特開 2019-110811 萎黄病菌由来の核酸を増幅するためのプライマーセットおよび萎黄病菌の検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2019-110811(P2019-110811A)

(43)【公開日】2019年7月11日

(54)【発明の名称】萎黄病菌由来の核酸を増幅するためのプライマーセットおよび萎黄病菌の検出方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20180101AFI20190621BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20190621BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20190621BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20190621BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 AZNA

   C12N15/00 A

   C12Q1/04

   C12M1/34 B

   C12M1/34 Z

【審査請求】有

【請求項の数】11

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】24

(21)【出願番号】特願2017-246578(P2017-246578)

(22)【出願日】2017年12月22日

(11)【特許番号】特許第6381771号(P6381771)

(45)【特許公報発行日】2018年8月29日

(71)【出願人】

【識別番号】304036743

【氏名又は名称】国立大学法人宇都宮大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000109

【氏名又は名称】特許業務法人特許事務所サイクス

(72)【発明者】

【氏名】加藤 寛

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B029AA07

4B029BB02

4B029BB16

4B029BB20

4B029CC01

4B029FA01

4B029FA03

4B029FA12

4B063QA00

4B063QA13

4B063QA18

4B063QQ06

4B063QQ28

4B063QQ42

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR62

4B063QS24

4B063QS34

4B063QX01

(57)【要約】      （修正有）

【課題】萎黄病菌の検出方法としてより迅速な方法の提供を可能とする、ＬＡＭＰ法用プライマーセットを提供する。
【解決手段】ＬＡＭＰ法により、萎黄病菌由来の核酸を増幅するためのプライマーセットであって、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマーがそれぞれ特定の４種の配列により示されるポリヌクレオチド等であるプライマーセット、ならびに上記プライマーセットを用いて、検体から抽出された核酸を鋳型にＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行うことを含む萎黄病菌の検出方法。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＬＡＭＰ法により、萎黄病菌由来の核酸を増幅するためのプライマーセットであって：
配列番号１の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号１の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、萎黄病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチド、もしくは配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、萎黄病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、萎黄病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチド、もしくは配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、萎黄病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー、または、
前記のＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、およびＢ３プライマーをそれぞれ構成するポリヌクレオチドの配列の相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、およびＢ３プライマーを含むプライマーセット。

【請求項2】

さらに、
配列番号５の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号５の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、萎黄病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＬＦプライマー、および
配列番号６の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは、配列番号６の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、萎黄病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＬＢプライマーから選択される１つ以上、または、
前記のＬＦプライマーおよびＬＢプライマーをそれぞれ構成するポリヌクレオチドの配列の相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマーおよびＬＢプライマーから選択される１つ以上を含む請求項１に記載のプライマーセット。

【請求項3】

前記ＬＦプライマーおよび前記ＬＢプライマーの双方を含む請求項２に記載のプライマーセット。

【請求項4】

萎黄病菌の検出方法であって、
検体から核酸を抽出すること、
請求項１〜３のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いて、前記核酸を鋳型にＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行うこと、
増幅産物があると判断された場合に検体に萎黄病菌が存在すると判断することを含む、検出方法。

【請求項5】

検体が土壌である請求項４に記載の検出方法。

【請求項6】

ＬＡＭＰ法により、萎黄病菌および炭疽病菌からなる群より選択される１つ以上の細菌由来の核酸を増幅するための複合プライマーセットであって：
請求項１〜３のいずれか一項に記載のプライマーセット、ならびに
配列番号１１の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号１１の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、炭疽病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号１２の配列により示されるポリヌクレオチド、もしくは配列番号１２の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、炭疽病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号１３の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号１３の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、炭疽病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号１４の配列により示されるポリヌクレオチド、もしくは配列番号１４の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、炭疽病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー、または、
前記のＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、およびＢ３プライマーをそれぞれ構成するポリヌクレオチドの配列の相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、およびＢ３プライマーを含む複合プライマーセット。

【請求項7】

さらに、
配列番号１５の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号１５の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、炭疽病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＬＦプライマー、および
配列番号１６の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは、配列番号１６の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、炭疽病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＬＢプライマーから選択される１つ以上、または、
前記のＬＦプライマーおよびＬＢプライマーをそれぞれ構成するポリヌクレオチドの配列の相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマーおよびＬＢプライマーから選択される１つ以上を含む請求項６に記載の複合プライマーセット。

【請求項8】

前記ＬＦプライマーおよび前記ＬＢプライマーの双方を含む請求項７に記載の複合プライマーセット。

【請求項9】

萎黄病菌および炭疽病菌からなる群より選択される１つ以上の細菌の検出方法であって、
検体から核酸を抽出すること、
請求項６〜８のいずれか一項に記載の複合プライマーセットを用いて、前記核酸を鋳型にＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行うこと、
前記増幅反応後のＤＮＡの二本鎖への会合曲線解析により、検体における上記細菌の存在の有無および存在する細菌の種類を判断することを含む、検出方法。

【請求項10】

請求項１〜３のいずれか一項に記載のプライマーセット、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、ｄＮＴＰｓ及び緩衝液を含む、萎黄病菌の検出用キット。

【請求項11】

ＬＡＭＰ法により、萎黄病菌由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセットであって：
配列番号１７または２２の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号１８の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号１９の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、
配列番号２０の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー、および、
配列番号２１の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマーを含むプライマーセット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、萎黄病菌由来の核酸を増幅するためのプライマーセットおよび萎黄病菌の検出方法に関する。

【背景技術】

【0002】

萎黄病はFusarium oxysporumが誘起する土壌病害である。萎黄病の症状は奇形葉の発生、矮化、葉色の変化などであり、症状が進展すると枯死に至る。特にイチゴでは萎黄病が発生しやすく、イチゴ生産における萎黄病菌の被害額は年間10億円を上回るほどである。萎黄病菌が産出する厚膜胞子は数年間土壌中で生存可能であり、厚膜胞子が潜伏する土壌は感染源となる。またイチゴ苗に感染後、好適条件下でも30〜40日間の潜伏期間があり、健全苗との識別が困難である。潜伏期間にある苗も生産現場に持ち込まれると感染源となる。

【0003】

萎黄病の診断方法としては、雑菌処理した検体（イチゴ葉）を萎黄病菌の伸長に好適な環境下で長期間保管することで潜伏する萎黄病菌の菌糸を誘導し、視認する方法が知られている（非特許文献１）。しかしこの方法は１０日〜２週間の長期間を要するという問題があった。また、菌糸が非病原性糸状菌に起因する場合があり偽陽性を示す問題もあった。

【0004】

非特許文献２および３においては、萎黄病菌の検出方法としてＰＣＲ法およびＬＡＭＰ法を利用した遺伝子診断方法がそれぞれ報告されている。これらの遺伝子診断方法によっては、萎黄病の診断を半日程度で行うことが可能になった。
ＬＡＭＰ法をイチゴ感染性の病原性糸状菌の検出に適用とした例としては、炭疽病菌の検出に用いた報告が非特許文献４にある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】石川成寿 (2011) これで防げるイチゴの炭疽病、萎黄病 農文協

