特開 2019-33685 エレクトロポレーション装置及びエレクトロポレーション方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2019-33685(P2019-33685A)

(43)【公開日】2019年3月7日

(54)【発明の名称】エレクトロポレーション装置及びエレクトロポレーション方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/42 20060101AFI20190208BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20190208BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20190208BHJP

   C12N 15/00 20060101ALI20190208BHJP

【ＦＩ】

   C12M1/42

   C12M1/00 A

   C12N15/00 A

   C12N15/00 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2017-156842(P2017-156842)

(22)【出願日】2017年8月15日

(71)【出願人】

【識別番号】304024430

【氏名又は名称】国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学

(74)【代理人】

【識別番号】100095407

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 満

(74)【代理人】

【識別番号】100109449

【弁理士】

【氏名又は名称】毛受 隆典

(74)【代理人】

【識別番号】100132883

【弁理士】

【氏名又は名称】森川 泰司

(74)【代理人】

【識別番号】100173462

【弁理士】

【氏名又は名称】宮本 一浩

(74)【代理人】

【識別番号】100202957

【弁理士】

【氏名又は名称】金森 毅

(72)【発明者】

【氏名】筒井 秀和

【テーマコード（参考）】

4B029

【Ｆターム（参考）】

4B029AA23

4B029AA24

4B029BB01

4B029BB11

4B029CC01

4B029CC02

4B029CC08

4B029DG10

4B029GB04

4B029GB10

(57)【要約】

【課題】少量の試料でエレクトロポレーションを実施することができ、且つ、試料を汚染しにくいエレクトロポレーション装置及びエレクトロポレーション方法を提供する。
【解決手段】エレクトロポレーション装置１は、電極面を有する下側電極２１及び別の電極面を有する上側電極２２からなる垂直電極２と、下側電極２１と上側電極２２の間に電圧を印加する電圧印加装置３と、を備える。試料Ｓは、両電極面の間に他の部材から離間して保持される。下側電極２１は、支持台２３を鉛直方向に貫通して固定されている。上側電極２２は、鉛直方向における位置を調整できるよう、ケース２４の上面を鉛直方向に貫通し、ナット２７で固定されている。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１の面を有する第１の電極と、
前記第１の面の鉛直方向に位置し、前記第１の面に対向する第２の面を有し、試料を前記第１の電極との間に他の部材から離間して保持する第２の電極と、
前記第１の電極及び前記第２の電極に電気的に接続され、当該第１の電極と当該第２の電極との間に電圧を印加する電圧印加装置と、を備える、
エレクトロポレーション装置。

【請求項2】

前記電圧の値を時刻毎に設定可能である、
請求項１に記載のエレクトロポレーション装置。

【請求項3】

前記第１の電極を、前記第１の面の前記鉛直方向の位置を調整可能に支持する支持台を備え、
前記第１の面と前記第２の面の距離を調整可能であり、当該第１の面と当該第２の面との間に異なるサイズの前記試料を保持可能である、
請求項１又は２に記載のエレクトロポレーション装置。

【請求項4】

前記第１の面と前記第２の面との間に保持された前記試料に水又は緩衝液を加える加水手段と、
前記第１の面と前記第２の面との間に保持されている前記試料を吸引して回収する回収手段と、を備える、
請求項１から３のいずれか１項に記載のエレクトロポレーション装置。

【請求項5】

前記第１の電極と前記第２の電極の少なくとも一方に発生した熱を放熱する放熱手段、及び／又は、前記第１の電極と前記第２の電極の少なくとも一方を冷却する冷却手段を備える、
請求項１から４のいずれか１項に記載のエレクトロポレーション装置。

【請求項6】

２つの電極を対向して配置させ、
前記２つの電極で試料を他の機械要素から離間して保持し、
前記２つの電極の間に電圧を印加することにより、当該２つの電極によって保持されている前記試料に前記電圧又は電流を印加し、前記試料に微細孔を形成する、
エレクトロポレーション方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、エレクトロポレーション装置及びエレクトロポレーション方法に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞、リポソームなどにパルス電圧を印加し、膜に微細孔を生じさせることにより、その内部に小分子、薬物、金属微粒子などを封入するエレクトロポレーション（electroporation、電気穿孔）が知られている。

【0003】

エレクトロポレーションを実施するために用いられる装置が、特許文献１から４に開示されている。

【0004】

特許文献１に記載されているエレクトロポレーション装置は、試料を満たす実験用容器であるキュベットの側面に一対の平行なアルミニウム製の電極を備える。このエレクトロポレーション装置は、キュベットの電極間に電圧を印加することにより、試料に電圧を印加する。

【0005】

特許文献２は、エレクトロポレーション用のピペットとチップを開示する。ピペットにチップを取り付け、試料容器からチップ内に試料を吸引し、チップと試料容器内の追加電極の間に電気パルスを印加することで、試料に電流パルスが印加される。

【0006】

特許文献３に記載されているエレクトロポレーション装置は、液溜部と上下一対の平板電極を備える。液溜部に溜められた緩衝液中に試料を含むシートが配置され、このシートを挟むように配置された平板電極間に電圧を印加することにより、試料に電圧が印加される。

