特開 2019-165745 ポリマーベシクルを使用する遺伝子編集ツールを送達するための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2019-165745(P2019-165745A)

(43)【公開日】2019年10月3日

(54)【発明の名称】ポリマーベシクルを使用する遺伝子編集ツールを送達するための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/88 20060101AFI20190906BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20190906BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20190906BHJP

   A61K 47/10 20060101ALI20190906BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20190906BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20190906BHJP

   A61K 38/46 20060101ALI20190906BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20190906BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20190906BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20190906BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20190906BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/88 Z

   A61P43/00 105

   A61K48/00

   A61K47/10

   A61K47/34

   A61K9/10

   A61K38/46

   A61P43/00 121

   A61K31/7105

   C12N15/09 110

   C12N15/63 Z

   C12N15/54

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

【全頁数】32

(21)【出願番号】特願2019-105213(P2019-105213)

(22)【出願日】2019年6月5日

(62)【分割の表示】特願2018-520385(P2018-520385)の分割

【原出願日】2016年7月1日

(31)【優先権主張番号】62/187,942

(32)【優先日】2015年7月2日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/322,346

(32)【優先日】2016年4月14日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】15/199,021

(32)【優先日】2016年6月30日

(33)【優先権主張国】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】518002398

【氏名又は名称】ポセイダ セラピューティクス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ピーター ピー． ゴローチャン

(72)【発明者】

【氏名】ジバン ナンデオ イェウレ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA22

4C076AA95

4C076BB01

4C076BB11

4C076BB13

4C076BB15

4C076BB16

4C076BB22

4C076BB25

4C076BB27

4C076BB29

4C076BB30

4C076BB31

4C076CC26

4C076EE04

4C076EE04F

4C076EE04Q

4C076EE23

4C076EE23F

4C076EE23Q

4C076EE49

4C076EE49F

4C076EE49Q

4C076FF16

4C076FF36

4C076FF63

4C076GG41

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA13

4C084BA44

4C084DC22

4C084MA02

4C084MA23

4C084MA52

4C084MA56

4C084MA57

4C084MA60

4C084MA63

4C084NA03

4C084NA05

4C084NA13

4C084ZB211

4C084ZC751

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA03

4C086MA05

4C086MA23

4C086MA52

4C086MA56

4C086MA57

4C086MA60

4C086MA63

4C086MA66

4C086NA03

4C086NA05

4C086NA13

4C086ZB21

4C086ZC75

(57)【要約】

【課題】ポリマーベシクルを使用する遺伝子編集ツールを送達するための組成物および方法を提供すること。
【解決手段】遺伝子改変のための組成物、およびその組成物を形成する方法。この組成物は、合成ポリマーベシクルと、合成ポリマーベシクル中に封入された遺伝子編集システムとを含み得る。遺伝子編集システムは、タンパク質構成成分と、宿主細胞ゲノム内の標的配列と相互作用するように構成された核酸構成成分とを含み得る。システムおよび方法は、合成ポリマーベシクルおよび合成ポリマーベシクル中に封入された遺伝子編集システムを含む組成物によって遺伝子改変を可能にする。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

本明細書に記載の発明。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

関連出願
本出願は、２０１５年７月２日に出願された米国仮特許出願第62/187,942号、２０１６年４月１４日に出願された米国仮特許出願第62/322,346号、および２０１６年６月３０日に出願された米国通常特許出願第15/199,021号に対する優先権の利益を主張し、これらの全ての出願はそれらの全体が本明細書により参照として援用される。

【0002】

背景
近年、配列特異的ヌクレアーゼの開発に基づいて、ゲノム編集技術の新時代が到来している。特に、かかるヌクレアーゼは、正確なゲノム位置にＤＮＡ二重鎖開裂（ＤＳＢ：ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ）を生じさせるために使用することができ、その後、細胞修復機構を利用してヌクレオチドおよび／または遺伝子をサイレンシングまたは置換する。核酸配列の標的編集は、遺伝子機能の研究にとって非常に有望なアプローチであり、またヒト遺伝性疾患の新しい治療法を提供する可能性を有する。

【0003】

現在の遺伝子編集ツールとして、例えばＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼＣａｓ９が挙げられ、これはゲノム内の配列特異的ＤＮＡ切断をもたらす。特異的ガイドＲＮＡを提供することによりＣａｓ９および他の酵素を任意の配列に方向付け、制御されたＤＮＡ開裂を導入する可能性は、ｉｎ ｖｉｖｏで様々な形でゲノムを潜在的に改変するための強力なツールを提供する。特に、ＤＮＡ中の開裂は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ：ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ）を介した切断部位でのＤＮＡ変異、またはＤＮＡ鋳型を使用して、相同組換え修復（ＨＤＲ：ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ）を介した切断部位の周囲のＤＮＡの置換をもたらし得る。ＨＤＲ鋳型は、ヌクレアーゼが標的とするＤＮＡ配列に所望の遺伝子変化を供給するように設計することができる。

【0004】

それゆえ、これらのツールは、例えば点変異を修正または誘導するためにネイティブＤＮＡについてヌクレオチド塩基を除去、置換、または付加する可能性、およびフレームシフト変異を修正または誘導するためにヌクレオチド塩基を変化させる可能性を提供する。さらに、かかるツールは、１つまたは１つより多くの遺伝子の部分として複数のコドンを含有するＤＮＡ片を除去、挿入、または改変することができ得る。

【0005】

現在、標的細胞に核酸を送達するための機構は、ウイルスベクターの使用を含む。しかしながら、ウイルスに基づく遺伝子送達は、毒性、ＤＮＡまたはＲＮＡの凝集、ペイロードサイズ限界、ならびにコストおよび時間を含むラージスケール生成での困難を含む、制限を有する。

【0006】

ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルスなど）および非ウイルスベクターの両方を使用した機能的ＤＮＡおよびＲＮＡの送達において進展があった。例えば、野生型ＡＡＶは、ウイルスの明らかな病原性の欠落などのいくつかの特徴のために、遺伝子治療研究者の興味を多く引くものであった。また、それは非分裂細胞に感染することができ、宿主細胞ゲノム内のヒト第１９染色体の特異的部位（ＡＡＶＳ１と呼ばれる）に安定的に組み込む能力を有する。この特徴のために、ランダム挿入および変異誘発の脅威を示し、ときにはがんの発症を伴うレトロウイルスよりも、野生型ＡＡＶはいくらか予測可能なものである。ＡＡＶに基づく遺伝子治療ベクターは、宿主細胞核においてエピソームのコンカテマーを形成する。非分裂細胞においては、これらのコンカテマーは、宿主細胞の寿命の間、無傷のままである。分裂細胞においては、エピソームＤＮＡは宿主細胞ＤＮＡに伴って複製されないので、ＡＡＶ ＤＮＡは細胞分裂を通して失われる。宿主ゲノムへのＡＡＶ ＤＮＡのランダム統合は検出可能であるが、非常に低い頻度でしか起こらない。また、ＡＡＶは非常に低い免疫原性しか示さず、外見上、中和抗体の発生に限定されており、一方でそれらは明らかに定義される細胞毒性応答を誘導しない。これらの特徴は、静止状態の細胞に感染する能力と共に、ＡＡＶがヒト遺伝子治療のためのベクターとしてアデノウイルスより優勢であることを示す。しかしながら、また、ウイルスベクター（ＡＡＶを含む）の使用は、いくつかの不利益、特にウイルスゲノムサイズの限定を伴う。例えば、ＡＡＶゲノムはたったの４．８キロベース（ｋｂ）であり、それゆえ様々な実施形態の多数の遺伝子編集ツールの単一媒体送達に使用することができない。

【0007】

遺伝子編集ツールを送達するためのウイルスの使用のさらなる欠点として、分裂細胞のみを標的にすること、宿主ゲノムへのランダム挿入、複製のリスク、および宿主免疫反応の可能性、ならびに特に部位特異的遺伝子修正を達成するために必要とされる多数の様々な遺伝子編集ツールの組み込みを妨げるウイルスキャプシドにより課されるペイロードサイズの限定を挙げることができる。

【0008】

一般的に、非ウイルスベクターは典型的に、製造するのが容易であり、免疫反応を生成しにくく、ウイルスベクターと比較して複製反応を生成しないが、既存の方法は概して、細胞への遺伝子材料のｉｎ ｖｉｖｏ導入に効果的でなく、比較的低い遺伝子発現をもたらした。具体的には、いくつかの既存の非ウイルスシステムは、細胞へのタンパク質および／または核酸の形態の遺伝子編集ツールの送達について最近調査されている。かかるシステムは、広く「ナノカプセル」と分類することができ、ここでは遊離ＤＮＡ／ＲＮＡ／タンパク質のスラリーを、ポリマーペプチド；電荷に基づいて核酸と自己集合させるためにカチオン性両親媒性ポリマーで改変した「脂質に基づく媒体」（例えば、リポソーム、脂質に基づくナノ粒子など）；および細胞内部移行を可能にする標的細胞により発現される特異的タンパク質への結合を介することを含む、核酸を標的にする「バイオコンジュゲート」（例えば、脂質、合成高分子など）で包む。これらの非ウイルスシステムの各々は、単一の送達媒体中に単一または多数の遺伝子編集ツールのいずれかを封入することについてそれ自体の１組の問題を提示する。例えば、ナノカプセルシステムでは、構造が非常に不安定であり、静脈内投与後にその内容物が脈管構造に漏れる場合がある。よって、有効な遺伝子編集に必要な十分な分量の材料構成成分の細胞内送達および放出を達成する性能はありそうにない。脂質に基づく媒体では、荷電した送達システムは、乏しい負荷容量および封入したペイロードの放出困難を示した。バイオコンジュゲートシステムでは、十分なサイズのベクターの使用は、核酸を血流／細胞質ゾル中のヌクレアーゼに直接曝露し、これはペイロードの断片化および破損を引き起こし、効率的な遺伝子編集を達成する能力を取り除く。

【0009】

したがって、標的細胞に、小分子ガイドＲＮＡなどの核酸、ｍＲＮＡなどの核酸、および／またはラージＤＮＡプラスミド、ならびにＣａｓ９などのタンパク質を送達するための有効な媒体が必要とされている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

要旨
システムおよび方法は、合成ポリマーベシクルおよび合成ポリマーベシクル中に封入された遺伝子編集システムを含む組成物によって遺伝子改変を可能にする。一部の実施形態では、遺伝子編集システムは、宿主細胞ゲノム内の標的配列と相互作用するように構成された核酸構成成分を含み得る。一部の実施形態では、遺伝子編集システムは、タンパク質構成成分をさらに含み得る。一部の実施形態では、タンパク質構成成分は、ＲＮＡ指令型ヌクレアーゼを含み得、核酸構成成分は、標的配列に特異的なガイドリボ核酸（ＲＮＡ）を含み得る。一部の実施形態では、核酸構成成分は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）修復鋳型をさらに含み得る。一部の実施形態では、ＲＮＡ指令型ヌクレアーゼは、宿主細胞ゲノムで少なくとも１つの開裂を創出することができ、宿主細胞の修復プロセスは、外因性ＤＮＡ修復鋳型に基づいて宿主細胞ゲノムの少なくとも１つのヌクレオチドの改変を誘発することができ、ここで少なくとも１つのヌクレオチドは、宿主細胞ゲノムの再ライゲーションに組み込まれる。