【非特許文献2】Plant Disease 97: 619-625, 2013

【非特許文献3】イチゴ萎黄病菌を同定・検出するためのDNA増幅法、須賀晴久、岐阜大学、生命科学総合研究支援センター（http://www.sangaku.gifu-u.ac.jp/download/pdf/seeds/74.pdf#search=%27%E5%B2%90%E9%98%9C）

【非特許文献4】Gen Plant Pathol DOI 10.1007/s10327-016-0665-8

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

萎黄病の蔓延を防ぐためにはより迅速に萎黄病菌を検出できることが必要である。ＬＡＭＰ法は、ＰＣＲ法よりも処理時間が短く、ＰＣＲ法において必要とされる高額機器も不要であり、実用のために好ましい技術である。しかし、非特許文献３に記載のＬＡＭＰ法を用いた萎黄病菌の検出方法に要する時間は一般的なＬＡＭＰ法と比較して長く、改善の余地がある。

【0007】

本発明は、ＬＡＭＰ法を用いた萎黄病菌の検出方法として、より迅速な方法の提供を課題とするものである。より具体的には、本発明は、上記の方法に利用できる萎黄病菌由来の核酸を増幅するためのプライマーセットを提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、上記課題の解決のために鋭意検討し、非特許文献３に記載のＬＡＭＰ法が長期間を要する原因が、上記方法において増幅されている核酸がコピー数の少ない染色体上にある遺伝子由来であるためであると推定した。そして、萎黄病中での存在量の多いリボゾームＤＮＡの配列を利用してプライマーを設計することに思い至り、さらに検討を重ねて本発明を完成させた。

【0009】

即ち、本発明は以下＜１＞〜＜１１＞を提供するものである。
＜１＞ＬＡＭＰ法により、萎黄病菌由来の核酸を増幅するためのプライマーセットであって：
配列番号１の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号１の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、萎黄病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチド、もしくは配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、萎黄病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、萎黄病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチド、もしくは配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、萎黄病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー、または、
前記のＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、およびＢ３プライマーをそれぞれ構成するポリヌクレオチドの配列の相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、およびＢ３プライマーを含むプライマーセット。

【0010】

＜２＞さらに、
配列番号５の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号５の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、萎黄病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＬＦプライマー、および
配列番号６の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは、配列番号６の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、萎黄病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＬＢプライマーから選択される１つ以上、または、
前記のＬＦプライマーおよびＬＢプライマーをそれぞれ構成するポリヌクレオチドの配列の相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマーおよびＬＢプライマーから選択される１つ以上を含む＜１＞に記載のプライマーセット。
＜３＞前記ＬＦプライマーおよび前記ＬＢプライマーの双方を含む＜２＞に記載のプライマーセット。

【0011】

＜４＞萎黄病菌の検出方法であって、
検体から核酸を抽出すること、
＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載のプライマーセットを用いて、前記核酸を鋳型にＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行うこと、
増幅産物があると判断された場合に検体に萎黄病菌が存在すると判断することを含む、検出方法。
＜５＞検体が土壌である＜４＞に記載の検出方法。
＜６＞ＬＡＭＰ法により、萎黄病菌および炭疽病菌からなる群より選択される１つ以上の細菌由来の核酸を増幅するための複合プライマーセットであって：
＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載のプライマーセット、ならびに
配列番号１１の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号１１の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、炭疽病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号１２の配列により示されるポリヌクレオチド、もしくは配列番号１２の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、炭疽病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号１３の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号１３の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、炭疽病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号１４の配列により示されるポリヌクレオチド、もしくは配列番号１４の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、炭疽病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー、または、
前記のＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、およびＢ３プライマーをそれぞれ構成するポリヌクレオチドの配列の相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、およびＢ３プライマーを含む複合プライマーセット。

【0012】

＜７＞さらに、
配列番号１５の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号１５の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、炭疽病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＬＦプライマー、および
配列番号１６の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは、配列番号１６の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、炭疽病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含むポリヌクレオチドからなるＬＢプライマーから選択される１つ以上、または、
前記のＬＦプライマーおよびＬＢプライマーをそれぞれ構成するポリヌクレオチドの配列の相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマーおよびＬＢプライマーから選択される１つ以上を含む＜６＞に記載の複合プライマーセット。
＜８＞前記ＬＦプライマーおよび前記ＬＢプライマーの双方を含む＜７＞に記載の複合プライマーセット。
＜９＞萎黄病菌および炭疽病菌からなる群より選択される１つ以上の細菌の検出方法であって、
検体から核酸を抽出すること、
＜６＞〜＜８＞のいずれかに記載の複合プライマーセットを用いて、前記核酸を鋳型にＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行うこと、
前記増幅反応後のＤＮＡの二本鎖への会合曲線解析により、検体における上記細菌の存在の有無および存在する細菌の種類を判断することを含む、検出方法。
＜１０＞＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載のプライマーセット、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、ｄＮＴＰｓ及び緩衝液を含む、萎黄病菌の検出用キット。

【0013】

＜１１＞ＬＡＭＰ法により、萎黄病菌由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセットであって：
配列番号１７または２２の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号１８の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号１９の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、
配列番号２０の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー、および、
配列番号２１の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマーを含むプライマーセット。

【発明の効果】

【0014】

本発明により、ＬＡＭＰ法によって萎黄病菌由来の核酸を増幅するためのプライマーセットが提供される。このプライマーセットを用いて、萎黄病菌を迅速に検出することができる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーと標的二本鎖ＤＮＡとの位置関係を示す図である。

【図2】ＰＣＲ法で得られた結果および本発明のプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法で得られた結果を合わせて示す写真である。

【図3】実施例で行ったＬＡＭＰ反応における各サンプルの吸光度変化を示すグラフである。

【図4】本発明の複合プライマーセット用いてＬＡＭＰ法による増幅を行った増幅産物の会合曲線を示す図である。

【図5】ＰＣＲによる増幅産物を３％アガロースゲル上で電気泳動した結果を示す写真である。

【発明を実施するための最良の形態】

【0016】

以下、本発明の実施の形態について更に詳しく述べる。
本明細書中において、核酸の塩基配列中のＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃは、デオキシリボヌクレオチド中のアデニン塩基、グアニン塩基、チミン塩基、シトシン塩基を示す。

【0017】

ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ-Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ)法は、Ｎｏｔｏｍｉらによって開発され、日本特許第３３１３３５８号公報、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ, ２８, ｅ６３, ２０００、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ, ２９０, １１９５-１１９８, ２００２、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ, ４７, Ｎｏ.９, １７４２-１７４３,２００１に報告されている核酸の増幅方法である。一般的に、ＬＡＭＰ法は、ＰＣＲを用いた方法に比べ増幅効率が優れていると共に、サンプル中の不純物の影響も受けにくい。そのため、簡便なサンプルの前処理で目的の核酸の増幅を行うことが可能である。

