中の本明細書中で示されるヌクレオチド配列において検出する工程、および処置レジメンに対する応答性に関連する薬理ゲノミクスバイオマーカーの存在がそのヌクレオチド配列において検出された試料の源である被験体に対し、処置レジメンを処方するかまたは投与する工程を含む。

【0083】

処置は、時々、予防的であり（例えば、疾患状態が起こるかまたは進行する確率を低下させるために処方されるかまたは投与される）、時々、治療的であり、そして時々、疾患状態の進行を遅延させるか、緩和させるか、または停止させる。障害を緩和するかまたはその発症を予防するための任意の公知の予防的または治療的処置が処方および／または投与され得る。

【0084】

薬理ゲノミクス方法はまた、薬物に対する応答を分析しそして予測するためにも使用され得る。例えば、薬理ゲノミクス分析は、個体が特定の薬物による処置に対し陽性の応答をする可能性を示す場合、この薬物が個体に投与され得る。反対に、この分析が、特定の薬物による処置に対して陰性の応答をするであろうことを示す場合、代替の処置過程が処方され得る。治療的処置に対する応答は、以下の集団のいずれかにおける被験体がジェノタイピングされるバックグラウンド研究において予測され得る：処置レジメンに対し好ましい応答をする集団、処置レジメンに対して有意な応答をしない集団、および処置レジメンに対して有害な応答をする（例えば、１つまたは複数の副作用を示す）集団。これらの集団は、例として提示され、他の集団および下位集団が、分析され得る。これらの分析の結果に基づき、被験体は、彼または彼女が処置レジメンに対し好ましい応答をするか、処置レジメンに対し有意な応答をしないか、または処置レジメンに対し有害な応答をするかを予測するためにジェノタイピングされる。

【0085】

分類／予測アルゴリズムは、検証および／または反復データセットを用いて開発され得る。失われたデータのいくつかをジェノタイピングされた多型遺伝子座の中からＬＤに基づいて置き換え得る回帰アルゴリズムが、使用され得る。ＳＮＰがジェノタイピングに使用される実施形態では、ＨａｐｍａｐなどのＳＮＰデータベースが、回帰アルゴリズムに使用され得る。分類／予測アルゴリズムの開発のために、検証データセットは、訓練データセットとして使用され得る。一旦、分類／予測アルゴリズムが開発されると、反復データセットは、アルゴリズムを試験するために使用され得る。

【0086】

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、被験体由来の試料および公知のクラスの参照試料中の薬理ゲノミクスバイオマーカーのジェノタイプに基づくＫ−最隣接分析を用いて被験体を応答性被験体または非応答性被験体に分類する工程を含む。いくつかの実施形態では、Ｋ−最隣接分析を用いた被験体の分類は、（１）パラメータＫ（すなわち、最隣接の数）を決定すること；（２）分類される新たな試料におけるマーカー遺伝子の測定された発現レベルと各参照試料におけるそれぞれのマーカー遺伝子の発現レベルとの間の相違を計算すること；（３）新たな試料と参照試料との間の最小の絶対差の重みつき平均（ＷＡＡＤ）によってこれらの試料を選択することにより、最近接参照試料を決定すること；および（４）公知のクラスのＫ最近接参照試料に基づいて新たな試料のクラスを決定することによって、実施される。これらの重量および／またはパラメータＫは、臨床試験試料と公知のクラスとの交差検証を用いて決定される。例えば、５倍（例えば、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍）からＮ倍までの交差検証が、重みつきＫ−最近接近傍分類誤謬を最小化するために使用され得、ここで、Ｎは、試料のサイズである。いくつかの実施形態では、Ｋは、４と１３との間の整数（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３）である。いくつかの実施形態では、この最近接参照試料（最近接近傍）は、分類される新たな試料の発現レベルと薬理ゲノミクスバイオマーカーのそれぞれについての各参照試料の発現レベルとの間の最小の絶対差の重みつき平均を有する試料である。

【0087】

予測、評価または評価の補助のための比較および／または計算は、問題の薬理ゲノミクスバイオマーカーについての測定値および／または参照値の種類に適切な任意の従来様式で実施され得る。比較するかまたは計算するプロセスは、手動であってもよく、または（例えば、コンピューターベースの機械を含む機械による）自動であってもよい。当業者に明らかであるように、反復ジェノタイピングが、薬理ゲノミクスバイオマーカーについて行われてもよい。

