特開 2018-151384 免疫測定用試薬、免疫測定用キット及び免疫測定方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2018-151384(P2018-151384A)

(43)【公開日】2018年9月27日

(54)【発明の名称】免疫測定用試薬、免疫測定用キット及び免疫測定方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/543 20060101AFI20180831BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/543 541A

【審査請求】未請求

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2018-39289(P2018-39289)

(22)【出願日】2018年3月6日

(31)【優先権主張番号】特願2017-46979(P2017-46979)

(32)【優先日】2017年3月13日

(33)【優先権主張国】JP

(71)【出願人】

【識別番号】000002288

【氏名又は名称】三洋化成工業株式会社

(72)【発明者】

【氏名】北川 隆啓

(57)【要約】      （修正有）

【課題】磁力で粒子を回収した際に起こる粒子同士の凝集を抑制し、高感度かつ再現性に優れた免疫測定用試薬、免疫測定用キット及び免疫測定方法を提供する。
【解決手段】抗原及び抗体のいずれも固定化されていない磁性粒子（Ａ）及び抗原又は抗体が固定化されてなる磁性粒子（Ｂ）からなる磁性粒子組成物（Ｃ）を含有する免疫測定用試薬であって、磁性粒子（Ａ）の体積平均粒子径（ｄ_A）と磁性粒子（Ｂ）の体積平均粒子径（ｄ_B）とが下記数式（１）の関係を満たし、磁性粒子組成物（Ｃ）中の磁性粒子（Ｂ）の含有量が磁性粒子組成物（Ｃ）の重量を基準として５〜８０重量％である免疫測定用試薬。０．８≦ｄ_A／ｄ_B≦１．２（１）
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗原及び抗体のいずれも固定化されていない磁性粒子（Ａ）及び抗原又は抗体が固定化されてなる磁性粒子（Ｂ）からなる磁性粒子組成物（Ｃ）を含有する免疫測定用試薬であって、磁性粒子（Ａ）の体積平均粒子径（ｄ_A）と磁性粒子（Ｂ）の体積平均粒子径（ｄ_B）とが下記数式（１）の関係を満たし、磁性粒子組成物（Ｃ）中の磁性粒子（Ｂ）の含有量が磁性粒子組成物（Ｃ）の重量を基準として５〜８０重量％である免疫測定用試薬。
０．８≦ｄ_A／ｄ_B≦１．２ （１）

【請求項2】

磁性粒子（Ａ）の粒度分布の変動係数（ｃ_A）、磁性粒子（Ｂ）の粒度分布の変動係数（ｃ_B）及び磁性粒子組成物（Ｃ）の粒度分布の変動係数（ｃ_C）が下記数式（２）及び（３）の関係を満たすものである請求項１に記載の免疫測定用試薬。
ｃ_B≦ｃ_A （２）
ｃ_C≦ｃ_A （３）

【請求項3】

磁性粒子（Ａ）が、体積平均粒子径が１〜２０ｎｍの超常磁性金属酸化物（Ｄ）を６０〜９５重量％含有する磁性シリカ粒子である請求項１又は２に記載の免疫測定用試薬。

【請求項4】

磁性粒子組成物（Ｃ）の体積平均粒子径が０．５〜１０μｍである請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫測定用試薬。

【請求項5】

請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫測定用試薬を含む免疫測定用キット。

【請求項6】

請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫測定用試薬を用いる免疫測定方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、免疫測定用試薬、免疫測定用キット及び免疫測定方法に関する。

【背景技術】

【0002】

従来、生体物質を含有する試料、例えば生体サンプル中のタンパク質等を測定又は精製する方法としてタンパク質が結合し得る粒子表面に生体サンプル中のタンパク質等を結合させ、生体サンプル中の目的タンパク質等以外の不純物を除くために、粒子を洗浄しタンパク質等が結合した粒子を回収して、タンパク質の結合量を測定する方法やタンパク質解離溶液中に解離させて精製する方法が知られている。

【0003】

また、磁力によって容易に分離、回収が可能であることから、磁性を有する粒子が用いられており、例えば特許文献１には、酸化鉄からなる芯粒子の表面にシリカの被膜が形成されてなる磁性シリカ粒子が記載されている。しかし、この磁性粒子は、磁性体が強磁性であり、回収時の磁場を取り除いても強磁性により磁性体自身が一時的な磁場を示し粒子同士が自己会合し、洗浄性が悪く、次の操作（例えば、免疫反応）に悪影響を及ぼすという問題がある。

【0004】

更に、強磁性による磁性体自身の自己会合を解決する目的で、例えば、特許文献２には、磁性体に超常磁性である磁性体を用いた磁性シリカ粒子が開示されている。しかし、この磁性粒子は、粒子径が小さい場合は、磁性体の含有量が低く、磁力で粒子を回収する際に時間がかかり、粒子径が大きい場合は、比表面積が小さいために、結合するタンパク質等の量が少ないという問題がある。

【0005】

そのため、粒子径が小さい場合でも迅速に磁力で粒子を回収することを目的として、特許文献３には、超常磁性である磁性体の含有率を高めた磁性シリカ粒子が開示されている。しかしながら、得られた磁性粒子は、粒子の表面に結合した抗体や抗原により磁力で粒子を回収した際に粒子同士が凝集し、その結果再び分散させることが困難となることがあり、免疫測定用試薬として用いた場合の再現性は十分満足のいくものではない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開２０００−２５６３８８号公報

【特許文献2】特開２０００−４０６０８号公報

【特許文献3】国際公開第２０１２／１７３００２パンフレット

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の目的は、磁力で粒子を回収した際に起こる粒子同士の凝集を抑制し、高感度かつ再現性に優れた免疫測定用試薬、免疫測定用キット及び免疫測定方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者は、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は、抗原及び抗体のいずれも固定化されていない磁性粒子（Ａ）及び抗原又は抗体が固定化されてなる磁性粒子（Ｂ）からなる磁性粒子組成物（Ｃ）を含有する免疫測定用試薬であって、磁性粒子（Ａ）の体積平均粒子径（ｄ_A）と磁性粒子（Ｂ）の体積平均粒子径（ｄ_B）とが下記数式（１）の関係を満たし、磁性粒子組成物（Ｃ）中の磁性粒子（Ｂ）の含有量が磁性粒子組成物（Ｃ）の重量を基準として５〜８０重量％である免疫測定用試薬；前記免疫測定用試薬を含む免疫測定用キット；前記免疫測定用試薬を用いる免疫測定方法である。
０．８≦ｄ_A／ｄ_B≦１．２ （１）