【0018】

本明細書において「ＬＡＭＰ法」は、ＲＴ−ＬＡＭＰ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法を含む意味で用いられる。ＲＴ−ＬＡＭＰ法においては、逆転写反応とＬＡＭＰ反応を同時に行うことによってＲＮＡを鋳型に核酸の増幅を行う。

【0019】

＜ＬＡＭＰ法に用いるプライマー＞
ＬＡＭＰ法におけるプライマーおよびプライマー設計について、以下説明する。
ＬＡＭＰ法に用いられるプライマーセットは、少なくとも、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーを含む。図１は、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーと標的二本鎖ＤＮＡとの位置関係を示した図である。
ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーは、各々二つの領域を含む。即ち、ＦＩＰはＦ１ｃとＦ２を含み、ＢＩＰはＢ２とＢ１ｃを含む。Ｆ３プライマーはＦ３領域を含んでいる。Ｂ３プライマーはＢ３領域を含む。各プライマーはそれぞれ以下のように設計する。

【0020】

（１）ＦＩＰプライマー：標的核酸のＦ２領域を３´端に持ち、５´末端側に標的核酸のＦ１ｃと同じ配列を持つように設計する。
（２）Ｆ３プライマー：標的核酸のＦ３領域を持つように設計する。
（３）ＢＩＰプライマー：標的核酸のＢ２領域を３´端に持ち、５´末端側に標的核酸のＢ１ｃと同じ配列を持つように設計する。
（４）Ｂ３プライマー：標的核酸のＢ３領域を持つように設計する。

【0021】

ここで、Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃ領域は、二本鎖を構成する一方の鎖のＤＮＡの５'末端側から３'末端側方向にかけてこの順で設定された領域である。またＢ３、Ｂ２、Ｂ１、Ｆ１ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ３ｃ領域は、その相補鎖のＤＮＡの５'末端側から３'末端側方向にかけてこの順で設定された領域である。このときＢ３とＢ３ｃ、Ｂ２とＢ２ｃ、Ｂ１とＢ１ｃ、Ｆ１ｃとＦ１、Ｆ２ｃとＦ２、Ｆ３ｃとＦ３は相補鎖である。

【0022】

このようなＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマーおよびＢ３プライマーを用いてＬＡＭＰ増幅を行なうと、図１の二本鎖ＤＮＡの夫々の鎖から、ダンベル型のステム・アンド・ループ構造の増幅産物が得られる。その増幅機構については、例えば、Ｗｅｂサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｉｋｅｎ．ｃｏ．ｊｐ／、または特開２００２−１８６７８１号公報を参照することが可能である。

【0023】

プライマーセットは、上記４種のプライマーのほかにループプライマーを含むことが好ましい。ループプライマーとしては、ＬＦプライマー、ＬＢプライマー、またはＬＦプライマーおよびＬＢプライマーを用いることが好ましい。ＬＦプライマーおよびＬＢプライマーは、増幅反応の起点となるダンベル構造の５'末端側のループの１本鎖部分に相補的な配列を持つループプライマーである。ＬＦプライマーは、図１中のＦ１領域とＦ２領域の間の配列に相補的な配列を持つようにすれば設計でき、ＬＢプライマーは、図１中のＢ１領域とＢ２領域の間の配列に相補的な配列を持つように設計できる。ＬＦプライマー及びＬＢプライマーを用いることにより、ＤＮＡ合成の起点を増やすことが可能となり、増幅効率が上がり、増幅に要する時間を１／３〜１／２に短縮することが可能となる。

【0024】

＜プライマーセット＞
本発明のプライマーセットはＬＡＭＰ法により萎黄病菌由来の核酸を増幅するためのプライマーセットである。
上記プライマーセットは、リボゾームＤＮＡ配列情報に基づき、保存性の高い領域において、Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１ｃ、Ｂ１ｃ、Ｂ２、Ｂ３領域を選択して設計された。
表１に複数の萎黄病菌株のリボゾームＤＮＡ配列情報のアライメントを示す。

【0025】

【表1】

【0026】

さらにループプライマーとして、ＬＦプライマーおよびＬＢプライマーを設計した。

【0027】

【表2】

【0028】

【表3】

【0029】

本発明者らは、リボゾームＤＮＡ配列情報に基づいて設計されたプライマーセットを用いてＬＡＭＰ反応を行うことにより、より迅速な萎黄病菌の検出が可能であることを見出した。リボゾームは、細胞における存在量が核と比較して多いためと考えられる。

【0030】

上記ＦＩＰプライマーは、萎黄病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含んでいてもよい。
具体的には、上記ＦＩＰプライマーは、配列番号１で示されるポリヌクレオチドの何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換しているかまたは、欠失および／もしくは挿入を有していてもよい。特に１〜数個のヌクレオチドが置換していてもよい。そのようなポリヌクレオチドの例は、アライメントに用いたいずれかの株におけるＦ２領域の配列を３´端に持ち、５´末端側に各株におけるＦ１領域の相補配列を持つポリヌクレオチドである。

【0031】

配列番号１で示されるポリヌクレオチドは配列番号８で表されるＦ２領域と配列番号７で表されるＦ１ｃ領域とが直接結合したものであるが、ＦＩＰプライマーは、Ｆ２領域とＦ１ｃ領域との間に、１〜６ヌクレオチドの配列（例えば、スペーサーとして使用される配列一例としてＡ、Ｔ、ＴＴ、ＴＴＴ、ＴＴＴＴ、ＴＴＴＴＡ、ＴＴＴＴＴ、ＴＴＴＴＴＴもしくは制限酵素認識配列（ＧＡＡＴＴＣ；制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位、ＧＧＡＴＴＣ；制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位、ＣＴＧＣＡＣ；制限酵素ＰｓｔＩ認識部位、ＧＡＴＡＴＣ；制限酵素ＥｃｏＲＶ認識部位）を含むポリヌクレオチドであってもよい。ただし、ＦＩＰプライマーにおいて、Ｆ２領域とＦ１ｃ領域は直接結合していることが好ましい。

【0032】

さらに、変異は上記ＦＩＰプライマー中のＧＣ含量が５０〜６０％になるような範囲の変異であることが好ましい。
プライマーは上記の範囲のポリヌクレオチドが、混合プライマーとして調製されたものであってもよい。

【0033】

上記ＢＩＰプライマーは、萎黄病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含んでいてもよい。
具体的には、上記ＢＩＰプライマーは、配列番号２の配列で示されるポリヌクレオチドの何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換しているかまたは、欠失および／もしくは挿入を有していてもよい。特に１〜数個のヌクレオチドが置換していてもよい。そのようなポリヌクレオチドの例は、アライメントに用いたいずれかの株におけるＢ２領域の配列を３´端に持ち、５´末端側に表１で示される各株におけるＢ１領域の相補配列を持つポリヌクレオチドである。

