特開 2020-103219 炭化水素処理剤、炭化水素の処理方法、及び炭化水素処理剤の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2020-103219(P2020-103219A)

(43)【公開日】2020年7月9日

(54)【発明の名称】炭化水素処理剤、炭化水素の処理方法、及び炭化水素処理剤の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20200612BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20200612BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/20 A

   C12N1/00 R

   C12N1/20 F

   C12N1/20 D

【審査請求】未請求

【請求項の数】11

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】23

(21)【出願番号】特願2018-247431(P2018-247431)

(22)【出願日】2018年12月28日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り （１）発行物名：日本農芸化学会２０１８年度大会講演要旨集（オンライン）、掲載ウェブサイトのアドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｊｓｂｂａ．ｂｉｏｗｅｂ．ｎｅ．ｊｐ／ｊｓｂｂａ２０１８／ｄｏｗｎｌｏａｄ＿ｐｄｆ．ｐｈｐ？ｐ＿ｃｏｄｅ＝３Ａ１１ｐ０９、掲載年月日：平成３０年３月５日 （２）集会名：日本農芸化学会２０１８年度大会、開催場所：名城大学（名古屋市天白区塩釜口１−５０１）、第３日（３月１７日）講演会場、開催日：平成３０年３月１７日 （３）掲載ウェブサイトのアドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｊ２０１８．ｊｐ／ｅｘｈｉｂｉｔｏｒ／ｊｓｓ２０１８０２６０．ｈｔｍｌ、掲載年月日：平成３０年７月２４日 （４）集会名：イノベーション・ジャパン２０１８、開催場所：東京ビックサイト（東京都江東区有明３−１１−１）、西展示棟・西１ホール、開催日：平成３０年８月３０日

(71)【出願人】

【識別番号】899000057

【氏名又は名称】学校法人日本大学

(71)【出願人】

【識別番号】599072297

【氏名又は名称】日之出産業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100161207

【弁理士】

【氏名又は名称】西澤 和純

(74)【代理人】

【識別番号】100175824

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100126882

【弁理士】

【氏名又は名称】五十嵐 光永

(72)【発明者】

【氏名】岩淵 範之

(72)【発明者】

【氏名】砂入 道夫

(72)【発明者】

【氏名】田上 晃二

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA45X

4B065AC11

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA21

4B065BA30

4B065BB10

4B065BD07

4B065BD25

4B065BD50

4B065CA54

(57)【要約】

【課題】炭化水素の迅速な処理を実現可能な、炭化水素処理剤等を提供する。
【解決手段】２種類以上の炭化水素分解菌を含む炭化水素処理剤であって、前記炭化水素分解菌は、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれか２つ以上を含む、炭化水素処理剤：（ａ）ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＰＲ４株及びその変異株からなる群より選択される少なくとも１株；（ｂ）ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＭＳＺ１株及びその変異株からなる群より選択される少なくとも１株；（ｃ）ゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ．）ＭＳＺ６株及びその変異株からなる群より選択される少なくとも１株；並びに（ｄ）ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＭＳＺ９株及びその変異株からなる群より選択される少なくとも１株。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

２種類以上の炭化水素分解菌を含む炭化水素処理剤であって、前記炭化水素分解菌は、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれか２つ以上を含む、炭化水素処理剤：
（ａ）ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＰＲ４株（ＮＢＲＣ１００８８７）及びその変異株からなる群より選択される少なくとも１株；
（ｂ）ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＭＳＺ１株（ＮＩＴＥ Ｐ−０２８２４）及びその変異株からなる群より選択される少なくとも１株；
（ｃ）ゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ．）ＭＳＺ６株（ＮＩＴＥ Ｐ−０２８２５）及びその変異株からなる群より選択される少なくとも１株；並びに
（ｄ）ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＭＳＺ９株（ＮＩＴＥ Ｐ−０２８２６）及びその変異株からなる群より選択される少なくとも１株。

【請求項2】

前記炭化水素分解菌が、前記（ａ）〜（ｄ）の全てを含む、請求項１に記載の炭化水素処理剤。

【請求項3】

有機溶媒と水性溶媒とを含むエマルション組成物である、請求項１又は２に記載の炭化水素処理剤。

【請求項4】

前記炭化水素分解菌が、油相中、及び油相と水相との界面の少なくとも一方に存在している、請求項３に記載の炭化水素処理剤。

【請求項5】

前記エマルション組成物が、水中油型エマルション組成物である、請求項３又は４に記載の炭化水素処理剤。

【請求項6】

前記水中油型エマルション組成物における油滴粒子の平均粒径が１〜１００μｍである、請求項５に記載の炭化水素処理剤。

【請求項7】

前記有機溶媒が炭素数１２〜１９のアルカンである、請求項３〜６のいずれか一項に記載の炭化水素処理剤。

【請求項8】

請求項１〜７のいずれか一項に記載の炭化水素処理剤を用いることを特徴とする、炭化水素の処理方法。

【請求項9】

２種類以上の炭化水素分解菌と、前記炭化水素分解菌が生育可能な培地と、有機溶媒と、を含む組成物を、超音波処理することにより、エマルションを形成させることを特徴とする、炭化水素処理剤の製造方法であって、
前記炭化水素分解菌が、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれか２つ以上を含む、炭化水素処理剤の製造方法：
（ａ）ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＰＲ４株（ＮＢＲＣ１００８８７）及びその変異株からなる群より選択される少なくとも１株；
（ｂ）ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＭＳＺ１株（ＮＩＴＥ Ｐ−０２８２４）及びその変異株からなる群より選択される少なくとも１株；
（ｃ）ゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ．）ＭＳＺ６株（ＮＩＴＥ Ｐ−０２８２５）及びその変異株からなる群より選択される少なくとも１株；並びに
（ｄ）ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＭＳＺ９株（ＮＩＴＥ Ｐ−０２８２６）及びその変異株からなる群より選択される少なくとも１株。

【請求項10】

前記炭化水素分解菌が、前記（ａ）〜（ｄ）の全てを含む、請求項９に記載の炭化水素処理剤の製造方法。

【請求項11】

前記エマルションが水中油型エマルションである、請求項９又は１０に記載の炭化水素処理剤の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、炭化水素処理剤、炭化水素の処理方法、及び炭化水素処理剤の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

バイオプロセスによる環境浄化を考える場合、応用が期待される微生物には、有機溶媒を含む特殊な環境下での良好な増殖や活発な代謝活動などの性質が求められる。また、石油流出事故などによる石油汚染環境の浄化に必要な微生物にも、高濃度難揮発性化合物存在下でこれらの分解を行いながら良好な増殖を示すために、これらに対する分解能だけでなく、共存する難揮発性化合物の毒性に対する耐性能が高いことが求められる。
そのためには、まず、微生物の有機溶媒耐性が必要であり、特にバイオプロセスにおいては、高濃度有機溶媒存在下での増殖が求められる。

【0003】

ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＰＲ４株（以下、「ＰＲ４株」という。）は、分岐鎖状のアルカンの一種であるプリスタン（２，６，１０，１４−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ）分解菌として単離された株であり、培養の経過と共にＥＰＳの生産に基づいた自身のコロニー形態をラフ型→ムコイド型→ラフ型へと変化させる株である。また、同株は難揮発性有機溶媒に耐性を示すことが知られている。

【0004】

本発明者らは、ＰＲ４株が、炭素数１４以上のテトラデカン、ペンタデカン、ヘキサデカン、プリスタン、スクワラン等に転移して、これらのアルカンを代謝及び分解できることを明らかにした（特許文献１）。

【0005】

また、本発明者らは、培地と親油性溶媒との二相培養系において、培地に添加するマグネシウム塩の濃度を制限することにより、親油性溶媒に対するＰＲ４株の局在性を、親油性溶媒粒子表面に吸着する形態から、親油性粒子内に転移する形態に変更できることを明らかにした（特許文献２）。

【0006】

さらに、本発明者らは、ＰＲ４株と、有機溶媒と、培地とを混合し、ＰＲ４株が生育可能な条件で超音波処理を行って、ＰＲ４株を有機溶媒によりミセル封入化することにより、風化原油の分解速度が向上することを明らかにした（特許文献３）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特許第４８７７９００号公報

【特許文献2】特許第５７４７３７１号公報

【特許文献3】特開２０１７−２０１９６２号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

特許文献３に記載の方法によれば、原油分解速度の向上に加えて、界面活性剤や乳化安定剤を用いることなく水中油型エマルションを形成させるため、それらの物質による環境汚染の恐れがない。しかしながら、石油流出事故等による油汚染は、処理が遅れるほど汚染の影響が深刻になるため、より迅速な対応が求められる。また、炭化水素含有廃水等の処理においても、炭化水素分解速度をより向上させることにより、時間とコストを削減することができる。