【発明の効果】

【0009】

本発明の免疫測定用試薬及び免疫測定用キットを用いれば、高感度かつ再現性高く測定対象物質を測定することができる。また、本発明の免疫測定方法は高感度かつ再現性が高い。

【発明を実施するための形態】

【0010】

＜免疫測定用試薬＞
本発明の免疫測定用試薬は、抗原及び抗体のいずれも固定化されていない磁性粒子（Ａ）及び抗原又は抗体が固定化されてなる磁性粒子（Ｂ）からなる磁性粒子組成物（Ｃ）を含有する免疫測定用試薬であって、磁性粒子（Ａ）の体積平均粒子径（ｄ_A）と磁性粒子（Ｂ）の体積平均粒子径（ｄ_B）とが下記数式（１）の関係を満たし、磁性粒子組成物（Ｃ）中の磁性粒子（Ｂ）の含有量が磁性粒子組成物（Ｃ）の重量を基準として５〜８０重量％である免疫測定用試薬である。
０．８≦ｄ_A／ｄ_B≦１．２ （１）
本発明においては、抗原又は抗体が固定化されていない磁性粒子（Ａ）及び抗原又は抗体が固定化されている磁性粒子（Ｂ）の体積平均粒子径が上記数式（１）を満たすことにより、高感度かつ再現性高く測定対象物質を測定することができる。

【0011】

磁性粒子（Ａ）は、一般的に免疫測定の分野で用いられるものであれば特に限定はされないが、免疫測定における測定時間の短時間化の観点から、例えば特開２０１４−２１０６８０号公報及び特開２０１３−０１９８８９号公報等に記載の公知の磁性シリカ粒子が好ましい。

【0012】

磁性シリカ粒子としては、免疫測定において測定時間の短時間化の観点から、体積平均粒子径が１〜２０ｎｍの超常磁性金属酸化物（Ｄ）を６０〜９５重量％含有する磁性シリカ粒子であることが好ましい。具体的には、シリカのマトリックス中に体積平均粒子径が１〜２０ｎｍで超常磁性を有する超常磁性金属酸化物（Ｄ）が分散されているものが好ましい。超常磁性とは、外部磁場の存在下で物質の個々の原子磁気モーメントが整列し誘発された一時的な磁場を示し、外部磁場を取り除くと、部分的な整列が損なわれ磁場を示さなくなることをいう。
尚、本発明における金属酸化物の体積平均粒子径は、任意の２００個の粒子について走査型電子顕微鏡（日本電子株式会社製「ＪＳＭ−７０００Ｆ」）で観察して測定された粒子径の平均値である。

【0013】

体積平均粒子径が１〜２０ｎｍで超常磁性を示す超常磁性金属酸化物（Ｄ）としては、鉄、コバルト、ニッケル及びこれらの合金等の酸化物が挙げられるが、磁界に対する感応性が優れていることから、酸化鉄が特に好ましい。超常磁性金属酸化物（Ｄ）は、１種を単独で用いても２種以上を併用してもよい。

【0014】

磁性シリカ粒子中の超常磁性金属酸化物（Ｄ）の含有量の下限は、磁性シリカ粒子の重量を基準として、６０重量％が好ましく、更に好ましくは６５重量％であり、上限は９５重量％が好ましく、更に好ましくは８５重量％である。
超常磁性金属酸化物（Ｄ）の含有量が６０重量％以上であると、得られた磁性シリカ粒子の磁性が十分であるため、実際の用途面における分離操作に時間がかからない。９５重量％以下のものは合成が容易である。

【0015】

磁性粒子（Ｂ）は、上記磁性粒子（Ａ）と同様の磁性粒子の表面に抗原又は抗体を固定化した磁性粒子である。磁性粒子（Ｂ）に用いる磁性粒子は、（Ｂ）と共に用いて磁性粒子組成物（Ｃ）を構成する磁性粒子（Ａ）と同一のものでも異なるものでもよいが、感度及び再現性の観点から同一のものを用いることが好ましい。