【0034】

配列番号２の配列で示されるポリヌクレオチドは、配列番号１０で表されるＢ２領域の配列と配列番号９で表されるＢ１ｃ領域の配列が直接結合したものである。ＢＩＰプライマーは、Ｂ２領域とＢ１ｃ領域に対応する配列との間に、１〜６ヌクレオチドの配列（例えば、スペーサーとして使用される配列、一例としてＡ、Ｔ、ＴＴ、ＴＴＴ、ＴＴＴＴ、ＴＴＴＴＡ、ＴＴＴＴＴ、ＴＴＴＴＴＴもしくは制限酵素認識配列(ＧＡＡＴＴＣ;制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位、ＧＧＡＴＴＣ;制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位、ＣＴＧＣＡＣ;制限酵素ＰｓｔＩ認識部位、ＧＡＴＡＴＣ;制限酵素ＥｃｏＲＶ認識部位）を含むポリヌクレオチドであってもよい。ただし、ＢＩＰプライマーにおいて、Ｂ２領域とＢ１ｃ領域は直接結合していることが好ましい。

【0035】

さらに、変異は上記ＢＩＰプライマー中のＧＣ含量が５０〜６０％になるような範囲の変異であることが好ましい。
プライマーは上記の範囲のポリヌクレオチドが、混合プライマーとして調製されたものであってもよい。

【0036】

上記Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＬＦプライマー、およびＬＢプライマーは、それぞれ、萎黄病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含んでいてもよい。
具体的には、それぞれ配列番号３から６それぞれの配列で示されるポリヌクレオチドの何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換しているかまたは、欠失および／もしくは挿入を有していてもよい。特に１〜数個のヌクレオチドが置換していてもよい。そのようなポリヌクレオチドの例は、アライメントに用いた示されるいずれかの株における、それぞれＦ３領域、Ｂ３領域、ＬＦ２領域、ＬＢ２領域の配列を持つポリヌクレオチドである。

【0037】

さらに、変異は上記Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＬＦプライマー、およびＬＢプライマーのそれぞれのＧＣ含量が５０〜６０％になるような範囲の変異であることが好ましい。
プライマーは上記の範囲のポリヌクレオチドが、それぞれ混合プライマーとして調製されたものであってもよい。

【0038】

ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＬＦプライマー、およびＬＢプライマーは、それぞれについて上述されるポリヌクレオチドを、全て同時に相補配列としたものによりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなっていてもよい。

【0039】

プライマーセットにおける各プライマーは、それぞれの塩基配列情報をもとに、一般的なＤＮＡ合成機で合成することができる。

【0040】

また、プライマーセットにおけるプライマー量比は特に限定されず、ＬＡＭＰ法において一般的である量比で用いればよい。例えば、ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーを同モル量、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーを同モル量とし、ＦＩＰプライマーの５０％〜１０％のモル量でＦ３プライマーを用いることができる。例えば、反応液１２．５マイクロリットルで目視判定する場合、１サンプル当たり、Ｆ３プライマーとＢ３プライマーはそれぞれ２．５ピコモル、ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーはそれぞれ２０ピコモル、ＬＦプライマーとＬＢプライマーはそれぞれ１０ピコモルとすることができる。反応液２５マイクロリットルで目視判定もしくはカネカ温調機能付き吸光度計 ＭｙＡｂｓｃｏｐｅ（登録商標）、エンドポイント濁度測定装置ＬＴ−１６（ニッポンジーン）もしくはＬＡＭＰ法用ＬＦ−８ Ｐｌｕｓ（ニッポンジーン）を使用する場合、１サンプル当たり、Ｆ３プライマーとＢ３プライマーはそれぞれ５ピコモル、ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーはそれぞれ４０ピコモル、ＬＦプライマーとＬＢプライマーはそれぞれ２０ピコモルで用いることができる。またＧｅｎｅｌｙｚｅｒ Ｆ（ＴＯＳＨＩＢＡ ＭＥＤＩＣＡＬ)、Ｇｅｎｉｅ（登録商標）ＩＩＩ（ニッポンジーン）を用いたモニタリングを行う場合、反応液２５マイクロリットルで１サンプル当たり、Ｆ３プライマーとＢ３プライマーはそれぞれ５ピコモル、ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーはそれぞれ２０ピコモル、ＬＦプライマーとＬＢプライマーはそれぞれ１０ピコモルで用いることができる。

【0041】

＜ＬＡＭＰ法：核酸の増幅＞
ＬＡＭＰ法によるＤＮＡの増幅反応においては、検体から抽出された核酸と、プライマーセットと、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素と、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰ）と、緩衝液とを含む反応液を、等温で一定時間静置すればよい。ＲＴ−ＬＡＭＰ法を行う場合は、さらに逆転写酵素を上記反応液に添加すればよい。

【0042】

温度は、５０℃以上７５℃以下が好ましく、６０℃以上６５℃以下がより好ましく、６３℃がさらに好ましい。静置時間は、１５分以上であればＤＮＡの増幅を検出できるが、１５分以上１時間以内が好ましく、２０分以上４０分以内がより好ましい。

【0043】

鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、ｄＮＴＰｓ及び緩衝液としては、例えば、Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ増幅試薬キット（栄研化学社製）に含まれる各試薬を使用できる。
またＬＡＭＰ法用ＤＮＡ増幅試薬セット-動物種・植物病検査専用Ａ-(ニッポンジーン) 及び ＬＡＭＰ法用ＤＮＡ増幅試薬セット-動物種・植物病検査専用Ｂ-(ニッポンジーン)も使用可能である。等温増幅蛍光測定装置Ｇｅｌｙｚｅｒ^TM Ｆシリーズ（ＴＯＳＨＩＢＡ ＭＥＤＩＣＡＬ）もしくは等温増幅蛍光測定装置Ｇｅｎｉｅ（登録商標）ＩＩＩ(ニッポンジーン)を使用する際は遺伝子増幅用試薬Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＯＳＨＩＢＡ ＭＥＤＩＣＡＬ）もしくはＩｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｆｏｒ Ｇｅｎｉｅ（登録商標）ＩＩＩ（ニッポンジーン）も使用可能である。

【0044】

＜萎黄病菌の検出＞
上記のプライマーセットを用いて核酸の増幅を行うことにより、簡便、安価、高速に、萎黄病菌を検出することが可能である。具体的には、検体に含まれる核酸をＬＡＭＰ増幅反応に供し、増幅反応の結果生じた増幅産物の有無を判定することにより、検体中の萎黄病菌を検出することができる。

【0045】

ここで「検体」としては、萎黄病が発生しうる全ての植物が挙げられる。検体となるうる植物としては、例えば、イチゴ、大根、キャベツ、レタス、コマツナ、およびチンゲンサイなどの他、コスモスなどの草花が挙げられる。イチゴは、萎黄病が発生しやすく、発生した場合の生産者への被害額も大きくなるため検体として好ましい。
植物において検体とする部位としては、葉、実、茎、根等、いずれの部位を用いてもよいが、葉を用いることが好ましい。

【0046】

また、土壌、特に上記植物の栽培のための土壌を検体とすることもできる。上述のように萎黄病菌が産出する厚膜胞子は数年間土壌中で生存可能であり、上記植物の栽培のための土壌を検体として萎黄病菌の有無を確認することにより、萎黄病の発生や拡大を未然に防止することが可能である。より確実な検出を行うために土壌は、フザリウム属菌を選択的に成長させるＦＯＧ２培地による前培養を行って検体とすることも好ましい。

