特開 2018-9084 免疫賦活化組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2018-9084(P2018-9084A)

(43)【公開日】2018年1月18日

(54)【発明の名称】免疫賦活化組成物

(51)【国際特許分類】

   C08G 79/04 20060101AFI20171215BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20171215BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20171215BHJP

   A61K 31/661 20060101ALI20171215BHJP

   B82Y 5/00 20110101ALI20171215BHJP

   C08J 3/12 20060101ALI20171215BHJP

【ＦＩ】

   C08G79/04

   A61P37/04

   A61K39/00 H

   A61K31/661

   B82Y5/00

   C08J3/12CFD

【審査請求】未請求

【請求項の数】4

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】38

(21)【出願番号】特願2016-138239(P2016-138239)

(22)【出願日】2016年7月13日

(71)【出願人】

【識別番号】399030060

【氏名又は名称】学校法人 関西大学

(74)【代理人】

【識別番号】100136319

【弁理士】

【氏名又は名称】北原 宏修

(74)【代理人】

【識別番号】100147706

【弁理士】

【氏名又は名称】多田 裕司

(74)【代理人】

【識別番号】100148275

【弁理士】

【氏名又は名称】山内 聡

(74)【代理人】

【識別番号】100142745

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 世子

(72)【発明者】

【氏名】岩▲崎▼ 泰彦

(72)【発明者】

【氏名】平野 佑弥

【テーマコード（参考）】

4C085

4C086

4F070

4J030

【Ｆターム（参考）】

4C085AA03

4C085BA01

4C085CC31

4C085EE01

4C086AA01

4C086AA02

4C086DA34

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB08

4F070AA47

4F070AC84

4F070AD06

4F070AE27

4F070AE30

4F070DB03

4F070DC15

4F070DC16

4J030CA01

4J030CB35

4J030CD03

4J030CD04

4J030CE02

4J030CE11

4J030CF02

4J030CG11

4J030CG29

(57)【要約】

【課題】本発明の課題は、免疫賦活化組成物の有効成分として利用可能な化学的安定性や安全性に優れた化合物やナノ粒子を提供することである。
【解決手段】本発明に係るに係る化合物は、ポリ（リン酸エチレン塩）部位および疎水性部位を含有する。疎水性部位は、ポリ（リン酸エチレン塩）部位よりも疎水性を示す部位である。また、本発明に係るナノ粒子は、ナノオーダーの寸法を有する粒子であって、コア粒子の表面にポリ（リン酸エチレン塩）が修飾されている。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

下式（１）のポリ（リン酸エチレン塩）部位と、
前記ポリ（リン酸エチレン塩）部位よりも疎水性を示す疎水性部位と
を含有する、化合物。

【化1】

【請求項2】

下式（２）のポリ（リン酸エチレンエステル）部位と、
前記ポリ（リン酸エチレンエステル）部位よりも疎水性を示す疎水性部位と
を含有する、化合物。

【化2】

【請求項3】

コア粒子と、
前記コア粒子の表面を修飾する請求項１または２に記載の化合物と
を備え、
前記請求項１または２に記載の化合物は、前記疎水性部位を介して前記コア粒子の表面層に接合されている
ナノ粒子。

【請求項4】

前記コア粒子は、生体適合性高分子を主成分として形成されている
請求項３に記載のナノ粒子。

【請求項5】

請求項１もしくは２に記載の化合物または請求項３もしくは４に記載のナノ粒子を有効成分とする免疫賦活化組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は化合物、特にポリ（リン酸エチレン）誘導体に関する。また、本発明は、その化合物を表面修飾したナノ粒子にも関する。さらに、本発明は上述の化合物およびナノ粒子を有効成分とする免疫賦活化組成物にも関する。

【背景技術】

【0002】

過去に「細菌の抽出物を有効成分とする免疫賦活化組成物」が提案されている（例えば、特表２０１２−５０２０２６号公報等参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特表２０１２−５０２０２６号公報

【特許文献2】特開２０００−０６９９６１号公報

【特許文献3】特開２００７−０５４０８０号公報

【特許文献4】国際公開第２００４／０７５９０６号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

しかし、細菌の抽出物は生体由来であるため、その化学的安定性や安全性が懸念されている。

【0005】

本発明の課題は、免疫賦活化組成物の有効成分として利用可能な化学的安定性や安全性に優れた化合物やナノ粒子を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の一局面に係る化合物は、ポリ（リン酸エチレン塩）部位および疎水性部位を含有する。ポリ（リン酸エチレン塩）部位は、下式（１）に示されるとおりの化学構造式で示される。疎水性部位は、ポリ（リン酸エチレン塩）部位よりも疎水性を示す部位である。

【0007】

【化1】

【0008】

本願発明者らの鋭意検討の結果、上述の化合物が免疫賦活化組成物の有効成分として利用することができると共に、化学的安定性に優れることが明らかとなった。また、この化合物は有機合成技術を用いて製造することができるため、生体由来成分に対する安全性の懸念は払拭される。したがって、この化合物は、化学的安定性や安全性に優れる免疫賦活化組成物の有効成分として利用することができる。

【0009】

本発明の他の局面に係る化合物は、ポリ（リン酸エチレンエステル）部位および疎水性部位を含有する。ポリ（リン酸エチレンエステル）部位は、下式（２）に示されるとおりの化学構造式で示される。疎水性部位は、ポリ（リン酸エチレンエステル）部位よりも疎水性を示す部位である。

【0010】

【化2】

【0011】

本願発明者らの鋭意検討の結果、上述の化合物が免疫賦活化組成物の有効成分として利用することができると共に、化学的安定性に優れることが明らかとなった。また、この化合物は有機合成技術を用いて製造することができるため、生体由来成分に対する安全性の懸念は払拭される。したがって、この化合物は、化学的安定性や安全性に優れる免疫賦活化組成物の有効成分として利用することができる。

【0012】

本発明の他の局面に係るナノ粒子は、ナノオーダーの寸法を有する粒子であって、コア粒子および上述の化合物を備える。上述の化合物は、コア粒子の表面を修飾する。なお、ここで、上述の化合物は、疎水性部位を介してコア粒子の表面層に接合されている。また、コア粒子は、生体適合性高分子を主成分として形成されていることが好ましい。

【0013】

本願発明者らの鋭意検討の結果、上述のナノ粒子が免疫賦活化組成物の有効成分として利用することができると共に、化学的安定性に優れることが明らかとなった。また、このナノ粒子は有機合成技術を用いて製造することができるため、生体由来成分に対する安全性の懸念は払拭される。したがって、このナノ粒子は、化学的安定性や安全性に優れる免疫賦活化組成物の有効成分として利用することができる。

【0014】

本発明の他の局面に係る免疫賦活化組成物は、上述の化合物または上述のナノ粒子を有効成分とする免疫賦活化組成物である。このため、この免疫賦活化組成物は、化学的安定性や安全性に優れる。なお、ここにいう「組成物」には、医薬品，サプリメントおよび食品添加剤等の製剤、飲食品（動植物そのものを除く。）ならびに飲食品組成物（加工された飲食品を含む。）等の動物（ヒトを含む）が摂取し得る物、医薬品等の動物（ヒトを含む）の細胞に注射等で直接投与し得る物等が含まれる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】実施例２で得られたＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子のイメージ図である。

【図2】実施例２で得られたＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の透過型電子顕微鏡像である。

【図3】実施例２および比較例１で得られたＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子およびＰＥＧ表面修飾ナノ粒子の粒径分布図である。

【図4】実施例２で得られたＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の粒子径および分散度の時間変化を示す図である。

【図5】実施例２および比較例１で得られたＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子およびＰＥＧ表面修飾ナノ粒子の種々の濃度における溶血活性を示す図である。

【図6】実施例２および比較例１で得られたＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子およびＰＥＧ表面修飾ナノ粒子の種々の濃度における細胞生存率を示す図である。

【図7】実施例２で得られたＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子をＲＡＷ２６４．７細胞に接触させた際のＲＡＷ２６４．７細胞の共焦点レーザー顕微鏡像、微分干渉顕微鏡像およびそれらの合成像である。

【図8】実施例２で得られたＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子をＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に接触させた際のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の共焦点レーザー顕微鏡像、微分干渉顕微鏡像およびそれらの合成像である。

【図9】リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））をＲＡＷ２６４．７細胞に接触させた際のＲＡＷ２６４．７細胞の共焦点レーザー顕微鏡像、微分干渉顕微鏡像およびそれらの合成像である。

【図10】リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））をＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に接触させた際のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の共焦点レーザー顕微鏡像、微分干渉顕微鏡像およびそれらの合成像である。

【図11】比較例１で得られたＰＥＧ表面修飾ナノ粒子の透過型電子顕微鏡像である。

【図12】比較例１で得られたＰＥＧ表面修飾ナノ粒子の粒子径および分散度の時間変化を示す図である。

【図13】比較例２で得られたＰＭＢ表面修飾ナノ粒子をＲＡＷ２６４．７細胞に接触させた際のＲＡＷ２６４．７細胞の共焦点レーザー顕微鏡像、微分干渉顕微鏡像およびそれらの合成像である。

【図14】比較例２で得られたＰＭＢ表面修飾ナノ粒子をＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に接触させた際のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の共焦点レーザー顕微鏡像、微分干渉顕微鏡像およびそれらの合成像である。

【図15】「実施例１で得られたＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ」、「実施例２で得られたＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子」、「比較例１で得られたＰＥＧ表面修飾ナノ粒子」および「比較例２で得られたＰＭＢ表面修飾ナノ粒子」をＲＡＷ２６４．７細胞に接触させた際に産生されたＴＮＦ−α量を示す図である。

【図16】図１５に示される各例のＴＮＦ−α量からコントロールのＴＮＦ−α量を減算した際の図である。

【図17】実施例１で得られたコレステロール末端ポリ（２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン）の平均分子量の測定方法を説明するための図である。

【図18】実施例１で得られたコレステロール末端ポリ（リン酸エチレン）のナトリウム塩の平均分子量の測定方法を説明するための図である。

【図19】臨界ミセル濃度の測定方法を説明するための図である。

【発明を実施するための形態】

【0016】

１．化合物
本発明の実施の形態に係る化合物は、主に、ポリ（リン酸エチレン誘導体）部位および疎水性部位から成る。なお、この化合物は、ポリ（リン酸エチレン誘導体）部位および疎水性部位のみから成っていてもよい。以下、これの部位について詳述した後、この化合物の合成方法について説明する。

【0017】

（１）ポリ（リン酸エチレン誘導体）部位
ポリ（リン酸エチレン誘導体）部位は、下式（１）に示されるポリ（リン酸エチレン塩）の構造を有していてもよいし、下式（２）に示されるポリ（リン酸エチレンエステル）の構造を有していてもよい。

【0018】

【化3】

【0019】

【化4】

【0020】

なお、上式（１）中、Ｍ^＋は、一価のカチオンであって、例えば、ナトリウムイオンやカリウムイオン等のアルカリ金属イオンであることが好ましい。また、同式中、ｎは２以上２００以下の範囲内であることが好ましく、２０以上１８０以下の範囲内であることがより好ましく４０以上１４０以下の範囲内であることがさらに好ましく、６０以上１２０以下の範囲内であることが特に好ましい。

【0021】

また、上式（２）中、Ｒは、メチル基やエチル基等の飽和アルキル基であることが好ましい。また、同式中、ｎは２以上２００以下の範囲内であることが好ましく、２０以上１８０以下の範囲内であることがより好ましく４０以上１４０以下の範囲内であることがさらに好ましく、６０以上１２０以下の範囲内であることが特に好ましい。

【0022】

（２）疎水性部位
疎水性部位は、ポリ（リン酸エチレン誘導体）部位よりも疎水性を示す部位であって、疎水性官能基であってもよいし、疎水性共重合部位であってもよい。疎水性官能基としては、例えば、アルキル基やコレステロール基等が挙げられるが、これらの例示に限れられない。なお、この疎水性部位は、化合物のいずれの位置に存在していてもよいが、ポリ（リン酸エチレン誘導体）部位の片末端に存在しているのが好ましい。また、疎水性部位の数は特に制限されないが、１つであることが好ましい。さらに、この化合物を後述する用途に用いる場合、この疎水性部位は、コレステロール構造等の生体適合性に優れる構造を有することが好ましい。

【0023】

（３）合成方法
ポリ（リン酸エチレンエステル）部位を有する化合物は、例えば、水酸基を有する疎水性化合物を開始剤として、塩化メチレン中で２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホランを重合反応させることによって得られる。なお、この際、触媒としてのジアザビシクロウンデセンを添加するのが好ましい。

