特開 2020-11969 システイン改変フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン結合分子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2020-11969(P2020-11969A)

(43)【公開日】2020年1月23日

(54)【発明の名称】システイン改変フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン結合分子

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/78 20060101AFI20191220BHJP

   C07K 14/71 20060101ALI20191220BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20191220BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20191220BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20191220BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/78ZNA

   C07K14/71

   C07K19/00

   C12P21/02 C

   C12N15/12

【審査請求】有

【請求項の数】12

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】120

(21)【出願番号】特願2019-160835(P2019-160835)

(22)【出願日】2019年9月4日

(62)【分割の表示】特願2016-522781(P2016-522781)の分割

【原出願日】2014年10月13日

(31)【優先権主張番号】61/890,539

(32)【優先日】2013年10月14日

(33)【優先権主張国】US

(71)【出願人】

【識別番号】509087759

【氏名又は名称】ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100093676

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100181168

【弁理士】

【氏名又は名称】丸山 智裕

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】ゴールドバーグ，シャローム

(72)【発明者】

【氏名】ジェイコブス，スティーブン

(72)【発明者】

【氏名】リン，トリシア

(72)【発明者】

【氏名】オニール，キャリン

【テーマコード（参考）】

4B064

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064CA19

4B064CE06

4B064CE07

4B064CE12

4B064DA05

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA20

4H045DA50

4H045EA20

4H045EA28

4H045FA72

4H045FA74

4H045GA10

4H045GA22

4H045GA26

(57)【要約】      （修正有）

【課題】均一な化学的コンジュゲーションを受けることができ、抗体コンジュゲートが直面する問題を回避することができる分子の提供。
【解決手段】１つ又は２つ以上の遊離のシステインアミノ酸を含む、システイン改変単特異性及び二重特異性ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）及び／又はｃ−Ｍｅｔ（チロシンキナーゼ受容体）とＦＮ３ドメイン（フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン）とを含有する分子。該分子は、親分子の核酸配列を変異誘発させること、及びシステイン改変ＦＮ３ドメイン含有単特異性又は二重特異性分子をコードするように、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基を、システインに交換すること；システイン改変ＦＮ３ドメイン含有分子を発現させること；並びにシステイン改変ＦＮ３ドメイン含有分子を回収すること、によって調製される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１８〜２９及び１０７〜１１０のいずれかのアミノ酸配列における６、８、１
０、１１、１４、１５、１６、２０、３０、３４、３８、４０、４１、４５、４７、４８
、５３、５４、５９、６０、６２、６４、７０、８８、８９、９０、９１、及び９３番目
の位置からなる群より選択される位置又は配列番号１２２〜１３７のいずれかのアミノ酸
配列におけるこれらの位置と同等の位置からなる群より選択される位置で少なくとも１つ
のシステイン置換を含む、単離されたシステイン改変フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３
）ドメイン。

【請求項2】

半減期延長部分を更に含む、請求項１に記載のシステイン改変フィブロネクチンＩＩＩ
型（ＦＮ３）ドメイン。

【請求項3】

前記半減期延長部分が、アルブミン結合分子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又
は免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部である、請求項２に記載のシステイン改変
フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン。

【請求項4】

（ｉ）配列番号１８〜２９、１０７〜１１０及び１２２〜１３７のいずれかのアミノ酸
配列をコードする核酸配列において、１つ又は２つ以上のヌクレオチド残基を、請求項１
に記載のシステイン改変ＦＮ３ドメインをコードするようにシステインアミノ酸残基をコ
ードするヌクレオチド残基に交換することによって、前記核酸配列を変異させることと、
（ｉｉ）前記システイン改変ＦＮ３ドメインを発現させることと、
（ｉｉｉ）前記システイン改変ＦＮ３ドメインを回収することと、
を含む、システイン改変ＦＮ３ドメインを調製する方法。

【請求項5】

前記変異させる工程が部位特異的変異誘発を行うことを含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記システイン改変ＦＮ３ドメインを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現させること
を含む、請求項４に記載の方法。

【請求項7】

前記回収する工程の後に、前記システイン改変ＦＮ３ドメインを、チオール反応性化学
試薬と反応させて、化学的にコンジュゲートされたシステイン改変ＦＮ３ドメインを生成
することを更に含む、請求項４に記載の方法。

【請求項8】

前記反応させる工程の後に、前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変ＦＮ３
ドメインのＥＧＦＲ結合を測定することを更に含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記反応させる工程の後に、前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変ＦＮ３
ドメインの付加後のＥＧＦＲ過剰発現腫瘍細胞株の細胞増殖阻害を測定することを更に含
む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記チオール反応性試薬がマレイミド部分を含む、請求項７に記載の方法。

【請求項11】

前記マレイミド部分を含むチオール反応性試薬が、ＮＥＭ、ＭＭＡＥ、及びＭＭＡＦか
らなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変ＦＮ３ドメインが、ＥＧＦＲ過剰発
現Ｈ１５７３細胞において測定されるとき、約１．７×１０^-10Ｍ〜約１．３×１０^-9Ｍ
の細胞増殖ＩＣ₅₀を有する、請求項７に記載の方法。

【請求項13】

配列番号１８９〜２１６及び２２７〜２５４からなる群より選択されるアミノ酸配列を
含む、単離システイン改変フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン。

【請求項14】

第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインと第２のＦＮ３ドメインとを含む
、単離システイン改変二重特異性ＦＮ３分子であって、
前記第１のＦＮ３ドメインが、配列番号１８〜２９及び１０７〜１１０のアミノ酸配列
における６、８、１０、１１、１４、１５、１６、２０、３０、３４、３８、４０、４１
、４５、４７、４８、５３、５４、５９、６０、６２、６４、７０、８８、８９、９０、
９１、及び９３番目の位置からなる群から選択される位置または配列番号１２２〜１３７
におけるこれらの位置と同等の位置からなる群から選択される位置でシステイン置換を含
み、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合して、ＥＧＦＲに対する上皮成長因
子（ＥＧＦ）の結合を遮断し、
前記第２のＦＮ３ドメインが、配列番号１１１〜１１４のアミノ酸配列における６、８
、１０、１１、１４、１５、１６、２０、３０、３４、３８、４０、４１、４５、４７、
４８、５３、５４、５９、６０、６２、６４、７０、８３、８４、８５、８６、及び８８
番目の位置からなる群から選択される位置でシステイン置換を含み、肝細胞増殖因子受容
体（ｃ−Ｍｅｔ）に特異的に結合して、ｃ−Ｍｅｔに対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の
結合を遮断する、単離システイン改変二重特異性ＦＮ３分子。

【請求項15】

配列番号２１９〜２２６及び２５７〜２６４からなる群より選択されるアミノ酸配列を
含む、請求項１４に記載の単離システイン改変二重特異性ＦＮ３分子。

【請求項16】

前記分子がチオール反応性試薬に化学的にコンジュゲートされている、請求項１４に記
載の単離システイン改変二重特異性分子。

【請求項17】

前記チオール反応性試薬がマレイミド部分である、請求項１６に記載の単離システイン
改変二重特異性分子。

【請求項18】

前記マレイミド部分が、ＮＥＭ、ＰＥＧ２４−マレイミド、フルオレセインマレイミド
、ＭＭＡＥ、及びＭＭＡＦからなる群より選択される、請求項１７に記載の単離システイ
ン改変二重特異性分子。

【請求項19】

前記第１のＦＮ３ドメインが、５０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦを用いてＮＣＩ−Ｈ２９２細
胞において測定されるとき、約０．９×１０^-9Ｍ〜約２．３×１０^-9ＭのＩＣ₅₀値でＥＧ
ＦＲの１１７３番目のチロシン残基でＥＧＦによって誘発されるＥＧＦＲのリン酸化を阻
害し、前記第２のＦＮ３ドメインが、１００ｎｇ／ｍＬヒトＨＧＦを用いてＮＣＩ−Ｈ２
９２細胞において測定されるとき、約４×１０^-10Ｍ〜約１．３×１０^-9ＭのＩＣ₅₀値で
ｃ−Ｍｅｔの１３４９番目のチロシン残基でＨＧＦによって誘発されるｃ−Ｍｅｔのリン
酸化を阻害する、請求項１８に記載のシステイン改変二重特異性分子。

【請求項20】

前記システイン改変二重特異性分子が、
（ｉ）ＥＧＦＲ過剰発現Ｈ１５７３細胞において測定されるとき、約５．０×１０^-11
Ｍ〜約５．８×１０^-10Ｍと、
（ｉｉ）ＥＧＦＲ過剰発現Ａ７３１細胞において測定されるとき、約７．８×１０^-12
Ｍ〜約１．１×１０^-9Ｍと、
からなる群より選択される細胞増殖ＩＣ₅₀値を有する、請求項１９に記載のシステイン
改変二重特異性分子。

【請求項21】

半減期延長部分を更に含む、請求項２０に記載のシステイン改変二重特異性分子。

【請求項22】

前記半減期延長部分が、アルブミン結合分子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又
は免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部である、請求項２１に記載のシステイン改
変二重特異性分子。

【請求項23】

（ｉ）配列番号１８〜２９、１０７〜１１及び１２２〜１３７のいずれかのアミノ酸配
列と配列番号１１１〜１１４のいずれかのアミノ酸配列とを含むアミノ酸配列をコードす
る核酸配列において、１つ又は２つ以上のヌクレオチド残基を、請求項１４に記載のシス
テイン改変二重特異性分子をコードするようにシステイン残基をコードするヌクレオチド
残基に交換することによって、前記核酸配列を変異させることと、
（ｉｉ）前記システイン改変二重特異性分子を発現させることと、
（ｉｉｉ）前記システイン改変二重特異性分子を回収することと、
を含む、単離システイン改変二重特異性分子を調製する方法。

【請求項24】

前記変異させる工程が、部位特異的変異誘発を行うことを含む、請求項２３に記載の方
法。

【請求項25】

前記システイン改変二重特異性分子を大腸菌において発現させることを含む、請求項２
３に記載の方法。

【請求項26】

前記回収する工程の後に、前記システイン改変二重特異性分子を、チオール反応性化学
試薬と反応させて、化学的にコンジュゲートされたシステイン改変二重特異性分子を生成
することを更に含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項27】

（ｉ）前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変二重特異性分子のＥＧＦＲ結
合を測定することと、
（ｉｉ）前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変二重特異性分子による、細
胞株におけるＥＧＦ刺激ＥＧＦＲリン酸化の阻害を測定することと、
（ｉｉｉ）前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変二重特異性分子による、
細胞株におけるＨＧＦ刺激ｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害を測定することと、
（ｉｖ）前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変二重特異性分子の添加後の
ＥＧＦＲ過剰発現腫瘍細胞株の増殖阻害を測定することと、
からなる群より選択される工程を更に含む、請求項２６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、システイン残基によって改変されている結合分子並びにそれらを作製及び使
用する方法に関する。より詳しくは、本発明は、システインによって改変されているＥＧ
ＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔに結合し得るフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン分
子に向けられる。

【背景技術】

【0002】

上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ又はＥｒｂＢ１又はＨＥＲ１）は、ｃ−ｅｒｂＢ１がん
原遺伝子によってコードされる１７０ｋＤａの膜貫通型糖タンパク質である。ＥＧＦＲは
、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）を含
む受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）ファミリー
メンバーである。これらのＲＴＫは、リガンド結合細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、１回膜貫
通ドメイン、及び触媒キナーゼドメインとＣ−末端テールとを含む細胞内ドメインからな
る相同な構造を共有する。ＥＧＦＲシグナリングは、リガンドの結合後に、受容体の立体
構造の変化、二量体化、及びトランス自己リン酸化が誘導され（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ ｅｔ
ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ，３７：３５３〜７３，２００８）、それ
によってシグナル伝達カスケードを開始することによって始まり、最終的に細胞増殖及び
生存を含む広く多様な細胞機能に影響を及ぼす。ＥＧＦＲの発現又はキナーゼ活性の増加
は、広範囲のヒトがんに関係しており、そのためＥＧＦＲは治療介入にとっての魅力的な
標的となる（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９：６５５０
〜６５６５，２０００；Ｇｒｕｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ
Ｉｎｓｔ ９５：８５１〜６７，２００３；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓ
ｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３３：３６９〜８５，２００６）。更に、ＥＧＦＲ遺伝子コピー
数とタンパク質発現の両方の増加は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤であるＩＲＥＳＳ
Ａ（商標）（ゲフィチニブ）に対する小細胞肺がんの好ましい応答に関連している（Ｈｉ
ｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ １８：７５２〜６０，２００７）。

【0003】

ＥＧＦＲ治療は、低分子と抗ＥＧＦＲ抗体の両方を含み、結腸直腸がん、膵臓がん、頭
頚部がん、及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の処置のために承認されている（Ｂａｓｅ
ｌｇａ ａｎｄ Ａｒｔｅａｇａ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２３：２４４５〜２４５
９（２０００５；Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２５９：７７５５
〜７７６０，１９８４；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ，１：１３１ １〜１３１８；１９９５；Ｐｒｅｗｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉ
ｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，４：２９５７〜２９６６，１９９８）。

【0004】

抗ＥＧＦＲ治療の効能は、腫瘍のタイプ及び腫瘍におけるＥＧＦＲの変異／増幅状態に
依存し得るが、皮膚毒性が起こることがある（Ｄｅ Ｒｏｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎ
ｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ １１：７５３〜７６２，２０１０；Ｌｉｎａｒｄｏｕ ｅｔ ａｌ
．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，６：３５２〜３６６，２００９；Ｌｉ ａ
ｎｄ Ｐｅｒｅｚ−Ｓｏｌｅｒ，Ｔａｒｇ Ｏｎｃｏｌ ４：１０７〜１１９，２００９
）。ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の二
次選択治療として一般的に用いられているが、耐性経路により投与は１２か月以内に中止
されることが多い（Ｒｉｅｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １２
：８３９〜４４，２００６）。

【0005】

ｃ−Ｍｅｔは、チロシンキナーゼ受容体をコードする。ｃ−Ｍｅｔは、発がん物質によ
る処置によって、構成的に活性な融合タンパク質であるＴＰＲ−ＭＥＴを生じることが見
いだされたことから、１９８４年にがん原遺伝子として初めて同定された（Ｃｏｏｐｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１１：２９〜３３，１９８４）。ｃ−Ｍｅｔをそのリ
ガンドであるＨＧＦを通して活性化すると、増殖、運動性、浸潤、転移、上皮−間葉転換
、血管新生／創傷治癒、及び組織再生を含む多くの細胞プロセスを刺激する（Ｃｈｒｉｓ
ｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ ２２５：１〜２６，２００５；
Ｐｅｔｅｒｓ ａｎｄ Ａｄｊｅｉ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ９：３１
４〜２６，２０１２）。ｃ−Ｍｅｔは、一本鎖タンパク質として合成され、これはタンパ
ク質分解によって、ジスルフィド結合で結合する５０ｋＤａのαサブユニットと１４０ｋ
Ｄａのβサブユニットに切断される（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅ
ｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２２：３０９〜３２５，２００３）。ｃ−Ｍｅｔは
、Ｒｏｎ及びＳｅａなどの他の膜受容体と構造的に類似であり、細胞外リガンド結合ドメ
イン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメイン（チロシンキナーゼドメインとＣ−末端テー
ル領域とを含む）で構成される。ＨＧＦ：ｃ−Ｍｅｔ結合の正確な化学量論は不明である
が、一般的に、２つのＨＧＦ分子が２つのｃ−Ｍｅｔ分子に結合して、受容体の二量体化
、並びに１２３０、１２３４、及び１２３５番目のチロシンで自己リン酸化が起こると考
えられている（Ｓｔａｍｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ２３
：２３２５〜２３３５，２００４）。リガンド非依存型のｃ−Ｍｅｔ自己リン酸化もまた
、遺伝子の増幅、変異、又は受容体の過剰発現により起こり得る。

【0006】

ｃ−Ｍｅｔは、胃がん、肺がん、結腸がん、乳がん、膀胱がん、頭頚部がん、卵巣がん
、前立腺がん、甲状腺がん、膵臓がん、及びＣＮＳのがんを含む多くのタイプのがんにお
いて、しばしば増幅、変異、又は過剰発現されている。キナーゼドメインに典型的に局在
するミスセンス変異は、遺伝性の乳頭状腎細胞がん（ＰＲＣＣ）では共通して見いだされ
、散発性のＰＲＣＣでは１３％に見いだされている（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ １８：２３４３〜２３５０，１９９９）。これに対し、ｃ−Ｍｅｔのセ
マフォリン又は膜近傍ドメインに局在するｃ−Ｍｅｔ変異は、胃がん、頭頚部がん、肝臓
がん、卵巣がん、ＮＳＣＬＣ、及び甲状腺がんにおいてしばしば見出されている（（Ｍａ
ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２２
：３０９〜３２５，２００３；Ｓａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ
ｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，１９９９．２４：２９９〜３０５）。ｃ−Ｍｅｔの増幅は、
脳がん、結腸直腸がん、胃がん、及び肺がんにおいて検出されており、しばしば疾患の進
行度と相関する（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ
Ｒｅｖｉｅｗｓ，２２：３０９〜３２５，２００３）。非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）及
び胃がんのそれぞれ、４％及び２０％までが、ｃ−Ｍｅｔの増幅を示す（Ｓａｋａｋｕｒ
ａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，１９９９．２４：
２９９〜３０５：Ｓｉｅｒｒａ ａｎｄ Ｔｓａｏ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｄｖａ
ｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３：Ｓ２１〜３５，２０１１）。
遺伝子の増幅がない場合であっても、ｃ−Ｍｅｔ過剰発現は、肺がんにおいてしばしば観
察される（Ｉｃｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，８７
：１０６３〜９，１９９６）。その上、臨床試料において、ほぼ半数の肺腺がんが高レベ
ルのｃ−Ｍｅｔ及びＨＧＦを示し、そのいずれも腫瘍の増殖速度の増強、転移、及び予後
不良と相関した（Ｓｉｅｒｒａ ａｎｄ Ｔｓａｏ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｄｖａ
ｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３：Ｓ２１〜３５，２０１１；Ｓ
ｉｅｇｆｒｉｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｔｈｏｒａｃ Ｓｕｒｇ ６６：１９１５〜
８，１９９８）。

【0007】

ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対して耐性となった全ての腫瘍のほぼ６０％が、ｃ
−Ｍｅｔ発現を増加させ、ｃ−Ｍｅｔを増幅し、又はその唯一の公知のリガンドであるＨ
ＧＦを増加させ（Ｔｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，１７：７７〜８
８，２０１０）、このことは、ｃ−Ｍｅｔを通してのＥＧＦＲの代償的経路が存在するこ
とを示唆している。ｃ−Ｍｅｔの増幅は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤であるゲフィチニブに
対して耐性となり、Ｈｅｒ３経路を通して生存の増強を示す培養細胞において初めて同定
された（Ｅｎｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１６：１０３９〜４３，
２００７）。これを、臨床試料において更にバリデートしたところ、ｃ−Ｍｅｔの増幅を
示したのは、エルロチニブ又はゲフィチニブのいずれかに対する耐性を獲得した患者４３
人中９人に対し、無処置患者では６２人中２人のみであった。興味深いことに、処置患者
９人中４人はまた、ＥＧＦＲ活性化変異Ｔ７９０Ｍを獲得し、このことは、同時の耐性経
路を証明している（Ｂｅａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
Ｕ Ｓ Ａ，１０４：２０９３２〜７，２００７）。

【0008】

がんにおけるＥＧＦＲとｃ−Ｍｅｔとの両方の個々の役割は、今では十分に確立されて
おり、これらの標的は、併用治療にとって魅力的となる。いずれの受容体も、同じ生存及
び抗アポトーシス経路（ＥＲＫ及びＡＫＴ）を通してシグナルを伝達し；このため、この
経路対を共に阻害すると、代償経路が活性化される可能性を制限して、それによって全有
効性を改善させ得る。ＥＧＦＲとｃ−Ｍｅｔを標的とする併用治療は、ＮＳＣＬに対して
Ｔａｒｃｅｖａ（エルロチニブ）と抗ｃ−Ｍｅｔ一価抗体とを併用する臨床試験（Ｓｐｉ
ｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１１ ＡＳＣＯ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｐｒｏｃ
ｅｅｄｉｎｇｓ ２０１１，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇ
ｙ：Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ．ｐ．７５０５）、及びＴａｒｃｅｖａ（エルロチニブ）とｃ
−Ｍｅｔの低分子阻害剤であるＡＲＱ−１９７とを併用する臨床試験（Ａｄｊｅｉ ｅｔ
ａｌ．，Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ，１６：７８８〜９９，２０１１）において試験されて
いる。併用治療又は二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、例えば、国際公開公報第
２００８／１２７７１０号、米国特許出願公開第２００９／００４２９０６号、国際公開
公報第２００９／１１１６９１号、国際公開公報第２００９／１２６８３４号、国際公開
公報第２０１０／０３９２４８号、国際公開公報第２０１０／１１５５５１号に開示され
ている。

【0009】

治療のためにＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔシグナリング経路に拮抗する現在の低分子
及び高分子（すなわち、抗体）アプローチは、低分子ではおそらく特異性が欠如し、その
ためオフターゲット活性の可能性及び低分子阻害剤で見られる用量制限毒性により、準最
適であり得る。典型的な二価の抗体では、膜結合受容体のクラスタリング及び下流のシグ
ナリング経路の望ましくない活性化が起こり得うるが、一価の抗体（半分のアーム）は、
製造プロセスに顕著な複雑さ及び費用をもたらす。