【0011】

一部の実施形態では、ＤＮＡ修復プロセスは、ＲＮＡ指令型ヌクレアーゼにより誘導された標的配列における二重鎖開裂のいずれかの側の領域に相同なＤＮＡ修復鋳型の領域に基づいて開始され得る。一部の実施形態では、遺伝子編集システムは、合成ポリマーベシクル中に、組成物の総重量に対して少なくとも３重量％の量で含まれ得る。

【0012】

一部の実施形態では、タンパク質構成成分は、ネイティブ形態の酵素を含み得る。一部の実施形態では、タンパク質構成成分は、宿主細胞への送達後に酵素に翻訳されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子を含み得る。一部の実施形態では、タンパク質構成成分は、酵素を発現するための１つまたは１つより多くの遺伝子をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列を含有する発現ベクターとしてであってもよい。一部の実施形態では、核酸構成成分は、ガイドリボ核酸（ＲＮＡ）を発現するための１つまたは１つより多くの遺伝子をコードするＤＮＡ配列であってもよい。

【0013】

一部の実施形態では、酵素およびガイドＲＮＡを発現するための遺伝子をコードするＤＮＡ配列は、単一の発現ベクター上で提供することができる。一部の実施形態では、タンパク質構成成分は、宿主ゲノムのセグメントへの核酸構成成分の結合に基づいて宿主ゲノムを切断するように構成された酵素を含み得る。一部の実施形態では、酵素は、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質９（Ｃａｓ９）である。一部の実施形態では、核酸構成成分は、少なくとも１つのトランスポゾンを含む発現ベクターを含み、タンパク質構成成分は、トランスポサーゼ剤を含む。一部の実施形態では、トランスポサーゼ剤は、ネイティブ酵素、宿主細胞への送達後に酵素に翻訳されるメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分子、および酵素を発現するための１つまたは１つより多くの遺伝子をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列の１つであってもよい。一部の実施形態では、酵素を発現するための遺伝子をコードするＤＮＡ配列は、トランスポゾンを含む発現ベクター上で提供してもよい。

【0014】

一部の実施形態では、合成ポリマーベシクルは、ポリ（エチレンオキシド）を含有する親水性ブロックと、疎水性ブロックとを含む、少なくとも１つのブロックコポリマーから発生させることができる。一部の実施形態では、疎水性ブロックは、脂肪族ポリ（無水物）、ポリ（核酸）、ポリ（エステル）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ペプチド）、ポリ（ホスファゼン）、および多（糖類）から選択することができる。一部の実施形態では、疎水性ブロックは、ポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、またはポリ（トリメチレンカーボネート）（ＰＴＭＣ）の１つまたは１つより多くを含み得る。

【0015】

様々な実施形態における宿主細胞ゲノムを改変するためのシステムおよび方法は、ポリマーソーム中に、タンパク質構成成分および核酸構成成分を含む遺伝子編集システムを封入することと、封入された遺伝子編集システムを宿主細胞に送達することとを含み得る。一部の実施形態では、核酸構成成分は、宿主細胞内の標的核酸配列と相互作用するように構成されてもよい。一部の実施形態では、ポリマーソームは、宿主細胞内で遺伝子編集システムを選択的に放出するように構成される。

【0016】

実施形態の方法はさらに、封入された遺伝子編集システムを含有する有効量の組成物を被験体に投与することにより、封入された遺伝子編集システムを宿主細胞に送達することを含み得る。一部の実施形態では、封入された遺伝子編集システムは、逐次飽和（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）プロトコールを使用して調製することができる。

【0017】

様々な実施形態における封入された遺伝子編集組成物の懸濁液を製造するシステムおよび方法は、ある分量のブロックコポリマーをある分量の低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と熱ブレンド（ｔｈｅｒｍａｌｌｙ ｂｌｅｎｄｉｎｇ）して、ＰＥＧ／ポリマー配合物を創出することと、遺伝子編集組成物溶液の一定分量をＰＥＧ／ポリマー配合物を含有する試料に添加することと、発生したポリマーソームが遺伝子編集組成物で逐次飽和されるように少なくとも１回の希釈ステップを行うこととを含み得る。一部の実施形態では、遺伝子編集組成物は、タンパク質構成成分と、宿主細胞ゲノム内の標的配列と相互作用するように構成された核酸構成成分とを含み得る。

【0018】

一部の実施形態では、ブロックコポリマーは、両親媒性ジブロックコポリマーを含み得る。一部の実施形態では、両親媒性ジブロックコポリマーは、ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（ブタジエン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ）を含み得る。一部の実施形態では、発生したポリマーソームは、遺伝子編集組成物に対して少なくとも５０％の封入効率を有し得る。

【0019】

様々な実施形態におけるシステムは、合成ポリマーベシクル中に封入された遺伝子編集システムを有する医薬組成物と、医薬組成物を静脈内に、吸入により、局所的に、経直腸的に、経膣的に、経皮的に、皮下に、腹腔内に、髄腔内に（intrathecally）、筋内に、
または経口で投与するための器具とを含むキットとして実行することができる。一部の実施形態では、遺伝子編集システムは、タンパク質構成成分と、宿主細胞ゲノム内の標的配列と相互作用するように構成された核酸構成成分とを含み得る。

【図面の簡単な説明】

【0020】

添付の図面は、本明細書に組み込まれ、本明細書の部分を構成し、例示的な実施形態を示し、様々な実施形態の説明と共に、本明細書中の特徴を説明する働きをする。

【0021】

【図1】図１は、２つのポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（ブタジエン）（すなわち、ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ）ジブロックコポリマー、および様々なナノ粒子封入に使用されるそれらのポリマーソーム配合物についての、特性の表である。

【0022】

【図2A】図２Ａおよび２Ｂは、逐次飽和プロトコールの使用から得た、モデルタンパク質（ミオグロビン）、または伸長因子１アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーターを使用する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現のための哺乳動物ＤＮＡベクターをコードするプラスミドＤＮＡ（すなわち、ｐＥＦ−ＧＦＰ ＤＮＡ）の、特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物から形成したポリマーソームへの共封入を示すグラフである。

【図2B】図２Ａおよび２Ｂは、逐次飽和プロトコールの使用から得た、モデルタンパク質（ミオグロビン）、または伸長因子１アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーターを使用する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現のための哺乳動物ＤＮＡベクターをコードするプラスミドＤＮＡ（すなわち、ｐＥＦ−ＧＦＰ ＤＮＡ）の、特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物から形成したポリマーソームへの共封入を示すグラフである。

【0023】

【図2C】図２Ｃ〜２Ｅは、逐次飽和プロトコールの使用から得た、モデルタンパク質（ミオグロビン）、および伸長因子１アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーターを使用する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現のための哺乳動物発現ベクターをコードするプラスミドＤＮＡ（すなわち、ｐＥＦ−ＧＦＰ ＤＮＡ）の、特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物から形成した同じポリマーソーム構築物への共封入を示すグラフである。

【図2D】図２Ｃ〜２Ｅは、逐次飽和プロトコールの使用から得た、モデルタンパク質（ミオグロビン）、および伸長因子１アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーターを使用する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現のための哺乳動物発現ベクターをコードするプラスミドＤＮＡ（すなわち、ｐＥＦ−ＧＦＰ ＤＮＡ）の、特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物から形成した同じポリマーソーム構築物への共封入を示すグラフである。

【図2E】図２Ｃ〜２Ｅは、逐次飽和プロトコールの使用から得た、モデルタンパク質（ミオグロビン）、および伸長因子１アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーターを使用する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現のための哺乳動物発現ベクターをコードするプラスミドＤＮＡ（すなわち、ｐＥＦ−ＧＦＰ ＤＮＡ）の、特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物から形成した同じポリマーソーム構築物への共封入を示すグラフである。

【0024】

【図3A】図３Ａ〜３Ｅは、薄膜水和プロトコールの使用から得た、モデルタンパク質（ミオグロビン）およびｐＥＦ−ＧＦＰ ＤＮＡの、特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物から形成した同じポリマーソーム構築物への共封入を示すグラフである。

【図3B】図３Ａ〜３Ｅは、薄膜水和プロトコールの使用から得た、モデルタンパク質（ミオグロビン）およびｐＥＦ−ＧＦＰ ＤＮＡの、特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物から形成した同じポリマーソーム構築物への共封入を示すグラフである。

【図3C】図３Ａ〜３Ｅは、薄膜水和プロトコールの使用から得た、モデルタンパク質（ミオグロビン）およびｐＥＦ−ＧＦＰ ＤＮＡの、特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物から形成した同じポリマーソーム構築物への共封入を示すグラフである。

【図3D】図３Ａ〜３Ｅは、薄膜水和プロトコールの使用から得た、モデルタンパク質（ミオグロビン）およびｐＥＦ−ＧＦＰ ＤＮＡの、特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物から形成した同じポリマーソーム構築物への共封入を示すグラフである。

【図3E】図３Ａ〜３Ｅは、薄膜水和プロトコールの使用から得た、モデルタンパク質（ミオグロビン）およびｐＥＦ−ＧＦＰ ＤＮＡの、特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物から形成した同じポリマーソーム構築物への共封入を示すグラフである。

【0025】

【図4A】図４Ａ〜４Ｅは、逐次飽和プロトコールの使用から得た、モデルタンパク質ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）およびｐＥＦ−ＧＦＰ ＤＮＡの、特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物から形成した同じポリマーソーム構築物への共封入を示すグラフである。

【図4B】図４Ａ〜４Ｅは、逐次飽和プロトコールの使用から得た、モデルタンパク質ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）およびｐＥＦ−ＧＦＰ ＤＮＡの、特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物から形成した同じポリマーソーム構築物への共封入を示すグラフである。

【図4C】図４Ａ〜４Ｅは、逐次飽和プロトコールの使用から得た、モデルタンパク質ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）およびｐＥＦ−ＧＦＰ ＤＮＡの、特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物から形成した同じポリマーソーム構築物への共封入を示すグラフである。

【図4D】図４Ａ〜４Ｅは、逐次飽和プロトコールの使用から得た、モデルタンパク質ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）およびｐＥＦ−ＧＦＰ ＤＮＡの、特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物から形成した同じポリマーソーム構築物への共封入を示すグラフである。

【図4E】図４Ａ〜４Ｅは、逐次飽和プロトコールの使用から得た、モデルタンパク質ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）およびｐＥＦ−ＧＦＰ ＤＮＡの、特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物から形成した同じポリマーソーム構築物への共封入を示すグラフである。

【0026】

【図5A】図５Ａ〜５Ｃは、逐次飽和プロトコールの使用から得た、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓからの機能的Ｃａｓ９タンパク質の、特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物から形成したポリマーソームへの封入を示すグラフである。

【図5B】図５Ａ〜５Ｃは、逐次飽和プロトコールの使用から得た、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓからの機能的Ｃａｓ９タンパク質の、特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物から形成したポリマーソームへの封入を示すグラフである。

【図5C】図５Ａ〜５Ｃは、逐次飽和プロトコールの使用から得た、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓからの機能的Ｃａｓ９タンパク質の、特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物から形成したポリマーソームへの封入を示すグラフである。

【0027】

【図6A】図６Ａ〜６Ｅは、逐次飽和プロトコールの使用から得た、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓからの機能的Ｃａｓ９タンパク質およびｐＥＦ−ＧＦＰ ＤＮＡの、特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物から形成した同じポリマーソーム構築物への共封入を示すグラフである。

