特開 2019-152604 Ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ法に基づいたハイスループット抗体検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2019-152604(P2019-152604A)

(43)【公開日】2019年9月12日

(54)【発明の名称】Ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ法に基づいたハイスループット抗体検出方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20190816BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20190816BHJP

   G01N 33/536 20060101ALI20190816BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20190816BHJP

   C07K 14/46 20060101ALN20190816BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/53 N

   G01N33/543 597

   G01N33/536 D

   C07K19/00ZNA

   C07K14/46

【審査請求】未請求

【請求項の数】37

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】98

(21)【出願番号】特願2018-39602(P2018-39602)

(22)【出願日】2018年3月6日

(71)【出願人】

【識別番号】518076779

【氏名又は名称】株式会社ＣｅＳＰＩＡ

(74)【代理人】

【識別番号】100106297

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 克博

(74)【代理人】

【識別番号】100130845

【弁理士】

【氏名又は名称】渡邉 伸一

(72)【発明者】

【氏名】谷村 幸宏

(72)【発明者】

【氏名】廣明 洋子

(72)【発明者】

【氏名】藤吉 好則

【テーマコード（参考）】

4H045

【Ｆターム（参考）】

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA41

4H045BA70

4H045CA40

4H045DA76

4H045DA86

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

【課題】多発性硬化症、視神経脊髄炎スペクトラム疾患、および抗ＭＯＧ抗体関連疾患／ＭＯＧ抗体疾患を含む、疾患の診断に有用な情報を提供する抗体のハイスループットな検出方法を提供すること。
【解決手段】ＣＢＡ法において複数の蛍光標識とフローサイトメトリーを用いることで、抗ＡＱＰ４抗体と抗ＭＯＧ抗体などの複数の抗体を同時に検出することができる。ＣＢＡ法に基づいたフローサイトメトリーを用いることで簡便、効率的、高感度に、かつ低コストで、試料中に含まれる抗体をハイスループットに検出する。また、生細胞を使用し精確な抗原タンパク質三次元立体構造を維持することにより検出感度が大幅に向上した。さらに、一度の測定において複数種類の抗体を同時に検出することができ、一度の測定において定量性のある膨大なデータを取得することができる。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

被検者に由来する試料中における２ｍｎ種の抗体を同時に検出または測定する方法であって、
ｍは１以上の整数であり、
ｎは１以上の整数であり、
第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
該第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、
該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含む、方法。

【請求項2】

第１から第２ｍｎの抗原タンパク質のそれぞれが蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳される、請求項１記載の方法。

【請求項3】

第１から第ｍｎの抗原タンパク質がそれぞれ第１の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第１の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第ｍｎ＋１から第２ｍｎの抗原タンパク質がそれぞれ第２の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第２の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である、請求項１または２記載の方法。

【請求項4】

第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第１細胞グループとし、同様に、第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第２細胞グループ、第（ｍ−１）ｎ＋１から第ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第ｍ細胞グループ、第（２ｍ−１）ｎ＋１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第２ｍ細胞グループとし、第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞がｎ種類ずつ２ｍのグループに分けられており、
第１細胞グループから第ｍ細胞グループが、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第ｍ＋１細胞グループから第２ｍ細胞グループが、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能である、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。

【請求項5】

第１細胞グループから第ｍ細胞グループが、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第ｍ＋１細胞グループから第２ｍ細胞グループが、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能である、請求項４記載の方法。

【請求項6】

第１細胞グループに属する第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞が、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第２細胞グループから第２ｍ細胞グループのそれぞれに属するｎ種類の細胞が、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能である、請求項４または５記載の方法。

【請求項7】

前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。

【請求項8】

前記第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞より選択される２〜２ｍｎ−１種の細胞のみを使用することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。

【請求項9】

前記ｍ段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、請求項４〜８のいずれか一項記載の方法。

【請求項10】

前記ｎ段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、請求項６〜９のいずれか一項記載の方法。

【請求項11】

第１から第２ｍｎの抗原タンパク質がそれぞれ互いに異なるタンパク質であり、第１から第２ｍｎの抗原タンパク質のうち少なくとも一つがＡＱＰ４、ＭＯＧ、ＮＭＤＡ受容体、ＬＧＩ１、ＣＡＳＰＲ２、ＡＭＰＡ受容体、グリシン受容体、ＧＡＢＡ_Ｂ受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、ＬＤＬ受容体関連タンパク質４、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびｋｖ１．４から成る群より選択される、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。

【請求項12】

被検者に由来する試料中における複数の抗体を同時に検出または測定する方法であって、
第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞であって、ｍは１以上の整数であり、ｎは１以上の整数であり、第１から第ｍｎの抗原タンパク質はそれぞれ第１の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第１の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第ｍｎ＋１から第２ｍｎの抗原タンパク質はそれぞれ第２の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第２の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であり、
第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第１細胞グループとし、同様に、第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第２細胞グループ、第（ｍ−１）ｎ＋１から第ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第ｍ細胞グループ、第（２ｍ−１）ｎ＋１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第２ｍ細胞グループとし、第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞がｎ種類ずつ２ｍのグループに分けられており、
第１細胞グループから第ｍ細胞グループが、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されているか又は第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第ｍ＋１細胞グループから第２ｍ細胞グループが、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されているか又は第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、
第１細胞グループに属する第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞が、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第２細胞グループから第２ｍ細胞グループのそれぞれに属するｎ種類の細胞が、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能である細胞のうち、２以上を調製する工程、
該２以上の細胞を含む２以上の細胞懸濁液を調製する工程、
該２以上の細胞懸濁液の各々に対して被検者に由来する１種類の試料が加えられるように、該２以上の細胞懸濁液に２以上の試料を加える工程、
該２以上の細胞懸濁液を１つの容器中で混合し、蛍光標識した二次抗体を加える工程、ならびに
該混合した細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含む、方法。

【請求項13】

第１から第２ｍｎの抗原タンパク質がそれぞれ互いに異なるタンパク質である、請求項１２記載の方法。

【請求項14】

第１から第２ｍｎの抗原タンパク質が同一のタンパク質を含む、請求項１２記載の方法。

【請求項15】

第１から第２ｍｎの抗原タンパク質のうち少なくとも一つが、ＡＱＰ４、ＭＯＧ、ＮＭＤＡ受容体、ＬＧＩ１、ＣＡＳＰＲ２、ＡＭＰＡ受容体、グリシン受容体、ＧＡＢＡ_Ｂ受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、ＬＤＬ受容体関連タンパク質４、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびｋｖ１．４から成る群より選択される、請求項１２〜１４のいずれか一項記載の方法。

【請求項16】

前記第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞より選択される２〜２ｍｎ−１種の細胞のみを使用することを特徴とする、請求項１２〜１５のいずれか一項記載の方法。

【請求項17】

前記ｍ段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、請求項１２〜１６のいずれか一項記載の方法。

【請求項18】

前記ｎ段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、請求項１２〜１７のいずれか一項記載の方法。

【請求項19】

１以上の被検者に由来する２ｍｎ個の試料中における抗体を同時に検出または測定する方法であって、
ｍは１以上の整数であり、
ｎは１以上の整数であり、
第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞をそれぞれ別個の容器中に調製する工程、
１以上の被検者に由来する第１から第２ｍｎの試料を、第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞にそれぞれ加えてインキュベートする工程、
被検者に由来する試料を加えた第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を１つの容器中で混合して細胞懸濁液を得る工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含む、方法。

【請求項20】

第１から第２ｍｎの抗原タンパク質のそれぞれが蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳される、請求項１９記載の方法。

【請求項21】

第１から第ｍｎの抗原タンパク質がそれぞれ第１の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第１の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第ｍｎ＋１から第２ｍｎの抗原タンパク質がそれぞれ第２の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第２の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である、請求項１９または２０記載の方法。

【請求項22】

第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第１細胞グループとし、同様に、第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第２細胞グループ、第（ｍ−１）ｎ＋１から第ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第ｍ細胞グループ、第（２ｍ−１）ｎ＋１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第２ｍ細胞グループとし、第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞がｎ種類ずつ２ｍのグループに分けられており、
第１細胞グループから第ｍ細胞グループが、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第ｍ＋１細胞グループから第２ｍ細胞グループが、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能である、請求項１９〜２１のいずれか一項記載の方法。

【請求項23】

第１細胞グループから第ｍ細胞グループが、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第ｍ＋１細胞グループから第２ｍ細胞グループが、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能である、請求項２２記載の方法。

【請求項24】

第１細胞グループに属する第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞が、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第２細胞グループから第２ｍ細胞グループのそれぞれに属するｎ種類の細胞が、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能である、請求項２２または２３記載の方法。

【請求項25】

前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、請求項１９〜２４のいずれか一項記載の方法。

【請求項26】

第１から第２ｍｎの抗原タンパク質が同じタンパク質である、請求項１９〜２５のいずれか一項記載の方法。

【請求項27】

第１から第２ｍｎの抗原タンパク質が異なるタンパク質を含む、請求項１９〜２５のいずれか一項記載の方法。

【請求項28】

前記第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞より選択される２〜２ｍｎ−１種の細胞のみを使用し、２〜２ｍｎ−１種類の試料中における抗体を同時に検出または測定することを特徴とする、請求項１９〜２７のいずれか一項記載の方法。

【請求項29】

前記ｍ段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、請求項２２〜２８のいずれか一項記載の方法。

【請求項30】

前記ｎ段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、請求項２４〜２９のいずれか一項記載の方法。

【請求項31】

第１から第２ｍｎの抗原タンパク質のうち少なくとも一つが、ＡＱＰ４、ＭＯＧ、ＮＭＤＡ受容体、ＬＧＩ１、ＣＡＳＰＲ２、ＡＭＰＡ受容体、グリシン受容体、ＧＡＢＡ_Ｂ受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、ＬＤＬ受容体関連タンパク質４、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびｋｖ１．４から成る群より選択される、請求項１９〜３０のいずれか一項記載の方法。

【請求項32】

第１から第２ｍｎの試料が全て異なる試料である、請求項１９〜３１のいずれか一項記載の方法。

【請求項33】

第１から第２ｍｎの試料が同一の試料を含む、請求項１９〜３１のいずれか一項記載の方法。

【請求項34】

被検者に由来する試料が血清、血漿、全血、脳脊髄液、涙、唾液、および尿から成る群より選択される、請求項１〜３３のいずれか一項記載の方法。

【請求項35】

前記蛍光タンパク質が、Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed、mRasberry、mPlum、PS-CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、およびKikumeGRから成る群より選択される、請求項２〜１８、２０〜３４のいずれか一項記載の方法。

【請求項36】

前記蛍光色素もしくは蛍光タンパク質がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択される、請求項４〜１８、２２〜３５のいずれか一項記載の方法。

【請求項37】

前記二次抗体がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択されるいずれかで標識されている、請求項７〜１８、２５〜３６のいずれか一項記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、試料中に含まれる抗体をcell-based assay法に基づきハイスループットに検出する方法に関する。より詳細には、自己免疫疾患に関連する自己抗体、例えば視神経脊髄炎スペクトラム疾患（ＮＭＯＳＤ）および抗ＭＯＧ抗体関連疾患／ＭＯＧ抗体疾患に関連する自己抗体を含む、複数の抗体を同時に、または個々の抗体を複数の試料について同時に検出する方法に関し、特に、アクアポリン−４（ＡＱＰ４）およびミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）に対する抗体を検出する方法に関する。また、本発明は、これらの抗体の検出に基づく、疾患の診断方法にも関する。

【背景技術】

【0002】

多発性硬化症（multiple sclerosis：ＭＳ）は、オリゴデンドロサイトによって髄鞘が形成される脳・脊髄・視神経などの中枢神経系に生じる慢性炎症性脱髄疾患であり、時間的・空間的に病変が多発することを特徴とする。ここで、脱髄とは髄鞘が後天的に破壊される形態変化を指す。通常、詳細な病歴聴取や経時的な神経学的診察により時間的・空間的な病変の多発性が証明され、他の疾患を十分に除外することで診断が確定される。

【0003】

一方、主として視神経と脊髄に由来する症候を呈する患者の中には、視神経脊髄炎スペクトラム疾患（neuromyelitis optica spectrum disorders：ＮＭＯＳＤ）の病態を有する患者が含まれている。典型的な視神経脊髄炎（ＮＭＯ）は、重度の視神経炎と横断性脊髄炎を特徴とする炎症性中枢神経疾患である。２００４年にＮＭＯに特異なＩｇＧ（ＮＭＯ−ＩｇＧ）が発見され、さらにアストロサイトの足突起に高密度に発現する水チャネルタンパク質であるアクアポリン−４（aquaporin-4：ＡＱＰ４）がその標的抗原であることが報告された（特許文献１、非特許文献１）。典型的なＮＭＯに加えて、視神経炎（再発性あるいは両眼性）や３椎体以上の長い脊髄炎のみの症例も、視神経脊髄炎関連疾患（NMO spectrum disorders：ＮＭＯＳＤ）として同じ範疇の疾患として捉えられている。抗ＡＱＰ４抗体はＮＭＯ／ＮＭＯＳＤにおける血液中バイオマーカーとして確立しており、特異的診断価値が認められている。このため、抗ＡＱＰ４抗体検査は、ＮＭＯ／ＮＭＯＳＤの診断と治療方針の決定にとって極めて重要な検査となる。

【0004】

抗ＭＯＧ抗体関連疾患／ＭＯＧ抗体疾患は、近年新しい疾患概念として認識されつつある中枢神経系の炎症性脱髄疾患である。ＭＯＧ（ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質；myelin oligodendrocyte glycoprotein）はミエリン鞘を構成する成分の一つであり、抗ＭＯＧ抗体はこのＭＯＧを認識する自己抗体である。抗ＭＯＧ抗体が認められる患者の中には、抗ＡＱＰ４抗体陰性ＮＭＯ／ＮＭＯＳＤや再発性視神経炎、急性散在性脳脊髄炎の病態を有する患者が含まれている。本願では、抗ＭＯＧ抗体陽性の脱髄疾患を広く捉えて抗ＭＯＧ抗体関連疾患／ＭＯＧ抗体疾患と記載する。抗ＭＯＧ抗体関連疾患／ＭＯＧ抗体疾患は、ＭＳならびに抗ＡＱＰ４抗体陽性ＮＭＯ／ＮＭＯＳＤと異なる疾患群であることが報告されている（非特許文献２）。

【0005】

これらの状況をふまえ、脱髄性疾患患者に対する多発性硬化症の診断においては、視神経脊髄炎関連疾患などを鑑別する必要があるため、抗体検査を実施することが推奨されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】国際公開パンフレットＷＯ２００５／０５１１７８

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Lennon et al., JEM, Vol.202, No.4, August 15, 2005, 473-477.

【非特許文献2】Kaneko et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry, Vol.87, No.11, November, 2016, 1257-1259

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、多発性硬化症、視神経脊髄炎スペクトラム疾患、および抗ＭＯＧ抗体関連疾患／ＭＯＧ抗体疾患を含む、疾患の診断に有用な情報を提供する抗体のハイスループットな検出方法を提供することを目的の一つとする。また、本発明の目的には、抗体の検出をより簡便かつ高感度に行う手法を提供することも含まれる。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、Cell-based assay法（ＣＢＡ法）に基づいたフローサイトメトリーを用いることで簡便、効率的、高感度に、かつ低コストで、試料中に含まれる抗体をハイスループットに検出することを可能とする手法を開発した。本発明により、検体処理の簡便化を実現すると共に、検体処理からデータ取得までにかかる時間を大幅に削減することに成功した。また、生細胞を使用し精確な抗原タンパク質三次元立体構造を維持することによる検出感度の大幅な向上に成功した。また、一度の測定において複数種類の抗体を同時に検出することに成功し、一度の測定において定量性のある膨大なデータを取得することに成功した。本発明者らが開発した手法により、例えば抗ＡＱＰ４抗体、抗ＭＯＧ抗体、抗ＮＭＤＡ抗体、抗ＬＧＩ１抗体、抗ＣＡＳＰＲ２抗体、抗ＡＭＰＡ受容体抗体、抗グリシン受容体抗体、抗ＧＡＢＡ_Ｂ受容体抗体、抗ニコチン性アセチルコリン受容体抗体、抗筋特異的受容体型チロシンキナーゼ抗体、抗ＬＤＬ受容体関連タンパク質４抗体、抗リアノジン受容体抗体、抗ジヒドロピリジン受容体抗体および抗ｋｖ１．４抗体などの複数の抗体を単一の試料から同時に高感度に検出することができる。また、本発明者らが開発した手法により、複数の試料に含まれる抗体の検出を同時に行うことが可能となる。本発明の手法の態様には、以下が包含される：

【0010】

Ａ：１２種類の抗体の同時検出方法
［態様Ａ１］被検者に由来する試料中における第１から第１２の抗体を同時に検出または測定する方法であって、
第１の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第２の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第３の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第４の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第５の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第６の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第７の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第８の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第９の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第１０の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第１１の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第１２の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
該第１から第１２の抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、
該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含む、方法。
［態様Ａ２］第１から第１２の抗原タンパク質のそれぞれが蛍光タンパク質と融合しているか又はバイシストロニック（ＩＲＥＳ）発現ベクター（ＩＲＥＳ：Internal Ribosome Entry Site）を用いて蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳される、態様Ａ１記載の方法。
［態様Ａ３］第１から第６の抗原タンパク質がそれぞれ第１の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第１の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第７から第１２の抗原タンパク質がそれぞれ第２の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第２の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である、態様Ａ１またはＡ２記載の方法。
［態様Ａ４］第４から第６の抗原タンパク質を発現する細胞および第１０から第１２の抗原タンパク質を発現する細胞が、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質で標識されている、態様Ａ１〜Ａ３のいずれか記載の方法。
［態様Ａ５］第４から第６の抗原タンパク質を発現する細胞および第１０から第１２の抗原タンパク質を発現する細胞が、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されている、態様Ａ１〜Ａ４のいずれか記載の方法。
［態様Ａ６］第２、第５、第８および第１１の抗原タンパク質を発現する細胞が第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質で弱く標識されており、第３、第６、第９および第１２の抗原タンパク質を発現する細胞が第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質で強く標識されており、弱く標識された細胞と強く標識された細胞とが区別可能である、態様Ａ１〜Ａ５のいずれか記載の方法。
［態様Ａ７］前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、態様Ａ１〜Ａ６のいずれか記載の方法。
［態様Ａ８］被検者に由来する試料が血清、血漿、全血、脳脊髄液、涙、唾液、および尿から成る群より選択される、態様Ａ１〜Ａ７のいずれか記載の方法。
［態様Ａ９］第１から第１２の抗原タンパク質がそれぞれ互いに異なるタンパク質であり、それぞれＡＱＰ４、ＭＯＧ、ＮＭＤＡ受容体、ＬＧＩ１、ＣＡＳＰＲ２、ＡＭＰＡ受容体、グリシン受容体、ＧＡＢＡ_Ｂ受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、ＬＤＬ受容体関連タンパク質４、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびｋｖ１．４から成る群より選択される、態様Ａ１〜Ａ８のいずれか記載の方法。
［態様Ａ１０］前記蛍光タンパク質が、Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed、mRasberry、mPlum、PS-CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、およびKikumeGRから成る群より選択される、態様Ａ２〜Ａ９のいずれか記載の方法。
［態様Ａ１１］前記蛍光色素もしくは蛍光タンパク質がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択される、態様Ａ４〜Ａ１０のいずれか記載の方法。
［態様Ａ１２］前記二次抗体がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択されるいずれかで標識されている、態様Ａ７〜Ａ１１のいずれか記載の方法。
［態様Ａ１３］前記第１から第１２の抗原タンパク質を発現する細胞より選択される２〜１１種の細胞のみを使用することを特徴とする、態様Ａ１〜Ａ１２のいずれか記載の方法。
［態様Ａ１４］被検者に由来する試料中における複数の抗体を同時に検出または測定する方法であって、第１から第１２の抗原タンパク質を発現する細胞であって、第１から第１２の抗原タンパク質のそれぞれは蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第１から第６の抗原タンパク質はそれぞれ第１の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第１の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第７から第１２の抗原タンパク質はそれぞれ第２の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第２の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であり、第４から第６の抗原タンパク質を発現する細胞および第１０から第１２の抗原タンパク質を発現する細胞は、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質で標識されているか又は第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されており、そして、第２、第５、第８および第１１の抗原タンパク質を発現する細胞は第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質で弱く標識されており、第３、第６、第９および第１２の抗原タンパク質を発現する細胞は第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質で強く標識されており、弱く標識された細胞と強く標識された細胞とが区別可能である細胞のうち、２以上を調製する工程、該２以上の細胞を含む２以上の細胞懸濁液を調製する工程、該２以上の細胞懸濁液の各々に対して被検者に由来する１種類の試料が加えられるように、該２以上の細胞懸濁液に２以上の試料を加える工程、該２以上の細胞懸濁液を１つの容器中で混合し、蛍光標識した二次抗体を加える工程、ならびに該混合した細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含む、方法。
［態様Ａ１５］第１から第１２の抗原タンパク質がそれぞれ互いに異なるタンパク質である、態様Ａ１４記載の方法。
［態様Ａ１６］第１から第１２の抗原タンパク質が同一のタンパク質を含む、態様Ａ１４記載の方法。
［態様Ａ１７］第１から第１２の抗原タンパク質が、ＡＱＰ４、ＭＯＧ、ＮＭＤＡ受容体、ＬＧＩ１、ＣＡＳＰＲ２、ＡＭＰＡ受容体、グリシン受容体、ＧＡＢＡ_Ｂ受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、ＬＤＬ受容体関連タンパク質４、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびｋｖ１．４から成る群より選択される、態様Ａ１４〜Ａ１６のいずれか記載の方法。
［態様Ａ１８］前記第１から第１２の抗原タンパク質を発現する細胞より選択される２〜１１種の細胞のみを使用することを特徴とする、態様Ａ１４〜Ａ１７のいずれか記載の方法。

【0011】

Ｂ：４種類の抗体の同時検出方法
［態様Ｂ１］被検者に由来する試料中における第１の抗体、第２の抗体、第３の抗体、および第４の抗体を同時に検出または測定する方法であって、
第１の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第２の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第３の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第４の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
該第１から第４の抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、
該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含む、方法。
［態様Ｂ２］第１から第４の抗原タンパク質のぞれそれが蛍光タンパク質と融合しているか又は第１から第４の抗原タンパク質のぞれそれがＩＲＥＳ発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳される、態様Ｂ１記載の方法。
［態様Ｂ３］第１および第２の抗原タンパク質がそれぞれ第１の蛍光タンパク質と融合しているか又は第１および第２の抗原タンパク質がそれぞれＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第１の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第３および第４の抗原タンパク質がそれぞれ第２の蛍光タンパク質と融合しているか又は第３および第４の抗原タンパク質がそれぞれＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第２の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である、態様Ｂ１またはＢ２記載の方法。
［態様Ｂ４］第２の抗原タンパク質を発現する細胞および第４の抗原タンパク質を発現する細胞が第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質で標識されている、態様Ｂ１〜Ｂ３のいずれか記載の方法。
［態様Ｂ５］第２の抗原タンパク質を発現する細胞および第４の抗原タンパク質を発現する細胞が第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されている、態様Ｂ１〜Ｂ４のいずれか記載の方法。
［態様Ｂ６］第１から第４の抗原タンパク質がそれぞれ第１の蛍光タンパク質と融合しているか又は第１から第４の抗原タンパク質がそれぞれＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第１の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第２の抗原タンパク質を発現する細胞が第１の蛍光色素もしくは第２の蛍光タンパク質で弱く標識されており、第３の抗原タンパク質を発現する細胞が第１の蛍光色素もしくは第２の蛍光タンパク質で強く標識されており、弱く標識された細胞と強く標識された細胞とが区別可能であり、第４の抗原タンパク質を発現する細胞が第２の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されている、態様Ｂ１またはＢ２記載の方法。
［態様Ｂ７］前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、態様Ｂ１〜Ｂ６のいずれか記載の方法。
［態様Ｂ８］被検者に由来する試料が血清、血漿、全血、脳脊髄液、涙、唾液、および尿から成る群より選択される、態様Ｂ１〜Ｂ７のいずれか記載の方法。
［態様Ｂ９］第１から第４の抗原タンパク質がそれぞれ互いに異なるタンパク質であり、それぞれＡＱＰ４、ＭＯＧ、ＮＭＤＡ受容体、ＬＧＩ１、ＣＡＳＰＲ２、ＡＭＰＡ受容体、グリシン受容体、ＧＡＢＡ_Ｂ受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、ＬＤＬ受容体関連タンパク質４、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびｋｖ１．４から成る群より選択される、態様Ｂ１〜Ｂ８のいずれか記載の方法。
［態様Ｂ１０］前記蛍光タンパク質が、Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed、mRasberry、mPlum、PS-CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、およびKikumeGRから成る群より選択される、態様Ｂ２〜Ｂ９のいずれか記載の方法。
［態様Ｂ１１］前記蛍光色素もしくは蛍光タンパク質がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択される、態様Ｂ４〜Ｂ１０のいずれか記載の方法。
［態様Ｂ１２］前記二次抗体がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択されるいずれかで標識されている、態様Ｂ７〜Ｂ１１のいずれか記載の方法。
［態様Ｂ１３］前記第１から第４の抗原タンパク質を発現する細胞より選択される２〜３種の細胞のみを使用することを特徴とする、態様Ｂ１〜Ｂ１２のいずれか記載の方法。