【0009】

本発明は上記事情に鑑みて為されたものであり、炭化水素の迅速な処理を実現可能な、炭化水素処理剤、前記炭化水素処理剤を用いた炭化水素処理方法、及び前記炭化水素処理剤の製造方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は以下の態様を含む。
［１］２種類以上の炭化水素分解菌を含む炭化水素処理剤であって、前記炭化水素分解菌は、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれか２つ以上を含む、炭化水素処理剤：
（ａ）ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＰＲ４株（ＮＢＲＣ１００８８７）及びその変異株からなる群より選択される少なくとも１株；
（ｂ）ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＭＳＺ１株（ＮＩＴＥ Ｐ−０２８２４）及びその変異株からなる群より選択される少なくとも１株；
（ｃ）ゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ．）ＭＳＺ６株（ＮＩＴＥ Ｐ−０２８２５）及びその変異株からなる群より選択される少なくとも１株；並びに
（ｄ）ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＭＳＺ９株（ＮＩＴＥ Ｐ−０２８２６）及びその変異株からなる群より選択される少なくとも１株。
［２］前記炭化水素分解菌が、前記（ａ）〜（ｄ）の全てを含む、［１］に記載の炭化水素処理剤。
［３］有機溶媒と水性溶媒とを含むエマルション組成物である、［１］又は［２］に記載の炭化水素処理剤。
［４］前記炭化水素分解菌が、油相中、及び油相と水相との界面の少なくとも一方に存在している、［３］に記載の炭化水素処理剤。
［５］前記エマルション組成物が、水中油型エマルション組成物である、［３］又は［４］に記載の炭化水素処理剤。
［６］前記水中油滴型エマルション組成物における油滴粒子の平均粒径が１〜１００μｍである、［５］に記載の炭化水素処理剤。
［７］前記有機溶媒が炭素数１２〜１９のアルカンである、［３］〜［６］のいずれか一項に記載の炭化水素処理剤。
［８］［１］〜［７］のいずれか一項に記載の炭化水素処理剤を用いることを特徴とする、炭化水素の処理方法。
［９］２種類以上の炭化水素分解菌と、前記炭化水素分解菌が生育可能な培地と、有機溶媒と、を含む組成物を、超音波処理することにより、エマルションを形成させることを特徴とする、炭化水素処理剤の製造方法であって、
前記炭化水素分解菌が、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれか２つ以上を含む、炭化水素処理剤の製造方法：
（ａ）ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＰＲ４株（ＮＢＲＣ１００８８７）及びその変異株からなる群より選択される少なくとも１株；
（ｂ）ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＭＳＺ１株（ＮＩＴＥ Ｐ−０２８２４）及びその変異株からなる群より選択される少なくとも１株；
（ｃ）ゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ．）ＭＳＺ６株（ＮＩＴＥ Ｐ−０２８２５）及びその変異株からなる群より選択される少なくとも１株；並びに
（ｄ）ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＭＳＺ９株（ＮＩＴＥ Ｐ−０２８２６）及びその変異株からなる群より選択される少なくとも１株。
［１０］前記炭化水素分解菌が、前記（ａ）〜（ｄ）の全てを含む、［９］に記載の炭化水素処理剤の製造方法。
［１１］前記エマルションが水中油型エマルションである、［９］又は［１０］に記載の炭化水素処理剤の製造方法。

【発明の効果】

【0011】

本発明によれば、炭化水素の迅速な処理を実現可能な、炭化水素処理剤、前記炭化水素処理剤を用いた炭化水素処理方法、及び前記炭化水素処理剤の製造方法が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】超音波処理の前後におけるＰＲ４株のコロニー形成能を示すグラフである。

【図2】炭化水素処理剤１（ＰＲ４株のＭＭ培地懸濁液）、炭化水素処理剤２（ＰＲ４株のＭＭ培地懸濁液の超音波処理物）、及び炭化水素処理剤３（ＰＲ４株のＭＭ培地懸濁液＋ｎ−ヘキサデカンの超音波処理物）を用いて、風化原油（ｗ−ｏｉｌ）の分解試験を行った結果を示すグラフである。

【図3】（Ａ）は、ＭＳＺ１株の各培養系における生育曲線を示すグラフである。（Ｂ）は、超音波処理の前後におけるＭＳＺ１株のコロニー形成能を示すグラフである。

【図4】（Ａ）は、ＭＳＺ６株の各培養系における生育曲線を示すグラフである。（Ｂ）は、超音波処理の前後におけるＭＳＺ６株のコロニー形成能を示すグラフである。

【図5】（Ａ）は、ＭＳＺ９株の各培養系における生育曲線を示すグラフである。（Ｂ）は、超音波処理の前後におけるＭＳＺ９株のコロニー形成能を示すグラフである。

【図6】ＭＭ＋ｗ−ｏｉｌ培養系における、ＰＲ４株、ＭＳＺ１株、ＭＳＺ６株、及びＭＳＺ９株の局在性を示す顕微鏡写真である。

【図7】炭化水素処理剤３（ＰＲ４株のＭＭ培地懸濁液＋ｎ−ヘキサデカンの超音波処理物）、及び炭化水素処理剤４（ＰＲ４株、ＭＳＺ１株、ＭＳＺ６株、及びＭＳＺ９株のＭＭ培地懸濁液＋ｎ−ヘキサデカンの超音波処理物）を用いて、風化原油（ｗ−ｏｉｌ）の分解試験を行った結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0013】

［炭化水素処理剤］
１実施形態において、本発明は、２種類以上の炭化水素分解菌を含む炭化水素処理剤を提供する。前記炭化水素分解菌は、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれか２つ以上を含む：
（ａ）ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＰＲ４株（ＮＢＲＣ１００８８７）及びその変異株からなる群より選択される少なくとも１株；
（ｂ）ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＭＳＺ１株（ＮＩＴＥ Ｐ−０２８２４）及びその変異株からなる群より選択される少なくとも１株；
（ｃ）ゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ．）ＭＳＺ６株（ＮＩＴＥ Ｐ−０２８２５）及びその変異株からなる群より選択される少なくとも１株；並びに
（ｄ）ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＭＳＺ９株（ＮＩＴＥ Ｐ−０２８２６）及びその変異株からなる群より選択される少なくとも１株。

【0014】

＜炭化水素分解菌＞
本明細書において、「炭化水素分解菌」とは、炭化水素を分解する能力を有する微生物を意味する。炭化水素の分解様式は、特に限定されず、炭化水素資化性を有していなくてもよい。炭化水素分解菌は、細菌であっても、菌類であってもよいが、細菌が好ましい。
本実施形態の炭化水素処理剤は、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれか２つ以上の組み合わせの炭化水素分解菌を含む。

【0015】

≪（ａ）〜（ｄ）の炭化水素分解菌≫
ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＰＲ４株（ＮＢＲＣ１００８８７）は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）のＮＩＴＥ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒから、ＮＢＲＣ１００８８７のＮＢＲＣ番号にて入手可能である。以下、本株を「ＰＲ４株」という。
ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＭＳＺ１株は、２０１８年１１月１９日付で、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２８２４として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている。以下、本株を「ＭＳＺ１株」という。
ゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ．）ＭＳＺ６株は、２０１８年１１月１９日付で、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２８２５として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている。以下、本株を「ＭＳＺ６株」という。
ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＭＳＺ９株は、２０１８年１１月１９日付で、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２８２６として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている。以下、本株を「ＭＳＺ９株」という。

【0016】

後述する実施例で示すように、上記４株は、いずれもヘキサデカン等の難揮発性有機溶媒に対する耐性能を有する。
上記４株は、有機溶媒／水性溶媒の２相培養系において、有機溶媒に対して吸着型の局在性又は転移型の局在性を示す。ここで、有機溶媒に対する「吸着型の局在性」とは、細菌細胞が、主に親油性溶媒と水相との界面に存在することを意味する。有機溶媒に対する「転移型の局在性」とは、細菌細胞が、主に親油性溶媒内に存在することを意味する。
より具体的には、ＰＲ４株は、有機溶媒／水性溶媒の培養系において、有機溶媒に対して転移型の局在性を示す。ＭＳＺ１株は、有機溶媒／水性溶媒の２相培養系において、２相培養系に対して転移型の局在性を示す。ＭＳＺ６株は、有機溶媒／水性溶媒の２相培養系において、有機溶媒に対して転移型の局在性を示す。ＭＳＺ９株は、有機溶媒／水性溶媒の２相培養系において、有機溶媒に対して吸着型の局在性を示す。

【0017】

上記４株は、風化原油（ｗｅａｔｈｅｒｅｄ ｃｒｕｄｅ ｏｉｌ；以下、「ｗ−ｏｉｌ」という。）／水性溶媒の培養系において、ｗ−ｏｉｌに対して吸着型の局在性又は転移型の局在性を示す。より具体的には、ＰＲ４株は、ｗ−ｏｉｌ／水性溶媒の培養系において、ｗ−ｏｉｌに対して転移型の局在性を示す。ＭＳＺ１株は、ｗ−ｏｉｌ／水性溶媒の２相培養系において、ｗ−ｏｉｌに対して転移型の局在性を示す。ＭＳＺ６株は、ｗ−ｏｉｌ／水性溶媒の２相培養系において、ｗ−ｏｉｌに対して転移型の局在性を示す。ＭＳＺ９株は、ｗ−ｏｉｌ／水性溶媒の２相培養系において、ｗ−ｏｉｌに対して吸着型の局在性を示す。

【0018】

さらに、上記４株は、有機溶媒／水性溶媒の２相系からなる水中油型エマルションにおいて、油滴粒子に対して吸着型の局在性又は転移型の局在性を示す。ここで、油滴粒子に対する「吸着型の局在性」とは、細菌細胞が、主に油滴粒子の表面（油滴粒子と水相との界面）に存在することを意味する。油滴粒子に対する「転移型の局在性」とは、細菌細胞が、主に油滴粒子内に存在することを意味する。
より具体的には、ＰＲ４株は、有機溶媒／水性溶媒の２相系からなる水中油型エマルションにおいて、油滴粒子に対して転移型の局在性を示す。ＭＳＺ１株は、有機溶媒／水性溶媒の２相系からなる水中油型エマルションにおいて、油滴粒子に対して転移型の局在性を示す。ＭＳＺ６株は、有機溶媒／水性溶媒の２相系からなる水中油型エマルションにおいて、油滴粒子に対して転移型の局在性を示す。ＭＳＺ９株は、有機溶媒／水性溶媒の２相系からなる水中油型エマルションにおいて、油滴粒子に対して吸着型の局在性を示す。