【0010】

したがって、更に細胞障害剤をコンジュゲートすることができ、このようにこれらの強
力な化合物をＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ発現腫瘍細胞に標的化して、これらのＥＧＦＲ／ｃ−
Ｍｅｔ阻害剤の抗腫瘍活性を増強する、更なる単特異性及び二重特異性ＥＧＦＲ及び／又
はｃ−Ｍｅｔ阻害剤が必要である。抗体薬物コンジュゲートは、当技術分野に存在するも
のの、薬物部分を結合させる従来の手段では、一般的に、薬物部分が抗体上の多数の部位
に結合した不均一な分子混合物を生じる。例えば、細胞障害剤は、典型的に、抗体にしば
しば多数存在するリジン残基を通して抗体にコンジュゲートされており、そのため、不均
一な抗体−薬物コンジュゲート混合物を生成する。反応条件に応じて、不均一な混合物は
典型的に、０〜約８個、又はそれより多くの薬物部分が結合した抗体分布を含む。加えて
、薬物部分対抗体の特定の整数比を有するコンジュゲートのそれぞれのサブグループには
、薬物部分が抗体上の様々な部位に結合したおそらく不均一な混合物が存在する。分析及
び調製方法は、コンジュゲーション反応により生じる不均一な混合物中の抗体−薬物コン
ジュゲート種分子を分離及び特徴付けするには不適切である。抗体は、大きく、複雑で、
構造的に多様な生体分子であり、しばしば多くの反応性官能基を有する。抗体とリンカー
試薬及び薬物−リンカー中間体との抗体の反応性は、ｐＨ、濃度、塩濃度、及び共溶媒な
どの要因に依存する。更に、多段階のコンジュゲーションプロセスは、反応条件を制御並
びに反応物質及び中間体を特徴づけする際の難しさにより、再現性がないことがあり得る
。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

抗体に存在するシステインを介した化学的コンジュゲーションもまた、証明されている
。しかし、タンパク質の様々なアミノ酸をシステインアミノ酸に変異させることによるシ
ステインのチオール基の改変は、おそらく問題が多く、特に、不対（遊離のシステイン）
残基又は反応若しくは酸化にとって比較的近づきやすい残基の場合には問題が多い。タン
パク質表面上の不対システイン残基は、対を形成して酸化し、分子間ジスルフィドを形成
することができ、それによってタンパク質の二量体又は多量体を形成することができる。
ジスルフィド二量体形成により、新しいシステインは、薬物、リガンド、又は他の標識と
のコンジュゲーションに関して非反応性となる。更に、タンパク質が、新たに改変された
システインと既存のシステイン残基との間で酸化的に分子内ジスルフィド結合を形成すれ
ば、いずれのシステイン基も、活性部位関与及び相互作用にとって利用できない。加えて
、タンパク質は、三次構造のミスフォールディング又は喪失により、不活性又は非特異的
となり得る（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ（２００２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１１：
１〜９）。

【0012】

このため、均一な化学的コンジュゲーションを受けることができ、抗体コンジュゲート
が直面する問題を回避することができる分子が必要である。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明は、配列番号２７に基づくＦＮ３ドメインの６、８、１０、１１、１４、１５、
１６、２０、３０、３４、３８、４０、４１、４５、４７、４８、５３、５４、５９、６
０、６２、６４、７０、８８、８９、９０、９１、及び９３番目の残基、並びに関連する
ＦＮ３ドメインにおける同等の位置からなる群より選択される位置で少なくとも１つのシ
ステイン置換を含む、単離システイン改変フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン
を提供する。ドメイン又はタンパク質中のある位置でのシステイン置換は、既存のアミノ
酸残基をシステイン残基に交換することを含む。

【0014】

本発明はまた、配列番号２７のアミノ酸配列から少なくとも１つのシステイン置換を有
する配列番号２７のアミノ酸配列を含み、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結
合して、ＥＧＦＲに対する上皮成長因子（ＥＧＦ）の結合を遮断する、単離システイン改
変フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインも提供する。

【0015】

本発明は更に、配列番号１１４のアミノ酸配列から少なくとも１つのシステイン置換を
有する配列番号１１４のアミノ酸配列を含み、肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）に特
異的に結合して、ｃ−Ｍｅｔに対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の結合を遮断する、単離
システイン改変フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを提供する。

【0016】

本発明は、システイン改変ＦＮ３ドメインを生成するためにシステイン置換が行われ得
る新規位置を提供する。前記位置には、配列番号１１〜１１４及び／又は配列番号１２２
〜１３７の６、８、１０、１１、１４、１５、１６、２０、３０、３４、３８、４０、４
１、４５、４７、４８、５３、５４、５９、６０、６２、６４、７０、８８、８９、９０
、９１、又は９３番目の残基の１つ又は２つ以上が挙げられる。

【0017】

本発明の１つの態様は、システイン改変ＦＮ３ドメインをコードするように１つ又は２
つ以上のアミノ酸残基をシステイン残基に交換することにより、親ＦＮ３ドメインの核酸
配列を変異させること；システイン改変ＦＮ３ドメインを発現させること；及びシステイ
ン改変ＦＮ３ドメインを単離すること、によって単離システイン改変ＦＮ３ドメインを調
製するプロセスである。

【0018】

本発明のもう一つの態様は、ＦＮ３ドメインがマレイミド部分を含む化学試薬に共有結
合している、化学的にコンジュゲートされた単離システイン改変ＦＮ３ドメインである。

【0019】

本発明のもう一つの実施形態は、ＥＧＦＲ過剰発現及び／又はｃ−Ｍｅｔ発現腫瘍細胞
株の増殖を阻害することができる、化学的にコンジュゲートされた単離システイン改変Ｆ
Ｎ３ドメインである。

【0020】

本出願はまた、第１及び第２のＦＮ３ドメインが、６、８、１０、１１、１４、１５、
１６、２０、３０、３４、３８、４０、４１、４５、４７、４８、５３、５４、５９、６
０、６２、６４、７０、８８、８９、９０、９１、及び９３番目の残基からなる群から選
択される位置でシステイン置換を含む、第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメ
インと第２のＦＮ３ドメインとを含み、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合
して、ＥＧＦＲに対する上皮成長因子（ＥＧＦ）の結合を遮断し、第２のＦＮ３ドメイン
が肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）に特異的に結合して、ｃ−Ｍｅｔに対する肝細胞
増殖因子（ＨＧＦ）の結合を遮断する、単離システイン改変二重特異性ＦＮ３分子を提供
する。

【0021】

本発明のもう一つの態様は、二重特異性分子がマレイミド部分を含む化学試薬に共有結
合している、化学的にコンジュゲートされた単離システイン改変二重特異性分子である。

【0022】

本発明の更なる態様は、システイン改変二重特異性分子をコードするように、１つ又は
２つ以上のアミノ酸残基をシステイン残基に交換することにより、親ＦＮ３二重特異性分
子の核酸配列を変異させること；システイン改変分子を発現させること；及びシステイン
改変二重特異性分子を単離すること、によって単離システイン改変二重特異性ＦＮ３を調
製するプロセスである。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1A】ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのアミノ酸アライメントである。ＢＣ及びＦＧループを、配列番号１８の２２〜２８番目及び７５〜８６番目の残基を四角で囲んで示す。いくつかの変種は、熱安定性を改善するＬ１７Ａ、Ｎ４６Ｋ、及びＥ８６Ｉ置換を含む（残基の番号はＴｅｎｃｏｎ配列番号１に従う）。

【図1B】ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのアミノ酸アライメントである。ＢＣ及びＦＧループを、配列番号１８の２２〜２８番目及び７５〜８６番目の残基を四角で囲んで示す。いくつかの変種は、熱安定性を改善するＬ１７Ａ、Ｎ４６Ｋ、及びＥ８６Ｉ置換を含む（残基の番号はＴｅｎｃｏｎ配列番号１に従う）。

【図2】細胞毒素／リンカー構造。

【図3】Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２タンパク質（配列番号２７）の結晶構造のリボン表示である。システイン置換に寛容な位置として同定された最終的な位置を、棒で示し、黒色で示す。結合ループＢＣ／ＦＧを薄い灰色で示す。

【図4】無作為化Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ交互表面を有する、Ｔｅｎｃｏｎ２７足場構造（配列番号９９）とＴＣＬ１４ライブラリ（配列番号１００）の配列アライメントである。ループ残基を四角で囲む。ループ及び鎖を配列の上に示す。

【図5A】ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの配列アライメントである。ＣループとＣＤ鎖及びＦループとＦＧ鎖を四角で囲み、これらは２９〜４３番目の残基及び６５〜８１番目の残基に及ぶ。

【図5B】ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの配列アライメントである。ＣループとＣＤ鎖及びＦループとＦＧ鎖を四角で囲み、これらは２９〜４３番目の残基及び６５〜８１番目の残基に及ぶ。

【図6】単特異性又は二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子で前処置して、ＨＧＦで刺激したＨ２９２細胞におけるｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害を示す。単特異性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン（Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５、図でＡ５として示す）の単独又はＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン（Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２、図で８３ｖ２として示す）との併用と比較して、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子（ＥＣＢ１）の効力の実質的な増加が観察された。

【図7】単特異性又は二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子で前処置した細胞におけるＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害である。高レベルのＥＧＦＲを発現する細胞株Ｈ２９２（Ａ）及びＨ５９６（Ｂ）において、抗ＥＧＦＲ単特異性及び二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子は、ＥＧＦＲリン酸化の減少において等しい効力を有する。ｃ−Ｍｅｔと比較して低レベルのＥＧＦＲを発現する細胞株Ｈ４４１（Ｃ）において、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、単特異性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン単独と比較してＥＧＦＲリン酸化阻害の効力を改善する。ＥＧＦＲと比較して低レベルのｃ−Ｍｅｔを有する細胞株Ｈ２９２（Ｄ）及びＨ５９６（Ｅ）において、ｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害は、単特異性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン単独と比較して二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子では有意に増強される。試験で使用した分子は：二重特異性ＥＣＢ５（図で１７−Ａ３として示す）、単特異性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインＰ５３Ａ１Ｒ５−１７（図で「１７」として示す）、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子ＥＣＢ３（図で８３−Ｈ９として示す）、及び単特異性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインＰ１１４ＡＲ７Ｐ９３−Ｈ９（図においてＨ９として示す）であった。

【図8】二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子を投与したマウスから単離した腫瘍における６時間又は７２時間の薬力学的シグナリングを示す。全ての分子は、６時間及び７２時間の両方でｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、及びＥＲＫリン酸化を有意に減少させ、阻害の程度は、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔに対するＦＮ３ドメインの親和性に依存した。二重特異性分子は、高い（８３はｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２である）又は中等度（図の「１７ｖ２」は、Ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２である）の親和性を有するＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを、高い（図の「Ａ３」はＰ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３である）又は中等度（図の「Ａ５」はＰ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５である）の親和性を有するｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインに連結させることによって作製された。

【図9】：アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）に結合した種々の親和性を有する二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の血漿中（上）及び腫瘍（下）での蓄積を、ＩＰ投与後６時間（左）及び７２時間（右）で示す。投与後６時間で、中等度親和性のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン（１７ｖ２）及び高親和性ｃ−Ｍｅｔ結合ドメイン（８３ｖ２）を有する二重特異性分子を投与したマウスにおいて腫瘍での蓄積は最大である。二重特異性分子は、以下の高親和性又は中等度親和性ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを組み入れた：８３ｖ２−Ａ５−ＡＢＤ（ＥＣＢ１８；ＥＧＦＲ／ｃＭｅｔに関して高／中等度）８３ｖ２−Ａ３−ＡＢＤ（ＥＣＢ３８；高／高）１７ｖ２−Ａ５（ＥＣＢ２８；中等度／中等度）１７ｖ２−Ａ３−ＡＢＤ（ＥＣＢ３９；中等度／高）。８３ｖ２はｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２を意味し；１７ｖ２はｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２を意味し；Ａ３はｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３を意味し；Ａ５はｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５を意味する。

【図10】Ｈ２９２−ＨＧＦ腫瘍異種移植片をＳＣＩＤ ｂｅｉｇｅマウスに植え込んだ。腫瘍の平均体積がおよそ８０ｍｍ^３に達したとき、マウスに二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子（２５ｍｇ／ｋｇ）又はＰＢＳビヒクルを１週間に３回投与した。二重特異性分子は全て、腫瘍の増殖を減少させ、腫瘍の増殖阻害（ＴＧＩ）は、ｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲに対する分子の親和性に依存した。（高ＥＧＦＲ−高ｃＭｅｔは、ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２−ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３（ＥＣＢ３８）を意味し；高ＥＧＦＲ−中等度ｃＭｅｔは、ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２−ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５（ＥＣＢ１８）を意味し；中等度ＥＧＦＲ−高ｃＭｅｔは、ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２−ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３（ＥＣＢ３９）を意味し；中等度ＥＧＦＲ−中等度ｃＭｅｔは、ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７−ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５（ＥＣＢ２８）を意味する）。

【図11】Ｈ２９２−ＨＧＦ腫瘍異種移植片をＳＣＩＤ ｂｅｉｇｅマウスに植え込んでマウスを異なる治療によって処置した。治療の抗腫瘍活性を示す。（二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔは、ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２−ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３−ＡＢＤ（ＥＣＢ３８）を意味し；他の治療は、クリゾチニブ、エルロチニブ、セツキシマブ、及びクリゾチニブとエルロチニブの併用である）。

【発明を実施するための形態】

【0024】

本明細書で用いられる用語「フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン」（ＦＮ３
ドメイン）は、フィブロネクチン、テナシン、細胞内細胞骨格タンパク質、サイトカイン
受容体、及び原核細胞酵素を含むタンパク質においてしばしば存在するドメインを意味す
る（Ｂｏｒｋ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ
ＳＡ ８９：８９９０〜８９９４，１９９２；Ｍｅｉｎｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ １７５：１９１０〜１９１８，１９９３；Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ
．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６５：１５６５９〜１５６６５，１９９０）。例示的な
ＦＮ３ドメインは、ヒトテナシンＣに存在する異なる１５個のＦＮ３ドメイン、ヒトフィ
ブロネクチン（ＦＮ）に存在する異なる１５個のＦＮ３ドメイン、及び例えば米国特許出
願公開第２０１０／０２１６７０８号に記述される非天然の合成ＦＮ３ドメインである。
個々のＦＮ３ドメインは、ドメイン番号とタンパク質の名称で呼ばれ、例えばテナシンの
３番目のＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）又はフィブロネクチンの１０番目のＦＮ３ドメイン（
ＦＮ１０）と呼ばれる。

【0025】

本明細書で使用される用語「置換する」、又は「置換した」、又は「変異する」、又は
「変異した」は、その配列の変種を生成するために、ポリペプチド又はポリヌクレオチド
の配列に１つ又は２つ以上のアミノ酸又はヌクレオチドを変化させること、欠失させるこ
と、又は挿入することを指す。

【0026】

本明細書で使用される用語「無作為化する」、又は「無作為化した」、又は「多様化し
た」、又は「多様化する」は、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に少なくとも１つ
の置換、挿入、又は欠失を作製することを指す。

【0027】

本明細書で使用される用語「変種」は、１つ又は２つ以上の修飾、例えば、置換、挿入
、又は欠失によって、基準ポリペプチド又は基準ポリヌクレオチドとは異なっている、ポ
リペプチド又はポリヌクレオチドを指す。

【0028】

本明細書で使用される用語「特異的に結合する」又は「特異的結合」は、１×１０^−６
Ｍ若しくはそれより低い、例えば１×１０^−７Ｍ若しくはそれより低い、１×１０^−８Ｍ
若しくはそれより低い、１×１０^−９Ｍ若しくはそれより低い、１×１０^−１０Ｍ若しく
はそれより低い、１×１０^−１１Ｍ若しくはそれより低い、１×１０^−１２Ｍ若しくはそ
れより低い、又は１×１０^−１３Ｍ若しくはそれより低い解離定数（Ｋ_Ｄ）で、本発明の
ＦＮ３ドメインが既定の抗原に結合する能力を指す。典型的に、本発明のＦＮ３ドメイン
は、例えばＰｒｏｔｅｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ）を用いる表面プラズ
モン共鳴によって測定した場合に非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ又はカゼイン）に対する
そのＫ_Ｄより少なくとも１０倍低いＫ_Ｄで既定の抗原（すなわち、ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅ
ｔ）に結合する。このように、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイ
ン含有分子は、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔの両方に対して少なくとも１×１０^−６Ｍ又はそ
れより低い結合親和性（Ｋ_Ｄ）でそれぞれのＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する
。しかし、既定の抗原に特異的に結合する本発明の単離ＦＮ３ドメインは、他の関連する
抗原、例えば他の種からの同じ既定の抗原（ホモログ）に対して交叉反応性を有し得る。

【0029】

用語「ライブラリ」は、変種のコレクションを指す。ライブラリは、ポリペプチド又は
ポリヌクレオチド変種で構成され得る。

【0030】

本明細書で使用される用語「安定性」は、例えばＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔなどの既定の
抗原に対する結合などの、その正常な機能活性のうちの少なくとも１つを保持するように
、生理学的条件下で分子が折りたたみ状態を維持できること指す。

【0031】

本明細書で使用される「上皮成長因子受容体」又は「ＥＧＦＲ」は、配列番号７３及び
ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５２１９に示される配列を有するヒトＥＧＦＲ（ＨＥ
Ｒ−１又はＥｒｂ−Ｂ１としても知られる）（Ｕｌｌｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕ
ｒｅ ３０９：４１８〜４２５，１９８４）、並びにその天然に存在する変種を意味する
。そのような変種には、周知のＥＧＦＲｖＩＩＩ及び他の選択的スプライス変種（例えば
、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ００５３３−１、Ｐ００５３３−２、Ｐ００５３３−３
、Ｐ００５３３−４として同定される変種）、変種ＧＬＮ−９８、ＡＲＧ−２６６、Ｌｙ
ｓ−５２１、ＩＬＥ−６７４、ＧＬＹ−９６２、及びＰＲＯ−９８８（Ｌｉｖｉｎｇｓｔ
ｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＮＩＥＨＳ−ＳＮＰｓ，ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｇｅｎｏｍ
ｅ ｐｒｏｊｅｃｔ，ＮＩＥＨＳ ＥＳ１５４７８）が挙げられる。

【0032】

本明細書において使用される「ＥＧＦＲリガンド」は、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ヘパリン
結合ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）、アンフィレグリン（ＡＲ）、及びエピレグリン（ＥＰＩ）
を含むＥＧＦＲの全ての（例えば、生理的）リガンドを包含する。

【0033】

本明細書において使用される「上皮成長因子」は、配列番号７４に示されるアミノ酸配
列を有する周知のアミノ酸５３個のヒトＥＧＦを指す。

【0034】

本明細書で使用される「肝細胞増殖因子受容体」又は「ｃ−Ｍｅｔ」は、配列番号１０
１又はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１１２０９７２に示されるアミノ酸配列を有す
るヒトｃ−Ｍｅｔ及びその天然の変種を指す。

【0035】

本明細書で使用される「肝細胞増殖因子」は、切断されてジスルフィド結合で結合した
α鎖とβ鎖の二量体を形成する、配列番号１０２に示されるアミノ酸配列を有する周知の
ヒトＨＧＦを指す。

【0036】

本明細書で互換的に使用される「結合を遮断する」、又は「結合を阻害する」とは、二
重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子の本発明のＦＮ３ドメインが、
ＥＧＦＲに対するＥＧＦ及び／又はｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦなどのＥＧＦＲリガンドの
結合を遮断できること又は阻害できることを指し、部分的及び完全な遮断／阻害の両方を
包含する。本発明のＦＮ３ドメイン、又は本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ Ｆ
Ｎ３ドメイン含有分子によるＥＧＦＲに対するＥＧＦ及び／又はｃ−Ｍｅｔに対するＨＧ
ＦなどのＥＧＦＲリガンドの遮断／阻害は、遮断又は阻害がない場合のＥＧＦＲに対する
ＥＧＦＲリガンド結合及び／又はｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦ結合と比較して、正常レベル
のＥＧＦＲシグナリング及び／又はｃ−Ｍｅｔシグナリングを部分的又は完全に減少させ
る。本発明のＦＮ３ドメイン、又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含
有分子は、阻害が少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％
、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％
、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％であるとき、ＥＧＦＲに対す
るＥＧＦ及び／又はｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦなどのＥＧＦＲリガンドの「結合を遮断す
る」。結合の阻害は、周知の方法、例えば本発明のＦＮ３ドメイン又は二重特異性ＥＧＦ
Ｒ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子に暴露されたＥＧＦＲ発現Ａ４３１細胞でのビ
オチニル化ＥＧＦの結合の阻害をＦＡＣＳを用いて測定することによって、又はｃ−Ｍｅ
ｔ細胞外ドメイン上のビオチニル化ＨＧＦの結合の阻害を周知の方法及び本明細書に記述
の方法を用いて測定することによって、測定することができる。

【0037】

用語「ＥＧＦＲシグナリング」は、ＥＧＦＲに対するＥＧＦＲリガンドの結合により誘
発されるシグナル伝達を指し、それによってＥＧＦＲにおける少なくとも１つのチロシン
残基の自己リン酸化が起こる。例示的なＥＧＦＲリガンドはＥＧＦである。

【0038】

本明細書で使用される「ＥＧＦＲシグナリングを中和する」とは、ＥＧＦなどのＥＧＦ
Ｒリガンドによって誘発されるＥＧＦＲシグナリングを、本発明のＦＮ３ドメインが、少
なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、
７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、
９７％、９８％、９９％又は１００％阻害できることを指す。

【0039】

用語「ｃ−Ｍｅｔシグナリング」は、ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合により誘発され
るシグナル伝達を指し、それによってｃ−Ｍｅｔにおける少なくとも１つのチロシン残基
の自己リン酸化が起こる。典型的に、ＨＧＦが結合すると、１２３０、１２３４、又は１
２３５番目の位置で少なくとも１つのチロシン残基が自己リン酸化される。

【0040】

本明細書で使用される「ｃ−Ｍｅｔシグナリングを中和する」とは、ＨＧＦによって誘
発されるｃ−Ｍｅｔシグナリングを、本発明のＦＮ３ドメインが、少なくとも３０％、３
５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８
５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９
９％又は１００％阻害できることを指す。