【0024】

また、ポリ（リン酸エチレン塩）部位を有する化合物は、例えば、上記ポリ（リン酸エチレンエステル）部位を有する化合物のエステル基をトリエチルアミン存在下で加水分解させることによって得られるポリ（リン酸エチレン）部位にカチオン交換樹脂に接触させることによって得られる。

【0025】

１．ナノ粒子
本発明の実施の形態に係るナノ粒子１００は、数十ｎｍ（ナノメートル）から数百ｎｍの直径を有する粒子であって、図１に示されるように、主に、コア粒子１１０およびポリ（リン酸エチレン誘導体）部位１２０から成る。なお、このナノ粒子の直径は、１ｎｍ以上５００ｎｍ以下の範囲内であることが好ましく、１０ｎｍ以上３００ｎｍ以下の範囲内であることがより好ましく、５０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下の範囲内であることがさらに好ましく、５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下の範囲内であることが特に好ましい。以下、これらの構成要素について詳述した後、このナノ粒子の調製方法について説明する。

【0026】

（１）コア粒子
コア粒子は、疎水性を示し、球状体であることが好ましい。また、このナノ粒子を後述する用途に用いる場合、コア粒子は、ポリ乳酸等の生体適合性に優れる高分子化合物から構成されていることが好ましい。なお、このコア粒子には、内部に疎水性化合物を内包させることができる。

【0027】

（２）ポリ（リン酸エチレン誘導体）部位
ポリ（リン酸エチレン誘導体）部位は、上述した化合物の疎水性部位がコア粒子に埋め込まれる（アンカ−リングされる）ことによって形成される。すなわち、本ナノ粒子のポリ（リン酸エチレン誘導体）部位は、上述の化合物のポリ（リン酸エチレン誘導体）部位である。このポリ（リン酸エチレン誘導体）部位は、親水性を示すため、親水性化合物を包接することができる。

【0028】

（３）調製方法
本発明の実施の形態に係るナノ粒子は、上述の化合物の水溶液を調製し、その水溶液を撹拌しながらその水溶液に、コア粒子を形成する高分子の溶液（溶媒は水に不溶なものを用いる）を徐々に滴下した後、その混合液を撹拌しながらその混合液に超音波処理を施すことによって得ることができる。

【0029】

３．用途
本願発明者ら鋭意検討した結果、上述の化合物およびナノ粒子は、免疫賦活化組成物（例えば、サイトカイン産生促進組成物、腫瘍壊死因子産生促進組成物、ＴＮＦ−α産生促進組成物）の有効成分として利用することができることが判明した。なお、この免疫賦活化組成物は、医薬品，サプリメントおよび食品添加剤等の製剤、飲食品（動植物そのものを除く。）ならびに飲食品組成物（加工された飲食品を含む。）等の形態を採り得る。以下に示す実施例においてその証明を行う。

【0030】

＜実施例および比較例＞
以下、実施例および比較例を示して本発明をより詳細に説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に限定されない。

【実施例1】

【0031】

−コレステロール末端ポリ（リン酸エチレン）ナトリウム塩の合成−
１．コレステロール末端ポリ（２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン）の合成
先ず、５０ｍＬ容量の三口活栓丸底フラスコに８．２８ｇ（６０ｍｍｏｌ）の２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホランを加え、その三口活栓丸底フラスコ内を２時間減圧させて乾燥させた。次に、上述の三口活栓丸底フラスコの内部をアルゴンガス雰囲気にすると共に三口活栓丸底フラスコの底を冷却しながら開始剤としてのコレステロール０．２７３ｇ（０．７０６ｍｍｏｌ，減圧下で一晩乾燥させた後に６ｍＬの塩化メチレンに溶解させたもの）および触媒としてのジアザビシクロウンデセン１０５．４μＬ（０．７０６ｍｍｏｌ）を上述の三口活栓丸底フラスコに加え、そのまま３時間かけて２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホランを重合させた。最後に、得られたポリ（２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン）をトルエン、ジエチルエーテルの順で再沈殿させることによって精製した。その結果、コレステロール末端ポリ（２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン）を得た。なお、このときの化学反応式は以下の通りである。

【化5】

【0032】

２．コレステロール末端ポリ（リン酸エチレン）のナトリウム塩の合成
上述の通りにして得られたポリ（２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン）２．５ｇを５０ｍＬの純水に溶解し、その水溶液に（２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン）ユニット１当量に対して２当量のトリエチルアミンを加えて攪拌混合した。そして、２４時間後にその水溶液に２０ｇのカチオン交換樹脂（ドイツのＭｅｒｃｋ社製のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ−１２０）を加えて１時間攪拌した後、その水溶液をろ過してカチオン交換樹脂を取り除いた。次に、透析膜（ＭＷＣＯ１０００）を用いてそのろ液を蒸留水で透析し、透析溶液を凍結乾燥して、ポリ（リン酸エチレン）を得た。

【0033】

上述の通りにして得られたポリ（リン酸エチレン）がｐＨ７．０の０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液１ｍＬ当たり２０ｍｇの量含有されるように、同ポリ（リン酸エチレン）を同０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液に添加した。次に、そのポリ（リン酸エチレン）水酸化ナトリウム溶液を蒸留水で１日透析して、目的のコレステロール末端ポリ（リン酸エチレン）ナトリウム塩（以下「ＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ」と略する。）を得た。なお、このときの化学反応式は以下の通りである。また、このＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａは、使用されるまでの間−３０℃の環境下で保存された。

【化6】

【0034】

−物性測定および試験−
１．分子量測定
（１）コレステロール末端ポリ（２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン）の分子量測定
重クロロホルムを溶媒として、コレステロール末端ポリ（２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン）の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。図１７には、その^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示した。次に、この^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルから「側鎖のメトキシ基由来のピークの積分値（ａ）」と「末端のコレステロール由来のピークの積分値の平均（（ｃ＋ｅ＋ｆ）／３）」との比を取ってその繰り返し単位数ｎを求めた（ｎ＝ａ／（（ｃ＋ｅ＋ｆ）／３））。そして、以下の式を用いてコレステロール末端ポリ（２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン）の分子量を求めた。

【0035】

（分子量）＝（２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホランの分子量（１３８．０２））×（繰り返し単位数ｎ）＋（コレステロールの分子量（３８６．３６８））

【0036】

なお、上述の通りに合成されたコレステロール末端ポリ（２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン）の２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホランの繰り返し単位数は１０６であり、コレステロール末端ポリ（２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン）の分子量は１５．０×１０^３であった。また、このコレステロール末端ポリ（２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン）の分散度は１．４５であった。

【0037】

（２）ＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａの分子量測定
重水を溶媒として、ＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａの^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。図１８には、その^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示した。次に、「図１７の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル」および「図１８の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル」の主鎖のメチレンユニットの積分値を４．０とし、以下の式を用いて脱メチル化度を計算した。

【0038】

（脱メチル化度（％））＝１００−（図１８の下向き矢印のピーク（残存メチル基由来）の積分値）／（図１７のａのピークの積分値）×１００

【0039】

得られた脱メチル化度および上述の繰り返し単位数を用いて脱メチル化された繰り返し単位数を計算した。そして、最後に脱メチル化されることで増加する分子量（ＣＨ_３（１５）→Ｎａ（２３））をコレステロール末端ポリ（２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン）の分子量に加えてＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａの分子量を得た。なお、このＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａの分子量は１５．８×１０^３であった。また、このＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａの分散度は１．４５であった。

【0040】

２．臨界ミセル濃度
（１）試薬の調製
（１−１）ピレン／アセトン溶液の調製
先ず、褐色の１０ｍＬサンプル管に１．２２ｍｇ（６×１０^−３ｍｍｏｌ）ピレンをはかり取り、そのピレンを１０ｍＬのアセトンに溶解させて６×１０^−４Ｍのピレン／アセトン溶液を調製した。そして、このピレン／アセトン溶液を１０００倍に希釈して６×１０^−７Ｍのピレン／アセトン溶液を調製し、その６×１０^−７Ｍのピレン／アセトン溶液を褐色のサンプル管に移した。

【0041】

（１−２）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ＝７．４）の調製
先ず、０．１２１ｇ（１ｍｍｏｌ）のトリスヒドロキシメチルアミノメタンをはかり取り、そのトリスヒドロキシメチルアミノメタンを２００ｍＬのビーカーに移して約８０ｍＬの純水に溶解させた。次に、そのトリスヒドロキシメチルアミノメタン水溶液のｐＨをｐＨメーターで測定しながら、トリスヒドロキシメチルアミノメタン水溶液に１Ｍの塩酸水溶液を徐々に加えてそのｐＨを７．４に調整した。最後に、ｐＨ調整済みのトリスヒドロキシメチルアミノメタン水溶液を１００ｍＬのメスフラスコに移して、純水でメスアップした。

【0042】

（１−３）ＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液の調製
５×１０^−１ｇ／ｄＬのＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液を３ｍＬ調製した。そして、このＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液を希釈して１×１０^−６ｇ／ｄＬから５×１０^−１ｇ／ｄＬまでの濃度の異なるＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液を調製した。

【0043】

（２）試験手順および結果
先ず、６×１０^−７Ｍピレン／アセトン溶液をシリンジで褐色バイアル瓶に１ｍＬずつ加えた。次に、このバイアル瓶をデシケーターに入れ、デシケーター内をダイヤフラムポンプで減圧状態にして同溶液中のアセトンを完全に蒸発させた。次いで、ＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液を１ｍＬずつバイアル瓶に加えた後、Ｖａｃｕｕｍ Ｏｖｅｎ ＡＤＰ２００（ヤマト科学株式会社製）を用いてそのＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液を６０℃で２時間インキュベートした。続いて、バイアル瓶にアルミホイルをかぶせてＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液を室温で一晩インキュベートした。そして、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ Ｆ−２５００（株式会社日立製作所製）を用いてＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液の蛍光スペクトルを測定した。その際の使用セルおよび測定条件は以下の通りであった。

【0044】

使用セル：石英セル（４面透過）１０×１０×４５ｍｍ
測定条件 励起波長：３３４ｎｍ
蛍光開始：３５０ｎｍ 蛍光終了：５００ｎｍ
スリット励起：１０ｎｍ 蛍光：２．５ｎｍ

【0045】

上記の測定条件でピレンの蛍光スペクトルを測定した後、３７３ｎｍおよび３９３ｎｍの蛍光強度をそれぞれＩ_１、Ｉ_３とし、その比Ｉ_３／Ｉ_１を濃度（常用対数で表記）に対してプロットする（図１９参照）。そして、このプロットを繋ぐ線の変曲点の濃度を臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）とした（ピレンは周辺環境が親水性から疎水性に変化するとＩ_３が大きくなる性質を有するため、ポリマー濃度を変化させていくと臨界ミセル濃度以上ではピレンがミセル内部に取り込まれることでＩ_３が大きくなり、結果的に比Ｉ_３／Ｉ_１が大きくなる。）。このＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａの臨界ミセル濃度は４．０７×１０^−２ｇ／ｄＬであった。

【0046】

３．サイトカイン（ＴＮＦ−α）の定量試験
先ず、１．２０×１０^４ｃｅｌｌ／ｍＬになるように調整したマウス由来ＲＡＷ２６４．７細胞懸濁液を１ｍＬずつ２４ｗｅｌｌプレートに播種し、細胞培養環境下で２４時間培養した。次に、終濃度が５０μｇ／ｍＬとなるようにＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））に分散させた。次いで、この分散液を１００μＬずつ、ＲＡＷ２６４．７細胞懸濁液が入ったｗｅｌｌプレートに添加して、細胞培養環境下でＣＨ−ＰＥＰ−ＮａをＲＡＷ２６４．７細胞に接触させた。そして、ｗｅｌｌプレート中の培地をエッペンチューブに回収し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製のＭｏｕｓｅ ＴＮＦ ａｌｐｈａ ＥＬＩＳＡ Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｏ（登録商標）を用いて培地中のＴＮＦ−αを定量した。その結果、１１５．７ｐｇのＴＮＦ−αが検出された。