【0007】

特許文献４に記載されているエレクトロポレーション装置は、上下に対向して配置された平板状の電極を備え、電極と側壁によって囲まれた領域に、試料を含む緩衝液が満たされ、電極間に電圧を印加することにより、試料に電圧が印加される。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】米国特許出願公開第２００５／０２８２２６５号明細書

【特許文献2】米国特許出願公開第２０１１／０２６３００５号明細書

【特許文献3】特開２００５−１６０３９７号公報

【特許文献4】特許第４５３４０４３号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

特許文献１に記載のエレクトロポレーション装置は、キュベットの容量が大きいため、数１０μｌから数１００μｌの試料が必要とされる。特許文献２に記載の装置も、チップとピペットの空洞部に試料を吸引するため、多量の試料が必要とされる。特許文献３、４に記載のエレクトロポレーション装置については、液溜めに試料をより多く満たさなければならない。

【0010】

また、特許文献１から４に記載の各エレクトロポレーション装置では、構造上、試料が電極だけでなく、キュベット、ピペット、液溜め等に接触する。従って、試料が汚染されるおそれがある。また、電極がイオン化し、当該イオンによって試料を汚染するおそれもある。

【0011】

本発明は、上記の問題点を解消し、少量の試料でエレクトロポレーションを実施することができ、且つ、試料を汚染しにくいエレクトロポレーション装置及びエレクトロポレーション方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係るエレクトロポレーション装置は、
第１の面を有する第１の電極と、
前記第１の面の鉛直方向に位置し、前記第１の面に対向する第２の面を有し、試料を前記第１の電極との間に他の部材から離間して保持する第２の電極と、
前記第１の電極及び前記第２の電極に電気的に接続され、当該第１の電極と当該第２の電極との間に電圧を印加する電圧印加装置と、を備える。

【0013】

また、本発明のエレクトロポレーション装置は、前記電圧の値を時刻毎に設定可能であってもよい。

【0014】

本発明のエレクトロポレーション装置は、前記第１の電極を、前記第１の面の前記鉛直方向の位置を調整可能に支持する支持台を備え、前記第１の面と前記第２の面の距離を調整可能であり、当該第１の面と当該第２の面との間に異なるサイズの前記試料を保持可能であってもよい。

【0015】

また、本発明のエレクトロポレーション装置は、前記第１の面と前記第２の面との間に保持された前記試料に水又は緩衝液を加える加水手段と、前記第１の面と前記第２の面との間に保持されている前記試料を吸引して回収する回収手段と、を備えてもよい。

【0016】

さらに、本発明のエレクトロポレーション装置は、前記第１の電極と前記第２の電極の少なくとも一方に発生した熱を放熱する放熱手段、及び／又は、前記第１の電極と前記第２の電極の少なくとも一方を冷却する冷却手段を備えてもよい。

【0017】

上記目的を達成するため、本発明の第２の観点に係るエレクトロポレーション方法は、
２つの電極を対向して配置させ、
前記２つの電極で試料を他の機械要素から離間して保持し、
前記２つの電極の間に電圧を印加することにより、当該２つの電極によって保持されている前記試料に前記電圧又は電流を印加し、前記試料に微細孔を形成する。

【発明の効果】

【0018】

本発明によれば、試料が対向する電極間に挟まれ、他の部材から離間して保持される。従って、試料が少量ですむ。また、電極以外の他の部材に接しないため、試料の汚染が起こりにくい。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】本発明の第１の実施の形態に係るエレクトロポレーション装置の構成を示す図である。

【図2】図１に示すエレクトロポレーション装置の垂直電極の構成を示す拡大斜視図である。

【図3】図１に示すエレクトロポレーション装置における試料の保持方法を説明するための拡大図である。

【図4】図１に示すエレクトロポレーション装置の垂直電極に電圧を印加した場合に生じる電界を示す説明図である。

【図5】（Ａ）は試料が少量の場合における接触角の説明図、（Ｂ）は試料が十分な量の場合における接触角の説明図である。

【図6】エレクトロポレーションに用いられる電圧波形の説明図であり、（Ａ）は矩形波、（Ｂ）は減衰波、（Ｃ）はバイアスつきの正弦波である。

【図7】（Ａ）は図１に示すエレクトロポレーション装置を用いてエレクトロポレーションを実施した後の垂直電極と試料の説明図であり、（Ｂ）は試料に呼び水を加える方法を示す説明図であり、（Ｃ）は呼び水を加えた後に試料を回収する方法を示す説明図である。

【図8】本発明の第２の実施の形態に係るエレクトロポレーション装置の構成図である。

【図9】本発明の第３の実施の形態に係るエレクトロポレーション装置の構成図である。

【図10】本発明の変形例に係るエレクトロポレーション装置の構成図である。

【図11】（Ａ）〜（Ｃ）は、垂直電極の変形例を示す拡大斜視図である。

【図12】図１に示すエレクトロポレーション装置を用いて行った第１の実験の顕微鏡画像である。

【図13】図１に示すエレクトロポレーション装置を用いて行った第２の実験の顕微鏡画像である。

【図14】図８に示すエレクトロポレーション装置を用いて行った第３の実験の顕微鏡画像である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