【0088】

また、本明細書中で開示されるコンパニオン診断試験を用いて処置に対する被験体の応答性を予後診断する方法が、本明細書中で提供される。本明細書中で記載される試験は、臨床薬物試験にも適用可能である。いくつかの実施形態では、薬理ゲノミクスバイオマーカーは、臨床試験のための被験体集団を層別化するかまたは選択するために使用され得る。薬理ゲノミクスバイオマーカーは、いくつかの実施形態では、処置に対して毒性応答を示し得る個体を、毒性応答を示さない個体から層別化するために使用され得る。他の実施形態では、薬理ゲノミクスバイオマーカーは、応答者である者から非応答者である者を分離するために使用され得る。本明細書中で記載される薬理ゲノミクスバイオマーカーは、臨床試験の薬理ゲノミクスベースの設計および実施の管理において使用され得る。

【0089】

治療剤に対する応答または治療剤に対する副作用の指標となる１つまたは複数の薬理ゲノミクスバイオマーカーは、本明細書中に記載される方法を用いて同定され得る。その後、そのような薬剤の臨床試験における潜在的参加者は、この薬物に対し好ましい応答をする可能性が最も高い個体を同定し、副作用を経験する可能性のある個体を除外するためにスクリーニングされ得る。このようにして、薬物処置の有効性は、この研究において陽性の応答をする可能性のない個体の包含の結果としての測定値の低下がなく、そして望まぬ安全性問題の危険性がなしに、この薬物に対して陽性の応答をする個体において測定され得る。

【0090】

したがって、別の実施形態は、処置または薬物の臨床試験における包含のために個体を選択する方法であって、この方法は、（ａ）個体から核酸試料を得る工程と、（ｂ）上記処置または上記薬物に対する陽性の応答に関連する多型変異、または上記処置または上記薬物に対する陰性の応答に関連する少なくとも１つの多型変異の、上記核酸試料における同一性を決定する工程と、（ｃ）上記核酸試料が上記処置もしくは上記薬物に対する陽性の応答に関連する上記多型変異を含む場合、または上記核酸試料が上記処置もしくは上記薬物に対する陰性の応答に関連する上記多型変異を含まない場合、上記個体を上記臨床試験に含める工程とを含む。加えて、本明細書中で記載される、処置または薬物の臨床試験における包含のために個体を選択するための方法は、本開示に記載される任意のさらなる限定を有する方法、またはその後、単独でもしくは任意の組み合わせで特定される方法を包含する。包含する工程（ｃ）は、上記核酸試料が上記処置または上記薬物に対する陽性の応答に関連する上記多型変異を含み、そして上記核酸試料が、上記処置または上記薬物に対する陰性の応答に関連する上記両アレルのマーカーを欠く場合に、上記薬物または上記処置を上記個体に投与する工程を、必要に応じて含む。

【0091】

Ｇ．追加の薬理ゲノミクスバイオマーカーまたは薬物標的
また、同定された薬理ゲノミクスバイオマーカーに近接する多型変異体を同定するための方法が提供される。したがって、本明細書は、同定された薬理ゲノミクスバイオマーカーに近接する多型変異を同定するための方法を特徴とする。別の実施形態では、時々同定される上記近接する多型変異体は、例えば、時々公に入手可能なデータベースにおいて公表される公に開示された多型変異体である。他の実施形態では、同定された上記多型変異体は、公には開示されず、公知の方法（核酸試料の群において同定された薬理ゲノミクスバイオマーカーを取り巻く領域を配列決定する工程が挙げられるが、これに限定されない）を用いて発見される。それゆえ、同定された薬理ゲノミクスバイオマーカーに近接の複数の多型変異体はこの方法を用いて同定される。

【0092】

上記近接する多型変異体は、多くの場合、上記同定された薬理ゲノミクスバイオマーカーを取り巻く領域において同定される。特定の実施形態では、この取り巻く領域は、上記同定された薬理ゲノミクスバイオマーカーの側面にある約５０ｋｂ（例えば、第１の多型変異体の５’側の約５０ｋｂおよび上記第１の多型変異体の３’側の約５０ｋｂ）であり、この領域は、時々、より短いフランキング配列（例えば、同定された薬理ゲノミクスバイオマーカーの５’および３’側の約４０ｋｂ、約３０ｋｂ、約２５ｋｂ、約２０ｋｂ、約１５ｋｂ、約１０ｋｂ、約７ｋｂ、約５ｋｂまたは約２ｋｂのフランキング配列）からなる。他の実施形態では、この領域は、より長いフランキング配列（例えば、同定された薬理ゲノミクスバイオマーカーの５’および３’側の約５５ｋｂ、約６０ｋｂ、約６５ｋｂ、約７０ｋｂ、約７５ｋｂ、約８０ｋｂ、約８５ｋｂ、約９０ｋｂ、約９５ｋｂまたは約１００ｋｂのフランキング配列）からなる。