【実施例2】

【0047】

−ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の調製−
先ず、ＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように、実施例１で調製したＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａを超純水に溶かしてＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ水溶液を調製し、そのＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ水溶液４０ｍＬを１１０ｍＬサンプル管に加えた。次に、１ｍｇ／ｍＬのポリ乳酸／クロロホルム溶液１ｍＬをバイアル瓶に加えた。なお、ポリ乳酸の数平均分子量（Ｍｎ）は１．９５×１０^４であり、分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）は１．３４であった。次いで、先の１１０ｍＬサンプル管に撹拌子を入れ、同サンプル管を氷浴しながらマグネティックスターラーで同サンプル管の内容物を４５０ｒｐｍで撹拌した。続いて、パスツールピペットでバイアル瓶から１ｍｇ／ｍＬのポリ乳酸／クロロホルム溶液を吸い取り、その吸い取った１ｍｇ／ｍＬのポリ乳酸／クロロホルム溶液を一滴ずつ１１０ｍＬサンプル管に滴下した。さらに続いて、この１１０ｍＬサンプル管の内容物を４５０ｒｐｍで撹拌しながら同内容物に対して３０分間超音波処理を施した。なお、超音波処理は、デューティ比４０、出力制御１．５〜２の条件下で実施された。そして、１１０ｍＬサンプル管の内容物を３０分間減圧乾燥処理して同内容物からクロロホルムを完全に留去させた後、その内容物をフィルター（孔径０．８μｍ）でろ過した。そのろ液を遠沈管に入れて４５０００ｒｐｍ、４℃で１．５時間超遠心分離処理した後、遠沈管中の上澄みを捨て、残った粒子に純水を加えて粒子を再分散させた。この遠心処理−再分散の処理を３回繰り返して、目的のＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子を得た。なお、得られたＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子のイメージを図１に示す。図１において、符号１００は「ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子」を示し、符号１１０は「ポリ乳酸コア粒子」を示し、符号１２０は「ポリ（リン酸エチレン）ナトリウム塩部位」を示している。また、得られたＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の透過型電子顕微鏡像が図２に示されている（なお、この撮像を可能とするために、ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子にはオキサノールＶＩ（染色剤）が含まれている。オキサノールＶＩは、ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の調製時においてポリ乳酸／クロロホルム溶液に添加される。）。

【0048】

−物性測定および試験−
１．粒子径測定
（１）透過型電子顕微鏡を利用したＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の粒子径測定
先ず、０．１μｇ／ｍＬのＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の水性分散液を調製した。次に、この水性分散液１０μｍをブチラール支持膜（ＳＴＥＭ Ｃｕ１５０グリッド（ピッチ：１５０μｍ），応研商事株式会社製）に滴下して５分間静置した後、そのブチラール支持膜をピンセットで静かに持ち上げ、ブチラール支持膜上の残液をキムワイプに吸収させた。そして、水性分散液滴下からキムワイプ（登録商標）での拭き取りまでの操作を３回繰り返した。その後、ブチラール支持膜をデシケーターに格納して減圧下で一晩乾燥させた。そして、乾燥後のブチラール支持膜を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ，日本電子株式会社製のＳｅｍＡｆｏｒｅ５．２１）で観察した。なお、透過型電子顕微鏡による観察は、ＨＴ Ｖｏｌｔａｇｅ:１００ｋＶの条件下で行った。そして、その透過型電子顕微像中の各粒子の粒子径（直径）を計測し、それらの粒子径の平均値をとったところ８８．２ｎｍであった。

【0049】

（２）動的光散乱法を利用したナノ粒子の粒子径測定
蒸留水または緩衝水溶液を分散媒として用いて０．５ｍｇ／ｍＬのＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の水性分散液を調製した。そして、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ−ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ社製）を用いてその水性分散液中のＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の粒子径（直径）および分散度（ＰＤＩ）を測定した。その結果、平均粒子径は９８．６４ｎｍであり、分散度は０．１４であった。参考までに述べておくと、分散度は０から１の範囲内の数値であり、分散度が０である場合は粒子径の分布が全くなく、分散度が０．１以下の値を示す場合は単分散と言え、分散度が０．１から０．３の間の値を示す場合は狭い粒子径分布を有すると言え、分散度が０．５より大きい値を示す場合は多分散であると言える。したがって、ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の粒子径は単分散であると言える。図３にはこのＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の粒径分布が実線で示されている。

【0050】

また、ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の調製後から７日間、１日おきに平均粒子径および分散度を測定した。その結果を図４に示す。図４に示されるように、ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の平均粒子径および分散度は共にほぼ一定であった。したがって、このＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子は極めて高い安定性を示すことが明らかとなった。

【0051】

２．ζ電位測定
蒸留水または緩衝水溶液を分散媒として用いて０．５ｍｇ／ｍＬのＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の水性分散液を調製した。そして、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ−ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ社製）を用いてその水性分散液中のＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子のζ電位を測定した。その結果、このＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子のζ電位は−５９．５ｍＶであった。

【0052】

３．生体適合試験
（１）溶血試験
（１−１）試薬の調製
（ｉ）ハンクス緩衝溶液の調製
先ず、８．００ｇの塩化ナトリウム、０．４０ｇの塩化カリウム、１．００ｇのＤ−グルコース、０．１２０８ｇのリン酸水素二ナトリウム１２水和物および０．０６ｇのリン酸二水素カリウムを１Ｌの蒸留水に溶解させた。そして、この水溶液のｐＨを固体の炭酸水素ナトリウムで調整することによってハンクス緩衝溶液（ＨＢＳＳ）を調製した。

【0053】

（ｉｉ）Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００／ＨＢＳＳ溶液の調製
５重量％になるようにＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００をハンクス緩衝溶液で希釈して、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００／ＨＢＳＳ溶液を調製した。

【0054】

（ｉｉｉ）ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子/ＨＢＳＳ分散液の調製
終濃度がそれぞれ１．０×１０^−１ｍｇ／ｍＬ、１．０×１０^−２ｍｇ／ｍＬ、１．０×１０^−３ｍｇ／ｍＬおよび１．０×１０^−４ｍｇ／ｍＬになるようにＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子をハンクス緩衝溶液で希釈して、最終的に濃度が異なる４種類のＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子/ＨＢＳＳ分散液を用意した。

【0055】

（１−２）試験手順および結果
先ず、予め３ｍＬの３．８重量％クエン酸三ナトリウム水溶液が入ったシリンジでヒトから採血を行って、採血した血液を５０ｍＬ容量の遠沈管に同管の内壁を伝わせながら加えた。次に、その遠沈管を遠心分離機（ベックマンコールター株式会社製のＡｌｌｅｇｒａ（登録商標）２１Ｒ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）にセットして１２００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離処理を行った後、遠沈管内に生じた上澄みを取り除き、沈殿物をハンクス緩衝溶液で１．５倍に希釈した。次いで、その遠沈管を遠心分離機にセットして２８００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離処理を行った。そして、上澄みに色の変化がなくなるまで、希釈−遠心分離処理の操作を繰り返し行った後、沈殿物にハンクス緩衝溶液を加えて血球懸濁液の全量を３０ｍＬにした。続いて、この血液懸濁液の一部を取り、これをハンクス緩衝溶液で１０倍に希釈した。さらに続けて、２００μＬのＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子/ＨＢＳＳ分散液が入ったエッペンチューブに、ハンクス緩衝溶液で１０倍に希釈した血液懸濁液８００ｍＬを加えて混合した。また、コントロールとして２００μＬのＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００／ＨＢＳＳ溶液および２００μＬのハンクス緩衝溶液が入ったエッペンチュ−ブに先の血球懸濁液８００μＬを加えて混合した。そして、これら３種類の試料を３７℃で３時間インキュベートした後、２０００ｒｐｍ、室温で１０分間遠心分離処理した。処理液の上澄みを９６ｗｅｌｌプレートに２００μＬずつ移し、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製Ｍｏｄｅｌ６８０ ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ ＲＥＡＤＥＲ）で各試料の吸光度（吸光波長（λ）４０５ｎｍ）を測定した。

【0056】

溶血率すなわち溶血活性は、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００／ＨＢＳＳ溶液入りの血球懸濁液の吸光度を１００とし、「Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００／ＨＢＳＳ溶液入りの血球懸濁液」の吸光度に対する「ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子/ＨＢＳＳ分散液入りの血球懸濁液」および「ハンクス緩衝溶液入りの血球懸濁液」の比率として求めた。その結果を図５に示す。なお、本結果は、図５中、各ナノ粒子濃度の左側の棒に表わされている。図５に示されるようにＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子/ＨＢＳＳ分散液入りの血球懸濁液の溶血活性は極めて低くなっており、赤血球をほとんど破壊しないことが明らかとなった。

【0057】

（２）細胞毒性試験
（２−１）試薬の調製
（ｉ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））の調製
０．９６ｇのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ（フナコシ株式会社製）を１１０ｍＬの超純水に溶解させた後、その水溶液をオートクレーブで１２１℃、１５分間滅菌してリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））を得た。

【0058】

（ｉｉ）１０％ＦＢＳ／ＭＥＭ−αの調製
４５０ｍＬのＭＥＭ−α（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ α）に５ｍＬのＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）と５０ｍＬのＦＢＳ（ｂｉｏｗｅｓｔ社製ｂｉｏｗｅｓｔ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）を無菌的に加えて、１０％ＦＢＳ／ＭＥＭ−αを得た。

【0059】

（ｉｉｉ）ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子／ＰＢＳ分散液の調製
１．１ｍｇ／ｍＬ（終濃度１．０×１０^−１ｍｇ／ｍＬ）になるようにＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ １０ｘ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）でＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子を希釈した後、その希釈液をフィルター（孔径０．２μｍ）に通すことで滅菌処理した。そして、終濃度がそれぞれ１．０×１０^−２ｍｇ／ｍＬ、１．０×１０^−３ｍｇ／ｍＬ、１．０×１０^−４ｍｇ／ｍＬ、１．０×１０^−５ｍｇ／ｍＬおよび１．０×１０^−６ｍｇ／ｍＬになるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））でそのろ液を希釈して、最終的に濃度が異なる６種類のＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子／ＰＢＳ分散液を用意した。

【0060】

（２−２）試験手順および結果
先ず、１０×１０^４ｃｅｌｌ／ｍＬになるように調製したマウス由来ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞懸濁液を１００μＬずつ９６ｗｅｌｌプレートに播種し、細胞培養環境下で２４時間培養した。次に、ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子／ＰＢＳ分散液をそれぞれ１０μＬずつ、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞懸濁液が入った９６ｗｅｌｌプレートに添加して、細胞培養環境下でＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子をＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に２４時間接触させた。次いで、ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子と接触させたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に１０μＬのＷＳＴ−８溶液を添加して、細胞培養環境下で４時間反応させた。そして、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製Ｍｏｄｅｌ６８０ ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ ＲＥＡＤＥＲ）で各試料の吸光度（吸光波長（λ）４５０ｎｍ）を測定した。また、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞懸濁液にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））を加えてコントロール液を調製し、そのコントロール液の吸光度（吸光波長（λ）４５０ｎｍ）を測定した。

【0061】

コントロール液の吸光度を１００とし、「コントロール液の吸光度」に対する「各試料液の吸光度」の比率を求め、それを細胞生存率とした。その結果を図６に示す。なお、本結果は、図６中、各ナノ粒子濃度の左側の棒に表わされている。図６に示されるようにＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子は、いずれの濃度においてもＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に対してほとんど毒性を示さないことが明らかとなった。

【0062】

４．細胞取り込み試験
（１）試薬の調製
（１−１）蛍光粒子含有ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の調製
１ｍｇ／ｍＬのポリ乳酸／クロロホルム溶液１ｍＬに対して５０μＬのＱＤ溶液を加えた以外は、実施例２の「−ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の調製−」の欄に記載した調製方法と同一の調製方法で蛍光粒子含有ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子を調製した。

【0063】

（１−２）蛍光粒子含有ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子／ＰＢＳ分散液の調製
１．１ｍｇ／ｍＬ（終濃度１．０×１０^−１ｍｇ／ｍＬ）になるようにＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ １０ｘ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）で蛍光粒子含有ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子を希釈した後、その希釈液をフィルター（孔径０．２μｍ）に通すことで滅菌処理した。そして、終濃度が１．０×１０^−２ｍｇ／ｍＬになるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））でそのろ液を希釈して蛍光粒子含有ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子／ＰＢＳ分散液を得た。