【0012】

Ｃ：２種類の抗体の同時検出方法
［態様Ｃ１］被検者に由来する試料中における第１の抗体および第２の抗体を同時に検出または測定する方法であって、
第１の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第２の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
該第１および第２の抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、
該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含む、方法。
［態様Ｃ２］第１および第２の抗原タンパク質のぞれそれが蛍光タンパク質と融合しているか又は第１および第２の抗原タンパク質のぞれそれがＩＲＥＳ発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳される、態様Ｃ１記載の方法。
［態様Ｃ３］第１の抗原タンパク質が第１の蛍光タンパク質と融合しているか又は第１の抗原タンパク質がＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第１の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第２の抗原タンパク質が第２の蛍光タンパク質と融合しているか又は第２の抗原タンパク質がＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第２の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とが同一の蛍光タンパク質である、態様Ｃ１またはＣ２記載の方法。
［態様Ｃ４］第１の抗原タンパク質が第１の蛍光タンパク質と融合しているか又は第１の抗原タンパク質がＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第１の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第２の抗原タンパク質が第２の蛍光タンパク質と融合しているか又は第２の抗原タンパク質がＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第２の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である、態様Ｃ１またはＣ２記載の方法。
［態様Ｃ５］第２の抗原タンパク質を発現する細胞が第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質で標識されている、態様Ｃ１〜Ｃ４のいずれか記載の方法。
［態様Ｃ６］第２の抗原タンパク質を発現する細胞が第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体で標識されている、態様Ｃ１〜Ｃ５のいずれか記載の方法。
［態様Ｃ７］前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、態様Ｃ１〜Ｃ６のいずれか記載の方法。
［態様Ｃ８］被検者に由来する試料が血清、血漿、全血、脳脊髄液、涙、唾液、および尿から成る群より選択される、態様Ｃ１〜Ｃ７のいずれか記載の方法。
［態様Ｃ９］第１および第２の抗原タンパク質がそれぞれ互いに異なるタンパク質であり、それぞれＡＱＰ４、ＭＯＧ、ＮＭＤＡ受容体、ＬＧＩ１、ＣＡＳＰＲ２、ＡＭＰＡ受容体、グリシン受容体、ＧＡＢＡ_Ｂ受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、ＬＤＬ受容体関連タンパク質４、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびｋｖ１．４から成る群より選択される、態様Ｃ１〜Ｃ８のいずれか記載の方法。
［態様Ｃ１０］前記蛍光タンパク質が、Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed、mRasberry、mPlum、PS-CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、およびKikumeGRから成る群より選択される、態様Ｃ２〜Ｃ９のいずれか記載の方法。
［態様Ｃ１１］前記蛍光色素もしくは蛍光タンパク質がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択される、態様Ｃ５〜Ｃ１０のいずれか記載の方法。
［態様Ｃ１２］前記二次抗体がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択されるいずれかで標識されている、態様Ｃ７〜Ｃ１１のいずれか記載の方法。

【0013】

Ｄ：抗ＡＱＰ４抗体および抗ＭＯＧ抗体の同時検出方法
［態様Ｄ１］被検者に由来する試料中における抗ＡＱＰ４抗体および抗ＭＯＧ抗体を同時に検出または測定する方法であって、
ＡＱＰ４タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
ＭＯＧタンパク質を発現する細胞を調製する工程、
該ＡＱＰ４タンパク質を発現する細胞と該ＭＯＧタンパク質を発現する細胞とを含む細胞懸濁液を調製する工程、
該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含む、方法。
［態様Ｄ２］ＡＱＰ４タンパク質が蛍光タンパク質と融合している、態様Ｄ１記載の方法。
［態様Ｄ３］ＭＯＧタンパク質が蛍光タンパク質と融合している、態様Ｄ１またはＤ２記載の方法。
［態様Ｄ４］ＡＱＰ４タンパク質が融合している蛍光タンパク質とＭＯＧタンパク質が融合している蛍光タンパク質とが同一である、態様Ｄ３記載の方法。
［態様Ｄ５］ＡＱＰ４タンパク質を発現する細胞およびＭＯＧタンパク質を発現する細胞のいずれか一方または両方が蛍光色素もしくは蛍光タンパク質で標識されている、態様Ｄ４記載の方法。
［態様Ｄ６］ＡＱＰ４タンパク質を発現する細胞およびＭＯＧタンパク質を発現する細胞のいずれか一方または両方が蛍光色素もしくは蛍光タンパク質の接合した抗体で標識されている、態様Ｄ４またはＤ５記載の方法。
［態様Ｄ７］ＡＱＰ４タンパク質が融合している蛍光タンパク質とＭＯＧタンパク質が融合している蛍光タンパク質とが異なるものである、態様Ｄ３記載の方法。
［態様Ｄ８］前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、態様Ｄ１〜Ｄ７のいずれか記載の方法。
［態様Ｄ９］被検者に由来する試料が血清、血漿、全血、および脳脊髄液から成る群より選択される、態様Ｄ１〜Ｄ８のいずれか記載の方法。
［態様Ｄ１０］ＡＱＰ４タンパク質が融合している蛍光タンパク質がＥＧＦＰである、態様Ｄ２〜Ｄ９のいずれか記載の方法。
［態様Ｄ１１］ＭＯＧタンパク質が融合している蛍光タンパク質がＥＧＦＰである、態様Ｄ３〜Ｄ９のいずれか記載の方法。
［態様Ｄ１２］ＡＱＰ４タンパク質を発現する細胞およびＭＯＧタンパク質を発現する細胞のいずれか一方がHoechst 33342で標識されている、態様Ｄ５〜Ｄ１１のいずれか記載の方法。
［態様Ｄ１３］前記二次抗体がAlexa Fluor 647で標識されている、態様Ｄ８〜Ｄ１２のいずれか記載の方法。

【0014】

Ｅ：４ｎ種類の抗体の同時検出方法
［態様Ｅ１］被検者に由来する試料中における４ｎ種の抗体を同時に検出または測定する方法であって、
ｎは１以上の整数であり、
第１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
該第１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、
該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含み、
第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞が、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞がそれぞれ区別可能であり、
同様に、第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞、第２ｎ＋１から第３ｎの抗原タンパク質を発現する細胞、第３ｎ＋１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞が、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞、第２ｎ＋１から第３ｎの抗原タンパク質を発現する細胞、第３ｎ＋１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞がそれぞれ区別可能である、
方法。
［態様Ｅ２］第１から第４ｎの抗原タンパク質のそれぞれが蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳される、態様Ｅ１記載の方法。
［態様Ｅ３］第１から第２ｎの抗原タンパク質がそれぞれ第１の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第１の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第２ｎ＋１から第４ｎの抗原タンパク質がそれぞれ第２の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第２の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である、態様Ｅ１またはＥ２記載の方法。
［態様Ｅ４］第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞および第３ｎ＋１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞が、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質で標識されている、態様Ｅ１〜Ｅ３のいずれか記載の方法。
［態様Ｅ５］第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞および第３ｎ＋１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞が、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されている、態様Ｅ１〜Ｅ４のいずれか記載の方法。
［態様Ｅ６］前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、態様Ｅ１〜Ｅ５のいずれか記載の方法。
［態様Ｅ７］前記第１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞より選択される２〜４ｎ−１種の細胞のみを使用することを特徴とする、態様Ｅ１〜Ｅ６のいずれか記載の方法。
［態様Ｅ８］前記ｎ段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、態様Ｅ１〜Ｅ７のいずれか記載の方法。
［態様Ｅ９］被検者に由来する試料中における複数の抗体を同時に検出または測定する方法であって、第１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞であって、ｎは１以上の整数であり、第１から第４ｎの抗原タンパク質のそれぞれは蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第１から第２ｎの抗原タンパク質はそれぞれ第１の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第１の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第２ｎ＋１から第４ｎの抗原タンパク質はそれぞれ第２の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第２の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であり、第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞および第３ｎ＋１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞は、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質で標識されているか又は第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されており、そして、第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞は第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞、第２ｎ＋１から第３ｎの抗原タンパク質を発現する細胞、第３ｎ＋１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞が、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞、第２ｎ＋１から第３ｎの抗原タンパク質を発現する細胞、第３ｎ＋１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞がそれぞれ区別可能である細胞のうち、２以上を調製する工程、該２以上の細胞を含む２以上の細胞懸濁液を調製する工程、該２以上の細胞懸濁液の各々に対して被検者に由来する１種類の試料が加えられるように、該２以上の細胞懸濁液に２以上の試料を加える工程、該２以上の細胞懸濁液を１つの容器中で混合し、蛍光標識した二次抗体を加える工程、ならびに該混合した細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含む、方法。
［態様Ｅ１０］第１から第４ｎの抗原タンパク質がそれぞれ互いに異なるタンパク質である、態様Ｅ９記載の方法。
［態様Ｅ１１］第１から第４ｎの抗原タンパク質が同一のタンパク質を含む、態様Ｅ９記載の方法。
［態様Ｅ１２］前記第１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞より選択される２〜４ｎ−１種の細胞のみを使用することを特徴とする、態様Ｅ９〜Ｅ１１のいずれか記載の方法。
［態様Ｅ１３］前記ｎ段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、態様Ｅ９〜Ｅ１２のいずれか記載の方法。

【0015】

Ｆ：１２種類の試料中の抗体の同時検出方法
［態様Ｆ１］１以上の被検者に由来する１２種類の試料中における抗体を同時に検出または測定する方法であって、
第１から第１２の抗原タンパク質を発現する細胞をそれぞれ別個の容器中に調製する工程、
１以上の被検者に由来する第１から第１２の試料を、第１から第１２の抗原タンパク質を発現する細胞にそれぞれ加えてインキュベートする工程、
被検者に由来する試料を加えた第１から第１２の抗原タンパク質を発現する細胞を１つの容器中で混合して細胞懸濁液を得る工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含む、方法。
［態様Ｆ２］第１から第１２の抗原タンパク質のそれぞれが蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳される、態様Ｆ１記載の方法。
［態様Ｆ３］第１から第６の抗原タンパク質がそれぞれ第１の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第１の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第７から第１２の抗原タンパク質がそれぞれ第２の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第２の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である、態様Ｆ１またはＦ２記載の方法。
［態様Ｆ４］第４から第６の抗原タンパク質を発現する細胞および第１０から第１２の抗原タンパク質を発現する細胞が、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質で標識されている、態様Ｆ１〜Ｆ３のいずれか記載の方法。
［態様Ｆ５］第４から第６の抗原タンパク質を発現する細胞および第１０から第１２の抗原タンパク質を発現する細胞が、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されている、態様Ｆ１〜Ｆ４のいずれか記載の方法。
［態様Ｆ６］第２、第５、第８および第１１の抗原タンパク質を発現する細胞が第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質で弱く標識されており、第３、第６、第９および第１２の抗原タンパク質を発現する細胞が第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質で強く標識されており、弱く標識された細胞と強く標識された細胞とが区別可能である、態様Ｆ１〜Ｆ５のいずれか記載の方法。
［態様Ｆ７］前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、態様Ｆ１〜Ｆ６のいずれか記載の方法。
［態様Ｆ８］被検者に由来する試料が血清、血漿、全血、脳脊髄液、涙、唾液、および尿から成る群より選択される、態様Ｆ１〜Ｆ７のいずれか記載の方法。
［態様Ｆ９］第１から第１２の抗原タンパク質が同じタンパク質である、態様Ｆ１〜Ｆ８のいずれか記載の方法。
［態様Ｆ１０］第１から第１２の抗原タンパク質が異なるタンパク質を含む、態様Ｆ１〜Ｆ８のいずれか記載の方法。
［態様Ｆ１１］前記蛍光タンパク質が、Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed、mRasberry、mPlum、PS-CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、およびKikumeGRから成る群より選択される、態様Ｆ２〜Ｆ１０のいずれか記載の方法。
［態様Ｆ１２］前記蛍光色素もしくは蛍光タンパク質がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択される、態様Ｆ４〜Ｆ１１のいずれか記載の方法。
［態様Ｆ１３］前記二次抗体がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択されるいずれかで標識されている、態様Ｆ７〜Ｆ１２のいずれか記載の方法。
［態様Ｆ１４］前記第１から第１２の抗原タンパク質を発現する細胞より選択される２〜１１種の細胞のみを使用し、２〜１１種類の試料中における抗体を同時に検出または測定することを特徴とする、態様Ｆ１〜Ｆ１３のいずれか記載の方法。
［態様Ｆ１５］第１から第１２の抗原タンパク質が、ＡＱＰ４、ＭＯＧ、ＮＭＤＡ受容体、ＬＧＩ１、ＣＡＳＰＲ２、ＡＭＰＡ受容体、グリシン受容体、ＧＡＢＡ_Ｂ受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、ＬＤＬ受容体関連タンパク質４、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびｋｖ１．４から成る群より選択される、態様Ｆ１〜Ｆ１４のいずれか記載の方法。
［態様Ｆ１６］第１から第１２の試料が全て異なる試料である、態様Ｆ１〜Ｆ１５のいずれか記載の方法。
［態様Ｆ１７］第１から第１２の試料が同一の試料を含む、態様Ｆ１〜Ｆ１５のいずれか記載の方法。

【0016】

Ｇ：４ｎ種類の試料中の抗体の同時検出方法
［態様Ｇ１］１以上の被検者に由来する４ｎ個の試料中における抗体を同時に検出または測定する方法であって、
ｎは１以上の整数であり、
第１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞をそれぞれ別個の容器中に調製する工程、
１以上の被検者に由来する第１から第４ｎの試料を、第１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞にそれぞれ加えてインキュベートする工程、
被検者に由来する試料を加えた第１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞を１つの容器中で混合して細胞懸濁液を得る工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含み、
第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞が、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞がそれぞれ区別可能であり、
同様に、第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞、第２ｎ＋１から第３ｎの抗原タンパク質を発現する細胞、第３ｎ＋１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞が、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞、第２ｎ＋１から第３ｎの抗原タンパク質を発現する細胞、第３ｎ＋１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞がそれぞれ区別可能である、
方法。
［態様Ｇ２］第１から第４ｎの抗原タンパク質のそれぞれが蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳される、態様Ｇ１記載の方法。
［態様Ｇ３］第１から第２ｎの抗原タンパク質がそれぞれ第１の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第１の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第２ｎ＋１から第４ｎの抗原タンパク質がそれぞれ第２の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第２の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である、態様Ｇ１またはＧ２記載の方法。
［態様Ｇ４］第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞および第３ｎ＋１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞が、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質で標識されている、態様Ｇ１〜Ｇ３のいずれか記載の方法。
［態様Ｇ５］第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞および第３ｎ＋１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞が、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されている、態様Ｇ１〜Ｇ４のいずれか記載の方法。
［態様Ｇ６］前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、態様Ｇ１〜Ｇ５のいずれか記載の方法。
［態様Ｇ７］第１から第４ｎの抗原タンパク質が同じタンパク質である、態様Ｇ１〜Ｇ６のいずれか記載の方法。
［態様Ｇ８］第１から第４ｎの抗原タンパク質が異なるタンパク質を含む、態様Ｇ１〜Ｇ６のいずれか記載の方法。
［態様Ｇ９］前記第１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞より選択される２〜４ｎ−１種の細胞のみを使用し、２〜４ｎ−１種類の試料中における抗体を同時に検出または測定することを特徴とする、態様Ｇ１〜Ｇ８のいずれか記載の方法。
［態様Ｇ１０］前記ｎ段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、態様Ｇ１〜Ｇ９のいずれか記載の方法。
［態様Ｇ１１］第１から第４ｎの抗原タンパク質のうち少なくとも一つが、ＡＱＰ４、ＭＯＧ、ＮＭＤＡ受容体、ＬＧＩ１、ＣＡＳＰＲ２、ＡＭＰＡ受容体、グリシン受容体、ＧＡＢＡ_Ｂ受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、ＬＤＬ受容体関連タンパク質４、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびｋｖ１．４から成る群より選択される、態様Ｇ１〜Ｇ１０のいずれか記載の方法。
［態様Ｇ１２］第１から第４ｎの試料が全て異なる試料である、態様Ｇ１〜Ｇ１１のいずれか記載の方法。
［態様Ｇ１３］第１から第４ｎの試料が同一の試料を含む、態様Ｇ１〜Ｇ１１のいずれか記載の方法。

【0017】

Ｈ：２ｍｎ種類の抗体の同時検出方法
［態様Ｈ１］被検者に由来する試料中における２ｍｎ種の抗体を同時に検出または測定する方法であって、
ｍは１以上の整数であり、
ｎは１以上の整数であり、
第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
該第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、
該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含む、方法。
［態様Ｈ２］第１から第２ｍｎの抗原タンパク質のそれぞれが蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳される、態様Ｈ１記載の方法。
［態様Ｈ３］第１から第ｍｎの抗原タンパク質がそれぞれ第１の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第１の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第ｍｎ＋１から第２ｍｎの抗原タンパク質がそれぞれ第２の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第２の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である、態様Ｈ１またはＨ２記載の方法。
［態様Ｈ４］第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第１細胞グループとし、同様に、第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第２細胞グループ、第（ｍ−１）ｎ＋１から第ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第ｍ細胞グループ、第（２ｍ−１）ｎ＋１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第２ｍ細胞グループとし、第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞がｎ種類ずつ２ｍのグループに分けられており、
第１細胞グループから第ｍ細胞グループが、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第ｍ＋１細胞グループから第２ｍ細胞グループが、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能である、態様Ｈ１〜Ｈ３のいずれか記載の方法。
［態様Ｈ５］第１細胞グループから第ｍ細胞グループが、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第ｍ＋１細胞グループから第２ｍ細胞グループが、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能である、態様Ｈ４記載の方法。
［態様Ｈ６］第１細胞グループに属する第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞が、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第２細胞グループから第２ｍ細胞グループのそれぞれに属するｎ種類の細胞が、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能である、態様Ｈ４またはＨ５記載の方法。
［態様Ｈ７］前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、態様Ｈ１〜Ｈ６のいずれか記載の方法。
［態様Ｈ８］前記第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞より選択される２〜２ｍｎ−１種の細胞のみを使用することを特徴とする、態様Ｈ１〜Ｈ７のいずれか記載の方法。
［態様Ｈ９］前記ｍ段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、態様Ｈ４〜Ｈ８のいずれか記載の方法。
［態様Ｈ１０］前記ｎ段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、態様Ｈ６〜Ｈ９のいずれか記載の方法。
［態様Ｈ１１］被検者に由来する試料が血清、血漿、全血、脳脊髄液、涙、唾液、および尿から成る群より選択される、態様Ｈ１〜Ｈ１０のいずれか記載の方法。
［態様Ｈ１２］第１から第２ｍｎの抗原タンパク質がそれぞれ互いに異なるタンパク質であり、第１から第２ｍｎの抗原タンパク質のうち少なくとも一つがＡＱＰ４、ＭＯＧ、ＮＭＤＡ受容体、ＬＧＩ１、ＣＡＳＰＲ２、ＡＭＰＡ受容体、グリシン受容体、ＧＡＢＡ_Ｂ受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、ＬＤＬ受容体関連タンパク質４、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびｋｖ１．４から成る群より選択される、態様Ｈ１〜Ｈ１１のいずれか記載の方法。
［態様Ｈ１３］前記蛍光タンパク質が、Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed、mRasberry、mPlum、PS-CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、およびKikumeGRから成る群より選択される、態様Ｈ２〜Ｈ１２のいずれか記載の方法。
［態様Ｈ１４］前記蛍光色素もしくは蛍光タンパク質がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択される、態様Ｈ４〜Ｈ１３のいずれか記載の方法。
［態様Ｈ１５］前記二次抗体がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択されるいずれかで標識されている、態様Ｈ７〜Ｈ１４のいずれか記載の方法。
［態様Ｈ１６］被検者に由来する試料中における複数の抗体を同時に検出または測定する方法であって、第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞であって、ｍは１以上の整数であり、ｎは１以上の整数であり、第１から第ｍｎの抗原タンパク質はそれぞれ第１の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第１の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第ｍｎ＋１から第２ｍｎの抗原タンパク質はそれぞれ第２の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第２の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であり、第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第１細胞グループとし、同様に、第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第２細胞グループ、第（ｍ−１）ｎ＋１から第ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第ｍ細胞グループ、第（２ｍ−１）ｎ＋１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第２ｍ細胞グループとし、第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞がｎ種類ずつ２ｍのグループに分けられており、第１細胞グループから第ｍ細胞グループが、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されているか又は第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第ｍ＋１細胞グループから第２ｍ細胞グループが、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されているか又は第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、第１細胞グループに属する第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞が、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第２細胞グループから第２ｍ細胞グループのそれぞれに属するｎ種類の細胞が、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能である細胞のうち、２以上を調製する工程、該２以上の細胞を含む２以上の細胞懸濁液を調製する工程、該２以上の細胞懸濁液の各々に対して被検者に由来する１種類の試料が加えられるように、該２以上の細胞懸濁液に２以上の試料を加える工程、該２以上の細胞懸濁液を１つの容器中で混合し、蛍光標識した二次抗体を加える工程、ならびに該混合した細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含む、方法。
［態様Ｈ１７］第１から第２ｍｎの抗原タンパク質がそれぞれ互いに異なるタンパク質である、態様Ｈ１６記載の方法。
［態様Ｈ１８］第１から第２ｍｎの抗原タンパク質が同一のタンパク質を含む、態様Ｈ１６記載の方法。
［態様Ｈ１９］第１から第２ｍｎの抗原タンパク質のうち少なくとも一つが、ＡＱＰ４、ＭＯＧ、ＮＭＤＡ受容体、ＬＧＩ１、ＣＡＳＰＲ２、ＡＭＰＡ受容体、グリシン受容体、ＧＡＢＡ_Ｂ受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、ＬＤＬ受容体関連タンパク質４、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびｋｖ１．４から成る群より選択される、態様Ｈ１６〜Ｈ１８のいずれか記載の方法。
［態様Ｈ２０］前記第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞より選択される２〜２ｍｎ−１種の細胞のみを使用することを特徴とする、態様Ｈ１６〜Ｈ１９のいずれか記載の方法。
［態様Ｈ２１］前記ｍ段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、態様Ｈ１６〜Ｈ２０のいずれか記載の方法。
［態様Ｈ２２］前記ｎ段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、態様Ｈ１６〜Ｈ２１のいずれか記載の方法。