【0041】

本明細書で互換的に使用される「過剰発現する」、「過剰発現された」、及び「過剰発
現している」は、同じ組織タイプの正常な細胞と比較して表面上に測定可能な高レベルの
ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔを有するがん細胞又は悪性細胞を指す。そのような過剰発
現は、遺伝子増幅、又は転写若しくは翻訳の増加によって、引き起こされ得る。ＥＧＦＲ
及び／又はｃ−Ｍｅｔの発現及び過剰発現は、周知のアッセイを用いて、例えば生存細胞
又は溶解細胞におけるＥＬＩＳＡ、免疫蛍光、フローサイトメトリー、又はラジオイムノ
アッセイを用いて測定することができる。あるいは又は加えて、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−
Ｍｅｔコード核酸分子のレベルは、例えば蛍光インサイチューハイブリダイゼーション、
サザンブロッティング、又はＰＣＲ技術を用いて細胞中で測定され得る。ＥＧＦＲ及び／
又はｃ−Ｍｅｔは、正常細胞と比較して、細胞表面上のＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔの
レベルが少なくとも１．５倍高いとき、過剰発現されている。

【0042】

本明細書で使用される「Ｔｅｎｃｏｎ」は、配列番号１に示され、米国特許出願公開第
２０１０／０２１６７０８号に記述される合成フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメ
インを指す。

【0043】

本明細書で使用される「がん細胞」又は「腫瘍細胞」は、インビボ、エクスビボ、及び
組織培養のいずれかにおいて、新しい遺伝材料の取り込みを必ずしも伴わない自発的又は
人為的な表現型の変化を有するがん様、前がん様、又は形質転換細胞を指す。形質転換は
、形質転換ウイルスの感染及び新たなゲノム核酸の取り込み、又は外因性の核酸の取り込
みにより発生し得るが、自然に又は発がん物質に対する暴露後にも発生して、それによっ
て内因性の遺伝子を変異させ得る。形質転換／がんは、例えば、インビトロ、インビボ、
及びエクスビボにおける、形態学的変化、細胞の不死化、異常な増殖制御、病巣の形成、
増殖、悪性度、腫瘍特異的マーカーレベル、浸潤性、ヌードマウスなどの適した動物宿主
における腫瘍の増殖又は抑制等によって例示される（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ
ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅ（３ｒｄ ｅｄ．１９９４））。

【0044】

用語「ベクター」は、生物系の内部で複製され得る、又はこうした系の間を移動するこ
とができるポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは典型的に、生物系
においてこれらのポリヌクレオチドの複製又は維持を促進するように機能する複製起点、
ポリアデニル化シグナル又は選択マーカーなどのエレメントを含んでいる。このような生
物系の例としては、細胞、ウイルス、動物、植物、及びベクターを複製することができる
生物学的成分を利用する再構成生物系を挙げることができる。ベクターを構成するポリヌ
クレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又はこれらのハイブリッド分子であり得る。

【0045】

用語「発現ベクター」は、発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコ
ードされるポリペプチドの翻訳を指示するために、生物系又は再構成生物系において利用
することができるベクターを意味する。

【0046】

用語「ポリヌクレオチド」は、糖−リン酸骨格又は他の同等の共有結合化学により共有
的に連結されたヌクレオチド鎖からなる分子を意味する。二本鎖及び一本鎖のＤＮＡ及び
ＲＮＡが、ポリヌクレオチドの典型例である。

【0047】

用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、ペプチド結合により連結されてポリペプ
チドを形成する少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を意味する。約５０個未満のア
ミノ酸からなる小さいポリペプチドは「ペプチド」と呼ばれる場合もある。

【0048】

本明細書で使用される用語「二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子」又は「二重特異性
ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子」は、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと、
別個のｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインとで構成され、それらが直接又はリンカーを介して
互いに共有結合している分子を意味する。例示的な二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ結合
分子は、ＥＧＦＲに特異的に結合する第１のＦＮ３ドメインと、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結
合する第２のＦＮ３ドメインとを含む。

【0049】

本明細書で使用される「価数」は、分子中の抗原に対して特異的な結合部位が明記され
た数存在することを指す。そのため、用語「１価」、「２価」、「４価」、及び「６価」
はそれぞれ、抗原に対して特異的な結合部位が分子中に１個、２個、４個、及び６個存在
することを指す。

【0050】

本明細書で使用される「混合物」は、互いに共有結合していない２つ以上のＦＮ３ドメ
インの試料又は調製物を指す。混合物は、２つ以上の同一のＦＮ３ドメイン又は別個のＦ
Ｎ３ドメインからなり得る。

【0051】

組成物
本発明は、システイン改変単特異性及び二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ド
メイン含有分子並びにそれらを作製及び使用する方法を提供する。

【0052】

単特異性ＥＧＦＲ結合分子
本発明は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合して、ＥＧＦＲに対する上
皮成長因子（ＥＧＦ）の結合を遮断し、それにより治療応用及び診断応用において広く使
用することができるフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを提供する。本発明は
、本発明のＦＮ３ドメインをコードするポリヌクレオチド又はその相補的核酸、ベクター
、宿主細胞、並びにそれらを作製及び使用する方法を提供する。

【0053】

本発明のＦＮ３ドメインは、高親和性でＥＧＦＲに結合して、ＥＧＦＲシグナリングを
阻害することから、低分子ＥＧＦＲ阻害剤と比較して特異性及び減少したオフターゲット
毒性の点で、並びに従来の抗体治療と比較して改善された組織浸透の点で恩典を提供し得
る。

【0054】

本発明の１つの実施形態は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合して、Ｅ
ＧＦＲに対する上皮成長因子（ＥＧＦ）の結合を遮断する単離フィブロネクチンＩＩＩ型
（ＦＮ３）ドメインである。

【0055】

本発明のＦＮ３ドメインは、Ａ４３１細胞を使用して、本発明のＦＮ３ドメインの存在
下又は非存在下でインキュベートしたＡ４３１細胞上で６００ｎＭのストレプトアビジン
−フィコエリスリンコンジュゲートを用いて結合したビオチニル化ＥＧＦからの蛍光の量
を検出する競合アッセイにおいて、約１×１０^−７Ｍより低い、約１×１０^−８Ｍより低
い、約１×１０^−９Ｍより低い、約１×１０^−１０Ｍより低い、約１×１０^−１１Ｍより
低い、又は約１×１０^−１２Ｍより低いＩＣ_５０値でＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合を遮
断し得る。例示的なＦＮ３ドメインは、配列番号１８〜２９、１０７〜１１０、又は１２
２〜１３７のアミノ酸配列を有するＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインなどであり、約１×１０
^−９Ｍ〜約１×１０^−７ＭのＩＣ_５０値でＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合を遮断し得る。
本発明のＦＮ３ドメインは、同じアッセイ条件を用いて、本発明のＦＮ３ドメインの非存
在下でのＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合と比較して、ＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合を少
なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、
７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、
９７％、９８％、９９％、又は１００％遮断し得る。

【0056】

本発明のＦＮ３ドメインは、同じアッセイ条件を用いて、本発明のＦＮ３ドメインの非
存在下でのシグナリングレベルと比較して、ＥＧＦＲシグナリングを少なくとも３０％、
３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、
８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、
９９％、又は１００％遮断し得る。

【0057】

ＥＧＦＲにＥＧＦなどのリガンドが結合すると、受容体の二量体化、自己リン酸化、受
容体内部の細胞質チロシンキナーゼドメインの活性化、並びにＤＮＡ合成（遺伝子活性化
）及び細胞周期進行又は分裂の調節に関係する多数のシグナル伝達及びトランス活性化経
路の開始を刺激する。ＥＧＦＲシグナリングが阻害されると、１つ又は２つ以上の下流の
ＥＧＦＲシグナリング経路が阻害され、それによってＥＧＦＲの中和は、細胞増殖及び分
化、血管新生、細胞運動性、及び転移の阻害を含む、様々な効果を有し得る。

【0058】

ＥＧＦＲシグナリングは、様々な周知の方法を用いて、例えばチロシンＹ１０６８、Ｙ
１１４８、及びＹ１１７３のいずれかでの受容体の自己リン酸化（Ｄｏｗｎｗａｒｄ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１１：４８３〜５，１９８４）及び／又は天然若しくは合
成基質のリン酸化を測定することにより測定され得る。リン酸化は、ホスホチロシン特異
的抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイ又はウェスタンブロットなどの周知の方法を用いて検
出することができる。例示的なアッセイは、Ｐａｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ
ａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒａ ２８３：１４３３〜４４，１９９７及びＢａｔｌｅｙ
ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ６２：１４３〜５０，１９９８において見いだされ得
る。

【0059】

１つの実施形態において、本発明のＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦを用
いてＡ４３１細胞において測定されるとき、約２．５×１０^−６Ｍより低い、例えば約１
×１０^−６Ｍより低い、約１×１０^−７Ｍより低い、約１×１０^−８Ｍより低い、約１×
１０^−９Ｍより低い、約１×１０^−１０Ｍより低い、約１×１０^−１１Ｍより低い、又は
約１×１０^−１２Ｍより低いＩＣ_５０値で、ＥＧＦＲの１１７３番目の残基位置のチロシ
ンでのＥＧＦ誘発ＥＧＦＲリン酸化を阻害する。

【0060】

１つの実施形態において、本発明のＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦを用
いてＡ４３１細胞において測定されるとき、約１．８×１０^−８Ｍ〜約２．５×１０^−６
ＭのＩＣ_５０値で、ＥＧＦＲの１１７３番目の残基位置のチロシンでのＥＧＦ誘発ＥＧＦ
Ｒリン酸化を阻害する。そのような例示的なＦＮ３ドメインは、配列番号１８〜２９、１
０７〜１１０、又は１２２〜１３７のアミノ酸配列を有するドメインである。

【0061】

１つの実施形態において、本発明のＦＮ３ドメインは、当業者によって実践される表面
プラズモン共鳴又はＫｉｎｅｘａ法によって決定する場合、約１×１０^−８Ｍより低い、
例えば、約１×１０^−９Ｍより低い、約１×１０^−１０Ｍより低い、約１×１０^−１１Ｍ
より低い未満、約１×１０^−１２Ｍより低い、又は約１×１０^−１３Ｍより低い解離定数
（Ｋ_Ｄ）でヒトＥＧＦＲに結合する。いくつかの実施形態において、本発明のＦＮ３ドメ
インは、約２×１０^−１０Ｍ〜約１×１０^−８ＭのＫ_ＤでヒトＥＧＦＲに結合する。ＥＧ
ＦＲに対するＦＮ３ドメインの親和性は、任意の適した方法を用いて実験により決定する
ことができる。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａ
ｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，」Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ，ＮＹ（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅ
ｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）；及び本明細
書に記述される方法を参照されたい）。特定のＦＮ３ドメイン−抗原相互作用に関して測
定される親和性は、異なる条件（例えば、モル浸透圧濃度、ｐＨ）下で測定すれば、異な
り得る。したがって、親和性及び他の抗原結合パラメータ（例えば、Ｋ_Ｄ、Ｋ_ｏｎ、Ｋ_ｏ
ｆｆ）の測定は、好ましくは、標準化された足場タンパク質及び抗原溶液、並びに本明細
書で記載される緩衝液などの標準化された緩衝液を用いて行われる。

【0062】

ＥＧＦＲに結合する本発明の例示的なＦＮ３ドメインには、配列番号１８〜２９、１０
７〜１１０、又は１２２〜１３７のＦＮ３ドメインが挙げられる。

【0063】

１つの実施形態において、ＥＧＦＲに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、配列番号２
７のアミノ酸配列と少なくとも８７％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0064】

１つの実施形態において、ＥＧＦＲに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、以下を含む
：
Ｘ_９がＭ若しくはＩである、配列ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ_９ＲＧＬ（配列番号１７９）、又
は配列ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬ（配列番号１８０）を含むＦＧループ；並びに
配列Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８（配列番号１８１）を含むＢＣループ；式中、
Ｘ_１はＡ、Ｔ、Ｇ、又はＤであり、
Ｘ_２はＡ、Ｄ、Ｙ、又はＷであり、
Ｘ_３はＰ、Ｄ、又はＮであり、
Ｘ_４はＬであるか、又は存在せず、
Ｘ_５はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ、又はＷであり、
Ｘ_６はＧ、Ｄ、又はＡであり、
Ｘ_７はＡ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、又はＤであり、及び
Ｘ_８はＹ、Ｆ又はＬである。

【0065】

ＥＧＦＲに特異的に結合して、ＥＧＦＲの自己リン酸化を阻害する本発明のＦＮ３ドメ
インは、構造の特徴として、Ｘ_９がＭ若しくはＩである、配列ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ_９ＲＧ
Ｌ（配列番号１７９）、又は配列ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬ（配列番号１８０）を含むＦ
Ｇループを含み得る。そのようなＦＮ３ドメインは更に、長さがアミノ酸８又は９個で、
配列Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８（配列番号１８１）によって定義され、５０ｎｇ
／ｍＬヒトＥＧＦを用いてＡ４３１細胞において測定されるとき、約２．５×１０^−６Ｍ
より低いのＩＣ_５０値で、及び約１．８×１０^−８Ｍ〜約２．５×１０^−６ＭのＩＣ_５０
値で、ＥＧＦＲの自己リン酸化を阻害するＢＣループを含み得る。

【0066】

ＥＧＦＲに特異的に結合して、ＥＧＦＲの自己リン酸化を阻害する本発明のＦＮ３ドメ
インは、
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８ＤＳ
ＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳ
ＩＹＧＶＨＮＶＹＫＤＴＮＸ_９ＲＧＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８２）の配列、又は
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８ＤＳ
ＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳ
ＩＹＧＶＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８３）の配列を更に含
み、
式中、
Ｘ_１はＡ、Ｔ、Ｇ、又はＤであり、
Ｘ_２はＡ、Ｄ、Ｙ、又はＷであり、
Ｘ_３はＰ、Ｄ、又はＮであり、
Ｘ_４はＬであるか、又は存在せず、
Ｘ_５はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ、又はＷであり、
Ｘ_６はＧ、Ｄ、又はＡであり、
Ｘ_７はＡ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、又はＤであり、
Ｘ_８はＹ、Ｆ、又はＬであり、及び
Ｘ_９はＭ又はＩである。

【0067】

ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを作製して、周知の方法及び本明細書に記述の方法を用い
て、そのＥＧＦＲ自己リン酸化阻害能に関して試験することができる。

【0068】

本発明のもう一つの実施形態は、ＥＧＦＲに特異的に結合する単離ＦＮ３ドメインであ
り、単離ＦＮ３ドメインは配列番号１８〜２９、１０７〜１１０、又は１２２〜１３７に
示される配列を含む。

【0069】

いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインは、例えば半減期延長分子
の発現及び／又はコンジュゲーションを促進するために、特定のＦＮ３ドメインのＮ−末
端に連結された開始メチオニン（Ｍｅｔ）又はＣ−末端に連結されたシステイン（Ｃｙｓ
）を含む。

【0070】

本発明のもう一つの実施形態は、ＥＧＦＲに特異的に結合して、ＥＧＦＲに対するＥＧ
Ｆの結合を遮断する単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインであり、ＦＮ３ド
メインは配列番号１のＴｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリから単離される
。

【0071】

単特異性ｃ−Ｍｅｔ結合分子
本発明は、肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）に特異的に結合して、ｃ−Ｍｅｔに対
する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の結合を遮断し、それにより治療応用及び診断応用におい
て広く使用することができるフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを提供する。
本発明は、本発明のＦＮ３ドメインをコードするポリヌクレオチド又はその相補的核酸、
ベクター、宿主細胞、並びにそれらを作製及び使用する方法を提供する。

【0072】

本発明のＦＮ３ドメインは、高親和性でｃ−Ｍｅｔに結合して、ｃ−Ｍｅｔシグナリン
グを阻害することから、低分子ｃ−Ｍｅｔ阻害剤と比較して、特異性及び減少したオフタ
ーゲット毒性の点で、並びに従来の抗体治療と比較して改善された組織浸透の点で恩典を
提供し得る。本発明のＦＮ３ドメインは、一価であり、それゆえ他の二価分子に関して起
こりうる望ましくない受容体クラスタリング及び活性化を防止する。

【0073】

本発明の１つの実施形態は、肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）に特異的に結合して
、ｃ−Ｍｅｔに対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の結合を遮断する単離フィブロネクチン
ＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである。

【0074】

本発明のＦＮ３ドメインは、本発明のＦＮ３ドメインの存在下でｃ−Ｍｅｔ−Ｆｃ融合
タンパク質に対するビオチニル化ＨＧＦの結合の阻害を検出するアッセイにおいて、約１
×１０^−７Ｍより低い、約１×１０^−８Ｍより低い、約１×１０^−９Ｍより低い、約１×
１０^−１０Ｍより低い、約１×１０^−１１Ｍより低い、又は約１×１０^−１２Ｍより低い
ＩＣ_５０値でｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を遮断し得る。例示的なＦＮ３ドメインは
、約２×１０^−１０Ｍ〜約６×１０^−８ＭのＩＣ_５０値でｃ−Ｍｅｔに対するＨＧのＦ結
合を遮断し得る。本発明のＦＮ３ドメインは、同じアッセイ条件を用いて、本発明のＦＮ
３ドメインの非存在下でのｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合と比較して、ｃ−Ｍｅｔに対
するＨＧＦの結合を少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０
％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４
％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％遮断し得る。

【0075】

本発明のＦＮ３ドメインは、同じアッセイ条件を用いて、本発明のＦＮ３ドメインの非
存在下でのシグナリングレベルと比較して、ｃ−Ｍｅｔシグナリングを少なくとも３０％
、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％
、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％
、９９％、又は１００％阻害し得る。

【0076】

ｃ−ＭｅｔにＨＧＦが結合すると、受容体の二量体化、自己リン酸化、受容体内部の細
胞質チロシンキナーゼドメインの活性化、並びにＤＮＡ合成（遺伝子活性化）及び細胞周
期進行又は分裂の調節に関係する多数のシグナル伝達及びトランス活性化経路の開始を刺
激する。ｃ−Ｍｅｔシグナリングが阻害されると、１つ又は２つ以上の下流のｃ−Ｍｅｔ
シグナリング経路が阻害され、そのためｃ−Ｍｅｔの中和は、細胞増殖及び分化、血管新
生、細胞運動性、及び転移の阻害を含む、様々な効果を有し得る。

【0077】

ｃ−Ｍｅｔシグナリングは、様々な周知の方法を用いて、例えば少なくとも１つのチロ
シン残基Ｙ１２３０、Ｙ１２３４、及びＩ１２３５での受容体の自己リン酸化及び／又は
天然若しくは合成基質のリン酸化を測定することによって測定され得る。リン酸化は、例
えばＥＬＩＳＡアッセイ又はウェスタンブロットにおいてホスホチロシンに対して特異的
な抗体を用いて検出することができる。チロシンキナーゼ活性に関するいくつかのアッセ
イ（Ｐａｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒａ ２８３
：１４３３〜４４，１９９７；Ｂａｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ６２：
１４３〜５０，１９９８）。

【0078】

１つの実施形態において、本発明のＦＮ３ドメインは、１００ｎｇ／ｍＬ組み換え型ヒ
トＨＧＦを用いてＮＣＩ−Ｈ４４１細胞において測定されるとき、約１×１０^−６Ｍより
低い、例えば約１×１０^−７Ｍより低い、約１×１０^−８Ｍより低い、約１×１０^−９Ｍ
より低い、約１×１０^−１０Ｍより低い、約１×１０^−１１Ｍより低い、約１×１０^−１
１Ｍより低い、又は約１×１０^−１２Ｍより低いＩＣ_５０値で、ｃ−Ｍｅｔの１３４９番
目の残基位置でのＨＧＦ誘発ｃ−Ｍｅｔリン酸化を阻害する。

【0079】

１つの実施形態において、本発明のＦＮ３ドメインは、１００ｎｇ／ｍＬ組み換え型ヒ
トＨＧＦを用いてＮＣＩ−Ｈ４４１細胞において測定されるとき、約４×１０^−９Ｍ〜約
１×１０^−６ＭのＩＣ_５０値で、ｃ−ＭｅｔのＹ１３４９のチロシンでのＨＧＦ誘発ｃ−
Ｍｅｔリン酸化を阻害する。

【0080】

１つの実施形態において、本発明のＦＮ３ドメインは、当業者によって実践される表面
プラズモン共鳴又はＫｉｎｅｘａ法によって決定するとき、約１×１０^−７Ｍ、約１×１
０^−８Ｍ、約１×１０^−９Ｍ、約１×１０^−１０Ｍ、約１×１０^−１１Ｍ、約１×１０^−
１２Ｍ、約１×１０^−１３Ｍ、約１×１０^−１４Ｍ、又は約１×１０^−１５Ｍに等しいか
又はそれより低い解離定数（Ｋ_Ｄ）でヒトｃ−Ｍｅｔに結合する。いくつかの実施形態に
おいて、本発明のＦＮ３ドメインは、約３×１０^−１０Ｍ〜約５×１０^−８ＭのＫ_Ｄでヒ
トｃ−Ｍｅｔに結合する。ｃ−Ｍｅｔに関するＦＮ３ドメインの親和性は、任意の適した
方法を用いて実験により決定することができる。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，ｅｔ
ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，」Ｉｎ Ｆ
ｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅ
ｎ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
，ＮＹ（１９９２）；及び本明細書に記述される方法を参照されたい）。特定のＦＮ３ド
メイン−抗原相互作用に関して測定される親和性は、異なる条件（例えば、モル浸透圧濃
度、ｐＨ）下で測定すれば、異なり得る。したがって、親和性及び他の抗原結合パラメー
タ（例えば、Ｋ_Ｄ、Ｋ_ｏｎ、Ｋ_ｏｆｆ）の測定は、好ましくは、標準化された足場タンパ
ク質及び抗原溶液、並びに本明細書で記載される緩衝液などの標準化された緩衝液を用い
て行われる。

【0081】

ｃ−Ｍｅｔに結合する本発明の例示的なＦＮ３ドメインには、配列番号３２〜４９、又
は１１１〜１１４のアミノ酸配列を有するＦＮ３ドメインが挙げられる。

【0082】

１つの実施形態において、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、配列番号
４１のアミノ酸配列と少なくとも８３％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0083】