【0064】

（２）試験手順および結果
先ず、「２０×１０^４ｃｅｌｌ／ｍＬになるように調整したマウス由来ＲＡＷ２６４．７細胞懸濁液」および「２×１０^４ｃｅｌｌ／ｍＬになるように調製したマウス由来ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞懸濁液」をそれぞれ１ｍＬずつプラスチックディッシュに播種し、細胞培養環境下で２４時間培養した。次に、蛍光粒子含有ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子／ＰＢＳ分散液をそれぞれ１００μＬずつ、ＲＡＷ２６４．７細胞懸濁液およびＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞懸濁液が入ったプラスチックディッシュに添加して、細胞培養環境下で蛍光粒子含有ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子をＲＡＷ２６４．７細胞およびＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞それぞれに２４時間接触させた。次いで、培地を廃棄した後に各細胞が剥がれないように緩やかにピペッティングしながら各細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））で洗浄した。そして、この操作を計３回行った。最後に、新しい血清培地１ｍＬを各細胞に添加して共焦点レーザー顕微鏡で各細胞を観察した。その結果を図７および図８に示す。なお、図７がＲＡＷ２６４．７細胞に対する結果であり、図８がＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に対する結果である。なお、左側の像が共焦点レーザー顕微鏡像であり、中央の像が微分干渉顕微鏡像であり、右側の像が共焦点レーザー顕微鏡像と微分干渉顕微鏡像との合成像である。また、微分干渉顕微鏡像および合成像の白色部分が蛍光発光箇所すなわち蛍光粒子含有ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の存在箇所である。これらの像より、ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子はＲＡＷ２６４．７細胞およびＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に効率的に取り込まれることが明らかとなった。

【0065】

なお、参考までに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））のみをＲＡＷ２６４．７細胞およびＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に接触させたときのＲＡＷ２６４．７細胞およびＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の共焦点レーザー顕微鏡像、微分干渉顕微鏡像およびそれらの合成像を図９および図１０に示した。なお、図９がＲＡＷ２６４．７細胞に対する結果であり、図１０がＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に対する結果である。

【0066】

５．サイトカインの定量試験
実施例１の「（３）サイトカイン（ＴＮＦ−α）の定量試験」の欄に記載した試験方法と同一の試験方法でＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子をＲＡＷ２６４．７細胞に接触させると共に、同欄に記載した定量方法と同一の定量方法でＴＮＦ−αを定量した。その結果、１６９．２ｐｇのＴＮＦ−αが検出された。

【0067】

（比較例１）
−ＰＥＧ表面修飾ナノ粒子の調製−
ＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａをコレステロール末端ポリエチレングリコール（重量平均分子量（Ｍｗ）：６．０×１０^３，分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）：１．０７，臨界ミセル濃度：５．５３×１０^−４ｇ／ｄＬ，ポリエチレングリコール部位の繰り返し単位数：約１０６）に代えた以外は、実施例２の「−ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の調製−」の欄に記載した調製方法と同一の調製方法でＰＥＧ表面修飾ナノ粒子を調製した。得られたＰＥＧ表面修飾ナノ粒子の透過型電子顕微鏡像が図１１に示されている（なお、この撮像を可能とするために、ＰＥＧ表面修飾ナノ粒子にはオキサノールＶＩ（染色剤）が含まれている。オキサノールＶＩは、ＰＥＧ表面修飾ナノ粒子の調製時においてポリ乳酸／クロロホルム溶液に添加される。）。

【0068】

−物性測定および試験−
１．粒子径測定
（１）透過型電子顕微鏡を利用したＰＥＧ表面修飾ナノ粒子の粒子径測定
実施例１に記載した測定方法と同一の測定方法でＰＥＧ表面修飾ナノ粒子の平均粒子径（直径）を測定したところ、その平均粒子径は９４．０ｎｍであった。

【0069】

（２）動的光散乱法を利用したナノ粒子の粒子径測定
実施例１に記載した測定方法と同一の測定方法でＰＥＧ表面修飾ナノ粒子の平均粒子径（直径）を測定したところ、その平均粒子径は１０５．９ｎｍであった。また、分散度（ＰＤＩ）は０．１７であった。したがって、ＰＥＧ表面修飾ナノ粒子の粒子径は単分散であると言える。図３にはこのＰＥＧ表面修飾ナノ粒子の粒径分布が破線で示されている。

【0070】

また、ＰＥＧ表面修飾ナノ粒子の調製後から７日間、１日おきに平均粒子径および分散度を求めた。その結果を図１２に示す。図１２に示されるように、ＰＥＧ表面修飾ナノ粒子の平均粒子径は日が経つに伴って減少し、分散度は日が経つに伴って上昇した。したがって、このＰＥＧ表面修飾ナノ粒子は安定性に優れるとは言い難いことが明らかとなった。

【0071】

２．ζ電位測定
実施例１に記載した測定方法と同一の測定方法でＰＥＧ表面修飾ナノ粒子のζ電位を測定したところ、そのζ電位は−２６．９ｍＶであった。

【0072】

３．生体適合試験
（１）溶血試験
ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子をＰＥＧ表面修飾ナノ粒子に代えた以外は、実施例２に記載した試験手順と同一の試験手順で試験を行った。その結果を図５に示す。なお、本結果は、図５中、各ナノ粒子濃度の右側の棒に表わされている。図５に示されるようにＰＥＧ表面修飾ナノ粒子/ＨＢＳＳ分散液入りの血球懸濁液の溶血活性は極めて低くなっており、赤血球をほとんど破壊しないことが明らかとなった。

【0073】

（２）細胞毒性試験
ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子をＰＥＧ表面修飾ナノ粒子に代えた以外は、実施例２に記載した試験手順と同一の試験手順で試験を行った。その結果を図６に示す。なお、本結果は、図６中、各ナノ粒子濃度の右側の棒に表わされている。図６に示されるようにＰＥＧ表面修飾ナノ粒子は、いずれの濃度においてもＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に対してほとんど毒性を示さないことが明らかとなった。

【0074】

４．サイトカインの定量試験
実施例１の「（３）サイトカイン（ＴＮＦ−α）の定量試験」の欄に記載した試験方法と同一の試験方法でＰＥＧ表面修飾ナノ粒子をＲＡＷ２６４．７細胞に接触させると共に、同欄に記載した定量方法と同一の定量方法でＴＮＦ−αを定量した。その結果、９６．７ｐｇのＴＮＦ−αが検出された。

【0075】

（比較例２）
−ＰＭＢ表面修飾ナノ粒子の調製−
ＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａを、以下の化学式（３）に示されるポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ｃｏ−メタクリル酸ブチル）（以下「ＰＭＢ」と称する）に代えた以外は、実施例２の「−ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の調製−」の欄に記載した調製方法と同一の調製方法でＰＭＢ表面修飾ナノ粒子を調製した。なお、このＰＭＢ表面修飾ナノ粒子に貧食されないことが明らかとなっている。

【化7】

【0076】

−物性測定および試験−
１．細胞取り込み試験
（１）試薬の調製
（１−１）蛍光粒子含有ＰＭＢ表面修飾ナノ粒子の調製
１ｍｇ／ｍＬのポリ乳酸／クロロホルム溶液１ｍＬに対して５０μＬのＱＤ溶液を加えた以外は、上述と同一の調製方法で蛍光粒子含有ＰＭＢ面修飾ナノ粒子を調製した。

【0077】

（１−２）蛍光粒子含有ＰＭＢ表面修飾ナノ粒子／ＰＢＳ分散液の調製
１．１ｍｇ／ｍＬ（終濃度１．０×１０^−１ｍｇ／ｍＬ）になるようにＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ １０ｘ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）で蛍光粒子含有ＰＭＢ表面修飾ナノ粒子を希釈した後、その希釈液をフィルター（孔径０．２μｍ）に通すことで滅菌処理した。そして、終濃度が１．０×１０^−２ｍｇ／ｍＬになるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））でそのろ液を希釈して蛍光粒子含有ＰＭＢ表面修飾ナノ粒子／ＰＢＳ分散液を得た。

【0078】

（２）試験手順および結果
蛍光粒子含有ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子／ＰＢＳ分散液を蛍光粒子含有ＰＭＢ表面修飾ナノ粒子／ＰＢＳ分散液に代えた以外は、実際例２の「４．細胞取り込み試験」の「（２）試験手順および結果」の欄に記載される試験手順と同一の手順で試験を行った。その結果を図１３および図１４に示す。なお、図１３がＲＡＷ２６４．７細胞に対する結果であり、図１４がＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に対する結果である。なお、左側の像が共焦点レーザー顕微鏡像であり、中央の像が微分干渉顕微鏡像であり、右側の像が共焦点レーザー顕微鏡像と微分干渉顕微鏡像との合成像である。また、微分干渉顕微鏡像および合成像の白色部分が蛍光発光箇所すなわち蛍光粒子含有ＰＭＢ表面修飾ナノ粒子の存在箇所である。これらの像より、ＰＭＢ表面修飾ナノ粒子は、僅かな量しかＲＡＷ２６４．７細胞およびＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に取り込まれないことが明らかとなった。

【0079】

２．サイトカインの定量試験
実施例１の「（３）サイトカイン（ＴＮＦ−α）の定量試験」の欄に記載した試験方法と同一の試験方法でＰＭＢ表面修飾ナノ粒子をＲＡＷ２６４．７細胞に接触させると共に、同欄に記載した定量方法と同一の定量方法でＴＮＦ−αを定量した。その結果、９４．９ｐｇのＴＮＦ−αが検出された。

【0080】

＜実施例および比較例に対する考察＞
実施例２のＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子のζ電位と比較例１のＰＥＧ面修飾ナノ粒子のζ電位とを比較すると、ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子はＰＥＧ面修飾ナノ粒子よりもマイナス電荷を帯びていることがわかる。このため、ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子にはＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａが有効に表面修飾されていることが裏付けられる。

【0081】

また、図１５には、「コントロールとしてのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））」、「実施例１で得られたＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ」、「実施例２で得られたＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子」、「比較例１で得られたＰＥＧ表面修飾ナノ粒子」および「比較例２で得られたＰＭＢ表面修飾ナノ粒子」をＲＡＷ２６４．７細胞に接触させた際に産生されたＴＮＦ−α量が示されている。この「実施例１で得られたＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ」および「実施例２で得られたＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子」をＲＡＷ２６４．７細胞に接触させると、「比較例１で得られたＰＥＧ表面修飾ナノ粒子」および「比較例２で得られたＰＭＢ表面修飾ナノ粒子」をＲＡＷ２６４．７細胞に接触させた場合に比べて多量のＴＮＦ−αを産生することが明らかとなった。したがって、「実施例１で得られたＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ」および「実施例２で得られたＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子」には、「比較例１で得られたＰＥＧ表面修飾ナノ粒子」および「比較例２で得られたＰＭＢ表面修飾ナノ粒子」よりも優れた免疫賦活化機能が認められた。また、「実施例２で得られたＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子」は、「実施例１で得られたＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ」よりも著しくその機能に秀でていることが明らかとなった。すなわち、「実施例１で得られたＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ」をナノ粒子化にすることによって免疫賦活化機能が向上することが確認された。なお、その効果をよりわかりやすくするために、図１６では、各試料に対応するＴＮＦ−α量からコントロールのＴＮＦ−α量を差し引いた値が棒グラフ化されている。

【産業上の利用可能性】

【0082】

本発明に係る化合物およびナノ粒子は、免疫賦活化剤（より具体的にはサイトカイン産生促進組成物、腫瘍壊死因子産生促進組成物、ＴＮＦ−α産生促進組成物）の有効成分として利用することができる。

【符号の説明】

【0083】

１００ ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子（ナノ粒子）
１１０ ポリ乳酸コア粒子（コア粒子）
１２０ ポリ（リン酸エチレン）ナトリウム塩部位（化合物）

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【手続補正書】

【提出日】2016年7月29日

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

下式（１）のポリ（リン酸エチレン塩）部位と、前記ポリ（リン酸エチレン塩）部位よりも疎水性を示す疎水性部位とを含有する第１化合物、
下式（２）のポリ（リン酸エチレンエステル）部位と、前記ポリ（リン酸エチレンエステル）部位よりも疎水性を示す疎水性部位とを含有する第２化合物
または
コア粒子と、前記疎水性部位を介して前記コア粒子の表面層に接合されている前記第１化合物もしくは前記第２化合物とを備えるナノ粒子
を有効成分とする免疫賦活化組成物。

【化1】

【化2】

【請求項2】

下式（１）のポリ（リン酸エチレン塩）部位と、前記ポリ（リン酸エチレン塩）部位よりも疎水性を示す疎水性部位とを含有する第１化合物、
下式（２）のポリ（リン酸エチレンエステル）部位と、前記ポリ（リン酸エチレンエステル）部位よりも疎水性を示す疎水性部位とを含有する第２化合物
または
コア粒子と、前記疎水性部位を介して前記コア粒子の表面層に接合されている前記第１化合物もしくは前記第２化合物とを備えるナノ粒子
を有効成分とするサイトカイン産生促進組成物。