以下に、本発明の実施の形態に係るエレクトロポレーション装置とエレクトロポレーション方法を、添付図面を参照しつつ説明する。

【0021】

（第１の実施の形態）
本実施の形態に係るエレクトロポレーション装置１は、図１に示すように、試料Ｓを保持すると共に電圧を印加する下側電極２１と上側電極２２とからなる垂直電極２と、下側電極２１と上側電極２２との間に電圧を印加する電圧印加装置３と、を備える。

【0022】

下側電極２１は、厚さ５ｍｍ程度の透明のアクリル樹脂製の板材からなる支持台２３を鉛直方向に貫通して固定されている。下側電極２１の一端は、支持台２３の上方に、他端は、支持台２３の下方に、それぞれ位置している。

【0023】

上側電極２２は、透明のアクリル樹脂製のケース２４の上面に、該上面を鉛直方向に貫通して固定されている。上側電極２２の一端は、ケース２４の上面の下方に、他端は、ケース２４の上面の上方に、それぞれ位置している。

【0024】

エレクトロポレーションの対象となる試料Ｓは、下側電極２１と上側電極２２の間に配置される。

【0025】

上側電極２２の外周面には雄ねじが形成され、ケース２４の上面中央部には、内面に雌ねじが形成された電極貫通穴が形成されている。上側電極２２は、電極貫通穴の雌ねじと螺合している。上側電極２２に形成された雄ねじにはナット２７も螺合している。上側電極２２を回転することにより、上側電極２２の上昇及び下降が可能である。また、ナット２７を締めることにより、上側電極２２をケース２４に固定することが可能である。

【0026】

ケース２４は、例えば、一辺の長さが２０ｍｍである立方体状の外形を有する。ケース２４には、その底面から鉛直方向上向きに、円柱状の空間が形成されている。円柱状の空間は、ケース２４の底面に開口している。

【0027】

下側電極２１と上側電極２２とは、ケース２４を支持台２３の基準位置に配置した状態で、その一端同士が互いに対向し、ケース２４内の円柱空間のほぼ中央に位置するように配置されている。

【0028】

支持台２３の上面には、複数の磁石２５Ａが埋設されている。ケース２４の下面部の所定位置には、磁石２５Ａとの間で吸引力が作用する磁石２５Ｂが埋設されている。ケース２４を支持台２３の上の所定位置に配置すると、磁石２５Ａと２５Ｂが引き合い、ケース２４は、支持台２３に位置合わせされ且つ固定される。これにより、上側電極２２が下側電極２１に位置合わせされる。

【0029】

支持台２３の底には、ゴム製の脚２６が３本、同一直線上に並ばないように設けられている。これにより、支持台２３が設置される面の凹凸や振動が脚２６によって吸収され、エレクトロポレーション装置１が安定して設置される。

【0030】

下側電極２１と上側電極２２は、いずれも、銅などの良導体の芯部材と、芯部材の表面を覆う金層とから形成される。下側電極２１と上側電極２２は、例えば、芯部材を金メッキして形成されている。下側電極２１と上側電極２２を金で覆うことにより、高電圧が印加されても、酸化・腐食しにくくなる。また、金は、酸・塩基や有機溶剤などに強いため、下側電極２１及び上側電極２２洗浄すれば、同一の電極を用いて複数回のエレクトロポレーションを実行することも可能となる。言い換えれば、表面に金膜を備える下側電極２１及び上側電極２２を用いることで、垂直電極２の再利用が容易になる。

【0031】

図２に示すように、下側電極２１の一端と上側電極２２の一端には、直径約２ｍｍ、厚さ約０．５ｍｍの円盤部２１Ａ、２２Ａが形成されている。円盤部２１Ａ、２２Ａの対向部分には、円形状の平坦な電極面ＣＳ１とＣＳ２がそれぞれ形成されている。ケース２４を支持台２３の基準位置に配置した状態では、下側電極２１の円盤部２１Ａの電極面ＣＳ１と上側電極２２の円盤部２２Ａの電極面ＣＳ２とは、いずれも水平、平行であり、且つ、互いに対向している。なお、下側電極２１と上側電極２２とは直接接触しない。下側電極２１の円盤部２１Ａの電極面ＣＳ１と上側電極２２の円盤部２２Ａの電極面ＣＳ２との距離Ｄは、上側電極２２を回転させて、鉛直方向の位置を調整することにより可変となっているが、例えば、０．３ｍｍ〜１．０ｍｍ程度に設定される。

【0032】

図３に示すように、エレクトロポレーションの対象となる試料Ｓは、下側電極２１の円盤部２１Ａと上側電極２２の円盤部２２Ａとの間に保持される。このとき、試料Ｓは、金表面のぬれ性により、下側電極２１の円盤部２１Ａの電極面ＣＳ１と上側電極２２の円盤部２２Ａの電極面ＣＳ２に吸着した状態で保持される。また、試料Ｓの側部は表面張力により、流れ落ちることなく保持される。このため、試料Ｓは、１つの液体の粒として電極２１と２２以外の部材（機械要素）から離間して保持される。この場合、試料Ｓの量は、例えば、１〜３μｌで足りる。従って、微少量の試料で実験を行ったり、高価な試料を用いて多数回の実験を繰り返したりすることが可能である。