【0019】

また、上記４株は、水性溶媒／有機溶媒の２相系からなる油中水型エマルションにおいて、油相に対して吸着型の局在性又は転移型の局在性を示す。ここで、油相に対する「吸着型の局在性」とは、細菌細胞が、主に油相と水滴粒子との界面に存在することを意味する。油相に対する「転移型の局在性」とは、細菌細胞が、主に油相内に存在することを意味する。
より具体的には、ＰＲ４株は、水性溶媒／有機溶媒の２相系からなる油中水型エマルションにおいて、油相に対して転移型の局在性を示す。ＭＳＺ１株は、水性溶媒／有機溶媒の２相系からなる油中水型エマルションにおいて、油相に対して転移型の局在性を示す。ＭＳＺ６株は、水性溶媒／有機溶媒の２相系からなる油中水型エマルションにおいて、油相に対して転移型の局在性を示す。ＭＳＺ９株は、水性溶媒／有機溶媒の２相系からなる油中水型エマルションにおいて、油相に対して吸着型の局在性を示す。

【0020】

本実施形態の炭化水素処理剤が含む炭化水素分解菌は、上記４株の変異株であってもよい。ここで「変異株」とは、自然発生的又は人為的に、元の菌株の遺伝子に変異が生じた菌株を意味する。遺伝子変異を生じさせる人為的手法は、特に限定されず、紫外線照射、放射線照射、亜硝酸などによる化学的処理、遺伝子導入などの遺伝子工学的手法等を例示することができる。上記４株の変異株は、元の菌株の遺伝子に変異が生じた菌株であって、元の菌株の炭化水素分解能及び局在性を維持した菌株であることが好ましい。
上記４株の変異株の好適な例としては、サイレント変異が生じた上記４株のいずれかの変異株；外来遺伝子が導入された上記４株のいずれかの変異株；炭化水素分解能及び局在性に関与しない遺伝子に変異が生じた上記４株のいずれかの変異株；炭化水素分解能及び局在性が増強された上記４株のいずれかの変異株；等が挙げられる。変異株と元の菌株との間のゲノムの配列同一性（相同性）は、９７％以上であることが好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましく、９９．５％以上がさらに好ましく。９９．９％以上が特に好ましい。

【0021】

上記４株は、一般的な好気性従属栄養細菌用の培地で培養することができる。培地は、固体培地であってもよく、液体培地であってもよい。培地は、炭素源、窒素源、及び無機塩類等の細菌の生存に必要な成分を含む公知の培地を用いることができる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストラン、スターチ、牛肉エキス、ピルビン酸、酢酸等が挙げられる。窒素源としては、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、ペプトン、カゼイン、カザミノ酸、尿素、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、モリブデンナトリウムなどのナトリウム塩；リン酸カリウム、塩化カリウムなどのカリウム塩；塩化カルシウム、リン酸カルシウムなどのカルシウム塩；塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムなどのマグネシウム塩；塩化鉄などの遷移金属塩；等が挙げられる。
培地の具体例としては、例えば、ＩＢ２液体培地、ＩＢ培地（特許第４８７７９００号公報参照）、ＹＧ液体培地、ＬＢ培地、マリンブロス、ニュートリエントブロス、トリプトソイブロス等が挙げられるが、これらに限定されない。中でも、上記４菌株の培養用培地としては、ＩＢ２液体培地及びＩＢ培地を好適に用いることができる。

【0022】

上記４株の培養用培地は、炭素源として、炭化水素を含んでいてもよい。炭化水素は、上記のような炭素源の替わりに用いてもよく、上記のような炭素源と併用してもよい。炭素源として用いる炭化水素は、特に限定されないが、アルカンが好ましい。アルカンは、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよく、環状であってもよい。アルカンとしては、炭素数１０〜１９が好ましく、炭素数１２〜１９がより好ましく、炭素数１３〜１９がさらに好ましい。

【0023】

上記４株は、一般的な好気性従属栄養細菌の培養に用いられる培養条件で培養することができある。例えば、ｐＨ条件としては、ｐＨ６．０〜８．０が挙げられ、ｐＨ７〜７．５が好ましい。温度条件としては、１５〜３５℃が挙げられ、２０〜３０℃が好ましく、２５〜３０℃がより好ましい。上記４株を液体培地で培養する場合、静置培養でも振盪培養でもよいが、増殖効率の観点から振盪培養が好ましい。また、通気攪拌培養してもよい。

【0024】

本実施形態の炭化水素処理剤に含まれる炭化水素分解菌は、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれか２つ以上の組み合わせを含む：
（ａ）ＰＲ４株及びその変異株からなる群より選択される少なくとも１株；
（ｂ）ＭＳＺ１株及びその変異株からなる群より選択される少なくとも１株；
（ｃ）ＭＳＺ６株及びその変異株からなる群より選択される少なくとも１株；並びに
（ｄ）ＭＳＺ９株及びその変異株からなる群より選択される少なくとも１株。

【0025】

炭化水素分解菌は、（ａ）〜（ｄ）のいずれか３つ以上の組み合わせを含むことが好ましく、（ａ）〜（ｄ）の４つ全てを含むことがより好ましい。
（ａ）は、ＲＰ４株及びその変異株のいずれであってもよく、両方を併用してもよい。ＲＰ４株の変異株は、１株であってもよく、２株以上を併用してもよい。同様に、（ｂ）は、ＭＳＺ１株及びその変異株のいずれであってもよく、両方を併用してもよい。ＭＳＺ１株の変異株は、１株であってもよく、２株以上を併用してもよい。同様に、（ｃ）は、ＭＳＺ６株及びその変異株のいずれであってもよく、両方を併用してもよい。ＭＳＺ６株の変異株は、１株であってもよく、２株以上を併用してもよい。同様に、（ｄ）は、ＭＳＺ９株及びその変異株のいずれであってもよく、両方を併用してもよい。ＭＳＺ９株の変異株は、１株であってもよく、２株以上を併用してもよい。

【0026】

（ａ）〜（ｄ）の炭化水素分解菌の混合割合は、特に限定されず、任意の割合とすることができる。例えば、（ａ）〜（ｄ）から選択される２種類以上の炭化水素分解菌の細胞数は相互に同程度であってもよく、それぞれ異なっていてもよい。

【0027】

≪他の炭化水素分解菌≫
本実施形態の炭化水素処理剤は、上記（ａ）〜（ｄ）の炭化水素分解菌に加えて、他の炭化水素分解菌を含んでいてもよい。他の炭化水素分解菌は、特に限定されず、炭化水素分解能を有することが確認されている、公知の炭化水素分解菌を用いることができる。他の炭化水素分解菌としては、例えば、特開２０１７−２０１９６２号公報に記載のロドコッカス属に属する細菌等が挙げられるが、これらに限定されない。
他の炭化水素分解菌は、１株であってもよく、２株以上を併用してもよい。

【0028】

＜他の成分＞
本実施形態の炭化水素処理剤は、炭化水素分解菌に加えて、他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、有機溶媒、及び水性溶媒等が挙げられる。

【0029】

≪有機溶媒≫
本明細書において、「有機溶媒」とは、有機化合物からなる液体を意味する。本実施形態の炭化水素処理剤に用いる有機溶媒は、特別な限定はなく、常温及び常圧下で液体であるものが好ましい。本明細書において、「常温」とは、特に冷やしたり、熱したりしない温度、すなわち平常の温度を意味し、例えば、１５〜３５℃の温度等が挙げられる。本明細書において、「常圧」とは、特別に減圧も加圧もしないときの圧力、すなわち大気圧に等しい圧力を意味し、例えば、１気圧（１ａｔｍ、１０１，３２５Ｐａ）程度等が挙げられる。

【0030】

有機溶媒は、炭化水素系溶媒であることが好ましく、脂肪族炭化水素であることがより好ましい。脂肪族炭化水素は、飽和であってもよく、不飽和であってもよいが、飽和脂肪族炭化水素が好ましい。飽和脂肪族炭化水素は、鎖状アルカンであってもよく、環状アルカン（シクロアルカン）であってもよい。鎖状アルカンは、直鎖状アルカンであってもよく、分岐鎖状アルカンであってもよい。本明細書において、「アルカン」は、鎖状アルカン及び環状アルカンを包含する。アルカンは、炭素数１２以上のアルカンが好ましく、炭素数１３以上のアルカンがより好ましい。中でも、炭素数１２〜１９のアルカンが好ましく、炭素数１３〜１９のアルカンがより好ましく、炭素数１３〜１６のアルカンがさらに好ましい。上記（ａ）〜（ｄ）の菌株は、炭素数が前記範囲内であるアルカンに対して、良好な局在性（転移型又は吸着型）を示す。

【0031】

直鎖状のアルカンとしては、例えば、ｎ−デカン（Ｃ１２）、ｎ−トリデカン（Ｃ１３）、ｎ−テトラデカン（Ｃ１４）、ｎ−ペンタデカン（Ｃ１５）、ｎ−ヘキサデカン（Ｃ１６）、ｎ−オクタデカン（ｎ１８）等が挙げられる。