【0047】

検体から、核酸を抽出し、抽出した核酸を鋳型としてＬＡＭＰ法による増幅反応を行う。核酸の抽出は、公知の方法で行えばよい。
い。
増幅産物の有無の判断は、例えば、ＬＡＭＰ法による核酸の増幅反応を行った後の反応液を肉眼で観察し、反応液の白濁が確認された場合に菌が存在すると判断できる。また、この反応液にＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ等の蛍光インターカレーターを加え、ＵＶ照射下で核酸の増幅を示す発光が確認された場合に菌が存在すると判断できる。この判断は目視で行うことも可能である。

【0048】

カネカ社性の温調機能付き吸光度計（ＭｙＡｂｓｃｏｐｅ（登録商標））もしくはエンドポイント濁度測定装置ＬＴ-１６（ニッポンジーン）、ＬＡＭＰ法用ＬＦ−８ Ｐｌｕｓ（ニッポンジーン）を用いて増幅産物量に応じた吸光度の変化を測定してもよい。増幅産物の有無に加えて、増幅産物の量をある程度判断することが可能である。

【0049】

また、ＬＡＭＰ反応で得られる一本鎖核酸の二本鎖への会合をモニタリングして会合曲線解析を行うことにより、増幅された核酸の検出が可能である。このような会合の解析は、例えば、東芝メディカルシステムズ株式会社の等温増幅蛍光測定装置Ｇｅｎｅｌｙｚｅｒ ＦもしくはＧｅｎｉｅ(登録商標)ＩＩＩ(ニッポンジーン)を用いて行うことができる。測定の際は、上記測定装置の専用試薬を用いればよい。

【0050】

リボゾームＤＮＡ配列情報に基づき設計された上記のプライマーセットを用いた検出方法において陽性であったサンプルを、さらに、染色体ＤＮＡ配列情報に基づき設計されたプライマーセットを用いた検出方法に適用して、さらに特異性の高い診断を行うことができる。萎黄病菌と同じフザリウム属菌である非病原性糸状菌Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ並びにＦ. ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓがしばしば植物から単離されるが、これらの非病原性糸状菌が、リボゾームＤＮＡ配列情報に基づき設計された上記のプライマーセットを用いた検出方法において偽陽性の原因となる可能性がある。後述の実施例で示すような染色体ＤＮＡ配列情報に基づいて設計されたプライマーセットを用いることにより、萎黄病菌由来の核酸をより特異的に検出することができる。例えば、これらのプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法においては上記の非病原性糸状菌２種由来の核酸は増幅しない。したがって、追加の試験を行うことにより偽陽性の可能性を排除することができる。

【0051】

＜糸状菌検出用キット＞
また、本発明の検出方法を使用するために必要な各種の試薬類は、予めパッケージングしてキット化することができる。具体的には、上記プライマーセット、核酸合成の基質となる４種類のｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）、鎖置換活性を有する鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、補助因子としての塩類（マグネシウム塩又はマンガン塩等）、酵素や鋳型を安定化する保護剤、さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類をキットとして提供できる。

【0052】

キットは、本発明のプライマーセットによってＬＡＭＰ反応が正常に進行することを確認するための陽性対照（ポジティブコントロール）を含んでいてもよい。陽性対照としては、例えば、本発明のプライマーセットにより増幅される領域を含んだＤＮＡが挙げられる。

【0053】

＜萎黄病菌および炭疽病菌の同時検出＞
リボゾームＤＮＡ配列情報に基づき設計された上記のプライマーセットを、さらに非特許文献４により報告されている炭疽病菌由来の核酸を増幅するためのプライマーセットと組み合わせた複合プライマーセットとすることにより、萎黄病菌および炭疽病菌のいずれか一方または双方に感染した検体を検出することが可能である。後述の実施例で示すように、複合プライマーセットを用いても、偽陽性は確認されないため、複合プライマーセットを用いることにより、萎黄病菌および炭疽病菌のいずれか１つ以上への感染を容易、迅速に低コストで検出することができる。

【0054】

複合プライマーセットの複数を組み合わせて用いた測定においては、増幅産物であるＤＮＡが二本鎖へと会合する経過を蛍光により測定する手法で会合曲線解析を行うことにより、検出されている感染菌の種類の数を判断することが可能であり、単独感染であるかまたは重複感染であるかを判別することができる。また、萎黄病菌および炭疽病菌それぞれ単一の核酸に基づく増幅産物についての既知のデータと照合することにより、感染菌の種類の特定が可能である。

【0055】

複合プライマーセットを用いた検出方法の検体としては、上述した植物のいずれかの部位を用いることが好ましい。炭疽病菌は水やりや風雨による飛沫感染で、苗から苗へと伝搬されることが知られているが土壌を介しての伝搬は報告されていないためである。

【実施例】

【0056】

以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

【0057】

＜リボゾームＤＮＡに基づくプライマーセットの設計＞
上述のように、プライマーセットを設計した。イチゴ萎黄病菌のリボゾームＤＮＡのＩＴＳ領域（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. ＦＩＴＰ０００３）でプライマーを設計に用いた。既知の菌株間で保存性が高い領域を選抜し、ループプライマーを含む、上記表２に示す配列番号１〜６の配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセットを設計した。
設計されたプライマーセット（プライマー）を、標準的なオリゴＤＮＡで合成し、さらにＨＰＬＣ精製後、滅菌蒸留水で１００μＭに希釈したものをマスターミックスとして冷凍保存した。夫々のプライマーについて、所定の濃度に希釈して一定量確保した。希釈したプライマーも−２０℃で冷凍保存した。

【0058】

＜土壌中のイチゴ萎黄病菌の検出＞
［イチゴ萎黄病菌の胞子の準備］
ＰＤＡ培地上で培養したイチゴ萎黄病菌の菌体を、白金耳でマングビーン液体培地に移し、常温で数日間振とう培養もしくは静置培養したあと、発生した胞子を回収した。顕微鏡で胞子数を数え、段階的に希釈した胞子懸濁液を準備した。あらかじめ５０ｍｌ三角フラスコに入れておいたオートクレーブ済み土壌（１０ｍｌ相当）に上記胞子懸濁液を滴下してそれぞれ検体とした。