【0018】

Ｉ：２ｍｎ種類の試料中の抗体の同時検出方法
［態様Ｉ１］１以上の被検者に由来する２ｍｎ個の試料中における抗体を同時に検出または測定する方法であって、
ｍは１以上の整数であり、
ｎは１以上の整数であり、
第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞をそれぞれ別個の容器中に調製する工程、
１以上の被検者に由来する第１から第２ｍｎの試料を、第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞にそれぞれ加えてインキュベートする工程、
被検者に由来する試料を加えた第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を１つの容器中で混合して細胞懸濁液を得る工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含む、方法。
［態様Ｉ２］第１から第２ｍｎの抗原タンパク質のそれぞれが蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳される、態様Ｉ１記載の方法。
［態様Ｉ３］第１から第ｍｎの抗原タンパク質がそれぞれ第１の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第１の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第ｍｎ＋１から第２ｍｎの抗原タンパク質がそれぞれ第２の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第２の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である、態様Ｉ１またはＩ２記載の方法。
［態様Ｉ４］第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第１細胞グループとし、同様に、第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第２細胞グループ、第（ｍ−１）ｎ＋１から第ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第ｍ細胞グループ、第（２ｍ−１）ｎ＋１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第２ｍ細胞グループとし、第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞がｎ種類ずつ２ｍのグループに分けられており、
第１細胞グループから第ｍ細胞グループが、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第ｍ＋１細胞グループから第２ｍ細胞グループが、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能である、態様Ｉ１〜Ｉ３のいずれか記載の方法。
［態様Ｉ５］第１細胞グループから第ｍ細胞グループが、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第ｍ＋１細胞グループから第２ｍ細胞グループが、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能である、態様Ｉ４記載の方法。
［態様Ｉ６］第１細胞グループに属する第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞が、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第２細胞グループから第２ｍ細胞グループのそれぞれに属するｎ種類の細胞が、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能である、態様Ｉ４またはＩ５記載の方法。
［態様Ｉ７］前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、態様Ｉ１〜Ｉ６のいずれか記載の方法。
［態様Ｉ８］第１から第２ｍｎの抗原タンパク質が同じタンパク質である、態様Ｉ１〜Ｉ７のいずれか記載の方法。
［態様Ｉ９］第１から第２ｍｎの抗原タンパク質が異なるタンパク質を含む、態様Ｉ１〜Ｉ７のいずれか記載の方法。
［態様Ｉ１０］前記第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞より選択される２〜２ｍｎ−１種の細胞のみを使用し、２〜２ｍｎ−１種類の試料中における抗体を同時に検出または測定することを特徴とする、態様Ｉ１〜Ｉ９のいずれか記載の方法。
［態様Ｉ１１］前記ｍ段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、態様Ｉ４〜Ｉ１０のいずれか記載の方法。
［態様Ｉ１２］前記ｎ段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、態様Ｉ６〜Ｉ１１のいずれか記載の方法。
［態様Ｉ１３］被検者に由来する試料が血清、血漿、全血、脳脊髄液、涙、唾液、および尿から成る群より選択される、態様Ｉ１〜Ｉ１２のいずれか記載の方法。
［態様Ｉ１４］前記蛍光タンパク質が、Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed、mRasberry、mPlum、PS-CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、およびKikumeGRから成る群より選択される、態様Ｉ２〜Ｉ１３のいずれか記載の方法。
［態様Ｉ１５］前記蛍光色素もしくは蛍光タンパク質がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択される、態様Ｉ４〜Ｉ１４のいずれか記載の方法。
［態様Ｉ１６］前記二次抗体がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択されるいずれかで標識されている、態様Ｉ７〜Ｉ１５のいずれか記載の方法。
［態様Ｉ１７］第１から第２ｍｎの抗原タンパク質のうち少なくとも一つが、ＡＱＰ４、ＭＯＧ、ＮＭＤＡ受容体、ＬＧＩ１、ＣＡＳＰＲ２、ＡＭＰＡ受容体、グリシン受容体、ＧＡＢＡ_Ｂ受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、ＬＤＬ受容体関連タンパク質４、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびｋｖ１．４から成る群より選択される、態様Ｉ１〜Ｉ１６のいずれか記載の方法。
［態様Ｉ１８］第１から第２ｍｎの試料が全て異なる試料である、態様Ｉ１〜Ｉ１７のいずれか記載の方法。
［態様Ｉ１９］第１から第２ｍｎの試料が同一の試料を含む、態様Ｉ１〜Ｉ１７のいずれか記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】被検者に由来する試料中における抗ＡＱＰ４抗体および抗ＭＯＧ抗体の同時検出の際に使用する細胞サンプルの作製手順を例示した図である。

【図2】図１で作製した細胞サンプルを用いて行う、フローサイトメトリー解析の方法を示した図である。

【図3-1】視神経脊髄炎関連疾患患者（５８歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陽性かつ抗ＭＯＧ抗体陰性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。横軸を前方散乱光（Forward Scatter：ＦＳＣ）、縦軸を側方散乱光（Side Scatter：ＳＳＣ）としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ１ゲートを作成した図である。５００００細胞の測定を行った。

【図3-2】視神経脊髄炎関連疾患患者（５８歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陽性かつ抗ＭＯＧ抗体陰性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図３−１のＰ１ゲート内に含まれる死細胞を７−ＡＡＤ染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するＰ２ゲートを作成した図である。

【図3-3】視神経脊髄炎関連疾患患者（５８歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陽性かつ抗ＭＯＧ抗体陰性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図３−２のＰ２ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ３ゲートを作成した図である。

【図3-4】視神経脊髄炎関連疾患患者（５８歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陽性かつ抗ＭＯＧ抗体陰性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図３−３のＰ３ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ４ゲートを作成した図である。図３−３と図３−４によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。

【図3-5】視神経脊髄炎関連疾患患者（５８歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陽性かつ抗ＭＯＧ抗体陰性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図３−４のＰ４ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とＳＳＣで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してＰ５ゲートを、Hoechst 33342陽性細胞群に対してＰ６ゲートを作成した図である。

【図3-6】視神経脊髄炎関連疾患患者（５８歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陽性かつ抗ＭＯＧ抗体陰性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図３−５のHoechst 33342陰性細胞群ならびに陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした１次元ヒストグラムで示した図である。

【図3-7】視神経脊髄炎関連疾患患者（５８歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陽性かつ抗ＭＯＧ抗体陰性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図３−５のＰ５ゲートをＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗ＡＱＰ４抗体が含まれている場合、Ｑ２領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにＱ２領域に細胞集団が存在する（本データでは、図３−５のＰ５ゲートHoechst 33342陰性細胞群のうちの３０．４％の細胞が存在する）ことから、本血清は抗ＡＱＰ４抗体陽性であると判断した。

【図3-8】視神経脊髄炎関連疾患患者（５８歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陽性かつ抗ＭＯＧ抗体陰性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図３−５のＰ６ゲートをＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗ＭＯＧ抗体が含まれている場合、Ｑ２領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにＱ２領域に細胞集団が存在しない（本データでは、図３−５のＰ６ゲートHoechst 33342陽性細胞群のうち僅かに０．３５％の細胞しか存在しない）ことから、本血清は抗ＭＯＧ抗体陰性であると判断した。

【図4-1】視神経脊髄炎関連疾患患者（４４歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陽性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。横軸を前方散乱光（Forward Scatter：ＦＳＣ）、縦軸を側方散乱光（Side Scatter：ＳＳＣ）としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ１ゲートを作成した図である。５００００細胞の測定を行った。

【図4-2】視神経脊髄炎関連疾患患者（４４歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陽性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図４−１のＰ１ゲート内に含まれる死細胞を７−ＡＡＤ染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するＰ２ゲートを作成した図である。

【図4-3】視神経脊髄炎関連疾患患者（４４歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陽性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図４−２のＰ２ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ３ゲートを作成した図である。

【図4-4】視神経脊髄炎関連疾患患者（４４歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陽性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図４−３のＰ３ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ４ゲートを作成した図である。図４−３と図４−４によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。

【図4-5】視神経脊髄炎関連疾患患者（４４歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陽性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図４−４のＰ４ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とＳＳＣで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してＰ５ゲートを、Hoechst 33342陽性細胞群に対してＰ６ゲートを作成した図である。

【図4-6】視神経脊髄炎関連疾患患者（４４歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陽性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図４−５のHoechst 33342陰性細胞群ならびに陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした１次元ヒストグラムで示した図である。

【図4-7】視神経脊髄炎関連疾患患者（４４歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陽性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図４−５のＰ５ゲートをＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗ＡＱＰ４抗体が含まれている場合、Ｑ２領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにＱ２領域に細胞集団が存在する（本データでは、図４−５のＰ５ゲートHoechst 33342陰性細胞群のうちの２８．３％の細胞が存在する）ことから、本血清は抗ＡＱＰ４抗体陽性であると判断した。

【図4-8】視神経脊髄炎関連疾患患者（４４歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陽性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図４−５のＰ６ゲートをＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗ＭＯＧ抗体が含まれている場合、Ｑ２領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにＱ２領域に細胞集団が存在する（本データでは、図４−５のＰ６ゲートHoechst 33342陽性細胞群のうちの１４．０％の細胞が存在する）ことから、本血清は抗ＭＯＧ抗体陽性であると判断した。

【図5-1】視神経脊髄炎関連疾患患者（５７歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体弱陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。横軸を前方散乱光（Forward Scatter：ＦＳＣ）、縦軸を側方散乱光（Side Scatter：ＳＳＣ）としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ１ゲートを作成した図である。５００００細胞の測定を行った。

【図5-2】視神経脊髄炎関連疾患患者（５７歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体弱陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図５−１のＰ１ゲート内に含まれる死細胞を７−ＡＡＤ染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するＰ２ゲートを作成した図である。

【図5-3】視神経脊髄炎関連疾患患者（５７歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体弱陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図５−２のＰ２ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ３ゲートを作成した図である。

【図5-4】視神経脊髄炎関連疾患患者（５７歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体弱陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図５−３のＰ３ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ４ゲートを作成した図である。図５−３と図５−４によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。

【図5-5】視神経脊髄炎関連疾患患者（５７歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体弱陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図５−４のＰ４ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とＳＳＣで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してＰ５ゲートを、Hoechst 33342陽性細胞群に対してＰ６ゲートを作成した図である。

【図5-6】視神経脊髄炎関連疾患患者（５７歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体弱陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図５−５のHoechst 33342陰性細胞群ならびに陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした１次元ヒストグラムで示した図である。

【図5-7】視神経脊髄炎関連疾患患者（５７歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体弱陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図５−５のＰ５ゲートをＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗ＡＱＰ４抗体が含まれている場合、Ｑ２領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにＱ２領域に細胞集団が存在しない（本データでは、図５−５のＰ５ゲートHoechst 33342陰性細胞群のうち僅かに０．１２％の細胞しか存在しない）ことから、本血清は抗ＡＱＰ４抗体陰性であると判断した。

【図5-8】視神経脊髄炎関連疾患患者（５７歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体弱陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図５−５のＰ６ゲートをＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗ＭＯＧ抗体が含まれている場合、Ｑ２領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにＱ２領域に細胞集団が存在する（本データでは、図５−５のＰ６ゲートHoechst 33342陽性細胞群のうちの３．５０％の細胞が存在する）ことから、本血清は抗ＭＯＧ抗体弱陽性であると判断した。

【図6-1】多発性硬化症患者（２３歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。横軸を前方散乱光（Forward Scatter：ＦＳＣ）、縦軸を側方散乱光（Side Scatter：ＳＳＣ）としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ１ゲートを作成した図である。５００００細胞の測定を行った。

【図6-2】多発性硬化症患者（２３歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図６−１のＰ１ゲート内に含まれる死細胞を７−ＡＡＤ染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するＰ２ゲートを作成した図である。

【図6-3】多発性硬化症患者（２３歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図６−２のＰ２ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ３ゲートを作成した図である。

【図6-4】多発性硬化症患者（２３歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図６−３のＰ３ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ４ゲートを作成した図である。図６−３と図６−４によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。

【図6-5】多発性硬化症患者（２３歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図６−４のＰ４ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とＳＳＣで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してＰ５ゲートを、Hoechst 33342陽性細胞群に対してＰ６ゲートを作成した図である。

【図6-6】多発性硬化症患者（２３歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図６−５のHoechst 33342陰性細胞群ならびに陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした１次元ヒストグラムで示した図である。

【図6-7】多発性硬化症患者（２３歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図６−５のＰ５ゲートをＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗ＡＱＰ４抗体が含まれている場合、Ｑ２領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにＱ２領域に細胞集団が存在しない（本データでは、図６−５のＰ５ゲートHoechst 33342陰性細胞群のうち僅かに０．２６％の細胞しか存在しない）ことから、本血清は抗ＡＱＰ４抗体陰性であると判断した。

【図6-8】多発性硬化症患者（２３歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図６−５のＰ６ゲートをＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗ＭＯＧ抗体が含まれている場合、Ｑ２領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにＱ２領域に細胞集団が存在する（本データでは、図６−５のＰ６ゲートHoechst 33342陽性細胞群のうちの２０．１％の細胞が存在する）ことから、本血清は抗ＭＯＧ抗体陽性であると判断した。

【図7-1】多発性硬化症患者（５０歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陰性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。横軸を前方散乱光（Forward Scatter：ＦＳＣ）、縦軸を側方散乱光（Side Scatter：ＳＳＣ）としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ１ゲートを作成した図である。５００００細胞の測定を行った。

【図7-2】多発性硬化症患者（５０歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陰性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図７−１のＰ１ゲート内に含まれる死細胞を７−ＡＡＤ染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するＰ２ゲートを作成した図である。

【図7-3】多発性硬化症患者（５０歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陰性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図７−２のＰ２ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ３ゲートを作成した図である。

【図7-4】多発性硬化症患者（５０歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陰性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図７−３のＰ３ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ４ゲートを作成した図である。図７−３と図７−４によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。

【図7-5】多発性硬化症患者（５０歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陰性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図７−４のＰ４ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とＳＳＣで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してＰ５ゲートを、Hoechst 33342陽性細胞群に対してＰ６ゲートを作成した図である。

【図7-6】多発性硬化症患者（５０歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陰性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図７−５のHoechst 33342陰性細胞群ならびに陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした１次元ヒストグラムで示した図である。

【図7-7】多発性硬化症患者（５０歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陰性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図７−５のＰ５ゲートをＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗ＡＱＰ４抗体が含まれている場合、Ｑ２領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにＱ２領域に細胞集団が存在しない（本データでは、図７−５のＰ５ゲートHoechst 33342陰性細胞群のうち僅かに０．４４％の細胞しか存在しない）ことから、本血清は抗ＡＱＰ４抗体陰性であると判断した。

【図7-8】多発性硬化症患者（５０歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陰性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図７−５のＰ６ゲートをＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗ＭＯＧ抗体が含まれている場合、Ｑ２領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにＱ２領域に細胞集団が存在しない（本データでは、図７−５のＰ６ゲートHoechst 33342陽性細胞群のうち僅かに０．２４％の細胞しか存在しない）ことから、本血清は抗ＭＯＧ抗体陰性であると判断した。

【図8-1】視神経炎患者（７８歳男性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。横軸を前方散乱光（Forward Scatter：ＦＳＣ）、縦軸を側方散乱光（Side Scatter：ＳＳＣ）としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ１ゲートを作成した図である。５００００細胞の測定を行った。

【図8-2】視神経炎患者（７８歳男性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図８−１のＰ１ゲート内に含まれる死細胞を７−ＡＡＤ染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するＰ２ゲートを作成した図である。

【図8-3】視神経炎患者（７８歳男性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図８−２のＰ２ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ３ゲートを作成した図である。

【図8-4】視神経炎患者（７８歳男性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図８−３のＰ３ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ４ゲートを作成した図である。図８−３と図８−４によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。

【図8-5】視神経炎患者（７８歳男性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図８−４のＰ４ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とＳＳＣで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してＰ５ゲートを、Hoechst 33342陽性細胞群に対してＰ６ゲートを作成した図である。

【図8-6】視神経炎患者（７８歳男性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図８−５のHoechst 33342陰性細胞群ならびに陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした１次元ヒストグラムで示した図である。

【図8-7】視神経炎患者（７８歳男性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図８−５のＰ５ゲートをＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗ＡＱＰ４抗体が含まれている場合、Ｑ２領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにＱ２領域に細胞集団が存在しない（本データでは、図８−５のＰ５ゲートHoechst 33342陰性細胞群のうち僅かに０．２６％の細胞しか存在しない）ことから、本血清は抗ＡＱＰ４抗体陰性であると判断した。

【図8-8】視神経炎患者（７８歳男性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図８−５のＰ６ゲートをＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗ＭＯＧ抗体が含まれている場合、Ｑ２領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにＱ２領域に細胞集団が存在する（本データでは、図８−５のＰ６ゲートHoechst 33342陽性細胞群のうちの２１．４％の細胞が存在する）ことから、本血清は抗ＭＯＧ抗体陽性であると判断した。

【図9-1】再発性急性散在性脳脊髄炎患者（１５歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。横軸を前方散乱光（Forward Scatter：ＦＳＣ）、縦軸を側方散乱光（Side Scatter：ＳＳＣ）としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ１ゲートを作成した図である。５００００細胞の測定を行った。

【図9-2】再発性急性散在性脳脊髄炎患者（１５歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図９−１のＰ１ゲート内に含まれる死細胞を７−ＡＡＤ染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するＰ２ゲートを作成した図である。

【図9-3】再発性急性散在性脳脊髄炎患者（１５歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図９−２のＰ２ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ３ゲートを作成した図である。

【図9-4】再発性急性散在性脳脊髄炎患者（１５歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図９−３のＰ３ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ４ゲートを作成した図である。図９−３と図９−４によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。

【図9-5】再発性急性散在性脳脊髄炎患者（１５歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図９−４のＰ４ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とＳＳＣで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してＰ５ゲートを、Hoechst 33342陽性細胞群に対してＰ６ゲートを作成した図である。

【図9-6】再発性急性散在性脳脊髄炎患者（１５歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図９−５のHoechst 33342陰性細胞群ならびに陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした１次元ヒストグラムで示した図である。

【図9-7】再発性急性散在性脳脊髄炎患者（１５歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図９−５のＰ５ゲートをＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗ＡＱＰ４抗体が含まれている場合、Ｑ２領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにＱ２領域に細胞集団が存在しない（本データでは、図９−５のＰ５ゲートHoechst 33342陰性細胞群のうち僅かに０．４０％の細胞しか存在しない）ことから、本血清は抗ＡＱＰ４抗体陰性であると判断した。

【図9-8】再発性急性散在性脳脊髄炎患者（１５歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図９−５のＰ６ゲートをＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗ＭＯＧ抗体が含まれている場合、Ｑ２領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにＱ２領域に細胞集団が存在する（本データでは、図９−５のＰ６ゲートHoechst 33342陽性細胞群のうちの６．４０％の細胞が存在する）ことから、本血清は抗ＭＯＧ抗体陽性であると判断した。

【図10-1】健常者（２４歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陰性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。横軸を前方散乱光（Forward Scatter：ＦＳＣ）、縦軸を側方散乱光（Side Scatter：ＳＳＣ）としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ１ゲートを作成した図である。５００００細胞の測定を行った。

【図10-2】健常者（２４歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陰性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図１０−１のＰ１ゲート内に含まれる死細胞を７−ＡＡＤ染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するＰ２ゲートを作成した図である。

【図10-3】健常者（２４歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陰性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図１０−２のＰ２ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ３ゲートを作成した図である。

【図10-4】健常者（２４歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陰性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図１０−３のＰ３ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ４ゲートを作成した図である。図１０−３と図１０−４によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。

【図10-5】健常者（２４歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陰性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図１０−４のＰ４ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とＳＳＣで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してＰ５ゲートを、Hoechst 33342陽性細胞群に対してＰ６ゲートを作成した図である。

【図10-6】健常者（２４歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陰性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図１０−５のHoechst 33342陰性細胞群ならびに陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした１次元ヒストグラムで示した図である。

【図10-7】健常者（２４歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陰性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図１０−５のＰ５ゲートをＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗ＡＱＰ４抗体が含まれている場合、Ｑ２領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにＱ２領域に細胞集団が存在しない（本データでは、図１０−５のＰ５ゲートHoechst 33342陰性細胞群のうち僅かに０．０７６％の細胞しか存在しない）ことから、本血清は抗ＡＱＰ４抗体陰性であると判断した。

【図10-8】健常者（２４歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陰性）を示したフローサイトメトリー解析の図である。図１０−５のＰ６ゲートをＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗ＭＯＧ抗体が含まれている場合、Ｑ２領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにＱ２領域に細胞集団が存在しない（本データでは、図１０−５のＰ６ゲートHoechst 33342陽性細胞群のうち僅かに０．０６１％の細胞しか存在しない）ことから、本血清は抗ＭＯＧ抗体陰性であると判断した。

【図11-1】第１の抗原タンパク質を発現する細胞、第２の抗原タンパク質を発現する細胞、第３の抗原タンパク質を発現する細胞を、第１の蛍光色素染色により、陰性群、弱陽性群、強陽性群の３群に分けたフローサイトメトリー解析の図である。本データでは第１の蛍光色素としてHoechst 33342を使用した。同様の手法を用いることで、３種類の細胞、具体的には第３ｎ−２の抗原タンパク質を発現する細胞、第３ｎ−１の抗原タンパク質を発現する細胞、第３ｎの抗原タンパク質を発現する細胞（ｎは２以上の整数）に対して、第１の蛍光色素染色により、陰性群、弱陽性群、強陽性群の３群に分けることができる。横軸を前方散乱光（Forward Scatter：ＦＳＣ）、縦軸を側方散乱光（Side Scatter：ＳＳＣ）としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ１ゲートを作成した図である。５００００細胞の測定を行った。

【図11-2】第１の抗原タンパク質を発現する細胞、第２の抗原タンパク質を発現する細胞、第３の抗原タンパク質を発現する細胞を、第１の蛍光色素染色により、陰性群、弱陽性群、強陽性群の３群に分けたフローサイトメトリー解析の図である。本データでは第１の蛍光色素としてHoechst 33342を使用した。同様の手法を用いることで、３種類の細胞、具体的には第３ｎ−２の抗原タンパク質を発現する細胞、第３ｎ−１の抗原タンパク質を発現する細胞、第３ｎの抗原タンパク質を発現する細胞（ｎは２以上の整数）に対して、第１の蛍光色素染色により、陰性群、弱陽性群、強陽性群の３群に分けることができる。図１１−１のＰ１ゲート内に含まれる死細胞を７−ＡＡＤ染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するＰ２ゲートを作成した図である。

【図11-3】第１の抗原タンパク質を発現する細胞、第２の抗原タンパク質を発現する細胞、第３の抗原タンパク質を発現する細胞を、第１の蛍光色素染色により、陰性群、弱陽性群、強陽性群の３群に分けたフローサイトメトリー解析の図である。本データでは第１の蛍光色素としてHoechst 33342を使用した。同様の手法を用いることで、３種類の細胞、具体的には第３ｎ−２の抗原タンパク質を発現する細胞、第３ｎ−１の抗原タンパク質を発現する細胞、第３ｎの抗原タンパク質を発現する細胞（ｎは２以上の整数）に対して、第１の蛍光色素染色により、陰性群、弱陽性群、強陽性群の３群に分けることができる。図１１−２のＰ２ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ３ゲートを作成した図である。