【0032】

分岐鎖状のアルカンとしては、例えば、２，２，７−トリメチルデカン（Ｃ１３）、２，６，８−トリメチルデカン（Ｃ１３）、２，４，６−トリメチルデカン（Ｃ１３）、３，５−ジメチルウンデカン（Ｃ１３）、４，７−ジメチルウンデカン（Ｃ１３）、２，５，５−トリメチルデカン（Ｃ１３）、５，７−ジメチルウンデカン（Ｃ１３）、２，８−ジメチルウンデカン（Ｃ１３）、４，８−ジメチルウンデカン（Ｃ１３）、２，３−ジメチルウンデカン（Ｃ１３）、２，２，９−トリメチルデカン（Ｃ１３）、５−メチル−５−プロピルノナン（Ｃ１３）、２，５，６−トリメチルデカン（Ｃ１３）、［Ｒ，（−）］ −３−メチルドデカン（Ｃ１３）、３，３，５−トリメチルデカン（Ｃ１３）、３，３−ジエチル−４，５，５−トリメチルオクタン（Ｃ１３）、４，４−ジプロピルヘプタン（Ｃ１３）、２，２，３，３−テトラメチルノナン（Ｃ１３）、２，４−ジメチル−３，３−ジイソプロピルペンタン（Ｃ１３）、２−メチルトリデカン（Ｃ１４）、７−メチルトリデカン（Ｃ１４）、３，８−ジエチルデカン（Ｃ１４）、（６Ｒ，７Ｓ）−６，７−ジメチルドデカン（Ｃ１４）、３，３，４，４−テトラエチルヘキサン（Ｃ１４）、２，２，３，３，４，４，５，５−オクタメチルヘキサン（Ｃ１４）、５−ブチルデカン（Ｃ１４）、２，５−ジメチル−３，４−ジイソプロピルヘキサン（Ｃ１４）、２，２，３，３，５，６，６−ヘプタメチルヘプタン（Ｃ１４）、３−ｔｅｒｔ−ブチル−２，２，５，５−テトラメチルヘキサン（Ｃ１４）、４−メチルテトラデカン（Ｃ１５）、２，７，１０−トリメチルドデカン（Ｃ１５）、７−メチルテトラデカン（Ｃ１５）、６−プロピルドデカン（Ｃ１５）、ファルネサン（Ｃ１５）、［Ｒ，（−）］−３−メチルテトラデカン（Ｃ１５）、２，６−ジメチル−３，５−ジイソプロピルヘプタン（Ｃ１５）、５−ブチルウンデカン（Ｃ１５）、５−ペンチルデカン（Ｃ１５）、（Ｒ）−５−エチル−５−プロピルウンデカン（Ｃ１６）、２，２，４，４，５，５，７，７−オクタメチルオクタン（Ｃ１６）、３，５，９−トリメチルトリデカン（Ｃ１６）、７−プロピルトリデカン（Ｃ１６）、５，８−ジエチルドデカン（Ｃ１６）、４−メチルペンタデカン（Ｃ１６）、３，３，６，６−テトラエチルオクタン（Ｃ１６）、２，４，６−トリメチルトリデカン（Ｃ１６）、３−メチルペンタデカン（Ｃ１６）、６−ペンチルウンデカン（Ｃ１６）、４，６−ジエチルドデカン（Ｃ１６）、２，２，４，４，６，６，７−ヘプタメチルノナン（Ｃ１６）、２，２，４，４，６，８，８−ヘプタメチルノナン（Ｃ１６）、２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｃ１９；プリスタン）等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0033】

環状アルカン（シクロアルカン）としては、例えば、シクロトリデカン（Ｃ１３）、シクロテトラデカン（Ｃ１４）、１，１，３，５−テトラメチルシクロヘキサン（Ｃ１４）、３−シクロヘキシル−４−メチルヘプタン（Ｃ１４）、シクロペンタデカン（Ｃ１５）、シクロヘキサデカン（Ｃ１６）等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0034】

有機溶媒としてのアルカンは、１個以上の水素原子が、ハロゲン原子又は水酸基で置換されていてもよい。前記ハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。

【0035】

これらの中でも、有機溶媒としては、ｎ−トリデカン（ｎ１３）、ｎ−テトラデカン（Ｃ１４）、ｎ−ペンタデカン（Ｃ１５）、又はｎ−ヘキサデカン（ｎ１６）がより好ましく、ｎ−ペンタデカン（Ｃ１６）がさらに好ましい。

【0036】

有機溶媒は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。有機溶媒は、有機溶媒の全量を基準として、炭素数１３〜１６のアルカンを２０％（ｖ／ｖ）以上含むことが好ましく、４０％（ｖ／ｖ）以上含むことがより好ましく、６０％（ｖ／ｖ）以上含むことがさらに好ましい。

【0037】

本実施形態の炭化水素処理剤に含まれる有機溶媒は、前記（ａ）〜（ｄ）の炭素水素分解菌により分解されるため、本実施形態の炭化水素処理剤を環境中で用いた場合でも、有機溶媒が環境中に残留することはない。

【0038】

≪水性溶媒≫
本明細書において、「水性溶媒」とは、水又は水溶液を意味する。水性溶媒の例としては、細菌培養用の液体培地が挙げられる。前記培地として、好気性従属栄養細菌を培養するために一般的に用いられる培地を用いることができる。あるいは、好気性従属栄養細菌の一般的な培地から、炭素源を除去したものを用いてもよい。培地としては、例えば、ＩＢ２液体培地、ＩＢ液体培地、ＹＧ液体培地、ＬＢ培地、マリンブロス、ニュートリエントブロス、トリプトソイブロス、ＭＭ培地、ＮＰ培地（特開２０１７−２０１９６２号公報参照）等が挙げられる。中でも、培地としては、ＩＢ２液体培地、ＩＢ液体培地、ＭＭ培地、又はＮＰ培地が好ましく、ＩＢ２液体培地又はＭＭ培地がより好ましい。

【0039】

＜エマルション組成物＞
本実施形態の炭化水素処理剤は、エマルション組成物であることが好ましい。「エマルション組成物」とは、水中油型エマルション組成物又は油中水型エマルション組成物のいずれかを意味する。「水中油型エマルション組成物」とは、水相中に油滴が分散しているエマルションを含む組成物を意味する。「油中水型エマルション組成物」とは、油相中に水滴が分散しているエマルションを含む組成物を意味する。本実施形態の炭化水素処理剤は、水性溶媒中に、有機溶媒の油滴粒子が分散している水中油型エマルション組成物であることが好ましい。上記（ａ）〜（ｄ）の炭化水素分解菌は、有機溶媒に対して吸着型又は転移型の局在性を示すため、エマルション組成物においては、主に、油相中、及び油相と水相との界面に存在している。上記（ａ）〜（ｄ）の炭化水素分解菌は、水中油型エマルションにおいては、主に、有機溶媒の油滴粒子の表面又は内部に存在している。

【0040】

本実施形態の炭化水素処理剤が水中油型エマルション組成物である場合、油滴粒子の平均粒径は、１〜１００μｍが好ましく、１〜５０μｍがより好ましく、５〜３０μｍがさらに好ましい。油滴粒子の平均粒径が前記範囲内であることにより、油滴粒子の内部に適度な数の炭化水素分解菌を内包させることができるとともに、油滴を安定して分散させることができる。
油滴粒子内に存在する炭化水素分解菌の数は、平均で１個以上であることが好ましい。油滴粒子内の炭化水素分解菌は、通常、１〜１０個であり、２〜８個、３〜６個、又は４〜５個等である。

【0041】

本実施形態の炭化水素処理剤が、水中油型エマルション組成物である場合、水性溶媒と有機溶媒との比（体積比）は、水性溶媒：有機溶媒＝１：１〜１：２０が好ましく、１：５〜１：１５がより好ましく、１：８〜１：１２がさらに好ましい。
本実施形態の炭化水素処理剤が、水中油型エマルション組成物である場合、炭化水素分解菌の濃度は、特に限定されないが、例えば、炭化水素分解菌の全てを合わせた濃度として、１０^４〜１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍＬが好ましく、１０^５〜１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬがより好ましい。

【0042】

本実施形態の炭化水素処理剤は、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれか２つ以上の炭化水素分解菌に、適宜他の炭化水素分解菌及び他の成分を添加して、混合することにより、製造することができる。本実施形態の炭化水素処理剤が水中油型エマルション組成物である場合の製造方法は、後述の「［炭化水素処理剤の製造方法］」に詳述する。

【0043】

本実施形態の炭化水素処理剤は、炭化水素に対して転移型又は吸着型の局在性を示す炭化水素分解菌を２種類以上含んでいるため、迅速に炭化水素を分解することができる。また、界面活性剤等を含まないため、環境中で用いられた場合であっても、炭化水素処理剤自体による環境負荷を低減することができる。そのため、石油汚染の浄化や炭化水素含有水の処理等に好適に利用することができる。

【0044】

また、本実施形態の炭化水素処理剤を水中油型エマルション組成物とした場合、予め、炭化水素分解菌を有機溶媒の微粒子の内部又は表面に局在化させることができるため、処理対象の炭化水素と接触させた場合に、炭化水素分解菌と炭化水素との接触面積が大きくなる。そのため、炭化水素の分解効率をより向上させることができる。