【0059】

［土壌からのＤＮＡ抽出］
「平成２３年度 成果普及技術資料」イチゴ炭疽病・萎黄病・疫病感染苗検査マニュアルに沿ってＤＮＡ抽出を行った。各検体（土壌）入り三角フラスコに滅菌蒸留水２０ｍｌを加え１分間振とうした。懸濁液１ｍｌを新しいチューブに移した。小型遠心機で１分間遠心し、上清を除去した。ガラスビーズ（径０．６ｍｍ、約０．２ｇ、６粒相当）とスキムミルク（０．２ｇ／ｍｌ）１０μＬ、抽出バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０、４０ｍＭ ＥＤＴＡ）２５０μＬ、１０％ＳＤＳ ５０μＬ、塩化べンジル１５０μＬを加え、ボルテックスで激しく攪拌した。６０℃で１５分間処理した。３Ｍ酢酸ナトリウム１５０μＬを加えて、ボルテックスで激しく攪拌した。その後氷上で１５分間静置した。小型遠心機で１分間遠心し、上清約３００μＬを新しいチューブに入れた。上清液に吸着液（ＭｇＥｘ Ｋｉｔ）６００μＬと磁気ビーズ（ＭｇＥｘ Ｋｉｔ）４０μＬを加えて、チューブミキサーで１分間攪拌した。磁気スタンド（商品名：Ｍａｇｉｃａｌ Ｔｒａｐｐｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ）にセットし、３０秒間静置し、その後上清を除去した。洗浄液９００μＬを加えて、チューブミキサーで１０秒間攪拌した。磁気スタンドにセットして３０秒間静置し、その後上清を除去した。７０％エタノール９００μＬを加えて、チューブミキサーで１０秒間攪拌した。チューブミキサーで１０秒間攪拌した。さらに、滅菌蒸留水１００μＬを加えて、チューブミキサーで１分間攪拌した。磁気スタンドにセットして３０秒間静置し、上清を新しいチューブに回収した。このように得られた調製物をＰＣＲまたはＬＡＭＰ法の鋳型に用いた。

【0060】

［ＬＡＭＰ法（目視判定）とＰＣＲ法の比較］
Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ増幅試薬キットとＬｏｏｐａｍｐ蛍光・目視検出試薬（栄研化学https://genome.e-mp.jp/products/mokusi.html）と上記プライマーセットを使用した。１サンプル当たり、１μＬの上記調製物と６．２５μＬの２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ、０．５μＬのＥｎｚｙｍｅ ｍｉｘ、０．５μＬの蛍光試薬、０．５μＬのＦ３プライマー（５μＭ）、０．５μＬのＢ３プライマー（５μＭ）、０．５μＬのＦＩＰプライマー（４０μＭ）、０．５μＬのＢＩＰプライマー（４０μＭ）、０．５μＬのＬＦプライマー（２０μＭ）、０．５μＬのＬＢプライマー（２０μＭ）、１．２５μＬの滅菌蒸留水を加えることで計１２．５μＬに調製した。
あるいは、２．０μＬの上記調製物と１２．５μＬの２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ、１．０μＬのＥｎｚｙｍｅ ｍｉｘ、１．０μＬの蛍光試薬、１．０μＬのＦ３プライマー（５μＭ）、１．０μＬのＢ３プライマー（５μＭ）、１．０μＬのＦＩＰプライマー（４０μＭ）、１．０μＬのＢＩＰプライマー（４０μＭ）、１．０μＬのＬＦプライマー（２０μＭ）、１．０μＬのＬＢプライマー（２０μＭ）、２．５μＬの滅菌蒸留水を加えることで計２５μＬに調製した。ネガティブコントロールとしてＤＮＡではなく滅菌蒸留水２．０μＬを添加した。
ＬＡＭＰ反応は６３℃９０分のあと９５℃２分とすることで行った。

【0061】

得られた結果をイチゴ炭疽病・萎黄病・疫病感染苗検査マニュアル「平成２３ 年度 成果普及技術資料」に従って行ったＰＣＲ法による結果を合わせて図２に示す。
ＬＡＭＰ法においても、ＰＣＲ法と同等の検出感度の結果が得られていることがわかる。なお、それぞれの方法に要した時間は、ＰＣＲ法が３時間、ＬＡＭＰ法が９０分であった。

【0062】

［吸光度計による検出］
Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ増幅試薬キットとカネカ温調機能付き吸光度計ＭｙＡｂｓｃｏｐｅ（登録商標）を用いた。２．０μＬの上記調製物と１２．５μＬの２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ、１．０μＬのＥｎｚｙｍｅ ｍｉｘ、１．０μＬのＦ３プライマー（５μＭ）、１．０μＬのＢ３プライマー（５μＭ）、１．０μＬのＦＩＰプライマー（４０μＭ）、１．０μＬのＢＩＰプライマー（４０μＭ）、１．０μＬのＬＦプライマー（２０μＭ）、１．０μＬのＬＢプライマー（２０μＭ）、３．５μＬの滅菌蒸留水を加えることで計２５μＬに調製した。ネガティブコントロールとしてＤＮＡではなく滅菌蒸留水２．０μＬを添加した。ＬＡＭＰ反応は６３℃６０分、８５℃１０分で行った。Ｇセンサで吸光度変化をリアルタイム測定した。
結果を図３に示す。リアルタイム測定により、目視判定した場合と比較して、さらなる迅速化が図られていることが分る。

【0063】

＜感染苗からのイチゴ萎黄病菌の検出＞
イチゴ苗にイチゴ萎黄病菌胞子懸濁液（１．０×１０⁵個／ｍｌ）を滴下摂取し、１週間常温で静置した。この苗と健全苗（非感染苗）につき、それぞれ、最外葉の葉柄基部をカミソリで数ｍｍ切り取り、５０ｍｌ滅菌蒸留水と小さい薬さじ１杯分のｐｏｌｙｃｌａｒ ＶＴを含む５００μＬチューブに入れ電子レンジで５００Ｗ１分間処理した。遠心後得られる調製物を、ＰＣＲまたはＬＡＭＰ法の鋳型として使用した。
１サンプル当たり、１μＬの上記調製物と６．２５μＬの２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ、０．５μＬのＥｎｚｙｍｅ ｍｉｘ、０．５μＬの蛍光試薬、０．５μＬのＦ３プライマー（５μＭ）、０．５μＬのＢ３プライマー（５μＭ）、０．５μＬのＦＩＰプライマー（４０μＭ）、０．５μＬのＢＩＰプライマー（４０μＭ）、０．５μＬのＬＦプライマー（２０μＭ）、０．５μＬのＬＢプライマー（２０μＭ）、１．２５μＬの滅菌蒸留水を加えることで計１２．５μＬに調製した。ＬＡＭＰ反応は６３℃１時間、９５℃２分で行った。
健全苗は陰性、感染苗は陽性（蛍光）である結果が得られた。

【0064】

＜イチゴ萎黄病菌とイチゴ炭疽病の同時検出＞
［ＤＮＡ抽出］
イチゴ炭疽病菌およびイチゴ萎黄病菌をそれぞれＰＤＡ培地上で数日間培養し、伸長した菌糸からＳａｉｔｏｈら（Ｇｅｎ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ ７２：３４８−３５０，２００６）の手法でＤＮＡを抽出した。ＤＮＡは５０μＬの蒸留水に希釈した。抽出したＤＮＡを−２０℃で保管した。

【0065】

［ＬＡＭＰ法（目視判定）］
Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ増幅試薬キットとＬｏｏｐａｍｐ 蛍光・目視検出試薬、上記のイチゴ炭疽病菌検出用プライマーセットとＫＡＴＯＨ ｅｔ ａｌ．，２０１６（非特許文献４）に記載のイチゴ萎黄病菌検出用プライマーセット（表４）とを使用した。