１つの実施形態において、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、以下を含
む：
配列ＤＳＦＸ_１０ＩＲＹＸ_１１ＥＸ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５ＧＸ_１６（配列番号１８４
）を含むＣ鎖及びＣＤループ、式中
Ｘ_１０はＷ、Ｆ、又はＶであり、
Ｘ_１１はＤ、Ｆ、又はＬであり、
Ｘ_１２はＶ、Ｆ、又はＬであり、
Ｘ_１３はＶ、Ｌ、又はＴであり、
Ｘ_１４はＶ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、又はＳであり、
Ｘ_１５はＧ、Ｓ、Ａ、Ｔ、又はＫであり、及び
Ｘ_１６は、Ｅ、又はＤであり、及び
配列ＴＥＹＸ_１７ＶＸ_１８ＩＸ_１９Ｘ_２０ＶＫＧＧＸ_２１Ｘ_２２ＳＸ_２３（配列番号１
８５）を含むＦ鎖及びＦＧループ、式中
Ｘ_１７はＹ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ、又はＡであり、
Ｘ_１８はＮ、Ｔ、Ｑ、又はＧであり、
Ｘ_１９はＬ、Ｍ、Ｎ、又はＩであり、
Ｘ_２０は、Ｇ、又はＳであり、
Ｘ_２１は、Ｓ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ、又はＫであり、
Ｘ_２２はＩ、Ｖ、又はＬであり、及び
Ｘ_２３はＶ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、又はＬである。

【0084】

ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合して、ｃ−Ｍｅｔの自己リン酸化を阻害する本発明のＦＮ３
ドメインは、配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ_１０ＩＲＹＸ_１
１ＥＸ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５ＧＸ_１６ＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴ
ＥＹＸ_１７ＶＸ_１８ＩＸ_１９Ｘ_２０ＶＫＧＧＸ_２１Ｘ_２２ＳＸ_２３ＰＬＳＡＥＦＴＴ（配
列番号１８６）を更に含み、
式中、
Ｘ_１０はＷ、Ｆ、又はＶであり、及び
Ｘ_１１はＤ、Ｆ、又はＬであり、
Ｘ_１２はＶ、Ｆ、又はＬであり、
Ｘ_１３はＶ、Ｌ、又はＴであり、
Ｘ_１４はＶ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、又はＳであり、
Ｘ_１５はＧ、Ｓ、Ａ、Ｔ、又はＫであり、
Ｘ_１６はＥ、又はＤであり、
Ｘ_１７はＹ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ、又はＡであり、
Ｘ_１８はＮ、Ｔ、Ｑ、又はＧであり、
Ｘ_１９はＬ、Ｍ、Ｎ、又はＩであり、
Ｘ_２０はＧ、又はＳであり、
Ｘ_２１は、Ｓ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ、又はＫであり、
Ｘ_２２はＩ、Ｖ、又はＬであり、及び
Ｘ_２３はＶ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、又はＬである。

【0085】

本発明のもう一つの実施形態は、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する単離ＦＮ３ドメインで
あり、ＦＮ３ドメインは配列番号３２〜４９、又は１１１〜１１４に示される配列を含む
。

【0086】

本発明のもう一つの実施形態は、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合して、ｃ−Ｍｅｔに対する
ＨＧＦの結合を遮断する単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインであり、ＦＮ
３ドメインは配列番号１のＴｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリから単離さ
れる。

【0087】

Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づくライブラリからのＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン
の単離
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）は、ヒトテナシン−Ｃからの１５個のＦＮ３ドメインのコ
ンセンサス配列から設計された天然に存在しないフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ド
メインである（Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５：１０７〜１１７，２０１２；米国
特許出願公開第２０１０／０２１６７０８号）。Ｔｅｎｃｏｎの結晶構造は、ＦＮ３ドメ
インの特徴である７個のβ鎖をつなぐ６回表面露出ループを示し、β鎖は、Ａ、Ｂ、Ｃ、
Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧと呼ばれ、ループは、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、及びＦＧルー
プと呼ばれる（Ｂｏｒｋ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：８９９０〜８９９２，１９９２；米国特許第６，６７３，９０
１号）。これらのループ又は各ループ内の選択された残基を、フィブロネクチンＩＩＩ型
（ＦＮ３）ドメインのライブラリを構築するために無作為化することができ、これらを用
いてＥＧＦＲに結合する新規分子を選択することができる。表１は、Ｔｅｎｃｏｎ（配列
番号１）における各ループ及びβ鎖の位置及び配列を示す。

【0088】

これにより、以下に記述されるライブラリＴＣＬ１又はＴＣＬ２などの、Ｔｅｎｃｏｎ
配列に基づいて設計されたライブラリは、無作為化ＦＧループ、又は無作為化ＢＣ及びＦ
Ｇループを有し得る。Ｔｅｎｃｏｎ ＢＣループは、長さがアミノ酸７個であり、このた
め、１、２、３、４、５、６、又は７個のアミノ酸を、ＢＣループで多様化させてＴｅｎ
ｃｏｎ配列に基づいて設計したライブラリにおいて無作為化してもよい。Ｔｅｎｃｏｎ
ＦＧループは、長さがアミノ酸７個であり、このため、１、２、３、４、５、６、又は７
個のアミノ酸を、ＦＧループで多様化させてＴｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計したライブ
ラリにおいて無作為化してもよい。Ｔｅｎｃｏｎライブラリにおけるループでの更なる多
様性は、ループでの残基の挿入及び／又は欠失によって達成され得る。例えば、ＦＧ及び
／又はＢＣループを、アミノ酸１〜２２個伸長させてもよく、又はアミノ酸１〜３個減少
させてもよい。ＴｅｎｃｏｎにおけるＦＧループは、長さがアミノ酸７個であり、抗体重
鎖における対応するループは、残基４〜２８個の範囲である。最大の多様性を提供するた
めに、ＦＧループを、残基４〜２８個の抗体ＣＤＲ３の長さの範囲に対応するように、配
列並びに長さを多様化させてもよい。例えば、追加の１、２、３、４、又は５個のアミノ
酸によってループを伸長させることにより、ＦＧループの長さを更に多様化させることが
できる。

【0089】

Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリはまた、ＦＮ３ドメインの側面を形
成する無作為化された代替表面を有してもよく、それらは２つ以上のβ鎖と少なくとも１
つのループを含んでもよい。そのような１つの代替表面は、Ｃ及びＦのβ鎖、並びにＣＤ
及びＦＧループのアミノ酸によって形成される（Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面）。Ｔｅｎｃｏ
ｎの代替Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面に基づくライブラリの設計を図４に示し、そのようなラ
イブラリの詳細な作製は米国特許出願第１３／８５２，９３０号に記述される。

【0090】

Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリはまた、１１、１４、１７、３７、
４６、７３、又は８６番目の位置（残基の番号付けは配列番号１に対応する）の残基で置
換を有し、改善された熱安定性を示すＴｅｎｃｏｎ変種などのＴｅｎｃｏｎ変種に基づい
て設計されたライブラリを含む。例示的なＴｅｎｃｏｎ変種は、米国特許出願第２０１１
／０２７４６２３号に記述され、配列番号１のＴｅｎｃｏｎと比較してＥ１１Ｒ、Ｌ１７
Ａ、Ｎ４６Ｖ、Ｅ８６Ｉの置換を有するＴｅｎｃｏｎ２７（配列番号９９）を含む。

【0091】

【表1】

【0092】

Ｔｅｎｃｏｎ及び他のＦＮ３配列に基づくライブラリは、無作為又は既定の組のアミノ
酸を用いて、選択された残基位置で無作為化することができる。例えば、ライブラリにお
いて無作為置換を有する変種を、天然に存在する２０個全てのアミノ酸をコードするＮＮ
Ｋコドンを用いて作製することができる。他の多様化スキームにおいて、アミノ酸Ａｌａ
、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ
、Ｇｌｙ、及びＣｙｓをコードするために、ＤＶＫコドンを使用することができる。ある
いは、２０個全てのアミノ酸残基を生じさせ、同時に停止コドンの頻度を低減するために
、ＮＮＳコドンを使用することができる。多様化させる位置で偏りのあるアミノ酸分布を
有するＦＮ３ドメインのライブラリは、例えばＳｌｏｎｏｍｉｃｓ（登録商標）技術（ｈ
ｔｔｐ：＿／／ｗｗｗ＿ｓｌｏｎｉｎｇ＿ｃｏｍ）を用いて合成することができる。この
技術は、何千もの遺伝子合成プロセスにとって十分な万能構築ブロックとして作用する、
既製の二本鎖トリプレットのライブラリを使用する。トリプレットのライブラリは、あら
ゆる所望のＤＮＡ分子を構築するのに必要な、全ての考えられる配列組合せを示す。コド
ン指定は、周知のＩＵＢコードによる。

【0093】

本発明のＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、ＲｅｐＡをコ
ードするＤＮＡ断片に、足場タンパク質をコードするＤＮＡ断片をライゲートして、イン
ビトロ翻訳後に形成される、それぞれのタンパク質がそれがコードするＤＮＡに安定に会
合する（米国特許第７，８４２，４７６号；Ｏｄｅｇｒｉｐ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０１，２８０６〜２８１０，２００４）タ
ンパク質−ＤＮＡ複合体のプールを作製するために、ＣＩＳディスプレイを用いてＴｅｎ
ｃｏｎライブラリなどのＦＮ３ライブラリを作製すること、及び当技術分野で周知の及び
実施例で記述される任意の方法によってＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔに対する特異的結
合に関してライブラリをアッセイすることによって単離することができる。用いることが
できる例示的な周知の方法は、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチイムノアッセイ、並びに競合的
及び非競合的アッセイである（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，１９９
４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参
照されたい）。ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する同定されたＦＮ３ドメインを
、ＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合、又はｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合などのＥＧＦＲ
リガンドの遮断能に関して、及び本明細書に記述の方法を用いてＥＧＦＲ及び／又はｃ−
Ｍｅｔシグナリングの阻害能に関して更に特徴を調べる。

【0094】

本発明のＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、ライブラリを
作製するために鋳型として任意のＦＮ３ドメインを用いること、及び本明細書に提供され
る方法を用いてＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する分子に関してライブラ
リをスクリーニングすることによって作製することができる。用いることができる例示的
なＦＮ３ドメインは、テナシンＣの３番目のＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）（配列番号７５）
、フィブコン（配列番号７６）、及びフィブロネクチンの１０番目のＦＮ３ドメイン（Ｆ
Ｎ１０）（配列番号７７）である。標準的なクローニング及び発現技術を用いて、インビ
トロでライブラリを発現又は翻訳させるために、ベクターにおいてライブラリをクローニ
ングするか、又はライブラリの二本鎖ｃＤＮＡカセットを合成する。例えば、リボソーム
ディスプレイ（Ｈａｎｅｓ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａ
ｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４，４９３７〜４９４２，１９９７）、ｍＲＮＡディスプレイ（
Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ
ＳＡ，９４，１２２９７〜１２３０２，１９９７）、又は他の無細胞系（米国特許第５，
６４３，７６８号）を用いることができる。ＦＮ３ドメイン変種のライブラリは、例えば
任意の適したバクテリオファージの表面上に表示された融合タンパク質として発現され得
る。バクテリオファージの表面上に融合ポリペプチドを表示する方法は周知である（米国
特許出願第２０１１／０１１８１４４号；国際公開公報第ＷＯ２００９／０８５４６２号
米国特許第６，９６９，１０８号；米国特許第６，１７２，１９７号；米国特許第５，２
２３，４０９号；米国特許第６，５８２，９１５号；米国特許第６，４７２，１４７号）
。

【0095】

本発明のＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、熱安定性を改
善するため、並びに熱フォールディング及びアンフォールディングの可逆性を改善するた
めなどの特性を改善するために改変することができる。タンパク質及び酵素の見かけの熱
安定性を増加させるために、類似の高熱安定性配列との比較に基づく合理的設計、ジスル
フィド架橋を安定化する設計、α−へリックス性向を増加させる変異、塩架橋の改変、タ
ンパク質の表面電荷の変化、定方向進化、及びコンセンサス配列の組成を含むいくつかの
方法が適用されている（Ｌｅｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｗｙｓｓ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ，１２，３７１〜３７５，２００１）。高熱安定性は、発現したタンパ
ク質の収率を増加させ、溶解度又は活性を改善し、免疫原性を減少させ、製造におけるコ
ールドチェーンの必要性を最小化することができる。Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）の熱安
定性を改善するために置換することができる残基は、１１、１４、１７、３７、４６、７
３、又は８６番目の残基位置であり、米国特許出願公開第２０１１／０２７４６２３号に
記述されている。これらの残基に対応する置換を、本発明の分子を含むＦＮ３ドメイン又
は二重特異性ＦＮ３ドメインに組み入れることができる。

【0096】

本発明のもう一つの実施形態は、ＥＧＦＲに特異的に結合してＥＧＦＲに対するＥＧＦ
の結合を遮断し、配列番号１８〜２９、１０７〜１１０、１２２〜１３７に示される配列
を含み、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）における１１、１４、１７、３７、４６、７３、及
び８６番目の位置に対応する１つ又は２つ以上の残基位置で置換を更に含む、単離ＦＮ３
ドメインである。

【0097】

本発明のもう一つの実施形態は、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合してｃ−Ｍｅｔに対するＨ
ＧＦの結合を遮断し、配列番号３２〜４９、又は１１１〜１１４に示される配列を含み、
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）における１１、１４、１７、３７、４６、７３、及び８６番
目の位置に対応する１つ又は２つ以上の残基位置で置換を更に含む、単離ＦＮ３ドメイン
である。

【0098】

例示的な置換は、Ｅ１１Ｎ、Ｅ１４Ｐ、Ｌ１７Ａ、Ｅ３７Ｐ、Ｎ４６Ｖ、Ｇ７３Ｙ、及
びＥ８６Ｉの置換である（番号付けは配列番号１に従う）。

【0099】

いくつかの実施形態において、本発明のＦＮ３ドメインは、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１
）における置換Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ、及びＥ８６Ｉに対応する置換を含む。

【0100】

ＥＧＦＲに特異的に結合するＦＮ３ドメイン（図１）は、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）
と比較して伸長したＦＧループを有する。それゆえ、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）におけ
る１１、１４、１７、３７、４６、７３、及び８６番目の位置に対応する残基は、配列番
号２４のＦＮ３ドメインを除き、図１Ａ及び１Ｂに示されるＥＧＦＲ ＦＮ３ドメインに
おける１１、１４、１７、３７、４６、７３、及び９１番目の残基であり、対応する残基
は、ＢＣループにおける１つのアミノ酸の挿入により、１１、１４、１７、３８、７４、
及び９２番目の残基である。

【0101】

本発明のもう一つの実施形態は、ＥＧＦＲに特異的に結合してＥＧＦＲに対するＥＧＦ
の結合を遮断し、配列番号１８〜２９、１０７〜１１０、又は１２２〜１３７に示される
配列を含み、任意でＴｅｎｃｏｎ（配列番号１）における置換Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ、及び
Ｅ８６Ｉに対応する置換を有する、単離ＦＮ３ドメインである。

【0102】

本発明のもう一つの実施形態は、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合してｃ−Ｍｅｔに対するＨ
ＧＦの結合を遮断し、配列番号３２〜４９、又は１１１〜１１４に示されるアミノ酸配列
を含み、任意でＴｅｎｃｏｎ（配列番号１）における置換Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ、及びＥ８
６Ｉに対応する置換を有する、単離ＦＮ３ドメインである。

【0103】

タンパク質安定性及びタンパク質不安定性の測定は、タンパク質完全性の同じ又は異な
る態様として見ることができる。タンパク質は、熱、紫外線又は電離放射線、溶液中の場
合には周囲の浸透圧モル濃度及びｐＨの変化、小さな孔寸法での濾過によって課される力
学的剪断力、紫外線放射、γ線照射によるなどの電離放射線、化学的若しくは熱脱水、又
はタンパク質構造の破壊を引き起こし得るその他の任意の作用若しくは力によって引き起
こされる変性に対して感受性がある、又は「不安定」である。分子の安定性は、標準方法
を用いて決定することができる。例えば、分子の安定性は、標準方法を用いて、分子の半
分がアンフォールドされるセ氏での温度である、熱融解（「ＴＭ」）温度を測定すること
によって決定することができる。典型的には、ＴＭが高いほど、分子はより安定している
。熱に加えて、化学環境もまた、タンパク質が特定の三次元構造を維持する能力を変化さ
せる。

【0104】

１つの実施形態において、ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔに結合するＦＮ３ドメインは、ＴＭ
の増加によって測定した場合に、改変前の同じドメインと比較して、少なくとも５％、１
０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６
０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％又はそれより高い
安定性の増加を示す。

【0105】

化学変性も同様に、様々な方法によって測定することができる。化学変性剤には、塩酸
グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、尿素、アセトン、有機溶媒（ＤＭＦ、ベ
ンゼン、アセトニトリル）、塩（硫酸アンモニウム、臭化リチウム、塩化リチウム、臭化
ナトリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム）、還元剤（例えば、ジチオスレイトール
、β−メルカプトエタノール、ジニトロベンゼン、及び水素化ホウ素ナトリウムなどの水
素化物）、非イオン性及びイオン性洗浄剤、酸（例えば、塩酸（ＨＣｌ）、酢酸（ＣＨ_３
ＣＯＯＨ）、ハロゲン化酢酸）、疎水性分子（例えば、リン脂質）、及び標的化変性剤が
挙げられる。変性の程度の定量化は、標的分子の結合能などの機能的特性の喪失、又は凝
集傾向、これまで溶媒が到達できなかった残基の露出、若しくはジスルフィド結合の破壊
若しくは形成などの物理化学的特性に依存し得る。

【0106】

１つの実施形態において、ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔに結合する本発明のＦＮ３ドメイン
は、化学変性剤として塩酸グアニジニウムを用いることによって測定した場合に、改変前
の同じ足場と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３
５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８
５％、９０％、又は９５％又はそれより高い安定性の増加を示す。安定性の増加は、周知
の方法を用いて、塩酸グアニジンの濃度を増加させた処置の際のトリプトファン蛍光の減
少の関数として測定することができる。

【0107】

本発明のＦＮ３ドメインは、例えば、価数を増加させ、このため標的分子結合の結合力
を増加させる手段として、又は２つ以上の異なる標的分子に同時に結合する二重特異性又
は多重特異性の足場を作製する手段として、単量体、二量体、又は多量体として作製され
得る。二量体及び多量体は、例えばアミノ酸リンカー、例えばポリグリシン、グリシン及
びセリン、又はアラニン及びプロリンを含むリンカーを含めることによって単特異性、二
重特異性、又は多重特異性タンパク質足場を連結させることによって作製され得る。例示
的なリンカーには、（ＧＳ）_２、（配列番号７８）、（ＧＧＧＧＳ）_５（配列番号７９）
、（ＡＰ）_２（配列番号８０）、（ＡＰ）_５（配列番号８１）、（ＡＰ）_１０（配列番号
８２）、（ＡＰ）_２０（配列番号８３）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）_５ＡＡＡ（配列番号８４）リ
ンカーが挙げられる。二量体及び多量体を、ＮからＣ−方向に互いに連結させてもよい。
ポリペプチドを新規連結融合ポリペプチドに接続するために天然に存在する、並び人工の
ペプチドリンカーを用いることは、文献において周知である（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４，５２６０〜５２６８，１９８９；Ａｌｆｔ
ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８，７２５〜７３１，１９９５；Ｒｏ
ｂｉｎｓｏｎ ＆ Ｓａｕｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，１０９〜１１６，１
９９６；米国特許第５，８５６，４５６号）。

【0108】

二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ結合分子
本発明の分子を含む二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメインは、低分子ＥＧ
ＦＲ阻害剤と比較して、特異性及び低減されたオフターゲット毒性の点で、通並びに常の
抗体治療薬と比較して改善された組織浸透の点で恩典を提供し得る。本発明は、少なくと
も部分的に、本発明の分子を含む二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメインが、
ＥＧＦＲ結合及びｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの混合物と比較すると、有意に改善され
た相乗的阻害効果を提供するという意外な発見に基づいている。分子は、腫瘍への浸透及
び保持を最大にするためにＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔの両方に対して特異的親和性となるよ
うに適合され得る。

【0109】

本発明の１つの実施形態は、第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインと第
２のＦＮ３ドメインとを含む単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であり、第１のＦＮ
３ドメインは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合して、ＥＧＦＲに対する
上皮成長因子（ＥＧＦ）の結合を遮断し、第２のＦＮ３ドメインは、肝細胞増殖因子受容
体（ｃ−Ｍｅｔ）に特異的に結合して、ｃ−Ｍｅｔに対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の
結合を遮断する。

【0110】

本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、任意のＥＧＦ
Ｒ結合ＦＮ３ドメインと本発明の任意のｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインとを直接又はリン
カーを介して共有的に連結させることによって作製され得る。したがって、二重特異性分
子の第１のＦＮ３ドメインは、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインに関する上記の特徴を有し得
て、二重特異性分子の第２のＦＮ３ドメインは、ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインに関する
上記の特徴を有し得る。

【0111】

１つの実施形態において、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子
の第１のＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦを用いてＡ４３１細胞において測
定されるとき、約２．５×１０^−６Ｍより低いＩＣ_５０値でＥＧＦＲの１１７３番目のチ
ロシン残基でＥＧＦによって誘発されるＥＧＦＲのリン酸化を阻害し、二重特異性ＥＧＦ
Ｒ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子の第２のＦＮ３ドメインは、１００ｎｇ／ｍＬ
ヒトＨＧＦを用いてＮＣＩ−Ｈ４４１細胞において測定されるとき、約１．５×１０^−６
Ｍより低いＩＣ_５０値でｃ−Ｍｅｔの１３４９番目のチロシン残基でＨＧＦによって誘発
されるｃ−Ｍｅｔのリン酸化を阻害する。

【0112】

もう１つの実施形態において、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有
分子の第１のＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦを用いてＡ４３１細胞におい
て測定されるとき、約１．８×１０^−８Ｍ〜約２．５×１０^−６ＭのＩＣ_５０値でＥＧＦ
Ｒの１１７３番目のチロシン残基でＥＧＦによって誘発されるＥＧＦＲのリン酸化を阻害
し、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子の第２のＦＮ３ドメイン
は、１００ｎｇ／ｍＬヒトＨＧＦを用いてＮＣＩ−Ｈ４４１細胞において測定されるとき
、約４×１０^−９Ｍ〜約１．５×１０^−６ＭのＩＣ_５０値でｃ−Ｍｅｔの１３４９番目の
チロシン残基でＨＧＦによって誘発されるｃ−Ｍｅｔのリン酸化を阻害する。

