特開 2019-206565 黒色腫の治療のための組合せ医薬

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2019-206565(P2019-206565A)

(43)【公開日】2019年12月5日

(54)【発明の名称】黒色腫の治療のための組合せ医薬

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/4025 20060101AFI20191108BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20191108BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20191108BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20191108BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20191108BHJP

   A61K 31/437 20060101ALI20191108BHJP

   A61K 31/506 20060101ALI20191108BHJP

   A61K 31/4184 20060101ALI20191108BHJP

   A61K 31/166 20060101ALI20191108BHJP

   A61K 31/519 20060101ALI20191108BHJP

   A61K 31/4523 20060101ALI20191108BHJP

   A61K 31/18 20060101ALI20191108BHJP

   A61K 31/44 20060101ALI20191108BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/4025

   A61P35/00

   A61P35/04

   A61P43/00 121

   A61K45/00

   A61K31/437

   A61K31/506

   A61K31/4184

   A61K31/166

   A61K31/519

   A61K31/4523

   A61K31/18

   A61K31/44

【審査請求】有

【請求項の数】48

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】47

(21)【出願番号】特願2019-141995(P2019-141995)

(22)【出願日】2019年8月1日

(62)【分割の表示】特願2016-524936(P2016-524936)の分割

【原出願日】2014年7月11日

(31)【優先権主張番号】61/845,749

(32)【優先日】2013年7月12日

(33)【優先権主張国】US

(71)【出願人】

【識別番号】516011659

【氏名又は名称】ピラマル エンタープライズイズ リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】230104019

【弁護士】

【氏名又は名称】大野 聖二

(74)【代理人】

【識別番号】100119183

【弁理士】

【氏名又は名称】松任谷 優子

(74)【代理人】

【識別番号】100149076

【弁理士】

【氏名又は名称】梅田 慎介

(74)【代理人】

【識別番号】100173185

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 裕

(72)【発明者】

【氏名】アガーワル，ヴィーナ

(72)【発明者】

【氏名】ペリヤサミ，ギリドハラン

(72)【発明者】

【氏名】ラトス，マギー

(72)【発明者】

【氏名】シュリーヴァスタヴァ，アンキタ

(72)【発明者】

【氏名】シュリニヴァーサ，スリーシャ

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

4C206

【Ｆターム（参考）】

4C084AA19

4C084NA05

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC202

4C084ZC751

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC07

4C086BC17

4C086BC21

4C086BC39

4C086BC82

4C086CB05

4C086CB09

4C086GA02

4C086GA07

4C086GA10

4C086GA13

4C086GA16

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA05

4C086ZB26

4C086ZC20

4C086ZC75

4C206AA01

4C206HA16

4C206JA11

4C206KA01

4C206KA17

4C206MA02

4C206MA04

4C206NA05

4C206ZB26

4C206ZC20

4C206ZC75

(57)【要約】      （修正有）

【課題】転移性黒色腫及び耐性ＢＲＡＦ突然変異黒色腫の進行予防及び／又は治療のための新規治療方法の提供。
【解決手段】（＋）−ｔｒａｎｓ−２−（２−クロロ−４−トリフルオロメチルフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチルピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩に代表されるクロメン−４−オン系化合物であるＣＤＫ（サイクリン依存性キナーゼ）阻害剤と、ベムラフェニブ及びダブラフェニブに代表されるＢＲＡＦ（セリン−トレオニンタンパク質キナーゼＢ−ｒａｆ）阻害剤及びトラメチニブに代表されるＭＥＫ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ）阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤、とを含む医薬組成物。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

黒色腫を治療するための医薬組成物であって、式Ｉ

【化1】

（式中、Ａｒはフェニルであり、このフェニルは、塩素およびトリフルオロメチルから選択される２つの異なる置換基で置換されている）
の化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ（サイクリン依存性キナーゼ）阻害剤の治療有効量と、ＢＲＡＦ（セリン−トレオニンタンパク質キナーゼＢ−ｒａｆ）阻害剤およびＭＥＫ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ）阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤の治療有効量を含む、医薬組成物。

【請求項2】

黒色腫を治療するための医薬組成物であって、式Ｉ

【化2】

（式中、Ａｒはフェニルであり、このフェニルは、塩素およびトリフルオロメチルから選択される２つの異なる置換基で置換されている）
の化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ（サイクリン依存性キナーゼ）阻害剤の治療有効量を含み、該組成物が、ＢＲＡＦ（セリン−トレオニンタンパク質キナーゼＢ−ｒａｆ）阻害剤およびＭＥＫ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ）阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤の治療有効量との同時投与または逐次的投与に用いられる、医薬組成物。

【請求項3】

ＣＤＫ阻害剤が（＋）−ｔｒａｎｓ−２−（２−クロロ−４−トリフルオロメチルフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩である、請求項１または２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

ＢＲＡＦ阻害剤が、Ｖ６００変異形態のＢＲＡＦの阻害剤である、請求項１から３のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項5】

ＢＲＡＦ阻害剤が、ソラフェニブ、ベムラフェニブ、ＧＤＣ−０８７９、ダブラフェニブ、ＰＬＸ４７２０、ＢＭＳ−９０８６６２、ＬＧＸ８１８、ＰＬＸ３６０３、ＡＲＱ−７３６、ＤＰ−４９７８およびＲＡＦ２６５から選択される、請求項１から３のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項6】

ＢＲＡＦ阻害剤がベムラフェニブである、請求項１から３のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項7】

ＢＲＡＦ阻害剤がダブラフェニブである、請求項１から３のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項8】

ＭＥＫ阻害剤が、Ｖ６００ＥまたはＶ６００Ｋ変異形態のＢＲＡＦの阻害剤である、請求項１から３のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項9】

ＭＥＫ阻害剤が、セルメチニブ、ビニメチニブ、ＰＤ−０３２５９０１、トラメチニブ、コビメチニブ、レファメチニブ、ピマセルチブ、ＴＡＫ−７３３およびＷＸ−５５４から選択される、請求項１から３のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項10】

ＭＥＫ阻害剤がトラメチニブである、請求項１から３のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項11】

前記ＣＤＫ阻害剤と、ＢＲＡＦ（セリン−トレオニンタンパク質キナーゼＢ−ｒａｆ）阻害剤およびＭＥＫ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ）阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤とが、それを必要とする対象に同時に投与される、請求項１から１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項12】

前記ＣＤＫ阻害剤と、ＢＲＡＦ（セリン−トレオニンタンパク質キナーゼＢ−ｒａｆ）阻害剤およびＭＥＫ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ）阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤とが、それを必要とする対象に逐次的に投与される、請求項１から１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項13】

黒色腫が非難治性黒色腫である、請求項１から１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項14】

黒色腫が非難治性ＢＲＡＦ変異型黒色腫である、請求項１３に記載の医薬組成物。

【請求項15】

黒色腫が非難治性ＢＲＡＦ Ｖ６００変異型黒色腫である、請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項16】

黒色腫が、非難治性ＢＲＡＦ Ｖ６００ＥまたはＢＲＡＦ Ｖ６００Ｋ変異型黒色腫である、請求項１５に記載の医薬組成物。

【請求項17】

黒色腫が再発性または難治性黒色腫である、請求項１から１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項18】

黒色腫が、再発性または難治性ＢＲＡＦ変異型黒色腫である、請求項１７に記載の医薬組成物。

【請求項19】

黒色腫が、再発性または難治性ＢＲＡＦ Ｖ６００変異型黒色腫である、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項20】

黒色腫が、再発性または難治性ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ黒色腫またはＢＲＡＦ Ｖ６００Ｋ変異型黒色腫である、請求項１９に記載の医薬組成物。

【請求項21】

黒色腫が転移性黒色腫である、請求項１から１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項22】

黒色腫が転移性ＢＲＡＦ変異型黒色腫である、請求項２１に記載の医薬組成物。

【請求項23】

黒色腫が転移性ＢＲＡＦ Ｖ６００変異型黒色腫である、請求項２２に記載の医薬組成物。

【請求項24】

黒色腫が転移性ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ黒色腫またはＢＲＡＦ Ｖ６００Ｋ変異型黒色腫である、請求項２３に記載の医薬組成物。

【請求項25】

黒色腫を治療するための医薬の製造における、式Ｉ

【化3】

（式中、Ａｒはフェニルであり、このフェニルは、塩素およびトリフルオロメチルから選択される２つの異なる置換基で置換されている）
の化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ（サイクリン依存性キナーゼ）阻害剤の治療有効量と、ＢＲＡＦ（セリン−トレオニンタンパク質キナーゼＢ−ｒａｆ）阻害剤およびＭＥＫ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ）阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤の治療有効量との使用。

【請求項26】

黒色腫を治療するための医薬の製造における、式Ｉ

【化4】

（式中、Ａｒはフェニルであり、このフェニルは、塩素およびトリフルオロメチルから選択される２つの異なる置換基で置換されている）
の化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ（サイクリン依存性キナーゼ）阻害剤の治療有効量の使用であって、該医薬が、ＢＲＡＦ（セリン−トレオニンタンパク質キナーゼＢ−ｒａｆ）阻害剤およびＭＥＫ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ）阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤の治療有効量との同時投与または逐次的投与に用いられる、使用。

【請求項27】

ＣＤＫ阻害剤が（＋）−ｔｒａｎｓ−２−（２−クロロ−４−トリフルオロメチルフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩である、請求項２５または２６に記載の使用。

【請求項28】

ＢＲＡＦ阻害剤が、Ｖ６００変異形態のＢＲＡＦの阻害剤である、請求項２５から２７のいずれか１項に記載の使用。

【請求項29】

ＢＲＡＦ阻害剤が、ソラフェニブ、ベムラフェニブ、ＧＤＣ−０８７９、ダブラフェニブ、ＰＬＸ４７２０、ＢＭＳ−９０８６６２、ＬＧＸ８１８、ＰＬＸ３６０３、ＡＲＱ−７３６、ＤＰ−４９７８およびＲＡＦ２６５から選択される、請求項２５から２７のいずれか１項に記載の使用。

【請求項30】

ＢＲＡＦ阻害剤がベムラフェニブである、請求項２５から２７のいずれか１項に記載の使用。

【請求項31】

ＢＲＡＦ阻害剤がダブラフェニブである、請求項２５から２７のいずれか１項に記載の使用。

【請求項32】

ＭＥＫ阻害剤が、Ｖ６００ＥまたはＶ６００Ｋ変異形態のＢＲＡＦの阻害剤である、請求項２５から２７のいずれか１項に記載の使用。

【請求項33】

ＭＥＫ阻害剤が、セルメチニブ、ビニメチニブ、ＰＤ−０３２５９０１、トラメチニブ、コビメチニブ、レファメチニブ、ピマセルチブ、ＴＡＫ−７３３およびＷＸ−５５４から選択される、請求項２５から２７のいずれか１項に記載の使用。

【請求項34】

ＭＥＫ阻害剤がトラメチニブである、請求項２５から２７のいずれか１項に記載の使用。

【請求項35】

前記ＣＤＫ阻害剤と、ＢＲＡＦ（セリン−トレオニンタンパク質キナーゼＢ−ｒａｆ）阻害剤およびＭＥＫ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ）阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤とが、それを必要とする対象に同時に投与される、請求項２５から３４のいずれか１項に記載の使用。

【請求項36】

前記ＣＤＫ阻害剤と、ＢＲＡＦ（セリン−トレオニンタンパク質キナーゼＢ−ｒａｆ）阻害剤およびＭＥＫ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ）阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤とが、それを必要とする対象に逐次的に投与される、請求項２５から３４のいずれか１項に記載の使用。

【請求項37】

黒色腫が非難治性黒色腫である、請求項２５から３６のいずれか１項に記載の使用。

【請求項38】

黒色腫が非難治性ＢＲＡＦ変異型黒色腫である、請求項３７に記載の使用。

【請求項39】

黒色腫が非難治性ＢＲＡＦ Ｖ６００変異型黒色腫である、請求項３８に記載の使用。

【請求項40】

黒色腫が、非難治性ＢＲＡＦ Ｖ６００ＥまたはＢＲＡＦ Ｖ６００Ｋ変異型黒色腫である、請求項３９に記載の使用。

【請求項41】

黒色腫が再発性または難治性黒色腫である、請求項２５から３６のいずれか１項に記載の使用。

【請求項42】

黒色腫が、再発性または難治性ＢＲＡＦ変異型黒色腫である、請求項４１に記載の使用。

【請求項43】

黒色腫が、再発性または難治性ＢＲＡＦ Ｖ６００変異型黒色腫である、請求項４２に記載の使用。

【請求項44】

黒色腫が、再発性または難治性ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ黒色腫またはＢＲＡＦ Ｖ６００Ｋ変異型黒色腫である、請求項４３に記載の使用。

【請求項45】

黒色腫が転移性黒色腫である、請求項２５から３６のいずれか１項に記載の使用。

【請求項46】

黒色腫が転移性ＢＲＡＦ変異型黒色腫である、請求項４５に記載の使用。

【請求項47】

黒色腫が転移性ＢＲＡＦ Ｖ６００変異型黒色腫である、請求項４６に記載の使用。

【請求項48】

黒色腫が転移性ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ黒色腫またはＢＲＡＦ Ｖ６００Ｋ変異型黒色腫である、請求項４７に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、黒色腫の治療における使用のための、式Ｉ（本明細書中に記載されている通り）の化合物または薬学的に許容されるその塩によって代表されるＣＤＫ（サイクリン依存性キナーゼ）阻害剤と、ＢＲＡＦ（セリン−トレオニンタンパク質キナーゼＢ−ｒａｆ）阻害剤またはＭＥＫ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ）阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤とを含む組合せ医薬に関する。本発明はまた、組合せ医薬を使用して黒色腫を治療する方法にも関する。

【背景技術】

【0002】

黒色腫は、最も重篤なタイプの皮膚がんである。実際に、黒色腫はメラニン形成細胞と呼ばれる細胞内から始まる悪性腫瘍であり、このメラニン形成細胞は色素生成細胞である。黒色腫は、皮膚内に最も頻繁に生じるが、眼の中または鼻、口または生殖器の内壁にも発症する。その後、黒色腫は内臓に拡散することができる。黒色腫が皮膚に生じた場合、皮膚黒色腫と呼ばれる。黒色腫が眼に生じた場合、眼の黒色腫または眼内黒色腫と呼ばれる。黒色腫の発生率は世界中で増加しており、皮膚がんによる死亡の８０％は悪性黒色腫が原因であることが報告されている（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２０１０年、第３６３巻、８号、７１１〜７２３ページ）。