【0033】

さらに、特許文献１〜４に記載のエレクトロポレーション装置においては、場所により、試料Ｓ付近の電界の強度が異なったり、電流の密度が偏ったりするおそれがある。これに対し、図３に示すように、エレクトロポレーション装置１では、互いに平行な下側電極２１の電極面ＣＳ１と上側電極２２の電極面ＣＳ２との間に、両面に接して且つ両面に吸着して、試料Ｓが保持される。従って、試料Ｓの厚みも全体で一定値Ｄである。このため、図４に示すように、下側電極２１の電極面ＣＳ１と上側電極２２の電極面ＣＳ２との間には、互いに平行で同一密度の電気力線が発生する。従って、試料Ｓに加わる電界が、試料Ｓ内の場所によらずほぼ一定となる。これにより、エレクトロポレーションの精度及び再現性が向上する。

【0034】

次に、垂直電極２に生じる電界と試料Ｓの量との関係を図５に基づいて説明する。
図５（Ａ）に示すように、試料Ｓの量が少なすぎる場合には、試料Ｓが上側電極２２の電極面ＣＳ２に接触しない。この状態で電極２１、２２間に電圧を印加しても、試料Ｓと電極面ＣＳ２との間に間隔があるため、絶縁抵抗が大きく、試料Ｓには電圧が加わらず、電流も流れない。

【0035】

これに対し、図５（Ｂ）に示すように、試料Ｓが電極面ＣＳ１と電極面ＣＳ２の両方に接している場合には、試料Ｓに電圧が印加され、電流が流れる。

【0036】

また、一般に、滴下された試料Ｓが懸濁液であれば、重力の作用により、細胞やリポソーム、導入する小分子や金属微粒子などについて、鉛直方向の濃度勾配が生じる。これに対し、下側電極２１と上側電極２２との間に生じる電界は、図４において前述したように、鉛直方向であり、且つ、その強度も一定である。従って、図５（Ｂ）に示すように、試料Ｓの量が十分である場合には、鉛直方向に垂直な方向において、場所によって電界の強度が変化することが少ない。従って、電界は、鉛直方向に垂直な方向においては、どの位置でもほぼ一定であり、試料Ｓに対して、場所に依存する不均一な電圧印加が起こらない。これにより、試料Ｓに効率よく電圧を印加することができ、再現性の高く、精度の高い実験を行うことができる。

【0037】

図５（Ａ）と図５（Ｂ）とを比較すると、図５（Ｂ）の場合の方が、試料Ｓの接触角θ（試料Ｓの表面が下側電極２１の電極面ＣＳ１（又は上側電極２２の電極面ＣＳ２）となす角度）が大きい。このように、試料Ｓが大きい接触角θで電極面ＣＳ１、ＣＳ２に接することで、試料Ｓは、印加された電圧による電気エネルギーを効率的に受けることができる。そこで、試料Ｓの特性、例えば、緩衝液の粘度、固形物の割合や、試料Ｓのサイズなどに応じて、下側電極２１と上側電極２２の距離Ｄを調整して、大きな接触角θが得られるように調整することが望ましい。

【0038】

図１に示す電圧印加装置３は、波形信号を発生させる波形発生装置３２と、波形発生装置３２によって生成された波形信号を増幅する増幅器３３と、を有する。波形とは、例えば、電圧波形、すなわち、時間に対する電圧の変化をいう。波形発生装置３２はパーソナルコンピュータ（ＰＣ）３１に接続されている。

【0039】

ＰＣ３１は、波形発生装置３２に生成させる波形を定義する波形データを作成し、編集し、保存する機能を有する。

【0040】

エレクトロポレーションに用いられる代表的な電圧波形には、スクエアパルス（矩形波、square pulse）とエクスポネンシャルパルス（減衰波、exponential pulse）とがある。スクエアパルスは、図６（Ａ）に例示するように、一定の電圧が一定期間持続する形状を有する。また、エクスポネンシャルパルスは、図６（Ｂ）に例示するように、時間の経過とともに指数関数的に電圧が低下する形状を有する。これらの波形にはそれぞれ特徴があり、例えば、生きた細胞を対象とする場合には、スクエアパルスを用いる方が、エクスポネンシャルパルスを用いるよりも電圧印加後の細胞の生存率が高くなることがある。

【0041】

ＰＣ３１は、例示したエクスポネンシャルパルスやスクエアパルス以外の任意の波形を作成し、編集し、保存することができる。ＰＣ３１は、例えば、図６（Ｃ）に例示するバイアスが付加された正弦波、三角波、これらの一部等を作成、編集、保存することが可能である。言い換えれば、ＰＣ３１は、時刻毎の電圧の値を細かく設定し、保存することができる。

【0042】

再び図１を参照すると、ＰＣ３１は、発生させる電圧パルスの波形、発生タイミング及び発生回数を波形発生装置３２に指示する制御信号を出力する。波形に関する情報は、例えば、ＰＣＭ信号などでＰＣ３１がその都度出力してもよく、また、波形発生装置３２に予め記憶されている波形の識別情報を指示する形態でもよい。