【図11-4】第１の抗原タンパク質を発現する細胞、第２の抗原タンパク質を発現する細胞、第３の抗原タンパク質を発現する細胞を、第１の蛍光色素染色により、陰性群、弱陽性群、強陽性群の３群に分けたフローサイトメトリー解析の図である。本データでは第１の蛍光色素としてHoechst 33342を使用した。同様の手法を用いることで、３種類の細胞、具体的には第３ｎ−２の抗原タンパク質を発現する細胞、第３ｎ−１の抗原タンパク質を発現する細胞、第３ｎの抗原タンパク質を発現する細胞（ｎは２以上の整数）に対して、第１の蛍光色素染色により、陰性群、弱陽性群、強陽性群の３群に分けることができる。図１１−３のＰ３ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ４ゲートを作成した図である。図１１−３と図１１−４によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。

【図11-5】第１の抗原タンパク質を発現する細胞、第２の抗原タンパク質を発現する細胞、第３の抗原タンパク質を発現する細胞を、第１の蛍光色素染色により、陰性群、弱陽性群、強陽性群の３群に分けたフローサイトメトリー解析の図である。本データでは第１の蛍光色素としてHoechst 33342を使用した。同様の手法を用いることで、３種類の細胞、具体的には第３ｎ−２の抗原タンパク質を発現する細胞、第３ｎ−１の抗原タンパク質を発現する細胞、第３ｎの抗原タンパク質を発現する細胞（ｎは２以上の整数）に対して、第１の蛍光色素染色により、陰性群、弱陽性群、強陽性群の３群に分けることができる。図１１−４のＰ４ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とＳＳＣで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してＰ５ゲートを、Hoechst 33342弱陽性細胞群に対してＰ６ゲートを、Hoechst 33342強陽性細胞群に対してＰ７ゲートを作成した図である。

【図11-6】第１の抗原タンパク質を発現する細胞、第２の抗原タンパク質を発現する細胞、第３の抗原タンパク質を発現する細胞を、第１の蛍光色素染色により、陰性群、弱陽性群、強陽性群の３群に分けたフローサイトメトリー解析の図である。本データでは第１の蛍光色素としてHoechst 33342を使用した。同様の手法を用いることで、３種類の細胞、具体的には第３ｎ−２の抗原タンパク質を発現する細胞、第３ｎ−１の抗原タンパク質を発現する細胞、第３ｎの抗原タンパク質を発現する細胞（ｎは２以上の整数）に対して、第１の蛍光色素染色により、陰性群、弱陽性群、強陽性群の３群に分けることができる。図１１−５のHoechst 33342陰性細胞群、弱陽性細胞群ならびに強陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした１次元ヒストグラムで示した図である。

【図12】ヒトＡＱＰ４Ｍ２３ ｃＤＮＡ配列を示す図である。図中に示される配列は、ストップコドン（下線）を含んでいるが、使用する発現ベクターの種類によっては、ストップコドン（ＴＧＡ）を削った配列を用いてもよい。

【図13】ヒトＭＯＧアイソフォームα１前駆体のｃＤＮＡ配列を示す図である。図中に示される配列は、ストップコドン（下線）を含んでいるが、使用する発現ベクターの種類によっては、ストップコドン（ＴＧＡ）を削った配列を用いてもよい。

【発明を実施するための形態】

【0020】

上述のとおり、本発明者らは、Cell-based assay法（ＣＢＡ法）に基づいたフローサイトメトリーを用いることで簡便、効率的、高感度に、かつ低コストで、試料中に含まれる抗体をハイスループットに検出することを可能とする手法を開発した。本発明により、検体処理の簡便化を実現すると共に、検体処理からデータ取得までにかかる時間を大幅に削減することに成功した。また、生細胞を使用し精確な抗原タンパク質三次元立体構造を維持することによる検出感度の大幅な向上に成功した。また、一度の測定において複数種類の抗体を同時に検出することに成功し、一度の測定において定量性のある膨大なデータを取得することに成功した。本発明者らが開発した手法により、抗ＡＱＰ４抗体、抗ＭＯＧ抗体、抗ＮＭＤＡ抗体、抗ＬＧＩ１抗体、抗ＣＡＳＰＲ２抗体、抗ＡＭＰＡ受容体抗体、抗グリシン受容体抗体、抗ＧＡＢＡ_Ｂ受容体抗体、抗ニコチン性アセチルコリン受容体抗体、抗筋特異的受容体型チロシンキナーゼ抗体、抗ＬＤＬ受容体関連タンパク質４抗体、抗リアノジン受容体抗体、抗ジヒドロピリジン受容体抗体および抗ｋｖ１．４抗体などの複数の抗体を単一の試料から同時に高感度に検出することができる。また、本発明者らが開発した手法により、複数の試料に含まれる抗体の検出を同時に行うことが可能となる。以下に、本発明を詳細に説明する。

【0021】

多発性硬化症（ＭＳ）
多発性硬化症（multiple sclerosis：ＭＳ）は、上述のとおり、オリゴデンドロサイトによって髄鞘が形成される脳・脊髄・視神経などの中枢神経系に生じる慢性炎症性脱髄疾患であり、時間的・空間的に病変が多発するのが特徴である。ここで、脱髄とは髄鞘が後天的に破壊される形態変化を指す。通常、詳細な病歴聴取や経時的な神経学的診察により時間的・空間的な病変の多発性を証明し、他の疾患を十分に除外することで診断を確定させる必要がある。このため、厚生労働省によるＭＳの指定難病診断基準と、その基盤となるMcDonald診断基準（２０１０年版）では、鑑別診断を行うことの重要性が説かれている。ＭＳとの鑑別診断が必要な疾患は、視神経脊髄炎（neuromyelitis optica：ＮＭＯ）、急性散在性脳脊髄炎、頸椎症性脊髄症、脊髄空洞症、脊髄小脳変性症、神経ベーチェット病、神経サルコイドーシス、ミトコンドリア脳筋症、進行性多巣性白質脳症などが挙げられる。視神経脊髄炎を鑑別するためには、視神経脊髄炎に特異的なＩｇＧ（抗ＡＱＰ４抗体［ＮＭＯ−ＩｇＧとしても知られる］）を測定する血液検査が必須である。

【0022】

視神経脊髄炎スペクトラム疾患（ＮＭＯＳＤ）
視神経脊髄炎（neuromyelitis optica：ＮＭＯ）は、重度の視神経炎と横断性脊髄炎を特徴とする炎症性中枢神経疾患である。最近までＮＭＯは多発性硬化症（ＭＳ）との関連が議論されてきたが、２００４年にＮＭＯに特異なＩｇＧ（ＮＭＯ−ＩｇＧ）が発見され、さらにアストロサイトの足突起に高密度に発現する水チャネルタンパク質であるアクアポリン−４（ＡＱＰ４）がその標的抗原であることが報告された。

【0023】

アクアポリン（ＡＱＰ）は細胞膜に存在する水チャネルであり、ＭＩＰ（major intrinsic proteins）ファミリーに属する膜内在タンパク質の一種である。アクアポリンはファミリーを形成しており、そのファミリーは２つのサブファミリー、アクアポリンとアクアグリセロポリンに大別される。アクアポリンサブファミリーは水分子のみを選択的に透過する水チャネルから構成される。これに対し、アクアグリセロポリンサブファミリーに属する水チャネルは、水分子の他にグリセロールや尿素等の水溶性小分子を通す性質を持っている。現在、哺乳類ではＡＱＰ０からＡＱＰ１２までの１３種類のアイソフォームが同定されている。

【0024】

ＡＱＰ４はアクアポリンサブファミリーに属する水チャネルである。ホモ四量体を形成して機能しており、脳に優勢的に発現している。脳の中でも特に、血管を取り巻くアストロサイトの足突起や、視床下部のラメラ構造状のグリア細胞、上衣細胞などに顕著に発現していることが明らかとなっている。また、ＡＱＰ４はアストロサイトのマーカータンパク質の一つである。ヒトと齧歯類ではＡＱＰ４のアミノ酸配列はほんの僅かに異なっている。ＡＱＰ４には２種類のアイソフォーム、ＡＱＰ４Ｍ１とＡＱＰ４Ｍ２３が存在する。ＡＱＰ４Ｍ２３は結晶性アレイと呼ばれる格子状のアレイ構造を形成することができるが、ＡＱＰ４Ｍ１は結晶性アレイを形成することができず、脳内の結晶性アレイのサイズはこの２種類のアイソフォームの発現比率によって制御されている。

【0025】

ＮＭＯはアストロサイトが主に破壊される疾患である点が、ＭＳとの大きな相違点である。血液脳関門のアストロサイトの足突起に豊富に存在しているＡＱＰ４に対する循環自己抗体が、補体や細胞を介してアストロサイトの傷害とそれに引き続く神経の炎症や脱髄を引き起こす。ＮＭＯは、ＭＳのようなオリゴデンドロサイトを中心とした中枢神経の炎症性脱髄疾患とは異なり、ＡＱＰ４を標的抗原とした自己免疫性アストロサイトパチーというべきものと考えられる。

【0026】

典型的なＮＭＯの診断基準としては、２００６年に発表されたWingerchukらの基準が広く用いられてきた。
（１）視神経炎
（２）急性脊髄炎、および
（３）以下の３項目のうち２項目以上を満たすこと
− ３椎体以上の連続性の脊髄病変
− Ｐａｔｙの脳ＭＲＩ基準を満たさない
− ＮＭＯ−ＩｇＧ（抗ＡＱＰ４抗体）陽性

【0027】

その後、典型的なＮＭＯに加えて、視神経炎（再発性あるいは両眼性）や３椎体以上の長い脊髄炎のみの症例も、視神経脊髄炎スペクトラム疾患（NMO spectrum disorders：ＮＭＯＳＤ）として、同じ範疇の疾患として捉えられるようになったが、ＮＭＯおよびＮＭＯＳＤの基準のいずれも満たさないものの、血清抗ＡＱＰ４抗体が陽性である病態も存在し、その治療反応性はＮＭＯ／ＮＭＯＳＤと同等であることが指摘され、近年では抗ＡＱＰ４抗体が陽性である病態を広義のＮＭＯＳＤと捉えることが一般的となっている。

【0028】

いずれにせよ、抗ＡＱＰ４抗体検査が、典型的なＮＭＯを含むＮＭＯＳＤの診断と治療方針の決定において極めて重要な検査であることに変わりはない。血清中の抗ＡＱＰ４抗体の有無を調べることによりＭＳとの鑑別診断を行うことができる。ＭＳとＮＭＯ／ＮＭＯＳＤの鑑別診断が重要であるのは、その治療方法が異なるためである。ＭＳの病態修飾薬のいくつかはＮＭＯ／ＮＭＯＳＤを増悪させる可能性が指摘されており、他方、一般にＭＳでは効果に乏しい免疫抑制剤がＮＭＯ／ＮＭＯＳＤでは有効となることが多い。

【0029】

抗ＭＯＧ抗体関連疾患／ＭＯＧ抗体疾患
上述のとおり、抗ＭＯＧ抗体関連疾患／ＭＯＧ抗体疾患は、ＭＳならびに抗ＡＱＰ４抗体陽性ＮＭＯ／ＮＭＯＳＤと異なる疾患群であることが報告されている。ＭＯＧ（ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質）はミエリン鞘を構成する成分の一つであり、抗ＭＯＧ抗体はこのＭＯＧを認識する自己抗体である。

【0030】

ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）は、中枢神経系の神経の髄鞘形成において重要であると考えられる糖タンパク質であり、ヒトでは、このタンパク質はＭＯＧ遺伝子によってコードされている。ＭＯＧの主要な分子機能はまだ分かっていないが、ミエリン鞘の構造形成に必要な「接着分子」として働いていると推測されている。ヒトのＭＯＧのｃＤＮＡコード領域は、ラット、マウスおよびウシに対する相同性が高く、高度に保存されていることが示されている。ヒトＭＯＧ遺伝子のｍＲＮＡには、選択的スプライシングにより、少なくとも９個のアイソフォームが存在している。

【0031】

抗ＭＯＧ抗体関連疾患／ＭＯＧ抗体疾患の臨床所見は、ＭＳおよび抗ＡＱＰ４抗体陽性ＮＭＯ／ＮＭＯＳＤのいずれとも異なる場合と酷似している場合があるため、臨床所見だけでの判断が難しいことも多い。しかし、抗ＭＯＧ抗体関連疾患／ＭＯＧ抗体疾患は、抗ＡＱＰ４抗体陽性ＮＭＯ／ＮＭＯＳＤと比較すると、視神経炎が多い、両眼同時の視神経炎が多い、若い患者が多い、男性が多い、下部脊髄炎が多い、単相性で再発が無い例が多い、軽症例が多くステロイドで改善が良好であることが多いなどの傾向があることが分かってきている。またＭＳと比較しても臨床所見が酷似している場合もあるため、抗ＭＯＧ抗体検査も、ＭＳとの鑑別診断を行う上で極めて重要な検査となりうる。脱髄性疾患患者の臨床所見から疾患がＭＳであると考え、ＭＳに対して効果のあるフィンゴリモドを投与したが効果が無く、血清中の抗ＭＯＧ抗体を調べることで抗ＭＯＧ抗体関連疾患／ＭＯＧ抗体疾患である（フィンゴリモドは抗ＭＯＧ抗体関連疾患／ＭＯＧ抗体疾患には効果がなく、神経症状を憎悪させる可能性がある）と判明した臨床例もあることから、脱髄性疾患患者診断における抗ＭＯＧ抗体検査は、極めて重要な検査となりうる。脱髄性疾患患者に対する多発性硬化症の診断においては、視神経脊髄炎関連疾患や抗ＭＯＧ抗体関連疾患／ＭＯＧ抗体疾患などを鑑別する必要があるため、抗体検査を実施することが推奨されている。

【0032】

その他の抗体
ＭＳの鑑別診断を行う上では、上記の抗ＡＱＰ４抗体と抗ＭＯＧ抗体に加えて、抗核抗体、リウマチ因子、甲状腺関連自己抗体（抗ＴＳＨ受容体抗体、抗サイログロブリン抗体、抗ぺルオキシダーゼ抗体）、抗ＳＳ−Ａ抗体、抗ＳＳ−Ｂ抗体、抗アセチルコリン受容体抗体などを検出することも有用となりうる。また、自己免疫性脳炎の診断を行う上で、抗ＮＭＤＡ抗体、抗ＬＧＩ１抗体、抗ＣＡＳＰＲ２抗体、抗ＡＭＰＡ受容体抗体、抗グリシン受容体抗体、抗ＧＡＢＡ_Ｂ受容体抗体などを検出することも有用となりうる。また、重症筋無力症の診断を行う上で、抗ニコチン性アセチルコリン受容体抗体、抗筋特異的受容体型チロシンキナーゼ抗体、抗ＬＤＬ受容体関連タンパク質４抗体、抗リアノジン受容体抗体、抗ジヒドロピリジン受容体抗体、抗ｋｖ１．４抗体などを検出することも有用となりうる。

【0033】

抗体検出方法
生物学的試料中における抗体の検出には、様々な免疫学的検査法が用いられうる。代表的な例としては、免疫組織化学、抗原タンパク質を発現させたヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３細胞あるいはその他の細胞を基質とした免疫細胞化学あるいはフローサイトメトリー、単離した抗原タンパク質あるいは細胞・組織抽出液を基質とした放射性免疫沈降法あるいは蛍光免疫沈降法、ウエスタンブロッティング、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などが挙げられる。

【0034】

抗ＡＱＰ４抗体を検出するにあたって最も感度の高い測定方法は、ＡＱＰ４を細胞に発現させ被検者血清と反応させるＣＢＡ（cell-based assay）法であり、この細胞をスライドガラス上に固定して行う間接免疫蛍光法（非特異的結合が問題になる）、組換えＡＱＰ４を用いたＥＬＩＳＡ法、マウス脳組織切片を用いた間接免疫蛍光法などはＣＢＡ法に比べると感度が低い。また、ＣＢＡ法以外のこれらの測定方法では偽陰性例や偽陽性例が生じることがあるため、ＣＢＡ法での測定が推奨されている。

【0035】

感度の高い抗ＡＱＰ４抗体検査法としては、例えば、ヒトＡＱＰ４Ｍ２３を細胞に発現させて被検者血清と反応させ、被検者ＩｇＧがＡＱＰ４の細胞外領域に結合していることを間接蛍光抗体法やフローサイトメトリーによって確認するＣＢＡ（cell-based assay）法が挙げられる。本発明者らは、本願において詳細に述べているように、フローサイトメトリーを用いたＣＢＡ法により非常に高感度かつ定量性のあるデータを得ることができる検査方法を実現することに成功した。

【0036】

ＣＢＡ（cell-based assay）法
ＣＢＡ法による試料に含まれる抗体の検出方法とは、任意の細胞に目的の抗原タンパク質の遺伝子を導入後、試料と反応させ、目的の抗体を認識する標識二次抗体を用いて標識シグナルを検出する方法を指す。

【0037】

ＣＢＡ法に使用する細胞には、例えば、チャイニーズハムスター卵巣由来のＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いることができるが、これに限定はされない。例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｌ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＰＣ１２細胞、Ｓｆ９細胞などを利用してもよい。また、これらの細胞に任意のタンパク質を安定発現させた細胞株（例えばＣＨＯ−ＩＣＡＭ−１細胞）を利用してもよい。また、株化された培養細胞で、目的の抗原タンパク質を内在的に発現している細胞を使用することもできる。例えば、目的の抗原タンパク質がＡＱＰ４の場合、Ｈ４細胞やＵ−８７ＭＧ細胞などを利用してもよい。また、組織から採取した細胞で、目的の抗原タンパク質（例えばＡＱＰ４やＭＯＧ）を発現している細胞を使用することもできる。例えば、脳のグリア細胞の一種であるアストロサイトにはＡＱＰ４が高発現していることが知られている。ヒトＡＱＰ４とラットＡＱＰ４、あるいはヒトＡＱＰ４とマウスＡＱＰ４の配列は殆どが同じであるため、脳から単離したヒトアストロサイトやラットアストロサイト、マウスアストロサイトを用いて測定することも可能である。ＡＱＰ４を発現している器官として、脳の他に胃、腎臓、筋肉なども挙げられる。また、脳のグリア細胞の一種であるオリゴデンドロサイトにＭＯＧが発現していることがわかっている。ヒトＭＯＧ、ラットＭＯＧ、マウスＭＯＧは配列が殆ど同じであるため、これらの脳組織由来のオリゴデンドロサイトも測定に用いることができる。ＣＢＡ法に使用する細胞は、Hoechst 33342などを用いて蛍光標識しておいてもよい。Hoechst 33342などを用いて蛍光標識する際には、染色の度合いを調整することで、区別可能な複数種の細胞を調製することができる。例えば、Hoechst 33342で処理をしていない細胞、Hoechst 33342を最終濃度０．１μｇ／ｍＬとなるように加えて３７℃で２０分間インキュベートした細胞、そして最終濃度５μｇ／ｍＬとなるように加えて３７℃で２０分間インキュベートした細胞を用意することにより、Hoechst 33342の蛍光強度で区別可能な３種類の細胞を用意することができる。インキュベートの際に加える最終濃度や反応時間などを調整することにより、条件を細分化し、区別可能な細胞の種類を増やすことも可能である。このような細胞の染色に使用される蛍光色素はHoechst 33342に限定はされない。また、複数の蛍光色素を併用してもよく、染色の対象は、核、細胞膜、細胞質、細胞小器官、脂質、および糖鎖などを含む、細胞を構成する任意の構造単位であってもよい。また、使用する細胞の細胞膜に恒常的に発現しているタンパク質に対する抗体を使用して蛍光標識してもよい。ＣＢＡ法に使用する細胞には、目的の抗原タンパク質、例えば、ＡＱＰ４とＭＯＧのうち、いずれか一つを導入することができる。場合によっては、ＣＢＡ法に使用する細胞には、ＡＱＰ４とＭＯＧの両方を導入してもよい。抗原タンパク質を導入していない細胞は、ネガティブコントロールとして使用することができる。ＣＢＡ法に使用する細胞には、ＡＱＰ４とＭＯＧ以外の他の抗原タンパク質が導入されていてもよく、また複数種類の細胞（例えばＣＨＯ−Ｋ１細胞とＨＥＫ２９３細胞）を併用してもよい。

【0038】

ＣＢＡ法に使用する細胞には、１回膜貫通型タンパク質、２回膜貫通型タンパク質、３回膜貫通型タンパク質、４回膜貫通型タンパク質、５回膜貫通型タンパク質、６回膜貫通型タンパク質、７回膜貫通型タンパク質、８回膜貫通型タンパク質、９回膜貫通型タンパク質、１０回膜貫通型タンパク質、１１回膜貫通型タンパク質、１２回膜貫通型タンパク質、１３回膜貫通型タンパク質、１４回膜貫通型タンパク質、１５回膜貫通型タンパク質、１６回膜貫通型タンパク質、１７回膜貫通型タンパク質、１８回膜貫通型タンパク質、１９回膜貫通型タンパク質、２０回膜貫通型タンパク質、２１回膜貫通型タンパク質、２２回膜貫通型タンパク質、２３回膜貫通型タンパク質、２４回膜貫通型タンパク質、２５回膜貫通型タンパク質、２６回膜貫通型タンパク質、２７回膜貫通型タンパク質、２８回膜貫通型タンパク質、２９回膜貫通型タンパク質、または３０回膜貫通型タンパク質などを含む、細胞膜に存在するタンパク質を抗原タンパク質として導入することができる。よって、本発明に係る方法の実施態様には、試料中に含まれる、１回膜貫通型タンパク質、２回膜貫通型タンパク質、３回膜貫通型タンパク質、４回膜貫通型タンパク質、５回膜貫通型タンパク質、６回膜貫通型タンパク質、７回膜貫通型タンパク質、８回膜貫通型タンパク質、９回膜貫通型タンパク質、１０回膜貫通型タンパク質、１１回膜貫通型タンパク質、１２回膜貫通型タンパク質、１３回膜貫通型タンパク質、１４回膜貫通型タンパク質、１５回膜貫通型タンパク質、１６回膜貫通型タンパク質、１７回膜貫通型タンパク質、１８回膜貫通型タンパク質、１９回膜貫通型タンパク質、２０回膜貫通型タンパク質、２１回膜貫通型タンパク質、２２回膜貫通型タンパク質、２３回膜貫通型タンパク質、２４回膜貫通型タンパク質、２５回膜貫通型タンパク質、２６回膜貫通型タンパク質、２７回膜貫通型タンパク質、２８回膜貫通型タンパク質、２９回膜貫通型タンパク質、３０回膜貫通型タンパク質などを含む、細胞膜に存在するタンパク質を認識する個々の抗体（例えば自己抗体）を独立に検出する方法であって、単一試料におけるこれらの任意の複数の抗体（例えば１２種類の抗体）の有無を同時測定によって解析を行うことができる方法が包含される。

【0039】

上記の細胞膜に存在するタンパク質には、Ｇタンパク質共役型受容体、イオンチャネル型受容体、電位依存性イオンチャネル、機械刺激感受性チャネル、一過性受容器電位チャネル、陽イオンチャネル、陰イオンチャネル、サイトカイン受容体、増殖因子受容体、酵素共役型受容体、ＡＰＣスーパーファミリー、ＡＢＣ輸送体スーパーファミリー、単純拡散型輸送体、受動輸送型輸送体、能動輸送型輸送体、リン脂質輸送体、ＡＴＰ駆動型ポンプ、ＡＴＰ合成酵素、免疫グロブリンスーパーファミリー、細胞接着分子、ＣＤ抗原、脂質アンカー型タンパク質、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型タンパク質、水チャネル、糖タンパク質、低密度リポタンパク質受容体、スカベンジャー受容体、ギャップ結合チャネル、Ｆｃ受容体、Toll様受容体、細胞死受容体、トランスフェリン受容体、トランスロカーゼ、電位依存性ホスファターゼ、小胞輸送タンパク質、核膜孔複合体、内在性膜タンパク質、表在性膜タンパク質などが含まれる。測定に使用する任意の細胞に対して発現させるタンパク質は上記のいずれかのファミリーに属する任意のタイプであってよく（例えば水チャネルの場合はＡＱＰ１でもよいし、ＡＱＰ４でもよいし、ＡＱＰ１０でもよい）、目的の膜タンパク質に２種類以上のアイソフォームが存在する場合、任意のタイプを選択することができ（例えばＡＱＰ４の場合、ＡＱＰ４Ｍ１でもＡＱＰ４Ｍ２３でもよい）、目的の膜タンパク質が多量体で構成される際は任意のサブユニットをホモならびにヘテロで選択することができる（例えばグリシン受容体の場合、α１サブユニットのホモ５量体でもよく、α３サブユニットのホモ５量体でもよく、α１サブユニットとβサブユニットのヘテロ５量体でもよい）。