【0003】

黒色腫が拡散する場合、がん細胞はリンパ節中に発見されることが多い。がんがリンパ節に到達している場合、これは、がん細胞が身体の他の部分、例えば、肝臓、肺または脳などに拡散しており、転移性黒色腫を引き起こしている可能性があるという徴候である。実際に、黒色腫の転移は極めて攻撃的であり、転移性黒色腫を有する患者の生存時間は平均して３〜１５カ月しかない。残念なことに、転移性黒色腫に有効な治療はない。早期診断および早急な外科切除は、患者にとって治癒の可能性への可能なオプションである。転移性黒色腫に対する治療レジメンは、最初は、インターロイキン−２、ダカルバジン、テモゾロミド、フォテムスチンおよびカルボプラチンなどの薬物で構成されるが、それぞれ乏しい応答速度および乏しい全生存期間を伴う。例えば、ダカルバジンは、７〜１２％の応答速度および治療開始後平均５〜８カ月の全生存期間を伴うことが判明した（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２０１１年、第３６４巻、２６号、２５０７〜２５１６ページ）。

【0004】

一般的ながんの大きなパネルにおける、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ経路の研究では、黒色腫の４０〜６０％が、セリン−トレオニンタンパク質キナーゼＢ−ｒａｆ（ＢＲＡＦ）をコードしている遺伝子において活性化突然変異を保持することが判明した。黒色腫中に観察されたＢＲＡＦ突然変異体の中で、９０％超がコドン６００に位置し、これらの中で、９０％超が単一のヌクレオチド突然変異体であり、結果として、バリンをグルタミン酸に置換する（ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ）。２番目によく起こる突然変異は、バリンをリシンに置換するＢＲＡＦ Ｖ６００Ｋであり、これは黒色腫の５〜６％を占め、これに続いてＢＲＡＦ Ｖ６００Ｒ（バリンをアルギニンに置換）およびＢＲＡＦ Ｖ６００Ｄ（バリンをアスパラギン酸に置換）である（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１２年、第１０巻、８５号、１〜９ページ）。

【0005】

ＢＲＡＦ阻害剤は、低いナノモル濃度でＢＲＡＦ変異体黒色腫を有する患者の大部分において腫瘍の縮小に有効であることが判明した。効力を制限する因子は、薬物耐性および５〜７カ月に制限されている無増悪生存率である。強力なＢＲＡＦ Ｖ６００阻害剤のいくつかの例として、ＢＡＹ４３−９００６（ソラフェニブ、Ｂａｙｅｒ）、ベムラフェニブ（ＰＬＸ４０３２、Ｐｌｅｘｘｉｋｏｎ；ＲＧ７２０４、ＲＯ５１８５４２６、Ｈｏｆ
ｍａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）、ＧＤＣ−０８７９（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ダブラフェニブ（ＧＳＫ２１１８４３６、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＰＬＸ４７２０（Ｈｏｆｍａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）、ＢＭＳ−９０８６６２（ＸＬ２８１、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＬＧＸ８１８（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＰＬＸ３６０３（ＲＯ５２１２０５４、Ｈｏｆｍａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）、ＡＲＱ−７３６（ＡｒＱｕｌｅ）、ＤＰ−４９７８（Ｄｅｃｉｐｈｅｒａ）およびＲＡＦ２６５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）が挙げられる。

【0006】

ベムラフェニブは、変異ＢＲＡＦ、特にＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ突然変異の強力な阻害剤である。ベムラフェニブは、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ突然変異を有する黒色腫に罹った患者の８１％において完全または部分的な腫瘍退縮を誘発させた。応答が、骨、肝臓および小腸を含むすべての疾患部位において観察された。しかし、ベムラフェニブに対する信頼できる早期応答後、応答性腫瘍は治療に対する耐性を生み出すことが判明した。ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ突然変異を有する一部の患者において、腫瘍は、初期応答の証拠なしに耐性を示した（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２０１０年、第３６３巻、９号、８０９〜８１９ページ）。ダブラフェニブは、ヒト野生型タイプＢＲＡＦおよびＣＲＡＦ酵素ならびに変異形態のＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ、ＢＲＡＦ Ｖ６００ＫおよびＢＲＡＦ Ｖ６００Ｄの強力および選択的なＲＡＦキナーゼ阻害剤である。

【0007】

ＭＥＫ１およびＭＥＫ２は、標的タンパク質内のチロシンとトレオニンの両方のリン酸化を触媒する二重特異性キナーゼである。二重特異性キナーゼはタンパク質セリン／トレオニンキナーゼファミリー内に含まれる。タンパク質リン酸化はシグナル伝達に使用される最も広範囲なクラスの翻訳後修飾である（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２０１２年、第４１７巻、５〜１０ページ）。ＭＥＫ１およびＭＥＫ２は、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫシグナル伝達カスケード（時には、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードとして表示されることもある）に参加する、遍在的に発現する親水性の非受容体タンパク質である。Ｒａｓ媒介性Ｒａｆ活性化は、ＭＥＫ１およびＭＥＫ２（ＭＡＰ／ＥＲＫキナーゼ１および２）の活性化を引き起こし、ひいてはチロシン１８５およびトレオニン１８３上のＥＲＫ１およびＥＲＫ２（細胞外シグナル調節キナーゼ１および２）をリン酸化する。活性化したＥＲＫ１およびＥＲＫ２は、転位し、核内に蓄積し、この核内で、細胞の増殖および生存を制御する転写因子を含む様々な基質をリン酸化することができる。これらのカスケードの制御された調節は細胞増殖および分化に関与しているのに対して、これらキナーゼの調節されていない活性化は発癌をもたらす可能性がある。ＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＥＫ経路の異常調節はヒト腫瘍の３０％超において検出されているが、ＭＥＫ１およびＭＥＫ２遺伝子における突然変異はほとんど検出されず、よって、ＭＥＫ１／２の過剰活性化は通常、ＲＡＳおよび／またはＢＲＡＦにおける機能獲得型変異に起因する。ヒトがんの発症におけるＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路の重要性を考慮すると、シグナル伝達カスケードのキナーゼ構成部分は、がんおよび他の増殖性疾患における病状悪化のモジュレーションに対して潜在的に重要なターゲットである。

【0008】

強力なＭＥＫ阻害剤のいくつかの例として、トラメチニブ（Ｍｅｋｉｎｉｓｔ（商標））、セルメチニブ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ビニメチニブ（Ａｒｒａｙ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）、ＰＤ−０３２５９０１（Ｐｆｉｚｅｒ）、コビメチニブ（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、レファメチニブ（Ｖａｌｅａｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｔ．）、ピマセルチブ（Ｓａｎｔｈｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＴＡＫ−７３３（Ｔａｋｅｄａ）およびＷＸ−５５４（ＵＣＢ Ｐｈａｒｍａ ＳＡ）が挙げられる。

【0009】

トラメチニブはＭＥＫ１およびＭＥＫ２の強力な選択的阻害剤である。ＢＲＡＦ阻害剤で以前に治療していないＢＲＡＦ Ｖ６００ＥまたはＢＲＡＦ Ｖ６００Ｋ突然変異を有
する転移性悪性黒色腫に罹った患者において、化学療法と比較した場合の、トラメチニブに関する有意な臨床的活性が実証されている（ダカルバジンまたはパクリタキセルのいずれか）。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

このように、転移性黒色腫および耐性ＢＲＡＦ突然変異黒色腫は、既存の療法で治療するのが引き続き困難であることが上記考察から明らかであり、したがって、これらの進行を予防することと、状態を治療することの両方のために、これらの状態に対する新規の有効な治療の必要性が引き続き存在する。

【課題を解決するための手段】

【0011】

一態様では、本発明は、黒色腫の治療における使用のための、式Ｉ（本明細書中に記載されている通り）の化合物または薬学的に許容されるその塩によって代表されるＣＤＫ（サイクリン依存性キナーゼ）阻害剤と、ＢＲＡＦ（セリン−トレオニンタンパク質キナーゼＢ−ｒａｆ）阻害剤またはＭＥＫ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ）阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤とを含む組合せ医薬に関する。

【0012】

別の態様では、本発明は、式Ｉ（本明細書中に記載されている通り）の化合物または薬学的に許容されるその塩によって代表されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量を、ＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤の治療有効量と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することを含む、黒色腫を治療する方法に関する。

【0013】

別の態様では、本発明は、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤と、ＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤と、１種または複数の薬学的に許容される担体、賦形剤または添加剤とを含む、本発明の医薬組成物に関する。

【0014】

さらなる態様では、本発明は、黒色腫の治療のための、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩によって代表されるＣＤＫ阻害剤と、ＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤とを含む、組合せ医薬の使用に関する。

【0015】

さらなる態様では、本発明は、黒色腫の治療のための医薬品の製造のための、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩によって代表されるＣＤＫ阻害剤およびＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤の使用に関する。

【0016】

さらなる態様では、本発明は、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤と、ＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤とを含む、医薬キットに関する。

【0017】

本発明の他の態様および適応可能なさらなる範囲が、以下に続く詳述された記載から明らかとなろう。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】５日後のＧ３６１黒色腫細胞における、単独でおよび組み合わせた化合物Ａ（ボルシクリブ）およびベムラフェニブの細胞周期およびアポトーシスに対する影響を、フローサイトメトリーを使用して表す図である。

【図2】２４ｈ処置したＧ３６１黒色腫細胞における、単独でおよび組み合わせた化合物Ａ（ボルシクリブ）およびベムラフェニブの初期アポトーシスに対する影響を、Ａｎｎｅｘｉｎ染色法を使用して表すグラフである。

【図3】単独でおよび組み合わせた化合物Ａ（ボルシクリブ）およびベムラフェニブの、５日後のＳＫ−ＭＥＬ３黒色腫細胞の細胞周期およびアポトーシスに対する影響を、フローサイトメトリーを使用して表す図である。

【図4】Ａ３７５細胞株における、単独でおよび組み合わせた化合物Ａ（ボルシクリブ）およびベムラフェニブ（４８ｈ）の影響を表すグラフである。

【図5】Ｇ３６１細胞株における、単独でおよび組み合わせた化合物Ａ（ボルシクリブ）およびベムラフェニブ（４８ｈ）の影響を表すグラフである。

【図6】ＭＤＡ−ＭＢ４３５Ｓ細胞株における、単独でおよび組み合わせた化合物Ａ（ボルシクリブ）およびベムラフェニブ（４８ｈ）の影響を表すグラフである。

【図7a】Ａ３７５親細胞株およびＡ３７５Ｒ耐性細胞株に関する化合物Ａ（ボルシクリブ）およびベムラフェニブ単独での（４８ｈ）用量反応曲線を表すグラフである。

【図7b】Ａ３７５親細胞株およびＡ３７５Ｒ耐性細胞株に関する化合物Ａ（ボルシクリブ）およびベムラフェニブ単独での（４８ｈ）用量反応曲線を表すグラフである。

【図8a】Ａ３７５耐性細胞株における、単独でおよび組み合わせた化合物Ａ（ボルシクリブ）およびベムラフェニブ（４８ｈ）の影響を表すグラフである。

【図8b】Ａ３７５耐性細胞株における、単独でおよび組み合わせた化合物Ａ（ボルシクリブ）およびベムラフェニブ（４８ｈ）の影響を表すグラフである。

【図9a】Ａ３７５Ｒ耐性細胞株における、単独でおよび組み合わせた化合物Ａ（ボルシクリブ）およびベムラフェニブ（４８ｈ）の影響を表すグラフである。

【図9b】Ａ３７５Ｒ耐性細胞株における、単独でおよび組み合わせた化合物Ａ（ボルシクリブ）およびベムラフェニブ（４８ｈ）の影響を表すグラフである。

【図10a】Ａ３７５耐性細胞株における、単独でおよび組み合わせた化合物Ａ（ボルシクリブ）およびトラメチニブ（４８ｈ）の影響を表すグラフである。

【図10b】Ａ３７５耐性細胞株における、単独でおよび組み合わせた化合物Ａ（ボルシクリブ）およびトラメチニブ（４８ｈ）の影響を表すグラフである。

【図11a】Ａ３７５Ｒ耐性細胞株における、単独でおよび組み合わせた化合物Ａ（ボルシクリブ）およびトラメチニブ（４８ｈ）の影響を表すグラフである。

【図11b】Ａ３７５Ｒ耐性細胞株における、単独でおよび組み合わせた化合物Ａ（ボルシクリブ）およびトラメチニブ（４８ｈ）の影響を表すグラフである。

【図12a】Ａ３７５耐性細胞株における、単独でおよび組み合わせた化合物Ａ（ボルシクリブ）およびダブラフェニブ（４８ｈ）の影響を表すグラフである。

【図12b】Ａ３７５耐性細胞株における、単独でおよび組み合わせた化合物Ａ（ボルシクリブ）およびダブラフェニブ（４８ｈ）の影響を表すグラフである。

【図13a】Ａ３７５Ｒ耐性細胞株における、単独でおよび組み合わせた化合物Ａ（ボルシクリブ）およびダブラフェニブ（４８ｈ）の影響を表すグラフである。

【図13b】Ａ３７５Ｒ耐性細胞株における、単独でおよび組み合わせた化合物Ａ（ボルシクリブ）およびダブラフェニブ（４８ｈ）の影響を表すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本明細書のこれより前および本明細書のこれより以下に使用されている一般的用語は、本開示の脈絡の中で、他に指摘されていない限り、好ましくは以下の意味を有する。したがって、本発明の状況で使用した場合の一般的用語の定義は、本明細書で以下に提供される：

【0020】

単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈でそうでないことが明確に指示されていない限り複数の言及を含む。

【0021】

用語の一部としての「（複数も可）」の使用は、用語の個々についてまたは複数についての言及を含み、例えば薬剤（複数も可）という用語は、単一の薬剤または複数の薬剤を示している。

【0022】

本明細書で使用する場合、「少なくとも１種の」という用語は、１種または複数を指す。例えば、「少なくとも１種の抗がん剤」という用語は、この組合せが単一の抗がん剤または複数の抗がん剤を含むことを意味する。

【0023】

「置換」または「〜で置換されている」とは、このような置換は置換された原子および置換基の許容された原子価に合致するという暗黙の条件を含み、ならびに転位、環化、脱離などの変換を容易に受けない安定した化合物を意味することを理解されたい。

【0024】

本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される」という用語は、担体、賦形剤、添加剤および／または塩は、製剤の他の成分と適合しなければならず、そのレシピエントにとって有害であってはならないことを意味する。「薬学的に許容される」はまた、組成物または剤形は、健全な医学的判断の範囲内であり、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしに動物またはヒトに対する使用に対して適切であり、妥当なベネフィット／リスク比に見合うことを意味する。