【図6B】図６Ａ〜６Ｅは、逐次飽和プロトコールの使用から得た、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓからの機能的Ｃａｓ９タンパク質およびｐＥＦ−ＧＦＰ ＤＮＡの、特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物から形成した同じポリマーソーム構築物への共封入を示すグラフである。

【図6C】図６Ａ〜６Ｅは、逐次飽和プロトコールの使用から得た、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓからの機能的Ｃａｓ９タンパク質およびｐＥＦ−ＧＦＰ ＤＮＡの、特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物から形成した同じポリマーソーム構築物への共封入を示すグラフである。

【図6D】図６Ａ〜６Ｅは、逐次飽和プロトコールの使用から得た、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓからの機能的Ｃａｓ９タンパク質およびｐＥＦ−ＧＦＰ ＤＮＡの、特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物から形成した同じポリマーソーム構築物への共封入を示すグラフである。

【図6E】図６Ａ〜６Ｅは、逐次飽和プロトコールの使用から得た、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓからの機能的Ｃａｓ９タンパク質およびｐＥＦ−ＧＦＰ ＤＮＡの、特定のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ配合物から形成した同じポリマーソーム構築物への共封入を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0028】

詳細な説明
遺伝子改変のための実施形態の組成物は、合成ポリマーベシクル、および合成ポリマーベシクル中に封入された遺伝子編集システムを含むように調製することができ、ここで遺伝子編集システムは、宿主細胞ゲノム内の標的配列と相互作用するように構成された核酸構成成分を含む。一実施形態では、また、遺伝子編集システムは、タンパク質構成成分を含み得る。一実施形態では、タンパク質構成成分は、リボ核酸（ＲＮＡ）指令型ヌクレアーゼであってもよく、核酸構成成分は、標的配列に相補的なガイドＲＮＡであってもよい。一実施形態では、また、核酸構成成分は、外因性デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）修復鋳型を含んでもよく、ＲＮＡ指令型ヌクレアーゼは、標的配列に隣接する宿主細胞ゲノムで二重鎖開裂を創出するように構成されてもよい。一実施形態では、宿主細胞の修復プロセスは、宿主細胞ゲノムの再ライゲーション中に、外因性ＤＮＡ修復鋳型に基づいて宿主細胞ゲノムの改変を誘発し得る。一実施形態では、ＤＮＡ修復鋳型は、ＲＮＡ指令型ヌクレアーゼにより誘導される二重鎖開裂に隣り合った宿主細胞ゲノムの領域に相同な末端領域を有し得る。一実施形態では、遺伝子編集システムは、合成ポリマーベシクル中に、組成物の総重量に対して少なくとも３重量％の量で含まれ得る。一実施形態では、タンパク質構成成分は、ネイティブ形態の酵素、または宿主細胞への送達後に酵素に翻訳されるように構成されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子であってもよい。一実施形態では、タンパク質構成成分は、酵素をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列を含有する発現ベクターとして送達することができる。一実施形態では、核酸構成成分は、ガイドリボ核酸（ＲＮＡ）をコードするＤＮＡ配列であってもよい。一実施形態では、酵素およびガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、単一の発現ベクター上で提供することができる。一実施形態では、タンパク質構成成分は、宿主ゲノムの相補的セグメントへの核酸構成成分の結合に基づいて宿主ゲノムを切断するように構成された酵素であってもよい。一実施形態では、酵素は、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質９（Ｃａｓ９）であってもよい。一実施形態では、核酸構成成分は、トランスポゾンを含む発現ベクターであってもよく、タンパク質構成成分は、トランスポサーゼであってもよい。一実施形態では、トランスポサーゼは、ネイティブ酵素、宿主細胞への送達後に酵素に翻訳されるように構成されたメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分子、および酵素をコードするＤＮＡ配列の１つであってもよい。一実施形態では、ＤＮＡ配列は、トランスポゾンを含む発現ベクター上で提供することができる。一実施形態では、合成ポリマーベシクルは、ポリ（エチレンオキシド）を有する親水性ブロックと、疎水性ブロックとを含む、少なくとも１つのブロックコポリマーから発生させることができる。一実施形態では、疎水性ブロックは、脂肪族ポリ（無水物）、ポリ（核酸）、ポリ（エステル）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ペプチド）、ポリ（ホスファゼン）、および多（糖類）から選択することができる。一実施形態では、疎水性ブロックは、ポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、またはポリ（トリメチレンカーボネート）（ＰＴＭＣ）の１つまたは１つより多くを含み得る。

【0029】

一実施形態では、宿主細胞ゲノムを改変する方法は、ポリマーソーム中に、遺伝子編集システムを封入することと、封入された遺伝子編集システムを宿主細胞に送達することとを含み得、ここでポリマーソームは、宿主細胞内で遺伝子編集システムを選択的に放出するように構成される。一実施形態では、遺伝子編集システムは、タンパク質構成成分と、宿主細胞内の標的核酸配列と相互作用するように構成された核酸構成成分とを含み得る。一実施形態では、封入された遺伝子編集システムの宿主細胞への送達は、封入された遺伝子編集システムを含有する有効量の組成物を被験体に投与することにより行うことができる。一実施形態では、封入された遺伝子編集システムは、逐次飽和プロトコールを使用して調製することができる。一実施形態では、封入された遺伝子編集組成物懸濁液の製造は、ある分量のブロックコポリマーをある分量の低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と熱ブレンドして、ＰＥＧ／ポリマー配合物を創出することと、遺伝子編集組成物溶液の一定分量をＰＥＧ／ポリマー配合物を含有する試料に添加することと、発生したポリマーソームが遺伝子編集組成物で逐次飽和されるように少なくとも１回の希釈ステップを行うこととを含み得る。一実施形態では、遺伝子編集組成物は、タンパク質構成成分と、宿主細胞ゲノム内の標的配列と相互作用するように構成された核酸構成成分とを含み得る。一実施形態では、ブロックコポリマーは、両親媒性ジブロックコポリマーであってもよい。一実施形態では、両親媒性ジブロックコポリマーは、ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（ブタジエン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ）であってもよい。一実施形態では、発生したポリマーソームは、遺伝子編集組成物に対して少なくとも５０％の封入効率を有する。

【0030】

様々な実施形態を、添付の図面を参照して詳細に説明する。可能である場合は、同じまたは同様の部分について言及するために、図面全体を通して同じ参照番号を使用する。特定の実施例および実行についてなされた参照は、例示の目的のためであり、特許請求の範囲を限定することを意図しない。

【0031】

明らかにするために別々の実施形態に関して本明細書で説明されるある特定の特徴は、また、単一の実施形態で組合せにて提供され得ることが理解されるべきである。逆に、簡潔にするために単一の実施形態に関して説明される様々な特徴は、また、別々にまたは任意の下位の組合せで、提供することができる。さらに、範囲で示される値の参照は、その範囲内のありとあらゆる値を含む。

【0032】

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容が明らかに別に規定しない限り、複数の指示物を含む。

【0033】

「複数」という単語は、本明細書では、１つより多くを意味するために使用される。ある範囲の値が表される場合、別の実施形態は、１つの特定の値からおよび／または他の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表される場合、先行詞「約」の使用により、特定の値は別の実施形態を形成することが理解される。全ての範囲は、包括的かつ組み合わせ可能である。

【0034】

「被験体」および「患者」という用語は、ヒト患者を指すために本明細書で相互変換可能に使用されるが、「被験体」という用語は、また、任意の動物を指すこともある。様々な実施形態で、被験体は哺乳動物、非ヒト動物、イヌ、および／または脊椎動物であり得ることを理解するべきである。

【0035】

「モノマー単位」という用語は、本明細書では、モノマーの１つとして、同じまたは同様の数の原子を含有するポリマー分子の単位を意味するために使用される。モノマー単位は、本明細書で使用される場合、単一の種類（同種）または様々な種類（異種）のものであってもよい。

【0036】

「ポリマー」という用語は、接続されたモノマー分子を含む高分子の通常の意味に従って使用される。

【0037】

「両親媒性」という用語は、本明細書では、極性（水溶性）群および疎水性（水不溶性）群の両方を含有する物質を意味するために使用される。

【0038】

「有効量」という用語は、本明細書では、特定の生物学的結果、例えば、これらだけには限らないが、本明細書で開示、説明、または例示される生物学的結果を達成するために有効な、化合物、材料、または組成物の量を指すために使用される。かかる結果として、当技術分野で好適な任意の手段により決定される、本明細書で挙げる疾患状態のいずれかと関連付けられる症状の有効な低減が挙げられ得るが、これに限定されない。当業者に認識されるように、薬剤、例えばヌクレアーゼ、インテグラーゼ、トランスポサーゼ、リコンビナーゼ、ハイブリッドタンパク質、融合タンパク質、タンパク質ダイマー、タンパク質（またはタンパク質ダイマー）およびポリヌクレオチドの複合体、またはポリヌクレオチドの有効量は、例えば所望の生物学的応答；標的にされる特異的対立遺伝子、ゲノム、標的部位、細胞、または組織；および使用される薬剤などの様々な因子によって変動し得る。

【0039】

「膜」という用語は、本明細書では、三次元空間内で二次元表面を画定し、したがって少なくとも局所的な意味で１つの空間を別の空間から分離する分子の空間的に明確な集合を意味するために使用される。

【0040】

「活性剤」という用語は、本明細書では、それが導入された生物学的システムをはっきりと変えるか、またはこれに影響を及ぼす任意のタンパク質、ペプチド、糖、糖類、ヌクレオシド、無機化合物、脂質、核酸、小合成化学化合物、または有機化合物を指すために使用される。

【0041】

「媒体」という用語は、本明細書では、固有の治療有益性を有しないが、細胞への送達の目的のために活性剤と組み合わされた場合、生成物の有効性および安全性を改善する利益ならびに患者の利便性および服薬遵守のために、これらだけには限らないが、活性剤のｉｎ ｖｉｖｏ送達の機構または様式、その濃度、バイオアベイラビリティ、吸収、分布、および排除を含む、活性剤の特性の改変をもたらす剤を指すために使用される。

【0042】

「担体」という用語は、本明細書では、薬物送達の目的のために薬学的活性剤を組み込むために使用される送達媒体を説明するために使用される。

【0043】

「ホモポリマー」という用語は、本明細書では、１つのモノマー種のポリマーに由来するポリマーを指すために使用される。

【0044】

「コポリマー」という用語は、本明細書では、１つのモノマーのみが使用されるホモポリマーとは対照的に、２つ（または２つより多く）のモノマー種のポリマーに由来するポリマーを指すために使用される。コポリマーは少なくとも２つの種の構成要素単位（また、構造単位）からなるので、コポリマーはこれらの単位がどのように鎖に沿って配置されるかに基づいて分類することができる。

【0045】

「ブロックコポリマー」という用語は、本明細書では、共有結合により連結した２つまたは２つより多くのホモポリマーサブユニットを含み、ホモポリマーサブユニットの連合は、接合ブロックとして公知の中間非繰返しサブユニットを必要とし得る、コポリマーを指すために使用される。２つまたは３つの別個のブロックを有するブロックコポリマーは、本明細書では、それぞれ「ジブロックコポリマー」および「トリブロックコポリマー」と呼ばれる。