【0093】

いくつかの実施形態では、上記薬理ゲノミクスバイオマーカーは、１つまたは複数の追加の薬理ゲノミクスバイオマーカーを同定するために使用され得る。例えば、薬理ゲノミクスバイオマーカーに近接して位置する他の多型遺伝子座が、関連の表現型との関連について分析され得る。さらに、遺伝子は、薬理ゲノミクスバイオマーカーに対して近接していることが同定され得、その機能が分析される。関連の表現型に直接的または間接的に関係する機能を有する遺伝子、または同じ細胞経路における他の遺伝子は、関連の表現型によるさらなる分析の標的であり得、新規な薬理ゲノミクスバイオマーカーが同定され得る。

【0094】

特定の実施形態では、多型変異体は、繰り返し同定される。例えば、第１の近接する多型変異体は、上で記載された方法を用いて同定され、次いで、上記第１の近接する多型変異体に近接する別の多型変異体が同定され（例えば、公に開示されるかまたは発見され）、上記第１の近接する多型変異体に近接する１つまたは複数の他の多型変異体の関連の有無が、決定される。

【0095】

本明細書中で記載される方法は、状態、疾患または障害に関連する遺伝子、領域または遺伝子座をさらに特徴付けるために使用され得る追加の多型変異体を同定するか、または発見するために、有用である。例えば、追加の多型変異体からのアレロタイピングまたはジェノタイピングデータは、機能的変異または連鎖不平衡の領域を同定するために使用され得る。特定の実施形態では、同定された薬理ゲノミクスバイオマーカーを含む領域内で同定されたかまたは発見された多型変異体は、本明細書中で記載される遺伝的方法および試料選択技術を用いてジェノタイピングされ、これらの多型変異体が上記同定された薬理ゲノミクスバイオマーカーと連鎖不平衡であるかどうかが決定され得る。上記同定された薬理ゲノミクスバイオマーカーとの連鎖不平衡にある領域のサイズもまた、これらのジェノタイピング方法を用いて評価され得る。したがって、多型変異体が、同定された薬理ゲノミクスバイオマーカーと連鎖不平衡にあるかどうかを決定するための方法が、本明細書中で提供される。そしてこのような情報は、本明細書中で記載される予後／診断方法において使用され得る。

【0096】

本明細書中で開示される方法によって同定された薬理ゲノミクスバイオマーカーを用いて新規な薬物標的を同定する方法が、本明細書中でさらに提供される。いくつかの実施形態では、上記バイオマーカーおよびその関連するＳＮＰもしくは遺伝子は、基礎となる生物学的経路または関連の表現型の基礎となるメカニズムの洞察（例えば効能、有害作用または他のエンドポイント）を得ることができる。これらの発見は、より良い診断または治療剤を開発するための手段になり得る。

【0097】

Ｈ．キット
上で記載された薬理ゲノミクスバイオマーカーに基づく診断キットが開発され得、これらは、対応する薬物に対する個体の応答を予測するために使用され得る。このような試験キットは、被験体が試料（例えば、頬側細胞または血液）をヘルスケア供給者の補助なしで得るために使用し得るデバイスおよび指示を含み得る。

【0098】

上で記載されているかまたは示唆されている用途における使用のために、キットまたは製品もまた、本発明によって提供される。このようなキットは、本明細書中で記載される薬理ゲノミクスバイオマーカーをジェノタイピングするために特異的な少なくとも１つの試薬を含み得、そしてさらに、本明細書中で記載される方法を実施するための指示を含み得る。

【0099】

いくつかの実施形態では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたはその任意の特定の部分の特異的増幅を可能にするプライマーおよびプライマー対、ならびに本発明の核酸分子またはその任意の部分に選択的にまたは特異的にハイブリダイズするプローブを含む組成物およびキットを提供する。プローブは、検出可能マーカー、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレーターまたは酵素などによって標識され得る。このようなプローブおよびプライマーは、試料中のポリヌクレオチドの存在を検出するために、そしてポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を発現する細胞を検出するための手段として、使用され得る。当業者によって理解されるように、非常に多くの異なるプライマーおよびプローブが、本明細書中で提供される配列に基づいて調整され得、ゲノムＤＮＡを増幅するため、クローニングするため、および／またはその存在および／もしくはレベルを決定するために効率的に使用され得る。