【0040】

具体的な同時測定の一例として、単一試料中に、抗ＮＭＤＡ受容体抗体、抗ＬＧＩ１抗体、抗ＣＡＳＰＲ２抗体、抗ＡＭＰＡ受容体抗体、抗グリシン受容体抗体、抗ＧＡＢＡ_Ｂ受容体抗体が含まれているかどうかを同時測定によって解析することができる。この測定は被検者が、自己免疫性脳炎、モルヴァン症候群、アイザックス症候群、小脳失調、錐体外路症状、ミオクローヌス、神経性筋強直、末梢神経障害、自律神経障害、てんかん、認知症などの臨床型・神経症候を呈する際に適用することができる。

【0041】

抗ＮＭＤＡ受容体抗体が認識するＮＭＤＡ受容体、抗ＡＭＰＡ受容体抗体が認識するＡＭＰＡ受容体、抗グリシン受容体抗体が認識するグリシン受容体は上記のイオンチャネル型受容体に分類される。抗ＬＧＩ１抗体が認識するＬＧＩ１（leucine-rich glioma-inactivated protein-1 ）、抗ＣＡＳＰＲ２抗体が認識するＣＡＳＰＲ２（contactin-associated protein-2 ）は電位依存性カリウムチャネル（voltage-gated potassium channel：ＶＧＫＣ）と細胞膜上で複合体を形成している。抗ＧＡＢＡ_Ｂ受容体抗体が認識するＧＡＢＡ_Ｂ受容体 は上記のＧタンパク質共役型受容体に分類される。

【0042】

また別の一例として、単一試料中に、抗ニコチン性アセチルコリン受容体抗体、抗筋特異的受容体型チロシンキナーゼ抗体、抗ＬＤＬ受容体関連タンパク質４抗体、抗リアノジン受容体抗体、抗ジヒドロピリジン受容体抗体、抗ｋｖ１．４抗体が含まれているかどうかを同時測定によって解析することができる。この測定は被検者が、重症筋無力症の症候を呈する際に適応することができる。

【0043】

抗ニコチン性アセチルコリン受容体抗体が認識するニコチン性アセチルコリン受容体、抗リアノジン受容体抗体が認識するリアノジン受容体は、上記のイオンチャネル型受容体に分類される。抗筋特異的受容体型チロシンキナーゼ抗体が認識する筋特異的受容体型チロシンキナーゼは、上記のサイトカイン受容体に分類される。抗ＬＤＬ受容体関連タンパク質４抗体が認識するＬＤＬ受容体関連タンパク質４は、上記の低比重リポタンパク質受容体に分類される。抗ジヒドロピリジン受容体抗体が認識するジヒドロピリジン受容体は、Ｌ型Ｃａ^２＋チャネルであり、上記の電位依存性イオンチャネルに分類される。抗ｋｖ１．４抗体が認識するｋｖ１．４は、上記の電位依存性イオンチャネルに分類される。

【0044】

さらにまた別の一例として、単一検体に、抗ＡＱＰ４抗体ならびに抗ＭＯＧ抗体が含まれているかどうかを同時測定によって解析することができる。この測定は被検者が、視神経炎、視覚障害、脊髄炎、脳脊髄炎、脳幹脳炎などの臨床型・神経症候を呈する際に適応することができる。抗ＡＱＰ４抗体が認識するＡＱＰ４は上記の水チャネルに分類される。抗ＭＯＧ抗体が認識するＭＯＧは上記の糖タンパク質に分類される。

【0045】

したがって、本発明に係るいくつかの態様は、上記のタンパク質に対する抗体の検出または測定の結果を指標とする、上記の疾患の診断方法に関する。また、本発明に係るいくつかの態様は、そのような診断結果に基づき、治療様式を決定することを含む、疾患の治療方法にも関する。

【0046】

抗原タンパク質の遺伝子導入には、例えば、pEGFP-N3などの発現ベクターを用いることができるが、これに限定はされない。細胞へのトランスフェクションに利用可能なベクターは、当業者には様々なものが知られている。また、ベクターをトランスフェクトする際には、Lipofectamine 3000などのトランスフェクション試薬を用いることができる。様々なトランスフェクション試薬（例えば、FuGENE HDなど）が当業者には公知である。ベクターに組み込むＡＱＰ４遺伝子（例えば、ＡＱＰ４Ｍ２３遺伝子）やＭＯＧ遺伝子などの配列は、当業者であればGenBankなどのデータベースから容易に入手できる。抗原タンパク質の細胞への遺伝子導入の際には、例えば、ウイルスベクター、プラスミド、リポソーム、ゲノム編集などの技術を利用してもよい。導入する抗原タンパク質は、必ずしも全長を含むものでなくともよく、断片であってもよい。また、導入する抗原タンパク質は、欠失、挿入、置換などの変異を含むものであってもよく、また、複数の任意の抗原タンパク質を組み合わせたキメラタンパク質であってもよい。さらに、導入する抗原タンパク質には、ＥＧＦＰなどの蛍光タンパク質を融合させておくことができる。種々の蛍光タンパク質（例えば、Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed、mRasberry、mPlum、PS-CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、KikumeGRなど）が当業者には公知であり、利用可能である。蛍光タンパク質は、好ましくは、抗原タンパク質（例えば、ＡＱＰ４、ＭＯＧ）のＣ末端領域に融合させることができるが、これに限定はされない。pEGFP-N3を用いた場合には、抗原タンパク質のＣ末端にＥＧＦＰが融合される。蛍光タンパク質は、抗原タンパク質のＮ末端領域やループ部分などに融合するように設計してもよい。

【0047】

抗原タンパク質の遺伝子導入には、ＩＲＥＳ発現ベクターを用いてもよい。ＩＲＥＳ（Internal Ribosome Entry Site：配列内リボソーム進入部位）は、タンパク質合成のプロセスの一部として、キャップ非依存的な翻訳の開始を可能とするＲＮＡ配列要素である。ＩＲＥＳ含有バイシストロン性ベクターは、２つのタンパク質を同じＲＮＡ転写物から個別に同時発現させることを可能とする。ＩＲＥＳ発現ベクターを用いて抗原タンパク質と蛍光タンパク質とを発現させた場合、蛍光タンパク質の検出される細胞では、ほぼ１００％目的の抗原タンパク質も発現している。市販のＩＲＥＳ発現ベクターとしては、例えば、クロンテック社のLiving Colors pIRES2 Vectorなどがある。本発明の方法においては、pEGFP-N3等の蛍光タンパク質融合発現ベクターとＩＲＥＳ発現ベクターとを組み合わせて用いることもできる。

【0048】

抗原タンパク質の発現は、一過性発現であってもよく、また安定発現であってもよい。抗原タンパク質を発現するように改変した細胞と、被検者由来の試料とを反応させる際には、例えば、１０^５ｃｅｌｌｓ／１００μＬの細胞懸濁液に対して１０μＬの被検者血清を加え、４℃で１５分間のインキュベートを行う。細胞の量、試料の量、温度、時間は、当業者であれば必要に応じて適宜調整することができる。本発明の方法によれば、複数アッセイの同時処理が可能であるため、サンプルの作製や測定に必要とされる時間や試料の量は従来のＣＢＡ法に比べて大幅に削減される。被検者由来の試料としては、血清のほかに、全血、血漿、脳脊髄液、涙、唾液、尿なども利用されうる。被検者は、哺乳動物、特にヒト、例えば、脱髄性疾患の症状を呈しているヒトである。

【0049】

二次抗体は、被検者由来の試料中に含まれる自己抗体を認識する。二次抗体の標識としては、例えば、蛍光標識を用いることができる。二次抗体は、典型的には抗ヒトＩｇＧ抗体であるが、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗ヒトＩｇＡ抗体、抗ヒトＩｇＥ抗体、抗ヒトＩｇＤ抗体なども使用されうる。二次抗体として有用な蛍光色素で標識された抗ヒトＩｇＧ抗体は、多くの製品が市販されており、容易に入手できる。蛍光標識された細胞試料は、フローサイトメーターを用いて検出することができる。蛍光標識は例えば、Alexa Fluor 647でありうるが、これに限定はされない。

【0050】

本発明の方法において、蛍光標識は例えば、AcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択されるものが使用されうる。本発明においては、単一のレーザーにより励起される複数の蛍光標識（例えば、ＥＧＦＰとPE-Cy7）を組み合わせて使用してもよい。

【0051】

フローサイトメトリー
フローサイトメトリー解析は、ＣＢＡ法によって被検者由来試料および二次抗体と反応させた細胞に対して、例えば、ベクトン・ディッキンソン社製FACSAriaIIを用いて行うことができる。本発明の方法によれば、例えば３種類の波長のレーザー（例えば、４８８ｎｍ青レーザー、６４０ｎｍ赤レーザー、３５５ｎｍＵＶレーザー）を用いて２種類以上の抗体を分析することができ、また、４種類の波長のレーザー（例えば、青、赤、黄、およびＵＶ）を用いて４種類以上（例えば、１２種類、１８種類、２４種類）の抗体を分析することができる。例えば、ＥＧＦＰとPE-Cy7は青レーザーにより、Alexa Fluor 647は赤レーザーにより、mCherryは黄レーザーにより、Hoechest 33342はＵＶレーザーにより、それぞれ励起される。使用するレーザーは、例えば、ＵＶレーザーの代わりに紫レーザーを、黄レーザーの代わりに黄緑レーザーを選択してもよい。また、使用するレーザーの組み合わせは任意でよい。測定したフローサイトメトリーデータの解析には、例えば、ＦｌｏｗＪｏを使用することができる。フローサイトメトリーデータの解析により、被検者由来試料中の抗体を検出および／または測定することができる。

【0052】

検出および測定
本発明の方法によれば、被検者に由来する試料中における複数の抗体、例えば、２種類、４種類、６種類、８種類、１２種類、１６種類、１８種類、２４種類、またはそれ以上の種類の抗体を同時に検出または測定する方法が提供される。また、本発明の方法によれば、１以上の被検者に由来する複数の試料中、例えば、２種類、４種類、６種類、８種類、１２種類、１６種類、１８種類、２４種類、またはそれ以上の試料中における抗体を同時に検出または測定する方法が提供される。フローサイトメーターを用いることで、複数種の抗体の検出および／または測定、あるいは複数の試料中における抗体の検出および／または測定を簡便かつ精確に同時に行うことができる。

【0053】

（１２種類の抗体の同時検出）
本発明の一つの態様としては、被検者に由来する試料中における１２種類の抗体を同時に検出または測定する方法が提供される。フローサイトメーターを用いることで、１２種類の抗体の検出および／または測定を簡便かつ精確に同時に行うことができる。一つの態様において、本方法は、第１の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第２の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第３の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第４の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第５の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第６の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第７の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第８の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第９の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第１０の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第１１の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第１２の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、該第１から第１２の抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含む。さらに、細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を行うことができる。

【0054】

いくつかの態様において、本発明の方法では、第１から第１２の抗原タンパク質は蛍光タンパク質と融合していてもよい。抗原タンパク質と融合した蛍光タンパク質はそれぞれ同一または異なるものでありうる。例えば、第１から第６の抗原タンパク質が第１の蛍光タンパク質と融合しており、第７から第１２の抗原タンパク質が第２の蛍光タンパク質と融合している場合、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であってもよい。

【0055】

いくつかの態様において、本発明の方法では、第１から第１２の抗原タンパク質はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳されてもよい。抗原タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳される蛍光タンパク質はそれぞれ同一または異なるものでありうる。例えば、第１から第６の抗原タンパク質がそれぞれＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第１の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第７から第１２の抗原タンパク質がそれぞれＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第２の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳される場合、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であってもよい。いくつかの態様において、本発明の方法では、例えば、第４から第６の抗原タンパク質を発現する細胞および第１０から第１２の抗原タンパク質を発現する細胞は、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質で標識されていてもよい。また、例えば、第４から第６の抗原タンパク質を発現する細胞および第１０から第１２の抗原タンパク質を発現する細胞は、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されていてもよい。蛍光色素／蛍光タンパク質としては、例えば、AcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、7-AADなどを使用することができる。

【0056】

いくつかの態様において、本発明の方法では、例えば、第２、第５、第８および第１１の抗原タンパク質を発現する細胞は、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質で弱く標識されており、第３、第６、第９および第１２の抗原タンパク質を発現する細胞が第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質で強く標識されていてもよい。ここで、弱く標識された細胞と強く標識された細胞とは、例えばフローサイトメーター上で区別可能である。蛍光色素／蛍光タンパク質としては、例えば、AcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、7-AADなどを使用することができる。

【0057】

なお、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質と同様に、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質によって細胞を３段階（陰性、弱陽性、強陽性）に標識することにより、１８種類の細胞を調製し、１８種類の抗体について同時に評価することも可能である。また、４段階の標識と組み合わせることにより、１６種類、２４種類、３２種類の抗体の同時評価も可能となる。

【0058】

さらに、細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を行うことができる。よって、本発明の態様の一つには、被検者に由来する試料中における第１から第１２の抗体を同時に検出または測定する方法であって、第１の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第２の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第３の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第４の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第５の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第６の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第７の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第８の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第９の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第１０の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第１１の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第１２の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、該第１から第１２の抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程、ならびに該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含み、ここで、第１から第１２の抗原タンパク質のそれぞれは蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第１から第６の抗原タンパク質はそれぞれ第１の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第１の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第７から第１２の抗原タンパク質はそれぞれ第２の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第２の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であり、第４から第６の抗原タンパク質を発現する細胞および第１０から第１２の抗原タンパク質を発現する細胞は、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質で標識されているか又は第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されており、そして第２、第５、第８および第１１の抗原タンパク質を発現する細胞は第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質で弱く標識されており、第３、第６、第９および第１２の抗原タンパク質を発現する細胞は第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質で強く標識されており、弱く標識された細胞と強く標識された細胞とが区別可能である、方法が含まれる。なお、上記二次抗体は、例えば、AcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、7-AADなどで標識されていてもよい。

【0059】

いくつかの態様において、被検者に由来する試料は血清、血漿、全血、脳脊髄液、涙、唾液、および尿から選択されてもよい。上記第１から第１２の抗原タンパク質は、それぞれ異なるタンパク質であってよく、ＡＱＰ４、ＭＯＧ、ＮＭＤＡ受容体、ＬＧＩ１、ＣＡＳＰＲ２、ＡＭＰＡ受容体、グリシン受容体、ＧＡＢＡ_Ｂ受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、ＬＤＬ受容体関連タンパク質４、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびｋｖ１．４から選択されるタンパク質が含まれていてもよい。

【0060】

上記第１の蛍光タンパク質はＥＧＦＰであってもよい。上記第２の蛍光タンパク質はmCherryであってもよい。上記第１の蛍光色素は、ＥＧＦＰと同じ波長のレーザーで励起することが可能なPE-Cy7であってもよい。上記第２の蛍光色素はHoechst 33342であってもよい。上記二次抗体はAlexa Fluor 647で標識されていてもよい。

【0061】

第１の蛍光タンパク質と第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質は、同じ波長のレーザーで励起されるものを使用することができる。同様に、第２の蛍光タンパク質と第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質は、同じ波長のレーザーで励起されるものを使用することもできる。本発明において使用される他の蛍光標識についても同様に、単一のレーザーにより複数の標識が励起されるものを組み合わせて使用することができる。

【0062】

いくつかの態様においては、１２未満の種類の抗体の同時検出を行ってもよい。前記第１から第１２の抗原タンパク質を発現する細胞のうち、例えば、２〜１１種の細胞のみを調製して使用することもできる。

【0063】

また、いくつかの態様において、本発明の方法は、被検者に由来する試料中における複数の抗体を同時に検出または測定する方法であって、
第１から第１２の抗原タンパク質を発現する細胞であって、第１から第１２の抗原タンパク質のそれぞれは蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第１から第６の抗原タンパク質はそれぞれ第１の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第１の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第７から第１２の抗原タンパク質はそれぞれ第２の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第２の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であり、第４から第６の抗原タンパク質を発現する細胞および第１０から第１２の抗原タンパク質を発現する細胞は、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質で標識されているか又は第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されており、そして、第２、第５、第８および第１１の抗原タンパク質を発現する細胞は第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質で弱く標識されており、第３、第６、第９および第１２の抗原タンパク質を発現する細胞は第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質で強く標識されており、弱く標識された細胞と強く標識された細胞とが区別可能である細胞のうち、２以上を調製する工程、
該２以上の細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、
該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、
該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含む、方法に関する。これにより、例えば２〜１１種の抗体の検査を同時に行うことができる。

【0064】

また、このような２以上の細胞を含む細胞懸濁液を複数調製し、各々の細胞懸濁液に対して被検者に由来する試料が１種類加えられるように、複数の細胞懸濁液に複数の被検者に由来する試料を加えることにより、複数の試料中の複数の抗体を分析することができる。例えば、３例の被検者に由来する試料を４種類の抗体について、あるいは４例の被検者に由来する試料を３種類の抗体について、同時に検査することができる。

【0065】

（４種類の抗体の同時検出）
本発明の別の態様としては、被検者に由来する試料中における第１の抗体、第２の抗体、第３の抗体、および第４の抗体を同時に検出または測定する方法が提供される。フローサイトメーターを用いることで、４種類の抗体の検出および／または測定を簡便かつ精確に同時に行うことができる。一つの態様において、本方法は、第１の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第２の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第３の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第４の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、該第１から第４の抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含む。さらに、細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を行うことができる。なお、二次抗体は、例えば、AcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、7-AADなどで標識されていてもよい。

【0066】

いくつかの態様において、本発明の方法では、第１から第４の抗原タンパク質はぞれそれ蛍光タンパク質と融合していてもよい。抗原タンパク質と融合した蛍光タンパク質はそれぞれ同一または異なるものでありうる。例えば、第１および第２の抗原タンパク質が第１の蛍光タンパク質と融合しており、第３および第４の抗原タンパク質が第２の蛍光タンパク質と融合している場合、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であってもよい。いくつかの態様において、本発明の方法では、第１から第４の抗原タンパク質がＩＲＥＳ発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳されてもよい。抗原タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳される蛍光タンパク質はそれぞれ同一または異なるものでありうる。例えば、第１および第２の抗原タンパク質がそれぞれＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第１の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第３および第４の抗原タンパク質がそれぞれＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第２の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳される場合、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であってもよい。第２の抗原タンパク質を発現する細胞および第４の抗原タンパク質を発現する細胞は、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質で標識されていてもよい。また、第２の抗原タンパク質を発現する細胞および第４の抗原タンパク質を発現する細胞は、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されていてもよい。蛍光色素／蛍光タンパク質としては、例えば、AcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、7-AADなどを使用することができる。

【0067】

いくつかの態様においては、第１から第４の抗原タンパク質がそれぞれ第１の蛍光タンパク質と融合しているか又は第１から第４の抗原タンパク質がそれぞれＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第１の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第２の抗原タンパク質を発現する細胞が第１の蛍光色素もしくは第２の蛍光タンパク質で弱く標識されており、第３の抗原タンパク質を発現する細胞が第１の蛍光色素もしくは第２の蛍光タンパク質で強く標識されており、弱く標識された細胞と強く標識された細胞とが（例えばフローサイトメーターにより）区別可能であり、第４の抗原タンパク質を発現する細胞が第２の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質により（例えば、第２の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体により）標識されていてもよい。このように標識した細胞を用いることで、４種類の抗体を検出することも可能である。

【0068】

いくつかの態様において、被検者に由来する試料は血清、血漿、全血、脳脊髄液、涙、唾液、および尿から選択されてもよい。上記第１から第４の抗原タンパク質は、それぞれ例えばＡＱＰ４、ＭＯＧ、ＮＭＤＡ受容体、ＬＧＩ１、ＣＡＳＰＲ２、ＡＭＰＡ受容体、グリシン受容体、ＧＡＢＡ_Ｂ受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、ＬＤＬ受容体関連タンパク質４、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびｋｖ１．４から選択されうる。

【0069】

上記第１の蛍光タンパク質はＥＧＦＰであってもよい。上記第２の蛍光タンパク質はmCherryであってもよい。上記第１の蛍光色素はHoechst 33342であってもよい。上記二次抗体はAlexa Fluor 647で標識されていてもよい。

【0070】

いくつかの態様においては、４未満の種類の抗体の同時検出を行ってもよい。前記第１から第４の抗原タンパク質を発現する細胞のうち、例えば、３種の細胞のみを調製して使用することもできる。

【0071】

（２種類の抗体の同時検出）
本発明の別の態様としては、被検者に由来する試料中における第１の抗体および第２の抗体を同時に検出または測定する方法が含まれる。フローサイトメーターを用いることで、２種類の抗体の検出および／または測定を簡便かつ精確に同時に行うことができる。一つの態様において、本方法は、第１の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第２の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、該第１および第２の抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含む。さらに、細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を行うことができる。なお、二次抗体は、例えば、AcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、7-AADなどで標識されていてもよい。

【0072】

いくつかの態様において、第１および第２の抗原タンパク質は、ぞれそれ蛍光タンパク質と融合していてもよい。抗原タンパク質と融合した蛍光タンパク質はそれぞれ同一または異なるものでありうる。例えば、第１の抗原タンパク質が第１の蛍光タンパク質と融合しており、第２の抗原タンパク質が第２の蛍光タンパク質と融合している場合、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは同一の蛍光タンパク質であってもよい。いくつかの態様において、本発明の方法では、第１および第２の抗原タンパク質がＩＲＥＳ発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳されてもよい。抗原タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳される蛍光タンパク質はそれぞれ同一または異なるものでありうる。例えば、第１の抗原タンパク質がＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第１の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第２の抗原タンパク質がＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第２の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳される場合、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは同一の蛍光タンパク質であってもよい。また、第２の抗原タンパク質を発現する細胞は、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質で標識されていてもよい。また、第２の抗原タンパク質を発現する細胞は、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されていてもよい。蛍光色素／蛍光タンパク質としては、例えば、AcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、7-AADなどを使用することができる。

【0073】

第１の抗原タンパク質が第１の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第１の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第２の抗原タンパク質が第２の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第２の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳される場合、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であってもよい。

【0074】

いくつかの態様において、細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を行うことができる。被検者に由来する試料は、血清、血漿、全血、脳脊髄液、涙、唾液、および尿から選択されてもよい。第１および第２の抗原タンパク質は、それぞれ例えばＡＱＰ４、ＭＯＧ、ＮＭＤＡ受容体、ＬＧＩ１、ＣＡＳＰＲ２、ＡＭＰＡ受容体、グリシン受容体、ＧＡＢＡ_Ｂ受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、ＬＤＬ受容体関連タンパク質４、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびｋｖ１．４から選択されうる。

【0075】

上記第１の蛍光タンパク質はＥＧＦＰであってもよい。上記第２の蛍光タンパク質はmCherryであってもよい。上記第１の蛍光色素がHoechst 33342であってもよい。上記二次抗体はAlexa Fluor 647で標識されていてもよい。