【0046】

「負荷容量」という用語は、本明細書では、担体の総重量で割った担体内の特定の化合物の重量を指すために使用される。「封入効率」および「負荷効率」という用語は、本明細書では、封入前の溶液中の元の化合物の重量で割った、担体懸濁液内に封入され、および／または組み込まれた特定の化合物の重量（％として表される）を指すために相互変換可能に使用される。

【0047】

「核酸」および「核酸構成成分」という用語は、本明細書では、核酸塩基および酸性部分を有する化合物、例えばヌクレオシド、ヌクレオチド、またはヌクレオチドのポリマーを指すために相互変換可能に使用される。典型的に、ポリマー核酸、例えば３つまたは３つより多くのヌクレオチドを含む核酸構成成分は直鎖分子であり、ここで隣接するヌクレオチドはホスホジエステルまたはホスホロチオエート連結を介して互いに連結される。一部の実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基（例えばヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を指す。一部の実施形態では、「核酸」は、３つまたは３つより多くの個々のヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドのポリマー（例えば少なくとも３つのヌクレオチドのストリング）を指すために相互変換可能に使用することができる。一部の実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡならびに一本鎖および／または二本鎖ＤＮＡを包含する。核酸は、例えばゲノム、転写産物、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、プラスミド、コスミド、染色体、染色分体に関して天然であるか、または他の天然核酸構成成分であってもよい。他方で、核酸構成成分は、非天然分子、例えば組換えＤＮＡもしくはＲＮＡ、人工染色体、遺伝子操作したゲノムもしくはその断片、または合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであってもよく、または非天然ヌクレオチドもしくはヌクレオシドを含んでもよい。さらに、「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」という用語、および／または同様の用語は、核酸アナログ、例えばホスホロチオエート連結を含むホスホジエステル骨格以外を有するアナログを含む。

【0048】

核酸は、天然源から精製してもよく、組換え発現系を使用して生成してもよく、任意選択で精製、化学合成などをしてもよい。適切な場合、例えば化学合成分子の場合、核酸は、ヌクレオシドアナログ、例えば化学修飾塩基または糖および骨格改変を有するアナログを含み得る。核酸配列は、別に示されない限り、５’〜３’方向で示される。一部の実施形態では、核酸は、天然ヌクレオシド（例えばアデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）；ヌクレオシドアナログ（例えば２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および２−チオシチジン）；化学修飾塩基；生物学的に改変した塩基（例えばメチル化塩基）；挿入塩基（intercalated base）；修飾糖（例えば２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；および／または修飾ホスフェート基（例えばホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホロアミダイト連結）であるか、またはこれらを含む。

【0049】

「ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ」および「ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ」という用語は、本明細書で相互変換可能に使用され、切断の標的ではない１つまたは１つより多くのＲＮＡと複合体を形成する（例えばこれと結合または会合する）ヌクレアーゼを指す。例のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、（ＣＲＩＳＰＲ関連システム）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ＲＮＡとの複合体である場合、ヌクレアーゼ：ＲＮＡ複合体と呼ばれることもある。典型的に、結合したＲＮＡ（複数可）は、ガイドＲＮＡと呼ばれる。ガイドＲＮＡは、２つもしくは２つより多くのＲＮＡの複合体として、または単一のＲＮＡ分子として存在し得る。単一のＲＮＡ分子として存在するガイドＲＮＡは単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と呼ばれることもあるが、「ガイドＲＮＡ」および「ｇＲＮＡ」という用語は、単一の分子または２つもしくは２つより多くの分子の複合体のいずれかとして存在するガイドＲＮＡを指すために本明細書で相互変換可能に使用することができる。典型的に、単一のＲＮＡ種として存在するガイドＲＮＡは、２つのドメイン：（１）標的核酸へのホモロジーを共有する（例えば、そして、標的へのＣａｓ９複合体の結合を指示する）ドメイン；および（２）Ｃａｓ９タンパク質に結合するドメインを含む。一部の実施形態では、ドメイン（２）は、ｔｒａｃｒＲＮＡとして公知の配列に対応し、ステム−ループ構造を含む。例えば、一部の実施形態では、ドメイン（２）は、ｔｒａｃｒＲＮＡに相同である。ガイドＲＮＡは、標的部位に相補的であり、標的部位へのヌクレアーゼ／ＲＮＡ複合体の結合を媒介し、ヌクレアーゼ：ＲＮＡ複合体の配列特異性を提供するヌクレオチド配列を含む。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）はＤＮＡ切断部位を標的にするためにＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションを使用するので、これらのタンパク質は、原理的に、ガイドＲＮＡにより特定されるどんな配列も標的にすることができる。

【0050】

「処置」、「処置する」、および「処置すること」という用語は、本明細書で説明する疾患もしくは障害の進行またはその１つもしくは１つより多くの症状を退行させ、緩和し、その発症を遅延させ、または阻害することを目的とした臨床的介入を指す。本明細書で使用される場合、「処置」、「処置する」、および「処置すること」という用語は、本明細書で説明する疾患もしくは障害の進行またはその１つもしくは１つより多くの症状を退行させ、緩和し、その発症を遅延させ、または阻害することを目的とした臨床的介入を指す。一部の実施形態では、処置は、１つもしくは１つより多くの症状が発現した後および／または疾患が診断された後に投与することができる。他の実施形態では、処置は、例えば疾患の症状の発症を防ぐか、もしくは遅延させるか、または疾患の発症もしくは進行を阻害するために、症状の非存在下で投与することができる。例えば、処置は、症状の発症前に（例えば症状歴に照らして、および／または遺伝的因子もしくは他の易罹患性因子に照らして）かかりやすい個体に投与することができる。また、処置は、症状が消散した後に、例えばそれらの再発を防ぐか、または遅延させるために継続することができる。

【0051】

ＤＮＡにおける二重鎖開裂（ＤＳＢ）の正確かつ効率的な修復は、細胞においてゲノム安定性を維持するために重要である。ＤＮＡへの構造的損傷は、いくつかの細胞内因子（例えばヌクレアーゼ、活性酸素種など）および外力（例えば電離放射線、紫外線（ＵＶ）照射など）のいずれかのために、ゲノム内でランダムかつ予測不能に起こり得る。特に、ＤＮＡにおける二重鎖開裂（ＤＳＢ）の正確かつ効率的な修復は、ゲノム安定性を維持するために重要である。したがって、細胞は天然にいくつかのＤＮＡ修復機構を保有し、これは特異的部位で制御されたＤＳＢを通してＤＮＡ配列を変えるために活用することができる。それゆえ、遺伝子改変ツールは、ゲノムにＤＳＢを導入する、非特異的ＤＮＡヌクレアーゼを伴うプログラム可能な配列特異的ＤＮＡ結合モジュールからなることができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲは、ほとんどが細菌で発見され、短い直接反復を含有する座であり、外因性配列、例えばプラスミドおよびファージに対する抵抗性を与える、原核生物獲得免疫系の部分である。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、原核生物の先天性免疫の構成成分であるＣＲＩＳＰＲ／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）システムから適合されたプログラム可能な遺伝子工学ツールである。

【0052】

真核生物細胞では、ＤＳＢの機構的修復は、主に２つの経路：非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換え修復（ＨＤＲ）によって起こる。ＮＨＥＪは、２つの末端の再ライゲーションで１個または数個のみの相補的塩基の整列を必要とするホモロジー独立経路である。ＨＤＲは、典型的にＤＳＢ修復のより正確な機構であり、ＤＮＡ開裂を修復するためにより長いストレッチの配列ホモロジーを使用する。具体的には、様々なＨＤＲ経路は、相同性ドナー（例えば姉妹染色分体、プラスミド、オリゴヌクレオチド（すなわち、オリゴ−ＤＮＡ）など）の使用により特徴付けられる。ＨＤＲでは、ＤＳＢ修復は、開裂で５’末端ＤＮＡ鎖を切除して、３’突出末端を創出することを含む。続いて、３’一本鎖ＤＮＡ（すなわち、３’突出末端）は、相同ＤＮＡ二重鎖に侵入し、１つの鎖に代わり、他方と対を形成して、ヘテロ二重鎖ＤＮＡおよび置換されたＤＮＡの一本鎖の領域からなる置換ループ（Ｄループ）構造を創出する。最後に、組換え中間体は解離して、ＤＮＡ修復を完了する。

【0053】

修復を完了するための異なる解離を提供する２つの特定のＨＤＲ経路は、二重鎖切断修復（ＤＳＢＲ：ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ ｒｅｐａｉｒ）および合成依存性単鎖アニーリング（ＳＤＳＡ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｔｒａｎｄ ａｎｎｅａｌｉｎｇ）を含む。ＤＳＢＲ経路では、３’突出末端は、無傷の相同鋳型に侵入し、ＤＮＡ修復合成のためのプライマーとして働く。Ｄ−ループは、侵入鎖の３’末端からの新規ＤＮＡ合成の開始、またはヘリカーゼ活性により延長することができ、これにより、ＤＳＢの反対側の３’突出末端はアニーリングし得、したがって二重「ホリデー接合」（ｄＨＪ）中間体を形成し得る。あるいは、また、両方のＤＳＢ末端からの２つの独立した鎖侵入、続いて同時のＤＮＡ合成およびアニーリングは、ｄＨＪ中間体をもたらし得る。組換えが１つの末端に依存するか、両方が鎖侵入を受けるかについての実験的証拠は不明である。これらのｄＨＪは、いくつかのＨＪレゾルバーゼの１つにより切断することができ、どちらの鎖対が切断されるかによって、非交叉（すなわち、同じ分子上の全て新しく合成された配列）または交叉（各分子上の新しい配列と古い配列との組合せ）結果を産出し得る。切断の代わりに、ｄＨＪは、「解離され」て、排他的に非交叉結果を産出し得る。

【0054】

ＳＤＳＡ経路は保存的であり、排他的に非交叉事象をもたらす。ＳＤＳＡ経路では、ＳＤＳＡにおける鎖侵入およびＤ−ループ形成に続いて、侵入鎖の新たに合成された部分は、鋳型から排され、他のＤＳＢ末端で非侵入鎖のプロセスされた末端に戻る。非侵入鎖の３’末端は、ギャップを満たすように伸長およびライゲーションされ、このようにしてＳＤＳＡを完了する。

【0055】

ポリマーソームは、ナノメートルの寸法（直径５０〜３００ｎｍ）で形成され、細胞酸素担体としてのいくつかの好ましい特性を示す、合成ポリマーベシクルである。例えば、ポリマーソームは、自己集合を通して生成することができ、それらの水性核内に親水性化合物、例えばヘモグロビン（Ｈｂ）およびミオグロビン（Ｍｂ）を封入することができる、二層および複数層のベシクルのクラスに属する。さらに、ポリマーソームは、完全生分解性ＦＤＡ承認構成成分から設計され、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは急性ｉｎ ｖｉｖｏ毒性を示さない、いくつかの選択肢を提供する。