【0100】

いくつかの実施形態では、キットは、ポリペプチドの存在を検出するための試薬を含み得る。このような試薬は、抗体またはポリペプチドに特異的に結合する他の結合分子であり得る。いくつかの実施形態では、このような抗体または結合分子は、多型の結果としてのポリペプチドに対する構造的変異を識別することが可能であり得、したがって、ジェノタイピングのために使用され得る。抗体または結合分子は、検出可能マーカー、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレーター、酵素または粒子などによって標識され得る。結合アッセイ、例えばＥＬＩＳＡを実施するための他の試薬が、このキット内に含まれ得る。

【0101】

いくつかの実施形態では、このキットは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、または１５の薬理ゲノミクスバイオマーカーをジェノタイピングするための試薬を含む。いくつかの実施形態では、このキットは、増幅された核酸を検出するためのプローブを捕捉するための表面または基板（例えば、マイクロアレイ）をさらに含み得る。

【0102】

このキットは、密閉された１つまたは複数の容器手段、例えばバイアル、チューブなどに入れられた区分されたキャリア手段を、さらに含み得る。これらの容器手段それぞれは、本方法において使用されるための分離エレメントの１つを含む。例えば、容器手段の１つは、検出可能に標識されているかまたは検出可能に標識され得るプローブを含み得る。このようなプローブは、薬理ゲノミクスバイオマーカーに特異的なポリヌクレオチドであってもよい。このキットが、標的核酸を検出するために核酸ハイブリダイゼーションを使用する場合、キットは、標的核酸配列の増幅のためのヌクレオチド（複数可）を含む容器、および／またはレポーター分子（例えば、酵素標識、蛍光標識または放射性同位体標識）に結合したレポーター手段（例えば、アビジンもしくはストレプトアビジンのようなビオチン結合タンパク質）を含む容器をも、有し得る。

【0103】

本発明のキットは、典型的には、上述の容器および市場および使用者の視点から望ましい材料（バッファ、希釈剤、フィラー、針、シリンジおよび使用のための指示を有するパッケージ挿入物が挙げられる）を含む１つまたは複数の他の容器を含む。ラベルが、この組成物が特定の治療または非治療的用途に使用されることを示すために、容器上に存在し得、さらに、上述のものなどのｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの使用のいずれかのための指示を示し得る。

【0104】

このキットは、組織試料または細胞試料を調製するためのおよびこの試料から核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）を調製するための指示および材料のセットを、さらに含み得る。

【0105】

本発明は、本発明の方法の実施における使用のために好適な、キットにおいて使用され得る種々の組成物を提供する。例えば、本発明は、このような方法において使用され得る表面、例えばアレイを提供する。いくつかの実施形態では、本発明のアレイは、本発明の薬理ゲノミクスバイオマーカーを検出するために有用な個々の核酸分子または核酸分子の集合を含む。例えば、本発明のアレイは、標的核酸を含む試料にハイブリダイズ可能な別々に配置される一連の個々の核酸オリゴヌクレオチドまたは核酸オリゴヌクレオチド組み合わせのセットを含み得、それにより、かかるハイブリダイゼーションが、本発明の薬理ゲノミクスバイオマーカーのジェノタイプを表示する。

【0106】

核酸を固体基板、例えばスライドガラスに付着させるためのいくつかの技術は、当該分野で周知である。１つの方法は、固体基板への付着が可能な部分、例えばアミン基、アミン基または正電荷を有する別の基の誘導体を含む修飾塩基またはアナログを、合成された核酸分子内へ組み込むことである。次いで、合成された生成物は、固体基板、例えばアルデヒドまたは増幅された生成物上の反応基と共有結合を形成する別の反応基でコーティングされたスライドガラスに接触し、スライドガラスに共有結合する。他の方法、例えば、アミノプロプリルシリカ表面化学を用いる方法もまた、当該分野で公知であり、ｃｍｔ．ｃｏｒｎｉｎｇ．ｃｏｍおよびｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｂｒｏｗｎ１のワールドワイドウェブにて開示されるとおりである。

