特開 2019-131728 プロテオグリカンの鉄塩、プロテオグリカン、それらの製造方法、細胞増殖促進剤、及び外用剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2019-131728(P2019-131728A)

(43)【公開日】2019年8月8日

(54)【発明の名称】プロテオグリカンの鉄塩、プロテオグリカン、それらの製造方法、細胞増殖促進剤、及び外用剤

(51)【国際特許分類】

   C08B 37/00 20060101AFI20190712BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20190712BHJP

   A61K 31/715 20060101ALI20190712BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20190712BHJP

   A61K 8/73 20060101ALI20190712BHJP

   C07K 14/78 20060101ALI20190712BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20190712BHJP

【ＦＩ】

   C08B37/00 Q

   A61P43/00 107

   A61K31/715

   A61P43/00 111

   A61Q19/00

   A61K8/73

   C07K14/78

   C12N5/071

【審査請求】未請求

【請求項の数】8

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】10

(21)【出願番号】特願2018-15956(P2018-15956)

(22)【出願日】2018年1月31日

(71)【出願人】

【識別番号】504229284

【氏名又は名称】国立大学法人弘前大学

(71)【出願人】

【識別番号】309015019

【氏名又は名称】地方独立行政法人青森県産業技術センター

(74)【代理人】

【識別番号】100106002

【弁理士】

【氏名又は名称】正林 真之

(74)【代理人】

【識別番号】100131705

【弁理士】

【氏名又は名称】新山 雄一

(72)【発明者】

【氏名】中根 明夫

(72)【発明者】

【氏名】成田 浩司

(72)【発明者】

【氏名】岡田 貴志

(72)【発明者】

【氏名】廣瀬 昌平

(72)【発明者】

【氏名】浅野 クリスナ

(72)【発明者】

【氏名】山口 信哉

(72)【発明者】

【氏名】安保 亜衣子

(72)【発明者】

【氏名】佐野 栄宏

(72)【発明者】

【氏名】齋藤 知明

【テーマコード（参考）】

4B065

4C083

4C086

4C090

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AC12

4B065BA30

4B065BB18

4B065BB19

4B065BC12

4B065CA44

4C083AD411

4C083AD412

4C083CC02

4C083EE12

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086AA04

4C086EA28

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA63

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZA89

4C086ZB22

4C086ZC02

4C090AA02

4C090AA05

4C090AA09

4C090BA79

4C090BB67

4C090BC27

4C090BD14

4C090BD19

4C090BD22

4C090BD24

4C090CA46

4C090DA09

4C090DA23

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA53

4H045CA52

4H045EA20

4H045EA28

4H045FA71

(57)【要約】

【課題】プロテオグリカンの鉄塩、特定の赤外線吸収ピークを有する新規のプロテオグリカン、それらの製造方法、並びにそれらを含む細胞増殖促進剤及び外用剤を提供すること。
【解決手段】プロテオグリカンの鉄塩、又はＫＢｒディスク透過法により測定した赤外吸収スペクトルにおいて、波数２８００ｃｍ^−１〜２９３０ｃｍ^−１に吸収ピークを有するプロテオグリカン、それらの製造方法、並びにそれらを含む細胞増殖促進剤及び外用剤。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

プロテオグリカンの鉄塩。

【請求項2】

ＫＢｒディスク透過法により測定した赤外吸収スペクトルにおいて、波数２８００ｃｍ^−１〜２９３０ｃｍ^−１に吸収ピークを有するプロテオグリカン。

【請求項3】

乾燥重量当たりの鉄含有量が１質量％以上であり、カルシウムの含有量が１質量％以下である、請求項１又は２に記載のプロテオグリカンないしその鉄塩。

【請求項4】

コロイド粒子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のプロテオグリカンないしその鉄塩。

【請求項5】

前記コロイド粒子の平均粒子径が５００ｎｍ〜１５００ｎｍである、請求項４に記載のプロテオグリカンないしその鉄塩。

【請求項6】

請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロテオグリカンないしその鉄塩の製造方法であって、原料のプロテオグリカン及び鉄化合物を反応させることを含む、製造方法。