【0025】

本明細書で使用する場合、「組合せ」または「組合せ医薬」という用語は、抗がん剤の併用投与、本発明の状況では、ＣＤＫ阻害剤（式Ｉの化合物）と、ＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤との併用投与を意味し、これらの抗がん剤は、独立して、同時にまたは組合せパートナーが相乗効果を示すことを特に可能にする時間間隔をおいて別々に投与することができる。

【0026】

サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）は、細胞周期の特異的な段階において活性化する酵素のファミリーである。ＣＤＫは、触媒サブユニット（実際のサイクリン依存性キナーゼまたはＣＤＫ）および調節サブユニット（サイクリン）からなる。少なくとも９種のＣＤＫ（ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ７、ＣＤＫ８、ＣＤＫ９など）および少なくとも１５種の異なるタイプのサイクリン（サイクリンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｅ、Ｈなど）が存在する。細胞周期の各ステップはこのようなＣＤＫ複合体により調節されている：Ｇ１／Ｓ移行（ＣＤＫ２／サイクリンＡ、ＣＤＫ４／サイクリンＤ１−Ｄ３、ＣＤＫ６／サイクリンＤ３）、Ｓ期（ＣＤＫ２／サイクリンＡ）、Ｇ２段階３０（ＣＤＫ１／サイクリンＡ）、Ｇ２／Ｍ移行段階（ＣＤＫ１／サイクリンＢ）。

【0027】

本明細書で使用する場合、「ＣＤＫ阻害剤」という用語は、１種または複数のサイクリン依存性キナーゼ（複数も可）（ＣＤＫ）を阻害することが可能な薬剤を指す。これらのキナーゼの異常な発現および過剰発現は、がんなどの多くの疾患状態において証拠だてられている。本発明の状況では、本発明の組合せ医薬中に含有されているＣＤＫ阻害剤は、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩を指す。本発明の化合物は、特異性をもって、ＣＤＫ１／サイクリンＢ、ＣＤＫ２／サイクリンＥ、ＣＤＫ４／サイクリンＤ、ＣＤＫ４／サイクリンＤ１および／またはＣＤＫ９／サイクリンＴ１を阻害する。

【0028】

本明細書で使用する場合、「ＢＲＡＦ阻害剤」という用語は、ＢＲＡＦキナーゼまたは変異したＢＲＡＦキナーゼ活性（１種または複数の変異形態のセリン−トレオニンタンパク質キナーゼＢ−ＲＡＦ（ＢＲＡＦ））を阻害可能な薬剤を指す。報告されたＢＲＡＦ突然変異の９０パーセントは、アミノ酸６００においてバリンがグルタミン酸で置換される（Ｖ６００Ｅ突然変異）。したがって、「ＢＲＡＦ阻害剤」という用語は、その範囲内に、ＢＲＡＦまたはその変異形態を阻害可能な化合物；またはＶ６００の変異形態のＢＲＡＦを阻害可能な化合物；または非難治性と難治性の黒色腫の両方におけるＶ６００Ｅ変異形態のＢＲＡＦを阻害可能な化合物を包含する。

【0029】

本明細書で使用する場合、「ＭＥＫ阻害剤」という用語は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＥＫ）と相互作用し、その酵素活性を阻害することが可能である薬剤を指す。ＭＥＫ酵素活性を阻害することは、ひいては基質ペプチドまたはタンパク質をリン酸化するＭＥＫの能力を低下させる。ＭＥＫ１およびＭＥＫ２は、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫシグナル伝達カスケードに関与しているタンパク質キナーゼである。このカスケードは、アポトーシス、細胞周期の進行、細胞遊走、分化、代謝および増殖を含む多種多様のプロセスの調節に関与している。したがって、「ＭＥＫ阻害剤」という用語は、その範囲内に、ＭＥＫを阻害可能な化合物を包含する。

【0030】

本明細書で使用する場合、「相乗的」または「相乗効果」または「相乗作用」という用語は、本明細書で使用する場合、化合物の組合せの治療効果を指し（ＢＲＡＦ阻害剤およびＣＤＫ阻害剤、すなわち式Ｉの化合物）、これは組合せ医薬で使用した化合物の相加効果より大きい。有利には、活性成分の間のこのような相乗効果（治療活性化合物）は、これらを組み合わせた場合、１種もしくは両方の活性成分のより少用量の使用を可能にし、同じ用量でより大きな効力が得られ、および／または多剤耐性の蓄積を予防もしくは遅延させる。ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙの組合せ指数（ＣＩ）法を使用して、組み合わせて使用した化合物の相乗効果、相加効果または拮抗効果を判定することができる。ＣＩ値が１未満である場合、この組合せで使用した化合物間で相乗効果が存在し、ＣＩ値が１と等しい場合、この組合せで使用した化合物間に相加効果が存在し、ＣＩ値が１を超える場合、拮抗効果が存在する。相乗効果は、組合せ医薬内に含有されている化合物または本発明の組成物を共製剤化することによって、および単位剤形を介して前記化合物を同時に投与するか、または同時にもしくは逐次的に投与される別々の製剤として投与することにより達成することができる。

【0031】

本明細書で使用する場合、「黒色腫」とは、皮膚および他の器官のメラニン細胞系に起因する腫瘍の増殖により特徴付けられる状態を指す。大部分のメラニン形成細胞は皮膚に生じるが、髄膜、消化管、リンパ節および眼にも発見されている。黒色腫が皮膚内に生じた場合、これは、皮膚黒色腫と呼ばれる。黒色腫は眼の中にも生じることができ、これは、眼のまたは眼内黒色腫と呼ばれる。黒色腫は、髄膜、消化管、リンパ節またはメラニン形成細胞が発見されている他の領域ではめったに生じない。

【0032】

交換可能なように使用される「変異型黒色腫」または「悪性黒色腫」という用語は、欠陥（「突然変異」とも呼ばれる）を有する黒色腫細胞を含むメラニン細胞の新生物を指す。悪性黒色腫は通常、母斑からまたは母斑付近から発生し、転移への顕著な傾向を有する細胞の塊からなる。黒色腫の４０〜６０％は、セリン−トレオニンタンパク質キナーゼＢ−ＲＡＦ（ＢＲＡＦ）をコードしている遺伝子の中に活性化している突然変異を保持する。黒色腫中に観察されたＢＲＡＦ突然変異の中で、９０％超がコドン６００の位置にあり、これらの中でも、９０％超が、グルタミン酸によるバリンの置換をもたらす単一のヌクレオチド突然変異である（ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ）。２番目に一般的な突然変異は、バリンをリシンに置換するＢＲＡＦ Ｖ６００Ｋであり、これは、黒色腫の５〜６％を占め、これにＢＲＡＦ Ｖ６００ＲおよびＢＲＡＦ Ｖ６００Ｄが続く。（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１２年、第１０巻、８５号、１〜９ページ）。

【0033】

「転移性黒色腫」という用語は、リンパ系および／または血管を介して、皮膚の表面下に位置する皮下組織を含む身体の他の部位、リンパ節、および他の器官、例えば、肺、肝臓、骨または脳などに拡散する黒色腫を指す。ＩＩＩ期黒色腫は、リンパ節転移のレベルにより特徴付けられる。遠隔転移の証拠はない。ＩＶ期黒色腫は、遠隔転移の位置および血清乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）のレベルにより特徴付けられる。この段階はまた転移性黒色腫とも呼ばれる。

【0034】

他に指摘されていない限り、「黒色腫」という用語はまた、再発性または耐性黒色腫を含み得る。「再発性」または「耐性」という用語は、黒色腫の繰り返す激増、または黒色腫の進行を指し、これは、前記激増または進行以前に疾患が治癒していたか否かに関わらない。

【0035】

したがって、組合せ医薬（本明細書中に記載されている通り）が提供される黒色腫の治療とは、非難治性、転移性または難治性（耐性）のＢＲＡＦ変異型黒色腫、特にＢＲＡＦ
Ｖ６００変異型黒色腫、より具体的にはＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異型黒色腫の治療を指す。

【0036】

「非応答性／難治性」という用語は、黒色腫に関連して使用した場合、黒色腫の治療のために、現在使用可能ながん療法、例えば、化学療法、放射線療法、手術、ホルモン療法および／または生物学的療法／免疫療法などで治療されている黒色腫を有する対象または患者を指すように本明細書で使用されており、この療法は、患者を治療するのに臨床的に十分ではないので、これらの患者は追加の有効な療法を必要としている、すなわち、療法の効果を受けないままでいる。この句はまた、療法に応答するが、副作用、再発に悩まされ、耐性が生じるか、または黒色腫の１種もしくは複数の症状のいかなる軽減も経験していない対象または患者について説明し得る。様々な実施形態では、「非応答性／難治性」とは、がん細胞の少なくとも一部の重要な部分が死滅していない、またはこれらの細胞分裂が停止していないことを意味する。がん細胞が「非応答性／難治性」であるかどうかの判定は、このような関連で当技術分野で受け入れられている「難治性」の意味を使用して、がん細胞に対する治療の有効性をアッセイする当技術分野で公知の任意の方法で、ｉｎ
ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで行うことができる。

【0037】

本明細書で使用する場合、「治療周期」という用語は、ＣＤＫ阻害剤、すなわち式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩；およびＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤の投与の反復連続がこの間に行われる時間周期を指す。

【0038】

「アポトーシス」という用語は、プログラミングされた細胞死の自然のプロセスを指す。アポトーシスは、細胞が特定化された細胞の機構を使用してそれ自体を死滅させる自己破壊のプロセスである。細胞は分解されて膜結合粒子となり、次いでこれがファゴサイトーシスにより排除される。アポトーシスは、後生動物が、細胞数を制御し、動物の生存を脅かす細胞を排除することを可能にする機序である。

【0039】

「対象」という用語は、本明細書で使用する場合、治療、観察または実験の対象となってきた動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトであり、より具体的には黒色腫に罹患したヒトを指す。「対象」という用語は、患者という用語と交換可能なように使用することができる。本発明の状況で、「それを必要とする対象」という句は、変異型または悪性黒色腫に対する治療を必要とする対象を意味する。代わりに、「それを必要とする対象」という句は、変異型または悪性黒色腫と診断された対象（患者）を意味する。

【0040】

「哺乳動物」という用語は、本明細書で使用する場合、ヒト、ならびに非ヒト哺乳動物を包含することを意図する。非ヒト哺乳動物として、これらに限定されないが、家畜、例えば、雌ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラットおよびマウスなど、ならびに非家禽動物が挙げられる。

【0041】

「治療有効量」という用語は、本明細書で使用する場合、このような治療を必要とする対象に投与された場合、治療利益を提供するのに十分である、ＣＤＫ阻害剤、すなわち、
式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩、およびＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤の量を指し、この治療利益とは以下を含む：（ｉ）黒色腫の１種もしくは複数の症状を予防もしくは遅延させる；（ｉｉ）黒色腫の１種もしくは複数の症状を回復させるもしくは排除する；または（ｉｉｉ）黒色腫を治療する。

【0042】

対象、好ましくは、哺乳動物、より好ましくはヒトにおける黒色腫に関する「治療する」または「治療」または「治療される」という用語は、以下を含む：（ｉ）黒色腫の阻害、すなわち、黒色腫の発症を阻止すること；（ｉｉ）黒色腫の回帰を減少させること；（ｉｉｉ）腫瘍細胞の末梢性器官への浸潤を阻害すること；（ｉｖ）転移を阻害すること（すなわち、減少、速度を落とすこと、または完全な休止）；（ｖ）黒色腫の回復、すなわち、黒色腫に伴う症状の重症度を減少させること；および（ｖｉ）黒色腫に伴う１種または複数の症状をある程度軽減すること。

【0043】

本発明の１つの態様によれば、黒色腫の治療における使用のための、式Ｉ

【0044】

【化1】

（式中、Ａｒはフェニル基であり、このフェニル基は、塩素およびトリフルオロメチルから選択される１または２つの異なる置換基で置換されている）
の化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤と、ＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤とを含む組合せ医薬が提供される。

【0045】

別の実施形態によれば、本発明の組合せ医薬中に含有されるＣＤＫ阻害剤は、式Ｉ（式中、Ａｒは、塩素およびトリフルオロメチルから選択される２つの異なる基で置換されているフェニル基である）の化合物または薬学的に許容されるその塩から選択される。

【0046】

別のさらなる実施形態によれば、本発明の組合せ医薬中に含有されるＣＤＫ阻害剤は、式Ｉ（式中、Ａｒは、塩素で置換されているフェニル基である）の化合物または薬学的に許容されるその塩から選択される。

【0047】

式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩の製造、およびこの化合物を含有する医薬組成物の製造は、ＰＣＴ特許公開ＷＯ２００４００４６３２（米国特許第７，２７１，１９３に対応する）およびＰＣＴ特許公開ＷＯ２００７１４８１５８に開示されている。これらのＰＣＴ特許公開は、式Ｉで表される化合物は、増殖性障害の治療に使用することができることを開示している。本明細書で上記に示されている通り式Ｉの化合物は、これらの塩の形態で使用することができる。式Ｉの化合物の好ましい塩として、酢酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、ケイヒ酸塩、クエン酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルクロン酸塩、グルタミン酸塩、グリコール酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヒドロフッ化物
、ケトグルタル酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メシル酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、スルファミン酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、トリフルオロ酢酸塩および当業者に公知の他の酸付加塩が挙げられる。

【0048】

一実施形態では、組合せ医薬に含有されるＣＤＫ阻害剤（式Ｉの化合物）は、（＋）−ｔｒａｎｓ−２−（２−クロロ−４−トリフルオロメチルフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オンまたはその薬学的に許容される塩である。

【0049】

別の実施形態では、組合せ医薬中に含有されるＣＤＫ阻害剤（式１の化合物）は（＋）−ｔｒａｎｓ−２−（２−クロロ−４−トリフルオロメチルフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチルピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩（本明細書では「化合物Ａ」と呼ばれる。化合物Ａはまた本明細書で「ボルシクリブ」とも呼ばれる）。

【0050】

一実施形態では、組合せ医薬中に含有されるＣＤＫ阻害剤（式１の化合物）は（＋）−ｔｒａｎｓ−２−（２−クロロ−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オンまたはその薬学的に許容される塩である。

【0051】

別の実施形態では、組合せ医薬中に含有されるＣＤＫ阻害剤（式１の化合物）は（＋）−ｔｒａｎｓ−２−（２−クロロ−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩（本明細書では「化合物Ｂ」と呼ばれる。化合物Ｂはまた本明細書で「リビシクリブ」とも呼ばれる）。