【0113】

もう一つの実施形態において、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有
分子の第１のＦＮ３ドメインは、約１×１０^−８Ｍより低い解離定数（Ｋ_Ｄ）でヒトＥＧ
ＦＲに結合し、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子の第２のＦＮ
３ドメインは、約５×１０^−８Ｍより低いのＫ_Ｄでヒトｃ−Ｍｅｔに結合する。

【0114】

ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔの両方に結合する二重特異性分子において、第１のＦＮ３ドメ
インは、約２×１０^−１０Ｍ〜約１×１０^−８ＭのＫ_ＤでヒトＥＧＦＲに結合し、第２の
ＦＮ３ドメインは、約３×１０^−１０Ｍ〜約５×１０^−８ＭのＫ_Ｄでヒトｃ−Ｍｅｔに結
合する。

【0115】

ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔに関する二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の親和性は、単
特異性分子に関して先に記述したように決定することができる。

【0116】

本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の第１のＦＮ３ドメインは、Ａ４３１細
胞を使用し、第１のＦＮ３ドメインの存在下又は非存在下でインキュベートしたＡ４３１
細胞において６００ｎＭのストレプトアビジン−フィコエリスリンコンジュゲートを用い
て結合したビオチニル化ＥＧＦからの蛍光量を検出するアッセイにおいて、約１×１０^−
９Ｍ〜約１．５×１０^−７ＭのＩＣ_５０値でＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合を遮断し得る
。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の第１のＦＮ３ドメインは、同じアッセ
イ条件を用いて、第１のＦＮ３ドメインの非存在下でのＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合と
比較するとき、ＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合を少なくとも３０％、３５％、４０％、４
５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９
１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００
％遮断し得る。

【0117】

本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の第２のＦＮ３ドメインは、第２のＦＮ
３ドメインの存在下でｃ−Ｍｅｔ−Ｆｃ融合タンパク質に対するビオチニル化ＨＧＦの結
合の阻害を検出するアッセイにおいて、約２×１０^−１０Ｍ〜約６×１０^−８ＭのＩＣ_５
０値でｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を遮断し得る。二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ
分子の第２のＦＮ３ドメインは、同じアッセイ条件を用いて、第２のＦＮ３ドメインの非
存在下でのｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合と比較するとき、ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦ
の結合を少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％
、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％
、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％遮断し得る。

【0118】

本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、同じアッセイ条件を用いて、本発明
の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の非存在下でのシグナリングレベルと比較すると
き、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔシグナリングを少なくとも３０％、３５％、４０％、
４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、
９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１０
０％阻害し得る。

【0119】

ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔシグナリングは、単特異性分子に関して先に記述した様々な周
知の方法を用いて測定され得る。

【0120】

ＥＧＦＲに特異的に結合する第１のＦＮ３ドメインと、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する
第２のＦＮ３ドメインとを含む本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、第１及
び第２のＦＮ３ドメインの混合物によって観察される相乗的阻害と比較するとき、ＥＧＦ
Ｒ及びｃ−Ｍｅｔシグナリングの相乗的阻害及び腫瘍細胞増殖の有意な増加をもたらす。
相乗的阻害は、例えば、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子によ
る、及び１つがＥＧＦＲに結合し、他方がｃ−Ｍｅｔに結合する２つの単特異性分子の混
合物によるＥＲＫリン酸化の阻害を測定することによって評価され得る。本発明の二重特
異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、２つの単特異性ＦＮ３ドメインの混合物に関するＩＣ
_５０値と比較すると、少なくとも約１００倍小さい、例えば少なくとも５００、１０００
、５０００、又は１０，０００倍小さいＩＣ_５０でＥＲＫリン酸化を阻害し得るが、この
ことは、２つの単特異性ＦＮ３ドメインの混合物と比較して、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−
Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子では効力が少なくとも１００倍増加したことを示す。例
示的な二重特異性ＥＧＦＲ−ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、約５×１０^−９Ｍ
又はそれより低いＩＣ_５０値でＥＲＫリン酸化を阻害し得る。ＥＲＫのリン酸化は、標準
的な方法及び本明細書に記述の方法を用いて測定することができる。

【0121】

本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、７．５ｎｇ／
ｍＬ ＨＧＦを添加した１０％ＦＢＳを含む培地によって細胞増殖が誘導される、第１の
ＦＮ３ドメインと第２のＦＮ３ドメインとの混合物によるＨ２９２細胞増殖の阻害のＩＣ
_５０値と比較して、少なくとも３０倍低いＩＣ_５０値でＨ２９２細胞増殖を阻害し得る。
本発明の二重特性分子は、第１のＦＮ３ドメインと第２のＦＮ３ドメインの混合物による
腫瘍細胞増殖阻害のＩＣ_５０値と比較して、約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９
０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、又は
約１０００倍低いＩＣ_５０値で腫瘍細胞増殖を阻害し得る。腫瘍細胞増殖の阻害は、標準
的な方法及び本明細書に記述される方法を用いて測定することができる。

【0122】

本発明のもう１つの実施形態は、第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン
と第２のＦＮ３ドメインとを含む二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であり、第１のＦＮ
３ドメインは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合して、ＥＧＦＲに対する
上皮成長因子（ＥＧＦ）の結合を遮断し、第２のＦＮ３ドメインは、肝細胞増殖因子受容
体（ｃ−Ｍｅｔ）に特異的に結合して、ｃ−Ｍｅｔに対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の
結合を遮断し、
第１のＦＮ３ドメインは、
Ｘ_９がＭ若しくはＩである、配列ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ_９ＲＧＬ（配列番号１７９）、又
は配列ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬ（配列番号１８０）を含むＦＧループ；及び
配列Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８（配列番号１８１）を含むＢＣループであって
；
Ｘ_１はＡ、Ｔ、Ｇ、又はＤであり、
Ｘ_２はＡ、Ｄ、Ｙ、又はＷであり、
Ｘ_３はＰ、Ｄ、又はＮであり、
Ｘ_４はＬであるか、又は存在せず、
Ｘ_５はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ、又はＷであり、
Ｘ_６はＧ、Ｄ、又はＡであり、
Ｘ_７はＡ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、又はＤであり、及び
Ｘ_８はＹ、Ｆ、又はＬであるＢＣループとを含み、並びに
第２のＦＮ３ドメインは、
配列ＤＳＦＸ_１０ＩＲＹＸ_１１ＥＸ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５ＧＸ_１６（配列番号１８４
）を含むＣ鎖及びＣＤループ、式中
Ｘ_１０はＷ、Ｆ、又はＶであり、
Ｘ_１１はＤ、Ｆ、又はＬであり、
Ｘ_１２はＶ、Ｆ、又はＬであり、
Ｘ_１３はＶ、Ｌ、又はＴであり、
Ｘ_１４はＶ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、又はＳであり、
Ｘ_１５はＧ、Ｓ、Ａ、Ｔ、又はＫであり、及び
Ｘ_１６はＥ、又はＤであり、及び
配列ＴＥＹＸ_１７ＶＸ_１８ＩＸ_１９Ｘ_２０ＶＫＧＧＸ_２１Ｘ_２２ＳＸ_２３（配列番号１
８５）を含むＦ鎖及びＦＧループ、式中
Ｘ_１７はＹ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ、又はＡであり、
Ｘ_１８はＮ、Ｔ、Ｑ、又はＧであり、
Ｘ_１９はＬ、Ｍ、Ｎ、又はＩであり、
Ｘ_２０はＧ、又はＳであり、
Ｘ_２１は、Ｓ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ、又はＫであり、
Ｘ_２２はＩ、Ｖ、又はＬであり、及び
Ｘ_２３はＶ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、又はＬである。

【0123】

もう一つの実施形態において、二重特異性分子は、以下の配列を含む、ＥＧＦＲに結合
する第１のＦＮ３ドメインを含む：
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８ＤＳ
ＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳ
ＩＹＧＶＨＮＶＹＫＤＴＮＸ_９ＲＧＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８２）の配列、又は
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８ＤＳ
ＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳ
ＩＹＧＶＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８３）の配列であって
式中、配列番号Ｘ及びＸにおいて、
Ｘ_１はＡ、Ｔ、Ｇ、又はＤであり、
Ｘ_２はＡ、Ｄ、Ｙ、又はＷであり、
Ｘ_３はＰ、Ｄ、又はＮであり、
Ｘ_４はＬであるか、又は存在せず、
Ｘ_５はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ、又はＷであり、
Ｘ_６はＧ、Ｄ、又はＡであり、
Ｘ_７はＡ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、又はＤであり、
Ｘ_８はＹ、Ｆ、又はＬであり、及び
Ｘ_９はＭ又はＩである。

【0124】

もう一つの実施形態において、二重特異性分子は、以下の配列を含む、ｃ−Ｍｅｔに結
合する第２のＦＮ３ドメインを含む：
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ_１０ＩＲＹＸ_１
１ＥＸ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５ＧＸ_１６ＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴ
ＥＹＸ_１７ＶＸ_１８ＩＸ_１９Ｘ_２０ＶＫＧＧＸ_２１Ｘ_２２ＳＸ_２３ＰＬＳＡＥＦＴＴ（配
列番号１８６）であって、
式中、
Ｘ_１０はＷ、Ｆ、又はＶであり、及び
Ｘ_１１はＤ、Ｆ、又はＬであり、
Ｘ_１２はＶ、Ｆ、又はＬであり、
Ｘ_１３はＶ、Ｌ、又はＴであり、
Ｘ_１４はＶ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、又はＳであり、
Ｘ_１５はＧ、Ｓ、Ａ、Ｔ、又はＫであり、
Ｘ_１６はＥ、又はＤであり、
Ｘ_１７はＹ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ、又はＡであり、
Ｘ_１８はＮ、Ｔ、Ｑ、又はＧであり、
Ｘ_１９はＬ、Ｍ、Ｎ、又はＩであり、
Ｘ_２０はＧ、又はＳであり、
Ｘ_２１は、Ｓ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ、又はＫであり、
Ｘ_２２はＩ、Ｖ、又はＬであり、及び
Ｘ_２３はＶ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、又はＬである。

【0125】

例示的な二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、配列番号５０
〜７２、１０６、１１８〜１２１、又は１３８〜１６５に示されるアミノ酸配列を含む。

【0126】

本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、Ｘ_９がＭ若しくはＩである、配列Ｈ
ＮＶＹＫＤＴＮＸ_９ＲＧＬ（配列番号１７９）、又は配列ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬ（配
列番号１８０）を含む、ＥＧＦＲに結合する第１のＦＮ３ドメインのＦＧループなどの、
ＥＧＦＲ自己リン酸化の阻害などのその機能的特徴に関連する一定の構造的特徴を含む。

【0127】

１つの実施形態において、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン
含有分子は、
５０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦを用いてＡ４３１細胞において測定されるとき、約８×１０
^−７Ｍより低いＩＣ_５０値でＥＧＦＲの１１７３番目のチロシン残基でＥＧＦによって誘
発されるＥＧＦＲのリン酸化を阻害し、
１００ｎｇ／ｍＬヒトＨＧＦを用いてＮＣＩ−Ｈ４４１細胞において測定されるとき、
約８．４×１０^−７Ｍより低いＩＣ_５０値でｃ−Ｍｅｔの１３４９番目のチロシン残基で
ＨＧＦによって誘発されるｃ−Ｍｅｔのリン酸化を阻害し、
７．５ｎｇ ＨＧＦを含む１０％ＦＢＳによって細胞増殖が誘導される、ＨＧＦによっ
て誘発されるＮＣＩ−Ｈ２９２細胞増殖を、約９．５×１０^−６Ｍより低いＩＣ_５０値で
阻害し、
約２．０×１０^−８Ｍより低いＫ_ＤでＥＧＦＲに結合し、
約２．０×１０^−８Ｍより低いＫ_Ｄでｃ−Ｍｅｔに結合する。

【0128】

もう１つの実施形態において、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメ
イン含有分子は、
５０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦを用いてＡ４３１細胞において測定されるとき、約４．２×
１０^−９Ｍ〜８×１０^−７ＭのＩＣ_５０値でＥＧＦＲの１１７３番目のチロシン残基でＥ
ＧＦによって誘発されるＥＧＦＲのリン酸化を阻害し、
１００ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦを用いてＮＣＩ−Ｈ４４１細胞において測定されるとき、
約２．４×１０^−８Ｍ〜約８．４×１０^−７ＭのＩＣ_５０値でｃ−Ｍｅｔの１３４９番目
のチロシン残基でＨＧＦによって誘発されるｃ−Ｍｅｔのリン酸化を阻害し、
７．５ｎｇ ＨＧＦを含む１０％ＦＢＳによって細胞増殖が誘導される、ＨＧＦによっ
て誘発されるＮＣＩ−Ｈ２９２細胞増殖を、約２．３×１０^−８Ｍ〜約９．５×１０^−６
ＭのＩＣ_５０値で阻害し、
約２×１０^−１０Ｍ〜約２．０×１０^−８ＭのＫ_ＤでＥＧＦＲに結合し、
約１×１０^−９Ｍ〜約２．０×１０^−８ＭのＫ_Ｄでｃ−Ｍｅｔに結合する。

【0129】

１つの実施形態において、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、以下の配列を含む
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン、
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８ＤＳ
ＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳ
ＩＹＧＶＨＮＶＹＫＤＴＮＸ_９ＲＧＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８２）であって、式
中
Ｘ_１は、Ｄであり、
Ｘ_２は、Ｄであり、
Ｘ_３は、Ｐであり、
Ｘ_４は、存在せず、
Ｘ_５は、Ｈ、又はＷであり、
Ｘ_６は、Ａであり、
Ｘ_７は、Ｆであり、
Ｘ_８は、Ｙであり、及び
Ｘ_９はＭ又はＩである、と、
以下の配列を含むｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン、
ＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ_１０ＩＲＹＸ_１１
ＥＸ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５ＧＸ_１６ＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥ
ＹＸ_１７ＶＸ_１８ＩＸ_１９Ｘ_２０ＶＫＧＧＸ_２１Ｘ_２２ＳＸ_２３ＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列
番号１８６）であって
式中、
Ｘ_１０は、Ｗであり、
Ｘ_１１は、Ｆであり、
Ｘ_１２は、Ｆであり、
Ｘ_１３は、Ｖ、又はＬであり、
Ｘ_１４は、Ｇ、又はＳであり、
Ｘ_１５は、Ｓ、又はＫであり、
Ｘ_１６は、Ｅ、又はＤであり、
Ｘ_１７は、Ｖであり、
Ｘ_１８は、Ｎであり、
Ｘ_１９は、Ｌ、又はＭであり、
Ｘ_２０は、Ｇ、又はＳであり、
Ｘ_２１は、Ｓ、又はＫであり、
Ｘ_２２は、Ｉであり、及び
Ｘ_２３が、Ｐである、とを含む。

【0130】

例示的な二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、配列番号５７、６１、６２、６３、
６４、６５、６６、６７、及び６８に示される配列を有する分子である。

【0131】

本発明の二重特異性分子は、上記のＴｅｎｃｏｎ（配列番号１）における１１、１４、
１７、３７、４６、７３、及び８６番目の位置に対応する、第１のＦＮ３ドメイン及び／
又は第２のＦＮ３ドメインにおける１つ又は２つ以上の残基位置での置換と、２９番目の
位置での置換とを更に含みうる。例示的な置換は、Ｅ１１Ｎ、Ｅ１４Ｐ、Ｌ１７Ａ、Ｅ３
７Ｐ、Ｎ４６Ｖ、Ｇ７３Ｙ、Ｅ８６Ｉ、及びＤ２９Ｅの置換である（番号付けは配列番号
１に従う）。当業者は、以下に記載されるその側鎖が関連するアミノ酸ファミリー内での
アミノ酸などの、他のアミノ酸を置換のために用いることができることを認識するであろ
う。作製された変種を、本明細書に記述の方法を用いて、その安定性及びＥＧＦＲ及び／
又はｃ−Ｍｅｔに対する結合に関して試験することができる。

【0132】

１つの実施形態において、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子
は、ＥＧＦＲに特異的に結合する第１のＦＮ３ドメインと、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合す
る第２のＦＮ３ドメインとを含み、第１のＦＮ３ドメインは、以下の配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＸ_２４ＶＴＸ_２５ＤＳＸ_２６ＲＬＳＷＤＤＰＸ_２７ＡＦＹＸ_２８
ＳＦＬＩＱＹＱＸ_２９ＳＥＫＶＧＥＡＩＸ_３０ＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴ
ＥＹＴＶＳＩＹＸ_３１ＶＨＮＶＹＫＤＴＮＸ_３２ＲＧＬＰＬＳＡＸ_３３ＦＴＴ（配列番号
１８７）であって、式中
Ｘ_２４は、Ｅ、Ｎ、又はＲであり、
Ｘ_２５は、Ｅ、又はＰであり、
Ｘ_２６は、Ｌ、又はＡであり、
Ｘ_２７は、Ｈ、又はＷであり、
Ｘ_２８は、Ｅ、又はＤであり、
Ｘ_２９は、Ｅ、又はＰであり、
Ｘ_３０は、Ｎ、又はＶであり、
Ｘ_３１はＧ、又はＹであり、
Ｘ_３２は、Ｍ、又はＩであり、及び
Ｘ_３３は、Ｅ、又はＩである、配列を含み、
及び第２のＦＮ３ドメインは、配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＸ_３４ＶＴＸ_３５ＤＳＸ_３６ＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＷＩ
ＲＹＦＸ_３７ＦＸ_３８Ｘ_３９Ｘ_４０ＧＸ_４１ＡＩＸ_４２ＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬ
ＫＰＧＴＥＹＶＶＮＩＸ_４３Ｘ_４４ＶＫＧＧＸ_４５ＩＳＰＰＬＳＡＸ_４６ＦＴＴ（配列番
号１８８）であって、式中、
Ｘ_３４は、Ｅ、Ｎ、又はＲであり、
Ｘ_３５は、Ｅ、又はＰであり、
Ｘ_３６は、Ｌ、又はＡであり、
Ｘ_３７は、Ｅ、又はＰであり、
Ｘ_３８は、Ｖ、又はＬであり、
Ｘ_３９は、Ｇ、又はＳであり、
Ｘ_４０は、Ｓ、又はＫであり、
Ｘ_４１は、Ｅ、又はＤであり、
Ｘ_４２は、Ｎ、又はＶであり、
Ｘ_４３は、Ｌ、又はＭであり、
Ｘ_４４は、Ｇ、又はＳであり、
Ｘ_４５は、Ｓ、又はＫであり、及び
Ｘ_４６は、Ｅ、又はＩである、配列を含む。

【0133】

他の実施形態において、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は
、配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも８７％同一であるアミノ酸配列を含む第１の
ＦＮ３ドメインと、配列番号４１のアミノ酸配列と少なくとも８３％同一であるアミノ酸
配列を含む第２のＦＮ３ドメインとを含む。

【0134】

本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ、ＦＮ３ドメイン含有分子は、腫瘍での蓄積
を最大にするためにＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔに対する特異的親和性となるように適合され
得る。

【0135】

本発明のもう１つの実施形態は、第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン
と第２のＦＮ３ドメインとを含む単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であり、第１の
ＦＮ３ドメインは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合して、ＥＧＦＲに対
する上皮成長因子（ＥＧＦ）の結合を遮断し、第２のＦＮ３ドメインは、肝細胞増殖因子
受容体（ｃ−Ｍｅｔ）に特異的に結合して、ｃ−Ｍｅｔに対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ
）の結合を遮断し、第１のＦＮ３ドメイン及び第２のＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴ
ｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリから単離される。

【0136】

本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、ＥＧＦＲ結合
ＦＮ３ドメインと本発明のｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインとを周知の方法を用いて共有的
に連結させることによって作製され得る。ＦＮ３ドメインは、リンカー、例えばポリグリ
シン、グリシン及びセリン、又はアラニン及びプロリンを含むリンカーによって連結され
得る。例示的なリンカーには、（ＧＳ）_２、（配列番号７８）、（ＧＧＧＧＳ）_５（配列
番号７９）、（ＡＰ）_２（配列番号８０）、（ＡＰ）_５（配列番号８１）、（ＡＰ）_１０
（配列番号８２）、（ＡＰ）_２０（配列番号８３）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）_５ＡＡＡ（配列番
号８４）リンカーが挙げられる。ポリペプチドを新規連結融合ポリペプチドに接続するた
めに天然に存在する、並びに人工のペプチドリンカーを用いることは、文献において周知
である（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４，５２６
０〜５２６８，１９８９；Ａｌｆｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８
，７２５〜７３１，１９９５；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＆ Ｓａｕｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ３５，１０９〜１１６，１９９６；米国特許第５，８５６，４５６号）。本発明
の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、第１のＦＮ３ドメインのＣ−末端から第２の
ＦＮ３ドメインのＮ−末端に、又は第２のＦＮ３ドメインのＣ−末端から第１のＦＮ３ド
メインのＮ−末端に共に連結され得る。任意のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインが、ｃ−Ｍｅ
ｔ結合ＦＮ３ドメインに共有的に連結され得る。例示的なＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインは
、配列番号１８〜２９、１０７〜１１０、及び１２２〜１３７に示されるアミノ酸配列を
有するドメインであり、例示的なｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、配列番号３２〜４９
、及び１１１〜１１４に示されるアミノ酸配列を有するドメインである。二重特異性分子
に連結されるＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインは、そのＮ−末端で開始メチオニン（Ｍｅｔ）
を更に含み得る。