【請求項7】

請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロテオグリカンないしその鉄塩を含む細胞増殖促進剤。

【請求項8】

請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロテオグリカンないしその鉄塩を含む外用剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、プロテオグリカンの鉄塩、特定の赤外線吸収ピークを有する新規のプロテオグリカン、それらの製造方法、並びにそれらを含む細胞増殖促進剤及び外用剤に関する。

【背景技術】

【0002】

プロテオグリカンは動物に存在し、結合組織の細胞外マトリックス中の基質を形成している。プロテオグリカンはグリコサミノグリカンとタンパク質の共有結合物の総称であり、一般の糖タンパク質に比べて、糖含量が極めて多いのが特徴である。プロテオグリカンは天然由来の高分子化合物であり、起源となる原料や抽出・製造条件により、分子量や含まれるアミノ酸や糖（中性糖、ウロン酸、アミノ糖など）の種類や量、比率も異なっており、さまざま分子種が存在する。
プロテオグリカンのアルカリ金属塩が高い保水力を有することが知られている（例えば、特許文献１）。
一方、プロテオグリカンには、従来から皮膚線維芽細胞増殖促進活性があることが知られ、活性メカニズムの１つとして、リン酸化Ｅｒｋ１／２発現の増加を介していることが知られている（例えば、非特許文献１）。
このように、プロテオグリカンに由来する化合物、プロテオグリカンから誘導された化合物（併せて、以下単に「プロテオグリカン化合物」ともいう。）は、有益な生理活性を有し得ることから、新規のプロテオグリカン化合物が求められていた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開２０１６−２９１５０号公報

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ｓａｎｏ Ｍ ｅｔａｌ，Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ８１（７）：１３６９−７８，２０１７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、上記従来技術の課題に鑑みなされたものであって、プロテオグリカンの鉄塩、特定の赤外線吸収ピークを有する新規のプロテオグリカン、それらの製造方法、並びにそれらを含む細胞増殖促進剤及び外用剤の提供を目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、プロテオグリカンの鉄塩ないし赤外吸収スペクトルにおいて特定のピークを有する新規のプロテオグリカンが、従来のプロテオグリカンよりも強い細胞増殖促進活性、特に、細胞増殖に関わる増殖因子として知られるトランスフォーミング増殖因子ＴＧＦ−β１の発現促進活性を示すことを見出した。本発明は、この知見に基づき完成するに至ったものである。すなわち、本発明は以下の通りである。

【0007】

（１）プロテオグリカンの鉄塩。

【0008】

（２）ＫＢｒディスク透過法により測定した赤外吸収スペクトルにおいて、波数２８００ｃｍ^−１〜２９３０ｃｍ^−１に吸収ピークを有するプロテオグリカン。

【0009】

（３）乾燥重量当たりの鉄含有量が１質量％以上であり、カルシウムの含有量が１質量％以下である、上記（１）又は（２）に記載のプロテオグリカンないしその鉄塩。
（４）コロイド粒子である、上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載のプロテオグリカンないしその鉄塩。
（５）上記コロイド粒子の平均粒子径が５００ｎｍ〜１５００ｎｍである、（４）のいずれか１項に記載のプロテオグリカンないしその鉄塩。
（６）上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載のプロテオグリカンないしその鉄塩の製造方法であって、原料のプロテオグリカン及び鉄化合物を反応させることを含む、製造方法。

【0010】

（７）上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載のプロテオグリカンないしその鉄塩を含む細胞増殖促進剤。
（８）上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載のプロテオグリカンないしその鉄塩を含む外用剤。