【0043】

波形発生装置３２は、ＰＣ３１からの制御信号に含まれる波形データを取り出して、再生するか、または、記憶装置内に予め記憶されている波形データのうち、コマンドに対応するものを選択して、必要に応じて合成して、再生し、指示された波形を有する電圧信号を指示されたタイミングで指示された回数出力する。波形発生装置３２は、電圧信号の出力が正常に完了したことなどの情報をＰＣ３１に送信し、ＰＣ３１はこれを報知する。

【0044】

増幅器３３は、直流電源３４から供給された電力を用いて、波形発生装置３２から入力された電圧信号を一定の倍率で増幅し、出力する。増幅器３３の一対の出力端は、末端に鰐口クリップやコネクタを備えた導線４１、４２を介して下側電極２１と上側電極２２に接続される。
なお、増幅器３３は、スピーカ３５にも接続されている。そして、下側電極２１と上側電極２２との間に流れる電流は、増幅器３３内部でＩＶ変換され、スピーカ３５に出力される。図５（Ａ）に示したように、試料Ｓの量が十分でなく、試料Ｓが下側電極２１の電極面ＣＳ１と上側電極２２の電極面ＣＳ２のいずれかに接していない場合には、下側電極２１と上側電極２２との間に流れる電流は極めて小さいため、スピーカ３５に入力される電圧の振幅も小さく、スピーカ３５から大きな音が聞こえることはない。これに対し、図５（Ｂ）に示したように、試料Ｓの量が十分であり、試料Ｓが下側電極２１の電極面ＣＳ１と上側電極２２の電極面ＣＳ２の両方に接している場合には、下側電極２１と上側電極２２との間に、試料Ｓの電気抵抗の値に応じた十分な大きさの電流が流れるため、スピーカ３５に入力される電圧の振幅もそれに応じて大きくなり、スピーカ３５から音が聞こえる。このように、増幅器３３にスピーカ３５を接続し、スピーカ３５からの音を確認することにより、試料Ｓが下側電極２１の電極面ＣＳ１と上側電極２２の電極面ＣＳ２の両方に確実に接しているか否かを簡便に判別することができる。また、試料Ｓが電極面ＣＳ１、ＣＳ２の両方に接しているか否かを判別する方法は上述したものに限られず、下側電極２１と上側電極２２との間に流れる電流の大きさをモニタリングできる方法であればよい。例えば、スピーカの替わりにオシロスコープ等を接続し、両電極２１、２２間に流れる電流を視覚的、または、定量的に監視して判別する方法を用いてもよい。

【0045】

（動作）
次に、上記構成を有するエレクトロポレーション装置１の動作を説明する。
まず、試料Ｓを用意する。具体的には、緩衝液等などに目的細胞やリポソーム、さらに、導入対象の金属微粒子、ＤＮＡ等の対象物を分散させて試料Ｓを構成する懸濁液を生成する。

【0046】

例えば、金ナノ粒子を細胞内に導入する場合、例えば、緩衝液をストレプトアビジン（Streptavidin）に結合した金属ナノ粒子と目的細胞とを分散させて試料を生成する。また、タンパク質又はmRNAを細胞内へ導入する場合には、緩衝液にタンパク質又はmRNAと、細胞とを分散させた緩衝液を生成する。

【0047】

次に、上側電極２２と共にケース２４を支持台２３から取り外す。
次に、試料Ｓをスポイトやマイクロピペットに吸い込み、下側電極２１の円盤部２１Ａの電極面ＣＳ１上に滴下する。滴下された試料Ｓは、表面張力の作用により球状になるが、その直径が、下側電極２１の円盤部２１Ａの直径より大きくなるまで、溢れないように静かに滴下を続ける。

【0048】

試料Ｓの直径が十分な大きさになったら、上方からケース２４を静かに被せる。
ケース２４と支持台２３に設けられた磁石２５Ａと２５Ｂの吸引力により、ケース２４は支持台２３の所定位置に固定される。これにより、下側電極２１の電極面ＣＳ１と上側電極２２の電極面ＣＳ２とは鉛直方向に対向し、その間に試料Ｓが挟まれる。このとき、試料Ｓが上側電極２２の電極面ＣＳ２にも接していることを確認する。試料Ｓを含む液体が、図５（Ａ）に示すように、上側電極２２の電極面ＣＳ２に接していない場合には、ケース２４を取り外し、さらに試料Ｓを追加するか、上側電極２２を下げ、下側電極２１と上側電極２２との距離Ｄを狭める。そして、図５（Ｂ）に示すように、下側電極２１の電極面ＣＳ１と上側電極２２の電極面ＣＳ２に触れ、且つ、接触角θが大きくなるように試料Ｓを配置する。

【0049】

また、ケース２４を被せたことにより、試料Ｓの一部が下側電極２１と上側電極２２との間から溢れ出した場合には、ケース２４を一度取り外し、こぼれた液体を除去する。必要に応じて、試料Ｓを追加するか、下側電極２１と上側電極２２との距離Ｄを広げてもよい。

【0050】

ユーザは、波形を新規に作成するか、事前に作成・保存されていた波形のデータを呼び出して、データを編集した後、ＰＣ３１を操作して、波形発生装置３２に制御信号を出力する。