【化3】

【化4】

【請求項3】

下式（１）のポリ（リン酸エチレン塩）部位と、前記ポリ（リン酸エチレン塩）部位よりも疎水性を示す疎水性部位とを含有する第１化合物、
下式（２）のポリ（リン酸エチレンエステル）部位と、前記ポリ（リン酸エチレンエステル）部位よりも疎水性を示す疎水性部位とを含有する第２化合物
または
コア粒子と、前記疎水性部位を介して前記コア粒子の表面層に接合されている前記第１化合物もしくは前記第２化合物とを備えるナノ粒子
を有効成分とする腫瘍壊死因子産生促進組成物。

【化5】

【化6】

【請求項4】

下式（１）のポリ（リン酸エチレン塩）部位と、前記ポリ（リン酸エチレン塩）部位よりも疎水性を示す疎水性部位とを含有する第１化合物、
下式（２）のポリ（リン酸エチレンエステル）部位と、前記ポリ（リン酸エチレンエステル）部位よりも疎水性を示す疎水性部位とを含有する第２化合物
または
コア粒子と、前記疎水性部位を介して前記コア粒子の表面層に接合されている前記第１化合物もしくは前記第２化合物とを備えるナノ粒子
を有効成分とするＴＮＦ−α産生促進組成物。

【化7】

【化8】

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、免疫賦活化組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

過去に「細菌の抽出物を有効成分とする免疫賦活化組成物」が提案されている（例えば、特表２０１２−５０２０２６号公報等参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特表２０１２−５０２０２６号公報

【特許文献2】特開２０００−０６９９６１号公報

【特許文献3】特開２００７−０５４０８０号公報

【特許文献4】国際公開第２００４／０７５９０６号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

しかし、細菌の抽出物は生体由来であるため、その化学的安定性や安全性が懸念されている。

【0005】

本発明の課題は、化学的安定性や安全性に優れた化合物やナノ粒子を有効成分とする免疫賦活化組成物を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の一局面に係る免疫賦活化組成物は、「下式（１）のポリ（リン酸エチレン塩）部位と、前記ポリ（リン酸エチレン塩）部位よりも疎水性を示す疎水性部位とを含有する第１化合物」、「下式（２）のポリ（リン酸エチレンエステル）部位と、前記ポリ（リン酸エチレンエステル）部位よりも疎水性を示す疎水性部位とを含有する第２化合物」、または、「コア粒子と、前記疎水性部位を介して前記コア粒子の表面層に接合されている前記第１化合物もしくは前記第２化合物とを備えるナノ粒子」を有効成分とする。なお、ナノ粒子は、ナノオーダーの寸法を有する粒子である。コア粒子は、生体適合性高分子を主成分として形成されていることが好ましい。なお、ここにいう「組成物」には、医薬品，サプリメントおよび食品添加剤等の製剤、飲食品（動植物そのものを除く。）ならびに飲食品組成物（加工された飲食品を含む。）等の動物（ヒトを含む）が摂取し得る物、医薬品等の動物（ヒトを含む）の細胞に注射等で直接投与し得る物等が含まれる。

【0007】

本願発明者らの鋭意検討の結果、上述の第１化合物、第２化合物またはナノ粒子が免疫賦活化組成物の有効成分として利用することができると共に、化学的安定性に優れることが明らかとなった。また、第１化合物、第２化合物またはナノ粒子は有機合成技術を用いて製造することができるため、生体由来成分に対する安全性の懸念は払拭される。したがって、この第１化合物、第２化合物またはナノ粒子は、化学的安定性や安全性に優れる免疫賦活化組成物の有効成分として利用することができる。

【化1】

【化2】

【0008】

本発明の他の局面に係るサイトカイン産生促進組成物は、「上式（１）のポリ（リン酸エチレン塩）部位と、前記ポリ（リン酸エチレン塩）部位よりも疎水性を示す疎水性部位とを含有する第１化合物」、「上式（２）のポリ（リン酸エチレンエステル）部位と、前記ポリ（リン酸エチレンエステル）部位よりも疎水性を示す疎水性部位とを含有する第２化合物」、または、「コア粒子と、前記疎水性部位を介して前記コア粒子の表面層に接合されている前記第１化合物もしくは前記第２化合物とを備えるナノ粒子」を有効成分とする。なお、ナノ粒子は、ナノオーダーの寸法を有する粒子である。コア粒子は、生体適合性高分子を主成分として形成されていることが好ましい。なお、ここにいう「組成物」には、医薬品，サプリメントおよび食品添加剤等の製剤、飲食品（動植物そのものを除く。）ならびに飲食品組成物（加工された飲食品を含む。）等の動物（ヒトを含む）が摂取し得る物、医薬品等の動物（ヒトを含む）の細胞に注射等で直接投与し得る物等が含まれる。

【0009】

本願発明者らの鋭意検討の結果、上述の第１化合物、第２化合物またはナノ粒子がサイトカイン産生促進組成物の有効成分として利用することができると共に、化学的安定性に優れることが明らかとなった。また、第１化合物、第２化合物またはナノ粒子は有機合成技術を用いて製造することができるため、生体由来成分に対する安全性の懸念は払拭される。したがって、この第１化合物、第２化合物またはナノ粒子は、化学的安定性や安全性に優れるサイトカイン産生促進組成物の有効成分として利用することができる。

【0010】

本発明の他の局面に係る腫瘍壊死因子産生促進組成物は、「上式（１）のポリ（リン酸エチレン塩）部位と、前記ポリ（リン酸エチレン塩）部位よりも疎水性を示す疎水性部位とを含有する第１化合物」、「上式（２）のポリ（リン酸エチレンエステル）部位と、前記ポリ（リン酸エチレンエステル）部位よりも疎水性を示す疎水性部位とを含有する第２化合物」、または、「コア粒子と、前記疎水性部位を介して前記コア粒子の表面層に接合されている前記第１化合物もしくは前記第２化合物とを備えるナノ粒子」を有効成分とする。なお、ナノ粒子は、ナノオーダーの寸法を有する粒子である。コア粒子は、生体適合性高分子を主成分として形成されていることが好ましい。なお、ここにいう「組成物」には、医薬品，サプリメントおよび食品添加剤等の製剤、飲食品（動植物そのものを除く。）ならびに飲食品組成物（加工された飲食品を含む。）等の動物（ヒトを含む）が摂取し得る物、医薬品等の動物（ヒトを含む）の細胞に注射等で直接投与し得る物等が含まれる。

【0011】

本願発明者らの鋭意検討の結果、上述の第１化合物、第２化合物またはナノ粒子が腫瘍壊死因子産生促進組成物の有効成分として利用することができると共に、化学的安定性に優れることが明らかとなった。また、第１化合物、第２化合物またはナノ粒子は有機合成技術を用いて製造することができるため、生体由来成分に対する安全性の懸念は払拭される。したがって、この第１化合物、第２化合物またはナノ粒子は、化学的安定性や安全性に優れる腫瘍壊死因子産生促進組成物の有効成分として利用することができる。

【0012】

本発明の他の局面に係るＴＮＦ−α産生促進組成物は、「上式（１）のポリ（リン酸エチレン塩）部位と、前記ポリ（リン酸エチレン塩）部位よりも疎水性を示す疎水性部位とを含有する第１化合物」、「上式（２）のポリ（リン酸エチレンエステル）部位と、前記ポリ（リン酸エチレンエステル）部位よりも疎水性を示す疎水性部位とを含有する第２化合物」、または、「コア粒子と、前記疎水性部位を介して前記コア粒子の表面層に接合されている前記第１化合物もしくは前記第２化合物とを備えるナノ粒子」を有効成分とする。なお、ナノ粒子は、ナノオーダーの寸法を有する粒子である。コア粒子は、生体適合性高分子を主成分として形成されていることが好ましい。なお、ここにいう「組成物」には、医薬品，サプリメントおよび食品添加剤等の製剤、飲食品（動植物そのものを除く。）ならびに飲食品組成物（加工された飲食品を含む。）等の動物（ヒトを含む）が摂取し得る物、医薬品等の動物（ヒトを含む）の細胞に注射等で直接投与し得る物等が含まれる。

【0013】

本願発明者らの鋭意検討の結果、上述の第１化合物、第２化合物またはナノ粒子がＴＮＦ−α産生促進組成物の有効成分として利用することができると共に、化学的安定性に優れることが明らかとなった。また、第１化合物、第２化合物またはナノ粒子は有機合成技術を用いて製造することができるため、生体由来成分に対する安全性の懸念は払拭される。したがって、この第１化合物、第２化合物またはナノ粒子は、化学的安定性や安全性に優れるＴＮＦ−α産生促進組成物の有効成分として利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】実施例２で得られたＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子のイメージ図である。

【図2】実施例２で得られたＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の透過型電子顕微鏡像である。

【図3】実施例２および比較例１で得られたＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子およびＰＥＧ表面修飾ナノ粒子の粒径分布図である。

【図4】実施例２で得られたＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の粒子径および分散度の時間変化を示す図である。

【図5】実施例２および比較例１で得られたＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子およびＰＥＧ表面修飾ナノ粒子の種々の濃度における溶血活性を示す図である。

【図6】実施例２および比較例１で得られたＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子およびＰＥＧ表面修飾ナノ粒子の種々の濃度における細胞生存率を示す図である。

【図7】実施例２で得られたＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子をＲＡＷ２６４．７細胞に接触させた際のＲＡＷ２６４．７細胞の共焦点レーザー顕微鏡像、微分干渉顕微鏡像およびそれらの合成像である。

【図8】実施例２で得られたＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子をＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に接触させた際のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の共焦点レーザー顕微鏡像、微分干渉顕微鏡像およびそれらの合成像である。

【図9】リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））をＲＡＷ２６４．７細胞に接触させた際のＲＡＷ２６４．７細胞の共焦点レーザー顕微鏡像、微分干渉顕微鏡像およびそれらの合成像である。

【図10】リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））をＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に接触させた際のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の共焦点レーザー顕微鏡像、微分干渉顕微鏡像およびそれらの合成像である。

【図11】比較例１で得られたＰＥＧ表面修飾ナノ粒子の透過型電子顕微鏡像である。

【図12】比較例１で得られたＰＥＧ表面修飾ナノ粒子の粒子径および分散度の時間変化を示す図である。

【図13】比較例２で得られたＰＭＢ表面修飾ナノ粒子をＲＡＷ２６４．７細胞に接触させた際のＲＡＷ２６４．７細胞の共焦点レーザー顕微鏡像、微分干渉顕微鏡像およびそれらの合成像である。

【図14】比較例２で得られたＰＭＢ表面修飾ナノ粒子をＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に接触させた際のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の共焦点レーザー顕微鏡像、微分干渉顕微鏡像およびそれらの合成像である。

【図15】「実施例１で得られたＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ」、「実施例２で得られたＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子」、「比較例１で得られたＰＥＧ表面修飾ナノ粒子」および「比較例２で得られたＰＭＢ表面修飾ナノ粒子」をＲＡＷ２６４．７細胞に接触させた際に産生されたＴＮＦ−α量を示す図である。

【図16】図１５に示される各例のＴＮＦ−α量からコントロールのＴＮＦ−α量を減算した際の図である。

【図17】実施例１で得られたコレステロール末端ポリ（２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン）の平均分子量の測定方法を説明するための図である。

【図18】実施例１で得られたコレステロール末端ポリ（リン酸エチレン）のナトリウム塩の平均分子量の測定方法を説明するための図である。

【図19】臨界ミセル濃度の測定方法を説明するための図である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

１．化合物
本発明の実施の形態に係る化合物は、主に、ポリ（リン酸エチレン誘導体）部位および疎水性部位から成る。なお、この化合物は、ポリ（リン酸エチレン誘導体）部位および疎水性部位のみから成っていてもよい。以下、これの部位について詳述した後、この化合物の合成方法について説明する。

【0016】

（１）ポリ（リン酸エチレン誘導体）部位
ポリ（リン酸エチレン誘導体）部位は、下式（１）に示されるポリ（リン酸エチレン塩）の構造を有していてもよいし、下式（２）に示されるポリ（リン酸エチレンエステル）の構造を有していてもよい。

【0017】

【化3】

【0018】

【化4】

【0019】

なお、上式（１）中、Ｍ^＋は、一価のカチオンであって、例えば、ナトリウムイオンやカリウムイオン等のアルカリ金属イオンであることが好ましい。また、同式中、ｎは２以上２００以下の範囲内であることが好ましく、２０以上１８０以下の範囲内であることがより好ましく４０以上１４０以下の範囲内であることがさらに好ましく、６０以上１２０以下の範囲内であることが特に好ましい。