【発明の効果】

【0011】

本発明のプロテオグリカンないしその鉄塩は、新規物質であり、例えば、従来のプロテオグリカンよりも強い細胞増殖活性を有し得、特にＴＧＦ−β１の発現促進活性を有し得る。
本発明の製造方法は、上記プロテオグリカンないしその鉄塩を製造し得る。
本発明によれば、上記プロテオグリカンないしその鉄塩を含む細胞増殖促進剤及び外用剤を提供し得る。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】Ｆｅ−ＰＧ塗布群及びＰＧ塗布群のＴＧＦ−β１のｍＲＮＡ発現量の定量的ＲＴ−ＰＣＲ試験結果を示す図である。

【図2】Ｆｅ−ＰＧの濃度依存的なＮＨＤＦ増殖促進評価結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

以下、本発明の実施態様について詳細に説明するが、本発明は、以下の実施態様に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。
また、本明細書において、「〜」は特に断りがなければ以上から以下を表す。

【0014】

＜プロテオグリカンないしプロテオグリカンの鉄塩＞
本発明は、プロテオグリカンの鉄塩に関する。
また、本発明はＫＢｒディスク透過法により測定した赤外吸収スペクトルにおいて、波数２８００ｃｍ^−１〜２９３０ｃｍ^−１に吸収ピークを有するプロテオグリカンに関するものでもある。
本発明のプロテオグリカンは、波数２８００ｃｍ^−１〜２９３０ｃｍ^−１に２本の吸収ピークを有することが好ましく、波数２８３０ｃｍ^−１〜２８８０ｃｍ^−１に１本の吸収ピーク、及び波数２８９０ｃｍ^−１〜２９３０ｃｍ^−１に１本の吸収ピークを有することがより好ましく、波数２８４０ｃｍ^−１〜２８７０ｃｍ^−１に１本の吸収ピーク、及び波数２９００ｃｍ^−１〜２９２５ｃｍ^−１に１本の吸収ピークを有することが更に好ましく、波数２８４５ｃｍ^−１〜２８６０ｃｍ^−１に１本の吸収ピーク、及び波数２９０５ｃｍ^−１〜２９２０ｃｍ^−１に１本の吸収ピークを有することが特に好ましい。
上記吸収ピークは、１８５０ｃｍ^−１〜１９００ｃｍ^−１の透過率を１００％としたとき、波数２８３０ｃｍ^−１〜２８８０ｃｍ^−１のピークの透過率は５０％以下の吸収であることが好ましく、具体的には３０％以上であってよいが、３０％以下であってもよい。
また、２８９０ｃｍ^−１〜２９３０ｃｍ^−１のピークの透過率は３０％以下であることが好ましい。
上記吸収ピークはプロテオグリカンが鉄塩を形成することにより発生し得る。
本発明のプロテオグリカン及び本発明のプロテオグリカンの鉄塩をまとめて、以下「プロテオグリカンないしその鉄塩」ともいう。
本発明のプロテオグリカンないしその鉄塩は、上記吸収ピーク以外、後述する原料となるプロテオグリカンと同様の吸収ピーク（特に、透過率５０％超のピークについて）を有し得る。

【0015】

本発明のプロテオグリカンないしその鉄塩において、乾燥重量当たりの鉄の含有量は本発明の効果を損なわない限り特に制限はないが、１質量％以上であることが好ましく、２質量％以上であることがより好ましく、３質量％以上であることが更に好ましく、４質量％以上であることが特に好ましい。
鉄含有量の上限値としては特に制限はなく、例えば、１０質量％以下であり、典型的には８質量％以下である。

【0016】

本発明のプロテオグリカンないしその鉄塩は、鉄塩を形成するプロテオグリカン及び鉄以外の成分（以下、単に「その他の成分」ともいう。）を含んでいても含んでいなくてもよく、その他の成分の乾燥重量当たりの含有量（複数のその他の成分が存在する場合には合計の含有量）が、乾燥重量当たりの鉄の含有量よりも少ないことが好ましい。
上記その他の成分としては、各種ミネラル等が挙げられる。
各種ミネラルとしては、例えば、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、リン、塩素等が挙げられる。
本発明のプロテオグリカンないしその鉄塩において、その他の成分（例えば、カルシウム）の乾燥重量当たりの含有量は１質量％以下であることが好ましく、０．７質量％以下であることがより好ましく、０．５質量％以下であることが更に好ましい。