【0051】

波形発生装置３２は、制御信号の指示に従った波形を有する電圧信号を指示された回数、指示されたタイミングで発生する。増幅器３３は、この電圧信号を電流増幅又は電圧増幅し、下側電極２１と上側電極２２の間に印加する。これにより、下側電極２１と上側電極２２の間に配置された試料Ｓに所望の波形を有する電圧パルス又は電流パルス信号が、所望の回数、所望のタイミングで印加される。

【0052】

これにより、下側電極２１と上側電極２２の間に配置された試料Ｓに電圧パルス又は電流パルスが印加され、目的細胞やリポソームに、金属微粒子、ＤＮＡ等の対象物が導入される。

【0053】

電圧パルス又は電流パルスの印加後、ケース２４を静かに取り外す。
図７（Ａ）に示すように、パルスの印加により、試料Ｓ中に気泡Ｂが発生することがある。
続いて、図７（Ｂ）に示すように、試料Ｓを作成するために用いたものと同様の緩衝液や蒸留水等の呼び水Ｗを、スポイトやピペットＰ１から下側電極２１上の試料Ｓに滴下する（加水する）。これにより、試料Ｓの体積が増加し、接触角θが大きくなるとともに、粘度が下がる。

【0054】

続いて、図７（Ｃ）に示すように、ユーザは、スポイトやピペットＰ２で吸い込むことにより、試料Ｓを回収する。

【0055】

呼び水Ｗを用いない場合には、試料Ｓ（エレクトロポレーションの実施により、体積は１μｌ程度になる。）の回収率は３０％程度であるところ、例えば、４μｌの呼び水Ｗを用いた場合の試料Ｓの回収率は７０〜８０％程度まで上昇する。試料Ｓの回収率の向上により、回収後の試料Ｓの分析が容易になり、分析精度も上昇する。

【0056】

以上で、１回のエレクトロポレーションの処理が終了する。

【0057】

以上説明したように、本実施の形態にかかるエレクトロポレーション装置１によれば、試料Ｓを下側電極２１と上側電極２２とで保持するため、微量の試料Ｓでエレクトロポレーションを実施可能である。また、試料Ｓの汚染を防止することが可能である。

【0058】

ケース２４で試料Ｓを覆うことにより、外気などによる試料Ｓの汚染も防止できる。ケース２４を透明とすることにより、目視しながらエレクトロポレーションを実施できる。

【0059】

また、試料Ｓに含まれる細胞又はリポソームに、それらの位置によらず、均一な強度の電界を印加することができる。

【0060】

さらに、呼び水Ｗを用いることにより、試料Ｓを効率良く回収することができる。

【0061】

また、任意の波形の電圧パルス又は電流パルスを、任意のタイミング、任意の回数で、試料Ｓに印加することができる。

【0062】

下側電極２１と上側電極２２との距離Ｄを調整でき、しかも、その距離Ｄを維持できるので、試料Ｓの特性に応じた調整が可能である。

【0063】

（第２の実施の形態）
次に、本発明の第２の実施の形態に係るエレクトロポレーション装置１００について説明する。なお、理解を容易にするため、エレクトロポレーション装置１と異なる部分を中心に説明する。

【0064】

この実施の形態に係るエレクトロポレーション装置１００は、下側電極１２１を冷却し、エレクトロポレーションによって生じる熱を拡散する手段を備える。

【0065】

本実施の形態において、図８に示すように、エレクトロポレーション装置１００の支持台１２３は、アルミニウム製であり、下側電極１２１と電気的及び熱的に接続されている。また、支持台１２３の底には、アルミニウム製の脚１２６が複数設けられている。

【0066】

熱伝導率が高いアルミニウムを支持台１２３や脚１２６の材質として用いることで、エレクトロポレーションの実施に伴い発生する熱が速やかに拡散し、試料Ｓの温度上昇を抑制し、又は、速やかな温度低下を実現することができる。すなわち、このような支持台１２３や脚１２６は、放熱手段及び／又冷却手段として機能する。また、下側電極１２１と支持台１２３とを電気的に接続することで、導線４１を下側電極１２１自体に接続する必要がなくなり、導線４１を接続する位置の自由度が向上する。

【0067】

さらに、脚１２６を、氷水Ｉが溜められたガラス容器１２８内に配置することにより、下側電極１２１を積極的に冷却してもよい。

【0068】

なお、放熱及び冷却の手法は、上述したものに限られず、例えば、下側電極１２１、上側電極１２２にフィンを設ける方法、クーラーを用いる方法等であってもよい。

【0069】

支持台１２３及び脚１２６の材質は、アルミニウムに限られず、熱伝導率が高く、電気抵抗の低い他の材質、例えば、ステンレスであってもよい。ステンレスを支持台１２３及び脚１２６の材質とすることにより、腐食しにくいエレクトロポレーション装置１００を実現できる。

【0070】

（第３の実施の形態）
前述した実施の形態においては、電極面ＣＳ１への試料Ｓの滴下、エレクトロポレーション実施後の試料Ｓへの呼び水Ｗの滴下、試料Ｓの回収、電極２１、２２の洗浄、上側電極２２の昇降などを人間が実施する例を示したが、これらを自動化してもよい。以下、自動化した機能を備えるエレクトロポレーション装置２００の実施の形態を説明する。