【0137】

二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子の変種は、本発明の範囲内
である。例えば、得られた変種が、親分子と比較して、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔに対して
類似の選択性及び効力を保持する限り、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイ
ン含有分子に置換を行うことができる。例示的な改変は、例えば、結果として親分子の特
徴と類似の特徴を有する変種が得られる保存的置換である。保存的置換とは、その側鎖が
関連するアミノ酸ファミリー間で起こる置換である。遺伝子コードされるアミノ酸は、４
つのファミリーに分類することができる：（１）酸性（アスパラギン酸塩、グルタミン酸
塩）；（２）塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）；（３）非極性（アラニン、バ
リン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトフ
ァン）；及び（４）非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セ
リン、トレオニン、チロシン）。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、時
に、芳香族アミノ酸として共に分類される。又は、アミノ酸のレパートリーを、（１）酸
性（アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩）；（２）塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチ
ジン）、（３）脂肪族（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン
、トレオニン）、ただしセリン及びトレオニンは、任意で脂肪族−ヒドロキシルとして個
別に分類される；（４）芳香族（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）；（５
）アミド（アスパラギン、グルタミン）；及び（６）イオウ含有（システイン及びメチオ
ニン）（Ｓｔｒｙｅｒ（ｅｄ．），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ ｅｄ，ＷＨ Ｆ
ｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，１９８１）として分類することができる。二重特異性分
子の特性を改善するために、異なるクラス間のアミノ酸のアミノ酸残基の置換を伴う非保
存的置換を、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子に行うことがで
きる。ポリペプチド又はその断片のアミノ酸配列の変化が機能相同体をもたらすか否かは
、本明細書に記載のアッセイを用いて、修飾ポリペプチド又は断片が、非修飾いポリペプ
チド又は断片と同様の様式で反応を生じる能力を評価することによって、容易に決定され
得る。１つより多くの置換が起こっているペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を、同
様に容易に試験することができる。

【0138】

本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、例えば標的分
子結合の価数及びその結果として結合力を増加させる手段として、二量体又は多量体とし
て作製され得る。多量体は、例えば、周知の方法を用いてアミノ酸リンカーを含めること
によって、１つ又は２つ以上のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと１つ又は２つ以上のｃ−Ｍ
ｅｔ結合ＦＮ３ドメインとを連結して、ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔのいずれかに対して少な
くとも二重特異性である少なくとも３つの個々のＦＮ３ドメインを含む分子を形成するこ
とによって作製され得る。

【0139】

本発明のもう１つの実施形態は、第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン
と第２のＦＮ３ドメインとを含む二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であり、第１のＦＮ
３ドメインは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合して、ＥＧＦＲに対する
上皮成長因子（ＥＧＦ）の結合を遮断し、第２のＦＮ３ドメインは、肝細胞増殖因子受容
体（ｃ−Ｍｅｔ）に特異的に結合して、ｃ−Ｍｅｔに対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の
結合を遮断し、配列番号５０〜７２、又は１０６に示されるアミノ酸配列を含む分子であ
る。

【0140】

半減期延長部分
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子又は単特異性ＥＧ
ＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメインは、例えば共有的相互作用を介して、他のサブユニッ
トを組み入れてもよい。本発明の１つの態様において、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ
ＦＮ３ドメイン含有分子は、半減期延長部分を更に含む。例示的な半減期延長部分は、
アルブミン、アルブミン結合タンパク質及び／又はドメイン、トランスフェリン及びその
断片及び類似体、並びにＦｃ領域である。例示的なアルブミン結合ドメインは、配列番号
１１７に示される。

【0141】

抗体定常領域の全て又は一部を、本発明の分子に結合させて、抗体様特性、特にＣ１ｑ
結合などのＦｃエフェクター機能、補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、
抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）、貪食、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、Ｂ
ＣＲ）のダウンレギュレーションなどの、Ｆｃ領域に関連する特性を付与してもよく、こ
れらの活性に関与するＦｃにおける残基を修飾することによって更に修飾することができ
る（論評に関しては、Ｓｔｒｏｈｌ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０
，６８５〜６９１，２００９を参照されたい）。

【0142】

本発明の二重特異性分子には、ＰＥＧ５０００又はＰＥＧ２０，０００などのポリエチ
レングリコール（ＰＥＧ）分子、例えばラウリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、ス
テアリン酸エステル、アラキジン酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エステル、
アラキドン酸エステル、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン
二酸などの異なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、ポリリジン、オクタン、炭水化物（
デキストラン、セルロース、オリゴ糖又は多糖）などの更なる部分を、所望の特性を得る
ために組み込むことができる。これらの部分は、タンパク質足場コード配列との直接融合
体であってもよく、標準的なクローニング及び発現技術によって作製してもよい。あるい
は、周知の化学カップリング方法を用いて、組み換え技術によって産生された本発明の分
子にその部分を結合させることができる。

【0143】

周知の方法を用いて、システイン残基を分子のＣ−末端に組み入れて、ＰＥＧ化した基
をシステインに結合させることによって、ＰＥＧ化部分を、例えば、本発明の二重特異性
又は単特異性分子に付加してもよい。Ｃ−末端システインを有する例示的な二重特異性分
子は、配列番号１７０〜１７８に示されるアミノ酸配列を有する分子である。

【0144】

追加の部分を組み入れた本発明の単特異性又は二重特異性分子を、いくつかの周知のア
ッセイによって、機能性に関して比較してもよい。例えば、Ｆｃドメイン及び／又はＦｃ
ドメイン変種を組み入れることにより変化した単特異性及び／又は二重特異性分子特性を
、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、又はＦｃＲｎ受容体などの可溶性型受容
体を用いるＦｃ受容体結合アッセイにおいてアッセイしてもよく、又は例えばＡＤＣＣ若
しくはＣＤＣを測定する周知の細胞系アッセイを用いて、又はインビボモデルにおける本
発明の分子の薬物動態特性を評価してアッセイしてもよい。

【0145】

ポリヌクレオチド、ベクター及び宿主細胞
本発明は、インビトロ転写／翻訳のために使用される直鎖ＤＮＡ配列、その組成物の真
核、原核、又はフィラメントファージ発現、分泌及び／又はディスプレイと適合するベク
ター、又はその定方向変異原を含む、単離ポリヌクレオチドとして、又は発現ベクターの
一部として、又は直鎖ＤＮＡ配列の一部として、本発明のＥＧＦＲ結合若しくはｃ−Ｍｅ
ｔ結合ＦＮ３ドメイン又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子を
コードする核酸を提供する。．特定の例示ポリヌクレオチドが本明細書で開示されるが、
しかしながら、所与の発現システム中の遺伝コードの縮重又はコドン選択性を考えたとき
に、本発明の結合タンパク質をコードする他のポリヌクレオチド、及び本発明のタンパク
質足場のライブラリも、また本発明の範囲内である。

【0146】

本発明の１つの実施形態は、配列番号１８〜２９、１０７〜１１０、又は１２２〜１３
７のアミノ酸配列を有するＥＧＦＲに特異的に結合するＦＮ３ドメインをコードする単離
ポリヌクレオチドである。

【0147】

本発明の１つの態様は、配列番号９７〜９８、又は１６８〜１６９のポリヌクレオチド
配列を含む単離ポリヌクレオチドである。

【0148】

本発明の１つの実施形態は、配列番号３２〜４９、又は１１１〜１１４に示される配列
のアミノ酸配列を有するｃ−Ｍｅｔに特異的に結合するＦＮ３ドメインをコードする単離
ポリヌクレオチドである。

【0149】

本発明の１つの実施形態は、配列番号５０〜７２、１０６、１１８〜１２１、又は１３
８〜１６５のアミノ酸配列を有する二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含
有分子をコードする単離ポリヌクレオチドである。

【0150】

本発明の１つの実施形態は、配列番号１１５〜１１６、又は１６６〜１６７のポリヌク
レオチドを含む単離ポリヌクレオチドである。

【0151】

本発明のポリヌクレオチドは、自動ポリヌクレオチド合成装置での固相ポリヌクレオチ
ド合成などの化学合成により作製され、完全な一本鎖又は二本鎖分子に構築され得る。あ
るいは、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＲに続いて慣用的なクローニングを行うなど
の他の技術により作製され得る。所定の公知の配列のポリヌクレオチドを作製又は得る技
術は、当技術分野で周知である。

【0152】

本発明のポリヌクレオチドは、プロモーター又はエンハンサー配列、イントロン、ポリ
アデニル化シグナル、ＲｅｐＡ結合を促進するｃｉｓ配列等などの、少なくとも１つの非
コード配列を含み得る。ポリヌクレオチド配列はまた、例えば、タンパク質の精製又は検
出を容易にするためのヘキサヒスチジンタグ又はＨＡタグなどのマーカー又はタグ配列、
シグナル配列、ＲｅｐＡ、Ｆｃなどの融合タンパク質パートナー、又はｐＩＸ若しくはｐ
ＩＩＩなどのバクテリオファージコートタンパク質をコードする追加のアミノ酸をコード
する追加の配列も含むことができる。

【0153】

本発明のもう１つの実施形態は、本発明のポリヌクレオチドを少なくとも１つ含むベク
ターである。そのようなベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロ
ウイルス発現ベクター、トランスポゾンに基づいたベクター、又は任意の手段によって所
定の生物又は遺伝子的バックグラウンドに本発明のポリヌクレオチドを導入するのに適し
た他の任意のベクターであり得る。そのようなベクターは、そのようなベクターによって
コードされるポリペプチドの発現を制御、調節、誘発、又は許容することができる核酸配
列エレメントを含む発現ベクターであり得る。このようなエレメントは、転写エンハンサ
ー結合部位、ＲＮＡポリメラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、及び所定の発現系にお
いてコードされたポリペプチドの発現を促進する他の部位を含み得る。このような発現系
は、当該技術分野において公知の細胞に基づく系、又は無細胞系であり得る。

【0154】

本発明のもう１つの実施形態は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。本発明の単
特異性ＥＧＦＲ結合若しくはｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン、又は二重特異性ＥＧＦＲ／
ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、任意で、当技術分野で周知であるように、細胞
株、混合細胞株、不死化細胞、又は不死化細胞のクローン集団によって作製することがで
きる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏ
ｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ（１９８７〜２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．
，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２
ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；Ｈ
ａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；Ｃｏｌｌｉｇ
ａｎ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４〜２０
０１）；Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ
，（１９９７〜２００１）を参照されたい。

【0155】

発現のために選択される宿主細胞は、哺乳動物起源であり得るか、又はＣＯＳ−１、Ｃ
ＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅ Ｇ２、６５３、ＳＰ
２／０、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫若しくは植物細胞、又はその任意の誘
導体、不死化若しくは形質転換細胞から選択され得る。あるいは、宿主細胞は、ポリペプ
チドをグリコシル化することができない種又は生物、例えば、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ
３）、ＢＬ２１−ＧＯＬＤ（ＤＥ３）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＪＭ１０９、ＨＭＳ１７４、
ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、及び天然若しくは改変大腸菌種（E. coli spp）、クレブシエ
ラ種（Klebsiella spp）、又はシュードモナス種（Pseudomonas spp）の菌株などの原核
細胞又は生物から選択され得る。

【0156】

本発明の別の実施形態は、ＥＧＦＲ若しくはｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する単離ＦＮ３
ドメイン、又は単離二重特異性ＥＧＦＲ−ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子が発現さ
れる条件で、本発明の単離宿主細胞を培養することと、ドメイン又は分子を精製すること
とを含む、ＥＧＦＲ若しくはｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する本発明の単離ＦＮ３ドメイン
、又は本発明の単離二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子を作製す
る方法である。

【0157】

ＥＧＦＲ若しくはｃ−Ｍｅｔに特異的に結合するＦＮ３ドメイン又は本発明の単離二重
特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、周知の方法、例えばプロテイ
ンＡ精製、硫酸アンモニウム、又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン若しくは陽イオン
交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマ
トグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフ
ィー、及びレクチンクロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
によって、組み換え型細胞培養から精製することができる。

【0158】

本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子及びＥＧＦＲ結合
若しくはｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの使用
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合Ｆ
Ｎ３ドメイン、若しくはｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、ヒト疾患又は細胞、組織、臓
器、体液、若しくは一般的に宿主における特定の病態を診断、モニター、調節、処置、軽
減、発生を予防するために役立つ、又は症状を低減するために用いられ得る。本発明の方
法を用いて任意の分類に属する動物患者を治療することができる。このような動物の例と
しては、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、及び家畜などの哺乳動物が挙げられる。

【0159】

本発明の１つの態様は、本発明の単離二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイ
ン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン若しくはｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインに細胞
を接触させることを含む、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔを発現する細胞の増殖又は繁殖
を阻害する方法である。

【0160】

本発明のもう１つの態様は、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔ発現腫瘍又はがん細胞の増
殖又は転移が阻害されるように、本発明の単離二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３
ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン若しくはｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン
の有効量を対象に投与することを含む、対象におけるＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔ発現
腫瘍又はがん細胞の増殖又は転移を阻害する方法である。

【0161】

本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合Ｆ
Ｎ３ドメイン若しくはｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦ
、又は他のＥＧＦＲリガンド又はＨＧＦの異常な活性化又は産生を特徴とする任意の疾患
若しくは障害、又は悪性疾患若しくはがんを伴ってもよく又は伴わなくてもよいＥＧＦＲ
若しくはｃ−Ｍｅｔ発現に関連する障害、を処置するために用いることができ、ＥＧＦＲ
、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦ、又は他のＥＧＦＲリガンド、又はＨＧＦの異常な活性化及び／又
は産生は、疾患又は障害を有する又はその素因を有する対象の細胞又は組織に存在する。

【0162】

本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、がん及び良性
腫瘍を含む腫瘍の処置のために用いられ得る。本発明の二重特異性分子による処置に対し
て感受性があるがんには、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔを過剰発現するがんが挙げられ
る。本発明の二重特異性分子による処置に対して感受性がある例示的ながんには、上皮細
胞がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肺腺がん、結腸直
腸がん、肛門がん、前立腺がん、腎臓がん、膀胱がん、頭頚部がん、卵巣がん、膵臓がん
、皮膚がん、口腔がん、食道がん、膣がん、子宮頚がん、脾臓のがん、精巣がん、胃がん
、胸腺のがん、結腸がん、甲状腺がん、肝臓がん、又は散発性若しくは遺伝性の乳頭状腎
細胞がん（ＰＲＣＣ）が挙げられる。

【0163】

ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合して、ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を遮断する本発明の
ＦＮ３ドメインは、がん及び良性腫瘍を含む腫瘍の処置のためであり得る。本発明のｃ−
Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインによる処置に対して感受性があるがんには、ｃ−Ｍｅｔを過剰
発現するがんが挙げられる。本発明のＦＮ３ドメインによる処置に対して感受性がある例
示的ながんには、上皮細胞がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、結腸直腸がん、肛門がん、
前立腺がん、腎臓がん、膀胱がん、頭頚部がん、卵巣がん、膵臓がん、皮膚がん、口腔が
ん、食道がん、膣がん、子宮頚がん、脾臓のがん、精巣がん、及び胸腺のがんが挙げられ
る。

【0164】

ＥＧＦＲに特異的に結合して、ＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合を遮断する本発明のＦＮ
３ドメインは、がん及び良性腫瘍を含む腫瘍の処置のために用いられ得る。本発明のＦＮ
３ドメインによる処置に対して感受性があるがんには、ＥＧＦＲ又は変種を過剰発現する
がんが挙げられる。本発明のＦＮ３ドメインによる処置に対して感受性がある例示的なが
んには、上皮細胞がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、結腸直腸がん、肛門がん、前立腺が
ん、腎臓がん、膀胱がん、頭頚部がん、卵巣がん、膵臓がん、皮膚がん、口腔がん、食道
がん、膣がん、子宮頚がん、脾臓のがん、精巣がん、及び胸腺のがんが挙げられる。

【0165】

投与／医薬組成物
治療的用途に関して、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有
分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、医薬的に許容
される担体中で活性成分としてドメイン又は分子の有効量を含む医薬組成物として調製さ
れ得る。用語「担体」は、それと共に活性化合物が投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、
又はビヒクルを指す。そのようなビヒクルは、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等の、石
油、動物、植物、又は合成起源のものを含む、水及び油などの液体であってよい。例えば
、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを用いることができる。これらの溶液は滅菌
され、一般には粒子状物質を含まない。これらは、通常の周知の滅菌技術（例えば、濾過
）によって滅菌することができる。組成物は、生理的条件に近づけるために必要とされる
製薬上許容される補助物質、例えばｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、滑剤及び
着色剤等を含むことができる。そのような医薬製剤中の本発明の分子の濃度は幅広く変化
してよく、すなわち約０．５重量％未満、通常は約１重量％又は少なくとも約１重量％か
ら最大で１５又は２０重量％まで変化してもよく、また、選択される特定の投与様式に従
って、主として必要とされる用量、液体の体積、粘度等に基づいて選択される。好適なビ
ヒクル、及び他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む製剤は、例えば、Ｒ
ｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａ
ｒｍａｃｙ，２１^ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔ
ｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ ２
００６，Ｐａｒｔ ５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ
ｐｐ ６９１〜１０９２に記載され、特にｐｐ．９５８〜９８９を参照されたい。

【0166】

本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合Ｆ
Ｎ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの治療用途のための投与様式は、非経口
投与、例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、又は皮下、肺、経粘膜（口腔、鼻内、膣内
、直腸）などの、宿主に作用物質を送達する任意の適した経路であり得て、錠剤、カプセ
ル剤、液剤、粉剤、ゲル剤、粒剤中での製剤を用いて、シリンジ、植え込みデバイス、浸
透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプ、又は当技術分野で周知の、当業者によって
認識される他の手段に含まれ得る。部位特異的投与は、例えば、関節内、気管支内、腹内
、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋
内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内
、脊髄内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、血管内、膀胱内、病巣内、膣内、直腸、口腔内、
舌下、鼻腔内、又は経皮送達によって達成され得る。

【0167】

したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝水、及び約１ｎ
ｇ〜約１００ｍｇ、例えば約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ、又はより好ましくは約５ｍｇ〜約２
５ｍｇの本発明のＦＮ３ドメインを含むように調製することができる。同様に、静脈内注
入用の本発明の医薬組成物は、約２５０ｍｌの滅菌リンゲル液と、約１ｍｇ〜約３０ｍｇ
、例えば約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメ
イン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン、又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを含む
ように構成することができる。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の方法が周
知であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ」、１５ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅ
ａｓｔｏｎ，ＰＡに、より詳細に記載されている。

【0168】

本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合Ｆ
Ｎ３ドメイン、又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、保存のために凍結乾燥して、使用
前に適した担体中で溶解することができる。この技術は、通常のタンパク調製物に関して
有効であることが示されており、当該技術分野で公知の凍結乾燥法及び溶解技術を用いる
ことができる。

【0169】

本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合Ｆ
Ｎ３ドメイン、又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを、対象に１回投与してもよく、又は
投与を、例えば１日後、２日後、３日後、５日後、６日後、１週間後、２週間後、３週間
後、１か月後、５週間後、６週間後、７週間後、２か月後、又は３か月後に繰り返しても
よい。反復投与は、同じ用量又は異なる用量で行うことができる。投与は、１回、２回、
３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、又はそれより多く繰り返してもよ
い。

【0170】

二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメ
イン、又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、第２の治療物質と併用して、同時に、連続
的に、又は個別に投与され得る。第２の治療物質は、化学療法剤、抗血管新生剤、又は細
胞障害剤であり得る。がんを処置するために使用するとき、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍ
ｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン、又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ
３ドメインは、手術、放射線療法、化学療法、又はその併用などの通常のがん治療と組み
合わせて用いられ得る。本発明のＦＮ３ドメインと併用して用いることができる例示的な
作用物質は、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＶＥＧＦのアンタゴニスト、並びにＩｒｅ
ｓｓａ（登録商標）（ゲフィチニブ）及びＴａｒｃｅｖａ（エルロチニブ）などのタンパ
ク質チロシンキナーゼ阻害剤である。

【0171】

本発明は一般論として記述されてきているが、本発明の実施形態は、特許請求の範囲を
限定するように解釈されるべきではない以下の実施例で更に開示される。

【実施例】

【0172】

実施例１．Ｔｅｎｃｏｎライブラリの構築
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）は、ヒトテナシン−Ｃからの１５個のＦＮ３ドメインのコ
ンセンサス配列から設計された、免疫グロブリン様足場構造のフィブロネクチンＩＩＩ型
（ＦＮ３）ドメインである（Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎ
ｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５：１０７〜１１７，２
０１２；米国特許出願公開第２０１０／０２１６７０８号）。Ｔｅｎｃｏｎの結晶構造は
、７個のβ鎖をつなぐ６回表面露出ループを示す。これらのループ又は各ループ内の選択
された残基を無作為化して、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのライブラリ
を構築することができ、このライブラリを用いて特異的標的に結合する新規分子を選択す
ることができる。

【0173】

Ｔｅｎｃｏｎ
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥ
ＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲ
ＳＮＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１）

【0174】

ＴＣＬ１ライブラリの構築
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）のＦＧループのみを無作為化するように設計されたライブ
ラリＴＣＬ１を、ｃｉｓディスプレイシステムで用いるために構築した（Ｊａｃｏｂｓ
ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｓｅ
ｌｅｃｔｉｏｎ，２５：１０７〜１１７，２０１２）。このシステムにおいて、Ｔａｃプ
ロモーター、Ｔｅｎｃｏｎライブラリコード配列、ＲｅｐＡコード配列、ｃｉｓエレメン
ト、及びｏｒｉエレメントの配列を組み入れる一本鎖ＤＮＡを作製する。インビトロ転写
／翻訳系で発現させると、それがコードされるＤＮＡに対してｃｉｓで結合したＴｅｎｃ
ｏｎ−ＲｅｐＡ融合タンパク質の複合体が産生される。次に、標的分子に結合する複合体
を単離して、以下に記述されるようにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅する
。

【0175】

ｃｉｓディスプレイで用いるためのＴＣＬ１ライブラリの構築は、ＰＣＲの連続ラウン
ドによって得られ、最終的に直鎖状の二本鎖ＤＮＡ分子が二等分して産生された；５’断
片は、プロモーターとＴｅｎｃｏｎ配列とを含むが、３’断片はｒｅｐＡ遺伝子とｃｉｓ
及びｏｒｉエレメントとを含む。これらの二等分分子を制限酵素消化によって結合させて
、完全な構築物を産生する。ＴＣＬ１ライブラリは、ＴｅｎｃｏｎのＦＧループ、ＫＧＧ
ＨＲＳＮ（配列番号８６）のみに無作為アミノ酸を組み入れるように設計された。このラ
イブラリの構築にＮＮＳコドンを用い、それによって２０個全てのアミノ酸と１つの終止
コドンがＦＧループにおそらく組み入れられた。ＴＣＬ１ライブラリは、多様性を更に増
加させるために、それぞれが異なる長さの、７〜１２残基の無作為化ＦＧループを有する
、６個の個別のサブライブラリを含む。Ｔｅｎｃｏｎに基づくライブラリの設計を表２に
示す。