【0056】

ポリマーソームは、リポソームおよび他のナノ粒子に基づく送達媒体に優るいくつかの優れた特性を示し、このため様々な分子の有効な担体である。例えば、それらの構成成分コポリマーブロックの構造によって、ポリマーソーム膜は、リポソームの膜（３〜４ｎｍ）より顕著に厚く（約９〜２２ｎｍ）なることができ、そのため、リポソームより５〜５０倍機械的に頑丈であり、少なくとも１０倍透水性が低い。ポリマーソームの循環半減期は、１．２〜３．７ｋＤａの範囲のポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）ブラシを有するものでは、同様のサイズのポリ（エチレングリコール）に基づくリポソーム（ＰＥＧリポソーム）の循環半減期（約２４〜４８時間）と類似し、さらに混成構築ブロックとして様々なコポリマーを使用することにより具体的に合わせることができる。ポリマーソームは、ベシクルサイズおよびモルホロジーにおける任意の変化を受けることなく、ｉｎ ｓｉｔｕで数ヵ月間、および十分に混合された準生理学的条件下の血漿中で数日間安定であることが示されている。それらは、最大６０℃まで表面内熱転移を示さない。加えて、ドキソルビシンを封入した、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬおよびポリ（エチレン−オキシド）−ブロック−ポリ（ブタジエン）−（ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ−）に基づくポリマーソーム配合物についての初期の動物研究は、急性または亜急性毒性を示さなかった。最後に、ポリマーソームの生成および保存は、経済的である。ポリマーソームは、製造後の費用のかかる精製プロセスを必要とすることなく、ラージスケールで容易に生成および保存することができる。

【0057】

有望な生分解性ポリマーソーム封入タンパク質配合物は、これらだけには限らないが、ポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、およびポリ（トリメチレンカーボネート）（ＰＴＭＣ）を含む、ＰＥＧと化学的に同義の（本明細書で相互変換可能に使用される）親水性生体適合性ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、ポリ（核酸）、ポリ（エステル）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ペプチド）、ポリ（ホスファゼン）、および多（糖類）からなるブロックコポリマーからなってもよい。１００％ＰＥＧ化表面からなるポリマーソームは、改善されたｉｎ ｖｉｔｒｏ化学的安定性、増強されたｉｎ ｖｉｖｏバイオアベイラビリティ、および延長された血液循環半減期を有する。例えば、ポリマーソームの膜部分を構成する脂肪族ポリエステルは、生理学的条件下で、例えばヒト体内で、それらのエステル結合の加水分解により分解される。それらの生分解性の性質のために、脂肪族ポリエステルは、薬物送達デバイスにおける移植可能な生体材料、生体再吸収可能な縫合糸、癒着防止剤として、および組織工学による傷害修復のための足場としての使用について多くの注目を集めている。

【0058】

様々な実施形態では、遺伝子編集に必要とされる分子（すなわち、遺伝子編集ツール）は、単一のポリマーソーム担体を使用して細胞に送達することができる。「遺伝子編集」という用語は、本明細書で使用される場合、遺伝子によりコードされる生成物の機能を付加、破壊、または調節するための、ゲノムＤＮＡ内の核酸の挿入、欠失、または置換を指す。様々な遺伝子編集システムは、最低限、ゲノムＤＮＡを切断して遺伝子機能を破壊または活性化する切断酵素（例えばヌクレアーゼまたはリコンビナーゼ）の導入を必要とする。さらに、新規または既存のヌクレオチド／核酸の挿入に関する遺伝子編集システムでは、挿入ツール（例えばＤＮＡ鋳型ベクター、トランスポゾン、またはレトロトランスポゾン）が、切断酵素（例えばヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、インテグラーゼ、またはトランスポサーゼ）に加えて細胞に送達されなければならない。リコンビナーゼのためのかかる挿入ツールの例として、ＤＮＡベクターが挙げられ得る。ヌクレアーゼについては、挿入ツールの例として、（新規合成ヌクレオチドを挿入するための）ＨＤＲのための鋳型ＤＮＡが挙げることができ；他の遺伝子編集システムは、インテグラーゼの送達に挿入ベクターが伴い、トランスポサーゼにトランスポゾン／レトロトランスポゾンが伴うことなどを必要とする。一部の実施形態では、切断酵素として使用され得るリコンビナーゼの例は、ＣＲＥリコンビナーゼである。様々な実施形態では、挿入ツールで使用され得るインテグラーゼの例として、いくつかのウイルス（例えばＡＡＶ、ガンマレトロウイルス、レンチウイルスなど）のいずれかから取られたウイルスに基づく酵素が挙げられる。挿入ツールで使用され得るトランスポゾン／レトロトランスポゾンの例として、ｐｉｇｇｙｂａｃ、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ、Ｌ１などが挙げられる。

【0059】

様々な実施形態では、切断酵素として使用され得るヌクレアーゼとして、Ｃａｓ９、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）、およびジンクフィンガーヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。また、Ｃａｓ９が切断酵素である実施形態は、ＲＮＡの形態で、またはその後細胞内で転写されるＤＮＡベクターの部分として細胞に送達され得るガイドＲＮＡを必要とする。よって、ＨＤＲのためにヌクレアーゼおよびＤＮＡ鋳型を使用する遺伝子編集システムの例は、少なくとも２つの遺伝子編集ツール（すなわち、ヌクレアーゼおよびＤＮＡ鋳型）の同じ細胞への送達を必要とし、特異的ヌクレアーゼＣａｓ９については３つのツール（すなわち、Ｃａｓ９、ガイドＲＮＡ、およびＤＮＡ鋳型）の送達を必要とする。別の例では、ヌクレアーゼ、およびトランスポサーゼを伴うトランスポゾンを使用する遺伝子編集システムは、少なくとも３つの遺伝子編集ツール（すなわち、ヌクレアーゼ、トランスポゾン、およびトランスポサーゼ）の同じ細胞への送達を必要とし、特異的ヌクレアーゼＣａｓ９については４つのツール（すなわち、Ｃａｓ９、ガイドＲＮＡ、トランスポゾン、およびトランスポサーゼ）の送達を必要とする。

【0060】

様々な実施形態では、２つまたは２つより多くの遺伝子編集ツールを必要とする遺伝子編集システムを含む、本明細書で説明する遺伝子編集システムは、単一のナノ粒子担体内に封入され得る。特に、１組の遺伝子編集ツールのポリマーソーム封入は、所望の遺伝子改変を行うために必要な全ての分子の細胞への効率的な送達を可能にし得る。

【0061】

ポリマーソームに基づく送達システムは、材料についての実質的な融通性、ならびに大きなペイロード容量、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性、およびナノ粒子ペイロードの標的化放出を提供する。例えば、ポリマーソームは、細胞エンドソーム内で遭遇するｐＨなどの、ｐＨ変化の結果としてその内容物を放出するように構成してもよい。

【0062】

一例では、二重鎖ＤＮＡの部位特異的切断は、様々なポリマーソームを使用したＲＮＡ指令型ヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡの送達により可能にすることができる。様々な実施形態のＲＮＡ分子は、２つの非コードＲＮＡエレメント：ネイティブＤＮＡ内の標的配列に相補的であり、これとヘテロ二量体化する２０ｂｐの独特な配列（スペーサー配列）を含有するＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）；および（２）トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）からなり得る。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖は、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと標的ＤＮＡ上の相補配列（プロトスペーサー）との間で相補的塩基対を形成し、ＤＮＡ／ＲＮＡ複合体を創出することにより、Ｃａｓ９をゲノム内の標的ＤＮＡに方向付ける。Ｃａｓ９タンパク質の標的特異性は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる、ＤＮＡ／ＲＮＡ複合体方向についてＤＮＡの対向鎖内の特異的ヌクレオチド塩基の存在に依存する。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、ｓｐＣａｓ９は、５’−ＮＧＧ−３’ＰＡＭを必要とする。

【0063】

ＲＮＡ指令型ヌクレアーゼは、ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体を認識し、標的配列内にＤＳＢを創出する。ＤＳＢは、ＤＮＡ／ＲＮＡ複合体について対向鎖上のＰＡＭ配列から３塩基に位置する。すなわち、ＰＡＭ配列（例えばＮＧＧ）は、３’方向では、プロトスペーサーに相補的な対向鎖上の領域に続く。

【0064】

一部の実施形態では、ポリマーソームは、ネイティブタンパク質形態であり得るＲＮＡ指令型ヌクレアーゼを封入するために使用することができる。一部の実施形態では、ＲＮＡ指令型ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡが代わりに封入されてもよく、一旦細胞内に入ると、アミノ酸に翻訳されて、酵素を形成する。

【0065】

様々な実施形態は、ポリマーソームに封入されるＤＮＡに基づくシステムであり得る。一部の実施形態では、ＲＮＡ指令型ヌクレアーゼを発現する発現ベクターを、ポリマーソームに封入することができる。発現ベクターは、例えば、ＲＮＡ指令型ヌクレアーゼをコードするＤＮＡおよびプロモーター領域を含有するように構築されたプラスミドであってもよい。標的細胞内に入ると、ＲＮＡ指令型ヌクレアーゼをコードするＤＮＡは、転写および翻訳されて、酵素を創出し得る。一部の実施形態では、発現ベクターは、ガイドＲＮＡおよびＲＮＡ指令型ヌクレアーゼを発現するように構築することができる。様々な実施形態では、また、ＨＤＲ鋳型として働くための外因性ＤＮＡを封入することにより、ＨＤＲを遺伝子編集に利用することができる。すなわち、一部の実施形態では、ポリマーソームは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡに加えてＤＮＡ修復鋳型を封入することができる。修復鋳型は、遺伝子編集のための所望の配列、ならびに標的のすぐ上流および下流の追加の相同配列（左および右ホモロジーアームと呼ばれる）を含有し得る。各ホモロジーアームの長さおよび結合位置は、導入される変化のサイズに依存する。修復鋳型は、特定の適用によって、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）、二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）、または二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）プラスミドであってもよい。例えば、ｓｓＤＮＡ鋳型（例えばｓｓＯＤＮまたはｄｓＯＤＮ）は、小改変（例えば最大約５０ｂｐまたは単一の点変異）を導入するために使用することができる。様々な実施形態では、また、ｓｓＯＤＮおよびｄｓＯＤＮは、意図される変異の両側に少なくとも４０塩基対のホモロジーアームを含み得る。より大きなインサートのために、各々８００ｂｐまたはそれより大きいホモロジーアームを包含するｄｓＤＮＡを使用することができる（例えば直鎖化されたプラスミドでまたはトランスポゾンとして）。

【0066】

したがって、様々なガイドＲＮＡ分子は、特異性の高いＤＮＡ修復鋳型と共役したＣａｓ９を使用して、ほとんどどんな遺伝子でも変異、活性化、または抑制させるように設計することができる。

【0067】

様々な実施形態では、ＲＮＡ指令型ヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）および複数のガイドＲＮＡを使用して、多重遺伝子編集適用を実現することができる。かかる適用は、大きなゲノム欠失、および／またはいくつかの遺伝子（例えば２〜７個の座）の同時改変を発生させるためのＣａｓ９の使用を含む。一部のシステムでは、複数のｇＲＮＡをクローニングすることにより、２〜７個の遺伝子座を標的にすることができる。

【0068】

また、様々な実施形態のシステムは、ベクター、例えば人工的に構築したプラスミド上で提供されるトランスポゾンを使用して、ＤＮＡを標的細胞のゲノムに統合するように設計することができる。かかるシステムの適用は、新規遺伝子を導入して（すなわち、「ノックイン」して）挿入されたＤＮＡを通して特定の機能を行うこと、または標的ＤＮＡにおける妨害を通して不適切に機能している変異した遺伝子を不活性化する（すなわち、「ノックアウト」する）ことを含み得る。