【0076】

（４ｎ種類の抗体の同時検出）
本発明の別の態様としては、被検者に由来する試料中における第１から第４ｎの抗体を同時に検出または測定する方法が含まれる。ここでｎは１以上の整数であり、好ましくは１、２、３、４、５を含む１０以下の整数である。フローサイトメーターを用いることで、４ｎ種類の抗体の検出および／または測定を簡便かつ精確に同時に行うことができる。

【0077】

一つの態様において、本方法は、第１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、該第１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含む。さらに、細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を行うことができる。なお、二次抗体を標識する蛍光タンパク質および蛍光色素の性質は、本発明に係る他の態様に関して記載したものと同様である。

【0078】

いくつかの態様において、第１から第４ｎの抗原タンパク質のそれぞれは、蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳されてもよい。例えば、第１から第２ｎの抗原タンパク質は、それぞれ第１の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第１の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第２ｎ＋１から第４ｎの抗原タンパク質は、それぞれ第２の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第２の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であってもよい。第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞および第３ｎ＋１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞は、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質で標識されていてもよい。第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞および第３ｎ＋１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞は、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されていてもよい。第１から第４の蛍光タンパク質および第１から第２の蛍光色素の性質は、本発明に係る他の態様に関して記載したものと同様である。

【0079】

いくつかの態様において、第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞は、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞、第２ｎ＋１から第３ｎの抗原タンパク質を発現する細胞、第３ｎ＋１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞が、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞、第２ｎ＋１から第３ｎの抗原タンパク質を発現する細胞、第３ｎ＋１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞がそれぞれ区別可能である。例えば、蛍光色素で標識していない細胞、蛍光色素で弱く標識した細胞、蛍光色素で強く標識した細胞といった３段階の強度で標識した細胞を調製することができる。本発明の文脈において、ｎ段階の強度で細胞を標識することには、細胞を標識しないことも含まれる。

【0080】

いくつかの態様においては、４ｎ未満の種類の抗体の同時検出を行ってもよい。前記第１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞のうち、例えば、２〜４ｎ−１種の細胞のみを調製して使用することもできる。

【0081】

また、いくつかの態様において、本発明の方法は、被検者に由来する試料中における複数の抗体を同時に検出または測定する方法であって、
第１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞であって、第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞が、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質により非標識を含んでいてもよいｎ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞、第２ｎ＋１から第３ｎの抗原タンパク質を発現する細胞、第３ｎ＋１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞が、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質により非標識を含んでいてもよいｎ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞、第２ｎ＋１から第３ｎの抗原タンパク質を発現する細胞、第３ｎ＋１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞がそれぞれ区別可能であり、第１から第４ｎの抗原タンパク質のそれぞれが蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞および第３ｎ＋１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞が、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質で標識されているか又は第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されている細胞のうち、２以上を調製する工程、
該２以上の細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、
該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、
該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含む、方法に関する。これにより、例えば、２〜４ｎ−１種の抗体の検査を同時に行うことができる。

【0082】

また、このような２以上の細胞を含む細胞懸濁液を複数調製し、各々の細胞懸濁液に対して被検者に由来する試料が１種類加えられるように、複数の細胞懸濁液に複数の被検者に由来する試料を加えることにより、複数の試料中の複数の抗体を分析することができる。例えば、３例の被検者に由来する試料を４種類の抗体について、あるいは４例の被検者に由来する試料を３種類の抗体について、同時に検査することができる。

【0083】

（２ｍｎ種類の抗体の同時検出）
上述した４ｎ種類の抗体の同時検出において、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質による標識をｍ段階に分けることにより、２ｍｎ種類の抗体の同時検出を行うことができる。よって、本発明の別の態様としては、被検者に由来する試料中における２ｍｎ種類の抗体を同時に検出または測定する方法が含まれる。ここでｍおよびｎは１以上の整数であり、好ましくは１、２、３、４、５を含む１０以下の整数である。フローサイトメーターを用いることで、２ｍｎ種類の抗体の検出および／または測定を簡便かつ精確に同時に行うことができる。２ｍｎは例えば、２、４、６、８、１２、１６、１８、２４、３２などの値を取り得る。被検者に由来する試料としては、例えば、血清、血漿、全血、脳脊髄液、涙、唾液、尿などを使用することができる。検出対象の抗体が結合する抗原タンパク質としては、例えば、ＡＱＰ４、ＭＯＧ、ＮＭＤＡ受容体、ＬＧＩ１、ＣＡＳＰＲ２、ＡＭＰＡ受容体、グリシン受容体、ＧＡＢＡ_Ｂ受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、ＬＤＬ受容体関連タンパク質４、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、ｋｖ１．４などを使用することができる。

【0084】

一つの態様において、本方法は、第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、該第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含む。さらに、細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を行うことができる。なお、二次抗体を標識する蛍光タンパク質および蛍光色素の性質は、本発明に係る他の態様に関して記載したものと同様である。第１から第２ｍｎの抗原タンパク質は、それぞれ互いに異なるタンパク質でありうる。

【0085】

いくつかの態様において、第１から第２ｍｎの抗原タンパク質のそれぞれは、蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳される。また、いくつかの態様において、第１から第ｍｎの抗原タンパク質はそれぞれ第１の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第１の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第ｍｎ＋１から第２ｍｎの抗原タンパク質がそれぞれ第２の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第２の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である。

【0086】

いくつかの態様においては、第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞のうち、第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第１細胞グループとし、同様に、第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第２細胞グループ、第（ｍ−１）ｎ＋１から第ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第ｍ細胞グループ、第（２ｍ−１）ｎ＋１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第２ｍ細胞グループとして、第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞がｎ種類ずつ２ｍのグループに分けられ、第１細胞グループから第ｍ細胞グループが、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質によりｍ段階の強度でそれぞれ標識され、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能とされており、同様に、第ｍ＋１細胞グループから第２ｍ細胞グループは、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質によりｍ段階の強度でそれぞれ標識され、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能とされうる。第１細胞グループから第ｍ細胞グループは、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されて、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能とされ、同様に、第ｍ＋１細胞グループから第２ｍ細胞グループが、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されて、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能とされてもよい。

【0087】

いくつかの態様においては、上記の第１細胞グループに属する第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞は、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能とされ、同様に、第２細胞グループから第２ｍ細胞グループのそれぞれに属するｎ種類の細胞は、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の強度でそれぞれ標識されて、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能とされうる。

【0088】

別の言い方をすれば、いくつかの態様において、第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞は、まず、第１から第ｍｎの細胞からなるグループと、第ｍｎ＋１から第２ｍｎの細胞からなるグループとに分けられる。この２群の区別は、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質の判別によりなされうる。次に、第１から第ｍｎの細胞からなるグループは、ｎ個の細胞からなるｍ個の群に分けられる。これらｍ個の群は、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質により各群ごとにｍ段階の異なる強度でそれぞれ標識されることにより、それぞれ区別されうる。また、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の蛍光強度によりそれぞれ区別されるｍ個の群にそれぞれ含まれるｎ個の細胞は、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の異なる強度でそれぞれ標識されることにより、それぞれ区別されうる。同様に、第ｍｎ＋１から第２ｍｎの細胞からなるグループについても、ｎ個の細胞からなるｍ個の群に分けられる。これらｍ個の群は、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質により各群ごとにｍ段階の異なる強度でそれぞれ標識されることにより、それぞれ区別されうる。また、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の蛍光強度によりそれぞれ区別されるｍ個の群にそれぞれ含まれるｎ個の細胞は、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の異なる強度でそれぞれ標識されることにより、それぞれ区別されうる。このようにして、蛍光標識に基づきそれぞれ区別可能な２ｍｎ種類の細胞が調製されうる。よって、本発明の一つの態様は、蛍光標識に基づきそれぞれ区別可能な２ｍｎ種類の細胞の調製方法にも関する。

【0089】

上記のように、細胞の標識には抗体を用いてもよい。第１から第４の蛍光タンパク質および第１から第２の蛍光色素の性質は、本発明に係る他の態様に関して記載したものと同様である。なお、例えば、蛍光色素で標識していない細胞、蛍光色素で弱く標識した細胞、蛍光色素で強く標識した細胞といった３段階の強度で標識した細胞を調製することができる。本発明の文脈において、ｍ段階あるいはｎ段階の強度で細胞を標識することには、細胞を標識しないことも含まれる。

【0090】

例えば、ｍ＝３、ｎ＝３の場合、１８種類の細胞を調製し、１８種類の抗体を同時に評価することができる。ｍ＝４、ｎ＝３の場合、２４種類の細胞を調製し、２４種類の抗体を同時に評価することができる。

【0091】

本発明の一つの態様は、よって、被検者に由来する試料中における２ｍｎ種の抗体を同時に検出または測定する方法であって、
ｍは１以上の整数であり、
ｎは１以上の整数であり、
第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
該第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、
該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、
該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含み、
ここで、第１から第ｍｎの抗原タンパク質がそれぞれ第１の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第１の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第ｍｎ＋１から第２ｍｎの抗原タンパク質がそれぞれ第２の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第２の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であり、
第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第１細胞グループとし、同様に、第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第２細胞グループ、第（ｍ−１）ｎ＋１から第ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第ｍ細胞グループ、第（２ｍ−１）ｎ＋１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第２ｍ細胞グループとし、第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞がｎ種類ずつ２ｍのグループに分けられており、
第１細胞グループから第ｍ細胞グループが、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質または第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第ｍ＋１細胞グループから第２ｍ細胞グループが、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質または第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、
第１細胞グループに属する第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞が、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第２細胞グループから第２ｍ細胞グループのそれぞれに属するｎ種類の細胞が、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能である、方法に関する。

【0092】

いくつかの態様においては、２ｍｎ未満の種類の抗体の同時検出を行ってもよい。前記第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞のうち、例えば、２〜２ｍｎ−１種の細胞のみを調製して使用することもできる。よって、本発明のいくつかの態様は、被検者に由来する試料中における２ｍｎ以下の抗体を同時に検出または測定する方法に関する。

【0093】

また、いくつかの態様において、本発明の方法は、被検者に由来する試料中における複数の抗体を同時に検出または測定する方法であって、
第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞であって、第１から第ｍｎの抗原タンパク質はそれぞれ第１の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第１の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第ｍｎ＋１から第２ｍｎの抗原タンパク質はそれぞれ第２の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第２の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であり、
第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第１細胞グループとし、同様に、第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第２細胞グループ、第（ｍ−１）ｎ＋１から第ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第ｍ細胞グループ、第（２ｍ−１）ｎ＋１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第２ｍ細胞グループとし、第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞がｎ種類ずつ２ｍのグループに分けられており、
第１細胞グループから第ｍ細胞グループが、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されているか又は第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第ｍ＋１細胞グループから第２ｍ細胞グループが、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されているか又は第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、
第１細胞グループに属する第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞が、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第２細胞グループから第２ｍ細胞グループのそれぞれに属するｎ種類の細胞が、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能である細胞のうち、２以上を調製する工程、
を含む、方法に関する。なお、ｍおよびｎは１以上の整数であり、好ましくは１、２、３、４、５を含む１０以下の整数である。また、本方法は、２以上の細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程、および細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含むものでありうる。

【0094】

これにより、例えば、２〜２ｍｎ−１種の抗体の検査を同時に行うことができる。また、２〜ｍｎ例の被検者に由来する試料中における２〜ｍｎ種類の抗体を同時に検出または測定することもできる。第１から第２ｍｎの抗原タンパク質はそれぞれ互いに異なるタンパク質であってもよい。第１から第２ｍｎの抗原タンパク質のうち少なくとも一つは、ＡＱＰ４、ＭＯＧ、ＮＭＤＡ受容体、ＬＧＩ１、ＣＡＳＰＲ２、ＡＭＰＡ受容体、グリシン受容体、ＧＡＢＡＢ受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、ＬＤＬ受容体関連タンパク質４、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびｋｖ１．４から選択されうる。

【0095】

上記のように、細胞の標識には抗体を用いてもよい。第１から第４の蛍光タンパク質および第１から第２の蛍光色素の性質は、本発明に係る他の態様に関して記載したものと同様である。なお、例えば、蛍光色素で標識していない細胞、蛍光色素で弱く標識した細胞、蛍光色素で強く標識した細胞といった３段階の強度で標識した細胞を調製することができる。本発明の文脈において、ｍ段階あるいはｎ段階の強度で細胞を標識することには、細胞を標識しないことも含まれる。

【0096】

このような２以上の細胞を含む細胞懸濁液を複数調製し、各々の細胞懸濁液に対して被検者に由来する試料が１種類加えられるように、複数の細胞懸濁液に複数の被検者に由来する試料を加えることにより、複数の試料中の複数の抗体を分析することができる。例えば、３例の被検者に由来する試料を４種類の抗体について、あるいは４例の被検者に由来する試料を３種類の抗体について、同時に検査することができる。

【0097】

（１２種類の試料中の抗体の同時検出）
本発明の一つの態様としては、１以上の被検者に由来する１２種類の試料中における抗体を同時に検出または測定する方法が提供される。フローサイトメーターを用いることで、１２種類の試料中における目的の抗体の検出および／または測定を簡便かつ精確に同時に行うことができる。一つの態様において、本方法は、第１から第１２の抗原タンパク質を発現する細胞を個別の容器中において調製する工程、１以上の被検者に由来する第１から第１２の試料を、第１から第１２の抗原タンパク質を発現する細胞にそれぞれ加えてインキュベートする工程、被検者に由来する試料を加えた第１から第１２の抗原タンパク質を発現する細胞を１つの容器中で混合して細胞懸濁液を得る工程、ならびに該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含む。ここで、試料を細胞に加えてインキュベートする際には、あらかじめ複数の細胞（例えば第１の抗原タンパク質を発現する細胞と第２の抗原タンパク質を発現する細胞）を混合しておき、それに複数の試料（例えば第１の試料と第２の試料。ここで、第１の試料と第２の試料は同じものであってもよい）を加えてインキュベートしてもよい。さらに、細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を行うことができる。なお、二次抗体は、例えば、AcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、7-AADなどで標識されていてもよい。

【0098】

いくつかの態様において、本発明の方法では、第１から第１２の抗原タンパク質は蛍光タンパク質と融合していてもよい。抗原タンパク質と融合した蛍光タンパク質はそれぞれ同一または異なるものでありうる。例えば、第１から第６の抗原タンパク質が第１の蛍光タンパク質と融合しており、第７から第１２の抗原タンパク質が第２の蛍光タンパク質と融合している場合、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であってもよい。いくつかの態様において、本発明の方法では、第１から第１２の抗原タンパク質はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳されてもよい。抗原タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳される蛍光タンパク質はそれぞれ同一または異なるものでありうる。例えば、第１から第６の抗原タンパク質がそれぞれＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第１の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第７から第１２の抗原タンパク質がそれぞれＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第２の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳される場合、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であってもよい。いくつかの態様において、本発明の方法では、例えば、第４から第６の抗原タンパク質を発現する細胞および第１０から第１２の抗原タンパク質を発現する細胞は、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質で標識されていてもよい。また、例えば、第４から第６の抗原タンパク質を発現する細胞および第１０から第１２の抗原タンパク質を発現する細胞は、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されていてもよい。蛍光色素／蛍光タンパク質としては、例えば、AcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、7-AADなどを使用することができる。

【0099】

いくつかの態様において、本発明の方法では、例えば、第２、第５、第８および第１１の抗原タンパク質を発現する細胞は、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質で弱く標識されており、第３、第６、第９および第１２の抗原タンパク質を発現する細胞が第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質で強く標識されていてもよい。ここで、弱く標識された細胞と強く標識された細胞とは、例えばフローサイトメーター上で区別可能である。蛍光色素／蛍光タンパク質としては、例えば、AcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、7-AADなどを使用することができる。

【0100】

さらに、細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を行うことができる。よって、本発明の態様の一つには、被検者に由来する試料中における第１から第１２の抗体を同時に検出または測定する方法であって、第１の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第２の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第３の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第４の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第５の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第６の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第７の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第８の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第９の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第１０の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第１１の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第１２の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、該第１から第１２の抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程、ならびに該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含み、ここで、第１から第１２の抗原タンパク質のそれぞれは蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第１から第６の抗原タンパク質はそれぞれ第１の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第１の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第７から第１２の抗原タンパク質はそれぞれ第２の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第２の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であり、第４から第６の抗原タンパク質を発現する細胞および第１０から第１２の抗原タンパク質を発現する細胞は、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質で標識されており、そして第２、第５、第８および第１１の抗原タンパク質を発現する細胞は第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質で弱く標識されており、第３、第６、第９および第１２の抗原タンパク質を発現する細胞は第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質で強く標識されており、弱く標識された細胞と強く標識された細胞とが区別可能である、方法が含まれる。第４から第６の抗原タンパク質を発現する細胞および第１０から第１２の抗原タンパク質を発現する細胞は、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体で標識されていてもよい。

【0101】

いくつかの態様において、被検者に由来する試料は血清、血漿、全血、脳脊髄液、涙、唾液、および尿から選択されてもよい。上記第１から第１２の抗原タンパク質は、すべて同じタンパク質であってよく、ＡＱＰ４、ＭＯＧ、ＮＭＤＡ受容体、ＬＧＩ１、ＣＡＳＰＲ２、ＡＭＰＡ受容体、グリシン受容体、ＧＡＢＡ_Ｂ受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、ＬＤＬ受容体関連タンパク質４、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびｋｖ１．４から選択されるタンパク質でありうる。上記第１から第１２の抗原タンパク質は、必ずしもすべて同じタンパク質である必要はなく、異なる抗原タンパク質を含んでいてもよい。例えば４例の被検者に由来する試料中に含まれる３種の自己抗体の有無を検出できるように、第１から第１２の抗原タンパク質を選択することもできる。このような場合は、各自己抗体に対応する３種の細胞を混合した後に各被検者に由来する試料を加えてインキュベートし、それらをさらに１つの容器中に加えて細胞懸濁液を得ることもできる。

【0102】

上記第１の蛍光タンパク質はＥＧＦＰであってもよい。上記第２の蛍光タンパク質はmCherryであってもよい。上記第１の蛍光色素は、ＥＧＦＰと同じ波長のレーザーで励起することが可能なPE-Cy7であってもよい。上記第２の蛍光色素はHoechst 33342であってもよい。上記二次抗体はAlexa Fluor 647で標識されていてもよい。

【0103】

第１の蛍光タンパク質と第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質は、同じ波長のレーザーで励起されるものを使用することができる。同様に、第２の蛍光タンパク質と第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質は、同じ波長のレーザーで励起されるものを使用することもできる。本発明において使用される他の蛍光標識についても同様に、単一のレーザーにより複数の標識が励起されるものを組み合わせて使用することができる。

【0104】

なお、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質と同様に、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質によって細胞を３段階（陰性、弱陽性、強陽性）に標識することにより、１８種類の細胞を調製し、１８種類の試料について同時に評価することも可能である。また、４段階の標識と組み合わせることにより、１６種類、２４種類、３２種類の試料の同時評価も可能となる。

【0105】

いくつかの態様においては、１２未満の種類の試料中における抗体の同時検出または同時測定を行ってもよい。前記第１から第１２の抗原タンパク質を発現する細胞のうち、例えば、２〜１１種の細胞のみを調製して使用し、２〜１１種類の試料中における抗体を同時に検出または測定することもできる。また、このような２以上の細胞を含む細胞懸濁液を複数調製し、複数の被検者に由来する試料と反応させることにより、複数の試料中の複数の抗体を分析することができる。例えば、３例の被検者に由来する試料を４種類の抗体について、あるいは４例の被検者に由来する試料を３種類の抗体について、同時に検査することができる。

【0106】

（４ｎ種類の試料中の抗体の同時検出）
本発明の別の態様としては、１以上の被検者に由来する４ｎ個の試料中における抗体を同時に検出または測定する方法が含まれる。ここでｎは１以上の整数であり、好ましくは１、２、３、４、５を含む１０以下の整数である。フローサイトメーターを用いることで、４ｎ個の試料中における抗体の検出および／または測定を簡便かつ精確に同時に行うことができる。

【0107】

一つの態様において、本方法は、第１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞をそれぞれ別個の容器中に調製する工程、１以上の被検者に由来する第１から第４ｎの試料を、第１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞にそれぞれ加えてインキュベートする工程、被検者に由来する試料を加えた第１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞を１つの容器中で混合して細胞懸濁液を得る工程、ならびに該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含む。一つの態様において、第１から第４ｎの抗原タンパク質は同じタンパク質でありうる。また、一つの態様において、第１から第４ｎの抗原タンパク質は、必ずしもすべて同じタンパク質である必要はなく、異なる抗原タンパク質を含んでいてもよい。試料を細胞に加えてインキュベートする際には、あらかじめ複数の細胞（例えば第１の抗原タンパク質を発現する細胞と第２の抗原タンパク質を発現する細胞）を混合しておき、それに複数の試料（例えば第１の試料と第２の試料。ここで、第１の試料と第２の試料は同じものであってもよい）を加えてインキュベートしてもよい。さらに、細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を行うことができる。なお、二次抗体を標識する蛍光タンパク質および蛍光色素の性質は、本発明に係る他の態様に関して記載したものと同様である。

【0108】

いくつかの態様において、第１から第４ｎの抗原タンパク質のそれぞれは、蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳されてもよい。例えば、第１から第２ｎの抗原タンパク質は、それぞれ第１の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第１の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第２ｎ＋１から第４ｎの抗原タンパク質は、それぞれ第２の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第２の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であってもよい。第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞および第３ｎ＋１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞は、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質で標識されていてもよい。第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞および第３ｎ＋１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞は、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されていてもよい。第１から第４の蛍光タンパク質および第１から第２の蛍光色素の性質は、本発明に係る他の態様に関して記載したものと同様である。

【0109】

いくつかの態様において、第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞は、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞、第２ｎ＋１から第３ｎの抗原タンパク質を発現する細胞、第３ｎ＋１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞が、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞、第２ｎ＋１から第３ｎの抗原タンパク質を発現する細胞、第３ｎ＋１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞がそれぞれ区別可能である。例えば、蛍光色素で標識していない細胞、蛍光色素で弱く標識した細胞、蛍光色素で強く標識した細胞といった３段階の強度で標識した細胞を調製することができる。本発明の文脈において、ｎ段階の強度で細胞を標識することには、細胞を標識しないことも含まれる。

【0110】

いくつかの態様においては、４ｎ未満の種類の試料中における抗体の同時検出または同時測定を行ってもよい。前記第１から第４ｎの抗原タンパク質を発現する細胞のうち、例えば、２〜４ｎ−１種の細胞のみを調製して使用し、２〜４ｎ−１種類の試料中における抗体を同時に検出または測定することもできる。また、このような２以上の細胞を含む細胞懸濁液を複数調製し、複数の被検者に由来する試料と反応させることにより、複数の試料中の複数の抗体を分析することができる。例えば、８例の被検者に由来する試料を２種類の抗体について、あるいは４例の被検者に由来する試料を４種類の抗体について、同時に検査することができる。

【0111】

（２ｍｎ種類の試料中の抗体の同時検出）
上述した４ｎ種類の試料の同時分析において、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質による標識をｍ段階に分けることにより、２ｍｎ種類の試料の同時分析を行うことができる。よって、本発明の別の態様としては、１以上の被検者に由来する２ｍｎ個の試料中における抗体を同時に検出または測定する方法が含まれる。ここでｍおよびｎは１以上の整数であり、好ましくは１、２、３、４、５を含む１０以下の整数である。フローサイトメーターを用いることで、２ｍｎ個の試料中に含まれる抗体の検出および／または測定を簡便かつ精確に同時に行うことができる。２ｍｎは例えば、２、４、６、８、１２、１６、１８、２４、３２などの値を取り得る。被検者に由来する試料としては、例えば、血清、血漿、全血、脳脊髄液、涙、唾液、尿などを使用することができる。検出対象の抗体が結合する抗原タンパク質としては、例えば、ＡＱＰ４、ＭＯＧ、ＮＭＤＡ受容体、ＬＧＩ１、ＣＡＳＰＲ２、ＡＭＰＡ受容体、グリシン受容体、ＧＡＢＡ_Ｂ受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、ＬＤＬ受容体関連タンパク質４、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、ｋｖ１．４などを使用することができる。