【0052】

一実施形態では、組合せ医薬中に含有されるＢＲＡＦ阻害剤は、Ｖ６００変異形態のＢＲＡＦの阻害剤である。

【0053】

一実施形態では、組合せ医薬中に含有されるＢＲＡＦ阻害剤は、Ｖ６００Ｅ変異形態のＢＲＡＦの阻害剤である。

【0054】

一実施形態では、組合せ医薬中に含有されるＢＲＡＦ阻害剤は、ＢＡＹ４３−９００６（ソラフェニブ、Ｂａｙｅｒ）、ベムラフェニブ（ＰＬＸ４０３２、Ｐｌｅｘｘｉｋｏｎ；ＲＧ７２０４、ＲＯ５１８５４２６、Ｈｏｆｍａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）、ＧＤＣ−０８７９（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ダブラフェニブ（ＧＳＫ２１１８４３６、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＰＬＸ４７２０（Ｈｏｆｍａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）、ＢＭＳ−９０８６６２（ＸＬ２８１、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＬＧＸ８１８（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＰＬＸ３６０３（ＲＯ５２１２０５４、Ｈｏｆｍａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）、ＡＲＱ−７３６（ＡｒＱｕｌｅ）、ＤＰ−４９７８（Ｄｅｃｉｐｈｅｒａ）またはＲＡＦ２６５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）から選択される。

【0055】

一実施形態では、組合せ医薬中に含有されるＢＲＡＦ阻害剤はベムラフェニブである。

【0056】

一実施形態では、組合せ医薬中に含有されるＢＲＡＦ阻害剤はダブラフェニブである。

【0057】

一実施形態では、組合せ医薬中に含有されるＭＥＫ阻害剤は、Ｖ６００変異形態のＢＲＡＦの阻害剤である。

【0058】

一実施形態では、組合せ医薬中に含有されるＭＥＫ阻害剤は、Ｖ６００ＥまたはＶ６００Ｋ変異形態のＢＲＡＦの阻害剤である。

【0059】

一実施形態では、組合せ医薬中に含有されるＭＥＫ阻害剤は、セルメチニブ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ビニメチニブ（Ａｒｒａｙ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）、ＰＤ−０３２５９０１（Ｐｆｉｚｅｒ）、トラメチニブ（Ｍｅｋｉｎｉｓｔ（商標））、コビメチニブ（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、レファメチニブ（Ｖａｌｅａｎｔ）、ピマセルチブ（Ｓａｎｔｈｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＴＡＫ−７３３（Ｔａｋｅｄａ）またはＷＸ−５５４（ＵＣＢ Ｐｈａｒｍａ ＳＡ）から選択される。

【0060】

一実施形態では、組合せ医薬中に含有されるＭＥＫ阻害剤はトラメチニブである。

【0061】

一実施形態では、本発明は、黒色腫の治療における使用のための組合せ医薬であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＢＲＡＦ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤の治療有効量とを含み、前記ＣＤＫ阻害剤および少なくとも１種の前記抗がん剤が同時に投与される、組合せ医薬に関する。

【0062】

一実施形態では、本発明は、黒色腫の治療における使用のための組合せ医薬であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＢＲＡＦ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤の治療有効量とを含み、前記ＣＤＫ阻害剤および少なくとも１種の前記抗がん剤が逐次的に投与される、組合せ医薬に関する。

【0063】

一実施形態では、本発明は、黒色腫の治療における使用のための組合せ医薬であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤の治療有効量とを含み、前記抗がん剤がＣＤＫ阻害剤の投与以前に投与される、組合せ医薬に関する。

【0064】

一実施形態では、本発明は、黒色腫の治療における使用のための組合せ医薬であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤の治療有効量とを含み、ＣＤＫ阻害剤が前記抗がん剤の投与以前に投与される、組合せ医薬に関する。

【0065】

一実施形態では、本発明は、黒色腫の治療における使用のための組合せ医薬であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤の治療有効量とを含み、ＣＤＫ阻害剤および前記抗がん剤が両方とも１日１回投与される、組合せ医薬に関する。

【0066】

別の実施形態では、本発明は、黒色腫の治療における使用のための組合せ医薬であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤の治療有効量とを含み、ＣＤＫ阻害剤が１日１回投与される一方で、前記抗がん剤が１日２回投与される、組合せ医薬に関する。

【0067】

さらに別の実施形態では、本発明は、黒色腫の治療における使用のための組合せ医薬であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治
療有効量と、ＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤の治療有効量とを含み、ＣＤＫ阻害剤および前記抗がん剤が両方とも１日２回投与される、組合せ医薬に関する。

【0068】

一態様では、本発明は、黒色腫の治療のための方法であって、式Ｉ（本明細書中に記載されている通り）の化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤の治療有効量とをそれを必要とする対象に投与することを含む、方法に関する。

【0069】

一実施形態では、本発明は、黒色腫を治療する方法であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤の治療有効量とを、それを必要とする対象に投与することを含み、ＣＤＫ阻害剤および前記抗がん剤が同時に投与される、方法に関する。

【0070】

一実施形態では、本発明は、黒色腫を治療する方法であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤の治療有効量とを、それを必要とする対象に投与することを含み、ＣＤＫ阻害剤および前記抗がん剤が逐次的に投与される、方法に関する。

【0071】

一実施形態では、本発明は、黒色腫を治療する方法であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤の治療有効量とを、それを必要とする対象に投与することを含み、前記抗がん剤が、前記ＣＤＫ阻害剤の投与以前に投与される、方法に関する。

【0072】

一実施形態では、本発明は、黒色腫を治療する方法であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤の治療有効量とを、それを必要とする対象に投与することを含み、前記ＣＤＫ阻害剤が前記抗がん剤の投与以前に投与される、方法に関する。

【0073】

一実施形態では、本発明は、黒色腫を治療する方法であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤の治療有効量とを、それを必要とする対象に投与することを含み、前記ＣＤＫ阻害剤および前記抗がん剤が両方とも１日１回投与される、方法に関する。

【0074】

別の実施形態では、本発明は、黒色腫を治療する方法であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤の少なくとも１種の治療有効量とを、それを必要とする対象に投与することを含み、前記ＣＤＫ阻害剤が１日１回投与され、前記抗がん剤が１日２回投与される、方法に関する。

【0075】

さらに別の実施形態では、本発明は、黒色腫を治療する方法であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤の少なくとも１種の治療有効量とを、それを必要とする対象に投与することを含み、前記ＣＤＫ阻害剤および前記抗がん剤が両方とも１日２回投与される、方法に関する。

【0076】

一実施形態では、黒色腫を治療する方法は、式Ｉの化合物から選択されるＣＤＫ阻害剤と、ＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤とを、本明細書に記載されている用量の範囲でそれを必要とする対象に投与することを含む。

【0077】

一実施形態では、本発明は、黒色腫の治療における使用のための組合せ医薬であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＢＲＡＦ阻害剤の治療有効量とを含み、前記ＢＲＡＦ阻害剤および前記ＣＤＫ阻害剤が同時に投与される、組合せ医薬に関する。

【0078】

一実施形態では、本発明は、黒色腫の治療における使用のための組合せ医薬であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＢＲＡＦ阻害剤の治療有効量とを含み、前記ＢＲＡＦ阻害剤および前記ＣＤＫ阻害剤が逐次的に投与される、組合せ医薬に関する。

【0079】

一実施形態では、本発明は、黒色腫の治療における使用のための組合せ医薬であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＢＲＡＦ阻害剤の治療有効量とを含み、前記ＢＲＡＦ阻害剤が前記ＣＤＫ阻害剤の投与以前に投与される、組合せ医薬に関する。

【0080】

一実施形態では、本発明は、黒色腫の治療における使用のための組合せ医薬であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＢＲＡＦ阻害剤の治療有効量とを含み、前記ＣＤＫ阻害剤が、前記ＢＲＡＦ阻害剤の投与以前に投与される、組合せ医薬に関する。

【0081】

一実施形態では、本発明は、黒色腫の治療における使用のための組合せ医薬であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＢＲＡＦ阻害剤の治療有効量とを含み、前記ＣＤＫ阻害剤および前記ＢＲＡＦ阻害剤が両方とも１日１回投与される、組合せ医薬に関する。

【0082】

別の実施形態では、本発明は、黒色腫の治療における使用のための組合せ医薬であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＢＲＡＦ阻害剤の治療有効量とを含み、前記ＣＤＫ阻害剤が１日１回投与され、前記ＢＲＡＦ阻害剤が１日２回投与される、組合せ医薬に関する。

【0083】

さらに別の実施形態では、本発明は、黒色腫の治療における使用のための組合せ医薬であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＢＲＡＦ阻害剤の治療有効量とを含み、前記ＣＤＫ阻害剤および前記ＢＲＡＦ阻害剤が両方とも１日２回投与される、組合せ医薬に関する。

【0084】

一態様では、本発明は、黒色腫の治療のための方法であって、式Ｉ（本明細書中に記載されている通り）の化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤およびＢＲＡＦ阻害剤の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法に関する。

【0085】

一実施形態では、本発明は、黒色腫を治療する方法であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＢＲＡＦ阻害剤の治療有効量とを、それを必要とする対象に投与することを含み、前記ＢＲＡＦ阻害剤および前記ＣＤＫ阻害剤が同時に投与される、方法に関する。

【0086】

一実施形態では、本発明は、黒色腫を治療する方法であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＢＲＡＦ阻害剤の治療有効量とを、それを必要とする対象に投与することを含み、前記ＢＲＡＦ阻害剤および前記ＣＤＫ阻害剤が逐次的に投与される、方法に関する。

【0087】

一実施形態では、本発明は、黒色腫を治療する方法であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＢＲＡＦ阻害剤の治療有効量とを、それを必要とする対象に投与することを含み、前記ＢＲＡＦ阻害剤が、前記ＣＤＫ阻害剤の投与以前に投与される、方法に関する。

【0088】

一実施形態では、本発明は、黒色腫を治療する方法であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＢＲＡＦ阻害剤の治療有効量とを、それを必要とする対象に投与することを含み、前記ＣＤＫ阻害剤が、前記ＢＲＡＦ阻害剤の投与以前に投与される、方法に関する。

【0089】

一実施形態では、本発明は、黒色腫を治療する方法であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＢＲＡＦ阻害剤の治療有効量とを、それを必要とする対象に投与することを含み、前記ＣＤＫ阻害剤および前記ＢＲＡＦ阻害剤が両方とも１日１回投与される、方法に関する。

【0090】

別の実施形態では、本発明は、黒色腫を治療する方法であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＢＲＡＦ阻害剤の治療有効量とを、それを必要とする対象に投与することを含み、前記ＣＤＫ阻害剤が１日１回投与される一方で、前記ＢＲＡＦ阻害剤が１日２回投与される、方法に関する。

【0091】

さらに別の実施形態では、本発明は、黒色腫を治療する方法であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＢＲＡＦ阻害剤の治療有効量とを、それを必要とする対象に投与することを含み、前記ＣＤＫ阻害剤および前記ＢＲＡＦ阻害剤が両方とも１日２回投与される、方法に関する。

【0092】

一実施形態では、黒色腫を治療する方法は、ＢＲＡＦ阻害剤と、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤とを、本明細書に記載されている用量の範囲でそれを必要とする対象に投与することを含む。

【0093】

一実施形態では、本発明は、黒色腫の治療における使用のための組合せ医薬であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＭＥＫ阻害剤の治療有効量とを含み、前記ＭＥＫ阻害剤および前記ＣＤＫ阻害剤が同時に投与される、組合せ医薬に関する。

【0094】

一実施形態では、本発明は、黒色腫の治療における使用のための組合せ医薬であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＭＥＫ阻害剤の治療有効量とを含み、ＭＥＫ阻害剤およびＣＤＫ阻害剤が逐次的に投与される、組合せ医薬に関する。

【0095】

一実施形態では、本発明は、黒色腫の治療における使用のための組合せ医薬であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＭＥＫ阻害剤の治療有効量とを含み、前記ＭＥＫ阻害剤が前記ＣＤＫ阻害剤の投与以前に投与される、組合せ医薬に関する。

【0096】

一実施形態では、本発明は、黒色腫の治療における使用のための組合せ医薬であって、
式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＭＥＫ阻害剤の治療有効量とを含み、前記ＣＤＫ阻害剤が前記ＭＥＫ阻害剤の投与以前に投与される、組合せ医薬に関する。

【0097】

一実施形態では、本発明は、黒色腫の治療における使用のための組合せ医薬であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＭＥＫ阻害剤の治療有効量とを含み、前記ＣＤＫ阻害剤および前記ＭＥＫ阻害剤が両方とも１日１回投与される、組合せ医薬に関する。

【0098】

別の実施形態では、本発明は、黒色腫の治療における使用のための組合せ医薬であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＭＥＫ阻害剤の治療有効量とを含み、前記ＣＤＫ阻害剤が１日１回投与される一方で、前記ＭＥＫ阻害剤が１日２回投与される、組合せ医薬に関する。

【0099】

さらに別の実施形態では、本発明は、黒色腫の治療における使用のための組合せ医薬であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＭＥＫ阻害剤の治療有効量とを含み、前記ＣＤＫ阻害剤および前記ＭＥＫ阻害剤が両方とも１日２回投与される、組合せ医薬に関する。

【0100】

一態様では、本発明は、黒色腫の治療のための方法であって、式Ｉ（本明細書中に記載されている通り）の化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法に関する。

【0101】

一実施形態では、本発明は、黒色腫を治療する方法であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＭＥＫ阻害剤の治療有効量とを、それを必要とする対象に投与することを含み、前記ＭＥＫ阻害剤および前記ＣＤＫ阻害剤が同時に投与される、方法に関する。

【0102】

一実施形態では、本発明は、黒色腫を治療する方法であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＭＥＫ阻害剤の治療有効量とを、それを必要とする対象に投与することを含み、前記ＭＥＫ阻害剤および前記ＣＤＫ阻害剤が逐次的に投与される、方法に関する。

【0103】

一実施形態では、本発明は、黒色腫を治療する方法であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＭＥＫ阻害剤の治療有効量とを、それを必要とする対象に投与することを含み、前記ＭＥＫ阻害剤が前記ＣＤＫ阻害剤の投与以前に投与される、方法に関する。

【0104】

一実施形態では、本発明は、黒色腫を治療する方法であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＭＥＫ阻害剤の治療有効量とを、それを必要とする対象に投与することを含み、前記ＣＤＫ阻害剤が前記ＭＥＫ阻害剤の投与以前に投与される、方法に関する。

【0105】

一実施形態では、本発明は、黒色腫を治療する方法であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＭＥＫ阻害剤の治療有効量とを、それを必要とする対象に投与することを含み、前記ＣＤＫ阻害剤および前記ＭＥＫ阻害剤が両方とも１日１回投与される、方法に関する。