【0107】

後に反応基に変換され得るオリゴヌクレオチドへの基の付着もまた、当該分野で公知の方法を用いて可能である。ヌクレオチドへのオリゴヌクレオチドの任意の付着は、オリゴヌクレオチドの一部になり、次いで、このものは、マイクロアレイの固体表面に付着し得る。増幅された核酸は、使用される技術が必要とするか、かつ／または許容するように、固体基板への付着の前または後に、断片への切断を介するかまたは検出可能標識の付着によるなどしてさらに修飾され得る。

【0108】

本発明は、生体医学分野で広く適用され得、最新の薬物開発および個別化医療という新たな分野に多くの主要な進歩をもたらす。これらの利点は、臨床開発において薬物のためのバイオマーカーを同定するために必要な時間を短縮し、費用を切り詰めること、調査した薬物についての成功の機会を劇的に増大すること、臨床試験における患者の層別化なしでは放棄されていたであろう薬物を救出することが挙げられるが、これらに限定されない。

【0109】

Ｉ．コンピューター読み取り可能媒体
なお別の態様では、ａ）最適以下のゲノムＤＮＡ試料の配列情報を受け取る工程と、ｂ）上記配列情報に基づき、組み入れ基準を最適化する工程と、ｃ）上記配列情報および最適化した上記組み入れ基準に基づいてジェノタイプを計算する工程とを含む、上記最適以下のゲノムＤＮＡ試料を用いたジェノタイピング方法についての複数の指示を含むコンピューター読み取り可能媒体が本明細書中で提供される。

【0110】

また、組み入れ基準を最適化する工程を含む、最適以下のゲノムＤＮＡ試料を用いるジェノタイピング方法も、本明細書中で提供される。いくつかの実施形態では、最適化を複数回繰り返して、試料を含めかつ／または除外することができる。いくつかの実施形態では、最適な組み入れ基準が、同定され得る。いくつかの実施形態では、ジェノタイピングデータは、ゲノムワイドなジェノタイプコーリングアルゴリズムおよび／または検証ジェノタイプコーリングアルゴリズムを用いることによって得ることができる。いくつかの実施形態では、組み入れ基準は、ジェノタイプコーリングアルゴリズムのコール率カットオフ値であってもよい。いくつかの実施形態では、ジェノタイプコールは、高品質ゲノムＤＮＡの全ゲノムジェノタイピングのために使用される典型的なコール率カットオフよりも低いコール率カットオフを用いることによって作製され得、ここで、使用されるコール率カットオフ値は、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％であり得る。いくつかの実施形態では、ジェノタイピングデータは、複数のジェノタイピングプラットホームを用いることによって得ることができる。いくつかの実施形態では、複数のジェノタイピングプラットホームからのジェノタイピングデータは、最適化のために比較され得る。

【0111】

さらに、最適以下のゲノムＤＮＡ試料を用いるジェノタイピング方法を用いる、アソシエーション解析を実施する方法が提供され、この方法は、組み入れ基準を最適化する工程を含む。いくつかの実施形態では、アソシエーション解析は、最適化のために複数回繰り返され得る。

【実施例】

【0112】

以下の実施例は、説明のために提供されるが、本発明を限定するものではない。

【0113】

（実施例１）
臨床試験由来の保存された血漿試料を用いた薬理ゲノミクスバイオマーカーの遡及的ｄｅ ｎｏｖｏ同定
患者。この臨床試験に登録され、薬物によって処置される患者の中で、４００人の個人からの血漿試料を利用可能である。症例は、この薬物処置から陽性の応答をした者と定義され、対照は、この薬物処置から応答しなかったかまたは陰性の応答をした者である。研究の前に、患者の確認および個々を同定可能な情報は除き、患者のアイデンティティを保護するために、全ての試料を、第三者によって再標識した。

【0114】

ＤＮＡ調製。ＤＮＡは、血漿試料から、いくらかの修正を加えたＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｖｉｒｕｓ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（バレンシア、ＣＡ、ＵＳＡ）によって抽出する。簡潔には、１ｍｌの血漿を短時間ボルテックスし、そして３０μｇのｔＲＮＡと完全に混合する。この混合物を、２００μｌのアリコートに分配し、これを、１時間インキュベートした後、溶解緩衝液を添加した。次いで、溶解物を、９６℃で５分間煮沸し、各アリコートを、同じカラムを通して濾過する。ＤＮＡは、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）中に溶出し、真空乾燥させ、滅菌水中に溶解する。多くの場合、血漿から抽出されたゲノムＤＮＡの品質は、その後のジェノタイピングのためには低すぎて不適当であり、次に、ＤＮＡ試料を、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ピスカタウェイ、ＮＪ、ＵＳＡ）を用いて増幅する。