【0066】

【表4】

【0067】

上記で得られたイチゴ炭疽病菌およびイチゴ萎黄病菌のＤＮＡ抽出物を用いて、双方を含む混合調製物と、一方の菌のＤＮＡ抽出物のみを含む調製物２つを準備した。ネガティブコントロールとしては滅菌蒸留水を使用した。１サンプル当たり、２μＬの調製物（または滅菌蒸留水）と１２．５μＬの２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ、１．０μＬのＥｎｚｙｍｅ ｍｉｘ、１．０μＬの蛍光試薬、０．５μＬのＣｇＦ３プライマー（１０μＭ）、０．５μＬのＣｇＢ３プライマー（１０μＭ）、０．５μＬのＣｇＦＩＰプライマー（４０μＭ）、０．５μＬのＣｇＢＩＰプライマー（４０μＭ）、０．５μＬのＣｇＬＦプライマー（４０μＭ）、０．５μＬのＣｇＬＢプライマー（４０μＭ）、０．５μＬのＦｏＦ３プライマー（１０μＭ）、０．５μＬのＦｏＢ３プライマー（１０μＭ）、０．５μＬのＦｏＦＩＰプライマー（４０μＭ）、０．５μＬのＦｏＢＩＰプライマー（４０μＭ）、０．５μＬのＦｏＬＦプライマー（４０μＭ）、０．５μＬのＦｏＬＢプライマー（４０μＭ）、０．５μＬ滅菌蒸留水を加えることで計２５．０μＬに調製した。
ＬＡＭＰ反応は６３℃９０分、９５℃２分で偽陽性を生じないことを確認後、６３℃６０分、９５℃２分で行った。
ネガティブコントロール以外の３サンプルで陽性（蛍光）である結果が得られた。

【0068】

［会合曲線解析］
１．０μＬの調製物（または滅菌蒸留水）、１５μＬのＩＳＯ−００４（Ｇｅｎｅｌｙｚｅｒ Ｆ用試薬）、１．０μＬのＣｇＦ３プライマー（５μＭ）、１．０μＬのＣｇＢ３プライマー（５μＭ）、０．５μＬのＣｇＦＩＰプライマー（４０μＭ）、０．５μＬのＣｇＢＩＰプライマー（４０μＭ）、０．５μＬのＣｇＬＦプライマー（２０μＭ）、０．５μＬのＣｇＬＢプライマー（２０μＭ）、１．０μＬのＦｏＦ３プライマー（５μＭ）、１．０μＬのＦｏＢ３プライマー（５μＭ）、０．５μＬのＦｏＦＩＰプライマー（４０μＭ）、０．５μＬのＦｏＢＩＰプライマー（４０μＭ）、０．５μＬのＦｏＬＦプライマー（２０μＭ）、０．５μＬのＦｏＬＢプライマー（２０μＭ）、１．０μＬ滅菌蒸留水を加えることで計２５．０μＬに調製した。調製したサンプルをＧｅｎｅｌｙｚｅｒ Ｆ（ＴＯＳＨＩＢＡ ＭＥＤＩＣＡＬ）にセットし、６３℃３０分処理後、９５℃２分間処理でＬＡＭＰ反応を停止させた後、徐々に８０℃まで下げた。その間に会合による蛍光をモニタリングした。結果を図４に示す。混合調製物サンプルは２つのピークを示した。

【0069】

＜染色体ＤＮＡに基づくプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法＞
［プライマーセットの設計］
萎黄病菌の染色体にある遺伝子配列を標的にして、表５に示すプライマーセットＡを設計した。萎黄病菌ＦＯＦ１０株のトランスポゾン領域Ｈａｎ＿Ｓｋｉｐｐｙ（アクセッション番号ＪＸ２０４３０４，Ｓｕｇａ ｅｔ ａｌ．２０１３）の塩基配列にＨａｎＲＣプライマー配列（Ｐａｓｑｕａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００７）（表６において小文字表記の部分）を繋ぎ合わせた配列（表６）に基づき、ループプライマーを含むプライマーセットをデザインした。Ｔｍ値について、Ｆ１ｃおよびＢ１領域で６５℃前後（６４〜６６℃）、Ｆ２領域、Ｂ２領域、Ｆ３領域、Ｂ３領域で６０℃前後（５９〜６１℃）、ループプライマーは６５℃前後（６４〜６６℃）にできるよう設定した。それぞれのＴｍ値の推算式はＮｅａｒｅｓｔ―Ｎｅｉｇｂｏｒ法で計算した。それぞれのプライマーについてＧＣ含量が４０〜６５％、好ましくは５０〜６５％になるように設定した。Ｆ２領域の外側からＢ２領域の外側まで（ＬＡＭＰ法の増幅領域）が１２０から１６０塩基になるように設計した。Ｆ２領域の５’末端からＦ１領域の５’末端まで（ループを形成する部分）は４０から６０塩基になるように設計した。Ｆ２領域とＦ３域の間の距離は０から６０塩基になるように設計した。Ｂ２領域の５’末端からＢ１領域の５’末端まで（ループを形成する部分）は４０から６０塩基になるように設計した。Ｂ２領域とＢ３域の間の距離は０から６０塩基になるように設計した。

【0070】

【表5】

【0071】

【表6】

【0072】

［目視によるＬＡＭＰ反応の観察］
上記プライマーセットＡを用いてＬＡＭＰ法によるＤＮＡ増幅を行った。ＬＡＭＰ 法用ＤＮＡ 増幅試薬セット（動物種・植物病検査専用Ｂ、ニッポンジーン）とプライマーセットＡを使いＬｉｆｅＥＣＯサーマルサイクラー（Ｂｉｏｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）で反応させた。２．５μＬの１０×反応バッファーＢ、５μＬの５×反応添加液、１．４μＬのｄＮＴＰｓ Ｍｉｘｔｕｒｅ、１μＬの検出液、１μＬの増幅酵素、４０ｐｍｏｌのＦＩＰ５１プライマーとＢＩＰ５１プライマー、２０ｐｍｏｌのＬＦ３５２プライマー、５ｐｍｏｌのＦ３５１プライマーとＢ３５１プライマーを添加したあと蒸留水で２３μＬにメスアップした。最後にＰＤＡ培地上で数日間培養したイチゴ萎黄病菌の菌糸からＳａｉｔｏｈら（２００６）の手法で抽出したＤＮＡ（２μＬ）を添加し反応させた。調製物においてはＤＮＡ濃度を１００ｐｇから１０ｎｇまで段階的に希釈した。ＬＡＭＰ反応は６１℃、６２℃、６３℃、６３．５℃、６４℃、６５℃そして６６℃のそれぞれ処理温度で１時間反応させた。その後９４℃２分の処理でＬＡＭＰ反応を停止させた。ＬＡＭＰ反応による増幅の有無は目視で判別した。反応液が空色の場合はイチゴ萎黄病菌の存在を示す陽性反応、紫色は陰性反応を示す。結果を表７に示す。