【0106】

別の実施形態では、本発明は、黒色腫を治療する方法であって、式Ｉの化合物または薬
学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＭＥＫ阻害剤の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含み、前記ＣＤＫ阻害剤が１日１回投与される一方で、前記ＭＥＫ阻害剤が１日２回投与される、方法に関する。

【0107】

さらに別の実施形態では、本発明は、黒色腫を治療する方法であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量とＭＥＫ阻害剤の治療有効量とを、それを必要とする対象に投与することを含み、前記ＣＤＫ阻害剤および前記ＭＥＫ阻害剤の両方とも１日２回投与される、方法に関する。

【0108】

一実施形態では、黒色腫を治療する方法は、ＭＥＫ阻害剤と、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤とを、本明細書に記載されている用量範囲で、それを必要とする対象に投与することを含む。

【0109】

一実施形態では、本発明は、黒色腫の治療における使用のための組合せ医薬であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＢＲＡＦ阻害剤の治療有効量と、ＭＥＫ阻害剤の治療有効量とを含む、組合せ医薬に関する。

【0110】

一実施形態では、本発明は、黒色腫を治療する方法であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と、ＢＲＡＦ阻害剤の治療有効量と、ＭＥＫ阻害剤の治療有効量とを、それを必要とする対象に投与することを含む、方法に関する。

【0111】

本発明の一実施形態では、治療している黒色腫は非難治性黒色腫である。

【0112】

本発明の別の実施形態では、治療している黒色腫は非難治性ＢＲＡＦ変異型黒色腫である。

【0113】

本発明のさらに別の実施形態では、治療している黒色腫は非難治性ＢＲＡＦ Ｖ６００変異型黒色腫である。

【0114】

本発明のさらなる実施形態では、治療している黒色腫は非難治性ＢＲＡＦ Ｖ６００ＥまたはＢＲＡＦ Ｖ６００Ｋ変異型黒色腫である。

【0115】

本発明の一実施形態では、治療している黒色腫は再発性または難治性黒色腫である。

【0116】

本発明の別の実施形態では、治療している黒色腫は耐性ＢＲＡＦ変異型黒色腫である。

【0117】

本発明のさらに別の実施形態では、治療している黒色腫は耐性ＢＲＡＦ Ｖ６００変異型黒色腫である。

【0118】

本発明のさらなる実施形態では、治療している黒色腫は耐性ＢＲＡＦ Ｖ６００ＥまたはＢＲＡＦ Ｖ６００Ｋ変異型黒色腫である。

【0119】

本発明の一実施形態では、治療している黒色腫は転移性黒色腫である。

【0120】

本発明の別の実施形態では、治療している黒色腫は転移性ＢＲＡＦ変異型黒色腫である。

【0121】

本発明のさらに別の実施形態では、治療している黒色腫は転移性ＢＲＡＦ Ｖ６００変
異型黒色腫である。

【0122】

本発明のさらなる実施形態では、治療している黒色腫は転移性ＢＲＡＦ Ｖ６００ＥまたはＢＲＡＦ Ｖ６００Ｋ変異型黒色腫である。

【0123】

本発明によると、ＣＤＫ阻害剤（式Ｉの化合物）、ならびに／またはＢＲＡＦ阻害剤および／もしくはＭＥＫ阻害剤から選択される抗がん剤の投与は、制限なしで、非経口、経口、舌下、経皮的、局所的、鼻腔内、エアゾール、眼内、気管内または直腸内を含む任意の適切な経路によることができる。

【0124】

一実施形態では、ＣＤＫ阻害剤は、その良好な血中濃度を生成および維持するために経口投与することができる一方で、ＢＲＡＦ阻害剤および／またはＭＥＫ阻害剤から選択される抗がん剤（複数も可）は、非経口的に、静脈内、皮下、筋肉内、血管内または点滴の経路により投与することができる。

【0125】

別の実施形態では、ＣＤＫ阻害剤は、非経口的に静脈内、皮下、筋肉内、血管内または点滴の経路により投与することができる一方で、ＢＲＡＦ阻害剤および／またはＭＥＫ阻害剤から選択される抗がん剤（複数も可）は経口投与することができる。

【0126】

さらなる実施形態では、ＣＤＫ阻害剤と、ＢＲＡＦ阻害剤および／またはＭＥＫ阻害剤から選択される抗がん剤（複数も可）との両方は、その良好な血中濃度を生成および維持するために経口投与することができる。

【0127】

またさらなる実施形態では、式ＩのＣＤＫ阻害剤と、ＢＲＡＦ阻害剤および／またはＭＥＫ阻害剤から選択される抗がん剤（複数も可）との両方は、静脈内、皮下、筋肉内、血管内または点滴の経路により非経口的に投与することによって、その良好な血中濃度を生成および維持することができる。

【0128】

一態様では、本発明は、黒色腫の治療における使用のための医薬組成物であって、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤と、ＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤と、１種または複数の薬学的に許容される担体、賦形剤または添加剤とを含む、医薬組成物に関する。丸剤、錠剤、コーティング錠および硬ゼラチンカプセル剤の生成については、使用することができる医薬活性のある添加剤として、これらに限定されないが、ラクトース、トウモロコシデンプンまたはその誘導体、アラビアガム、苦土またはグルコースなどが挙げられる。軟ゼラチンカプセル剤および坐剤については、使用することができる担体として、これらに限定されないが、脂肪、ワックス、天然の油または硬化油などが挙げられる。液剤、例えば注射溶液剤の生成に、または乳剤もしくはシロップ剤に適切な担体は、例えば、水、生理的塩化ナトリウム溶液もしくはアルコール、例えば、エタノール、プロパノールもしくはグリセロール、糖溶液、例えば、グルコース溶液もしくはマンニトール溶液、または記述された様々な溶媒の混合物である。

【0129】

ＣＤＫ阻害剤（式Ｉの化合物）と、ＢＲＡＦ阻害剤および／またはＭＥＫ阻害剤から選択される抗がん剤（複数も可）とは、個々にまたは組み合わせて、当業者に精通している従来の製薬技術を使用して、例えば、ブレンディング、造粒、溶解または凍結乾燥などにより、医薬剤形へと製剤化することができる。

【0130】

一般的に、医薬としての使用を意図する組成物は、医薬組成物の製造に対して当技術分野で公知の任意の方法、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ−Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（第２１版）（２００５年）、Ｇｏｏｄｍａ
ｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（第１１版）（２００６年）およびＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（第９版）、およびＳｏｌｉｄ−Ｓｔａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ（第２版）（１９９９年）などに従い調製することができる。

【0131】

本明細書に記載されている組成物は、経口投与に適切な形態、例えば、固体剤形、例えば、錠剤、カプセル剤、ロゼンジ剤または顆粒剤；液体剤形、例えば、乳剤、液剤、懸濁剤；非経口注射（静脈内、皮下、筋肉内、血管内または点滴を含む）に適切な形態、例えば、無菌液剤、懸濁剤または乳剤；局所投与に適切な形態、例えば、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤またはローション剤であることができる。

【0132】

経口投与用組成物は、錠剤、ロゼンジ剤、水性懸濁剤または油性懸濁剤、顆粒剤、散剤、カシェ剤、乳剤、カプセル剤、シロップ剤またはエリキシル剤の形態であってよい。経口投与された組成物は、１種または複数の任意選択の薬剤、例えば、甘味剤、例えば、フルクトース、アスパルテームまたはサッカリンなど；矯味矯臭剤、例えば、ペパーミント、冬緑油またはサクランボなど；着色剤；および保存剤を含有することによって、薬学的に口当たりの良い調製物を得ることができる。浸透活性のある推進化合物を取り囲む選択的に浸透性のある膜もまた、本発明による組合せ医薬中に含有されている化合物（ＣＤＫ阻害剤、ならびに／またはＢＲＡＦ阻害剤および／もしくはＭＥＫ阻害剤から選択される抗がん剤（複数も可））の経口投与に対して適切である。経口投与に対して適切である組成物として、標準的なビヒクル、例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、トウモロコシデンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを挙げることができる。このようなビヒクルは好ましくは薬学的等級のものである。

【0133】

軟膏剤、クリーム剤に対して、活性成分（ＣＤＫ阻害剤、ならびに／またはＢＲＡＦ阻害剤および／もしくはＭＥＫ阻害剤から選択される抗がん剤（複数も可））は、水中油型または油中水型基剤の中に製剤化する。

【0134】

筋肉内、腹腔内、皮下および静脈内の使用に対して、活性成分（ＣＤＫ阻害剤、ならびに／またはＢＲＡＦ阻害剤および／もしくはＭＥＫ阻害剤から選択される抗がん剤（複数も可））の無菌液剤が通常利用され、液剤のｐＨは、適切に調節され、緩衝されるべきである。

【0135】

さらに、化合物、すなわち医薬組成物中に含有されるＣＤＫ阻害剤、ならびに／またはＢＲＡＦ阻害剤および／もしくはＭＥＫ阻害剤から選択される抗がん剤（複数も可）の効果を適切な製剤を介して遅延または延長させることができる。例えば、ゆっくりと溶解する化合物のペレットを調製し、錠剤またはカプセル剤中に組み込むことができる。この技術は、いくつかの異なる溶解速度のペレットを作製し、カプセル剤にペレットの混合物を充填することによって改善することができる。錠剤またはカプセル剤は、予想可能な期間の間、溶解を食い止めるフィルムでコーティングすることができる。非経口の調製物さえも、血清中でゆっくりとしか分散しないようにする油性または乳化したビヒクル中に化合物を溶解または懸濁させることによって長時間作用性にすることができる。

【0136】

投与に使用される、式Ｉの化合物から選択されるＣＤＫ阻害剤、ならびにＢＲＡＦ阻害剤および／またはＭＥＫ阻害剤から選択される抗がん剤（複数も可）の有効用量は、疾患（黒色腫）の重症度、症状の重症度、患者の年齢、性別、体重および感度の差、投与のモード、時間、間隔および持続時間、製剤の性質およびタイプなどに応じて異なる。ある特定の実施形態では、本発明による組合せ医薬に含有されている治療剤は、両方の薬剤が依
然として活性のある時間枠内で投与される。当業者であれば、投与される前記治療剤の半減期を求めることによって、このような時間枠を求めることができる。本明細書で以前に示した通り、医薬組成物中に含有されている抗がん剤は、同時または逐次的に投与することができる。当業者であれば、本発明の範囲および精神の中でいくつかの変形形態が可能であることを認識されよう。

【0137】

投与する治療剤の投薬量は、所望の効果を生むように選択されるべきである。ＣＤＫ阻害剤の適切な投薬量は、約５ｍｇ〜約５００ｍｇであってよい。投与されることになるＣＤＫ阻害剤の用量は、治療すべき黒色腫の重症度に応じて幅広い範囲を網羅することができる。毎日投与されることになる用量は、所望の効果を得るように選択することができる。適切な用量は、約５０ｍｇ／日〜３５０ｍｇ／日のＣＤＫ阻害剤の範囲であってよい。必要とされる場合、より高いまたはより低い１日用量もまた投与することができる。

【0138】

一実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤は、約１ｍｇ／日〜約２５００ｍｇ／日を投与することができ、この量は、１日当たり、または１回の投与当たり、または治療の１サイクル当たりの単回用量もしくは複数回用量で付与することができる。

【0139】

一実施形態では、ＭＥＫ阻害剤は、約０．０１ｍｇ／日〜２０００ｍｇ／日を投与することができ、この量は、１日当たり、または１回の投与当たり、または治療の１サイクル当たりの単回用量もしくは複数回用量で付与することができる。

【0140】

一実施形態では、ＣＤＫ阻害剤と、ＢＲＡＦ阻害剤および／またはＭＥＫ阻害剤から選択される抗がん剤（複数も可）との両方が１日１回投与される。別の実施形態では、ＣＤＫ阻害剤と、ＢＲＡＦ阻害剤および／またはＭＥＫ阻害剤から選択される抗がん剤（複数も可）との両方が１日２回投与される。さらなる実施形態では、ＣＤＫ阻害剤は１日１回投与される一方で、ＢＲＡＦ阻害剤および／またはＭＥＫ阻害剤から選択される抗がん剤（複数も可）は１日２回投与される。しかし、本発明による組合せ医薬中に含有されている各治療剤の量は、組み合わせて使用する場合、単独で投与される場合の治療効果を生む量より通常少ないことになる。便宜のため、総１日用量は、所望する場合、分割し、その日の間に少しずつ投与することができる。

【0141】

本発明で提供される組合せは、ある特定のアッセイ系、およびいくつかの異なる投与スケジュールで、ｉｎ ｖｉｔｒｏで評価されてきた。実験の詳細は、として本明細書で以下に提供されている通りである。本明細書で提示されたデータでは、ＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤は、式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩から選択されるＣＤＫ阻害剤と組み合わせた場合、相乗効果を示すことが明確に示されている。治療剤は、黒色腫の治療に組み合わせて使用した場合、細胞がＣＤＫ阻害剤のみで処置された場合（すなわち、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を単独で）またはＢＲＡＦ阻害剤のみもしくはＭＥＫ阻害剤のみで処置された場合よりも、増殖性細胞におけるアポトーシスまたは細胞毒性を増加させることが明確に示された。

【0142】

一態様では、本発明は、ＣＤＫ阻害剤（式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩）と、ＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤とを含む医薬キットに関する。医薬キットは、式Ｉの化合物もしくは薬学的に許容されるその塩と、ＢＲＡＦ阻害剤もしくはＭＥＫ阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤とを一定用量製剤として含有する容器を含んでもよいし、またはキットは、式Ｉの化合物もしくは薬学的に許容されるその塩、およびＢＲＡＦ阻害剤もしくはＭＥＫ阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤に対して２つ以上の別々の容器を含んでもよい。キットは、適応、使用法、用量、投与の指示、禁忌、予防策および注意事項についての情報を含む添付文書をさらに含んでもよい。使用することができる適切な容器として、ビン、バイ
アル、アンプル、シリンジまたはブリスター包装が挙げられる。医薬キットは、薬学的に許容される緩衝剤、注射用の水、リン酸緩衝食塩水、リンガー液およびデキストロース溶液を含むさらなる容器を場合によって含んでもよい。

【0143】

ＣＤＫ阻害剤、すなわち、本発明の組合せ医薬中に含有されている式Ｉの化合物は、ＰＣＴ特許公開ＷＯ２００４００４６３２およびＰＣＴ特許公開ＷＯ２００７１４８１５８に開示されている方法に従い調製することができる。