【0045】

［炭化水素処理剤の製造方法］
１実施形態において、本発明は、２種類以上の炭化水素分解菌と、前記炭化水素分解菌が生育可能な培地と、有機溶媒と、を含む組成物を、超音波処理することにより、エマルションを形成させることを特徴とする、炭化水素処理剤の製造方法を提供する。
前記炭化水素分解菌は、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれか２つ以上を含む：
（ａ）ＰＲ４株及びその変異株からなる群より選択される少なくとも１種；
（ｂ）ＭＳＺ１株及びその変異株からなる群より選択される少なくとも１種；
（ｃ）ＭＳＺ６株及びその変異株からなる群より選択される少なくとも１種；並びに
（ｄ）ＭＳＺ９株及びその変異株からなる群より選択される少なくとも１種。

【0046】

本実施形態の製造方法では、まず、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれか２つ以上の炭化水素分解菌と、有機溶媒と、水性溶媒と、を含む組成物を準備する。（ａ）〜（ｄ）の炭化水素分解菌は、上述の「［炭化水素処理剤］」で説明したものと同様である。炭化水素分解菌は、前記（ａ）〜（ｄ）の全てを含んでいてもよく、（ａ）〜（ｄ）以外の炭化水素分解菌を含んでいてもよい。好ましくは、炭化水素分解菌は、前記（ａ）〜（ｄ）の全てを含む。
有機溶媒、及び水性溶媒は、上述の「［炭化水素処理剤］」で挙げたものと同様のものが挙げられる。

【0047】

本実施形態の製造方法において形成させるエマルションは、水中油型エマルションであることが好ましい。水中油型エマルションを形成させる場合、前記組成物における水性溶媒と有機溶媒との比（体積比）は、水性溶媒：有機溶媒＝１：１〜１：２０が好ましく、１：５〜１：１５がより好ましく、１：８〜１：１２がさらに好ましい。水性溶媒と有機溶媒との比が前記好ましい範囲内であると、水中油型エマルションが形成しやすくなる。
前記組成物における炭化水素分解菌の濃度は、特に限定されないが、例えば、炭化水素分解菌の全てを合わせた濃度として、１０^４〜１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍＬが好ましく、１０^５〜１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬがより好ましい。

【0048】

次に、前記組成物を超音波処理することにより、エマルション、好ましくは水中油型エマルションを形成させる。超音波処理は、炭化水素分解菌の生存を阻害しない条件で行う。「炭化水素分解菌の生存を阻害しない条件」とは、超音波処理により、炭化水素分解菌の生細胞率又はコロニー形成率に顕著な影響を与えない条件を意味する。例えば、超音波処理後の生菌率が、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８０％以上であるような条件である。あるいは、超音波処理前のコロニー形成率に対する超音波処理後のコロニー形成率が、１０％以上であることが好ましく、２０％以上であることがより好ましく、２５％以上であることがさらに好ましい。
例えば、超音波処理における周波数としては、３０〜５０ｋＨｚが好ましく、３５〜４５ｋＨｚがより好ましく、３８〜４２ｋＨｚがさらに好ましく、４０ｋＨｚが特に好ましい。超音波処理の時間としては、エマルション、好ましくは水中油型エマルションが形成されるのに十分な時間であればよく、例えば、５〜３０分が好ましく、１０〜２０分がより好ましく、１２〜２７分がさらに好ましく、１５分が特に好ましい。

【0049】

超音波処理は、前記組成物に対して直接的に行ってもよく、前記組成物を含む容器を介して間接的に行ってもよい。炭化水素分解菌に細胞に与えるダメージが少なくなることから、超音波処理は、前記組成物を含む容器を介して間接的に行うことが好ましい。

【0050】

超音波処理に用いる超音波発生装置としては、特別な限定なく、市販のものを使用することができる。超音波発生装置としては、例えば、振動子が平板（振動板）に装着されている定在波型（洗浄器型）超音波発生装置、振動子の先端に円筒状のホーンが装着されているホーン型（ホモジナイザー型）超音波発生装置等が挙げられる。炭化水素分解菌に細胞に与えるダメージが少なくなることから、定在波型（洗浄器型）超音波発生装置を用いることが好ましい。定在波型（洗浄器型）超音波発生装置としては、例えば、超音波洗浄機（アズワンＵＳＤ−４Ｒ）等が挙げられる。

【0051】

超音波処理の具体例としては、例えば、炭化水素分解菌１０^７〜１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍＬと、有機溶媒１ｍＬと、水性溶媒１０ｍＬと、を含む組成物を試験管等の容器に入れ、超音波洗浄機（例、アズワンＵＳＤ−４Ｒ）の水槽中の水（例えば、４Ｌ）に前記容器を浸漬し、常温及び常圧下において、４０ｋＨｚで１５分間処理を行うこと等が挙げられる。このとき、容器中の組成物の液面が、超音波洗浄機の水面よりも１．５ｃｍ〜２．０ｃｍ程度下であることが好ましい。

【0052】

超音波処理により作製されたエマルション、好ましくは水中油型エマルションにおける炭化水素分解菌の局在性は、例えば、位相差顕微鏡等を用いて確認することができる。また、有機溶媒の油滴の平均粒径は、例えば、位相差顕微鏡等を用いて目視で計測する方法、又はレーザー回折式粒度分布測定装置等を用いて計測する方法等で確認することができる。

【0053】

本実施形態の製造方法によれば、簡易な方法で、エマルション、好ましくは水中油型エマルションである炭化水素処理剤を製造することができ、炭化水素分解菌を有機溶媒の微粒子の内部又は表面に局在化させることができる。また、界面活性剤や乳化剤等を用いることなく、エマルションを形成できる。そのため、炭化水素の分解効率が高く、且つ環境負荷の低い炭化水素処理剤を得ることができる。

【0054】

［炭化水素の処理方法］
１実施形態において、本発明は、上記実施形態の炭化水素処理剤を用いることを特徴とする、炭化水素の処理方法を提供する。

【0055】

本明細書において、「炭化水素の処理」とは、対象中の炭化水素を除去すること、又は炭化水素濃度を低減させることを意味する。本実施形態の処理方法では、上記実施形態の炭化水素処理剤を、炭化水素含有水、又は炭化水素含有土壌等の処理対象に投入すればよい。それにより、処理剤中の炭化水素分解菌により、処理対象中の炭化水素が分解され、処理耐対象中の炭化水素を除去することができる。

【0056】

＜処理対象となる炭化水素＞
処理対象となる炭化水素は、特別な限定はなく、前記炭化水素処理剤が含有する炭化水素分解菌が分解可能なものであればよい。前記処理対象となる炭化水素としては、例えば、脂肪族炭化水素が挙げられ、直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルカンが好ましく例示される。より好ましくは、炭素数６以上の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルカン等が挙げられる。前記アルカンの炭素数の上限は、炭化水素分解菌が分解可能である限り特に制限されないが、例えば、炭素数５０以下、炭素数４０以下、炭素数３５以下、炭素数３３以下等が挙げられる。

【0057】

炭素数６以上の直鎖状のアルカンとしては、例えば、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン、ｎ−ノナン、ｎ−デカン、ｎ−ウンデカン、ｎ−ドデカン、ｎ−トリデカン、ｎ−テトラデカン（Ｃ１４）、ｎ−ペンタデカン（Ｃ１５）、ｎ−ヘキサデカン（Ｃ１６）、ｎ−ヘプタデカン（Ｃ１７）、ｎ−オクタデカン（Ｃ１８）、ｎ−ノナデカン（Ｃ１９）、ｎ−イコサン（Ｃ２０）、ｎ−ペンタコサン（Ｃ２５）、ｎ−トリアコンタン（Ｃ３０）等が挙げられ、これらに限定されない。