【0016】

本発明における抗原としては、一般的に免疫測定の分野で用いられるものであれば特に限定はされず、血清，血液，血漿，尿等の生体体液、リンパ液、血球、各種細胞類等の生体由来の試料中に含まれるヌクレオチド鎖（オリゴヌクレオチド鎖、ポリヌクレオチド鎖）；染色体；核酸（デオキシリボ核酸（ＤＮＡ），リボ核酸（ＲＮＡ）等）；ペプチド鎖（例えばＣ−ペプチド、アンジオテンシンＩ等）；タンパク質〔例えばプロカルシトニン、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）、β２−ミクログロブリン、アルブミン、ヘモグロビン、ミオグロビン、トランスフェリン、プロテインＡ、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）、フェリチン、トロポニンＴ（ＴｎＴ）、ヒト脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｎ端フラグメント（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）、これらの分解産物〕；血液凝固関連因子（例えばフィブリノーゲン、フィブリン分解産物、プロトロンビン、トロンビン等）；酵素〔例えばアミラーゼ（例えば膵型、唾液腺型、Ｘ型等）、アルカリホスファターゼ（例えば肝性、骨性、胎盤性、小腸性等）、酸性ホスファターゼ（例えばＰＡＰ等）、γ−グルタミルトランスファラーゼ（例えば腎性、膵性、肝性等）、リパーゼ（例えば膵型、胃型等）、クレアチンキナーゼ（例えばＣＫ−１、ＣＫ−２、ｍＣＫ等）、乳酸脱水素酵素（例えばＬＤＨ１〜ＬＤＨ５等）、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（例えばＡＳＴｍ、ＡＳＴｓ等）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（例えばＡＬＴｍ、ＡＬＴｓ等）、コリンエステラーゼ（例えばＣｈＥ１〜ＣｈＥ５等）、ロイシンアミノペプチダーゼ（例えばＣ−ＬＡＰ、ＡＡ、ＣＡＰ等）、レニン、プロテインキナーゼ、チロシンキナーゼ等〕及びこれら酵素のインヒビター；ホルモン（例えばＰＴＨ、ＴＳＨ、インシュリン、ＬＨ、ＦＳＨ、エストラジオール、プロラクチン等）；レセプター（例えばエストロゲン、ＴＳＨ等に対するレセプター）；リガンド（例えばエストロゲン、ＴＳＨ等）；細菌（例えば結核菌、肺炎球菌、ジフテリア菌、髄膜炎菌、淋菌、ブドウ球菌、レンサ球菌、腸内細菌、大腸菌、ヘリコバクター・ピロリ等）；ウイルス（例えばルベラウイルス、ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス、ＡＴＬウイルス、ＡＩＤＳウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、ポリオウイルス、ＥＢウイルス、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ等）；真菌（例えばカンジダ、クリプトコッカス等）；スピロヘータ（例えばレプトスピラ、梅毒トレポネーマ等）；クラミジア、マイコプラズマ等の微生物；当該微生物に由来するタンパク質又はペプチド或いは糖鎖抗原；気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎等のアレルギーの原因となる各種アレルゲン（例えばハウスダスト、例えばコナヒョウダニ、ヤケヒョウダニ等のダニ類、例えばスギ、ヒノキ、スズメノヒエ、ブタクサ、オオアワガエリ、ハルガヤ、ライムギ等の花粉、例えばネコ、イヌ、カニ等の動物、例えば米、卵白等の食物、真菌、昆虫、木材、薬剤、化学物質等に由来するアレルゲン等）；脂質（例えばリポタンパク質等）；プロテアーゼ（例えばトリプシン、プラスミン、セリンプロテアーゼ等）；腫瘍マーカータンパク抗原（例えばＰＳＡ、ＰＧＩ、ＰＧＩＩ等）；糖鎖抗原〔例えばＡＦＰ（例えばＬ１からＬ３等）、ｈＣＧ（ｈＣＧファミリー）、トランスフェリン、ＩｇＧ、サイログロブリン、Ｄｅｃａｙ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ−ｆａｃｔｏｒ（ＤＡＦ）、癌胎児性抗原（例えばＣＥＡ、ＮＣＡ、ＮＣＡ−２、ＮＦＡ等）、ＣＡ１９−９、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、ＣＡ１２５、前立腺特異抗原、癌細胞が産生する特殊な糖鎖を有する腫瘍マーカー糖鎖抗原、ＡＢＯ糖鎖抗原等〕；糖鎖（例えばヒアルロン酸、β−グルカン、上記糖鎖抗原等が有する糖鎖等）；糖鎖に結合するタンパク質（例えばヒアルロン酸結合タンパク、βグルカン結合タンパク等）；リン脂質（例えばカルジオリピン等）；リポ多糖（例えばエンドトキシン等）；化学物質（例えばＴ３、Ｔ４、ＦＴ３、ＦＴ４、トリブチルスズ、ノニルフェノール、４−オクチルフェノール、フタル酸ジ−ｎ−ブチル、フタル酸ジシクロヘキシル、ベンゾフェノン、オクタクロロスチレン、フタル酸ジ−２−エチルヘキシル等の環境ホルモン）；人体に投与・接種される各種薬剤及びこれらの代謝物；アプタマー；核酸結合性物質等が挙げられる。

【0017】

本発明において、抗体としては、一般的に免疫測定の分野で用いられるものであれば特に限定はされず、具体的には、抗原（Ａ）として例示したものに対する抗体が挙げられる。尚、本発明において用いられる抗体には、パパインやペプシン等の蛋白質分解酵素、或いは化学的分解により生じるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント等の分解産物も包含される。

【0018】

本発明における磁性粒子（Ｂ）において、磁性粒子（Ａ）の表面に抗原又は抗体を固定化する方法としては、上述の磁性粒子（Ａ）に、抗原又は抗体を物理吸着させる方法等が挙げられるが、より効率良く測定対象物質等、具体的には、抗原又は抗体を固定化させる観点から、グルタルアルデヒド、アルブミン、カルボジイミド、ストレプトアビジン、ビオチン及び官能基を有するアルキルアルコキシシランからなる群から選ばれる少なくとも１種の有機化合物を磁性粒子（Ａ）の表面に結合させ、それらを介して、抗原又は抗体を磁性粒子（Ａ）に固定化させることが好ましく、更に好ましいのは官能基を有するアルキルアルコキシシランを介して固定化させることである。
このような官能基を有するアルキルアルコキシシランとしては、ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリエトキシシラン、２−（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、ｐ−スチリルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−２−（アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−２−（アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−トリエトキシシリル−Ｎ−（１，３−ジメチル−ブチリデン）プロピルアミン、Ｎ−フェニル−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、トリス−（トリメトキシシリルプロピル）イソシアヌレート、３−ウレイドプロピルトリアルコキシシラン、３−メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン及び３−イソシアネートプロピルトリエトキシシラン等が挙げられる。

【0019】

本発明において、磁性粒子（Ａ）には抗原又は抗体は固定化されていない。

【0020】

本発明の免疫測定用試薬は、磁性粒子（Ａ）の体積平均粒子径（ｄ_A）と磁性粒子（Ｂ）の体積平均粒子径（ｄ_B）とが下記数式（１）の関係を満たすものである。
０．８≦ｄ_A／ｄ_B≦１．２ （１）
ｄ_A／ｄ_Bが０．８以上、かつ１．２以下である場合、試薬として用いた場合の再現性がよくなる。再現性の観点から、ｄ_A／ｄ_Bの上限は１．０であることが好ましく、下限は０．９であることが好ましい。尚、体積平均粒子径は、例えば、分級する等により調整することができる。
磁性粒子（Ａ）及び（Ｂ）の体積平均粒子径（ｄ_A）及び（ｄ_B）は、下記測定方法により測定される値である。
＜体積平均粒子径の測定方法＞
本発明における体積平均粒子径は、例えばレーザー回折・散乱式粒子径分布測定装置（マイクロトラック・ベル株式会社製「マイクロトラックＭＴ３３００」）で測定して得られる体積平均粒子径である。

【0021】

磁性粒子組成物（Ｃ）の体積平均粒子径は、０．５〜１０μｍが好ましく、更に好ましくは１〜５μｍである。磁性粒子組成物（Ｃ）の平均粒子径が０．５μｍ未満の場合、分離回収の際の時間がかかる傾向にあり、２０μｍを超えると、比表面積が小さくなり、担持する物質（抗原又は抗体）の結合量が低く結合効率が低下する傾向にある。