【0144】

式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩の調製のための一般的方法は、以下のステップ：
（ａ）ルイス酸触媒の存在下で、式ＶＩＡ

【0145】

【化2】

の中間体化合物の分割されたエナンチオマーとして純粋な（−）−ｔｒａｎｓエナンチオマーを、無水酢酸で処理することによって、分割された式ＶＩＩＡ

【0146】

【化3】

のアセチル化化合物を得るステップと、
（ｂ）塩基および溶媒の存在下で、分割された式ＶＩＩＡのアセチル化化合物を、式ＡｒＣＯＯＨの酸または式ＡｒＣＯＣｌの酸塩化物または式（ＡｒＣＯ）₂Ｏの酸無水物また
は式ＡｒＣＯＯＣＨ₃のエステル（式中、Ａｒは、式Ｉの化合物に関連して本明細書で上
記に定義された通りである）と反応させることによって、式ＶＩＩＩＡ

【0147】

【化4】

の分割化合物を得るステップと、
（ｃ）適切な溶媒中で式ＶＩＩＩＡの分割化合物を塩基で処理することによって、式ＩＸ
Ａ

【0148】

【化5】

（式中、Ａｒは上で定義された通りである）、
の対応する分割されたβ−ジケトン化合物を得るステップと、
（ｄ）式ＩＸＡの分割されたβ−ジケトン化合物を、塩酸などの酸で処理することによって、式ＸＡ

【0149】

【化6】

の対応する環化化合物を得るステップと、
（ｅ）１２０〜１８０℃の範囲の温度で脱アルキル化剤と共にこれを加熱することにより、式ＸＡの化合物を脱アルキル化の対象とすることによって、式Ｉの化合物の（＋）−ｔｒａｎｓエナンチオマーを得、および場合によって、対象化合物をその薬学的に許容される塩に変換するステップと
を含む。

【0150】

上記ステップ（ａ）で利用されるルイス酸触媒は、ＢＦ₃、Ｅｔ₂Ｏ、塩化亜鉛、塩化アルミニウムおよびチタニウム塩化物から選択することができる。

【0151】

プロセスステップ（ｂ）で利用される塩基は、トリエチルアミン、ピリジンおよびＤＣＣ−ＤＭＡＰの組合せ（Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドと４−ジメチルアミノピリジンの組合せ）から選択することができる。

【0152】

式ＶＩＩＩＡの化合物の対応する式ＩＸＡのβ−ジケトン化合物への転位は、Ｂａｋｅｒ−Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ転位として公知であることは当業者には明らかである（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、１９３３年、１３８１ページおよびＣｕｒｒ．Ｓｃｉ．、１９３３年、第４巻、２１４ページ）。

【0153】

プロセスステップ（ｃ）で使用される塩基は、リチウムヘキサメチルジシラジド、ナトリウムヘキサメチルジシラジド、カリウムヘキサメチルジシラジド、水素化ナトリウムおよび水素化カリウムから選択することができる。好ましい塩基はリチウムヘキサメチルジシラジドである。

【0154】

式ＩＸＡの化合物の脱アルキル化のためのプロセスステップ（ｅ）において使用される脱アルキル化剤は、ピリジン塩酸塩、三臭化ホウ素、三フッ化ホウ素エーテレートおよび三塩化アルミニウムから選択することができる。好ましい脱アルキル化剤はピリジン塩酸塩である。

【0155】

式ＶＩＡの出発化合物の調製は、１−メチル−４−ピペリドンを１，３，５−トリメトキシベンゼンの氷酢酸中溶液と反応させることによって、１−メチル−４−（２，４，６−トリメトキシフェニル）−１，２，３，６−テトラヒドロピリジンを生成し、これを、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル、水素化ホウ素ナトリウムおよびテトラヒドロフランと反応させることによって、１−メチル−４−（２，４，６−トリメトキシフェニル）ピペリジン−３−オールを生成することを含む。１−メチル−４−（２，４，６−トリメトキシフェニル）ピペリジン−３−オールを式ＶＩＡの化合物へと変換することは、トリエチルアミン、ピリジン、炭酸カリウムまたは炭酸ナトリウムなど酸素求核試薬の存在下で、ｐ−トルエンスルホニルクロリド、メタンスルホニルクロリド、トリフル無水物または五塩化リンなどの適当な試薬による処理により、化合物、１−メチル−４−（２，４，６−トリメトキシフェニル）ピペリジン−３−オールのピペリジン環上に存在するヒドロキシル基を、トシル、メシル、トリフレートまたはハロゲン化物などの脱離基へ変換し、これに続いて、酢酸ナトリウムまたは酢酸カリウムなどの酸素求核試薬の存在下、イソプロパノール、エタノールまたはプロパノールなどのアルコール性溶媒中で環縮小を行うことを含む。

【0156】

薬理学的アッセイで使用した代表的な化合物、化合物Ａ（ボルシクリブとも呼ばれる）は、（＋）−ｔｒａｎｓ−２−（２−クロロ−４−トリフルオロフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩を指し、刊行されたＰＣＴ公開ＷＯ２００７１４８１５８で開示された化合物の１つであった。

【0157】

薬理学的アッセイで使用したもう１つの代表的な化合物、化合物Ｂ（リビシクリブとも呼ばれる）は、（＋）−ｔｒａｎｓ−２−（２−クロロフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩を指し、刊行されたＰＣＴ公開ＷＯ２００４００４６３２で開示された化合物の１つであった。

【0158】

ＣＤＫ阻害剤と、ＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤から選択される少なくとも１種の抗がん剤とを含む本発明による組合せの相乗効果が、好ましいその実施形態を参照してより詳細にここで説明される。これらは、例としてのみ提供され、本発明を制限することを意図しないことに注意されたい。

【0159】

本発明は、反対であると明示的に特定された場合を除いて、様々な代替の変形形態およびステップの順序が想定し得ることを理解されたい。さらに、任意の作業実施例を除いて、または別の方法が示されていない限り、明細書および特許請求の範囲に使用されている、例えば成分の量を表現するすべての数は、すべての場合において「約」という用語で修飾されているものとして理解されたい。したがって、特にそれとは反対の指示がない限り、以下の明細書および付随する特許請求の範囲に示された数値的パラメーターは、本発明で得られる所望の特性に応じて異なり得る。

【0160】

当業者であれば、いくつかの変形形態が本発明の範囲および趣旨内で可能であることを認識している。本発明は、ここで、以下の非限定的例を参照してより詳細に記載される。以下の実施例は、本発明をさらに例示するが、当然のことながら、その範囲を制限するも
のとして決して解釈されるべきではない。

【実施例】

【0161】

以下の略語または用語が本明細書で使用されている：
ＢＦ₃：三フッ化ホウ素
ＢＦ₃．Ｅｔ₂Ｏ：三フッ化ホウ素ジエチルエーテル
ＣａＣｌ₂：塩化カルシウム
ＣＨＣｌ₃：クロロホルム
ＣＤＣｌ₃：重水素化クロロホルム
ＣＯ₂：二酸化炭素
ＤＣＣ：Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン
ＤＭＦ：Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
Ｅｔ₂Ｏ：ジエチルエーテル
ＥｔＯＡｃ：酢酸エチル
ｇ：グラム
ｈ：時間
ＨＣｌ：塩酸
ＩＰＡ：イソプロピルアルコール
ＫＢｒ：臭化カリウム
Ｋｇ：キログラム
Ｌ：リットル
ＭｅＯＨ：メタノール
ｍｉｎ：分
ｍｇ：ミリグラム
ｍＬ：ミリリットル
μＬ：ミクロリットル
μＭ：マイクロモル
ｍｍｏｌ：ミリモル
ｍｏｌ：モル
ＮａＣｌ：塩化ナトリウム
Ｎａ₂ＣＯ₃：炭酸ナトリウム
ＮａＨＣＯ₃：炭酸水素ナトリウム
Ｎａ₂ＳＯ₄：硫酸ナトリウム
ｎ−ＢｕＬｉ：ｎ−ブチルリチウム
ＰＥＬ：Ｐｉｒａｍａｌ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ
℃：摂氏度
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン

【0162】

例
化合物Ａ（ボルシクリブ）および化合物Ｂ（リビシクリブ）の調製、式１の代表的な化合物を本明細書で参照例として提示する：

【0163】

参照例１：
（ａ）（＋）−ｔｒａｎｓ−２−（２−クロロ−４−トリフルオロメチルフェニル）−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチルピロリジン−３−イル）−５，７−ジメトキシ−クロメン−４−オンの調製
窒素雰囲気下、０℃で維持されたｎ−ＢｕＬｉ（ヘキサン中１５％溶液、２．２ｍＬ、５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍＬ）中溶液、に、ヘキサメチルジシラザン（１．０８ｍＬ
、５．１ｍｍｏｌ）を滴加し、１５ｍｉｎ撹拌した。温度を０℃で維持しながら、これに、（＋）−ｔｒａｎｓ−２−クロロ−４−トリフルオロメチル安息香酸２−（２−アセトキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−６−アセチル−３，５−ジメトキシフェニルエステル（１．４４ｇ、２．５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍＬ）中溶液を滴加した。添加後、室温まで温めて反応させ、２．５ｈ撹拌した。反応混合物を希釈ＨＣｌで酸性化し、１０％炭酸水素ナトリウムでｐＨ８〜９に塩基性化した。水層をクロロホルム（３×２５ｍＬ）で抽出した。有機層を水（２５ｍＬ）、ブライン（２５ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で脱水した。有機層を減圧下で濃縮し、真空下で乾燥させることによって、油として酢酸３−｛３−［３−（２−クロロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−３−オキソ−プロピオニル］−２−ヒドロキシ−４，６−ジメトキシ−フェニル｝−１−メチル−ピロリジン−２−イルメチルエステルを生成した（１．３ｇ、９０．２％）。このエステルを濃縮ＨＣｌ（１０ｍＬ）に溶解し、３ｈ撹拌して環化を生じさせた。３ｈの終わりに、反応混合物を固体ＮａＨＣＯ₃でｐＨ８〜９に塩基性化した。水層をクロロホ
ルム（２５×３ｍＬ）で抽出し、水（２５ｍＬ）およびブライン（２５ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ₂ＳＯ₄で脱水し、減圧下で濃縮し、真空で脱水した。クロロホルム中３％メタノールおよび０．１％アンモニアを溶離液として有するカラムクロマトグラフィーで残渣を精製することによって、黄色の固体として、化合物、（＋）−ｔｒａｎｓ−２−（２−クロロ−４−トリフルオロメチルフェニル）−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチルピロリジン−３−イル）−５，７−ジメトキシ−クロメン−４−オンを生成した。
収量: 0.56 g (48.2 %); ¹H NMR (CDCl₃, 300MHz): δ 7.95 (d, 1H), 7.78 (s, 1H), 7.69 (d, 1H), 6.61 (s, 1H), 6.46 (s, 1H), 4.21 (m, 1H), 4.01 (s, 3H), 3.93 (s, 3H), 3.71 (dd, 1H), 3.41 (d, 1H), 3.26 (m, 1H), 2.84 (m, 1H), 2.70 (m, 1H), 2.44 (s, 3H), 2.10 (m, 2H); MS (ES+): m/z 497 (M+1).

【0164】

（ｂ）（＋）−ｔｒａｎｓ−２−（２−クロロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシ−メチル−１−メチルピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オンの調製
パート（ａ）で得た化合物（０．２５ｇ、０．５ｍｍｏｌ）、ピリジン塩酸塩（０．２５ｇ、２．１６ｍｍｏｌ）および触媒量のキノリンの混合物を１８０℃で２．５ｈの間加熱した。反応混合物をメタノール（２５ｍＬ）で希釈し、固体Ｎａ₂ＣＯ₃でｐＨ１０に塩基性化した。反応混合物を濾過し、メタノールで洗浄した。有機層を濃縮し、０．１％アンモニアおよびクロロホルム中４．５％メタノールを溶離液として使用するカラムクロマトグラフィーで残渣を精製することによって、黄色の固体として、化合物、（＋）−ｔｒａｎｓ−２−（２−クロロ−４−トリフルオロメチルフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシ−メチル−１−メチルピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オンを生成した。
収量: 0.15 g (63.7 %); ¹ H NMR (CDCl₃, 300MHz): δ 7.99 (m, 2H), 7.83 (d, 1H), 6.65 (s, 1H), 6.41 (s, 1H), 4.24 (m, 1H), 3.90 (m, 2H), 3.70 (m, 1H), 3.60 (m, 1H), 3.41 (m, 1H), 2.99 (s, 3H), 2.54 (m, 1H), 2.28 (m, 1H); MS (ES+): m/z 470 (M+1).

【0165】

（ｃ）（＋）−ｔｒａｎｓ−２−（２−クロロ−４−トリフルオロメチルフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシ−メチル−１−メチルピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩（化合物Ａまたはボルシクリブ）の調製
（ｂ）で得た化合物（０．１ｇ、０．２ｍｍｏｌ）をメタノール（２ｍＬ）中に懸濁させ、エーテルのＨＣｌで処理し、有機溶媒を蒸発させることによって、化合物、（＋）−ｔｒａｎｓ−２−（２−クロロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩を生成した。
収量: 0.1 g (92.8 %); ¹H NMR (CDCl₃, 300MHz): δ 8.02 (d, 2H), 7.83 (d, 1H), 6.64 (s, 1H), 6.41 (s, 1H), 4.23 (m, 1H), 3.73 (m, 2H), 3.68 (m, 1H), 3.51 (m, 1H),
3.39 (m, 1H), 2.99 (s, 3H), 2.54 (m, 1H), 2.31 (m, 1H).