【0017】

本発明のプロテオグリカンないしその鉄塩は、コロイド粒子であってもコロイド粒子でなくてもよいが、コロイド粒子であることが好ましい。
上記コロイド粒子の平均粒子径としては、５００ｎｍ〜１５００ｎｍが好ましく、７００ｎｍ〜１２００ｎｍがより好ましく、８００ｎｍ〜１０００ｎｍが更に好ましい。
平均粒子径は動的光散乱式粒径分布測定装置（例えば、ＬＢ−５５０、堀場製作所社製）を用いて測定することができる。

【0018】

本発明のプロテオグリカンないしその鉄塩の製造方法としては、プロテオグリカンの鉄塩が形成される限り特に制限はないが、後述する＜プロテオグリカンないしその鉄塩の製造方法＞において説明する製造方法により形成することが好ましい。

【0019】

本発明のプロテオグリカンないしその鉄塩の原料となるプロテオグリカンは、グリコサミノグリカンとタンパク質の共有結合物の総称であり、一般の糖タンパク質に比べて、糖含量が極めて多いのが特徴である。プロテオグリカンは天然由来の高分子化合物であり、起源となる原料や抽出・製造条件により、分子量や含まれるアミノ酸や糖（中性糖、ウロン酸、アミノ糖など）の種類や量、比率も異なっており、さまざま分子種が存在する。一般的にプロテオグリカンの分子量は数十万から数百万である。プロテオグリカンの原料由来としては、牛、鶏、鯨などの哺乳類の軟骨や、鮭、鮫、エイなどの魚類の軟骨であり、その種類を問わないものであり、食されることも多い。また、プロテオグリカンの抽出薬剤についても、酢酸などの有機酸や酸、アルカリ、グアニジン塩酸など様々あるが、本発明では抽出薬剤や温度や時間などの抽出・製造の条件も限定しないものである。

【0020】

上記原料となるプロテオグリカンは、その他の成分を含んでいても含んでいなくてもよく、その他の成分（例えば、カルシウム）の乾燥重量当たりの含有量（複数のその他の成分が存在する場合には合計の含有量）は、例えば、１０質量％以下であり、好ましくは８質量％以下であり、より好ましくは６質量％以下である。
その他の成分（例えば、カルシウム）の含有量の下限値としては特に制限はなく、例えば、０．３質量％以上であり、典型的には０．５質量％以上である。

【0021】

＜プロテオグリカンないしその鉄塩の製造方法＞
本発明のプロテオグリカンないしその鉄塩の製造方法は、上述した原料となるプロテオグリカンと、鉄化合物とを反応させることを含む。
上記反応としては、鉄塩を形成し得る限り特に制限はなく、例えば、原料となるプロテオグリカンに含まれる上記その他の成分と、上記鉄化合物に含まれる鉄イオンとの塩交換反応、原料となるプロテオグリカンが有する官能基による鉄原子への求核反応等が挙げられ、上記鉄化合物に含まれる鉄イオンによる塩交換反応であることが好ましい。
上記鉄化合物としては、任意の無機鉄塩（例えば、硫酸鉄、塩化鉄等）又は有機鉄塩（例えば、酢酸鉄）が挙げられ、無機鉄塩が好ましく、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物がより好ましい。

【0022】

原料となるプロテオグリカンと、鉄化合物との反応条件としては、０℃以上２０℃以下で行うことが好ましく、０℃以上１０℃以下で行うことがより好ましく、０℃以上５℃以下で行うことが更に好ましい。
反応時間としては、１時間以上であることが好ましく、１０時間以上であることがより好ましく、２０時間以上であることが更に好ましい。