【0022】

本発明において、磁性粒子（Ａ）の粒度分布の変動係数（ｃ_A）、磁性粒子（Ｂ）の粒度分布の変動係数（ｃ_B）及び磁性粒子組成物（Ｃ）の粒度分布の変動係数（ｃ_C）は、感度及び再現性の観点から、下記数式（２）及び（３）の関係を満たすものであることが好ましい。
ｃ_B≦ｃ_A （２）
ｃ_C≦ｃ_A （３）
変動係数（ｃ_A）、（ｃ_B）及び（ｃ_C）は、下記測定方法により測定される値である。
＜変動係数の測定方法＞
本発明における変動係数ｃは、例えばレーザー回折・散乱式粒子径分布測定装置（マイクロトラック・ベル株式会社製「マイクロトラックＭＴ３３００」）で測定して得られる体積平均粒子径（ｄ）と標準偏差（ＳＤ）とを数式（４）に当てはめることにより得られる値である。
変動係数（ｃ）＝ＳＤ／ｄ×１００ （４）

【0023】

磁性粒子（Ａ）と変動係数が同一か小さい磁性粒子（Ｂ）を用いることにより、数式（２）を満たすことができる。磁性粒子（Ｂ）を製造する際に、混合する磁性粒子（Ａ）と同一のもの、即ち、組成、体積平均粒子径及び変動係数等が（Ａ）と同じ磁性粒子に抗原又は抗体を固定化する場合、磁性粒子（Ｂ）を分級してその変動係数を調整することができる。

【0024】

また、磁性粒子（Ａ）とは異なる体積平均粒子径ｄ_Bや変動係数ｃ_Bを有する磁性粒子（Ｂ）を用いる場合、（Ｃ）を分級して数式（３）を満たすように調整することができる。

【0025】

本発明において、磁性粒子組成物（Ｃ）中の（Ｂ）の含有量は、（Ｃ）の重量を基準として５〜８０重量％であり、感度及び再現性の観点から１０〜５０重量％が更に好ましい。

【0026】

本発明の免疫測定用試薬は、磁性粒子組成物（Ｃ）以外に水性溶媒［水、生理食塩水、各種緩衝液（リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液及びＴｒｉｓ緩衝液等）、アルブミン溶液、デキストラン溶液、正常ヒト又は動物血清溶液及び合成高分子溶液並びにこれらの２種以上の混合溶液等］等を含有することができる。

【0027】

免疫測定用試薬中の磁性粒子組成物（Ｃ）の含有量は、感度及び再現性の観点から、免疫測定用試薬の重量を基準として、０．００１〜１０重量％が好ましく、更に好ましくは０．０１〜３重量％である。

【0028】

免疫測定用試薬中には、上記以外に、免疫反応を妨げない範囲で、その他の成分｛糖類（グルコース、シュークロース等）、無機塩（塩化ナトリウム等）、（Ａ）以外の界面活性剤（モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン等）、防腐剤（アジ化ナトリウム等）及び非特異反応防止剤等（正常動物由来のＩｇＧ抗体等）からなる群より選ばれる少なくとも１種等｝を含有させてもよい。
免疫測定用試薬中に糖類、無機塩、界面活性剤、防腐剤及び非特異反応防止剤を含む場合、それぞれの含有量は、免疫測定用試薬の重量を基準として、糖類の含有量は０．１〜１０重量％、無機塩の含有量は０．０１〜５重量％、界面活性剤の含有量は０．０２〜５重量％、防腐剤の含有量は０．００１〜０．１重量％、非特異反応防止剤の含有量は０．００１〜５重量％が好ましい。

【0029】

本発明の免疫測定用試薬は、免疫測定における固相担体試薬として用いることができる。

【0030】

＜免疫測定用キット＞
本発明の免疫測定用キットは、上記免疫測定用試薬を含む免疫測定用キットである。
具体的には、上記本発明の免疫測定用試薬を固相担体試薬として含む免疫測定用キットが含まれる。また、本発明の免疫測定用キットには、本発明の免疫測定用試薬以外に、標識試薬（Ｆ）、化学発光試薬（Ｉ）、標準試薬（濃度既知の測定対象物溶液等）、希釈用試薬（高濃度検体の希釈用試薬等）、洗浄試薬（反応容器の洗浄用試薬等）等を含んでもよく、更に取り扱い説明書、測定に必要な治具等（例えば検体容器等）を含んでもよい。

【0031】

標識試薬（Ｆ）は、標識物質により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ１）、標識物質により標識された測定対象物質（Ｆ２）又は標識物質により標識された測定対象物質の類似物質（Ｆ３）を含有する。

【0032】

標識物質により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ１）、標識物質により標識された測定対象物質（Ｆ２）及び標識物質により標識された測定対象物質の類似物質（Ｆ３）における標識物質は、測定対象物質と特異的に結合する物質、測定対象物質又は測定対象物質の類似物質を標識するために用いられるものであり、例えば酵素免疫測定法（ＥＩＡ）において用いられるアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ（以下、ＰＯＤと略記することがある）、マイクロペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ルシフェラーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼ等の酵素類、例えば放射免疫測定法（ＲＩＡ）において用いられる９９ｍＴｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、１４Ｃ、３Ｈ、３２Ｐ等の放射性同位元素、例えば蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）において用いられるフルオレセイン、ダンシル、フルオレスカミン、クマリン、ナフチルアミン又はこれらの誘導体、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光性物質、例えばルシフェリン、イソルミノール、ルミノール、ビス（２，４，６−トリフロロフェニル）オキザレート等の発光性物質、例えばフェノール、ナフトール、アントラセン又はこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、例えば４−アミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル、３−アミノ−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル、２，６−ジ−ｔ−ブチル−α−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−オキソ−２，５−シクロヘキサジエン−１−イリデン）−ｐ−トリオキシル等のオキシル基を有する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質等が挙げられる。
これらの内、感度等の観点から、酵素、蛍光性物質が好ましく、更に好ましいのはアルカリホスファターゼ、ＰＯＤ及びグルコースオキシダーゼであり、特に好ましいのはＰＯＤである。

【0033】

標識物質を、測定対象物質と特異的に結合する物質、測定対象物質又は測定対象物質の類似物質に結合させるには、一般的に免疫測定の分野で用いられる方法、例えば自体公知のＥＩＡ、ＲＩＡ或はＦＩＡ等において一般に行われている自体公知の標識方法［例えば、医化学実験講座、第８巻、山村雄一監修、第１版、中山書店、１９７１；図説 蛍光抗体、川生明著、第１版、（株）ソフトサイエンス社、１９８３；酵素免疫測定法、石川栄治、河合忠、室井潔編、第２版、医学書院、１９８２等］等を利用すればよい。