【0176】

【表2】

^＊ＴＡＰＤＡＡＦＤ：配列番号１の残基２２〜２８
^＊＊ＫＧＧＨＲＳＮ：配列番号８６
Ｘは、ＮＮＳコドンによってコードされる縮重アミノ酸を指す。
＃は、本文に記述される「設計されたアミノ酸分布」を指す。

【0177】

ＴＣＬ１ライブラリを構築するために、連続ラウンドのＰＣＲを行ってＴａｃプロモー
ターを付加して、ＦＧループに縮重を作製し、最終的なアセンブリのために必要な制限部
位を付加した。第一に、ＦＧループの５’でプロモーター配列及びＴｅｎｃｏｎ配列を含
むＤＮＡ配列を、２段階のＰＣＲによって作製した。完全なＴｅｎｃｏｎ遺伝子配列に対
応するＤＮＡをＰＣＲ鋳型として、プライマーＰＯＰ２２２０（配列番号２）及びＴＣ５
’ｔｏＦＧ（配列番号３）と共に用いた。この反応から得られたＰＣＲ産物を、プライマ
ー１３０ｍｅｒ（配列番号４）及びＴｃ５’ｔｏＦＧと共に次のラウンドのＰＣＲ増幅の
鋳型として用いて、Ｔｅｎｃｏｎに対する５’及びプロモーターの付加を完了した。次に
、第一段階で産生されたＤＮＡ産物を縮重ヌクレオチドを含むフォワードプライマーＰＯ
Ｐ２２２２（配列番号５）、及びリバースプライマーＴＣＦ７（配列番号６）、ＴＣＦ８
（配列番号７）、ＴＣＦ９（配列番号８）、ＴＣＦ１０（配列番号９）、ＴＣＦ１１（配
列番号１０）、又はＴＣＦ１２（配列番号１１）によって、増幅することによって、多様
性をＦ：Ｇループに導入した。ＰＣＲサイクルを最少にして、ライブラリの多様性を最大
にするために、それぞれのサブライブラリに関して、１００μＬのＰＣＲ反応を少なくと
も８回実施した。このＰＣＲ産物少なくとも５μｇを、ゲル精製して、プライマーＰＯＰ
２２２２（配列番号５）及びＰＯＰ２２３４（配列番号１２）による次のＰＣＲ段階に用
い、Ｔｅｎｃｏｎ配列の３’末端に６×Ｈｉｓタグ及びＮｏｔＩ制限部位が付加された。
このＰＣＲ反応は、わずか１５回のＰＣＲサイクル及び鋳型ＤＮＡ少なくとも５００ｎｇ
を用いて行われた。得られたＰＣＲ産物をゲル精製して、ＮｏｔＩ制限酵素によって消化
して、Ｑｉａｇｅｎカラムで精製した。

【0178】

ライブラリの３’断片は、ＰｓｐＯＭＩ制限部位、ｒｅｐＡ遺伝子のコード領域、並び
にｃｉｓ及びｏｒｉエレメントを含む、ディスプレイのためのエレメントを含む一定のＤ
ＮＡ配列である。ＰＣＲ反応は、Ｍ１３フォワードプライマー及びＭ１３リバースプライ
マーと共にこのＤＮＡ断片を含むプラスミド（ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ）を用いて行った。得られたＰＣＲ産物を、ＰｓｐＯＭＩで終夜消化して、ゲル精製
した。ライブラリＤＮＡの５’部分をｒｅｐＡ遺伝子を含む３’ＤＮＡにライゲートする
ために、５’ＤＮＡの２ｐｍｏｌを、ＮｏｔＩ及びＰｓｐＯＭＩ酵素並びにＴ４リガーゼ
の存在下で３’ｒｅｐＡ ＤＮＡの等モル量にライゲートした。３７℃で終夜ライゲーシ
ョン後、ライゲートしたＤＮＡの少量をゲルに載せてライゲーション効率をチェックした
。ライゲートしたライブラリ産物を、１２のＰＣＲ増幅に分けて、プライマー対ＰＯＰ２
２５０（配列番号１３）及びＤｉｄＬｉｇＲｅｖ（配列番号１４）を用いて１２サイクル
のＰＣＲ反応を行った。ＴＣＬ１ライブラリの各サブライブラリに関するＤＮＡの収率は
、３２〜３４μｇの範囲であった。

【0179】

ライブラリの品質を評価するために、ワーキングライブラリの少量を、プライマーＴｃ
ｏｎ５ｎｅｗ２（配列番号１５）及びＴｃｏｎ６（配列番号１６）によって増幅して、リ
ガーゼ非依存的クローニングにより改変ｐＥＴベクターにおいてクローニングした。プラ
スミドＤＮＡをＢＬ２１−ＧＯＬＤ（ＤＥ３）コンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
）に形質転換して、無作為に採取したコロニー９６個をＴ７プロモータープライマーを用
いてシークエンシングした。同一の配列は認められなかった。全体的に、フレームシフト
変異を有することなく完全なプロモーター及びＴｅｎｃｏｎコード配列を有したのは、ク
ローンのおよそ７０〜８５％であった。終止コドンを有するクローンを除く機能的配列の
割合は、５９％〜８０％であった。

【0180】

ＴＣＬ２ライブラリの構築
ＴｅｎｃｏｎのＢＣ及びＦＧループの両方が無作為化されて、それぞれの位置でのアミ
ノ酸の分布が厳密に制御されているＴＣＬ２ライブラリを構築した。表３は、ＴＣＬ２ラ
イブラリにおける所望のループ位置でのアミノ酸分布を示す。設計されたアミノ酸分布は
２つの目的を有した。第一に、ライブラリを、Ｔｅｎｃｏｎ結晶構造の解析及び／又はホ
モロジーモデリングに基づいて、Ｔｅｎｃｏｎのフィールディング及び安定性にとって構
造的に重要となると予測される残基に向けて偏らせた。例えば、２９番目の位置は、Ｔｅ
ｎｃｏｎが折り畳まれた際に疎水性コアの中に埋もれることから、疎水性アミノ酸のサブ
セットのみとなるように固定した。第二の設計は、高親和性結合体を効率よく産生するた
めに、抗体の重鎖ＨＣＤＲ３に選択的に認められる残基の分布となるようにアミノ酸分布
を偏らせることを含んだ（（Ｂｉｒｔａｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ
３７７：１５１８〜２８，２００８；Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃ
ｉ １６：４７６〜８４，２００７）。この目標に向かって、表３の「設計された分布」
は、以下の分布を指す：６％アラニン、６％アルギニン、３．９％アスパラギン、７．５
％アスパラギン酸、２．５％グルタミン酸、１．５％グルタミン、１５％グリシン、２．
３％ヒスチジン、２．５％イソロイシン、５％ロイシン、１．５％リジン、２．５％フェ
ニルアラニン、４％プロリン、１０％セリン、４．５％トレオニン、４％トリプトファン
、１７．３％チロシン、及び４％バリン。この分布には、メチオニン、システイン、及び
終止コドンが含まれない。

【0181】

【表3】

^＊残基の番号は、配列番号１のＴｅｎｃｏｎ配列に基づく。

【0182】

ＴＣＬ２ライブラリの５’断片は、プロモーターと、ライブラリのプールとして化学合
成された（Ｓｌｏｎｉｎｇ Ｂｉｏｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１
）のコード配列とを含んだ。このＤＮＡプールは、少なくとも１×１０^１１個の異なるメ
ンバーを含んだ。ＲｅｐＡとのライゲーションのために、断片の末端で、ＢｓａＩ制限部
位を設計に含めた。

【0183】

ライブラリの３’断片は、６×Ｈｉｓタグ、ｒｅｐＡ遺伝子のコード領域、及びｃｉｓ
エレメントを含む、ディスプレイのためのエレメントを含む一定のＤＮＡ配列であった。
ＤＮＡを、既存のＤＮＡ鋳型（上記）及びプライマーＬＳ１００８（配列番号１７）及び
ＤｉｄＬｉｇＲｅｖ（配列番号１４）を用いて、ＰＣＲ反応によって調製した。完全なＴ
ＣＬ２ライブラリをアセンブルするために、ＢｓａＩ消化５’ＴｅｎｃｏｎライブラリＤ
ＮＡの全体で１μｇを、同じ酵素による制限消化によって調製した３’断片３．５μｇに
ライゲートした。終夜ライゲーションの後、ＤＮＡをＱｉａｇｅｎカラムによって精製し
て、２６０ｎｍでの吸光度を測定することによってＤＮＡを定量した。ライゲートしたラ
イブラリ産物を、プライマー対ＰＯＰ２２５０（配列番号１３）及びＤｉｄＬｉｇＲｅｖ
（配列番号１４）を用いて１２サイクルのＰＣＲ反応によって増幅した。それぞれがライ
ゲートしたＤＮＡ産物５０ｎｇを鋳型として含む、全体で７２回の反応を行った。ＴＣＬ
２ワーキングライブラリＤＮＡの総収率は、約１００μｇであった。ライブラリＴＣＬ１
に関して先に記述したように、少量のワーキングライブラリをサブクローニングして、シ
ークエンシングした。同一の配列は認められなかった。フレームシフト変異を有すること
なく完全なプロモーター及びＴｅｎｃｏｎコード配列を含んだのは、配列の約８０％であ
った。

【0184】

ＴＣＬ１４ライブラリの構築
上部（ＢＣ、ＤＥ、及びＦＧ）及び下部（ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦ）ループ、例えば、Ｆ
Ｎ３ドメインにおける報告された結合表面は、ＦＮ３構造の中心を形成するβ鎖によって
分離される。ループのみによって形成された表面とは異なる形状を有するＦＮ３ドメイン
の２つの「側面」に存在する代替表面を、ＦＮ３ドメインの１つの側面で２つの逆平行β
鎖、すなわちＣ鎖とＦβ鎖、及びＣＤループとＦＧループによって形成して、本明細書に
おいて以降Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面と呼ぶ。

【0185】

Ｔｅｎｃｏｎの代替表面を無作為化するライブラリは、図４に示されるように、Ｃ鎖と
Ｆ鎖の表面露出残基並びにＣＤ及びＦＧループの一部を無作為に選択することによって作
製した。Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）と比較して以下の置換を有するＴｅｎｃｏｎ変種、
Ｔｅｎｃｏｎ２７（配列番号９９）を用いて、ライブラリを作製した：Ｅ１１Ｒ、Ｌ１７
Ａ、Ｎ４６Ｖ、Ｅ８６Ｉ。このライブラリを構築するために用いた方法の詳細な記述は、
米国特許出願第１３／８５２，９３０号に記述される。

【0186】

実施例２：ＥＧＦＲに結合してＥＧＦ結合を阻害するフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ
３）ドメインの選択
ライブラリのスクリーニング
ｃｉｓディスプレイを用いて、ＴＣＬ１及びＴＣＬ２ライブラリからＥＧＦＲ結合ドメ
インを選択した。ＩｇＧ１ Ｆｃに融合したＥＧＦＲの組み換え型ヒト細胞外ドメイン（
Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、標準的な方法を用いてビオチニル化して、これをパニング
のために用いた（配列番号７３の完全長ＥＧＦＲの２５〜６４５番目の残基）。インビト
ロ転写及び翻訳（ＩＴＴ）に関して、ライブラリＤＮＡ ２〜６μｇを０．１ｍＭ ｃｏ
ｍｐｌｅｔｅアミノ酸、１×Ｓ３０プレミクス成分、及びＳ３０抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ
）３０μＬと共に全量１００μＬ中で３０℃でインキュベートした。１時間後、ブロッキ
ング溶液（２％ウシ血清アルブミン、１００μｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡ、及び１ｍｇ／
ｍＬヘパリンを添加したＰＢＳ、ｐＨ７．４）４５０μＬを添加して、反応を氷中で１５
分間インキュベートした。ＥＧＦＲ−Ｆｃ：ＥＧＦ複合体は、ブロッキング溶液中で組み
換え型ヒトＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とビオチニル化組み換え型ＥＧＦＲ−Ｆｃ
とを、室温で１時間混合することによって、ＥＧＦＲ対ＥＧＦのモル比１：１及び１０：
１でアセンブルされた。結合に関して、ブロックされたＩＴＴ反応物５００μＬをＥＧＦ
Ｒ−Ｆｃ：ＥＧＦ複合体１００μＬと混合して、室温で１時間インキュベートした後、結
合した複合体をニュートラアビジン又はストレプトアビジン磁気ビーズによって吸引した
。非結合ライブラリメンバーを、ＰＢＳＴ及びＰＢＳで連続的に洗浄することによって除
去した。洗浄後、６５℃に１０分間加熱することによって、結合した複合体からＤＮＡを
溶出させ、ＰＣＲによって増幅し、更なるパニングラウンドのために制限酵素消化及びラ
イゲーションによってＲｅｐＡをコードするＤＮＡ断片に結合させた。各ラウンドにおい
て、標的ＥＧＦＲ−Ｆｃの濃度を２００ｎＭから５０ｎＭへと連続的に低下させて、洗浄
のストリンジェンシーを増加させることによって、高親和性結合体を単離した。ラウンド
４及び５において、非結合及び弱く結合したＦＮ３ドメインを、ＰＢＳ中で１０倍モル過
剰量の非ビオチニル化ＥＧＦＲ−Ｆｃの存在下で終夜洗浄することによって除去した。

【0187】

パニング後、選択したＦＮ３ドメインをオリゴＴｃｏｎ５ｎｅｗ２（配列番号１５）及
びＴｃｏｎ６（配列番号１６）を用いてＰＣＲによって増幅し、リガーゼ非依存的クロー
ニングサイトを含めるように改変されたｐＥＴベクターにサブクローニングして、標準的
な分子生物学技術を用いて大腸菌において可溶性で発現させるためにＢＬ２１−ＧＯＬＤ
（ＤＥ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）細胞に形質転換した。精製及び検出を可能にするた
めに、Ｃ−末端ポリヒスチジンタグをコードする遺伝子配列を、各ＦＮ３ドメインに付加
した。１ｍＬの９６ウェルブロックにおいて、１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを添加し
た２ＹＴ培地中で、培養物を３７℃で吸光度が０．６〜０．８となるまで増殖させた後、
ＩＰＴＧを１ｍＭとなるように添加し、その時点で温度を３０℃に低下させた。およそ１
６時間後に細胞を遠心沈降させて回収し、−２０℃で凍結した。各ペレットをＢｕｇＢｕ
ｓｔｅｒ（登録商標）ＨＴ溶解緩衝液（Ｎｏｖａｇｅｎ ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ）０．６ｍＬ中で、室温で４５分間振とうさせながらインキュベートすることによって
細胞溶解物を得た。

【0188】

細胞上でＥＧＦＲに結合するＦＮ３ドメインの選択
より生理的な意味で異なるＦＮ３ドメインのＥＧＦＲ結合能を評価するために、そのＡ
４３１細胞結合能を測定した。Ａ４３１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，カタログ番号ＣＲＬ−１５５５）は、約２×１０^６個の受
容体／細胞でＥＧＦＲを過剰発現する。細胞を不透明な黒色９６ウェルプレートに５，０
００個／ウェルで播種して、３７℃の湿潤５％ ＣＯ_２環境で終夜接着させた。ＦＮ３ド
メイン発現細菌溶解物をＦＡＣＳ染色緩衝液（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中で
１，０００倍希釈して、同じプレートを３枚作製して室温で１時間インキュベートした。
溶解物を除去して、細胞を、１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ染色緩衝液によって３回洗浄
した。細胞を、ＦＡＣＳ染色緩衝液中で１：１００に希釈した抗ペンタＨｉｓ−Ａｌｅｘ
ａ ４８８抗体コンジュゲート（Ｑｉａｇｅｎ）５０μＬ／ウェルと共に室温で２０分間
インキュベートした。細胞を１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ染色緩衝液によって３回洗浄
した後、ウェルにＦＡＣＳ染色緩衝液１００μＬを満たし、Ａｃｕｍｅｎ ｅＸ３リーダ
ーを用いて４８８ｎｍで蛍光を読み取った。ＦＮ３ドメインを含む細菌溶解物を、そのＡ
４３１細胞結合能に関してスクリーニングし（ＴＣＬ１及びＴＣＬ２ライブラリに関して
１３２０個の粗細菌溶解物）、結合がバックグラウンドシグナルより１０倍以上高い陽性
クローンが５１６個同定された。ＴＣＬ１４ライブラリからの溶解物３００個を、結合に
関してスクリーニングし、ＥＧＦＲに結合する独自のＦＮ３ドメイン配列５８個が得られ
た。

【0189】

細胞上でＥＧＦＲに対するＥＧＦ結合を阻害するＦＮ３ドメインの選択
ＥＧＦＲ結合の作用機序の特徴をよりよく調べるために、同定された様々なＦＮ３ドメ
インクローンのＥＧＦＲ結合能を、Ａ４３１細胞を用いてＥＧＦ競合的に測定し、Ａ４３
１結合アッセイスクリーニングと同時に行った。Ａ４３１細胞を不透明な黒色９６ウェル
プレートに５，０００個／ウェルで播種して、３７℃の湿潤５％ ＣＯ_２環境で終夜接着
させた。細胞を、５０μＬ／ウェルの１：１，０００倍希釈した細菌溶解物と共に、同じ
プレートを３枚作製して室温で１時間インキュベートした。ビオチニル化ＥＧＦ（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｅ−３４７７）を、最終濃度３０ｎｇ／ｍＬとなるように
各ウェルに添加して、室温で１０分間インキュベートした。細胞を、１５０μＬ／ウェル
のＦＡＣＳ染色緩衝液によって３回洗浄した。細胞を、ＦＡＣＳ染色緩衝液中で１：１０
０に希釈したストレプトアビジン−フィコエリスリンコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ）５０μＬ／ウェルと共に室温で２０分間インキュベートした。細胞を１５０μＬ／
ウェルのＦＡＣＳ染色緩衝液によって３回洗浄した後、ウェルにＦＡＣＳ染色緩衝液１０
０μＬを満たし、Ａｃｕｍｅｎ ｅＸ３リーダーを用いて６００ｎｍで蛍光を読み取った
。

【0190】

ＦＮ３ドメインを含む細菌溶解物を、上記のＥＧＦ競合アッセイにおいてスクリーニン
グした。ＴＣＬ１及びＴＣＬ２ライブラリに関して１３２０個の粗細菌溶解物をスクリー
ニングして、ＥＧＦ結合を５０％超阻害する陽性クローンを４５１個同定した。

【0191】

同定されたＦＮ３ドメイン結合ＥＧＦＲの発現及び精製
ＨｉｓタグＦＮ３ドメインを Ｈｉｓ ＭｕｌｔｉＴｒａｐ（商標）ＨＰプレート（Ｇ
Ｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって澄明化大腸菌溶解物から精製して、２０ｍＭリン酸
ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、及び２５０ｍＭイミダゾールを含むｐＨ７．４
の緩衝液で溶出した。精製試料を、ＰＤ ＭｕｌｔｉＴｒａｐ（商標）Ｇ−２５プレート
（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる分析のために、ｐＨ７．４のＰＢＳに交換した
。

【0192】

サイズ排除クロマトグラフィー分析
サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、ＥＧＦＲに結合するＦＮ３ドメインの凝集状
態を決定した。各精製ＦＮ３ドメインのアリコート（１０μＬ）をＳｕｐｅｒｄｅｘ ７
５ ５／１５０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に流速０．３ｍＬ／分でｐＨ７．
４のＰＢＳを移動相として注入した。カラムからの溶出を、２８０ｎｍの吸光度によって
モニターした。ＳＥＣによって高レベルの凝集を示したセンチリンを更なる分析から除外
した。

【0193】

ＥＧＦＲ−Ｆｃからの選択されたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのオフレート
選択したＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインをスクリーニングして、高親和性結合体の選択を
容易にするために、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ−３６機器（ＢｉｏＲａｄ）においてＥＧＦ
Ｒ−Ｆｃに対する結合の遅いオフレート（ｋ_ｏｆｆ）を示すドメインを同定した。ヤギ抗
ヒトＦｃ ＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、チップ上の水平方向の６本全てのリガ
ンド流路において５μｇ／ｍＬの濃度で、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ
中で流速３０μＬ／分でアミンカップリング（ｐＨ５．０）によって直接固定した。固定
密度は、平均で約１５００応答単位（ＲＵ）であり、異なる流路間の変動は５％未満であ
った。ＥＧＦＲ−Ｆｃは、垂直のリガンド方向で、密度およそ６００ＲＵで抗ヒトＦｃ
ＩｇＧ表面上で捕捉された。試験したＦＮ３ドメインを全て、１μＭの濃度に標準化して
、その水平方向の結合に関して試験した。スクリーニングの処理能力を最大にするために
、ＦＮ３ドメインに関して６本全てのアナライト流路を用いた。解離相を、１００μＬ／
分の流速で１０分間モニターした。スポット間結合シグナルを、アナライトと固定された
ＩｇＧ表面との間の非特異的結合をモニターするための参照として用いて、すべての結合
反応から差し引いた。処理された結合データを１：１の単純なラングミュア結合モデルに
局所的にフィットさせて、捕捉されたＥＧＦＲ−Ｆｃに対するそれぞれのＦＮ３ドメイン
の結合のｋ_ｏｆｆを引き出した。