【0023】

本発明のプロテオグリカンないしその鉄塩の製造方法は、上記反応後、得られたプロテオグリカンないしその鉄塩を精製することを含むことが好ましい。
上記精製法としては、透析すること及びろ過することよりなる群から選択される少なくとも１つを含むことが好ましく、透析すること及びろ過することの両方を含むことがより好ましい。
透析方法としては特に制限はなく、０℃以上２０℃以下で行うことが好ましく、０℃以上１０℃以下で行うことがより好ましく、０℃以上５℃以下で行うことが更に好ましい。
ろ過方法としても特に制限はなく、任意のろ紙にて行うことができる。
必要に応じ、凍結乾燥を行い、本発明のプロテオグリカンないしその鉄塩を得ることができる。

【0024】

＜細胞増殖促進剤＞
本発明の細胞増殖促進剤は、上記プロテオグリカンないしその鉄塩を含む。
本発明の細胞増殖促進剤は、例えば、皮膚線維芽細胞に対して優れた増殖促進作用を有するので、医薬品として創傷の治癒や皮膚の新陳代謝の活性化などに適用することができる。その投与は、経皮投与であることが好ましい。
投与に際してはそれぞれの投与方法に適した剤型に製剤化すればよい。製剤形態としては、例えば、軟膏、乳剤、懸濁剤などが挙げられ、これら製剤の調製は、無毒性の賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、防腐剤、等張化剤、安定化剤、分散剤、酸化防止剤、着色剤、矯味剤、緩衝剤などの添加剤を使用して自体公知の方法にて行うことができる。無毒性の添加剤としては、例えば、でんぷん、ゼラチン、ブドウ糖、乳糖、果糖、マルトース、炭酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ペトロラタム、グリセリン、エタノール、シロップ、塩化ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、クエン酸、ポリビニルピロリドン、水などが挙げられる。製剤中における有効成分の含有量は、その剤型に応じて異なるが、従来のプロテオグリカンでは一般に０．０１〜１００質量％の濃度であることが要求されるところ、本発明の細胞増殖促進剤では０．０００１〜１質量％の濃度であっても細胞増殖促進作用を発揮することができる。
製剤の投与量は、投与対象者の性別や年齢や体重の他、症状の軽重、医師の診断などにより広範に調整することができるが、従来のプロテオグリカンでは一般に１日当り０．０１〜３００ｍｇ／ｋｇ要求されるところ、本発明の細胞増殖促進剤では１日当り０．０００１〜３ｍｇ／ｋｇであっても細胞増殖促進作用を発揮することができる。
上記の投与量は、１日１回または数回に分けて投与すればよい。本発明の細胞増殖促進剤は、細胞増殖促進作用を発揮するに足る有効量を添加した化粧品の形態で上記の用途などに適用してもよい。

【0025】

＜外用剤＞
本発明の外用剤は、上記プロテオグリカンないしその鉄塩を含む。
本発明の外用剤は、皮膚に塗布して用いられる剤であれば特に限定はないが、例えば、医療用の皮膚外用剤、化粧料等が挙げられる。本発明の外用剤には、上記プロテオグリカンないしその鉄塩以外に、通常、医薬品、医薬部外品、化粧品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば、水性成分、油性成分、粉末成分、アルコール類、保湿剤、増粘剤、紫外線吸収剤、美白剤、防腐剤、酸化防止剤、界面活性剤、香料、色素などを適宜必要に応じて配合することができる。そのような配合の方法は、日局製剤総則に記載の方法に従って行うことができる。

【0026】

本発明の外用剤の「剤型」としては、皮膚に適用できる剤型であれば特に限定されないが、クリーム剤、軟膏剤、液剤、ローション剤、ゲル剤などの塗布剤、パップ剤、テープ剤、パッチ剤などの貼付剤等が挙げられる。また、本発明の外用剤は、医薬品、医薬部外品、化粧品等として利用することができる。
上記外用剤が塗布剤の場合、上記塗布剤における上記プロテオグリカンないしその鉄塩の濃度としては本発明の効果を損なわない限り特に制限はないが０．３〜５００μｇ／ｍｌとすることができ、０．４〜４００μｇ／ｍｌであることが好ましい。
上記外用剤が塗布剤の場合、その使用方法としては、適量（例えば、数ｇ（１ｇ等）、数十μｌ（５０μｌ等））を手に取り、１日１回〜数回（例えば、２回又は３回）皮膚に塗布することができる。