【0034】

標識物質の使用量は、用いる標識物質の種類により異なるため一概には言えないが、例えばＰＯＤを標識物質として使用する場合には、測定対象物質と特異的に結合する物質、測定対象物質又は測定対象物質の類似物質と標識物質とを、例えば好ましくは１：１〜２０（更に好ましくは１：１〜１０、特に好ましくは１：１〜２）のモル比となるように、緩衝液中に含有させて用いればよい。
緩衝液としては、一般的に免疫測定の分野で用いられている、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液及びグッド緩衝液等が挙げられ、そのｐＨは、抗原抗体反応を抑制しない範囲であればよく、５〜１０が好ましい。
また、このような緩衝液中には、目的の抗原抗体反応を阻害しないものであれば、例えばアルブミン、グロブリン、水溶性ゼラチン、ポリエチレングリコール等の安定化剤、界面活性剤及び糖類等を含有させておいてもよい。

【0035】

標識物質により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ１）、標識物質により標識された測定対象物質（Ｆ２）及び標識物質により標識された測定対象物質の類似物質（Ｆ３）における測定対象物質、測定対象物質と特異的に結合する物質及び測定対象物質の類似物質については、それぞれ後述のものが挙げられる。

【0036】

標識試薬（Ｆ）中の標識物質により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ１）、標識物質により標識された測定対象物質（Ｆ２）及び標識物質により標識された測定対象物質の類似物質（Ｆ３）の含有量は、感度の観点から、０．０１〜４０μｇ／ｍＬが好ましく、更に好ましくは０．１〜２０μｇ／ｍＬである。

【0037】

標識試薬（Ｆ）中には、免疫反応を妨げない範囲で、その他の成分｛糖類（グルコース、シュークロース等）、無機塩（塩化ナトリウム等）、（Ａ）以外の界面活性剤（モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン等）、防腐剤（アジ化ナトリウム等）及び非特異反応防止剤等（正常動物由来のＩｇＧ抗体等）からなる群より選ばれる少なくとも１種等｝を含有させてもよい。
標識試薬（Ｆ）中糖類、無機塩、界面活性剤、防腐剤及び非特異反応防止剤を含む場合、それぞれの含有量は、（Ｆ）の重量に基づいて、糖類の含有量は０．１〜１０重量％、無機塩の含有量は０．０１〜５重量％、界面活性剤の含有量は０．０２〜５重量％、防腐剤の含有量は０．００１〜０．１重量％、非特異反応防止剤の含有量は０．００１〜５重量％が好ましい。

【0038】

標識複合体中の標識物質量の測定方法は用いた標識物質に基づいて選択され、例えば公知の化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、蛍光酵素免疫測定法（ＦＥＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、ラッテックス光学免疫測定法（ＬＰＩＡ）及びラッテックス粒子計数免疫凝集測定法（ＣＩＡ）等で用いられる方法に基づいて行うことができる。

【0039】

例えば、標識物質量の測定を化学発光法により行う場合、化学発光試薬（Ｇ）を用いる。
化学発光試薬（Ｇ）は、用いた標識物質に基づき選択され、例えば、標識物質がペルオキシダーゼである場合、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物及び化学発光増強剤を必須構成成分とする化学発光試薬第１液と、酸化剤及び水を必須構成成分とする化学発光試薬第２液とを含む。

【0040】

２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物としては、例えば、特開平２−２９１２９９号公報、特開平１０−３１９０１５号公報及び特開２０００−２７９１９６号公報等に記載の公知の２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物及びこれらの混合物等が使用できる。
これらの内、感度の観点から、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−アミノヘキシル−Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＨＥＩ）、Ｎ−アミノブチル−Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＢＥＩ）及びこれらの金属塩（アルカリ金属塩等）が好ましく、更に好ましいのはルミノール及びその金属塩、特に好ましいのはルミノールのナトリウム塩である。

【0041】

化学発光増強剤としては、例えば、特開昭５９−５００２５２号公報、特開昭５９−１７１８３９号公報及び特開平２−２９１２９９号公報等に記載の公知の化学発光増強剤及びこれらの混合物等が使用できる。これらの内、化学発光増強効果等の観点から、フェノールが好ましく、更に好ましいのはＰ−ヨードフェノール、４−（シアノメチルチオ）フェノール及び４−シアノメチルチオ−２−クロロフェノール、特に好ましいのは４−（シアノメチルチオ）フェノールである。

【0042】

化学発光試薬第１液は、水及び各種緩衝液（リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液及びＴｒｉｓ緩衝液等）を含有することができる。

【0043】

化学発光試薬第１液は、酵素の蛍光強度の観点からはアルカリ性であることが好ましく、第１液のｐＨは、７〜１１が好ましく、更に好ましくは８〜１０である。
尚、ｐＨは、ＪＩＳ Ｋ０４００−１２−１０：２０００に準拠して測定温度２５℃で測定される。

【0044】

化学発光試薬第２液が含有する酸化剤としては、例えば、特開平８−２６１９４３号公報及び特開２０００−２７９１９６号公報等に記載の公知の酸化剤等［無機の過酸化物（過酸化水素、過ホウ酸ナトリウム及び過ホウ酸カリウム等）、有機過酸化物（過酸化ジアルキル及び過酸化アシル等）、ペルオクソ酸化合物（ペルオクソ硫酸及びペルオクソリン酸等）等］が挙げられる。
これらの内、保存安定性等の観点から、過酸化水素、過ホウ酸ナトリウム及び過ホウ酸カリウムが好ましく、更に好ましいのは過酸化水素である。

【0045】

化学発光試薬（Ｉ）として、感度の観点から、ルミノール発光試薬（Ｉ１）及び過酸化水素液（Ｉ２）を含むことが好ましい。

【0046】

＜免疫測定方法＞
本発明の免疫測定方法は、上述の磁性粒子組成物（Ｃ）を含有する免疫測定用試薬を用いて試料中の測定対象物質を測定する免疫測定方法であり、磁性粒子（Ａ）、磁性粒子（Ｂ）及び磁性粒子組成物（Ｃ）として好ましいものは上記免疫測定用試薬と同様である。

【0047】

本発明の免疫測定方法は、磁性粒子組成物（Ｃ）を用いて、試料中の測定対象物質を測定する免疫測定方法であれば特に限定はないが、例えば、磁性粒子組成物（Ｃ）及び水性溶媒を含む溶液（Ｘ）中で行われるものが含まれる。
水性溶媒としては、水、生理食塩水、各種緩衝液（リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液及びＴｒｉｓ緩衝液等）、アルブミン溶液、デキストラン溶液、正常ヒト又は動物血清溶液及び合成高分子溶液並びにこれらの２種以上の混合溶液等が挙げられる。