【0020】

また、上式（２）中、Ｒは、メチル基やエチル基等の飽和アルキル基であることが好ましい。また、同式中、ｎは２以上２００以下の範囲内であることが好ましく、２０以上１８０以下の範囲内であることがより好ましく４０以上１４０以下の範囲内であることがさらに好ましく、６０以上１２０以下の範囲内であることが特に好ましい。

【0021】

（２）疎水性部位
疎水性部位は、ポリ（リン酸エチレン誘導体）部位よりも疎水性を示す部位であって、疎水性官能基であってもよいし、疎水性共重合部位であってもよい。疎水性官能基としては、例えば、アルキル基やコレステロール基等が挙げられるが、これらの例示に限れられない。なお、この疎水性部位は、化合物のいずれの位置に存在していてもよいが、ポリ（リン酸エチレン誘導体）部位の片末端に存在しているのが好ましい。また、疎水性部位の数は特に制限されないが、１つであることが好ましい。さらに、この化合物を後述する用途に用いる場合、この疎水性部位は、コレステロール構造等の生体適合性に優れる構造を有することが好ましい。

【0022】

（３）合成方法
ポリ（リン酸エチレンエステル）部位を有する化合物は、例えば、水酸基を有する疎水性化合物を開始剤として、塩化メチレン中で２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホランを重合反応させることによって得られる。なお、この際、触媒としてのジアザビシクロウンデセンを添加するのが好ましい。

【0023】

また、ポリ（リン酸エチレン塩）部位を有する化合物は、例えば、上記ポリ（リン酸エチレンエステル）部位を有する化合物のエステル基をトリエチルアミン存在下で加水分解させることによって得られるポリ（リン酸エチレン）部位にカチオン交換樹脂に接触させることによって得られる。

【0024】

１．ナノ粒子
本発明の実施の形態に係るナノ粒子１００は、数十ｎｍ（ナノメートル）から数百ｎｍの直径を有する粒子であって、図１に示されるように、主に、コア粒子１１０およびポリ（リン酸エチレン誘導体）部位１２０から成る。なお、このナノ粒子の直径は、１ｎｍ以上５００ｎｍ以下の範囲内であることが好ましく、１０ｎｍ以上３００ｎｍ以下の範囲内であることがより好ましく、５０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下の範囲内であることがさらに好ましく、５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下の範囲内であることが特に好ましい。以下、これらの構成要素について詳述した後、このナノ粒子の調製方法について説明する。

【0025】

（１）コア粒子
コア粒子は、疎水性を示し、球状体であることが好ましい。また、このナノ粒子を後述する用途に用いる場合、コア粒子は、ポリ乳酸等の生体適合性に優れる高分子化合物から構成されていることが好ましい。なお、このコア粒子には、内部に疎水性化合物を内包させることができる。

【0026】

（２）ポリ（リン酸エチレン誘導体）部位
ポリ（リン酸エチレン誘導体）部位は、上述した化合物の疎水性部位がコア粒子に埋め込まれる（アンカ−リングされる）ことによって形成される。すなわち、本ナノ粒子のポリ（リン酸エチレン誘導体）部位は、上述の化合物のポリ（リン酸エチレン誘導体）部位である。このポリ（リン酸エチレン誘導体）部位は、親水性を示すため、親水性化合物を包接することができる。

【0027】

（３）調製方法
本発明の実施の形態に係るナノ粒子は、上述の化合物の水溶液を調製し、その水溶液を撹拌しながらその水溶液に、コア粒子を形成する高分子の溶液（溶媒は水に不溶なものを用いる）を徐々に滴下した後、その混合液を撹拌しながらその混合液に超音波処理を施すことによって得ることができる。

【0028】

３．用途
本願発明者ら鋭意検討した結果、上述の化合物およびナノ粒子は、免疫賦活化組成物（例えば、サイトカイン産生促進組成物、腫瘍壊死因子産生促進組成物、ＴＮＦ−α産生促進組成物）の有効成分として利用することができることが判明した。なお、この免疫賦活化組成物は、医薬品，サプリメントおよび食品添加剤等の製剤、飲食品（動植物そのものを除く。）ならびに飲食品組成物（加工された飲食品を含む。）等の形態を採り得る。以下に示す実施例においてその証明を行う。

【0029】

＜実施例および比較例＞
以下、実施例および比較例を示して本発明をより詳細に説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に限定されない。

【実施例1】

【0030】

−コレステロール末端ポリ（リン酸エチレン）ナトリウム塩の合成−
１．コレステロール末端ポリ（２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン）の合成
先ず、５０ｍＬ容量の三口活栓丸底フラスコに８．２８ｇ（６０ｍｍｏｌ）の２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホランを加え、その三口活栓丸底フラスコ内を２時間減圧させて乾燥させた。次に、上述の三口活栓丸底フラスコの内部をアルゴンガス雰囲気にすると共に三口活栓丸底フラスコの底を冷却しながら開始剤としてのコレステロール０．２７３ｇ（０．７０６ｍｍｏｌ，減圧下で一晩乾燥させた後に６ｍＬの塩化メチレンに溶解させたもの）および触媒としてのジアザビシクロウンデセン１０５．４μＬ（０．７０６ｍｍｏｌ）を上述の三口活栓丸底フラスコに加え、そのまま３時間かけて２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホランを重合させた。最後に、得られたポリ（２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン）をトルエン、ジエチルエーテルの順で再沈殿させることによって精製した。その結果、コレステロール末端ポリ（２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン）を得た。なお、このときの化学反応式は以下の通りである。

【化5】

【0031】

２．コレステロール末端ポリ（リン酸エチレン）のナトリウム塩の合成
上述の通りにして得られたポリ（２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン）２．５ｇを５０ｍＬの純水に溶解し、その水溶液に（２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン）ユニット１当量に対して２当量のトリエチルアミンを加えて攪拌混合した。そして、２４時間後にその水溶液に２０ｇのカチオン交換樹脂（ドイツのＭｅｒｃｋ社製のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ−１２０）を加えて１時間攪拌した後、その水溶液をろ過してカチオン交換樹脂を取り除いた。次に、透析膜（ＭＷＣＯ１０００）を用いてそのろ液を蒸留水で透析し、透析溶液を凍結乾燥して、ポリ（リン酸エチレン）を得た。

【0032】

上述の通りにして得られたポリ（リン酸エチレン）がｐＨ７．０の０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液１ｍＬ当たり２０ｍｇの量含有されるように、同ポリ（リン酸エチレン）を同０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液に添加した。次に、そのポリ（リン酸エチレン）水酸化ナトリウム溶液を蒸留水で１日透析して、目的のコレステロール末端ポリ（リン酸エチレン）ナトリウム塩（以下「ＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ」と略する。）を得た。なお、このときの化学反応式は以下の通りである。また、このＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａは、使用されるまでの間−３０℃の環境下で保存された。

【化6】

【0033】

−物性測定および試験−
１．分子量測定
（１）コレステロール末端ポリ（２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン）の分子量測定
重クロロホルムを溶媒として、コレステロール末端ポリ（２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン）の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。図１７には、その^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示した。次に、この^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルから「側鎖のメトキシ基由来のピークの積分値（ａ）」と「末端のコレステロール由来のピークの積分値の平均（（ｃ＋ｅ＋ｆ）／３）」との比を取ってその繰り返し単位数ｎを求めた（ｎ＝ａ／（（ｃ＋ｅ＋ｆ）／３））。そして、以下の式を用いてコレステロール末端ポリ（２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン）の分子量を求めた。

【0034】

（分子量）＝（２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホランの分子量（１３８．０２））×（繰り返し単位数ｎ）＋（コレステロールの分子量（３８６．３６８））

【0035】

なお、上述の通りに合成されたコレステロール末端ポリ（２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン）の２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホランの繰り返し単位数は１０６であり、コレステロール末端ポリ（２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン）の分子量は１５．０×１０^３であった。また、このコレステロール末端ポリ（２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン）の分散度は１．４５であった。

【0036】

（２）ＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａの分子量測定
重水を溶媒として、ＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａの^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。図１８には、その^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示した。次に、「図１７の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル」および「図１８の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル」の主鎖のメチレンユニットの積分値を４．０とし、以下の式を用いて脱メチル化度を計算した。

【0037】

（脱メチル化度（％））＝１００−（図１８の下向き矢印のピーク（残存メチル基由来）の積分値）／（図１７のａのピークの積分値）×１００

【0038】

得られた脱メチル化度および上述の繰り返し単位数を用いて脱メチル化された繰り返し単位数を計算した。そして、最後に脱メチル化されることで増加する分子量（ＣＨ_３（１５）→Ｎａ（２３））をコレステロール末端ポリ（２−メトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン）の分子量に加えてＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａの分子量を得た。なお、このＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａの分子量は１５．８×１０^３であった。また、このＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａの分散度は１．４５であった。

【0039】

２．臨界ミセル濃度
（１）試薬の調製
（１−１）ピレン／アセトン溶液の調製
先ず、褐色の１０ｍＬサンプル管に１．２２ｍｇ（６×１０^−３ｍｍｏｌ）ピレンをはかり取り、そのピレンを１０ｍＬのアセトンに溶解させて６×１０^−４Ｍのピレン／アセトン溶液を調製した。そして、このピレン／アセトン溶液を１０００倍に希釈して６×１０^−７Ｍのピレン／アセトン溶液を調製し、その６×１０^−７Ｍのピレン／アセトン溶液を褐色のサンプル管に移した。

【0040】

（１−２）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ＝７．４）の調製
先ず、０．１２１ｇ（１ｍｍｏｌ）のトリスヒドロキシメチルアミノメタンをはかり取り、そのトリスヒドロキシメチルアミノメタンを２００ｍＬのビーカーに移して約８０ｍＬの純水に溶解させた。次に、そのトリスヒドロキシメチルアミノメタン水溶液のｐＨをｐＨメーターで測定しながら、トリスヒドロキシメチルアミノメタン水溶液に１Ｍの塩酸水溶液を徐々に加えてそのｐＨを７．４に調整した。最後に、ｐＨ調整済みのトリスヒドロキシメチルアミノメタン水溶液を１００ｍＬのメスフラスコに移して、純水でメスアップした。

【0041】

（１−３）ＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液の調製
５×１０^−１ｇ／ｄＬのＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液を３ｍＬ調製した。そして、このＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液を希釈して１×１０^−６ｇ／ｄＬから５×１０^−１ｇ／ｄＬまでの濃度の異なるＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ／Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ緩衝溶液を調製した。

【0042】

（２）試験手順および結果
先ず、６×１０^−７Ｍピレン／アセトン溶液をシリンジで褐色バイアル瓶に１ｍＬずつ加えた。次に、このバイアル瓶をデシケーターに入れ、デシケーター内をダイヤフラムポンプで減圧状態にして同溶液中のアセトンを完全に蒸発させた。次いで、ＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液を１ｍＬずつバイアル瓶に加えた後、Ｖａｃｕｕｍ Ｏｖｅｎ ＡＤＰ２００（ヤマト科学株式会社製）を用いてそのＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液を６０℃で２時間インキュベートした。続いて、バイアル瓶にアルミホイルをかぶせてＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液を室温で一晩インキュベートした。そして、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ Ｆ−２５００（株式会社日立製作所製）を用いてＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液の蛍光スペクトルを測定した。その際の使用セルおよび測定条件は以下の通りであった。

【0043】

使用セル：石英セル（４面透過）１０×１０×４５ｍｍ
測定条件 励起波長：３３４ｎｍ
蛍光開始：３５０ｎｍ 蛍光終了：５００ｎｍ
スリット励起：１０ｎｍ 蛍光：２．５ｎｍ

【0044】

上記の測定条件でピレンの蛍光スペクトルを測定した後、３７３ｎｍおよび３９３ｎｍの蛍光強度をそれぞれＩ_１、Ｉ_３とし、その比Ｉ_３／Ｉ_１を濃度（常用対数で表記）に対してプロットする（図１９参照）。そして、このプロットを繋ぐ線の変曲点の濃度を臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）とした（ピレンは周辺環境が親水性から疎水性に変化するとＩ_３が大きくなる性質を有するため、ポリマー濃度を変化させていくと臨界ミセル濃度以上ではピレンがミセル内部に取り込まれることでＩ_３が大きくなり、結果的に比Ｉ_３／Ｉ_１が大きくなる。）。このＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａの臨界ミセル濃度は４．０７×１０^−２ｇ／ｄＬであった。