【0058】

前記炭素数６以上の分岐鎖状のアルカンとしては、例えば、以下のようなもの等が挙げられ、これらに限定されない。
炭素数６：２−メチルペンタン、２，３−ジメチルブタン、３−メチルペンタン、３−メチルペンタン、ジメチルブタン、２，２‐ジメチルブタン
炭素数７：３−メチルヘキサン、３，３−ジメチルペンタン、２，２，３−トリメチルブタン、２，３−ジメチルペンタン、３−エチルペンタン、２−メチルヘキサン、２，２−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン
炭素数８：（３Ｒ，４Ｓ）−３，４−ジメチルヘキサン、２，２，３，３−テトラメチルブタン、（Ｓ）−３−メチルヘプタン、３，４−ジメチルヘキサン、３−メチルヘプタン、３−エチルヘキサン、３−メチル−３−エチルペンタン、２−メチル−３−エチルペンタン、２，３，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、２−メチルヘプタン、４−メチルヘプタン、２，３，４−トリメチルペンタン、２，２，３−トリメチルペンタン、２，４−ジメチルヘキサン、２，３−ジメチルヘキサン
炭素数９：２，２，４，４−テトラメチルペンタン、３−エチルヘプタン、３，３，４−トリメチルヘキサン、２，２−ジメチルヘプタン、２，４−ジメチルヘプタン、３−エチル−２，３−ジメチルペンタン、２，３，４−トリメチルヘキサン、２，２，３，４−テトラメチルペンタン、４−エチルヘプタン、３，５−ジメチルヘプタン
炭素数１０：２，４−ジメチル−３−イソプロピルペンタン、２，３，５−トリメチルヘプタン、２,２−ジメチルオクタン、２，２，４，５−テトラメチルヘキサン、５−エチル−２−メチルヘプタン、２−メチル−３，３−ジエチルペンタン、２，３，３，５−テトラメチルヘキサン、２，２，５−トリメチルヘプタン、４−メチルノナン、２，４，５−トリメチルヘプタン、２，４，６−トリメチルヘプタン、３，４−ジエチルヘキサン
炭素数１１：４−イソプロピルオクタン、３，６−ジメチルノナン、２，２，６，６−テトラメチルヘプタン、３，４−ジエチルヘプタン、２，６−ジメチルノナン、２，３，７−トリメチルオクタン、２，４，６−トリメチルオクタン、３，３，５，５−テトラメチルヘプタン、４−エチル−４−メチルオクタン、３，５−ジエチルヘプタン、２，３，６−トリメチルオクタン、２，２，６−トリメチルオクタン、２−メチルデカン、２，２，３，３，４，４−ヘキサメチルペンタン、３，３−ジエチルヘプタン、２，５，６−トリメチルオクタン
炭素数１２：３，７−ジメチルデカン、５，６−ジメチルデカン、５−メチルウンデカン、２，２，４，６，６−ペンタメチルヘプタン、４−エチルデカン、２，３，５−トリメチルノナン、２，９−ジメチルデカン、５−プロピルノナン、２−メチルウンデカン、３，４−ジメチルデカン、２，２，７，７−テトラメチルオクタン、２，４，５，７−テトラメチルオクタン、２，２−ジメチルデカン、２，２，４，４，６−ペンタメチルヘプタン、２，２−ジブチルブタン
炭素数１３：２，２，７−トリメチルデカン、２，６，８−トリメチルデカン、２，４，６−トリメチルデカン、３，５−ジメチルウンデカン、４，７−ジメチルウンデカン、２，５，５−トリメチルデカン、５，７−ジメチルウンデカン、２，８−ジメチルウンデカン、４，８−ジメチルウンデカン、２，３−ジメチルウンデカン、２，２，９−トリメチルデカン、５−メチル−５−プロピルノナン、２，５，６−トリメチルデカン、［Ｒ，（−）］ −３−メチルドデカン、３，３，５−トリメチルデカン、３，３−ジエチル−４，５，５−トリメチルオクタン、４，４−ジプロピルヘプタン、２，２，３，３−テトラメチルノナン、２，４−ジメチル−３，３−ジイソプロピルペンタン
炭素数１４：２−メチルトリデカン、７−メチルトリデカン、３，８−ジエチルデカン、（６Ｒ，７Ｓ）−６，７−ジメチルドデカン、３，３，４，４−テトラエチルヘキサン、２，２，３，３，４，４，５，５−オクタメチルヘキサン、５−ブチルデカン、２，５−ジメチル−３，４−ジイソプロピルヘキサン、２，２，３，３，５，６，６−ヘプタメチルヘプタン、３−ｔｅｒｔ−ブチル−２，２，５，５−テトラメチルヘキサン
炭素数１５：４−メチルテトラデカン、２，７，１０−トリメチルドデカン、７−メチルテトラデカン、６−プロピルドデカン、ファルネサン、［Ｒ，（−）］−３−メチルテトラデカン、２，６−ジメチル−３，５−ジイソプロピルヘプタン、５−ブチルウンデカン、５−ペンチルデカン
炭素数１６：（Ｒ）−５−エチル−５−プロピルウンデカン、２，２，４，４，５，５，７，７−オクタメチルオクタン、３，５，９−トリメチルトリデカン、７−プロピルトリデカン、５，８−ジエチルドデカン、４−メチルペンタデカン、３，３，６，６−テトラエチルオクタン、２，４，６−トリメチルトリデカン、３−メチルペンタデカン、６−ペンチルウンデカン、４，６−ジエチルドデカン、２，２，４，４，６，６，７−ヘプタメチルノナン、２，２，４，４，６，８，８−ヘプタメチルノナン
炭素数１７：４，６，８，１０−テトラメチルトリデカン、５，９−ジメチルペンタデカン、２，５−ジメチルペンタデカン、（Ｓ）−３−メチルヘキサデカン、５,５−ジブチルノナン、４，４−ジプロピルウンデカン、６−ペンチルドデカン、２，６，１０−トリメチルテトラデカン、２，２，４，４−テトラメチル−３，３−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルペンタン、２−メチルヘキサデカン
炭素数１８：２−メチルヘプタデカン、３−メチルヘプタデカン、２，３，４，５，６，７，８，９−オクタメチルデカン、７，９−ジメチルヘキサデカン、４，９−ジプロピルドデカン、２，２，５，５−テトラメチル−３，４−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルヘキサン、４−メチルヘプタデカン、８−メチルヘプタデカン、２，２，４，９，１１，１１−ヘキサメチルドデカン、７−メチルヘプタデカン、４，５，６，７−テトラエチルデカン、７−ブチルテトラデカン
炭素数１９：プリスタン、２，６−ジメチルヘプタデカン、３−メチルオクタデカン、３，３−ジメチルヘプタデカン、（７Ｒ，１１Ｓ）−７，１１−ジメチルヘプタデカン、５，９−ジメチルヘプタデカン、５−メチルオクタデカン、２，６，１０，１３−テトラメチルペンタデカン、７−ヘキシルトリデカン、５，５，７，７−テトラエチルウンデカン、２−メチルオクタデカン
炭素数２０：フィタン、２−メチルノナデカン、３−メチルノナデカン、８−ｔｅｒｔ−ブチルヘキサデカン、４−メチルノナデカン、７，１１−ジメチルオクタデカン、２，６−ジメチルオクタデカン、９−メチルノナデカン、４−プロピルヘプタデカン、３−メチル−３−エチルヘプタデカン、２，６，１１，１５−テトラメチルヘキサデカン、５−ブチルヘキサデカン
炭素数２５：９−オクチルヘプタデカン、１０−ヘキシルノナデカン、２，６，１０，１５，１９−ペンタメチルイコサン、２，６，１０，１４，１９−ペンタメチルイコサン、７，７−ジヘキシルトリデカン、９−（２−エチルヘキシル）ヘプタデカン、ハシアン、２−メチルテトラコサン、２，２，８，８−テトラメチル−５，５―ビス（３，３−ジメチルブチル）ノナン、２，６，１０，１４，１８−ペンタメチルイコサン
炭素数３０：スクワラン、２，１０−ジメチルオクタコサン、７−メチルノナコサン、１１−ノニルヘニコサン、（Ｒ）−３−メチルノナコサン、８，１２−ジメチルオクタコサン、３−メチルノナコサン、９−オクチルドコサン、７，１２−ジヘキシルオクタデカン、リザン、２，６−ジメチルオクタコサン

【0059】

前記炭素数６以上の環状のアルカンとしては、例えば、シクロヘキサン（Ｃ６）、シクロヘプタン（Ｃ７）、シクロオクタン（Ｃ８）、シクロノナン（Ｃ９）、シクロデカン（Ｃ１０）、１，１，３，３−テトラメチルシクロヘキサン（Ｃ１０）、１−メチル−２，４−ジエチルシクロペンタン（Ｃ１０）、１，５−ジメチルシクロオクタン（Ｃ１０）、シクロウンデガン（Ｃ１１）、シクロドデカン（Ｃ１２）、１−エチル−２−ペンチルシクロペンタン（Ｃ１２）、１−メチルシクロウンデカン（Ｃ１２）、ブチルシクロオクタン（Ｃ１２）、シクロトリデカン（Ｃ１３）、シクロテトラデカン（Ｃ１４）、１，１，３，５−テトラメチルシクロヘキサン（Ｃ１４）、１，２，４，５−テトラエチルシクロヘキサン（Ｃ１４）、３−シクロヘキシル−４−メチルヘプタン（Ｃ１４）、１，１，２−トリメチルシクロウンデカン（Ｃ１４）、イソプロピルシクロウンデカン（Ｃ１４）、シクロペンタデカン（Ｃ１５）、シクロヘキサデカン（Ｃ１６）、（１−プロピルヘプチル）シクロヘキサン（Ｃ１６）、１−ブチルシクロドデカン（Ｃ１６）、メチルシクロペンタデカン（Ｃ１６）、シクロヘプタデカン（Ｃ１７）、シクロオクタデカン（Ｃ１８）、（１−ペンチルヘプチル）シクロヘキサン（Ｃ１８）、ドデカメチルシクロヘキサン（Ｃ１８）、シクロノナデカン（Ｃ１９）、セムブラン（Ｃ２０）、シクロイコサン（Ｃ２０）、テトラデシルシクロヘキサン（Ｃ２０）、シクロペンタコサン（Ｃ２５）、（１−ノニルデシル）シクロヘキサン（Ｃ２５）、９−（３−シクロペンチルプロピル）ヘプタデカン（Ｃ２５）、シクロトリアコンタン（Ｃ３０）、イコサメチルシクロデカン（Ｃ３０）、ペンタコシルシクロペンタン（Ｃ３０）等が挙げられ、これらに限定されない。

【0060】

処理対象の炭化水素は、１種単独であってもよく、２種以上の混合物であってもよい。炭化水素の混合物の例としては、例えば、原油、石油、及びこれらの派生物等が挙げられる。本実施形態の処理方法は、炭化水素分解効率が高く、且つ環境負荷の低い炭化水素処理剤を用いるため、海上流出油、河川流出油、湖沼流出油、油汚染土壌、オイルポンド等の環境中の炭化水素汚染の浄化に好適に用いることができる。