【実施例】

【0027】

以下、実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例に限定されるものではない。

【0028】

＜実施例１＞
〔プロテオグリカンの鉄塩の調製〕
原料のプロテオグリカンは、市販の鮭由来プロテオグリカン（角弘プロテオグリカン研究所社製）を以下用いた。
まず、上記原料のプロテオグリカン１００ｍｇを脱イオン水５０ｍＬに溶解してＡ液を得、次に０．２Ｍの硫酸鉄（ＩＩ）七水和物（和光純薬工業社製）を脱イオン水５０ｍＬに溶解してＢ液を得、Ａ液及びＢ液を予め４℃に冷却した。
４℃下でＡ液をスターラーで撹拌しながらＢ液を加えた後、４℃にて一晩スターラーで撹拌した。
得られた反応液を透析用セルロースチューブ（エーディア社製）に入れ、４℃の低温室で、脱イオン水に対して透析を行った。水の交換は１日３回３日間行った。
透析後に透析用セルロースチューブ内に生じていた沈殿を、ガラスろ紙（ＧＡ１００、アドバンテック東洋社製）を用いてろ過した。
上記ろ過後にろ液を集め、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮（東京理科器械社製）し、凍結乾燥（東京理科器械社製）した後、綿状の薄い褐色の物質としてプロテオグリカンの鉄塩を得た。

【0029】

〔プロテオグリカンの鉄塩の粒度分布測定〕
上記得られたプロテオグリカンの鉄塩の粒度分布を動的光散乱式粒径分布測定装置（ＬＢ−５５０、堀場製作所社製）を用いて測定した。
上記プロテオグリカンの鉄塩を脱イオン水を用いて０．２％（Ｗ／Ｖ）に調製して測定した結果、平均粒子径９５２．１ｎｍのコロイド粒子であった。

【0030】

〔鉄含有量及びカルシウム含有量の測定〕
上記得られたプロテオグリカンの鉄塩の鉄含有量及びカルシウム含有量をエネルギー分散型蛍光Ｘ線分析装置（ＥＤＸ−８００ＨＳ、島津製作所社製）を用いて測定した。
トウモロコシデンプン（製造専用、和光純薬工業社製）に、酸化鉄（ＩＩＩ）（和光純薬工業社製）と炭酸カルシウム（和光純薬工業社製）を所定の濃度になるよう十分に混合し、鉄含有量及びカルシウム含有量と蛍光強度との検量線を作成して行った。
上記測定の結果、上記得られたプロテオグリカンの鉄塩の鉄含有量は、乾燥重量当たり４．８質量％であった。カルシウム含有量は検量線の下限値である０．５質量％以下であった。
なお、原料のプロテオグリカンのカルシウム含有量は、キレート滴定法により分析したところ、乾燥重量当たり５．３質量％であった。
原料のプロテオグリカンの鉄含有量は、検量線の下限値である０．５質量％以下であった。

【0031】

〔プロテオグリカンの鉄塩の赤外吸収スペクトルの測定〕
上記得られたプロテオグリカンの鉄塩の赤外吸収スペクトルをフーリエ変換赤外分光光度計（ＦＴ／ＩＲ−４２０、日本分光社製）を用いて、ＫＢｒディスク透過法にて測定した。測定範囲４０００〜４００ｃｍ^−１、分解能４ｃｍ^−１、積算回数５４、スキャンスピード２ｍｍ／秒の条件にて測定した。
上記測定の結果、プロテオグリカンの鉄塩に、原料のプロテオグリカン及び硫酸鉄（ＩＩ）七水和物にない２本のピーク２９１９ｃｍ^−１（透過率２４％）及び２８５１ｃｍ^−１
（透過率４１％）が観測された。