【0071】

この構成に係るエレクトロポレーション装置２００は、図９に例示するように、レール２３１と、自走車２３２と、アーム２３３と、ディスペンサ２３４と、を備える。

【0072】

レール２３１は、ケース２４で覆われた範囲内の支持台２３（又は１２３）の上に水平に配置される。
自走車２３２は、レール２３１に沿って自走する。
アーム２３３は、自走車２３２の上に配置され、鉛直方向に伸縮する。
ディスペンサ２３４は、アーム２３３の先端部に配置され、内部に試料Ｓを保持し、試料Ｓを電極面ＣＳ１上に配置する。

【0073】

また、下側電極２１と上側電極２２には、直動アクチュエータ２４１と２４２が配置され、下側電極２１と上側電極２２をそれぞれ鉛直方向に移動させる。

【0074】

自走車２３２とアーム２３３とディスペンサ２３４と直動アクチュエータ２４１、２４２は、例えば、ＰＣ３１により制御される。

【0075】

次に、このような構成において、電極面ＣＳ１上に試料Ｓを載置する動作を説明する。
初期状態では、自走車２３２は、ケース２４内で下側電極２１から離れた退避位置にある。
ＰＣ３１は、直動アクチュエータ２４１と２４２を制御して、下側電極２１を基準位置に、上側電極２２を基準位置よりも上方に移動する。

【0076】

次に、ＰＣ３１は、自走車２３２を制御し、ディスペンサ２３４が試料Ｓを電極面ＣＳ１上に滴下することが可能な位置である滴下位置まで移動させる。
ＰＣ３１は、アーム２３３の長さを制御して、ディスペンサ２３４の高さを調整する。
続いて、ＰＣ３１は、ディスペンサ２３４の向き、角度などを制御し、電極面ＣＳ１上に規定量の試料Ｓを吐出する。なお、ディスペンサ２３４は、内部に攪拌機構を備え、吐出前に試料を攪拌することが望ましい。
その後、ＰＣ３１は、自走車２３２、アーム２３３、ディスペンサ２３４を制御して、退避位置に移動させる。
続いて、ＰＣ３１は、直動アクチュエータ２４２を制御して、上側電極２２を基準位置まで降下させる。

【0077】

このような構成によれば、試料Ｓの載置を自動化することができる。

【0078】

なお、同様の構成により、呼び水Ｗを滴下する機構を構成可能である。この場合、ディスペンサ２３４は、加水手段としての機能を有する。
さらに、ディスペンサ２３４と吸収器（プランジャ）を置換することにより、エレクトロポレーション実施後の試料Ｓを回収する機構を実現可能である。この場合、吸収器（プランジャ）は、回収手段としての機能を有する。
さらに、純水などの洗浄液を収納したディスペンサ２３４と洗浄液を吸収する吸収器とを配置することにより、電極２１、２２を洗浄する洗浄機構を構成することも可能である。
また、これらの構成の一部を共用化してもよい。例えば、１台のディスペンサ２３４に試料Ｓと洗浄液を収容させ、異なる吐出口からこれらを吐出するようにしてもよい。また、１台の自走車２３２或いはアーム２３３に、ディスペンサ２３４と吸引器を配置するなどしてもよい。

【0079】

また、作業性を向上するため、図１０に示すエレクトロポレーション装置３００に示すように、ケース２４に開閉扉２４３を配置してもよい。

【0080】

以上、本発明の実施の形態に係るエレクトロポレーション装置１等とエレクトロポレーション装置１等が実行するエレクトロポレーション方法について説明したが、本願発明はこれらに限定されない。

【0081】

例えば、多数の試料Ｓのエレクトロポレーションを一度に行うため、支持台２３の上に多数の下側電極２１、上側電極２２及びケース２４を設けてもよい。
また、ケース２４内部空間の形状は、円柱以外、例えば、四角柱であってもよい。
また、下側電極２１と上側電極２２とを金で覆う例を説明したが、各電極の電極面とその近傍のみを金で覆ってもよい。また、金以外の物質でコーティングしてもよい。

【0082】

下側電極２１と上側電極２２の形状も実施の形態で示したものに限定されず、適量の試料Ｓを空中で保持できるならば、任意の形状であってもよい。

【0083】

例えば、図１１（Ａ）は、金属棒の先端を水平に切断して水平面を形成した形状を有する電極２１、２２の例を示す。
また、図１１（Ｂ）は、金属棒の先端に、円錐台を形成し、その円錐台の底面が水平となるように配置した電極２１、２２を示す。
また、図１１（Ｃ）は、円錐台形状の電極２１、２２を示す。
このような垂直電極２を用いても、試料Ｓが挟み込まれる面は、水平であるから、前述した発明の効果が得られる。また、電極面ＣＳ１、ＣＳ２は、円形に限定されず、楕円形などでもよい。

【0084】

なお、試料Ｓは表面張力により電極面ＣＳ１、ＣＳ２の間に保持される。従って、電極面ＣＳ１、ＣＳ２のエッジは、明確であることが望ましく、面取りなどの処理の無い、鋭いエッジを有することが望ましい。