【0069】

一部の実施形態では、ＤＮＡは、「カットアンドペースト」機構を介してベクターと染色体との間で直接転移されるトランスポゾンであってもよい。一部の実施形態では、トランスポゾンは、レトロトランスポゾン、すなわち、最初にＲＮＡ中間体に転写され、続いて逆転写によりＤＮＡに転写され、転移されるＤＮＡであってもよい。

【0070】

様々な実施形態では、ポリマーソームは、トランスポゾンを含むベクター、および標的ゲノム内の特異的部位へのトランスポゾンの統合を触媒するトランスポサーゼを封入し得る。使用されるトランスポサーゼは、選択された特定のトランスポゾンに特異的であり、トランスポゾンの各々は、様々な実施形態での使用に望ましい特定の特性を有し得る。トランスポゾンの一例は、ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゾンであり、これはｐｉｇｇｙｂａｃトランスポサーゼにより標的ゲノムに転移される。具体的には、ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポサーゼは、トランスポゾンの両末端上のトランスポゾン特異的末端逆位配列（ＩＴＲ：ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を認識し、ＩＴＲ間の内容物をＴＴＡＡ染色体部位に移行させる。ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゾンシステムは、ＩＴＲ間に含まれ得る目的の遺伝子についてペイロード限界がない。トランスポゾンシステムの別の例は、ｓｌｅｅｐｉｎｇｂｅａｕｔｙトランスポゾンであり、これは、ＩＴＲを認識し、ＩＴＲ間の内容物をＴＡ染色体部位に移行させるｓｌｅｅｐｉｎｇｂｅａｕｔｙトランスポサーゼにより標的ゲノムに転移される。様々な実施形態では、ＳＢトランスポゾン媒介遺伝子移入、またはいくつかの同様のトランスポゾンのいずれかを使用する遺伝子移入は、治療用遺伝子の長期発現のために使用することができる。

【0071】

本明細書で論じるＲＮＡ指令型ヌクレアーゼと同様に、ポリマーソームは、トランスポサーゼを、そのネイティブタンパク質で、標的細胞内で転写されてタンパク質になるｍＲＮＡとして、またはトランスポサーゼタンパク質を発現するＤＮＡを含有する発現ベクターとして、封入することができる。例えば、トランスポサーゼをコードする遺伝子は、トランスポゾンそれ自体と同じベクター内で提供してもよく、異なるベクター上で提供してもよい。

【0072】

様々な実施形態はさらに、標的細胞への送達のために、ポリマーソーム中にＲＮＡ指令型ヌクレアーゼ、１つまたは１つより多くのガイドＲＮＡ、およびトランスポゾンシステムを封入することを可能にし得る。かかるポリマーソームは、例えば疾患を引き起こす変異した遺伝子をその遺伝子の健康なコピーで置換するために使用することができ、遺伝子の健康なコピーは、ヌクレアーゼ活性により規定される特異的部位に挿入される。具体的には、挿入される１つまたは１つより多くの遺伝子を含み、トランスポサーゼによる認識のためにＩＴＲにより囲まれたトランスポゾンを創出してもよい。トランスポゾンおよびＩＴＲは、ＩＴＲの各末端上のホモロジーアームを含有するベクター上で提供することができる。トランスポゾンシステム（すなわち、トランスポゾンベクターおよび対応するトランスポサーゼ）は、ＲＮＡ指令型ヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡと共に送達された場合、ＨＤＲで使用されるＤＮＡ修復鋳型の機能を提供し得る。すなわち、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼによる１つまたは１つより多くのＤＳＢの創出後、ＨＤＲまたはＮＨＥＪを通して修復する代わりに、トランスポゾンを、ホモロジーアームに基づいて標的ＤＮＡに挿入することができる。一部の実施形態では、トランスポゾン挿入は、ＤＳＢにより発生した２つの末端の間で起こり得る。他の実施形態では、トランスポゾンは、標的ＤＮＡ内の第１のＤＳＢの１つのアームと第２のＤＳＢの他のアームとの間に挿入され得る（すなわち、２つのＤＳＢの間で配列を置換する）。

【0073】

タンパク質および／または核酸を封入する様々なポリマーソーム配合物を様々な使用のために設計することができるが、各封入システムは、有効であるために共通の特徴を含み得る。例えば、核酸は、少なくとも５０％の封入効率でポリマーソームに封入することができ、重量で最終ナノ粒子配合物の少なくとも１０〜２０重量％を占め得る。かかる最低限の重量割合および効率は、効率的なＤＮＡ切断を達成するのに十分な核酸の送達、および生成物が低コストで再現性よく発生し得ることを確実にする。別の例では、ポリマーソームは、安定であり、それでもポリマーソームが細胞内に取り込まれたら封入したペイロードの容易な放出を提供し、これによりエンドソームの再輸送を避け、核酸の放出を確実にするように設計することができる。さらに、様々な遺伝子治療システムで、ベクター（すなわち、トランスポゾン）は安定な発現を提供するように設計することができる。

【0074】

本明細書で説明するポリマーソーム封入で提供される遺伝子編集ツールは、いくつかのｉｎ ｖｉｖｏ適用に有利であり得る。例えば、実施形態の材料は、遺伝子の欠陥を切断または修復するために、様々な細胞種に送達することができる。かかる細胞として、肝細胞、肝内皮細胞、免疫細胞、ニューロンなどが挙げられるが、これらに限定されない。また、実施形態のポリマーソームは、疾患を引き起こす欠陥のある遺伝子をサイレンシングするために、様々な細胞種に送達することができる（例えば、レーバー先天黒内障の根底にある変異をサイレンシングするための網膜細胞への送達）。

【0075】

本明細書で説明するタンパク質および／または核酸のポリマーソーム封入および／または共封入を発生させるために、様々な方法を使用することができる。一部の実施形態では、独特な生物学的機能を有する核酸および／またはタンパク質を様々な分解性および非分解性ポリマーソームに封入および／または共封入するために、従来の封入技術、例えば薄膜再水和、直接水和、およびエレクトロフォーメーションを使用することができる。他の実施形態では、かかるタンパク質および／または核酸のポリマーソーム封入および／または共封入を調製するために、逐次飽和プロトコールを使用することができる。

【0076】

具体的には、逐次飽和プロトコールは、等しい量のポリマー（例えば１０ｍｇ）およびＰＥＧ（例えば１０ｍｇ）を約９５℃で約１時間加熱することを含む。試料混合物を遠心分離し、室温まで冷却してもよい。封入する生成物（例えばタンパク質および／または核酸を含有する遺伝子編集システム／組成物）の溶液は、例えば７．４ｐＨのｐＨのポリブチレンスクシネート（ＰＢＳ）中に調製してもよい。少量の溶液を最初に試料混合物に添加し（例えば１０μＬ）、完全に混合し、続いて室温で約３０分間超音波処理してもよい。試料をさらに、いくつかの希釈ステップで希釈してもよい。具体的には、各希釈ステップは、タンパク質および／または核酸を含有するある体積の溶液を添加し、続いて完全に混合し、室温で約３０分間超音波処理することを含み得る。希釈ステップ後、得られた試料を、少なくとも１０００ｋＤａ分子量のカットオフ膜を用いて、等張ＰＢＳ中で約４℃にて少なくとも３０時間透析してもよい。０．４重量％プロナーゼ溶液での処理によるタンパク質分解により、表面結合生成物を除去してもよい。様々な実施形態では、得られたポリマーソーム懸濁液の封入は、タンパク質分解の前後に測定してもよい。具体的には、タンパク質および／または核酸の濃度は、誘導結合プラズマ光学発光分光法（ＩＣＰ−ＯＥＳ：ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｌａｓｍａ ｏｐｔｉｃａｌ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ：ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｌａｓｍａ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、マトリックス支援飛行時間型吸収質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：ｍａｔｒｉｘ ａｓｓｉｓｔｅｄ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ）、原子吸光分析（ＡＡＳ：ａｔｏｍｉｃ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、および／または紫外可視吸収分光法を使用して測定することができる。

【0077】

逐次飽和ステップは、ポリマーソーム内の遺伝子編集システムとしてタンパク質および／または核酸を封入することについて好ましい結果を提供し得る。すなわち、遺伝子編集組成物の負荷容量は、他の技術（例えば直接水和など）を使用するポリマーソーム封入と比較して顕著に改善され得る。特定の理論に束縛されるものではないが、かかる改善は、ポリマーソーム形成プロセスが初期希釈ステップ中に完了しないこと、およびさらなる封入がそれぞれの続くタンパク質溶液の添加と共に実現されることを示唆する。複数のリポソーム形成法からの様々なステップを最適化および組み合わせることにより、特定の逐次飽和プロトコールを、特定の遺伝子編集組成物（例えばタンパク質および／または核酸）およびポリマーソーム種のために開発してもよい。遺伝子編集システムの最終濃度、ポリマーソーム担体内で達成され得る相対的負荷レベル（すなわち、ｗ／ｗ％ 組成物／ポリマー）、および遺伝子編集組成物封入効率に影響する因子を、体系的に評価してもよい。ポリマー分子量、遺伝子編集組成物の特性、緩衝溶液のｐＨおよび性質、正確なポリマー水和条件（すなわち、時間、温度、およびブレンド技術）、超音波処理ステップの回数および持続期間、ならびに凍結融解サイクルの付加または回避などの因子は全て、最終的なポリマーソームに封入される遺伝子編集システムの濃度および忠実度に影響を有し得る。

【0078】

一部の実施形態では、各希釈ステップに使用される遺伝子編集組成物の濃度に基づいて達成され得る、封入効率と最終負荷容量（すなわち、組成物対ポリマーの重量割合）との間の直接的なトレードオフがあり得る。最終生成物がポリマーソーム送達媒体を利用する目的、すなわち、生化学的安定性を改善すること、循環半減期を増大させること、有害な副作用を最小限にすること、および関連するタンパク質の制御放出を達成することに適応することを保証するために、タンパク質および／または核酸の水性封入は、表面会合組成物に好ましい。広範囲の分子量およびサイズにわたり変動する様々な遺伝子編集組成物を使用して、様々な実施形態の技術を用いることができる。

【0079】

モデルタンパク質およびモデル核酸の様々なポリマーソーム封入、ならびにかかるタンパク質および核酸の共封入の創出は、従来技術および逐次飽和を使用して創出することができる。例えば、ミオグロビン（Ｍｂ；Ｍｗ＝約１７ｋＤａ）は、治療的可能性を有する他の小タンパク質に匹敵するサイズおよび熱安定性（すなわち、６０℃超で変性）を有するので、モデルタンパク質として使用した。また、ミオグロビンは、強い紫外線（ＵＶ）吸収を有し、これは、その鉄含有ヘム基の酸化還元状態により決定されるその機能状態の容易な特定を可能にする。かかる封入で使用され得る他のモデルタンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｍｗ＝約６６ｋＤａ）およびカタラーゼ（Ｍｗ＝約２５０ｋＤａ）である。様々なサイズを有するモデルタンパク質の封入および共封入は、様々な実施形態で使用され得る機能的タンパク質のサイズの範囲を提供する。さらに、伸長因子１アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーターを使用する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現のための哺乳動物発現ベクターをコードするプラスミドＤＮＡ（すなわち、ｐＥＦ−ＧＦＰ ＤＮＡ）などの、様々なＤＮＡプラスミドを、ポリマーソーム封入のモデル核酸として使用することができる。ｐＥＦ−ＧＦＰ ＤＮＡは、約５０００塩基対であり、約３２８３ｋＤａの分子量を有する。