【0073】

【表7】

【0074】

［ＰＣＲによる萎黄病菌の検出との比較］
ＰＣＲによる検出試験を同じ段階的に希釈したＤＮＡを鋳型にして検定した。ＰＣＲ反応液（２０μＬ）は０．５μＬのＴａｋａｒａ ＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、２μＬの１０×Ｅｘ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ （Ｍｇ²⁺ ｐｌｕｓ）、１．６μＬのｄＮＴＰ、それぞれ１μＬの５μＭ ＦｏｆｒａＦプライマーとＦｏｆｒａＲプライマー（Ｓｕｇａ ｅｔ ａｌ． ２０１３）、そしてＬＡＭＰ法で用いたものと同じ調製物２μＬで反応させた。ＬｉｆｅＥＣＯサーマルサイクラーにセットし、９４℃で２分間処理の後、９４℃３０秒から５５℃３０秒、７２℃３０秒までを４０回繰り返した。その後７２℃で８分間処理して反応を終了させた。ＰＣＲによる増幅産物は３％アガロースゲル上で電気泳動した。次にエチジウムブロマイドでゲルを染色後、紫外線照射で増幅産物を確認した。結果を図５に示す。図５中、ＭはＤＮＡマーカー、１は鋳型無し、２は１０ｎｇ、３は１ｎｇ、４は１００ｐｇの結果である。

【0075】

図５に示す結果から、上記プライマーセットＡを用いたＬＡＭＰ反応はＳｕｇａら（２０１３）（非特許文献２）が考案したＰＣＲと同様の結果を示すことがわかる。この結果は、１時間のＬＡＭＰ反応で得られたものであり、岐阜大のＬＡＭＰ反応（非特許文献３）で要した２．５時間と比較して短縮が図られている。

【0076】

［特異性の確認］
萎黄病菌（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．Ｆｒａｇａｒｉａｅ）ｕｂ−２株、ＫＮＫ，ＵＫＡ−１株；非病原性糸状菌Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ＦＯＦ１３、ＦＯＦ２５、ＦＯＦ５５、ＦＯＦ１１３、ＦＯＦ１２１株、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ａｃｕｔａｔｕｍ ｉａ−１株、Ｃ．ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ ＯＴＴ−５１２株、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｃｔｏｒｕｍ ＰＣ１５株；非病原性糸状菌Ｆ． ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ＭＡＦＦ７２７５１９株、Ｆ． ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ ９ｃ−１−１株について陽性を示すか否かを確認した。これら菌株は室温下のＰＤＡ培地で保管した。これらＰＤＡ培地上で伸長した菌糸から、Ｓａｉｔｏｈら（２００６）の手法でＤＮＡを抽出した。ＤＮＡは５０μＬの蒸留水に希釈した。抽出したＤＮＡを−２０℃で保管し、ＰＣＲとＬＡＭＰ反応に使用した。ＤＮＡ濃度は分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｌｉｔｅ； Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で計測した。ＤＮＡが確実に抽出されているか、糸状菌ＤＮＡならば普遍的に増幅するＰＣＲプライマーセットで確認した。
ＰＤＡ上で生育させた糸状菌から抽出したＤＮＡを鋳型にして、上記手順と同様に、プライマーセットＡを用いたＬＡＭＰ法の選択的特異性を検定した。
結果を表８に示す。

【0077】

【表8】

【0078】

萎黄病菌のみ陽性反応を示し、非病原性糸状菌Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ，Ｆ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓの他、炭疽病菌Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ，Ｃ． ａｃｕｔａｔｕｍそして疫病菌Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｃｔｏｒｕｍでは陰性反応を示していることがわかる。

【0079】

表６のアライメントに基づき、さらに表９に示すプライマーセットＢおよびＣもデザインし、それぞれを用いて、同様にＬＡＭＰ反応の観察を行ったが、いずれも、非病原性糸状菌 F. oxysporumにも陽性を示した。

【0080】

【表9】

【0081】

［ＬＡＭＰ法を用いた土壌からの萎黄病菌の確認］
高圧滅菌した土壌１０ｍＬ相当に胞子数が異なる萎黄病菌懸濁液を加え、ＦＯＧ２培地を添加して４日間前培養した後に抽出したＤＮＡを鋳型として上記手順と同様に、プライマーセットＡを用いてＬＡＭＰ反応による核酸増幅、検出を行った。その結果、１０²個、１０³個、１０⁴、および１０⁵個の胞子を含む土壌全てが陽性反応を示した（表１０）。

【0082】

【表10】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2018年4月27日

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＬＡＭＰ法により、萎黄病菌由来の核酸を増幅するためのプライマーセットであって：
配列番号１の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号１の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、萎黄病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含み、該変異がＦ２領域（配列番号８）とＦ１ｃ領域（配列番号７）との間への１〜６ヌクレオチドの配列の挿入であるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチドもしくは配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、萎黄病菌由来の核酸を増幅可能な範囲で変異を含み、該変異がＢ２領域（配列番号１０）とＢ１ｃ領域（配列番号９）との間への１〜６ヌクレオチドの配列の挿入であるポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー
を含むプライマーセット。

【請求項2】

配列番号１の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマーを含む請求項１に記載のプライマーセット。

【請求項3】

さらに、
配列番号５の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマー、および
配列番号６の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＬＢプライマーから選択される１つ以上
を含む請求項１または２に記載のプライマーセット。

【請求項4】

前記ＬＦプライマーおよび前記ＬＢプライマーの双方を含む請求項３に記載のプライマーセット。

【請求項5】

萎黄病菌の検出方法であって、
検体から核酸を抽出すること、
請求項１〜４のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いて、前記核酸を鋳型にＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行うこと、
増幅産物があると判断された場合に検体に萎黄病菌が存在すると判断することを含む、検出方法。

【請求項6】

検体が土壌である請求項５に記載の検出方法。

【請求項7】

ＬＡＭＰ法により、萎黄病菌および炭疽病菌からなる群より選択される１つ以上の糸状菌由来の核酸を増幅するための複合プライマーセットであって：
請求項１〜４のいずれか一項に記載のプライマーセット、ならびに
配列番号１１の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
配列番号１２の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
配列番号１３の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、および
配列番号１４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマーを含むプライマーセット
を含む複合プライマーセット。

【請求項8】

さらに、
配列番号１５の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＬＦプライマー、および
配列番号１６の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＬＢプライマーから選択される１つ以上
を含む請求項７に記載の複合プライマーセット。

【請求項9】

前記ＬＦプライマーおよび前記ＬＢプライマーの双方を含む請求項８に記載の複合プライマーセット。

【請求項10】

萎黄病菌および炭疽病菌からなる群より選択される１つ以上の糸状菌の検出方法であって、
検体から核酸を抽出すること、
請求項７〜９のいずれか一項に記載の複合プライマーセットを用いて、前記核酸を鋳型にＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行うこと、
前記増幅反応後のＤＮＡの二本鎖への会合曲線解析により、検体における上記糸状菌の存在の有無および存在する糸状菌の種類の数を判断することを含む、検出方法。

【請求項11】

請求項１〜４のいずれか一項に記載のプライマーセット、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、ｄＮＴＰｓ及び緩衝液を含む、萎黄病菌の検出用キット。