【0166】

参照例２：
（ａ）（＋）−ｔｒａｎｓ−２−（２−クロロフェニル）−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチルピロリジン−３−イル）−５，７−ジメトキシ−クロメン−４−オンの調製
窒素雰囲気下で撹拌しながら、水素化ナトリウム（５０％、０．５４ｇ、１１．２５ｍｍｏｌ）を、（−）−ｔｒａｎｓ−１−［２−ヒドロキシ−３−（２−ヒドロキシメチル−１−メチルピロリジン−３−イル）−４，６−ジメトキシフェニル）−エタノン（０．７ｇ、２．２ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（１５ｍＬ）中溶液に、０℃で少しずつ加えた。１０ｍｉｎ後、メチル２−クロロベンゾエート（１．１５ｇ、６．７５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を２５℃で２ｈ撹拌した。メタノールを２０℃未満で慎重に加えた。反応混合物をクラッシュアイス（３００ｇ）上に注入し、１：１ＨＣｌ（ｐＨ２）で酸性化し、ＥｔＯＡｃ（２×１００ｍＬ）を使用して抽出した。飽和したＮａ₂ＣＯ₃（ｐＨ１０）を使用して水層を塩基性化し、ＣＨＣｌ₃（３×２００ｍＬ）を使用して抽出した。有機層
を脱水し（無水Ｎａ₂ＳＯ₄）、濃縮した。残渣に、濃縮ＨＣｌ（２５ｍＬ）を加え、室温で２ｈ撹拌した。反応混合物をクラッシュアイス（３００ｇ）上に注入し、Ｎａ₂ＣＯ₃飽和水溶液を使用して塩基性にした。ＣＨＣｌ₃（３×２００ｍＬ）を使用して混合物を抽
出した。有機抽出物を水で洗浄し、脱水し（無水Ｎａ₂ＳＯ₄）、濃縮することによって、化合物、（＋）−ｔｒａｎｓ−２−（２−クロロ−フェニル）−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−５，７−ジメトキシ−クロメン−４−オンを得た。
収量: 0.67 g (64 %); mp: 91 - 93℃; [α]_D²⁵ = + 5.8°(c = 0.7, メタノール); IR (KBr): 3431 , 1648, 1598, 1571 cm^-1; ¹H NMR (CDCl₃, 300MHz): δ 7.70 (dd, 1H), 7.52 (m, 1H), 7.45 (m, 2H), 6.50 (s, 1H), 6.44 (s, 1H), 4.17 (m, 1H), 4.00 (s, 3H), 3.97 (s, 3H), 3.64 (dd, 1H), 3.40 (d, 1H), 3.15 (m, 1H), 2.74 (d, 1H), 2.52 (m, 1H), 2.32 (s, 3H), 2.00 (m, 2H); MS (ES+): m/z 430 (M+1).

【0167】

（ｂ）（＋）−ｔｒａｎｓ−２−（２−クロロフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オンの調製
溶融したピリジン塩酸塩（４．１ｇ、３５．６ｍｍｏｌ）をパート（ａ）で得た化合物（０．４ｇ、０．９ｍｍｏｌ）に加え、１８０℃で１．５ｈ加熱した。反応混合物を２５℃に冷却し，ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）で希釈し、Ｎａ₂ＣＯ₃を使用してｐＨ１０に塩基性化した。混合物を濾過し、有機層を濃縮した。残渣を水（５ｍＬ）中に懸濁させ、３０ｍｉｎ撹拌し、濾過し、乾燥させることによって、化合物、（＋）−ｔｒａｎｓ−２−（２−クロロ−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オンを得た。
収量: 0.25 g (70 %); IR (KBr): 3422, 3135, 1664, 1623, 1559 cm^-1 ; ¹H NMR (CDCl₃, 300MHz): δ 7.56 (d, 1H), 7.36 (m, 3H), 6.36 (s, 1H), 6.20 (s, 1H), 4.02 (m, 1H), 3.70 (m, 2H), 3.15 (m, 2H), 2.88 (m, 1H), 2.58 (s, 3H), 2.35 (m, 1H), 1 .88 (m, 1H); MS (ES+): m/z 402 (M+1); 分析: C₂₁H₂₀ClNO₅ C, 62.24 (62.71); H, 5.07 (4.97); N, 3.60 (3.48); Cl, 9.01 (8.83).

【0168】

（ｃ）（＋）−ｔｒａｎｓ−２−（２−クロロフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩（化合物Ｂまたはリビシクリブ）の調製
パート（ｂ）で得た化合物（０．２ｇ、０．４８ｍｍｏｌ）をＩＰＡ（５ｍＬ）中に懸濁させ、３．５％ＨＣｌ（２５ｍＬ）を加えた。懸濁液を加熱して、透明な溶液を得た。
溶液を冷却し、固体を濾過することによって、化合物、（＋）−ｔｒａｎｓ−２−（２−クロロフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩を得た。
収量: 0.21 g (97 %); mp: 188 - 192℃; [α]_D²⁵ = +21.3°(c = 0.2, メタノール); ¹ H NMR (CD₃OD, 300MHz): δ 7.80 (d, 1H), 7.60 (m, 3H), 6.53 (s, 1H), 6.37 (s, 1H), 4.23 (m, 1H), 3.89 (m, 2H), 3.63 (m, 1H), 3.59 (dd, 1H), 3.38 (m, 1H), 2.90 (s, 3H), 2.45 (m, 1H), 2.35 (m, 1H); MS (ES+): m/z 402 (M +1) (遊離塩基).

【0169】

生物学的データ：
薬理学的アッセイ：

【実施例1】

【0170】

Ｉ．ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異した黒色腫細胞株中での、化合物Ａ（ＣＤＫ阻害剤、ボルシクリブとも呼ばれる）およびベムラフェニブ（ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ阻害剤）の組合せの使用を含めたｉｎ ｖｉｔｒｏでの研究
目的：
化合物Ａ（ＣＤＫ阻害剤、ボルシクリブとも呼ばれる）とベムラフェニブ（ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ阻害剤）の組合せの、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異した黒色腫細胞株における細胞周期およびアポトーシスに対する効果を研究する。

【0171】

材料および方法：
細胞株
ＡＴＣＣ（アメリカ培養細胞系統保存機関）、ＵＳＡから得たＧ３６１およびＳＫ−ＭＥＬ３黒色腫細胞株をこの研究に使用した。Ｇ３６１は、ベムラフェニブ感受性細胞株であり、ＳＫ−ＭＥＬ３はベムラフェニブ耐性細胞株である。両方の細胞株はＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異している。

【0172】

Ａ．フローサイトメトリーを使用した細胞周期分布の分析：
Ｇ３６１／ＳＫ−ＭＥＬ３黒色腫細胞を２５ｍｍ³組織培養物フラスコ内に播種した。
２４ｈ後、Ｇ３６１細胞を以下で５日間処置した：ｉ）化合物Ａ（１μΜ）；ｉｉ）ベムラフェニブ（１μΜ）；およびｉｉｉ）化合物Ａ（１μΜ）とベムラフェニブ（１μΜ）とを一緒に。

【0173】

ＳＫ−ＭＥＬ３黒色腫細胞の場合、細胞を以下で５日間処置した：ｉ）化合物Ａ（１μΜ）；ｉｉ）ベムラフェニブ（１０μΜ）；およびｉｉｉ）化合物Ａ（１μΜ）とベムラフェニブ（１０μΜ）とを一緒に。

【0174】

対照細胞は未処置のままで５日間置いた。分離細胞と付着細胞の両方を５日目間の終わりに収集した。１０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離しながら、細胞をおよそ５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。細胞を５００μｌのＰＢＳに再懸濁させ、５００μｌの氷冷７０％エタノール中に固定した。固定された細胞を室温で３０ｍｉｎインキュベートし、１０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ回転させた。細胞ペレットに、１ｍＬの冷やした７０％エタノールを加え、さらなる分析まで０℃未満で保存した。細胞をＰＢＳで２回洗浄して、固定剤を除去し、２５０μｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。これに、１２．５μｌのヨウ化プロピジウム（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬ）および１２．５μｌのＲｎａｓｅ Ａ（１ｍｇ／ｍｌ）を加えた。３７℃での３０ｍｉｎのインキュベーション後、フローサイトメトリーを使用して細胞を分析した。

【0175】

製造業者の推奨に従い、これらの試験にフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、ＵＳＡ）を使用した。４８８ｎｍに設定した
アルゴンイオンレーザーを励振源として使用した。２ｎ〜４ｎの間のＤＮＡ含有量を有する細胞を、赤色蛍光のレベルにより定義された通りに細胞周期のＧ１、ＳおよびＧ２／Ｍ段階として指定した。２ｎ未満のＤＮＡ含有量を示す細胞をサブＧ１細胞として指定した。各細胞周期区画内の細胞数を存在する細胞の総数のパーセンテージとして表現した。

【0176】

Ｂ．Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ染色（初期アポトーシス検出のため）
ＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣは、アポトーシス細胞を同定するための感受性プローブである。初期アポトーシスの間、膜リン脂質ホスホチジルセリン（ＰＳ）は、原形質膜の内側から外側のリーフレットに転位し、これによってＰＳが外部細胞環境に曝露される。Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖは、ＰＳに対して高親和性を有し、曝露されたＰＳを有する細胞に結合する３５〜３６ｋＤａカルシウム依存性リン脂質結合タンパク質である。

【0177】

ヨウ化プロピジウムは、漏出する膜を介して細胞に入り、したがって、遅いアポトーシスの検出に対してフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）と併用して使用されている極性色素である。

【0178】

黒色腫細胞Ｇ３６１を２５ｍｍ³組織培養物フラスコ内に播種した。２４ｈ後、細胞を
以下で２４ｈ処置した：ｉ）化合物Ａ（１μΜ）；ｉｉ）ベムラフェニブ（１μΜ）；およびｉｉｉ）化合物Ａ（１μΜ）とベムラフェニブ（１μΜ）とを一緒に。対照細胞は未処置のまま２４ｈ置いた。流動性の細胞を含有する培地を収集し、異なる時間点においてトリプシンで収集した後、付着細胞と共にプールした。１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離しながら、細胞を冷たいＰＢＳで２回洗浄した。１×１０⁶細胞／ｍｌの濃度で、細胞
ペレットを１×結合緩衝剤（１０ｍｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣＩ₂）中に再懸濁させた。１００μｌの溶液（１×１０⁵細胞）をＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウムで着色した。細胞を、暗所で、室温で（２５〜３０℃）１５ｍｉｎインキュベートし、フローサイトメトリーで試料を分析した。

【0179】

結果：
これらの試験の結果は図１〜３に示されている。

【0180】

結論：
図１は、ベムラフェニブで処置したＧ３６１細胞は、対照細胞（７２．３６％）と対比して、９１．９４％の有意なＧ１の停止を示していることを指摘している。サブＧ１期から認められるように、化合物Ａおよびベムラフェニブ単独で処置した細胞は、それぞれ９．４８％および２．３％アポトーシスしか示さなかったのに対して、化合物Ａとベムラフェニブの組合せで処置した細胞は、５３．６７％の細胞にアポトーシスが起こっていることを示し、これは、組合せが相乗的であることを指摘している。

【0181】

図２では、上側右の四分円は、初期のアポトーシスにあるＧ３６１細胞を示している。その後アポトーシスが起こっているこれらの細胞は細胞死へとつながる。化合物Ａとベムラフェニブの組合せで処置した細胞は、それぞれ化合物Ａおよびベムラフェニブのみで処置した細胞に関する８％および２０％と対比して、２７％の細胞が初期アポトーシス（ａｎｎｅｘｉｎ着色した細胞）にあることを示した。このデータは、この組合せが相乗効果を示していることを指摘している。

【0182】

図３では、ベムラフェニブのみで処置したＳＫ−ＭＥＬ３細胞は、対照細胞（６７．３８％）と対比して７６．７８％の有意なＧ１停止を示した。サブＧ１期から認められるように、アポトーシスは、化合物Ａとベムラフェニブの組合せで処置した細胞の２９．７５％に見られる一方で、化合物Ａおよびベムラフェニブ単独で処置した細胞は、それぞれ１
９．６３％および１５．１２％のアポトーシスしか示さず、この組合せが相乗的であることを指摘している。

【0183】

図１〜３に図示されているおよび上で説明されている結果は、化合物Ａとベムラフェニブの組合せは、ベムラフェニブ感受性および耐性のＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異した黒色腫細胞株において相乗的であり、化合物Ａおよびベムラフェニブを単独で使用した場合と比較して、組み合わせて使用した場合により多くのアポトーシスを誘発することを明確に確立した。

【0184】

ＩＩ．ヒトＢＲＡＦ−変異した黒色腫細胞における化合物Ａとベムラフェニブ（ＢＲＡＦ
Ｖ６００Ｅ阻害剤）とのｉｎ ｖｉｔｒｏでの二重組合せ試験
目的：この研究目的は、ＢＲＡＦ変異した黒色腫細胞における化合物Ａ（ＣＤＫ阻害剤）とベムラフェニブ（ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ阻害剤）の組合せの効力を評価することであった。

【0185】

Ａ．材料
試験化合物：化合物Ａ（ＰＥＬ’Ｓ Ｌａｂで調製）；ベムラフェニブ（Ｎａｎｊｉｎｇ
Ｃｈｅｍｌｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｃｏ．、Ｌｔｄ、中国）
ビヒクル：ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ−Ｃｈｅｍｉｅ Ｇｍｂｈ、ドイツ）投薬の準備：化合物Ａおよびベムラフェニブは、秤量し、必要量のＤＭＳＯ中に溶解して、必要とされるストック溶液を得た。
試験システム：試験システムは、Ｇ３６１、Ａ３７５およびＭＤＡＭＢ−４３５Ｓ（ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異した）細胞株を含んでいた。これらは、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ＵＳＡから得た。

【0186】

Ｂ．方法
化合物Ａとベムラフェニブの様々な組合せを使用する細胞毒性試験を、ＣＣＫ８生細胞デヒドロゲナーゼアッセイを使用して行った。

【0187】

ｉ）細胞カウンティングキット−８（ＣＣＫ８）生細胞デヒドロゲナーゼアッセイ
ヒトＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異した黒色腫がん細胞株、Ｇ３６１、Ａ３７５およびＭＤＡＭＢ−４３５Ｓを、９６−ウェルプレート中の１９９μｌＬのＲＰＭＩ １６４０培地に、３０００個の細胞／ウェルの密度で播種し、一晩インキュベートして細胞を付着させた。次いで細胞をそれぞれの試験化合物で処理した。全部で１０の群があった；
ｉ）１μΜのベムラフェニブを単独で４８ｈ；
ｉｉ）０．３μΜ／０．１μΜの化合物Ａを単独で４８ｈ；
ｉｉｉ）１μΜ／０．３μΜの化合物Ａを単独で４８ｈ；
ｉｖ）３μΜ／１μΜの化合物Ａを単独で４８ｈ；
ｖ）１０μΜ／３μΜの化合物Ａを単独で４８ｈ；
ｖｉ）０．３μΜ／０．１μΜの化合物Ａと１μΜのベムラフェニブの組合せを４８ｈ；ｖｉｉ）１μΜ／０．３μΜの化合物Ａと１μΜのベムラフェニブの組合せを４８ｈ；
ｖｉｉｉ）３μΜ／１μΜの化合物Ａと１μΜのベムラフェニブの組合せを４８ｈ；
ｉｘ）１０μΜ／３μΜの化合物Ａと１μΜのベムラフェニブの組合せを４８ｈ；
ｘ）対照ウェルをＤＭＳＯビヒクルで４８ｈ処理した。