【0080】

様々な実施形態は、ＰＥＧ、および生分解性ポリマー（例えば生分解性ポリエステル、ポリ（アミド）、ポリ（ペプチド）、ポリ（核酸）など）である疎水性ブロックからなる、様々な両親媒性ポリマーのいずれかを使用して調製することができる。疎水性ブロックを形成し得る生分解性ポリマーの例として、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（メチルカプロラクトン）、ポリ（ヒドロキシブチレート）、ポリ（ヒドロキシバレレート）、ポリ（ヒドロキシヘキサノエート（hdyroxyhexanoate））、ポリ（ヒドロキシオクタノエート（hydroxyoxtanoate））、およびポリ（トリメチレンカーボネート）が挙げられるが、これらに限定されない。
実験

【0081】

得られた粒子間の封入特性および形成技術を比較するために、様々なポリマーソーム配合物を使用することができる。例えば、ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤジブロックコポリマーは、完全にＰＥＧ化した表面を保有するポリマーソームを形成するために使用される。かかる表面は、非荷電かつ非分解性であり、ベシクル完全性を確実にし、不必要なタンパク質相互作用または改変を最小限にするために理想的なシステムを提供する。２つの異なる分子量のＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤジブロックコポリマー、「ＯＢ１８」および「ＯＢ２９」を用いて、それらが様々な最小サイズ、ＰＥＧ長、および膜コア厚さのポリマーソームに関係するときの結果の一般化可能性を決定する。図１は、ＯＢ１８およびＯＢ２９の様々な特性の比較を示す表を提供する。

【0082】

比較および定量研究を以下のように行った。

【0083】

材料

【0084】

ＰＥＯ（３９００）−ｂ−ＰＢＤ（６５００）（ＯＢ１８）およびＰＥＯ（１３００）−ｂ−ＰＢＤ（２５００）（ＯＢ２９）は、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｏｕｒｃｅ（Ｄｏｒｖａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）から購入した。ウマ骨格筋Ｍｂ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カタラーゼ（Ｃ）、ハイドロサルファイトナトリウム、ポリ（エチレングリコール）ジメチルエーテル（ＰＥＧ；Ｍｎ＝約５００）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓからのプロテアーゼ（「プロナーゼ」）、およびジクロロメタン（ＤＣＭ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）から購入した。透析チューブおよびバイアルは、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒａｎｃｈｏ
Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＵＳＡ）から購入した。従来使用のための他の化学物質は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓｕｗａｎｅｅ、ＵＳＡ）から購入した。全ての化学物質は、別に示さない限り、試薬等級のものであった。

【0085】

動的光散乱（ＤＬＳ：ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）装置であるＤｅｌｓａ（商標）Ｎａｎｏ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）を使用して、粒子サイズを測定した。Ｇｅｎｅｓｙｓ（商標）１０Ｓ紫外可視分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｕｗａｎｅｅ、ＵＳＡ）を使用して光吸収分光法により、ミオグロビン濃度を決定した。マイクロビシンコニン酸（マイクロ−ＢＣＡ）タンパク質アッセイキットを使用して、紫外可視分光光度法を利用して、および製造業者のプロトコール（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）に従うことにより、ポリマーソームに封入した懸濁液中のＢＳＡ濃度を測定した。Ｖｉｓｔａ−ＰＲＯ ＣＣＤ ＩＣＰ−ＯＥＳ（Ｖａｒｉａｎ、ＵＳＡ）を使用して、ポリマーソームに封入した懸濁液中のＤＮＡ濃度を決定した。

【0086】

具体的には、ＤＮＡ封入を定量するために、ＤＮＡ試料を最初に白金（ＩＩ）に基づく薬剤シスプラチンと反応させ、標準曲線を生成し、ＤＮＡ濃度がどのように懸濁液中でＤＮＡ結合白金の量と相関するかを示した。かかる標準曲線は、ＤＮＡ試料の連続希釈後、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）分光光度計（すなわち、紫外可視分光光度法）を使用してＤＮＡ濃度を、およびＩＣＰ−ＯＥＳにより白金濃度を測定することにより創出した。このようにして、界面活性剤Ｔｗｅｅｎ８０の添加による、形成したポリマーソームの破壊、続くＩＣＰ−ＯＥＳによる白金濃度（およびそれゆえ懸濁液中のＤＮＡ濃度）の測定を通して、ポリマーソームに封入したＤＮＡ懸濁液の定量的研究におけるＤＮＡ量を計算した。このプロセスは、タンパク質およびＤＮＡの両方について同じ測定技術（すなわち、紫外可視分光光度法）を使用することを避けたものであり、そうでなければ、正確な測定を妨害することとなる。

【実施例】

【0087】

第１の比較モデルでは、ミオグロビン（Ｍｂ）およびｐＥＦ−ＧＦＰ ＤＮＡを、逐次飽和法を使用してＯＢ２９内に共封入した。図２Ａは、１８時間のタンパク質分解前後のＭｂの封入量（μｇ／ｍＬ）を示し、タンパク質分解は、ポリマーソーム懸濁液から任意の非特異的結合（すなわち、表面関連）タンパク質を除去するために利用される技術である。最終ポリマーソーム中に封入されたＭｂの量を、紫外可視吸収分光法（分光光度法とも呼ばれる）を使用して定量した。

【0088】

図２Ｂは、第１の比較モデルにおけるタンパク質対ポリマーの平均最終重量割合（すなわち、ｗ／ｗ％ Ｍｂ／ポリマー）としての、平均負荷容量を、タンパク質分解前後で示す。図２Ｃは、第１の比較モデルを使用して発生させたナノスケールのポリマーソーム中のＤＮＡの平均封入量（μｇ／ｍＬ）を、タンパク質分解前後で示す。図２Ｃ中の封入量は、Ｔｗｅｅｎ８０でのベシクル破壊後の溶液中のＤＮＡ結合白金を測定するためにＩＣＰ−ＯＥＳを使用して、定量した。図２Ｄは、得られたポリマーソーム中のＤＮＡ対ポリマーの平均最終重量割合（すなわち、ｗ／ｗ％ ＤＮＡ／ポリマー）としての、平均負荷容量を、タンパク質分解前後で示す。図２Ｅは、水性腔内にＭｂおよびＤＮＡの両方を含有し、第１の比較モデルで発生させたポリマーソームの平均サイズ（すなわち、流体力学直径）を示す。示されるように、Ｍｂについて約１〜１．５ｍｇ／ｍＬの封入量（全て、ポリマーソームの水性腔内に含有されていた）が、第１の比較モデルを使用して達成され、最終ポリマーソーム組成物の約３〜４重量％に対応した。さらに、ＤＮＡについての分析は、第１の比較モデルを使用して達成され、最終ポリマーソーム組成物の約０．１５重量％に対応し、最終ポリマーソームは直径約２００ｎｍのサイズを示した。

【0089】

第２の比較モデルでは、ＭｂおよびｐＥＦ−ＧＦＰ ＤＮＡを、薄膜水和法を使用してＯＢ２９に基づくポリマーソーム中に共封入した。薄膜水和および直接水和は、水溶性種をポリマーソームの水性腔内に封入するための従来手順であり、様々な出版物（例えばO'Neilら、A Novel Method for the Encapsulation of Biomolecules into Polymersomes via Direct Hydration、Langmuir、２００９年２５巻（１６号）、９０２５
〜９０２９頁）で説明されている。

【0090】

図３Ａは、第２の比較モデルを使用して発生させたナノ粒子内のＭｂの封入量（μｇ／ｍＬ）を、１８時間のタンパク質分解前後で示す。封入量は、紫外可視吸収分光法を使用して定量した。

【0091】

図３Ｂは、同じナノスケールベシクル構築物内にＭｂおよびＤＮＡの両方を封入し、第２の比較モデルで発生させたポリマーソームについてのタンパク質対ポリマーの平均最終重量割合（すなわち、ｗ／ｗ％ Ｍｂ／ポリマー）としての、平均負荷容量を、タンパク質分解前後で示す。図３Ｃは、このポリマーソーム中のＤＮＡの平均封入量（μｇ／ｍＬ）を、タンパク質分解前後で示す。図３Ｃ中の封入量は、ＤＮＡ結合白金のＩＣＰ−ＯＥＳを使用して定量した。図３Ｄは、第２の比較モデルで発生させたポリマーソーム中のＤＮＡ対ポリマーの平均最終重量割合（すなわち、ｗ／ｗ％ ＤＮＡ／ポリマー）としての、平均負荷容量を、タンパク質分解前後で示す。図３Ｅは、同じナノスケールベシクル構築物内にＭｂおよびＤＮＡの両方を封入したポリマーソームの平均サイズ（すなわち、直径）を示す。示されるように、Ｍｂについての約８０μｇ／ｍＬの封入が、第２の比較モデルを使用して達成され、最終ポリマーソーム配合物中の約１０重量％のタンパク質に対応した。さらに、ＤＮＡについての約１２μｇ／ｍＬの封入が、第２の比較モデルを使用して達成され、最終ポリマーソーム配合物の約０．１８重量％に対応した。第２の比較モデルを使用して発生させ、同じナノスケールベシクル構築物内にＭｂおよびＤＮＡの両方を封入した最終ポリマーソーム配合物は、直径約７３０ｎｍの平均粒子サイズを有することが分かった。

【0092】

第３の比較モデルでは、ＢＳＡおよびｐＥＦ−ＧＦＰ ＤＮＡを、逐次飽和技術を使用してＯＢ２９に基づくポリマーソーム中に共封入した。図４Ａは、得られたポリマーソーム中のＢＳＡの平均封入量（μｇ／ｍＬ）を、１８時間のタンパク質分解前後で示す。封入されたタンパク質の量は、マイクロ−ＢＣＡアッセイを使用して定量した。

【0093】

図４Ｂは、第３の比較モデルで発生させたポリマーソーム中のタンパク質対ポリマーの平均最終重量割合（すなわち、ｗ／ｗ％ ＢＳＡ／ポリマー）としての、平均負荷容量を、タンパク質分解前後で示す。図４Ｃは、このポリマーソーム中のＤＮＡの平均封入量（μｇ／ｍＬ）を、タンパク質分解前後で示す。図４Ｃ中の封入量は、ＤＮＡ結合白金のＩＣＰ−ＯＥＳを使用して定量した。図４Ｄは、第３の比較モデルで発生させたポリマーソーム中のＤＮＡ対ポリマーの最終重量割合（すなわち、ｗ／ｗ％ ＤＮＡ／ポリマー）としての、平均負荷容量を、タンパク質分解前後で示す。図４Ｅは、同じナノスケールベシクル構築物内にＢＳＡおよびＤＮＡの両方を封入したポリマーソームの平均サイズ（すなわち、直径）を示す。示されるように、ＢＳＡについての約１〜１．５ｍｇ／ｍＬの封入が、第３の比較モデルを使用して達成され、最終ポリマーソーム配合物の約３〜４重量％に対応した。さらに、ＤＮＡについての約５０μｇ／ｍＬの封入が、第３の比較モデルを使用して達成され、最終ポリマーソーム配合物の約０．１５重量％に対応した。同じナノスケールベシクル構築物内にＢＳＡおよびＤＮＡの両方を封入したポリマーソームは、第３の比較モデルで発生させた場合、直径約２００ｎｍのサイズを有した。