【0048】

溶液（Ｘ）中の磁性粒子組成物（Ｃ）の含有量は、感度及び再現性の観点から、０．００１〜１０重量％が好ましく、更に好ましくは０．０１〜３重量％である。

【0049】

溶液（Ｘ）中には、磁性粒子組成物（Ｃ）以外に、免疫反応を妨げない範囲で、その他の成分｛糖類（グルコース、シュークロース等）、無機塩（塩化ナトリウム等）、（Ａ）以外の界面活性剤（モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン等）、防腐剤（アジ化ナトリウム等）及び非特異反応防止剤等（正常動物由来のＩｇＧ抗体等）からなる群より選ばれる少なくとも１種等｝を含有させてもよい。
溶液（Ｘ）中に糖類、無機塩、界面活性剤、防腐剤及び非特異反応防止剤を含む場合、それぞれの含有量は、溶液（Ｘ）の重量に基づいて、糖類の含有量は０．１〜１０重量％、無機塩の含有量は０．０１〜５重量％、界面活性剤の含有量は０．０２〜５重量％、防腐剤の含有量は０．００１〜０．１重量％、非特異反応防止剤の含有量は０．００１〜５重量％が好ましい。

【0050】

本発明における免疫反応の方法には、免疫測定の分野で一般的に行われる文献［例えば、酵素免疫測定法第２版（石川栄治ら編集、医学書院）１９８２年］記載のサンドイッチ法、競合法及び特開平６−１３００６３号公報記載の方法、具体的には以下の３種の方法が含まれる。

【0051】

＜第１の方法：サンドイッチ法＞
磁性粒子（Ｂ）（好ましくは磁性シリカ粒子）が、測定対象物質と特異的に結合する物質（測定対象物質結合物質）としての抗原又は抗体をその表面に固定化しているものであって、測定対象物質を含む試料（例えば生体試料）と、磁性粒子（Ｂ）と、標識物質により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（標識測定対象物質結合物質）（Ｆ１）とを接触させて、磁性粒子（Ｂ）上に測定対象物質結合物質としての抗原又は抗体と測定対象物質と標識測定対象物質結合物質（Ｆ１）との複合体（標識複合体）を形成させ、標識複合体を担持した磁性粒子（Ｂ）をＢ／Ｆ分離して、標識複合体中の標識物質量を測定し、その結果に基づいて試料中の測定対象物質を測定する。

【0052】

＜第２の方法：競合法１＞
磁性粒子（Ｂ）（好ましくは磁性シリカ粒子）が、測定対象物質又は測定対象物質の類似物質としての抗原又は抗体をその表面に固定化しているものであって、測定対象物質を含む試料（例えば生体試料）と、標識物質により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質（標識測定対象物質結合物質）（Ｆ１）と、磁性粒子（Ｂ）とを接触させて、標識測定対象物質結合物質（Ｆ１）に、磁性粒子（Ｂ）に固定化した抗原又は抗体と試料中の測定対象物質とを競合反応させ、磁性粒子（Ｂ）上に抗原又は抗体と標識測定対象物質結合物質（Ｆ１）との複合体（標識複合体）を形成させた後、標識複合体を担持した磁性粒子（Ｂ）をＢ／Ｆ分離して、標識複合体中の標識物質量を測定し、その結果に基づいて試料中の測定対象物質を測定する。

【0053】

＜第３の方法：競合法２＞
磁性粒子（Ｂ）（好ましくは磁性シリカ粒子）が、測定対象物質と特異的に結合する物質（測定対象物質結合物質）としての抗原又は抗体をその表面に固定化しているものであって、測定対象物質を含む試料（例えば生体試料）と、標識物質により標識された測定対象物質（Ｆ２）又は標識物質により標識された測定対象物質の類似物質（Ｆ３）［標識測定対象物質（Ｆ２）又はその類似物質（Ｆ３）］と、磁性粒子（Ｂ）とを接触させて、磁性粒子（Ｂ）に固定化した抗原又は抗体に、測定対象物質と標識測定対象物質（Ｆ２）又はその類似物質（Ｆ３）とを競合反応させ、磁性粒子（Ｂ）上に測定対象物質結合物質と標識測定対象物質（Ｆ２）又はその類似物質（Ｆ３）との複合体（標識複合体）を形成させた後、標識複合体を担持した磁性粒子（Ｂ）をＢ／Ｆ分離して、標識複合体中の標識物質量を測定し、その結果に基づいて試料中の測定対象物質を測定する。

【0054】

本発明における測定対象物質としては、上述の抗原と抗体が挙げられ、測定対象物質が抗原の場合は、その抗体を磁性粒子（Ｂ）に固定化し、測定対象物質が抗体の場合は、その抗原を磁性粒子（Ｂ）に固定化する。

【0055】

本発明における測定対象物質の類似物質（アナログ）としては、測定対象物質と特異的に結合する物質が有する測定対象物質との結合部位と結合し得るもの、言い換えれば、測定対象物質が有する測定対象物質と特異的に結合する物質との結合部位を有するもの、更に言い換えれば、測定対象物質と測定対象物質と特異的に結合する物質との反応時に共存させると測定対象物質と測定対象物質と特異的に結合する物質との反応と競合し得るものが挙げられる。

【0056】

本発明における測定対象物質と特異的に結合する物質は、測定対象物質が「抗原」であるときは「抗体」であり、測定対象物質が「抗体」であるときは「抗原」である。

【0057】

本発明の免疫測定方法は、磁性粒子組成物（Ｃ）を用いて、試料中の測定対象物質を測定する免疫測定方法であれば特に限定されず、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、蛍光酵素免疫測定法（ＦＥＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、ラッテックス光学免疫測定法（ＬＰＩＡ）及びラッテックス粒子計数免疫凝集測定法（ＣＩＡ）に用いられる検査の測定方法等に適用できる。

【実施例】

【0058】

以下、実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下において、部は重量部を示す。

【0059】

＜製造例１＞
［磁性シリカ粒子（Ａ１）の作製］
○超常磁性金属酸化物粒子の製造工程
反応容器に塩化鉄（ＩＩＩ）６水和物１８６部、塩化鉄（ＩＩ）４水和物６８部及び水１２８８部を仕込んで溶解させて５０℃に昇温し、撹拌下温度を５０〜５５℃の保持しながら、２５重量％アンモニア水２８０部を１時間かけて滴下し、水中にマグネタイト粒子を得た。得られたマグネタイト粒子に分散剤であるオレイン酸６４部を加え、２時間撹拌を継続した。室温に冷却後、デカンテーションにより固液分離して得られたオレイン酸が吸着したマグネタイト粒子を水１０００部で洗浄する操作を３回行い、更にアセトン１０００部で洗浄する操作を２回行い、４０℃で２日間乾燥させることで、体積平均粒子径が１５ｎｍの超常磁性金属酸化物粒子を得た。