【0188】

プレートは、加湿した５％ＣＯ₂インキュベーター内で、３７°±１℃でインキュベー
トした。ベムラフェニブは３種のすべての異なる細胞株に対して１．０μΜの濃度で使用し、化合物Ａは、Ａ３７５黒色腫細胞の場合、０．３μΜ、１μΜ、３μΜおよび１０μΜ濃度で使用し、Ｇ３６１およびＭＤＡＭＢ４３５Ｓ黒色腫細胞の場合、０．１μΜ、０．３μΜ、１．０μΜ、３．０μΜの濃度で使用した。インキュベーション期間の終わり
に、ＣＣＫ８細胞毒性アッセイプロトコルを使用してプレートをアッセイした。ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙ（４）によるＣｏｍｐｕｓｙｎソフトウエアを使用して組合せ指数（ＣＩ）を計算することによって、相乗作用を求めた。ＣＩ＜１は相乗的であり、ＣＩ＝１は相加的であり、ＣＩ＞１は拮抗的である。

【0189】

統計分析：
スチューデントｔ検定を使用して統計分析を実施し、ｐ値＜０．０５は有意とみなされた。データは、平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として表現される。平均値は、それぞれ三重反復で実施される、少なくとも２つの独立した実験から得られる。

【0190】

ｉｉ）細胞毒性アッセイプロトコル
対数的に増大する細胞を、３ｘ１０³細胞／ウェルの密度でプレーティングし、１６〜
１８ｈの間回復させた。化合物Ａとベムラフェニブの両方の化合物の濃度を４８ｈ変化させて、細胞を検証した。４８ｈ後、細胞毒性をＣＣＫ−８試薬（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、およびＪａｐａｎ）により求めた。製造業者の指示に従い、５μＬ／ウェルのＣＣＫ−８試薬を加え、プレートを２ｈインキュベートした。４５０ｎｍから６５０ｎｍの波長に補正し、対照に対して正規化し、Ｔｅｃａｎ Ｓａｐｐｈｉｒｅ マルチ−蛍光 ミクロ−プレートリーダー上の吸光度を測定することによって毒性を求めた。すべての実験は三重反復で実施した。

【0191】

化合物Ａおよびベムラフェニブに関する処置スケジュール：
表１および２は、Ａ３７５細胞およびＧ３６１およびＭＤＡ−ＭＢ４３５Ｓ細胞における化合物Ａおよびベムラフェニブのそれぞれの処置スケジュールを示している。

【0192】

【表1】

【0193】

【表2】

【0194】

結果：
異なる細胞株における化合物Ａおよびベムラフェニブおよびこれらの組合せに関する細胞毒性のＩＣ₅₀値が表３に提示されている。図４〜６および表４〜６は、様々な黒色腫細胞株における化合物Ａとベムラフェニブの組合せの効果を表している。

【0195】

【表3】

【0196】

図４〜６において、Ｘ軸は、化合物Ａおよびベムラフェニブ単独での濃度および組み合
わせた場合の化合物の濃度を示し、左のＹ軸は細胞毒性（％）を示し、右のＹ−軸は組合せ指数値を示している。

【0197】

図４において、１μΜのベムラフェニブで処置した細胞は２３％阻害を示したのに対して、３μΜの化合物Ａで処置した細胞は細胞の４６％阻害を示した。しかし、この最適以下の濃度において、細胞を、化合物Ａと組み合わせたベムラフェニブで処置した場合、組合せ指数（ＣＩ）は０．７０であり、細胞の８３％阻害という相乗効果が観察された。示された相乗的データは、それぞれ三重反復で実施した、２つの独立した実験に関する平均値を意味する。

【0198】

【表4】

【0199】

図５において、１μΜのベムラフェニブで処置した細胞は３０％阻害を示したのに対して、０．３μΜの化合物Ａで処置した細胞は細胞の２％阻害しか示さなかった。しかし、この最適以下の濃度において、細胞を、化合物Ａと組み合わせたベムラフェニブで処置した場合、組合せ指数値は０．７７であり、細胞の５２％阻害という注目すべき相乗効果が観察された。細胞を、ベムラフェニブ（１μΜ）と組み合わせた化合物Ａ（３μΜ）で処置した場合、組合せ指数０．９で細胞の９１％阻害を示した。示された相乗的データは、それぞれ三重反復で実施した、２つの独立した実験に関する平均値を意味する。

【0200】

【表5】

【0201】

図６において、１μΜのベムラフェニブで処置した細胞は細胞の３１％阻害を示したのに対して、１μΜの化合物Ａで処置した細胞は細胞の３２％阻害を示した。最適以下の濃度において、細胞を、化合物Ａと組み合わせたベムラフェニブで処置した場合、組合せ指数０．７４で細胞の９０％阻害という相乗効果が観察された。示された相乗的データは、それぞれ三重反復で実施した、２つの独立した実験に関する平均値を意味する。

【0202】

【表6】

【0203】

結論：
ベムラフェニブと化合物Ａの組合せは、ＢＲＡＦ変異した黒色腫細胞において顕著な相乗効果を示した。

【0204】

参考文献：
１．Ｓｍａｌｌｅｙ ＫＳ、Ｌｉｏｎｉ Ｍ、Ｐａｌｍａ ＭＤ、Ｘｉａｏ Ｍ、Ｄｅｓａｉ Ｂ、Ｅｇｙｈａｚｉ Ｓ、Ｈａｎｓｓｏｎ Ｊ、Ｗｕ Ｈ、Ｋｉｎｇ ＡＪ、Ｖａｎ Ｂｅｌｌｅ Ｐ、Ｅｌｄｅｒ ＤＥ、Ｆｌａｈｅｒｔｙ ＫＴ、Ｈｅｒｌｙｎ Ｍ、Ｎａｔｈａｎｓｏｎ ＫＬ；「Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１ ｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎ ｃａｎ ｍｅｄｉａｔｅ ＢＲＡＦ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ−ｍｕｔａｔｅｄ ｍｅｌａｎｏｍａｓ」；Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．、２００８年、第７巻、２８７６〜２８８３ページ。
２．Ｓｍａｌｌｅｙ ＫＳＭ ａｎｄ Ｆｌａｈｅｒｔｙ ＫＴ；「Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ＢＲＡＦ／ＭＥＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎｔｏ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｍｅｌａｎｏｍａ」；Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｃａｎｃｅｒ、２００９年、第１００巻、４３１〜４３５ページ。
３．Ｄｈｏｍｅｎ Ｎ、Ｍａｒａｉｓ Ｒ；「ＢＲＡＦ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ」Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．、２００９年、第２３巻、３号、５２９〜４５ページ。
４．Ｔｉｎｇ−ＣｈａｏＣｈｏｕ；「Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｂａｓｉｓ、ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｓｉｇｎ、ａｎｄ ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ ａｎｄ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍｉｎ ｄｒｕｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ」Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．、２００６年、第５８巻、６２１〜８１ページ。

【実施例2】

【0205】

Ａ．ヒトＢＲＡＦ−Ｖ６００Ｅ変異した黒色腫細胞株（Ａ３７５）およびそのベムラフェニブ耐性誘導体（Ａ３７５Ｒ）における、化合物Ａ（ＣＤＫ阻害剤、ボルシクリブとも呼ばれる）と、ＢＲＡＦ阻害剤（ベムラフェニブまたはダブラフェニブ）またはＭＥＫ阻害剤（トラメチニブ）から選択される１種の抗がん剤とのｉｎ ｖｉｔｒｏでの組合せ試験

【0206】

目的：
本研究の目的は、ＢＲＡＦ変異した黒色腫細胞における、ＣＤＫ阻害剤（ボルシクリブ）と、ＢＲＡＦ阻害剤（ベムラフェニブまたはダブラフェニブ）またはＭＥＫ阻害剤（トラメチニブ）の組合せの効力を評価することであった。

【0207】

Ｂ．材料：
試験化合物：化合物Ａ（ＰＥＬ’Ｓ Ｌａｂ．で調製）；ベムラフェニブ（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ ＵＳＡ、Ｓ１２６７）；ダブラフェニブ（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ ＵＳＡ、Ｓ２８０７）およびトラメチニブ（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ ＵＳＡ、Ｓ２６７３）ビヒクル：ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ−Ｃｈｅｍｉｅ Ｇｍｂｈ、ドイツ）投薬の準備：試験化合物を秤量し、必要量のＤＭＳＯ中に溶解して、必要とされるストック溶液を得た。
試験系：試験系はＡ３７５（ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異）細胞株を含んだ。これは、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（アメリカ培養細胞系統保存機関））、ＵＳＡおよびＡ３７５Ｒ細胞株（ベムラフェニブ耐性−ＰＥＬ’Ｓ Ｌａｂ．で開発）から得た。

【0208】

Ｃ．方法：
ＣＣＫ８生細胞デヒドロゲナーゼアッセイを使用して、すべての試験化合物を単剤としておよび組み合わせて使用する細胞毒性試験を行った。

【0209】

細胞カウンティングキット−８（ＣＣＫ８）生細胞デヒドロゲナーゼアッセイ：
対数的に増大するヒトＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異した黒色腫細胞を、１５００細胞／ウェルの密度で、３８４−ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）中の３０μＬのダルベッコ改変イーグル培地培地（ＤＭＥＭ）に、Ｔｅｃａｎ自動化プラットフォーム（ＦｒｅｅｄｏｍＥｖｏ Ｌｉｑｕｉｄ 取扱いシステム）を使用して播種し、約１２〜１６ｈインキュベートして、細胞を付着させた。次いで、細胞を異なる用量の化合物Ａおよび抗
がん剤（ベムラフェニブまたはダブラフェニブまたはトラメチニブ）で、単剤療法として（個々に使用）および組み合わせて、４８ｈ処置した。異なる投薬量を使用する試験を、各組合せ（例えば化合物Ａとベムラフェニブの組合せ）に対して行った。Ａ３７５およびＡ３７５Ｒ細胞において個々におよび組み合わせて使用した場合の試験化合物の処置の比率を表７Ａ〜７Ｃに示す（すなわち、化合物Ａとベムラフェニブの組合せ；化合物Ａとダブラフェニブの組合せ；および化合物Ａとトラメチニブの組合せ）。化合物Ａ（μΜ）の以下の用量を使用した：１、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６、０．０３、０．０１５；ベムラフェニブ（μΜ）３０、１５、７．５、３．７５、１．８７５、０．９、０．４、０．２、０．１、０．０５；ダブラフェニブ（μΜ）３、１．５、０．７５、０．３７、０．１８、０．０９、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５；トラメチニブ（μΜ）１、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６２５、０．０３１、０．０１５、０．００７、０．００３、０．００１。表７Ａ〜７Ｃに示されているように、上記用量の抗がん剤（ベムラフェニブまたはダブラフェニブまたはトラメチニブ）を化合物Ａと複数の比率で混合した。使用されている対照は、細胞のみまたは細胞とビヒクル（ＤＭＳＯ）である。

【0210】

プレートは、加湿した５％ＣＯ₂インキュベーター内で、３７°±１℃で４８ｈインキ
ュベートした。ポストインキュベーション後、ＣＣＫ８試薬（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ、メリーランド州、および日本）を使用してプレートをアッセイした。製造業者の指示に従い、３μｌのＣＣＫ−８試薬を３８４ウェルプレートの各ウェルに加え、プレートを２ｈインキュベートした。対照に対して正規化した４５０ｎｍの波長で、Ｔｅｃａｎ サファイア マルチ−蛍光 ミクロ−プレートリーダー上の吸光度を測定することによって、毒性を求めた。すべての実験は４回実施した。

【0211】

組合せ指数（ＣＩ）（１未満のＣＩ値は相乗効果を示す）を計算するＣｈｏｕ Ｔａｌａｌａｙ法に基づくＣａｌｃｕｓｙｎソフトウエア（Ｂｉｏｓｏｆｔ、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ、ＭＯ、ＵＳＡ）を使用して組合せの効力を定量化した。

【0212】

表７Ａ〜７Ｃ：Ａ３７５およびＡ３７５Ｒ細胞における化合物Ａおよび抗がん剤（ベムラフェニブまたはダブラフェニブまたはトラメチニブ）の単剤療法として（個々に使用）および組み合わせた場合の処置の比率。

【0213】

単独でのまたは組み合わせた化合物Ａ（Ａとして表示）およびベムラフェニブ（Ｖとして表示）の処置の比率が表７Ａに表されている。

【0214】

【表7】

【0215】

単独でのまたは組み合わせた化合物Ａ（Ａとして表示）およびダブラフェニブ（Ｄとして表示）の処置の比率が表７Ｂに表されている。

【0216】

【表8】

【0217】

単独でのまたは組み合わせた化合物Ａ（Ａとして表示）およびトラメチニブ（Ｔとして表示）の処置の比率が表７Ｃに表されている。

【0218】

【表9】

【0219】

結果：
これらの試験の結果が図７〜１３に示されている。

【0220】

結論：
１．図７ａおよび７ｂから、Ａ３７５細胞株はベムラフェニブに対して極めて感受性があるのに対して、Ａ３７５Ｒは耐性があると結論づけることができる。さらに、Ａ３７５とＡ３７５Ｒの両方が化合物Ａ（ボルシクリブ）に対して同等に感受性がある。
２．図８ａおよび８ｂから、化合物Ａ（ボルシクリブ）とベムラフェニブの組合せはＡ３７５細胞株において強い相乗効果（ＣＩ＜０．５）を示すと結論づけることができる。
３．図９ａおよび９ｂから、化合物Ａ（ボルシクリブ）とベムラフェニブの組合せは、Ａ３７５Ｒ細胞株において強い相乗効果（ＣＩ＜０．５）を示すと結論づけることができる。
４．図１０ａおよび１０ｂから、化合物Ａ（ボルシクリブ）とダブラフェニブの組合せはＡ３７５細胞株において強い相乗効果（ＣＩ＜０．５）を示すと結論づけることができる。
５．図１１ａおよび１１ｂから、化合物Ａ（ボルシクリブ）とダブラフェニブの組合せはＡ３７５Ｒ細胞株において強い相乗効果（ＣＩ＜０．５）を示すと結論づけることができる。
６．図１２ａおよび１２ｂから、化合物Ａ（ボルシクリブ）とトラメチニブの組合せはＡ３７５細胞株において強い相乗効果（ＣＩ＜０．５）を示すと結論づけることができる。７．図１３ａおよび１３ｂから、化合物Ａ（ボルシクリブ）とトラメチニブの組合せはＡ３７５Ｒ細胞株において強い相乗効果（ＣＩ＜０．５）を示すと結論づけることができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7a】

【図7b】

【図8a】

【図8b】

【図9a】

【図9b】

【図10a】

【図10b】

【図11a】

【図11b】

【図12a】

【図12b】

【図13a】

【図13b】