【0112】

一つの態様において、本方法は、第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞をそれぞれ別個の容器中に調製する工程、１以上の被検者に由来する第１から第２ｍｎの試料を、第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞にそれぞれ加えてインキュベートする工程、被検者に由来する試料を加えた第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を１つの容器中で混合して細胞懸濁液を得る工程、ならびに該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含む。ここで、試料を細胞に加えてインキュベートする際には、あらかじめ複数の細胞（例えば第１の抗原タンパク質を発現する細胞と第２の抗原タンパク質を発現する細胞）を混合しておき、それに複数の試料（例えば第１の試料と第２の試料。ここで、第１の試料と第２の試料は同じものであってもよい）を加えてインキュベートしてもよい。さらに、細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を行うことができる。なお、二次抗体を標識する蛍光タンパク質および蛍光色素の性質は、本発明に係る他の態様に関して記載したものと同様である。第１から第２ｍｎの抗原タンパク質は、同じタンパク質であっても、異なるタンパク質を含んでいてもよい。

【0113】

いくつかの態様において、第１から第２ｍｎの抗原タンパク質のそれぞれは、蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳される。また、いくつかの態様において、第１から第ｍｎの抗原タンパク質はそれぞれ第１の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第１の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第ｍｎ＋１から第２ｍｎの抗原タンパク質がそれぞれ第２の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第２の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である。

【0114】

いくつかの態様においては、第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞のうち、第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第１細胞グループとし、同様に、第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第２細胞グループ、第（ｍ−１）ｎ＋１から第ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第ｍ細胞グループ、第（２ｍ−１）ｎ＋１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第２ｍ細胞グループとして、第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞がｎ種類ずつ２ｍのグループに分けられ、第１細胞グループから第ｍ細胞グループが、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質によりｍ段階の強度でそれぞれ標識され、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能とされており、同様に、第ｍ＋１細胞グループから第２ｍ細胞グループは、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質によりｍ段階の強度でそれぞれ標識され、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能とされうる。第１細胞グループから第ｍ細胞グループは、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されて、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能とされ、同様に、第ｍ＋１細胞グループから第２ｍ細胞グループが、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されて、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能とされてもよい。

【0115】

いくつかの態様においては、上記の第１細胞グループに属する第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞は、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能とされ、同様に、第２細胞グループから第２ｍ細胞グループのそれぞれに属するｎ種類の細胞は、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の強度でそれぞれ標識されて、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能とされうる。

【0116】

別の言い方をすれば、いくつかの態様において、第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞は、まず、第１から第ｍｎの細胞からなるグループと、第ｍｎ＋１から第２ｍｎの細胞からなるグループとに分けられる。この２群の区別は、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質の判別によりなされうる。次に、第１から第ｍｎの細胞からなるグループは、ｎ個の細胞からなるｍ個の群に分けられる。これらｍ個の群は、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質により各群ごとにｍ段階の異なる強度でそれぞれ標識されることにより、それぞれ区別されうる。また、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の蛍光強度によりそれぞれ区別されるｍ個の群にそれぞれ含まれるｎ個の細胞は、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の異なる強度でそれぞれ標識されることにより、それぞれ区別されうる。同様に、第ｍｎ＋１から第２ｍｎの細胞からなるグループについても、ｎ個の細胞からなるｍ個の群に分けられる。これらｍ個の群は、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質により各群ごとにｍ段階の異なる強度でそれぞれ標識されることにより、それぞれ区別されうる。また、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の蛍光強度によりそれぞれ区別されるｍ個の群にそれぞれ含まれるｎ個の細胞は、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の異なる強度でそれぞれ標識されることにより、それぞれ区別されうる。このようにして、蛍光標識に基づきそれぞれ区別可能な２ｍｎ種類の細胞が調製されうる。よって、本発明の一つの態様は、蛍光標識に基づきそれぞれ区別可能な２ｍｎ種類の細胞の調製方法にも関する。

【0117】

上記のように、細胞の標識には抗体を用いてもよい。第１から第４の蛍光タンパク質および第１から第２の蛍光色素の性質は、本発明に係る他の態様に関して記載したものと同様である。なお、例えば、蛍光色素で標識していない細胞、蛍光色素で弱く標識した細胞、蛍光色素で強く標識した細胞といった３段階の強度で標識した細胞を調製することができる。本発明の文脈において、ｍ段階あるいはｎ段階の強度で細胞を標識することには、細胞を標識しないことも含まれる。

【0118】

例えば、ｍ＝３、ｎ＝３の場合、１８種類の細胞を調製し、１８個の試料を同時に評価することができる。ｍ＝４、ｎ＝３の場合、２４種類の細胞を調製し、２４個の試料を同時に評価することができる。

【0119】

本発明の態様の一つは、よって、１以上の被検者に由来する２ｍｎ個の試料中における抗体を同時に検出または測定する方法であって、
ｍは１以上の整数であり、
ｎは１以上の整数であり、
第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞をそれぞれ別個の容器中に調製する工程、
１以上の被検者に由来する第１から第２ｍｎの試料を、第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞にそれぞれ加えてインキュベートする工程、
被検者に由来する試料を加えた第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を１つの容器中で混合して細胞懸濁液を得る工程、
該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含み、
ここで、第１から第ｍｎの抗原タンパク質がそれぞれ第１の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第１の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第ｍｎ＋１から第２ｍｎの抗原タンパク質がそれぞれ第２の蛍光タンパク質と融合しているか又はＩＲＥＳ発現ベクターを用いて第２の蛍光タンパク質と同一のｍＲＮＡから翻訳され、第１の蛍光タンパク質と第２の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であり、
第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第１細胞グループとし、同様に、第ｎ＋１から第２ｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第２細胞グループ、第（ｍ−１）ｎ＋１から第ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第ｍ細胞グループ、第（２ｍ−１）ｎ＋１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞を第２ｍ細胞グループとし、第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞がｎ種類ずつ２ｍのグループに分けられており、
第１細胞グループから第ｍ細胞グループが、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質または第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第ｍ＋１細胞グループから第２ｍ細胞グループが、第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質または第１の蛍光色素もしくは第３の蛍光タンパク質の接合した抗体によりｍ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、
第１細胞グループに属する第１から第ｎの抗原タンパク質を発現する細胞が、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第２細胞グループから第２ｍ細胞グループのそれぞれに属するｎ種類の細胞が、第２の蛍光色素もしくは第４の蛍光タンパク質によりｎ段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能である、方法に関する。

【0120】

いくつかの態様においては、２ｍｎ未満の種類の試料中における抗体の同時検出または同時測定を行ってもよい。前記第１から第２ｍｎの抗原タンパク質を発現する細胞のうち、例えば、２〜２ｍｎ−１種の細胞のみを調製して使用し、２〜２ｍｎ−１種類の試料中における抗体を同時に検出または測定することもできる。また、このような２以上の細胞を含む細胞懸濁液を複数調製し、複数の被検者に由来する試料と反応させることにより、複数の試料中の複数の抗体を分析することができる。例えば、８例の被検者に由来する試料を２種類の抗体について、あるいは４例の被検者に由来する試料を４種類の抗体について、同時に検査することができる。よって、本発明のいくつかの態様は、１以上の被検者に由来する２ｍｎ以下の試料中における抗体を同時に検出または測定する方法に関する。

【0121】

診断
本発明の方法によれば、被検者に由来する試料中における複数の抗体を同時に検出または測定することにより、疾患の診断に有用な指標を得ることができる。

【0122】

例えば、被検者の血清中における抗ＡＱＰ４抗体の存在は、被検者におけるＮＭＯ／ＮＭＯＳＤの存在を指し示しうる。したがって、本発明の方法の態様の一つは、被検者に由来する試料中における抗ＡＱＰ４抗体および抗ＭＯＧ抗体を同時に検出または測定する方法であって、ＡＱＰ４タンパク質（例えばＡＱＰ４Ｍ２３タンパク質）を発現する細胞を調製する工程、ＭＯＧタンパク質を発現する細胞を調製する工程、該ＡＱＰ４タンパク質を発現する細胞と該ＭＯＧタンパク質を発現する細胞とを含む細胞懸濁液を調製する工程、該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含み、試料中における抗ＡＱＰ４抗体の存在が被検者におけるＮＭＯ／ＮＭＯＳＤの存在を指し示す、方法に関する。さらに、細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を行うことができる。

【0123】

また、例えば、被検者の血清中における抗ＭＯＧ抗体の存在は、被検者における抗ＭＯＧ抗体関連疾患／ＭＯＧ抗体疾患の存在を指し示しうる。したがって、本発明の方法の態様の一つは、被検者に由来する試料中における抗ＡＱＰ４抗体および抗ＭＯＧ抗体を同時に検出または測定する方法であって、ＡＱＰ４タンパク質を発現する細胞を調製する工程、ＭＯＧタンパク質を発現する細胞を調製する工程、該ＡＱＰ４タンパク質を発現する細胞と該ＭＯＧタンパク質を発現する細胞とを含む細胞懸濁液を調製する工程、該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含み、試料中における抗ＭＯＧ抗体の存在が被検者における抗ＭＯＧ抗体関連疾患／ＭＯＧ抗体疾患の存在を指し示す、方法に関する。さらに、細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を行うことができる。

【0124】

また、例えば、被検者、特に脱髄性疾患患者の血清中における抗ＡＱＰ４抗体および抗ＭＯＧ抗体の不在は、被検者におけるＭＳの存在を指し示しうる。したがって、本発明の方法の態様の一つは、被検者に由来する試料中における抗ＡＱＰ４抗体および抗ＭＯＧ抗体を同時に検出または測定する方法であって、ＡＱＰ４タンパク質を発現する細胞を調製する工程、ＭＯＧタンパク質を発現する細胞を調製する工程、該ＡＱＰ４タンパク質を発現する細胞と該ＭＯＧタンパク質を発現する細胞とを含む細胞懸濁液を調製する工程、該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含み、試料中における抗ＡＱＰ４抗体および抗ＭＯＧ抗体の不在が被検者におけるＭＳの存在を指し示す、方法に関する。さらに、細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を行うことができる。

【0125】

同様にして、例えば本願に記載のＡＱＰ４、ＭＯＧ以外のタンパク質を利用して、本願に記載の他の疾患の診断に有用な指標を得ることもできる。

【0126】

以下に、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これらにより本発明は何ら制限を受けるものではない。

【実施例】

【0127】

＜例１：細胞培養と一過性発現の方法＞
ＣＨＯ−Ｋ１細胞の培養は、１０％ウシ胎児血清、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＨａｍ’ｓ Ｆ−１２Ｋ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ_２濃度の環境下で行った。hAQP4M23 cDNA（配列番号：１）ならびにhMOG isoform alpha1 precursor cDNA（配列番号：２）を、発現ベクターｐＥＧＦＰ−Ｎ３のマルチクローニングサイトに挿入したプラスミドを作製した。細胞を播種した翌日、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００を用いてトランスフェクションを行い、４８時間後にフローサイトメトリー測定を行った（図１参照）。

【0128】

＜例２：フローサイトメトリー解析＞
ヒトＭＯＧを発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞に最終濃度５μｇ／ｍＬとなるようにHoechst 33342を加え、３７℃で２０分間のインキュベートを行った。ヒトＡＱＰ４Ｍ２３を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞ならびにHoechst 33342染色を行ったヒトＭＯＧを発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞を回収し、それぞれの細胞懸濁液が１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調整した。その後、２種類の細胞懸濁液を等量混ぜ、４℃で２時間のインキュベートを行った。細胞懸濁液として、３％ウシ胎児血清、２ｍＭ ＥＤＴＡを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を用いた。

【0129】

１０^５ｃｅｌｌｓ／１００μＬの細胞懸濁液に対して１０μＬの患者血清を加え、４℃で１５分間のインキュベートを行った。その後、細胞懸濁液を用いて遠心洗浄を２回行い、二次抗体を加えた。二次抗体はAlexa Fluor 647標識抗ヒトＩｇＧ抗体を用い、抗体反応濃度は１：５００を採用した。４℃で３０分間のインキュベートを行った後、２回の遠心洗浄を行い、４８８ｎｍ青レーザー、６４０ｎｍ赤レーザー、３５５ｎｍＵＶレーザーを搭載したベクトン・ディッキンソン社製FACSAriaIIを用いて測定した。

【0130】

死細胞ならびにダブレットを除いたＣＨＯ−Ｋ１細胞画分をHoechst 33342青色蛍光強度と側方散乱光で展開し、Hoechst 33342陽性細胞群とHoechst 33342陰性細胞群に対するゲートを設定した。死細胞の染色には７−ＡＡＤを用いた。Hoechst 33342陽性細胞群とHoechst 33342陰性細胞群をそれぞれＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開し、測定サンプルに含まれるＥＧＦＰ陽性かつAlexa Fluor 647陽性細胞の割合を算出した。測定したフローサイトメトリーデータの解析にはＦｌｏｗＪｏを使用した（図２参照）。

【0131】

＜例３：患者試料の分析＞
視神経脊髄炎関連疾患患者（５８歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陽性かつ抗ＭＯＧ抗体陰性）を示したフローサイトメトリー解析の図を図３−１から３−８に示す。図３−１は、横軸を前方散乱光（Forward Scatter：ＦＳＣ）、縦軸を側方散乱光（Side Scatter：ＳＳＣ）としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ１ゲートを作成した図である。５００００細胞の測定を行った。図３−２は、図３−１のＰ１ゲート内に含まれる死細胞を７−ＡＡＤ染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するＰ２ゲートを作成した図である。図３−３は、図３−２のＰ２ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ３ゲートを作成した図である。図３−４は、図３−３のＰ３ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ４ゲートを作成した図である。図３−３と図３−４によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。図３−５は、図３−４のＰ４ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とＳＳＣで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してＰ５ゲートを、Hoechst 33342陽性細胞群に対してＰ６ゲートを作成した図である。図３−６は、図３−５のHoechst 33342陰性細胞群ならびに陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした１次元ヒストグラムで示した図である。図３−７は、図３−５のＰ５ゲートをＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗ＡＱＰ４抗体が含まれている場合、Ｑ２領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにＱ２領域に細胞集団が存在する（本データでは、図３−５のＰ５ゲートHoechst 33342陰性細胞群のうちの３０．４％の細胞が存在する）ことから、本血清は抗ＡＱＰ４抗体陽性であると判断した。図３−８は、図３−５のＰ６ゲートをＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗ＭＯＧ抗体が含まれている場合、Ｑ２領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにＱ２領域に細胞集団が存在しない（本データでは、図３−５のＰ６ゲートHoechst 33342陽性細胞群のうち僅かに０．３５％の細胞しか存在しない）ことから、本血清は抗ＭＯＧ抗体陰性であると判断した。

【0132】

＜例４：患者試料の分析＞
視神経脊髄炎関連疾患患者（４４歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陽性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図を図４−１から図４−８に示す。図４−１は、横軸を前方散乱光（Forward Scatter：ＦＳＣ）、縦軸を側方散乱光（Side Scatter：ＳＳＣ）としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ１ゲートを作成した図である。５００００細胞の測定を行った。図４−２は、図４−１のＰ１ゲート内に含まれる死細胞を７−ＡＡＤ染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するＰ２ゲートを作成した図である。図４−３は、図４−２のＰ２ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ３ゲートを作成した図である。図４−４は、図４−３のＰ３ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ４ゲートを作成した図である。図４−３と図４−４によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。図４−５は、図４−４のＰ４ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とＳＳＣで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してＰ５ゲートを、Hoechst 33342陽性細胞群に対してＰ６ゲートを作成した図である。図４−６は、図４−５のHoechst 33342陰性細胞群ならびに陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした１次元ヒストグラムで示した図である。図４−７は、図４−５のＰ５ゲートをＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗ＡＱＰ４抗体が含まれている場合、Ｑ２領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにＱ２領域に細胞集団が存在する（本データでは、図４−５のＰ５ゲートHoechst 33342陰性細胞群のうちの２８．３％の細胞が存在する）ことから、本血清は抗ＡＱＰ４抗体陽性であると判断した。図４−８は、図４−５のＰ６ゲートをＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗ＭＯＧ抗体が含まれている場合、Ｑ２領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにＱ２領域に細胞集団が存在する（本データでは、図４−５のＰ６ゲートHoechst 33342陽性細胞群のうちの１４．０％の細胞が存在する）ことから、本血清は抗ＭＯＧ抗体陽性であると判断した。

【0133】

＜例５：患者試料の分析＞
視神経脊髄炎関連疾患患者（５７歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体弱陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図を図５−１から図５−８に示す。図５−１は、横軸を前方散乱光（Forward Scatter：ＦＳＣ）、縦軸を側方散乱光（Side Scatter：ＳＳＣ）としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ１ゲートを作成した図である。５００００細胞の測定を行った。図５−２は、図５−１のＰ１ゲート内に含まれる死細胞を７−ＡＡＤ染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するＰ２ゲートを作成した図である。図５−３は、図５−２のＰ２ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ３ゲートを作成した図である。図５−４は、図５−３のＰ３ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ４ゲートを作成した図である。図５−３と図５−４によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。図５−５は、図５−４のＰ４ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とＳＳＣで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してＰ５ゲートを、Hoechst 33342陽性細胞群に対してＰ６ゲートを作成した図である。図５−６は、図５−５のHoechst 33342陰性細胞群ならびに陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした１次元ヒストグラムで示した図である。図５−７は、図５−５のＰ５ゲートをＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗ＡＱＰ４抗体が含まれている場合、Ｑ２領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにＱ２領域に細胞集団が存在しない（本データでは、図５−５のＰ５ゲートHoechst 33342陰性細胞群のうち僅かに０．１２％の細胞しか存在しない）ことから、本血清は抗ＡＱＰ４抗体陰性であると判断した。図５−８は、図５−５のＰ６ゲートをＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗ＭＯＧ抗体が含まれている場合、Ｑ２領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにＱ２領域に細胞集団が存在する（本データでは、図５−５のＰ６ゲートHoechst 33342陽性細胞群のうちの３．５０％の細胞が存在する）ことから、本血清は抗ＭＯＧ抗体弱陽性であると判断した。

【0134】

＜例６：患者試料の分析＞
多発性硬化症患者（２３歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図を図６−１から図６−８に示す。図６−１は、横軸を前方散乱光（Forward Scatter：ＦＳＣ）、縦軸を側方散乱光（Side Scatter：ＳＳＣ）としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ１ゲートを作成した図である。５００００細胞の測定を行った。図６−２は、図６−１のＰ１ゲート内に含まれる死細胞を７−ＡＡＤ染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するＰ２ゲートを作成した図である。図６−３は、図６−２のＰ２ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ３ゲートを作成した図である。図６−４は、図６−３のＰ３ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ４ゲートを作成した図である。図６−３と図６−４によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。図６−５は、図６−４のＰ４ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とＳＳＣで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してＰ５ゲートを、Hoechst 33342陽性細胞群に対してＰ６ゲートを作成した図である。図６−６は、図６−５のHoechst 33342陰性細胞群ならびに陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした１次元ヒストグラムで示した図である。図６−７は、図６−５のＰ５ゲートをＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗ＡＱＰ４抗体が含まれている場合、Ｑ２領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにＱ２領域に細胞集団が存在しない（本データでは、図６−５のＰ５ゲートHoechst 33342陰性細胞群のうち僅かに０．２６％の細胞しか存在しない）ことから、本血清は抗ＡＱＰ４抗体陰性であると判断した。図６−８は、図６−５のＰ６ゲートをＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗ＭＯＧ抗体が含まれている場合、Ｑ２領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにＱ２領域に細胞集団が存在する（本データでは、図６−５のＰ６ゲートHoechst 33342陽性細胞群のうちの２０．１％の細胞が存在する）ことから、本血清は抗ＭＯＧ抗体陽性であると判断した。

【0135】

＜例７：患者試料の分析＞
多発性硬化症患者（５０歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陰性）を示したフローサイトメトリー解析の図を図７−１から図７−８に示す。図７−１は、横軸を前方散乱光（Forward Scatter：ＦＳＣ）、縦軸を側方散乱光（Side Scatter：ＳＳＣ）としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ１ゲートを作成した図である。５００００細胞の測定を行った。図７−２は、図７−１のＰ１ゲート内に含まれる死細胞を７−ＡＡＤ染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するＰ２ゲートを作成した図である。図７−３は、図７−２のＰ２ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ３ゲートを作成した図である。図７−４は、図７−３のＰ３ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ４ゲートを作成した図である。図７−３と図７−４によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。図７−５は、図７−４のＰ４ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とＳＳＣで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してＰ５ゲートを、Hoechst 33342陽性細胞群に対してＰ６ゲートを作成した図である。図７−６は、図７−５のHoechst 33342陰性細胞群ならびに陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした１次元ヒストグラムで示した図である。図７−７は、図７−５のＰ５ゲートをＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗ＡＱＰ４抗体が含まれている場合、Ｑ２領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにＱ２領域に細胞集団が存在しない（本データでは、図７−５のＰ５ゲートHoechst 33342陰性細胞群のうち僅かに０．４４％の細胞しか存在しない）ことから、本血清は抗ＡＱＰ４抗体陰性であると判断した。図７−８は、図７−５のＰ６ゲートをＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗ＭＯＧ抗体が含まれている場合、Ｑ２領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにＱ２領域に細胞集団が存在しない（本データでは、図７−５のＰ６ゲートHoechst 33342陽性細胞群のうち僅かに０．２４％の細胞しか存在しない）ことから、本血清は抗ＭＯＧ抗体陰性であると判断した。

【0136】

＜例８：患者試料の分析＞
視神経炎患者（７８歳男性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図を図８−１から図８−８に示す。図８−１は、横軸を前方散乱光（Forward Scatter：ＦＳＣ）、縦軸を側方散乱光（Side Scatter：ＳＳＣ）としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ１ゲートを作成した図である。５００００細胞の測定を行った。図８−２は、図８−１のＰ１ゲート内に含まれる死細胞を７−ＡＡＤ染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するＰ２ゲートを作成した図である。図８−３は、図８−２のＰ２ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ３ゲートを作成した図である。図８−４は、図８−３のＰ３ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ４ゲートを作成した図である。図８−３と図８−４によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。図８−５は、図８−４のＰ４ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とＳＳＣで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してＰ５ゲートを、Hoechst 33342陽性細胞群に対してＰ６ゲートを作成した図である。図８−６は、図８−５のHoechst 33342陰性細胞群ならびに陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした１次元ヒストグラムで示した図である。図８−７は、図８−５のＰ５ゲートをＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗ＡＱＰ４抗体が含まれている場合、Ｑ２領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにＱ２領域に細胞集団が存在しない（本データでは、図８−５のＰ５ゲートHoechst 33342陰性細胞群のうち僅かに０．２６％の細胞しか存在しない）ことから、本血清は抗ＡＱＰ４抗体陰性であると判断した。図８−８は、図８−５のＰ６ゲートをＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗ＭＯＧ抗体が含まれている場合、Ｑ２領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにＱ２領域に細胞集団が存在する（本データでは、図８−５のＰ６ゲートHoechst 33342陽性細胞群のうちの２１．４％の細胞が存在する）ことから、本血清は抗ＭＯＧ抗体陽性であると判断した。