【0061】

また、本実施形態の処理方法は、炭化水素を含む廃水の処理のために使用することができ、例えば、生活排水、工業排水用水の処理等に好適に用いることができる。本実施形態の処理方法は、炭化水素分解効率が高く、且つ環境負荷の低いため、廃水を効率よく処理することができ、処理後の排水を特別な処理を行うことなく環境中に放出することができる。

【実施例】

【0062】

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0063】

［材料及び方法］
＜培地＞
（ＩＢ２寒天培地）
ミリＱ水８００ｍＬに、８ｇのグルコース（和光純薬工業社製）、８ｇのｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ ｃｏｍｐａｎｙ社製)、０．１６ｇのＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ（和光純薬工業社製）、０．０８ｇのＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ（和光純薬工業社製）、０．０８ｇのＮａＣｌ（和光純薬工業社製）、０．０１６ｇのＦｅＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ（和光純薬工業社製）、及び０．４ｇの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４（和光純薬工業社製）を加えた。ｐＨ７．２に調整後、さらに１２ｇのアガー（和光純薬工業社製）を加え、１２１℃で１５分間オートクレーブし、冷却した。

【0064】

（ＩＢ２液体培地）
ミリＱ水５００ｍＬに、５ｇのグルコース（和光純薬工業社製）、５ｇのｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ ｃｏｍｐａｎｙ社製)、０．０９ｇのＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ（和光純薬工業社製）、０．０５ｇのＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ（和光純薬工業社製）、０．０５ｇのＮａＣｌ（和光純薬工業社製）、０．０１ｇのＦｅＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ（和光純薬工業社製）、及び０．２５ｇの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４（和光純薬工業社製）を加えた。ｐＨ７．２に調整後、１２１℃で１５分間オートクレーブし、冷却した。

【0065】

（ＭＭ培地）
ミリＱ水５００ｍＬに、０．０９ｇのＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ（和光純薬工業社製）、０．０５ｇのＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ（和光純薬工業社製）、０．０５ｇのＮａＣｌ（和光純薬工業社製）、０．０１ｇのＦｅＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ（和光純薬工業社製）、０．２５ｇの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４（和光純薬工業社製）、及び０．２５ｇのＫ_２ＨＰＯ_４（和光純薬工業社製）を加えた。ｐＨ７．２に調整後、１２１℃で１５分間オートクレーブし、冷却した。

【0066】

＜有機溶媒試薬＞
ｎ−ドデカン（以下、「Ｃ１２」ともいう。）（和光純薬工業）
ｎ−テトラデカン（以下、「Ｃ１４」ともいう。）（和光純薬工業）
ｎ−ペンタデカン（以下、「Ｃ１５」ともいう。）（和光純薬工業）
ｎ−ヘキサデカン（以下、「Ｃ１６」ともいう。）（和光純薬工業）
プリスタン（以下、「Ｃ１９」ともいう。）（ＡＣＲＯＳＳ）

【0067】

＜培養方法＞
（前培養）
ＩＢ２寒天培地上のコロニーをディスポスティックで掻き取り、試験管（φ１８）に入った５ｍＬのＩＢ２液体培地に懸濁した。その後、２８℃、１１０ｒｐｍで２〜６日間振盪培養し、定常期に達したものを前培養液とした。

【0068】

（ＩＢ２培地による本培養：ＩＢ２培養系）
前培養液を１／１０又は１／１００に希釈し、希釈前培養液を作製した。１０ｍＬのＩＢ２液体培地を試験管（φ２４）に入れ、前記の希釈前培養液を１００μＬ添加した。その後、２８℃、１１０ ｒｐｍの条件で振盪培養を行った。

【0069】

（Ｃ１６含有ＩＢ２培地による本培養：ＩＢ２＋Ｃ１６培養系）
前培養液を１／１０又は１／１００に希釈し、希釈前培養液を作製した。１０ｍＬのＩＢ２液体培地及び５００μＬのＣ１６を試験管（φ２４）に入れ、前記の希釈前培養液を１００μＬ添加した。その後、２８℃、１１０ ｒｐｍの条件で振盪培養を行った。

【0070】

（Ｃ１６含有ＭＭ培地による本培養：ＭＭ＋Ｃ１６培養系）
前培養液を１／１０又は１／１００に希釈し、希釈前培養液を作製した。１０ｍＬのＭＭ培地及び５００μＬのＣ１６を試験管（φ２４）に入れ、前記の希釈前培養液を１００μＬ添加した。その後、２８℃、１１０ ｒｐｍの条件で振盪培養を行った。

【0071】

＜ＧＣ／ＭＳ解析＞
ＧＣ／ＭＳ解析には、ＧＣＭＳ−ＴＱ８０３０（島津製作所）を使用した。カラムには、ＲＥＳＴＥＫ Ｒｔｘ−１（３０ｍ×０．２５ｍｍ、内径１μｍ）を用いた。分析条件を下記に示す。

【0072】

ＧＣ分析条件
カラムオーブン温度：５０℃
気化室温度：２５０℃
注入モード：スプリット
線速度：４０．０ｃｍ／ｓｅｃ
スプリット比：１５．０
カラムオーブン温度：３００℃−６℃／ｍｉｎ−３００℃（１０ｍｉｎ）
注入量：１μＬ

【0073】

ＭＳ分析条件
イオン源温度：２００℃
インターフェイス温度：３００℃
スキャンレンジ：ｍ／ｚ １５−３５０
スキャン時間：０．３ｓｅｃ

【0074】

［参考例１］超音波処理がＰＲ４株に及ぼす影響
ＰＲ４株を、定常期に達するまでＩＢ２液体培地で培養した。次いで、超音波洗浄機（ＵＳＤ−４Ｒ；アズワン社製）を用いて、前記培養液の超音波処理（２５℃、１５分間、４０ｋＨｚ）を行った。超音波処理前及び超音波処理後の培養液を希釈した後、１００μＬの希釈培養液をＩＢ２寒天培地上に塗抹して培養した。ＩＢ２寒天培地上に形成されたコロニー数をカウントし、処理前後のコロニー形成能を比較した。その結果を図１に示す。図１に示すように、超音波処理は、ＰＲ４株のコロニー形成能にほとんど影響しないことが確認された。

【0075】

また、上記と同様に超音波処理を行ったＰＲ４株について、ＤＡＰＩ（和光純薬工業）及びＣＦＤＡ（ＤＯＪＩＮＤＯ）での二重染色を行い、（ＣＦＤＡでカウントされた菌数）／（ＤＡＰＩでカウントされた菌数）により生菌率を算出した。その結果、生菌率は９５．４±０．２％であり、超音波処理は、ＰＲ４株の生存にほとんど影響しないことが確認された。

【0076】

［参考例２］ＰＲ４株を含む炭化水素処理剤によるＷ−ｏｉｌの分解
＜炭化水素処理剤の調製＞
（炭化水素処理剤１）
ＰＲ４株を定常期に達するまで前培養し、菌体を洗浄した。その後、ＤＡＰＩ染色により菌数測定を行い、菌体をＭＭ培地に懸濁して１０^８ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの母液を作製した。この母液を炭化水素処理剤１とした。

【0077】

（炭化水素処理剤２）
炭化水素処理剤１と同様に母液を作製した。試験管（φ２４）に、１０ｍＬの母液を加えた後、超音波洗浄機（ＵＳＤ−４Ｒ；アズワン社製）を用いて超音波処理（２５℃、１５分間、４０ｋＨｚ）を行った。これを炭化水素処理剤２とした。

【0078】

（炭化水素処理剤３）
炭化水素処理剤１と同様に母液を作製した。試験管（φ２４）に、１０ｍＬの母液及び１ｍＬのＣ１６を加えた後、超音波処理（２５℃、１５分間、４０ｋＨｚ）を行い、水中油型エマルション組成物を作製した。これを炭化水素処理剤３とした。

【0079】

＜ｗ−ｏｉｌの分解試験＞
ｗ−ｏｉｌには、アラビアンライト原油の加熱処理産物を用いた。１０ｍｇのｗ−ｏｉｌ及び１０ｍＬのＭＭ培地を入れた試験管（φ２４）を準備した。前記試験管に、炭化水素処理剤１〜３のいずれかを１００μＬ添加し、２８℃、１１０ｒｐｍで９６時間振盪培養した。炭化水素処理剤１又は２を用いた場合には、培養開始時に、１０μＬのＣ１６を添加した。
前記試験管に１０μＬのＣ１６のみを添加して、同様に振盪培養を行ったものをネガティブコントロールとした。

【0080】

＜残留成分の分析＞
内部標準として０．０１ｍｇ／ｍＬのナフタレンを含有するクロロホルムを、前記振盪培養後の各試験官に５ｍＬずつ添加して撹拌し、残存成分の抽出を行った。クロロホルム抽出操作を２回行い、抽出液のクロロホルム相から１ｍＬを採取して、ＧＣ／ＭＳ解析用サンプルとした。ＧＣ／ＭＳにより残存成分を解析し、ネガティブコントロールにおける残存量を１００％としたときの相対残存量として、各炭化水素処理剤添加群における残存量を求めた。その結果を図２に示す。図２中、横軸は、アルカン成分の炭素数を示す。

【0081】

図２に示すように、炭化水素処理剤１〜３のいずれを用いた場合も、各アルカン成分の分解が確認された。炭化水素処理剤１〜３の中でも、炭化水素処理剤３を用いた場合の残存率が顕著に低かった。