【0060】

＜超常磁性金属酸化物粒子の体積平均粒子径の測定方法＞
走査型電子顕微鏡（型番ＪＳＭ−７０００Ｆ、メーカー名日本電子株式会社）を用いて、任意の２００個の超常磁性金属酸化物粒子［水中のマグネタイト粒子をデカンテーションにより固液分離し、水で洗浄後、乾燥して得られたもの。］を観察して粒子径を測定し、体積平均粒子径を求めた。

【0061】

○磁性シリカ粒子の合成
超常磁性金属酸化物粒子８０部をテトラエトキシシラン２４０部に加えて分散し、分散液（ａ１）を調製した。次に、反応容器に水５０５０部、２５重量％アンモニア水溶液３５００部、エマルミン２００（三洋化成工業（株）製）４００部を加えてクリアミックス（エムテクニック（株）製）を用いて混合し溶液（ａ２）を得た。５０℃に昇温後、クリアミックスを回転数６，０００ｒｐｍで攪拌しながら、上記分散液（ａ１）を溶液（ａ２）に１時間かけて滴下後、５０℃で１時間反応させた。反応後、２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して微粒子の存在する上清を除いた。

【0062】

○磁性シリカ粒子（Ａ１）の分級工程：
得られた固相に水５０００部を加えて粒子を分散させて２８００ｒｐｍで１分間遠心分離後、微粒子の存在する上清を除く操作を２０回（遠心分離工程１）行い、続いて得られた固相に水５０００部を加えて粒子を分散させて２２００ｒｐｍで１分間遠心分離（遠心分離工程２）することにより、大きな粒子径の粒子を沈降させて除去することで分級を行った。更に、磁石を用いて粒子を集磁し上清を除く操作を１０回（洗浄工程１）行い、超常磁性金属酸化物粒子の含有量が８１重量％である磁性シリカ粒子（Ａ１）を得た。

【0063】

＜超常磁性金属酸化物粒子の含有量の測定方法＞
磁性シリカ粒子の任意の２０個について、走査型電子顕微鏡（型番ＪＳＭ−７０００Ｆ、メーカー名日本電子株式会社）で観察し、エネルギー分散型Ｘ線分光装置（型番ＩＮＣＡ Ｗａｖｅ／Ｅｎｅｒｇｙ、メーカー名オックスフォード社）により超常磁性金属酸化物粒子の含有量を測定してその平均値を含有量Ｓとした。また、同測定にてシリカの含有量を測定しその平均値を含有量Ｔとした。以下の計算式にて、超常磁性金属酸化物粒子の含有量を求めた。
超常磁性金属酸化物粒子の含有量（重量％）＝［（Ｓ）／（Ｓ＋Ｔ）］×１００

【0064】

＜製造例２〜４＞
製造例１の「磁性シリカ粒子（Ａ１）の分級工程」において、表１に記載の条件とする以外は同様にして、磁性シリカ粒子（Ａ２）〜（Ａ４）を得た。

【0065】

【表1】

【0066】

＜製造例５＞
［磁性シリカ粒子（Ｂ１）の作製］
１重量％γ−アミノプロピルトリエトキシシラン含有アセトン溶液４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に製造した磁性シリカ粒子（Ａ１）１４０ｍｇを加え、２５℃で１時間反応させ、ネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去した。次いで脱イオン水４０ｍＬを加えて蓋をし、ポリスチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌した後、ネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去して磁性シリカ粒子を洗浄した。この洗浄操作を５回行った。次いで、この洗浄後の磁性シリカ粒子を２重量％グルタルアルデヒド含有水溶液４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で１時間反応させた。そして、脱イオン水４０ｍＬを加えて蓋をし、ポリスチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌したのち、ネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去して磁性シリカ粒子を洗浄した。この洗浄操作を１０回行った。更にこの洗浄後の磁性シリカ粒子を抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ダコジャパン（株）製）を１０μｇ／ｍＬの濃度で含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．７）１２０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で１時間反応させた。反応後、ネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を集磁後、抗ＣＥＡモノクローナル抗体含有リン酸緩衝液を除去した。次いで、磁性シリカ粒子を１重量％の牛血清アルブミン含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で１２時間浸漬させたのち、ネオジウム磁石でシリカ粒子を集磁後、１重量％の牛血清アルブミン含有のリン酸緩衝液を除去し、抗ＣＥＡ抗体を結合した磁性シリカ粒子（Ｂ１）を得た。

【0067】

＜製造例６〜８＞
製造例５において、磁性シリカ粒子（Ａ１）に代えて磁性シリカ粒子（Ａ２）〜（Ａ４）をそれぞれ用いる以外は同様にして、抗ＣＥＡ抗体を結合した磁性シリカ粒子（Ｂ２）〜（Ｂ４）を得た。

【0068】

＜実施例１＞
磁性シリカ粒子（Ａ１）の濃度が０．２ｍｇ／ｍＬ、磁性シリカ粒子（Ｂ１）の濃度が０．１ｍｇ／ｍＬとなるように、磁性シリカ粒子（Ｂ１）及び磁性シリカ粒子（Ａ１）が入った容器に０．８５重量％のＮａＣｌ及び１重量％ナロアクティーＣＬ−１００を含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、磁性シリカ粒子組成物（Ｃ１）を含む固相担体試薬（１）を調製し、冷蔵（２〜１０℃）で保存した。

【0069】

＜実施例２〜６及び比較例１〜４＞
実施例１において、磁性シリカ粒子（Ａ１）及び磁性シリカ（Ｂ１）に代えて磁性シリカ粒子（Ａ）及び（Ｂ）として表２に記載のもの及び量を用いて磁性シリカ粒子組成物（Ｃ２）〜（Ｃ６）又は（Ｃ’１）〜（Ｃ’４）をそれぞれ含む固相担体試薬（２）〜（６）及び（１’）〜（４’）を調整し、冷蔵（２〜１０℃）で保存した。

【0070】

＜磁性シリカ粒子の体積平均粒子径及び変動係数の測定方法＞
磁性シリカ粒子（Ａ１）〜（Ａ４）、（Ｂ１）〜（Ｂ４）、磁性シリカ粒子組成物（Ｃ１）〜（Ｃ６）及び（Ｃ’１）〜（Ｃ’４）の体積平均粒子径及び変動係数は、レーザー回折・散乱式粒子径分布測定装置（マイクロトラック・ベル株式会社製「マイクロトラックＭＴ３３００」）を用いて測定した。結果を表２に示す。