【0045】

３．サイトカイン（ＴＮＦ−α）の定量試験
先ず、１．２０×１０^４ｃｅｌｌ／ｍＬになるように調整したマウス由来ＲＡＷ２６４．７細胞懸濁液を１ｍＬずつ２４ｗｅｌｌプレートに播種し、細胞培養環境下で２４時間培養した。次に、終濃度が５０μｇ／ｍＬとなるようにＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））に分散させた。次いで、この分散液を１００μＬずつ、ＲＡＷ２６４．７細胞懸濁液が入ったｗｅｌｌプレートに添加して、細胞培養環境下でＣＨ−ＰＥＰ−ＮａをＲＡＷ２６４．７細胞に接触させた。そして、ｗｅｌｌプレート中の培地をエッペンチューブに回収し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製のＭｏｕｓｅ ＴＮＦ ａｌｐｈａ ＥＬＩＳＡ Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｏ（登録商標）を用いて培地中のＴＮＦ−αを定量した。その結果、１１５．７ｐｇのＴＮＦ−αが検出された。

【実施例2】

【0046】

−ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の調製−
先ず、ＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように、実施例１で調製したＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａを超純水に溶かしてＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ水溶液を調製し、そのＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ水溶液４０ｍＬを１１０ｍＬサンプル管に加えた。次に、１ｍｇ／ｍＬのポリ乳酸／クロロホルム溶液１ｍＬをバイアル瓶に加えた。なお、ポリ乳酸の数平均分子量（Ｍｎ）は１．９５×１０^４であり、分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）は１．３４であった。次いで、先の１１０ｍＬサンプル管に撹拌子を入れ、同サンプル管を氷浴しながらマグネティックスターラーで同サンプル管の内容物を４５０ｒｐｍで撹拌した。続いて、パスツールピペットでバイアル瓶から１ｍｇ／ｍＬのポリ乳酸／クロロホルム溶液を吸い取り、その吸い取った１ｍｇ／ｍＬのポリ乳酸／クロロホルム溶液を一滴ずつ１１０ｍＬサンプル管に滴下した。さらに続いて、この１１０ｍＬサンプル管の内容物を４５０ｒｐｍで撹拌しながら同内容物に対して３０分間超音波処理を施した。なお、超音波処理は、デューティ比４０、出力制御１．５〜２の条件下で実施された。そして、１１０ｍＬサンプル管の内容物を３０分間減圧乾燥処理して同内容物からクロロホルムを完全に留去させた後、その内容物をフィルター（孔径０．８μｍ）でろ過した。そのろ液を遠沈管に入れて４５０００ｒｐｍ、４℃で１．５時間超遠心分離処理した後、遠沈管中の上澄みを捨て、残った粒子に純水を加えて粒子を再分散させた。この遠心処理−再分散の処理を３回繰り返して、目的のＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子を得た。なお、得られたＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子のイメージを図１に示す。図１において、符号１００は「ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子」を示し、符号１１０は「ポリ乳酸コア粒子」を示し、符号１２０は「ポリ（リン酸エチレン）ナトリウム塩部位」を示している。また、得られたＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の透過型電子顕微鏡像が図２に示されている（なお、この撮像を可能とするために、ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子にはオキサノールＶＩ（染色剤）が含まれている。オキサノールＶＩは、ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の調製時においてポリ乳酸／クロロホルム溶液に添加される。）。

【0047】

−物性測定および試験−
１．粒子径測定
（１）透過型電子顕微鏡を利用したＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の粒子径測定
先ず、０．１μｇ／ｍＬのＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の水性分散液を調製した。次に、この水性分散液１０μｍをブチラール支持膜（ＳＴＥＭ Ｃｕ１５０グリッド（ピッチ：１５０μｍ），応研商事株式会社製）に滴下して５分間静置した後、そのブチラール支持膜をピンセットで静かに持ち上げ、ブチラール支持膜上の残液をキムワイプに吸収させた。そして、水性分散液滴下からキムワイプ（登録商標）での拭き取りまでの操作を３回繰り返した。その後、ブチラール支持膜をデシケーターに格納して減圧下で一晩乾燥させた。そして、乾燥後のブチラール支持膜を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ，日本電子株式会社製のＳｅｍＡｆｏｒｅ５．２１）で観察した。なお、透過型電子顕微鏡による観察は、ＨＴ Ｖｏｌｔａｇｅ:１００ｋＶの条件下で行った。そして、その透過型電子顕微像中の各粒子の粒子径（直径）を計測し、それらの粒子径の平均値をとったところ８８．２ｎｍであった。

【0048】

（２）動的光散乱法を利用したナノ粒子の粒子径測定
蒸留水または緩衝水溶液を分散媒として用いて０．５ｍｇ／ｍＬのＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の水性分散液を調製した。そして、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ−ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ社製）を用いてその水性分散液中のＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の粒子径（直径）および分散度（ＰＤＩ）を測定した。その結果、平均粒子径は９８．６４ｎｍであり、分散度は０．１４であった。参考までに述べておくと、分散度は０から１の範囲内の数値であり、分散度が０である場合は粒子径の分布が全くなく、分散度が０．１以下の値を示す場合は単分散と言え、分散度が０．１から０．３の間の値を示す場合は狭い粒子径分布を有すると言え、分散度が０．５より大きい値を示す場合は多分散であると言える。したがって、ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の粒子径は単分散であると言える。図３にはこのＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の粒径分布が実線で示されている。

【0049】

また、ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の調製後から７日間、１日おきに平均粒子径および分散度を測定した。その結果を図４に示す。図４に示されるように、ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の平均粒子径および分散度は共にほぼ一定であった。したがって、このＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子は極めて高い安定性を示すことが明らかとなった。

【0050】

２．ζ電位測定
蒸留水または緩衝水溶液を分散媒として用いて０．５ｍｇ／ｍＬのＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の水性分散液を調製した。そして、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ−ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ社製）を用いてその水性分散液中のＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子のζ電位を測定した。その結果、このＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子のζ電位は−５９．５ｍＶであった。

【0051】

３．生体適合試験
（１）溶血試験
（１−１）試薬の調製
（ｉ）ハンクス緩衝溶液の調製
先ず、８．００ｇの塩化ナトリウム、０．４０ｇの塩化カリウム、１．００ｇのＤ−グルコース、０．１２０８ｇのリン酸水素二ナトリウム１２水和物および０．０６ｇのリン酸二水素カリウムを１Ｌの蒸留水に溶解させた。そして、この水溶液のｐＨを固体の炭酸水素ナトリウムで調整することによってハンクス緩衝溶液（ＨＢＳＳ）を調製した。

【0052】

（ｉｉ）Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００／ＨＢＳＳ溶液の調製
５重量％になるようにＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００をハンクス緩衝溶液で希釈して、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００／ＨＢＳＳ溶液を調製した。

【0053】

（ｉｉｉ）ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子/ＨＢＳＳ分散液の調製
終濃度がそれぞれ１．０×１０^−１ｍｇ／ｍＬ、１．０×１０^−２ｍｇ／ｍＬ、１．０×１０^−３ｍｇ／ｍＬおよび１．０×１０^−４ｍｇ／ｍＬになるようにＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子をハンクス緩衝溶液で希釈して、最終的に濃度が異なる４種類のＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子/ＨＢＳＳ分散液を用意した。

【0054】

（１−２）試験手順および結果
先ず、予め３ｍＬの３．８重量％クエン酸三ナトリウム水溶液が入ったシリンジでヒトから採血を行って、採血した血液を５０ｍＬ容量の遠沈管に同管の内壁を伝わせながら加えた。次に、その遠沈管を遠心分離機（ベックマンコールター株式会社製のＡｌｌｅｇｒａ（登録商標）２１Ｒ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）にセットして１２００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離処理を行った後、遠沈管内に生じた上澄みを取り除き、沈殿物をハンクス緩衝溶液で１．５倍に希釈した。次いで、その遠沈管を遠心分離機にセットして２８００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離処理を行った。そして、上澄みに色の変化がなくなるまで、希釈−遠心分離処理の操作を繰り返し行った後、沈殿物にハンクス緩衝溶液を加えて血球懸濁液の全量を３０ｍＬにした。続いて、この血液懸濁液の一部を取り、これをハンクス緩衝溶液で１０倍に希釈した。さらに続けて、２００μＬのＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子/ＨＢＳＳ分散液が入ったエッペンチューブに、ハンクス緩衝溶液で１０倍に希釈した血液懸濁液８００ｍＬを加えて混合した。また、コントロールとして２００μＬのＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００／ＨＢＳＳ溶液および２００μＬのハンクス緩衝溶液が入ったエッペンチュ−ブに先の血球懸濁液８００μＬを加えて混合した。そして、これら３種類の試料を３７℃で３時間インキュベートした後、２０００ｒｐｍ、室温で１０分間遠心分離処理した。処理液の上澄みを９６ｗｅｌｌプレートに２００μＬずつ移し、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製Ｍｏｄｅｌ６８０ ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ ＲＥＡＤＥＲ）で各試料の吸光度（吸光波長（λ）４０５ｎｍ）を測定した。

【0055】

溶血率すなわち溶血活性は、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００／ＨＢＳＳ溶液入りの血球懸濁液の吸光度を１００とし、「Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００／ＨＢＳＳ溶液入りの血球懸濁液」の吸光度に対する「ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子/ＨＢＳＳ分散液入りの血球懸濁液」および「ハンクス緩衝溶液入りの血球懸濁液」の比率として求めた。その結果を図５に示す。なお、本結果は、図５中、各ナノ粒子濃度の左側の棒に表わされている。図５に示されるようにＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子/ＨＢＳＳ分散液入りの血球懸濁液の溶血活性は極めて低くなっており、赤血球をほとんど破壊しないことが明らかとなった。

【0056】

（２）細胞毒性試験
（２−１）試薬の調製
（ｉ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））の調製
０．９６ｇのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ（フナコシ株式会社製）を１１０ｍＬの超純水に溶解させた後、その水溶液をオートクレーブで１２１℃、１５分間
滅菌してリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））を得た。

【0057】

（ｉｉ）１０％ＦＢＳ／ＭＥＭ−αの調製
４５０ｍＬのＭＥＭ−α（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ α）に５ｍＬのＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）と５０ｍＬのＦＢＳ（ｂｉｏｗｅｓｔ社製ｂｉｏｗｅｓｔ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）を無菌的に加えて、１０％ＦＢＳ／ＭＥＭ−αを得た。

【0058】

（ｉｉｉ）ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子／ＰＢＳ分散液の調製
１．１ｍｇ／ｍＬ（終濃度１．０×１０^−１ｍｇ／ｍＬ）になるようにＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ １０ｘ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）でＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子を希釈した後、その希釈液をフィルター（孔径０．２μｍ）に通すことで滅菌処理した。そして、終濃度がそれぞれ１．０×１０^−２ｍｇ／ｍＬ、１．０×１０^−３ｍｇ／ｍＬ、１．０×１０^−４ｍｇ／ｍＬ、１．０×１０^−５ｍｇ／ｍＬおよび１．０×１０^−６ｍｇ／ｍＬになるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））でそのろ液を希釈して、最終的に濃度が異なる６種類のＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子／ＰＢＳ分散液を用意した。

【0059】

（２−２）試験手順および結果
先ず、１０×１０^４ｃｅｌｌ／ｍＬになるように調製したマウス由来ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞懸濁液を１００μＬずつ９６ｗｅｌｌプレートに播種し、細胞培養環境下で２４時間培養した。次に、ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子／ＰＢＳ分散液をそれぞれ１０μＬずつ、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞懸濁液が入った９６ｗｅｌｌプレートに添加して、細胞培養環境下でＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子をＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に２４時間接触させた。次いで、ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子と接触させたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に１０μＬのＷＳＴ−８溶液を添加して、細胞培養環境下で４時間反応させた。そして、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製Ｍｏｄｅｌ６８０ ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ ＲＥＡＤＥＲ）で各試料の吸光度（吸光波長（λ）４５０ｎｍ）を測定した。また、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞懸濁液にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））を加えてコントロール液を調製し、そのコントロール液の吸光度（吸光波長（λ）４５０ｎｍ）を測定した。

【0060】

コントロール液の吸光度を１００とし、「コントロール液の吸光度」に対する「各試料液の吸光度」の比率を求め、それを細胞生存率とした。その結果を図６に示す。なお、本結果は、図６中、各ナノ粒子濃度の左側の棒に表わされている。図６に示されるようにＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子は、いずれの濃度においてもＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に対してほとんど毒性を示さないことが明らかとなった。

【0061】

４．細胞取り込み試験
（１）試薬の調製
（１−１）蛍光粒子含有ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の調製
１ｍｇ／ｍＬのポリ乳酸／クロロホルム溶液１ｍＬに対して５０μＬのＱＤ溶液を加えた以外は、実施例２の「−ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の調製−」の欄に記載した調製方法と同一の調製方法で蛍光粒子含有ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子を調製した。