【0082】

［参考例３］ＩＢ２液体培地／有機溶媒２相系におけるＰＲ４株の局在性
１０ｍＬのＩＢ２液体培地に、Ｃ１２、Ｃ１５、Ｃ１６、又はＣ１９を１ｍＬ加えた。続いて、ＰＲ４株の前培養液を１００μＬ加え、２８℃、１１０ｒｐｍで１日振盪培養した。培養後、培養液の超音波処理（２５℃、１５分間、４０ｋＨｚ）を行った。続いて、超音波処理後の培養液を、位相差顕微鏡（オリンパス社製）を用いて観察した。

【0083】

Ｃ１２を用いた場合では、有機溶媒としてＣ１２相と水相の界面に菌体が観察され、油滴の表面に菌体が吸着する吸着型の局在性を示した。一方、有機溶媒としてＣ１５、Ｃ１６又はＣ１９を用いた場合には、油滴の内部に菌体が観察され、油滴内部に菌体が転移する転移型の局在性を示した。

【0084】

［実施例１］炭化水素処理剤用の炭化水素分解菌の探索
＜候補菌株の選定＞
（ＩＢ２＋Ｃ１６培養系における局在性）
まず、ＩＢ２＋Ｃ１６培養系において、アルカン類との相互作用を確認し、２７株を選択した。この２７株について、ＩＢ２＋Ｃ１６培養系における局在性を検討し、候補菌株の選定を行った。

【0085】

２７株のそれぞれを、ＩＢ２＋Ｃ１６培養系で２〜３日間培養した。培養後、培養液の超音波処理（２５℃、１５分間、４０ｋＨｚ）を行った。次いで、超音波処理前及び超音波処理後の各培養液を、生物顕微鏡（ＢＸ６０；オリンパス社製）により観察した。また、顕微鏡による観察の前に、ＤＡＰＩ染色を行い、位相差及び蛍光ミラーユニット（Ｕ−ＦＵＷ；オリンパス社製）の同一視野を撮影し、比較することで、細胞の局在性を明確化した。

【0086】

２７株の全てにおいて、超音波処理により、物理的乳化が可能であった。
局在性については、２７株の多くにおいて、超音波処理の前と後とで局在性の変化が観察された。具体的には、超音波処理後に、菌体が水相に移行する様子が観察された。
一方、ＭＳＺ１株、ＭＳＺ６株、及びＭＳＺ９株では、超音波処理の前と後とで局在性の変化が観察されなかった。具体的には、ＭＳＺ１株及びＭＳＺ６株は、超音波処理の前後で、いずれも転移型の局在性を示した。ＭＳＺ９株は、超音波処理の前後で、いずれも吸着型の局在性を示した。さらに、これらの菌株は、数μｍ程度の極小な油滴粒子にも転移又は吸着が観察され、１粒子あたりに転移又は吸着する菌密度も比較的高いことが確認された。
以上の結果から、炭化水素処理剤用の候補菌株として、ＭＳＺ１株、ＭＳＺ６株、及びＭＳＺ９株を選定した。

【0087】

（各培養系における生育試験）
ＭＳＺ１株、ＭＳＺ６株、及びＭＳＺ９株を、ＩＢ２培養系、ＩＢ２＋Ｃ１６培養系、及びＭＭ＋Ｃ１６培養系の各培養系でそれぞれ培養し、生育曲線を作製した。その結果を、図３（Ａ）（ＭＳＺ１株）、図４（Ａ）（ＭＳＺ６株）、及び図５（Ａ）（ＭＳＺ９株）にそれぞれ示す。
いずれの菌株においても、ＩＢ２＋Ｃ１６培養系では、ＩＢ２培養系と比較して、増殖が若干抑制されたが、抑制の程度はわずかであった。一方、いずれの菌株も、Ｃ１６を唯一の炭素源とするＭＭ＋Ｃ１６培養系での増殖が確認された。この結果から、ＭＳＺ１株、ＭＳＺ６株、及びＭＳＺ９株は、Ｃ１６の資化能を有することが示唆された。

【0088】

（超音波処理の影響）
ＭＳＺ１株、ＭＳＺ６株、及びＭＳＺ９株を、それぞれ、定常期に達するまでＩＢ２液体培地で培養した。次いで、前記培養液の超音波処理（２５℃、１５分間、４０ｋＨｚ）を行った。超音波処理前及び超音波処理後の培養液を希釈した後、１００μＬの希釈培養液をＩＢ２寒天培地上に塗抹して培養した。ＩＢ２寒天培地上に形成されたコロニー数をカウントし、処理前後のコロニー形成能を比較した。
その結果を図３（Ｂ）（ＭＳＺ１株）、図４（Ｂ）（ＭＳＺ６株）、及び図５（Ｂ）（ＭＳＺ９株）にそれぞれ示す。これらの図に示すように、超音波処理は、これら菌株のコロニー形成能に大きな影響を与えないことが確認された。

【0089】

また、上記と同様に超音波処理を行った各菌株について、ＤＡＰＩ及びＣＦＤＡでの二重染色を行い、（ＣＦＤＡでカウントされた菌数）／（ＤＡＰＩでカウントされた菌数）により生菌率を算出した。その結果、ＭＳＺ１株、ＭＳＺ６株、及びＭＳＺ９株の生菌率は、それぞれ、９９．３±０．０％、９８．５±０．５％、及び９１．５±７％であった。この結果から、超音波処理は、これらの菌株の生存にほとんど影響しないことが確認された。

【0090】

（ＭＭ＋ｗ−ｏｉｌ培養系における局在性）
ＭＳＺ１株、ＭＳＺ６株、及びＭＳＺ９株を、それぞれ、定常期に達するまでＩＢ２液体培地で培養した。菌体を洗浄した後、ＭＭ培地に懸濁し、１０ｍＬのＭＭ培地及び０．１５ｇのｗ−ｏｉｌを添加した試験管（φ２４）に添加した。その後、２８℃、１１０ｒｐｍの条件で振盪培養を行い、１、２、４日目に培養液をサンプリングし、生物顕微鏡（ＢＸ５３；オリンパス社製）により観察した。

【0091】

図６は、各菌株の顕微鏡写真を示す。上記３菌株に加えて、ＰＲ４株の顕微鏡写真も併せて示す。図６に示すように、ＰＲ４株、ＭＳＺ１株、及びＭＳＺ６株では、ｗ−ｏｉｌ内に菌体が観察され、転移型の局在性を示した。これらの菌株では、培養１、２、４日目のいずれの観察でも、転移型の局在性が確認された。
一方、ＭＳＺ９株は、ｗ−ｏｉｌ相と水相との界面に菌体が存在しており、吸着型の局在性を示した。ＭＳＺ９株では、培養２日目以降に吸着型の局在性が確認された。

【0092】

［実施例２］ｗ−ｏｉｌの分解試験
＜炭化水素処理剤の調製＞
（炭化水素処理剤３）
上記参考例２における炭化水素処理剤３と同じものを用いた。

【0093】

（炭化水素処理剤４）
ＰＲ４株、ＭＳＺ１株、ＭＳＺ６株、及びＭＳＺ９株を、それぞれ、定常期に達するまで前培養し、菌体を洗浄した。その後、ＤＡＰＩ染色により菌数測定を行い、各菌体をＭＭ培地に懸濁して、１０^８ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの母液をそれぞれ作製した。試験管（φ２４）に、２．５ｍＬずつの各母液（合計１０ｍＬ）及び１ｍＬのＣ１６を加えた後、超音波処理（２５℃、１５分間、４０ｋＨｚ）を行い、水中油型エマルション組成物を作製した。これを炭化水素処理剤４とした。

【0094】

＜ｗ−ｏｉｌの分解試験＞
１０ｍｇのｗ−ｏｉｌ及び１０ｍＬのＭＭ培地を入れた試験管（φ２４）を準備した。前記試験管に、炭化水素処理剤３又は４を１００μＬ添加し、２８℃、１１０ｒｐｍで７２時間振盪培養した。
前記試験管に１０μＬのＣ１６のみを添加して、同様に振盪培養を行ったものをネガティブコントロールとした。

【0095】

＜残留成分の分析＞
参考例２と同様の方法で、ＧＣ／ＭＳにより残存成分を解析し、ネガティブコントロールにおける残存量を１００％としたときの相対残存量として、各炭化水素処理剤添加群における残存量を求めた。その結果を図７に示す。図７中、横軸は、アルカン成分の炭素数を示す。

【0096】

図７に示すように、炭化水素処理剤３及び４のいずれを用いた場合も、各アルカン成分の分解が確認された。炭化水素処理剤４を用いた場合、炭化水素処理剤３を用いた場合と比較して、各成分の残存量が顕著に低下していた。この結果から、ＰＲ４株と組み合わせて、ＭＳＺ１株、ＭＳＺ６株、及びＭＳＺ９株を用いることにより、ＰＲ４株を単独で用いるよりも炭化水素分解速度が向上することが示された。

【産業上の利用可能性】

【0097】

本発明によれば、炭化水素の迅速な処理を実現可能な、炭化水素処理剤、前記炭化水素処理剤を用いた炭化水素処理方法、及び前記炭化水素処理剤の製造方法が提供される。本発明の実施形態にかかる炭化水素処理剤及び炭化水素の処理方法は、炭化水素汚染された環境の浄化、及び炭化水素含有廃水の処理等に利用可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】