【0071】

［免疫測定用キット］
実施例１〜６及び比較例１〜４で得たそれぞれの固相担体試薬（１）〜（６）又は（１’）〜（４’）と、以下の標識試薬（ＰＯＤ標識抗ＣＥＡ抗体含有試薬）、化学発光試薬第１液及び化学発光試薬第２液とをそれぞれ組み合わせて、免疫測定用キット（Ｓ１）〜（Ｓ６）及び（Ｓ’１）〜（Ｓ’４）とした。

【0072】

［標識試薬の作製］
抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ダコジャパン（株）製）、西洋ワサビ由来ＰＯＤ（東洋紡（株）製）を用い、文献（エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトール；ジェイ．バイオケム，Ｖｏｌ．９２，１９８２，１４１３−１４２４）に記載の方法でＰＯＤ標識抗ＣＥＡ抗体を調製した。これを０．５重量％の牛血清アルブミン及び界面活性剤として１重量％ナロアクティーＣＬ−１００を含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で、ＰＯＤ標識抗ＣＥＡ抗体濃度として１００ｎＭの濃度に希釈し、標識試薬を調製し、冷蔵（２〜１０℃）で保存した。

【0073】

［化学発光試薬第１液の調製］
ルミノールのナトリウム塩［シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製］０．７ｇ及び４−（シアノメチルチオ）フェノール０．１ｇを１，０００ｍＬメスフラスコに仕込んだ。３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）を溶液の容量が１，０００ｍＬになるように仕込み、２５℃で均一混合して化学発光試薬第１液を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）保存した。

【0074】

［化学発光試薬第２液の調製］
１，０００ｍＬ及び過酸化水素［和光純薬工業（株）製、試薬特級、濃度３０重量％］６．６ｇを１，０００ｍＬメスフラスコに仕込んだ。脱イオン水を溶液の容量が１，０００ｍＬになるように仕込み、２５℃で均一混合して化学発光試薬第２液を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）保存した。

【0075】

＜実施例７〜１２及び比較例５〜８＞
得られた免疫測定用キット（Ｓ１）〜（Ｓ６）及び（Ｓ’１）〜（Ｓ’４）を用いて、以下の方法により免疫測定における感度及び同時再現性を評価した。結果を表２に示す。

【0076】

＜免疫測定における感度及び同時再現性の評価方法＞
固相担体試薬（Ｃ１）〜（Ｃ６）又は（Ｃ’１）〜（Ｃ’４）をそれぞれ用いて、それぞれ固相担体試薬０．０２５ｍＬと０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で調製したＣＥＡ濃度が１．０ｎｇ／ｍＬの標準ＣＥＡ液０．０２５ｍＬを試験管に入れて混合し、試験管中で３７℃３分間反応させ、抗ＣＥＡ抗体結合磁性シリカ粒子／ＣＥＡ複合体を形成させた。反応後、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて磁性シリカ粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を３回行った。

【0077】

続いて、標識試薬を試験管に注入し、試験管中で３７℃３分間反応させ、抗ＣＥＡ抗体結合磁性シリカ粒子／ＣＥＡ／ＰＯＤ標識抗ＣＥＡ抗体複合体を形成させた。反応後、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて磁性シリカ粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を２回行った。
最後に、化学発光試薬第１液（Ｉ−１）０．０７ｍＬと化学発光試薬第２液（Ｉ−２）０．０７ｍＬとを同時に加え、３７℃で４３秒間発光反応させ、化学発光試薬を添加後４３〜４５秒の平均発光量をルミノメーター［ベルトールドジャパン社製「Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０７」］で測定した。尚、ＣＥＡ濃度が１．０ｎｇ／ｍＬの標準ＣＥＡ液の代わりにＣＥＡ濃度が０ｎｇ／ｍＬの標準ＣＥＡ液を使用して上記と同様の操作を行いバックグラウンドとして用いた。

【0078】

感度については、ＣＥＡ濃度が１．０ｎｇ／ｍＬと０ｎｇ／ｍＬの標準溶液を用いた免疫測定を行った場合の発光量の比｛（１．０ｎｇ／ｍＬの標準溶液を用いた場合の発光量）／（０ｎｇ／ｍＬの標準溶液を用いた場合の発光量）｝を感度として表２に記載した。尚、数値が大きいほど、感度が高いことを意味する。

【0079】

同時再現性については、ＣＥＡ濃度が１ｎｇ／ｍＬの標準溶液を用いて免疫測定を行い、それを１０回繰り返し、平均発光量（Ｘ１）と標準偏差（Ｘ２）から以下の計算式で変動係数（ＣＶ）を算出した。尚、変動係数（ＣＶ）が小さいほど、再現性が高いことを意味する。
ＣＶ（％）＝（Ｘ２／Ｘ１）×１００

【0080】

【表2】

【0081】

表２の結果から、磁性シリカ粒子組成物（Ｃ）中の磁性シリカ粒子（Ｂ）の含有量が２重量％と少ない比較例２は、感度が極めて低いことがわかる。また、磁性シリカ粒子組成物（Ｃ）中の磁性シリカ粒子（Ｂ）の含有量が９１重量％と多すぎる比較例１は、感度は高いものの、変動係数が大きく、再現性が低いことがわかる。また、磁性粒子（Ａ）の体積平均粒子径（ｄ_A）と磁性粒子（Ｂ）の体積平均粒子径（ｄ_B）とが数式（１）の関係を満たさない比較例３及び４においても、感度は高いものの、変動係数が大きく、再現性が低いことがわかる。
一方、磁性粒子組成物（Ｃ）の重量を基準として磁性粒子組成物（Ｃ）中の磁性粒子（Ｂ）の含有量が５〜８０重量％であり、磁性粒子（Ａ）の体積平均粒子径（ｄ_A）と磁性粒子（Ｂ）の体積平均粒子径（ｄ_B）とが数式（１）の関係を満たす本発明の実施例１〜６の免疫測定試薬を用いた実施例７〜１２の免疫測定方法においては、高感度かつ再現性高く測定対象物質を測定することができることがわかる。

【産業上の利用可能性】

【0082】

本発明の免疫測定用試薬、免疫測定用キット及び免疫測定方法は、高感度かつ再現性に優れていることから、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法及び化学発光免疫測定法等の臨床検査に幅広く適用できる。