【0062】

（１−２）蛍光粒子含有ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子／ＰＢＳ分散液の調製
１．１ｍｇ／ｍＬ（終濃度１．０×１０^−１ｍｇ／ｍＬ）になるようにＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ １０ｘ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）で蛍光粒子含有ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子を希釈した後、その希釈液をフィルター（孔径０．２μｍ）に通すことで滅菌処理した。そして、終濃度が１．０×１０^−２ｍｇ／ｍＬになるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））でそのろ液を希釈して蛍光粒子含有ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子／ＰＢＳ分散液を得た。

【0063】

（２）試験手順および結果
先ず、「２０×１０^４ｃｅｌｌ／ｍＬになるように調整したマウス由来ＲＡＷ２６４．７細胞懸濁液」および「２×１０^４ｃｅｌｌ／ｍＬになるように調製したマウス由来ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞懸濁液」をそれぞれ１ｍＬずつプラスチックディッシュに播種し、細胞培養環境下で２４時間培養した。次に、蛍光粒子含有ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子／ＰＢＳ分散液をそれぞれ１００μＬずつ、ＲＡＷ２６４．７細胞懸濁液およびＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞懸濁液が入ったプラスチックディッシュに添加して、細胞培養環境下で蛍光粒子含有ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子をＲＡＷ２６４．７細胞およびＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞それぞれに２４時間接触させた。次いで、培地を廃棄した後に各細胞が剥がれないように緩やかにピペッティングしながら各細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））で洗浄した。そして、この操作を計３回行った。最後に、新しい血清培地１ｍＬを各細胞に添加して共焦点レーザー顕微鏡で各細胞を観察した。その結果を図７および図８に示す。なお、図７がＲＡＷ２６４．７細胞に対する結果であり、図８がＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に対する結果である。なお、左側の像が共焦点レーザー顕微鏡像であり、中央の像が微分干渉顕微鏡像であり、右側の像が共焦点レーザー顕微鏡像と微分干渉顕微鏡像との合成像である。また、微分干渉顕微鏡像および合成像の白色部分が蛍光発光箇所すなわち蛍光粒子含有ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の存在箇所である。これらの像より、ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子はＲＡＷ２６４．７細胞およびＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に効率的に取り込まれることが明らかとなった。

【0064】

なお、参考までに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））のみをＲＡＷ２６４．７細胞およびＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に接触させたときのＲＡＷ２６４．７細胞およびＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の共焦点レーザー顕微鏡像、微分干渉顕微鏡像およびそれらの合成像を図９および図１０に示した。なお、図９がＲＡＷ２６４．７細胞に対する結果であり、図１０がＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に対する結果である。

【0065】

５．サイトカインの定量試験
実施例１の「（３）サイトカイン（ＴＮＦ−α）の定量試験」の欄に記載した試験方法と同一の試験方法でＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子をＲＡＷ２６４．７細胞に接触させると共に、同欄に記載した定量方法と同一の定量方法でＴＮＦ−αを定量した。その結果、１６９．２ｐｇのＴＮＦ−αが検出された。

【0066】

（比較例１）
−ＰＥＧ表面修飾ナノ粒子の調製−
ＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａをコレステロール末端ポリエチレングリコール（重量平均分子量（Ｍｗ）：６．０×１０^３，分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）：１．０７，臨界ミセル濃度：５．５３×１０^−４ｇ／ｄＬ，ポリエチレングリコール部位の繰り返し単位数：約１０６）に代えた以外は、実施例２の「−ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の調製−」の欄に記載した調製方法と同一の調製方法でＰＥＧ表面修飾ナノ粒子を調製した。得られたＰＥＧ表面修飾ナノ粒子の透過型電子顕微鏡像が図１１に示されている（なお、この撮像を可能とするために、ＰＥＧ表面修飾ナノ粒子にはオキサノールＶＩ（染色剤）が含まれている。オキサノールＶＩは、ＰＥＧ表面修飾ナノ粒子の調製時においてポリ乳酸／クロロホルム溶液に添加される。）。

【0067】

−物性測定および試験−
１．粒子径測定
（１）透過型電子顕微鏡を利用したＰＥＧ表面修飾ナノ粒子の粒子径測定
実施例１に記載した測定方法と同一の測定方法でＰＥＧ表面修飾ナノ粒子の平均粒子径（直径）を測定したところ、その平均粒子径は９４．０ｎｍであった。

【0068】

（２）動的光散乱法を利用したナノ粒子の粒子径測定
実施例１に記載した測定方法と同一の測定方法でＰＥＧ表面修飾ナノ粒子の平均粒子径（直径）を測定したところ、その平均粒子径は１０５．９ｎｍであった。また、分散度（ＰＤＩ）は０．１７であった。したがって、ＰＥＧ表面修飾ナノ粒子の粒子径は単分散であると言える。図３にはこのＰＥＧ表面修飾ナノ粒子の粒径分布が破線で示されている。

【0069】

また、ＰＥＧ表面修飾ナノ粒子の調製後から７日間、１日おきに平均粒子径および分散度を求めた。その結果を図１２に示す。図１２に示されるように、ＰＥＧ表面修飾ナノ粒子の平均粒子径は日が経つに伴って減少し、分散度は日が経つに伴って上昇した。したがって、このＰＥＧ表面修飾ナノ粒子は安定性に優れるとは言い難いことが明らかとなった。

【0070】

２．ζ電位測定
実施例１に記載した測定方法と同一の測定方法でＰＥＧ表面修飾ナノ粒子のζ電位を測定したところ、そのζ電位は−２６．９ｍＶであった。

【0071】

３．生体適合試験
（１）溶血試験
ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子をＰＥＧ表面修飾ナノ粒子に代えた以外は、実施例２に記載した試験手順と同一の試験手順で試験を行った。その結果を図５に示す。なお、本結果は、図５中、各ナノ粒子濃度の右側の棒に表わされている。図５に示されるようにＰＥＧ表面修飾ナノ粒子/ＨＢＳＳ分散液入りの血球懸濁液の溶血活性は極めて低くなっており、赤血球をほとんど破壊しないことが明らかとなった。

【0072】

（２）細胞毒性試験
ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子をＰＥＧ表面修飾ナノ粒子に代えた以外は、実施例２に記載した試験手順と同一の試験手順で試験を行った。その結果を図６に示す。なお、本結果は、図６中、各ナノ粒子濃度の右側の棒に表わされている。図６に示されるようにＰＥＧ表面修飾ナノ粒子は、いずれの濃度においてもＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に対してほとんど毒性を示さないことが明らかとなった。

【0073】

４．サイトカインの定量試験
実施例１の「（３）サイトカイン（ＴＮＦ−α）の定量試験」の欄に記載した試験方法と同一の試験方法でＰＥＧ表面修飾ナノ粒子をＲＡＷ２６４．７細胞に接触させると共に、同欄に記載した定量方法と同一の定量方法でＴＮＦ−αを定量した。その結果、９６．７ｐｇのＴＮＦ−αが検出された。

【0074】

（比較例２）
−ＰＭＢ表面修飾ナノ粒子の調製−
ＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａを、以下の化学式（３）に示されるポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ｃｏ−メタクリル酸ブチル）（以下「ＰＭＢ」と称する）に代えた以外は、実施例２の「−ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子の調製−」の欄に記載した調製方法と同一の調製方法でＰＭＢ表面修飾ナノ粒子を調製した。なお、このＰＭＢ表面修飾ナノ粒子に貧食されないことが明らかとなっている。

【化7】

【0075】

−物性測定および試験−
１．細胞取り込み試験
（１）試薬の調製
（１−１）蛍光粒子含有ＰＭＢ表面修飾ナノ粒子の調製
１ｍｇ／ｍＬのポリ乳酸／クロロホルム溶液１ｍＬに対して５０μＬのＱＤ溶液を加えた以外は、上述と同一の調製方法で蛍光粒子含有ＰＭＢ面修飾ナノ粒子を調製した。

【0076】

（１−２）蛍光粒子含有ＰＭＢ表面修飾ナノ粒子／ＰＢＳ分散液の調製
１．１ｍｇ／ｍＬ（終濃度１．０×１０^−１ｍｇ／ｍＬ）になるようにＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ １０ｘ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）で蛍光粒子含有ＰＭＢ表面修飾ナノ粒子を希釈した後、その希釈液をフィルター（孔径０．２μｍ）に通すことで滅菌処理した。そして、終濃度が１．０×１０^−２ｍｇ／ｍＬになるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））でそのろ液を希釈して蛍光粒子含有ＰＭＢ表面修飾ナノ粒子／ＰＢＳ分散液を得た。

【0077】

（２）試験手順および結果
蛍光粒子含有ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子／ＰＢＳ分散液を蛍光粒子含有ＰＭＢ表面修飾ナノ粒子／ＰＢＳ分散液に代えた以外は、実際例２の「４．細胞取り込み試験」の「（２）試験手順および結果」の欄に記載される試験手順と同一の手順で試験を行った。その結果を図１３および図１４に示す。なお、図１３がＲＡＷ２６４．７細胞に対する結果であり、図１４がＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に対する結果である。なお、左側の像が共焦点レーザー顕微鏡像であり、中央の像が微分干渉顕微鏡像であり、右側の像が共焦点レーザー顕微鏡像と微分干渉顕微鏡像との合成像である。また、微分干渉顕微鏡像および合成像の白色部分が蛍光発光箇所すなわち蛍光粒子含有ＰＭＢ表面修飾ナノ粒子の存在箇所である。これらの像より、ＰＭＢ表面修飾ナノ粒子は、僅かな量しかＲＡＷ２６４．７細胞およびＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に取り込まれないことが明らかとなった。

【0078】

２．サイトカインの定量試験
実施例１の「（３）サイトカイン（ＴＮＦ−α）の定量試験」の欄に記載した試験方法と同一の試験方法でＰＭＢ表面修飾ナノ粒子をＲＡＷ２６４．７細胞に接触させると共に、同欄に記載した定量方法と同一の定量方法でＴＮＦ−αを定量した。その結果、９４．９ｐｇのＴＮＦ−αが検出された。

【0079】

＜実施例および比較例に対する考察＞
実施例２のＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子のζ電位と比較例１のＰＥＧ面修飾ナノ粒子のζ電位とを比較すると、ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子はＰＥＧ面修飾ナノ粒子よりもマイナス電荷を帯びていることがわかる。このため、ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子にはＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａが有効に表面修飾されていることが裏付けられる。

【0080】

また、図１５には、「コントロールとしてのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））」、「実施例１で得られたＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ」、「実施例２で得られたＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子」、「比較例１で得られたＰＥＧ表面修飾ナノ粒子」および「比較例２で得られたＰＭＢ表面修飾ナノ粒子」をＲＡＷ２６４．７細胞に接触させた際に産生されたＴＮＦ−α量が示されている。この「実施例１で得られたＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ」および「実施例２で得られたＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子」をＲＡＷ２６４．７細胞に接触させると、「比較例１で得られたＰＥＧ表面修飾ナノ粒子」および「比較例２で得られたＰＭＢ表面修飾ナノ粒子」をＲＡＷ２６４．７細胞に接触させた場合に比べて多量のＴＮＦ−αを産生することが明らかとなった。したがって、「実施例１で得られたＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ」および「実施例２で得られたＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子」には、「比較例１で得られたＰＥＧ表面修飾ナノ粒子」および「比較例２で得られたＰＭＢ表面修飾ナノ粒子」よりも優れた免疫賦活化機能が認められた。また、「実施例２で得られたＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子」は、「実施例１で得られたＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ」よりも著しくその機能に秀でていることが明らかとなった。すなわち、「実施例１で得られたＣＨ−ＰＥＰ−Ｎａ」をナノ粒子化にすることによって免疫賦活化機能が向上することが確認された。なお、その効果をよりわかりやすくするために、図１６では、各試料に対応するＴＮＦ−α量からコントロールのＴＮＦ−α量を差し引いた値が棒グラフ化されている。

【産業上の利用可能性】

【0081】

本発明に係る化合物およびナノ粒子は、免疫賦活化剤（より具体的にはサイトカイン産生促進組成物、腫瘍壊死因子産生促進組成物、ＴＮＦ−α産生促進組成物）の有効成分として利用することができる。

【符号の説明】

【0082】

１００ ＰＥＰ−Ｎａ表面修飾ナノ粒子（ナノ粒子）
１１０ ポリ乳酸コア粒子（コア粒子）
１２０ ポリ（リン酸エチレン）ナトリウム塩部位（化合物）