【実施例】

【0085】

本実施の形態に係るエレクトロポレーション装置１を用いてエレクトロポレーションを実施し、エレクトロポレーションが可能であることを確認する実験を行った。

【0086】

（第１の実験）
第１の実験は、金ナノ粒子（ストレプトアビジン（Streptavidin）と結合、直径６０ｎｍ）を細胞内へ導入する実験である。

【0087】

HEK293細胞に対し、エレクトロポレーション装置１を用いて、４０Ｖ（矩形波の電圧、以下同様）、５ｍｓ（矩形波の電圧印加時間、以下同様）のパルスを２回、印加した。
図１２（Ａ）は細胞の輪郭の位置を示す蛍光画像（顕微鏡画像、以下同様）であり、図１２（Ｂ）は（Ａ）に対応する細胞における金ナノ粒子の散乱像である。図１２（Ａ）、（Ｂ）はいずれも光学断層像である。これに対し、図１２（Ｃ）、（Ｄ）は、それぞれ、図１２（Ａ）、（Ｂ）の断層像を（Ａ）、（Ｂ）の断層面に対して垂直な方向であるＺ軸方向に投影したＺ軸投影像である。

【0088】

細胞のある断面において、図１２（Ａ）に示すように、細胞の内側の領域に（細胞膜に想到する部分が８の字状に発光している。）、図１２（Ｂ）に示すように、複数の明るい点が存在することから、HEK293細胞の内部に金ナノ粒子が導入されたことが理解される。また、このことは、Ｚ軸投影像である図１２（Ｃ）、（Ｄ）を参照するとより明確に理解される。図１２（Ａ）と図１２（Ｃ）、図１２（Ｂ）と図１２（Ｄ）がそれぞれ対応する。図１２（Ｄ）に示すように、細胞の内側の領域に、多数の明るい点が存在することから、HEK293細胞の内部に少なくとも数１０個の金ナノ粒子が導入されたことが理解される。

【0089】

（第２の実験）
第２の実験は、タンパク質又はmRNAを細胞内へ導入する実験である。
細胞にはHEK293細胞を、タンパク質にはKusabira-Orange（蛍光タンパク質の一種）を、mRNAには発現すると蛍光タンパク質venusが生成されるものをそれぞれ用いた。
Kusabira-Orangeを導入する実験では、４５Ｖ、５ｍｓのパルスを２回、mRNAを導入する実験では、３５Ｖ、５ｍｓのパルスを２回、印加した。

【0090】

図１３（Ａ）はKusabira-Orangeの蛍光画像であり、図１３（Ｂ）はvenusの蛍光画像である。
図１３（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、発光している点が複数確認される。これは、Kusabira-Orange又はvenusを発現するmRNAがHEK293細胞内に良好に導入されたことを示している。

【0091】

以上説明した第１の実験及び第２の実験の結果から、エレクトロポレーション装置１を用いて、微少量の試料Ｓでエレクトロポレーションを実施することができたことが理解される。

【0092】

（第３の実験）
第３の実験は、エレクトロポレーションを実施する際に、垂直電極２を冷却することによる細胞の生存率の変化を調べる実験である。エレクトロポレーション装置１又はエレクトロポレーション装置１００を用いてHEK293細胞に４０Ｖ、５ｍｓのパルスを２回印加して、ＧＦＰ発現プラスミドを導入した。室温そのままで実験した場合（エレクトロポレーション装置１を使用）と、支持台２３ごと垂直電極２を氷水（０℃）で冷却しながら実験した場合（エレクトロポレーション装置１００を使用）とで比較した。

【0093】

図１４（Ａ）及び（Ｂ）は、多数の細胞を含む領域を同等の拡大率で撮影した蛍光画像である。ＧＦＰは、生存している細胞において発現するため、生存している細胞の存在する領域は蛍光を発し、画像に発光する点として現れる。
冷却しない場合（図１４（Ａ））に比べ、冷却した場合（図１４（Ｂ））の方が、蛍光を発している領域が広い。これは、冷却した場合の方が、冷却しない場合に比べて細胞の生存率が高いことを示している。

【0094】

第３の実験の結果から、エレクトロポレーション装置１００を用いたエレクトロポレーションの実施により、細胞の生存率が向上することが理解される。

【符号の説明】

【0095】

１、１００、２００、３００ エレクトロポレーション装置
２ 垂直電極
２１、１２１ 下側電極
２２、１２２ 上側電極
２１Ａ、２２Ａ 円盤部
２３、１２３ 支持台
２４ ケース
２５Ａ、２５Ｂ 磁石
２６、１２６ 脚
２７ ナット
１２８ ガラス容器
３ 電圧印加装置
３１ パーソナルコンピュータ（ＰＣ）
３２ 波形発生装置
３３ 増幅器
３４ 直流電源
３５ スピーカ
４１、４２ 導線
２３１ レール
２３２ 自走車
２３３ アーム
２３４ ディスペンサ
２４１、２４２ 直動アクチュエータ
２４３ 開閉扉
Ｂ 気泡
ＣＳ１、ＣＳ２ 電極面
Ｐ１、Ｐ２ ピペット
Ｓ 試料
Ｗ 呼び水

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】