【0032】

＜実施例２＞
〔プロテオグリカンの鉄塩のＴＧＦ−β１の発現促進評価〕
７週齢の雌のＩＣＲマウス（ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ製）を、各群を８匹として、下記Ｆｅ−ＰＧ塗布群、ＰＧ塗布群及びコントロール群に分け、恒温、恒湿の一定環境の飼育室で７日間飼育し、飼育８日後に左耳介及び背部の皮膚を採取した。なお、実験動物の取り扱いは弘前大学動物実験委員会により承認され、弘前大学動物実験に関する規程に従った。

【0033】

Ｆｅ−ＰＧ塗布群：上記実施例１で得られたプロテオグリカンの鉄塩（以下、単に「Ｆｅ−ＰＧ」ともいう。）を背部に０．０１ｍｇ／背部の量で７日間連日塗布した群、
ＰＧ塗布群：市販の鮭由来プロテオグリカン（角弘プロテオグリカン研究所社製）（以下、単に「ＰＧ」ともいう。）を背部に０．０１ｍｇ／背部の量で７日間連日塗布した群、及び
コントロール群：７日間投与した飲水にＦｅ−ＰＧ及びＰＧのいずれも含有させず、背部にＦｅ−ＰＧ及びＰＧのいずれも７日間連日塗布しなかった群。

【0034】

上記採取した各群の皮膚を用いて全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応で得たｃＤＮＡを用いてＧＡＰＤＨの発現を内部標準として定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。

【0035】

図１は、Ｆｅ−ＰＧ塗布群及びＰＧ塗布群のＴＧＦ−β１のｍＲＮＡ発現量の定量的ＲＴ−ＰＣＲ試験結果を示す図である。
図１に示した結果から明らかなように、ＰＧ塗布群と比較してＦｅ−ＰＧ塗布群はＴＧＦ−β１のｍＲＮＡ発現量がＰ値（Ｔｕｋｅｙ法）０．０５未満の有意差で大きいことが分かる。

【0036】

＜実施例３＞
〔プロテオグリカンの鉄塩のヒト皮膚線維芽細胞増殖促進評価〕
プロテオグリカンの鉄塩（Ｆｅ−ＰＧ）の濃度依存的なヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の増殖促進効果を、Ｆｅ−ＰＧ又はコントロールとしてＰＧを０．０４９，０．０９８，０．１９５，０．３９１，０．７８１，１．５６３，３．１２５，６．２５，１２．５，２５，５０，１００，２００，４００，８００μｇ／ｍｌ添加した培地を用いて、７２時間後にＷＳＴ−８アッセイにより評価した。具体的には以下の通りである。

【0037】

（ＮＨＤＦの培養）
ＮＨＤＦはＫｕｒａｂｏ社から購入し、５％ＣＯ_２，９５％空気、３７℃にて培養した。培地は、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清；商品名ＳＨ３０９１０．０３；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン及び５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンのＤＭＥＭ培地（商品名０８４５６−３６；Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ社製）を用いた。

【0038】

（ＷＳＴ−８アッセイ）
ＷＳＴ−８［３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ ２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ］を含むセルカウンティングキット（商品名ＣＫ０４；Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）を用いて行った。
ＮＨＤＦ細胞を９６ウェル培養プレートに４×１０^４個／ｍｌの濃度で各ウェル１００μｌずつまき、２４時間培養後、Ｆｅ−ＰＧ又はＰＧを上記各濃度含む、０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清），５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン及び５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンのＤＭＥＭ培地１００μｌに各ウェルそれぞれ交換し、７２時間培養した。
その後、ＷＳＴ−８を各ウェル１０μｌずつ加え、１時間培養した。その９６ウェル培養プレートはマイクロプレートリーダー（商品名ＴｒｉＳｔａｒ ＬＢ ９４１；Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。結果を図２に示す。図２中、値は、ＰＧをコントロールとした％で表す。

【0039】

図２に示した結果から明らかなように、コントロールのＰＧと比較して、Ｆｅ−ＰＧは０．３９１〜４００μｇ／ｍｌの濃度において有意にＮＨＤＦの増殖を促進する効果があることが分かる。

【図1】

【図2】