【0115】

ＳＮＰジェノタイピングおよびデータ分析。第Ｉ段階（図１）において、１５０の試料（７５件の症例および７５件の対照）を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ標準的プロトコール（サンタクララ、ＣＡ、ＵＳＡ）にしたがう５００，０００のＳＮＰを含むＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ ５００Ｋ Ｍａｐｐｉｎｇ Ａｒｒａｙ Ｓｅｔを用いてジェノタイピングする。血漿試料からおよびジェノタイピング前に適用された全ゲノム増幅から得られた最適以下のゲノムＤＮＡの品質に起因して、試料のいくつかからのコール率は、高品質ゲノムＤＮＡを用いた場合の典型的なコール率（９５％を超える）よりも実質的に低い可能性がある。したがって、カットオフコール率は、できる限り多くの試料を含めるために、従来の標準よりも有意に低く調整される。ジェノタイプコーリングアルゴリズムのコール率カットオフ値の調整および調整されたコール率カットオフ値に基づくジェノタイプコールの作製を複数回繰り返して、試料を含めかつ／または除外する最適基準を同定する（図２）。最適なカットオフ基準よりも低いコール率を有する試料の除去後、遺伝子データ分析ソフトウェアＰＬＩＮＫ（Ｐｕｒｃｅｌｌら、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ（２００７年）８１巻、５５９〜５７５２頁）を用いてジェノタイプ結果を分析し、関連の表現型との各多型遺伝子座の関連ｐ値を計算する。多型遺伝子座を、関連の表現型に対する関連の計算値によって並べる。２００の最も有意に関連するＳＮＰを、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ ｉＰＬＥＸアッセイ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ、サンディエゴ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて第ＩＩ段階研究のために選択する。これらのアッセイを、臨床試験からの４００のＤＮＡ試料の全てをジェノタイピングするために使用する。この中で、第Ｉ段階で使用される１５０の試料を、検証群として選択し、他の２５０の試料を、反復群として使用する（図１）。最終ジェノタイプコールを、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ Ｔｙｐｅｒ ｓｕｉｔｅ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ、サンディエゴ、ＣＡ、ＵＳＡ）からのＳｅｑｕｅｎｏｍ Ｔｙｐｅｒ Ａｎａｌｙｚｅｒによって作製する。検証群からのジェノタイピングした結果を、第Ｉ段階で得られた結果と比較する。試料のいくつかからのコール率は、高品質ゲノムＤＮＡを用いた場合の典型的なコール率（９５％を超える）よりも実質的に低い可能性があり、カットオフコール率を複数回調整して、試料を含めかつ／または除外する。最適なカットオフ基準よりも低いコール率を有する試料および２つの段階の間であまりに多くの不一致がある試料を除去した後（図３）、関連の表現型との各ＳＮＰの関連ｐ値を、ＰＬＩＮＫプログラムを用いて計算することによって、アソシエーション解析を実施する。この計算は、アレル頻度および／またはジェノタイプベースの試験に基づき得、関連の表現型は、分類形質、定量的形質または別の関連の表現型であってもよい。薬物応答に対する有意な関連を示す薬理ゲノミクスバイオマーカーが同定され、これらの薬理ゲノミクスバイオマーカーは、１つまたは複数のＳＮＰを含み得る。同定された複数の薬理ゲノミクスバイオマーカーは、ゲノム上で互いに近接して配置され得、遺伝子のイントロン／エキソン、遺伝子間領域、またはゲノム上の公知でない遺伝子を含む領域に配置し得る。分類アルゴリズム、例えばサポートベクターマシン（ＳＶＭ）およびロジスティック回帰は、データセットに適用されて、最適なバイオマーカーおよびスコアリングアルゴリズムを同定し得、したがって、薬物処置に対する患者の応答は、適切に予測され得る。

【0116】

上記の実施例は、説明目的でのみ含まれ、本発明の範囲を限定することを意図しない。上で記載されたものに対する多くの改変が可能である。上で記載された実施例に対する変更および改変は当業者に明らかであり、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ、限定されることが意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【外国語明細書】

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