【0137】

＜例９：患者試料の分析＞
再発性急性散在性脳脊髄炎患者（１５歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陽性）を示したフローサイトメトリー解析の図を図９−１から図９−８に示す。図９−１は、横軸を前方散乱光（Forward Scatter：ＦＳＣ）、縦軸を側方散乱光（Side Scatter：ＳＳＣ）としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ１ゲートを作成した図である。５００００細胞の測定を行った。図９−２は、図９−１のＰ１ゲート内に含まれる死細胞を７−ＡＡＤ染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するＰ２ゲートを作成した図である。図９−３は、図９−２のＰ２ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ３ゲートを作成した図である。図９−４は、図９−３のＰ３ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ４ゲートを作成した図である。図９−３と図９−４によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。図９−５は、図９−４のＰ４ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とＳＳＣで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してＰ５ゲートを、Hoechst 33342陽性細胞群に対してＰ６ゲートを作成した図である。図９−６は、図９−５のHoechst 33342陰性細胞群ならびに陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした１次元ヒストグラムで示した図である。図９−７は、図９−５のＰ５ゲートをＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗ＡＱＰ４抗体が含まれている場合、Ｑ２領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにＱ２領域に細胞集団が存在しない（本データでは、図９−５のＰ５ゲートHoechst 33342陰性細胞群のうち僅かに０．４０％の細胞しか存在しない）ことから、本血清は抗ＡＱＰ４抗体陰性であると判断した。図９−８は、図９−５のＰ６ゲートをＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗ＭＯＧ抗体が含まれている場合、Ｑ２領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにＱ２領域に細胞集団が存在する（本データでは、図９−５のＰ６ゲートHoechst 33342陽性細胞群のうちの６．４０％の細胞が存在する）ことから、本血清は抗ＭＯＧ抗体陽性であると判断した。

【0138】

＜例１０：患者試料の分析＞
健常者（２４歳女性）から採取した血清の検査結果（抗ＡＱＰ４抗体陰性かつ抗ＭＯＧ抗体陰性）を示したフローサイトメトリー解析の図を図１０−１から図１０−８に示す。
図１０−１は、横軸を前方散乱光（Forward Scatter：ＦＳＣ）、縦軸を側方散乱光（Side Scatter：ＳＳＣ）としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ１ゲートを作成した図である。５００００細胞の測定を行った。図１０−２は、図１０−１のＰ１ゲート内に含まれる死細胞を７−ＡＡＤ染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するＰ２ゲートを作成した図である。図１０−３は、図１０−２のＰ２ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ３ゲートを作成した図である。図１０−４は、図１０−３のＰ３ゲートをＦＳＣのＨｅｉｇｈｔとＷｉｄｔｈパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するＰ４ゲートを作成した図である。図１０−３と図１０−４によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。図１０−５は、図１０−４のＰ４ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とＳＳＣで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してＰ５ゲートを、Hoechst 33342陽性細胞群に対してＰ６ゲートを作成した図である。図１０−６は、図１０−５のHoechst 33342陰性細胞群ならびに陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした１次元ヒストグラムで示した図である。図１０−７は、図１０−５のＰ５ゲートをＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗ＡＱＰ４抗体が含まれている場合、Ｑ２領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにＱ２領域に細胞集団が存在しない（本データでは、図１０−５のＰ５ゲートHoechst 33342陰性細胞群のうち僅かに０．０７６％の細胞しか存在しない）ことから、本血清は抗ＡＱＰ４抗体陰性であると判断した。図１０−８は、図１０−５のＰ６ゲートをＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗ＭＯＧ抗体が含まれている場合、Ｑ２領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにＱ２領域に細胞集団が存在しない（本データでは、図１０−５のＰ６ゲートHoechst 33342陽性細胞群のうち僅かに０．０６１％の細胞しか存在しない）ことから、本血清は抗ＭＯＧ抗体陰性であると判断した。

【0139】

＜例１１：複数試料の分析に利用可能な細胞の調製＞
複数個の試料（例えば、６種類、１２種類、２４種類）を同時にアッセイするのに使用可能な細胞の調製を行った。例えば、６種類の試料を同時に分析するためには、以下の６種類の細胞を調製することができる：
１．第１の抗原タンパク質と第１の蛍光タンパク質（例えばＥＧＦＰ）の融合タンパク質を発現し、第１の蛍光色素（例えばHoechst 33342）陰性である第１の細胞；
２．第１の抗原タンパク質と第１の蛍光タンパク質（例えばＥＧＦＰ）の融合タンパク質を発現し、第１の蛍光色素（例えばHoechst 33342）弱陽性である第２の細胞；
３．第１の抗原タンパク質と第１の蛍光タンパク質（例えばＥＧＦＰ）の融合タンパク質を発現し、第１の蛍光色素（例えばHoechst 33342）強陽性である第３の細胞；
４．第１の抗原タンパク質と第２の蛍光タンパク質（例えばmCherry）の融合タンパク質を発現し、第１の蛍光色素（例えばHoechst 33342）陰性である第４の細胞；
５．第１の抗原タンパク質と第２の蛍光タンパク質（例えばmCherry）の融合タンパク質を発現し、第１の蛍光色素（例えばHoechst 33342）弱陽性である第５の細胞；
６．第１の抗原タンパク質と第２の蛍光タンパク質（例えばmCherry）の融合タンパク質を発現し、第１の蛍光色素（例えばHoechst 33342）強陽性である第６の細胞。

【0140】

ここで、第１、第２、第３の細胞はそれぞれ、第１の蛍光色素による染色が３段階（陰性、弱陽性、強陽性）に調節されている。第４、第５、第６の細胞もそれぞれ、第１の蛍光色素による染色が３段階（陰性、弱陽性、強陽性）に調節されている。第４〜第６の細胞は、第２の蛍光タンパク質の代わりに第１の蛍光タンパク質を使用し、細胞に恒常的に発現している膜タンパク質に対する第２の蛍光色素で標識された抗体を使用して標識を行ってもよい。また、第２の蛍光タンパク質と第２の蛍光色素の両方を用いて標識を行うことにより、区別可能な細胞の数を１２種類に増やすこともできる。さらに、第１の蛍光色素による染色のレベルをさらに細分化することにより、細胞の種類を例えば２４種類に増やすこともできる。なお、本明細書の記載から明らかなように、融合タンパク質の代わりにＩＲＥＳ系を用いて蛍光タンパク質を発現させてもよい。また、蛍光タンパク質融合発現ベクターとＩＲＥＳ発現ベクターを併用してもよい。その他、核を染色する色素とそれと同系色の細胞膜、細胞質、細胞小器官、脂質、および糖鎖などを含む、細胞を構成する任意の構造単位を染色する色素を併用することにより細胞を区別することもできる。また、複数種の細胞を併用することもできる。

【0141】

Hoechst 33342陰性の細胞、Hoechst 33342で弱く染色した細胞、およびHoechst 33342で強く染色した細胞を混合し、フローサイトメトリーで分析した結果を図１１−１〜１１−６に示す。ＣＨＯ−Ｋ１細胞を１０％ウシ胎児血清、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＨａｍ’ｓ Ｆ−１２Ｋ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ_２濃度の環境下で、３枚の培養ディッシュ（培養ディッシュＡ、培養ディッシュＢ、培養ディッシュＣとする）を用いて培養した。各ディッシュに対する処理は以下の通りであった：
培養ディッシュＡ：Hoechst 33342による染色を行わない；
培養ディッシュＢ：Hoechst 33342によって弱く染色を行う；
培養ディッシュＣ：Hoechst 33342によって強く染色を行う。

【0142】

細胞を播種した７２時間後に、培養ディッシュＢには最終濃度０．１μｇ／ｍＬとなるように、培養ディッシュＣには最終濃度５μｇ／ｍＬとなるように、Hoechst 33342を加え、３７℃で２０分間のインキュベートを行った。その後、３枚の培養ディッシュから細胞をそれぞれ回収し、各細胞懸濁液が１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調整した。細胞懸濁液として、３％ウシ胎児血清、２ｍＭ ＥＤＴＡを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を用いた。３種類の細胞懸濁液を等量混ぜ、４８８ｎｍ青レーザー、６４０ｎｍ赤レーザー、３５５ｎｍＵＶレーザーを搭載したベクトン・ディッキンソン社製FACSAriaIIを用いて測定した。

【0143】

死細胞ならびにダブレットを除いたＣＨＯ−Ｋ１細胞画分をHoechst 33342青色蛍光強度と側方散乱光で展開し、Hoechst 33342陰性細胞群、Hoechst 33342弱陽性細胞群、Hoechst 33342強陽性細胞群に対するゲートを設定した。死細胞の染色には７−ＡＡＤを用いた。測定したフローサイトメトリーデータの解析にはＦｌｏｗＪｏを使用した。図１１−５のドットプロットおよび図１１−６のヒストグラムから明らかなようにHoechst 33342による染色の度合いを調整することにより、アッセイに用いる細胞の種類を増やすことができる。

【0144】

＜例１２：１２疾患自己抗体の同時測定＞
１．細胞培養と一過性発現の方法
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を１０％ウシ胎児血清、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＨａｍ’ｓ Ｆ−１２Ｋ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ_２濃度の環境下で、１２枚の培養ディッシュを用いて培養する。第１の抗原タンパク質をコードする遺伝子１、第２の抗原タンパク質をコードする遺伝子２、第３の抗原タンパク質をコードする遺伝子３、第４の抗原タンパク質をコードする遺伝子４、第５の抗原タンパク質をコードする遺伝子５、第６の抗原タンパク質をコードする遺伝子６をそれぞれ発現ベクターｐＥＧＦＰ−Ｎ３のマルチクローニングサイトに挿入した６種類のプラスミドを作製する。第７の抗原タンパク質をコードする遺伝子７、第８の抗原タンパク質をコードする遺伝子８、第９の抗原タンパク質をコードする遺伝子９、第１０の抗原タンパク質をコードする遺伝子１０、第１１の抗原タンパク質をコードする遺伝子１１、第１２の抗原タンパク質をコードする遺伝子１２をそれぞれ発現ベクターpMSCV-IRES-mCherry FPのマルチクローニングサイトに挿入した６種類のプラスミドを作製する。細胞を播種した翌日、１２枚の培養ディッシュに対して１２種類のプラスミドを１種類ずつ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００を用いてトランスフェクションを行い、４８時間後にフローサイトメトリー測定を行う。

【0145】

２．フローサイトメトリー解析
第２の抗原タンパク質を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞、第５の抗原タンパク質を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞、第８の抗原タンパク質を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞、第１１の抗原タンパク質を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞にそれぞれ最終濃度０．１μｇ／ｍＬとなるようにHoechst 33342を加える。第３の抗原タンパク質を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞、第６の抗原タンパク質を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞、第９の抗原タンパク質を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞、第１２の抗原タンパク質を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞に最終濃度５μｇ／ｍＬとなるようにHoechst 33342を加える。３７℃で２０分間のインキュベートを行う。第１の抗原タンパク質を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞、第２の抗原タンパク質を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞、第３の抗原タンパク質を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞、第４の抗原タンパク質を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞、第５の抗原タンパク質を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞、第６の抗原タンパク質を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞、第７の抗原タンパク質を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞、第８の抗原タンパク質を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞、第９の抗原タンパク質を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞、第１０の抗原タンパク質を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞、第１１の抗原タンパク質を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞、第１２の抗原タンパク質を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞を回収し、それぞれの細胞懸濁液が１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調整後、４℃で１時間３０分のインキュベートを行う。

【0146】

その後、第４の抗原タンパク質を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液、第５の抗原タンパク質を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液、第６の抗原タンパク質を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液、第１０の抗原タンパク質を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液、第１１の抗原タンパク質を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液、第１２の抗原タンパク質を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に恒常的に発現している膜タンパク質に対する抗体を加え、４℃で３０分間のインキュベートを行う。ここで、抗体はＰＥ−Ｃｙ７によって標識されているものを使用する。第１の抗原タンパク質を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液、第２の抗原タンパク質を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液、第３の抗原タンパク質を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液、第７の抗原タンパク質を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液、第８の抗原タンパク質を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液、第９の抗原タンパク質を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液には何も加えず、引き続き４℃で３０分間のインキュベートを行う。細胞懸濁液として、３％ウシ胎児血清、２ｍＭ ＥＤＴＡを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を用いる。

【0147】

１２種類全ての細胞懸濁液からそれぞれ５０μＬずつ取り、６００μＬの細胞懸濁液を作製した後、６０μＬの患者血清を加え、４℃で１５分間のインキュベートを行う。その後、細胞懸濁液を用いて遠心洗浄を２回行い、二次抗体を加える。二次抗体はAlexa Fluor 647標識抗ヒトＩｇＧ抗体を用い、抗体反応濃度は１：５００を採用する。４℃で３０分間のインキュベートを行った後、２回の遠心洗浄を行い、４８８ｎｍ青レーザー、６４０ｎｍ赤レーザー、５６１ｎｍ黄緑レーザー、３５５ｎｍＵＶレーザーを搭載したベクトン・ディッキンソン社製FACSAriaIIを用いて測定する。

【0148】

死細胞ならびにダブレットを除いたＣＨＯ−Ｋ１細胞画分をＰＥ−Ｃｙ７蛍光強度と側方散乱光で展開し、ＰＥ−Ｃｙ７陰性細胞群とＰＥ−Ｃｙ７陽性細胞群に対するゲートを設定する。死細胞の染色には７−ＡＡＤを用いる。ＰＥ−Ｃｙ７陰性細胞群をHoechst 33342青色蛍光強度と側方散乱光で展開し、Hoechst 33342陰性細胞群、Hoechst 33342弱陽性細胞群、Hoechst 33342強陽性細胞群に対するゲートを設定する。Hoechst 33342陰性細胞群、Hoechst 33342弱陽性細胞群、Hoechst 33342強陽性細胞群をそれぞれＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開し、測定サンプルに含まれるＥＧＦＰ陽性かつAlexa Fluor 647陽性細胞の割合を算出する。

【0149】

ＰＥ−Ｃｙ７陽性細胞群をHoechst 33342青色蛍光強度と側方散乱光で展開し、Hoechst 33342陰性細胞群、Hoechst 33342弱陽性細胞群、Hoechst 33342強陽性細胞群に対するゲートを設定する。Hoechst 33342陰性細胞群、Hoechst 33342弱陽性細胞群、Hoechst 33342強陽性細胞群をそれぞれＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開し、測定サンプルに含まれるＥＧＦＰ陽性かつAlexa Fluor 647陽性細胞の割合を算出する。測定したフローサイトメトリーデータの解析にはＦｌｏｗＪｏを使用する。

【0150】

＜例１３：１２検体の同時測定＞
１．細胞培養と一過性発現の方法
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を１０％ウシ胎児血清、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＨａｍ’ｓ Ｆ−１２Ｋ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ_２濃度の環境下で、１２枚の培養ディッシュ（培養ディッシュ１、培養ディッシュ２、培養ディッシュ３、培養ディッシュ４、培養ディッシュ５、培養ディッシュ６、培養ディッシュ７、培養ディッシュ８、培養ディッシュ９、培養ディッシュ１０、培養ディッシュ１１、培養ディッシュ１２とする）を用いて培養する。hAQP4M23 cDNA（配列番号：１）を、発現ベクターｐＥＧＦＰ−Ｎ３のマルチクローニングサイトに挿入したプラスミドを作製する。細胞を播種した翌日、培養ディッシュ１、培養ディッシュ２、培養ディッシュ３、培養ディッシュ４、培養ディッシュ５、培養ディッシュ６に対してLipofectamine 3000を用いてトランスフェクションを行う。また、hAQP4M23 cDNA（配列番号：１）を、発現ベクターpMSCV-IRES-mCherry FPのマルチクローニングサイトに挿入したプラスミドを作製する。細胞を播種した翌日、培養ディッシュ７、培養ディッシュ８、培養ディッシュ９、培養ディッシュ１０、培養ディッシュ１１、培養ディッシュ１２に対してLipofectamine 3000を用いてトランスフェクションを行う。トランスフェクションから４８時間後にフローサイトメトリー測定を行う。

【0151】

２．フローサイトメトリー解析
培養ディッシュ２、培養ディッシュ５、培養ディッシュ８、培養ディッシュ１１に最終濃度０．１μｇ／ｍＬとなるようにHoechst 33342を加え、培養ディッシュ３、培養ディッシュ６、培養ディッシュ９、培養ディッシュ１２に最終濃度５μｇ／ｍＬとなるようにHoechst 33342を加え、３７℃で２０分間のインキュベートを行う。培養ディッシュ１のＣＨＯ−Ｋ１細胞、培養ディッシュ２のＣＨＯ−Ｋ１細胞、培養ディッシュ３のＣＨＯ−Ｋ１細胞、培養ディッシュ４のＣＨＯ−Ｋ１細胞、培養ディッシュ５のＣＨＯ−Ｋ１細胞、培養ディッシュ６のＣＨＯ−Ｋ１細胞、培養ディッシュ７のＣＨＯ−Ｋ１細胞、培養ディッシュ８のＣＨＯ−Ｋ１細胞、培養ディッシュ９のＣＨＯ−Ｋ１細胞、培養ディッシュ１０のＣＨＯ−Ｋ１細胞、培養ディッシュ１１のＣＨＯ−Ｋ１細胞、培養ディッシュ１２のＣＨＯ−Ｋ１細胞を回収し、それぞれの細胞懸濁液が１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調整後、４℃で１時間３０分のインキュベートを行う。

【0152】

その後、培養ディッシュ４のＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液（ＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液４とする）、培養ディッシュ５のＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液（ＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液５とする）、培養ディッシュ６のＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液（ＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液６とする）、培養ディッシュ１０のＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液（ＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液１０とする）、培養ディッシュ１１のＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液（ＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液１１とする）、培養ディッシュ１２のＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液（ＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液１２とする）に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に恒常的に発現している膜タンパク質に対する抗体を加え、４℃で３０分間のインキュベートを行う。抗体はＰＥ−Ｃｙ７によって標識されているものを使用する。培養ディッシュ１のＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液（ＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液１とする）、培養ディッシュ２のＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液（ＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液２とする）、培養ディッシュ３のＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液（ＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液３とする）、培養ディッシュ７のＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液（ＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液７とする）、培養ディッシュ８のＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液（ＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液８とする）、培養ディッシュ９のＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液（ＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液９とする）には何も加えず、引き続き４℃で３０分間のインキュベートを行う。細胞懸濁液として、３％ウシ胎児血清、２ｍＭ ＥＤＴＡを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を用いる。

【0153】

１０^５ｃｅｌｌｓ／１００μＬのＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液１に対して１０μＬの検体者１の血清を加え、１０^５ｃｅｌｌｓ／１００μＬのＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液２に対して１０μＬの検体者２の血清を加え、１０^５ｃｅｌｌｓ／１００μＬのＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液３に対して１０μＬの検体者３の血清を加え、１０^５ｃｅｌｌｓ／１００μＬのＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液４に対して１０μＬの検体者４の血清を加え、１０^５ｃｅｌｌｓ／１００μＬのＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液５に対して１０μＬの検体者５の血清を加え、１０^５ｃｅｌｌｓ／１００μＬのＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液６に対して１０μＬの検体者６の血清を加え、１０^５ｃｅｌｌｓ／１００μＬのＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液７に対して１０μＬの検体者７の血清を加え、１０^５ｃｅｌｌｓ／１００μＬのＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液８に対して１０μＬの検体者８の血清を加え、１０^５ｃｅｌｌｓ／１００μＬのＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液９に対して１０μＬの検体者９の血清を加え、１０^５ｃｅｌｌｓ／１００μＬのＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液１０に対して１０μＬの検体者１０の血清を加え、１０^５ｃｅｌｌｓ／１００μＬのＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液１１に対して１０μＬの検体者１１の血清を加え、１０^５ｃｅｌｌｓ／１００μＬのＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液１２に対して１０μＬの検体者１２の血清を加え、４℃で１５分間のインキュベートを行う。その後、１２種類全ての細胞懸濁液からそれぞれ５０μＬずつ取り、６００μＬの細胞懸濁液を作製する。細胞懸濁液を用いて遠心洗浄を２回行い、二次抗体を加える。二次抗体はAlexa Fluor 647標識抗ヒトＩｇＧ抗体を用い、抗体反応濃度は１：５００を採用する。４℃で３０分間のインキュベートを行った後、２回の遠心洗浄を行い、４８８ｎｍ青レーザー、６４０ｎｍ赤レーザー、５６１ｎｍ黄緑レーザー、３５５ｎｍＵＶレーザーを搭載したベクトン・ディッキンソン社製FACSAriaIIを用いて測定する。

【0154】

死細胞ならびにダブレットを除いたＣＨＯ−Ｋ１細胞画分をＰＥ−Ｃｙ７蛍光強度と側方散乱光で展開し、ＰＥ−Ｃｙ７陰性細胞群とＰＥ−Ｃｙ７陽性細胞群に対するゲートを設定する。死細胞の染色には７−ＡＡＤを用いる。ＰＥ−Ｃｙ７陰性細胞群をHoechst 33342青色蛍光強度と側方散乱光で展開し、Hoechst 33342陰性細胞群、Hoechst 33342弱陽性細胞群、Hoechst 33342強陽性細胞群に対するゲートを設定する。Hoechst 33342陰性細胞群、Hoechst 33342弱陽性細胞群、Hoechst 33342強陽性細胞群をそれぞれＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開し、測定サンプルに含まれるＥＧＦＰ陽性かつAlexa Fluor 647陽性細胞の割合を算出する。

【0155】

ＰＥ−Ｃｙ７陽性細胞群をHoechst 33342青色蛍光強度と側方散乱光で展開し、Hoechst 33342陰性細胞群、Hoechst 33342弱陽性細胞群、Hoechst 33342強陽性細胞群に対するゲートを設定する。Hoechst 33342陰性細胞群、Hoechst 33342弱陽性細胞群、Hoechst 33342強陽性細胞群をそれぞれＥＧＦＰ蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開し、測定サンプルに含まれるＥＧＦＰ陽性かつAlexa Fluor 647陽性細胞の割合を算出する。測定したフローサイトメトリーデータの解析にはＦｌｏｗＪｏを使用する。

【0156】

本明細書には、本発明の好ましい実施態様を示してあるが、そのような実施態様が単に例示の目的で提供されていることは、当業者には明らかであり、当業者であれば、本発明から逸脱することなく、様々な変形、変更、置換を加えることが可能であろう。本明細書に記載されている発明の様々な代替的実施形態が、本発明を実施する際に使用されうることが理解されるべきである。また、本明細書中において参照している特許および特許出願書類を含む、全ての刊行物に記載の内容は、その引用によって、本明細書中に明記された内容と同様に取り込まれていると解釈すべきである。

【産業上の利用可能性】

【0157】

本発明者らは、フローサイトメトリーを用いて簡便かつ高感度に抗体を検出することを可能とする手法を開発した。本発明者らが開発した手法により、抗ＡＱＰ４抗体および抗ＭＯＧ抗体などの複数の抗体を同時に高感度に検出することができる。例えば抗ＡＱＰ４抗体と抗ＭＯＧ抗体の検出は、多発性硬化症、視神経脊髄炎スペクトラム疾患、および抗ＭＯＧ抗体関連疾患／ＭＯＧ抗体疾患の診断に有用な情報を提供しうる。また、本発明者らが開発した手法により、複数の試料中に含まれる抗体の分析を同時に行うことが可能となる。

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図3-4】

【図3-5】

【図3-6】

【図3-7】

【図3-8】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図4-4】

【図4-5】

【図4-6】

【図4-7】

【図4-8】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図5-4】

【図5-5】

【図5-6】

【図5-7】

【図5-8】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】

【図6-5】

【図6-6】

【図6-7】

【図6-8】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図7-4】

【図7-5】

【図7-6】

【図7-7】

【図7-8】

【図8-1】

【図8-2】

【図8-3】

【図8-4】

【図8-5】

【図8-6】

【図8-7】

【図8-8】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【図9-4】

【図9-5】

【図9-6】

【図9-7】

【図9-8】

【図10-1】

【図10-2】

【図10-3】

【図10-4】

【図10-5】

【図10-6】

【図10-7】

【図10-8】

【図11-1】

【図11-2】

【図11-3】

【図11-4】

【図11-5】

【図11-6】

【図12】

【図13】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]