【0094】

図２Ｅ、３Ｅ、および４Ｅで示される結果を図１中のナノ粒子サイズと比較することにより示されるように、最終ポリマーソームは、逐次飽和技術を使用したタンパク質（ＭｂまたはＢＳＡのいずれか）と核酸（ｐＥＦ−ＧＦＰ ＤＮＡ）との共封入により、顕著に大きくならなかった。しかしながら、薄膜水和を使用して発生させた場合、同じナノスケールベシクル構築物内にタンパク質および核酸の両方を封入した最終ポリマーソームのサイズは、よりもっと大きかった。

【0095】

同じプロトコールを使用したさらなるポリマーソーム封入は、他の非分解性ポリマー（例えばＯＢ１８）から製造されるポリマーソーム、および様々な分解性ポリマーから製造されるポリマーソームを使用して、比較モデルとして開発されており、継続して開発されている。かかる分解性ポリマーの例として、ＰＥＯ（５０００）−ｂ−ＰＣＬ（１６３００）（「Ｐ２３５０−ＥＯＣＬ」）；ＰＥＯ（２０００）−ｂ−ＰＭＣＬ（１１９００）（「ＯＣＬ」）；ＰＥＯ（２０００）−ｂ−ＰＭＣＬ（８３００）（「ＯＭＣＬ」）；ＰＥＯ（１１００）−ｂ−ＰＴＭＣ（５１００）（「ＯＴＭＣ」）；およびＰＥＯ（２０００）−ｂ−ＰＴＭＣ／ＰＣＬ（１１２００）（「ＯＴＣＬ」）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0096】

ポリマーソームに封入したＲＮＡ指令型ヌクレアーゼの例の実施形態を、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９タンパク質を使用して調製した。具体的には、４−ヒドロキシ安息香酸エステルポリ（ブタジエン２５００−ｂ−エチレンオキシド１３００）（「ＯＢ２９−Ｂｚ」）の非分解性ポリマーを、逐次飽和プロトコールを使用してＣａｓ９タンパク質（粉末、２５０μｇ／バイアル）を封入するために使用し、逐次飽和プロトコールでは、試料を室温で３０時間透析した（ＭＷカットオフ＝１００ｋＤａ）。図５Ａは、得られたポリマーソーム中のＣａｓ９タンパク質の平均封入量（μｇ／ｍＬ）を、タンパク質分解前後で示す。封入は、マイクロ−ＢＣＡアッセイを使用して定量した。図５Ｂは、得られたポリマーソーム中のＣａｓ９タンパク質の平均封入効率（％ＥＥ）を、タンパク質分解前後で示す。図５Ｃは、この例の実施形態で発生させたポリマーソーム中のタンパク質対ポリマーの平均最終重量割合（すなわち、ｗ／ｗ％ Ｃａｓ９タンパク質／ポリマー）としての、平均負荷容量を、タンパク質分解前後で示す。示されるように、Ｃａｓ９タンパク質についての約３ｍｇ／ｍＬの封入が、この例の実施形態で達成され、最終ポリマーソーム配合物の約３〜４重量％に対応した。Ｃａｓ９タンパク質の封入効率は、約６５％であった。

【0097】

第４の比較モデルでは、Ｃａｓ９タンパク質およびｐＥＦ−ＧＦＰ ＤＮＡを、逐次飽和技術を使用してＯＢ２９−Ｂｚ中に共封入した。図６Ａは、第４の比較モデルで発生させたポリマーソーム中に封入されたＣａｓ９タンパク質の平均量（μｇ／ｍＬ）を示す。封入量は、マイクロ−ＢＣＡアッセイにより定量した。図６Ｂは、ポリマーソーム中のタンパク質対ポリマーの平均最終重量割合（すなわち、ｗ／ｗ％ Ｃａｓ９タンパク質／ポリマー）としての、平均負荷容量を、タンパク質分解前後で示す。

【0098】

図６Ｃは、第４の比較モデルで発生させたナノ粒子中に封入したＤＮＡの平均量（μｇ／ｍＬ）を、タンパク質分解前後で示す。図６Ｃ中の封入量は、ＤＮＡ結合白金のＩＣＰ−ＯＥＳを使用して定量した。図６Ｄは、得られたポリマーソーム中のＤＮＡ対ポリマーの平均最終重量割合（すなわち、ｗ／ｗ％ ＤＮＡ／ポリマー）としての、平均負荷容量を、タンパク質分解前後で示す。図６Ｅは、第４の比較モデルで発生させた最終ポリマーソームの平均サイズ（すなわち、直径）を示す。示されるように、Ｃａｓ９タンパク質についての約１ｍｇ／ｍＬの封入が、第４の比較モデルを使用して達成され、最終ポリマーソーム配合物の約３重量％に対応した。さらに、約５０μｇ／ｍＬの封入が、第４の比較モデルを使用してＤＮＡについて達成され、同じナノスケールベシクル構築物内にＣａｓ９タンパク質およびＤＮＡの両方を封入した最終ポリマーソーム配合物の約０．１５重量％に対応した。これらのポリマーソームは、直径約２２０ｎｍであった。
一実施形態において、例えば、以下の項目が提供される。
（項目１）
遺伝子改変のための組成物であって、
合成ポリマーベシクルと、
前記合成ポリマーベシクル中に封入された遺伝子編集システムであって、宿主細胞ゲノム内の標的配列と相互作用するように構成された核酸構成成分を含む遺伝子編集システムと
を含む組成物。
（項目２）
前記遺伝子編集システムが、タンパク質構成成分をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記タンパク質構成成分が、リボ核酸（ＲＮＡ）指令型ヌクレアーゼを含み、
前記核酸構成成分が、前記標的配列に相補的なガイドＲＮＡを含む、
項目２に記載の組成物。
（項目４）
前記核酸構成成分が、外因性デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）修復鋳型をさらに含み、
前記ＲＮＡ指令型ヌクレアーゼが、前記標的配列に隣接する前記宿主細胞ゲノムで二重鎖開裂を創出するように構成され、
前記宿主細胞内の修復プロセスが、前記宿主細胞ゲノムの再ライゲーション中に、前記外因性ＤＮＡ修復鋳型に基づいて前記宿主細胞ゲノムの改変を誘発する、
項目３に記載の組成物。
（項目５）
前記ＤＮＡ修復鋳型が、前記ＲＮＡ指令型ヌクレアーゼにより誘導された前記二重鎖開裂に隣り合った前記宿主細胞ゲノムの領域に相同な末端領域を含む、項目４に記載の組成物。
（項目６）
前記遺伝子編集システムが、前記組成物の総重量に対して少なくとも３重量％の量で、前記合成ポリマーベシクル中に含まれる、項目１に記載の組成物。
（項目７）
タンパク質構成成分が、ネイティブ形態の酵素、または前記宿主細胞への送達後に酵素に翻訳されるように構成されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子を含む、項目１に記載の組成物。
（項目８）
前記タンパク質構成成分が、酵素をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列を含有する発現ベクターとして送達される、項目２に記載の組成物。
（項目９）
前記核酸構成成分が、ガイドリボ核酸（ＲＮＡ）をコードするＤＮＡ配列を含む、項目８に記載の組成物。
（項目１０）
前記酵素および前記ガイドＲＮＡをコードする前記ＤＮＡ配列が、単一の発現ベクター上で提供される、項目９に記載の組成物。
（項目１１）
前記タンパク質構成成分が、前記宿主ゲノムの相補的セグメントへの前記核酸構成成分の結合に基づいて前記宿主ゲノムを切断するように構成された酵素を含む、項目２に記載の組成物。
（項目１２）
前記酵素が、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質９（Ｃａｓ９）を含む、項目１１に記載の組成物。
（項目１３）
前記核酸構成成分が、トランスポゾンを含む発現ベクターを含み、
前記タンパク質構成成分が、トランスポサーゼを含む、
項目２に記載の組成物。
（項目１４）
前記トランスポサーゼが、
ネイティブ酵素、
前記宿主細胞への送達後に前記酵素に翻訳されるように構成されたメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分子、および
前記酵素をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列
の１つである、項目１３に記載の組成物。
（項目１５）
前記ＤＮＡ配列が、前記トランスポゾンを含む前記発現ベクター上で提供される、項目１４に記載の組成物。
（項目１６）
前記合成ポリマーベシクルが、
ポリ（エチレンオキシド）を含む親水性ブロックと
疎水性ブロックと
を含む少なくとも１つのブロックコポリマーから生成される、項目１に記載の組成物。
（項目１７）
前記疎水性ブロックが、脂肪族ポリ（無水物）、ポリ（核酸）、ポリ（エステル）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ペプチド）、ポリ（ホスファゼン）、および多（糖類）から選択される、項目１５に記載の組成物。
（項目１８）
前記疎水性ブロックが、ポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、またはポリ（トリメチレンカーボネート）（ＰＴＭＣ）の１つまたは１つより多くを含む、項目１５に記載の組成物。
（項目１９）
宿主細胞ゲノムを改変する方法であって、
ポリマーソーム中に、
タンパク質構成成分、および
前記宿主細胞内の標的核酸配列と相互作用するように構成された核酸構成成分
を含む遺伝子編集システムを封入することと、
前記封入された遺伝子編集システムを前記宿主細胞に送達することと
を含み、
前記ポリマーソームが、前記宿主細胞内で前記遺伝子編集システムを選択的に放出するように構成される、方法。
（項目２０）
前記封入された遺伝子編集システムを前記宿主細胞に送達することが、前記封入された遺伝子編集システムを含有する有効量の組成物を被験体に投与することを含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記封入された遺伝子編集システムが、逐次飽和プロトコールを使用して調製される、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
封入された遺伝子編集組成物の懸濁液を製造する方法であって、
ある分量のブロックコポリマーをある分量の低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と熱ブレンドして、ＰＥＧ／ポリマー配合物を創出することと、
前記遺伝子編集組成物の溶液の一定分量を、前記ＰＥＧ／ポリマー配合物を含有する試料に添加することと、
生成されたポリマーソームが、前記遺伝子編集組成物で逐次飽和されるように少なくとも１回の希釈ステップを行うことと
を含み、
前記遺伝子編集組成物が、
タンパク質構成成分、および
宿主細胞ゲノム内の標的配列と相互作用するように構成された核酸構成成分
を含む、方法。
（項目２３）
前記ブロックコポリマーが、両親媒性ジブロックコポリマーを含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記両親媒性ジブロックコポリマーが、ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（ブタジエン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＤ）を含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記生成されたポリマーソームが、前記遺伝子編集組成物に対して少なくとも５０％の封入効率を有する、項目２２に記載の方法。
（項目２６）
キットであって、
合成ポリマーベシクル中に封入された遺伝子編集システムを含む医薬組成物であって、前記遺伝子編集システムが、
タンパク質構成成分、および
宿主細胞ゲノム内の標的配列と相互作用するように構成された核酸構成成分
を含む、医薬組成物と、
前記医薬組成物を静脈内に、吸入により、局所的に、経直腸的に、経膣的に、経皮的に、皮下に、腹腔内に、髄腔内に、筋内に、または経口で投与するための器具と
を含むキット。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【外国語明細書】

2019165745000001.pdf