【0194】

ＥＧＦ刺激ＥＧＦＲリン酸化の阻害
精製ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを、Ａ４３１細胞におけるＥＧＦＲのＥＧＦ刺激リン
酸化の阻害能に関して１つの濃度で試験した。ＥＧＦＲのリン酸化を、ＥＧＦＲ ｐｈｏ
ｓｐｈｏ（Ｔｙｒ１１７３）キット（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を用
いてモニターした。細胞を、透明な９６ウェル組織培養処置プレート（Ｎｕｎｃ）におい
て１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）と共にＧｌｕｔａｍａｘ（商標）を含む
ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）１００μＬ／ウェル中で２０，０００個／ウェルで播種し、
３７℃の湿潤５％ ＣＯ_２環境で終夜接着させた。培養培地を完全に除去して、細胞を３
７℃の湿潤５％ ＣＯ_２環境で、ＦＢＳを含まない培地１００μＬ／ウェル中で終夜枯渇
させた。次に、細胞を、湿潤５％ ＣＯ_２環境で、濃度２μＭのＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメ
インを含む予め加温した（３７℃）枯渇培地１００μＬ／ウェルによって３７℃で１時間
処置した。対照は、枯渇培地のみで処置した。最終濃度が５０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦとなる
ように１００ｎｇ／ｍＬ組み換え型ヒトＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号
２３６−ＥＧ）及び１μＭ ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを含む予め加温した（３７℃）
枯渇培地１００μＬ／ウェルを添加して軽く混合し、３７℃、５％ ＣＯ_２で１５分間イ
ンキュベートすることにより、細胞を刺激した。一組の対照ウェルは、陰性対照として刺
激しないままであった。培地を完全に除去して、細胞を、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ溶解緩衝液（
Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）１００μＬ／ウェルによって、製造元の指
示に従って、室温で振とうさせながら１０分間溶解した。１１７３番目のチロシンでリン
酸化されたＥＧＦＲを測定するように構成されたアッセイプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌ
ｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を、製造元の指示に従って提供されたブロッキング溶液によっ
て室温で１．５〜２時間ブロックした。プレートを、１Ｘ Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液（Ｍｅｓ
ｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）２００μＬ／ウェルによって４回洗浄した。細胞
溶解物のアリコート（３０μＬ／ウェル）をアッセイプレートに移し、これをプレート密
封フィルム（ＶＷＲ）で覆い、振とうさせながら室温で１時間インキュベートした。アッ
セイプレートをＴｒｉｓ洗浄緩衝液２００μＬ／ウェルで４回洗浄した後、氷冷検出抗体
溶液（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）２５μＬを、気泡を入れないように
注意して各ウェルに添加した。プレートを振とうさせながら室温で１時間インキュベート
した後、Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液２００μＬ／ウェルによって４回洗浄した。読み取り緩衝液
（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）１５０μＬ／ウェルを添加して、製造元
がインストールしたアッセイ特異的デフォルト設定を用いてＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｉ
ｍａｇｅｒ ６０００機器（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で読み取るこ
とにより、シグナルを検出した。ＥＧＦ刺激陽性対照シグナルの％阻害を、各ＥＧＦＲ結
合ＦＮ３ドメインに関して計算した。

【0195】

ＥＧＦ刺激ＥＧＦＲリン酸化の阻害を、ＴＣＬ１及びＴＣＬ２ライブラリから同定され
た２３２個のクローンに関して測定した。これらのクローンのうち２２個が、１μＭの濃
度でＥＧＦＲのリン酸化を５０％以上阻害した。発現が不良であるか、又はサイズ排除ク
ロマトグラフィーにより多量体であると判断されたクローンを除去した後、クローン９個
を、更に物理学的に特徴を調べるために先に進めた。これらのクローンのＢＣ及びＦＧル
ープ配列を表４に示す。選択された９個のクローン中８個が、共通のＦＧループ配列（Ｈ
ＮＶＹＫＤＴＮＭＲＧＬ；配列番号９５）を有し、いくつかのクローンではそのＢＣルー
プ配列に有意な類似性領域が認められた。

【0196】

【表4】

【0197】

実施例３：ＥＧＦ結合を阻害するＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの特徴づけ
大規模発現、精製、及びエンドトキシンの除去
表４に示された９個のＦＮ３ドメインを、詳細な特徴づけのためにより多くの材料を提
供するよう規模を拡大した。各ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン変種を含む終夜培養物を用い
て、終夜培養物を１／８０希釈して１００μｇ／ｍＬアンピシリンを添加したＴｅｒｒｉ
ｆｉｃブロス培地０．８Ｌを新しい培地に接種して、振とうさせながら３７℃でインキュ
ベートした。６００ｎｍでの吸光度が約１．２〜１．５に達すると、ＩＰＴＧを最終濃度
１ｍＭとなるように添加することによって培養物を誘導し、温度を３０℃に低下した。４
時間後、遠心沈降によって細胞を回収して、細胞沈降物を必要となるまで−８０℃で保存
した。

【0198】

細胞溶解に関して、融解した沈降物を、２５Ｕ／ｍＬ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標
）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１ｋＵ／ｍＬ ｒＬｙｓｏｚｙｍｅ（商標）（Ｎ
ｏｖａｇｅｎ ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加した１Ｘ ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ
（登録商標）に、沈降物１グラムあたりＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）５ｍＬの割合で
浮遊させた。軽く撹拌しながら、溶解を室温で１時間進行させた後、４℃、５６，０００
×ｇで５０分間遠心沈降させた。上清を回収して０．２μｍのフィルターで濾過した後、
ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ １００ｓクロマトグラフィー
システムを用いて、緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、５００ｍＭ
ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール）によって予め平衡にした５ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐ Ｆ
Ｆカラムにロードした。カラムを、カラム容積の２０倍の緩衝液Ａによって洗浄し、カラ
ム容積の６倍量の１６％緩衝液Ｂ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、５００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール）によって更に洗浄した。ＦＮ３ドメインを、カ
ラム容積の１０倍量の５０％ Ｂによって溶出した後、カラム容積の６倍量の５０〜１０
０％ Ｂの勾配によって溶出した。ＦＮ３ドメインタンパク質を含む分画をプールしてＭ
ｉｌｌｉｐｏｒｅ １０Ｋ ＭＷＣＯ濃縮器を用いて濃縮し、濾過後、ＰＢＳで予め平衡
にしたＨｉＬｏａｄ（商標）１６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５カラム（ＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。サイズ排除カラムから溶出したタンパク質単量体
のピークは保持された。

【0199】

エンドトキシンは、ＡｃｔｉＣｌｅａｎ Ｅｔｏｘ樹脂（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏ
ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）によるバッチアプローチを用いて除去した。エンドトキシンの
除去前に、樹脂を１Ｎ ＮａＯＨによって３７℃で２時間（又は４℃で終夜）前処置し、
ｐＨ試験紙によって測定してｐＨが約７で安定化するまで、ＰＢＳによって十分に洗浄し
た。精製タンパク質を、０．２μｍフィルターで濾過したのち、Ｅｔｏｘ樹脂１ｍＬをタ
ンパク質１０ｍＬ対樹脂１ｍＬの比率で添加した。樹脂に対するエンドトキシンの結合を
、軽く回転させながら室温で少なくとも２時間進行させた。樹脂を、５００×ｇで２分間
の遠心沈降によって除去して、タンパク質上清を保持した。エンドトキシンレベルを、Ｅ
ｎｄｏＳａｆｅ（登録商標）−ＰＴＳ（商標）カートリッジを用いて測定し、ＥｎｄｏＳ
ａｆｅ（登録商標）−ＭＣＳリーダー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）で分析した。エン
ドトキシンレベルが、最初のＥｔｏｘ処置後に５ＥＵ／ｍｇを超える場合、エンドトキシ
ンレベルが５ＥＵ／ｍｇ以下に減少するまで上記の技法を繰り返した。エンドトキシンレ
ベルが５ＥＵ／ｍｇを超え、Ｅｔｏｘによる２回連続の処置後に安定化された場合、残り
のエンドトキシンを除去するために、そのタンパク質に関する陰イオン交換又は疎水性相
互作用クロマトグラフィーの条件が確立された。

【0200】

選択されたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのＥＧＦＲ−Ｆｃに対する親和性（ＥＧＦＲ−
Ｆｃ親和性）の決定
組み換え型ＥＧＦＲ細胞外ドメインに対する選択されたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの
結合親和性を、Ｐｒｏｔｅｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて表面プ
ラズモン共鳴法によって更に特徴を調べた。アッセイの設定（チップの調製、ＥＧＦＲ−
Ｆｃ捕捉）は、オフレート分析に関して先に記述したものと類似であった。選択されたＥ
ＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを、１μＭ濃度で水平方向に３倍連続希釈で試験した。緩衝液
試料もまた、ベースラインでの安定性をモニターするために注入した。各ＥＧＦＲ結合Ｆ
Ｎ３ドメインの全ての濃度に関する解離相を、流速１００μＬ／分で３０分間（オフレー
トスクリーニングから約１０^−２ｓ^−１のｋ_ｏｆｆを有するドメインに関して）、又は１
時間（約１０^−３ｓ^−１又はそれより遅いｋ_ｏｆｆを有するドメインに関して）モニター
した。２組の参照データを、反応データから差し引いた：１）ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイ
ンと固定したＩｇＧ表面との非特異的相互作用を修正するためのスポット間シグナル；２
）捕捉されたＥＧＦＲ−Ｆｃ表面の経時的な解離によるベースラインの揺れを補正するた
めの緩衝液チャネルシグナル。各ＦＮ３ドメインに関してすべての濃度での処理された結
合データを１：１の単純なラングミュア結合モデルに全体的にフィットさせて、速度論（
ｋ_ｏｎ、ｋ_ｏｆｆ）及び親和性（Ｋ_Ｄ）定数の推定値を引き出した。表５は構築物のそれ
ぞれに関する速度論定数を示し、親和性は２００ｐＭから９．６ｎＭまで変化する。

【0201】

細胞上でＥＧＦＲに対する選択されたＥＧＦＲ−結合ＦＮ３ドメインの結合（Ａ４３１
細胞結合アッセイ）
Ａ４３１細胞を不透明な黒色９６ウェルプレートに５，０００個／ウェルで播種して、
３７℃の湿潤５％ ＣＯ_２環境で終夜接着させた。精製ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン（１
．５ｎＭ〜３０μＭ）を、同じプレートを３枚ずつ作製して、細胞（５０μＬ）に室温で
１時間添加した。上清を除去して、細胞を、１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ染色緩衝液に
よって３回洗浄した。細胞を、ＦＡＣＳ染色緩衝液中で１：１００に希釈した抗ペンタＨ
ｉｓ−Ａｌｅｘａ ４８８抗体コンジュゲート（Ｑｉａｇｅｎ）５０μＬ／ウェルと共に
室温で２０分間インキュベートした。細胞を１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ染色緩衝液に
よって３回洗浄した後、ウェルにＦＡＣＳ染色緩衝液１００μＬを満たし、Ａｃｕｍｅｎ
ｅＸ３リーダーを用いて４８８ｎｍで蛍光を読み取った。データを、ＦＮ３ドメインモ
ル濃度の対数に対して未加工の蛍光シグナルとしてプロットして、ＥＣ_５０値を計算する
ためにＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用
いて、様々な勾配を有するシグモイド用量反応曲線にフィットさせた。表５は、構築物の
それぞれに関して、２．２〜２０μＭを超える範囲のＥＣ_５０を報告する。

【0202】

選択されたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを用いた細胞上のＥＧＦＲに対するＥＧＦ結合
の阻害（Ａ４３１細胞ＥＧＦ競合アッセイ）
Ａ４３１細胞を不透明な黒色９６ウェルプレートに５，０００個／ウェルで播種して、
３７℃の湿潤５％ ＣＯ_２環境で終夜接着させた。精製ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン（１
．５ｎＭ〜３０μＭ）を、同じプレートを３枚ずつ作製して、細胞（５０μＬ／ウェル）
に室温で１時間添加した。ビオチニル化ＥＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｅ
−３４７７）を、最終濃度３０ｎｇ／ｍＬとなるように各ウェルに添加して、室温で１０
分間インキュベートした。細胞を、１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ染色緩衝液によって３
回洗浄した。細胞を、ＦＡＣＳ染色緩衝液中で１：１００に希釈したストレプトアビジン
−フィコエリスリンコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５０μＬ／ウェルと共に室
温で２０分間インキュベートした。細胞を１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ染色緩衝液によ
って３回洗浄した後、ウェルにＦＡＣＳ染色緩衝液１００μＬを満たし、Ａｃｕｍｅｎ
ｅＸ３リーダーを用いて６００ｎｍで蛍光を読み取った。データを、ＦＮ３ドメインモル
濃度の対数に対して未加工の蛍光シグナルとしてプロットして、ＩＣ_５０値を計算するた
めにＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用い
て、様々な勾配を有するシグモイド用量反応曲線にフィットさせた。表５は、１．８〜１
２１ｎＭの範囲のＩＣ_５０値を報告する。

【0203】

ＥＧＦ刺激ＥＧＦＲリン酸化の阻害（ホスホ−ＥＧＦＲアッセイ）
ＥＧＦ刺激ＥＧＦＲリン酸化を有意に阻害した選択されたＦＮ３ドメインを、阻害に関
するＩＣ_５０値を測定することによってより完全に評価した。ＥＧＦ刺激ＥＧＦＲリン酸
化の阻害を、「ＥＧＦ刺激ＥＧＦＲリン酸化の阻害」において先に記述したように、ＦＮ
３ドメイン濃度を変化させて（０．５ｎＭ〜１０μＭ）評価した。データを、ＦＮ３ドメ
インモル濃度の対数に対してエレクトロケミルミネッセンスシグナルとしてプロットして
、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて
、様々な勾配を有するシグモイド用量反応曲線にデータをフィットさせることによって、
ＩＣ_５０値を決定した。表５は、１８ｎＭ〜＞２．５μＭの範囲のＩＣ_５０値を報告する
。

【0204】

ヒト腫瘍細胞の増殖の阻害（ＮＣＩ−Ｈ２９２増殖及びＮＣＩ−Ｈ３２２増殖アッセイ
）
ＥＧＦＲ依存的細胞増殖の阻害を、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインに対する暴露後のＥＧ
ＦＲ過剰発現ヒト腫瘍細胞株ＮＣＩ−Ｈ２９２及びＮＣＩ−Ｈ３２２（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、それぞれカタログ番号ＣＲＬ−１
８４８及びＣＲＬ−５８０６）の生存率を測定することによって評価した。細胞を、不透
明な白色９６ウェル組織培養処置プレート（Ｎｕｎｃ）において、Ｇｌｕｔａｍａｘ（商
標）、並びに１０％熱不活化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）及び１％ペニシリン／ストレプ
トマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加した１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂ
ｃｏ）１００μＬ／ウェル中で５００個／ウェル（ＮＣＩ−Ｈ２９２）又は１，０００個
／ウェル（ＮＣＩ−Ｈ３２２）で播種し、３７℃の湿潤５％ ＣＯ_２環境で終夜接着させ
た。細胞を、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの濃度範囲を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）を５μＬ／ウェル添加することによって処置した。対照を５μＬ／ウェルのＰＢＳの
み、又は２５ｍＭエチレンジアミン四酢酸のＰＢＳ溶液によって処置した。細胞を、３７
℃、５％ ＣＯ_２で１２０時間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録
商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）７５μＬ／ウェルを添加した後、プレートシェーカー上で
２分間混合し、室温の暗所で更に１０分間インキュベートすることによって生存細胞を検
出した。プレートを、ルミネッセンスモードに設定したＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレ
ートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読み取り、読み取り時間は、溶
媒のみのブランクに対して０．５秒／ウェルであった。データをＦＮ３ドメインモル濃度
の対数に対するＰＢＳ処置細胞増殖の百分率としてプロットした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐ
ｒｉｓｍ ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、様々な勾配を有するシ
グモイド用量反応曲線の等式にデータをフィットさせることによって、ＩＣ_５０値を決定
した。表５は、ＮＣＩ−Ｈ２９２及びＮＣＩ−Ｈ３２２細胞をそれぞれ用いて、５．９ｎ
Ｍ〜１．１５μＮ及び９．２ｎＭ〜３．１μＭ超の範囲のＩＣ_５０値を示す。

【0205】

表５は、各アッセイのＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの生物特性の要約を示す。

【0206】

【表5】

【0207】

実施例４：ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの改変
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのサブセットを、各分子の立体構造の安定性を増加させる
ように、改変した。変異体Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ、及びＥ８６Ｉ（米国特許出願公開第２０
１１／０２７４６２３号に記述）をＤＮＡ合成によって、クローンＰ５４ＡＲ４−８３、
Ｐ５４ＣＲ４−３１、及びＰ５４ＡＲ４−３７に組み入れた。新規変異体Ｐ５４ＡＲ４−
８３ｖ２、Ｐ５４ＣＲ４３１−ｖ２、及びＰ５４ＡＲ４−３７ｖ２を、上記のように発現
させて精製した。ＰＢＳ中での示差走査熱量測定を用いて、対応する親分子の安定性と比
較するために、各変異体の安定性を評価した。表６は、各クローンが有意に安定化され、
Ｔ_ｍの平均値は１８．５℃増加することを示す。

【0208】

【表6】

【0209】

実施例５：ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのシステイン改変と化学コンジュゲーション
ＦＮ３ドメインのシステイン変異体を、基礎となるＴｅｎｃｏｎ分子及びシステイン残
基を有しないその変種から作製する。これらの変異は、低分子薬、蛍光タグ、ポリエチレ
ングリコール、又は他の任意の数の化学実体を化学コンジュゲートするための部位として
役立つように、独自のシステイン残基を、基礎となるＴｅｎｃｏｎ配列（配列番号１）又
は他のＦＮ３ドメインに組み入れるために、当技術分野で公知の標準的な分子生物学技術
を用いて作製され得る。選択される変異部位は、特定の基準を満たさなければならない。
例えば、遊離のシステインを含むように変異させたＴｅｎｃｏｎ配列は、（ｉ）大腸菌に
おいて高度に発現され、（ｉｉ）高レベルの溶解度及び熱安定性を維持し、並びに（ｉｉ
ｉ）コンジュゲーションの際に標的抗原に対する結合を維持しなければならない。Ｔｅｎ
ｃｏｎ足場は、わずか約９０〜９５個のアミノ酸であることから、化学コンジュゲーショ
ンのための理想的な位置を厳密に決定するために、１システイン変種を、足場のあらゆる
位置で容易に構築することができる。

【0210】

ＥＧＦＲに結合するＰ５４ＡＲ４−８３ｖ２変異体（配列番号２７）の１〜９５番目（
又はＮ−末端メチオニンが存在するときには２〜９６番目）の位置の各個々のアミノ酸残
基をシステインに変異させて、最善の化学コンジュゲーション部位を評価した。

【0211】

構築、発現、及び精製
Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２の各個々のシステイン変種のアミノ酸配列を、大腸菌発現のた
めの選択的コドンを用いてタンパク質をコードする核酸配列に逆転写して、合成遺伝子を
作製した（ＤＮＡ ２．０）。これらの遺伝子を、Ｔ５プロモーター配列によって駆動さ
れる発現のために、ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０１ベクター（ＤＮＡ２．０）にクローニング
し、大腸菌株ＢＬ２１（Ａｇｉｌｅｎｔ）に形質転換した。Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２「シ
ステインスキャン」ライブラリは、９６ウェルプレート上にアレイにしたグリセロールス
トックとして提供され、それぞれの発現及び精製は、実施例２に記述される同じ技法に従
った。

【0212】

化学コンジュゲーション
Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２「システインスキャン」ライブラリに関して、コンジュゲーシ
ョンを精製プロセスに組み入れた。澄明化した溶解物中のシステイン変種は、溶解物をウ
ェルに添加して、１００×ｇで５分間遠心沈降させることにより、Ｈｉｓ−ｔｒａｐ Ｈ
Ｐプレート（カタログ番号２８−４００８−２９、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い
て９６ウェルフォーマットでＮｉ−ＮＴＡ樹脂に結合させた。樹脂を緩衝液Ａで３回洗浄
した後、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を１．５ｍＭ溶液の５００μＬとして添加した
。ロティサリーシェーカーで室温で１時間インキュベートした後、過剰量のＮＥＭを遠心
沈降によって除去して、緩衝液Ａによって３回洗浄した。コンジュゲートされたシステイ
ン変種を１５０μＬの緩衝液Ｂによって２回溶出し、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０メンブレン
（カタログ番号ＭＡＵＦ１０１０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を有するＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅ
ｎ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅｓ又は９６−ウェルＰＤ ＭｕｌｔｉＴｒａｐプレート（
カタログ番号２８−９１８０−０６、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってＰＢＳに交
換した。コンジュゲートを質量分析によって特徴を調べた（表７）。発現が不良であるか
（５ｍＬ培養物から得られたタンパク質が０．１ｍｇ未満、又は質量分析によって検出し
てタンパク質が得られない）又はＮＥＭに対するコンジュゲーションが不良である（質量
分析によって測定してコンジュゲーションが８０％未満）システイン変種を、更なる分析
から除外した。これによって、発現が不良であるためにＬ１Ｃ、Ｗ２１Ｃ、Ｑ３６Ｃ、Ｅ
３７Ｃ、Ａ４４Ｃ、Ｄ５７Ｃ、Ｌ６１Ｃ、Ｙ６７Ｃ、及びＦ９２Ｃが除外され、コンジュ
ゲーション効率が低いためにＡ１７Ｃ、Ｌ１９Ｃ、Ｉ３３Ｃ、Ｙ３５Ｃ、Ｙ５６Ｃ、Ｌ５
８Ｃ、Ｔ６５Ｃ、Ｖ６９Ｃ、Ｉ７１Ｃ、及びＴ９４Ｃが除外された。

【0213】

【表7-1】

【0214】

【表7-2】

【表7-3】

【0215】

分析的サイズ排除クロマトグラフィー
Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２の各ＮＥＭコンジュゲートシステイン変種のサイズ排除クロマ
トグラフィーを、実施例２に記述されるように行った。表８は、結果を要約する。Ａｂｓ
２８０シグナルを積分して、単量体領域のピーク（５．５〜６分）を、オリゴマー領域の
ピーク（４〜５．３分）と比較することにより、各タンパク質の％単量体を決定した。

【0216】

【表8-1】

【0217】

【表8-2】

【表8-3】

【0218】

ＥＧＦＲ結合アッセイ
Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２のＮＥＭコンジュゲートシステイン変種のＥＧＦＲに対する相
対的結合親和性を、実施例２に記述されるように評価した。表９は、Ｐ５４ＡＲ４−８３
ｖ２親タンパク質と比較した各システイン変種のＥＧＦＲ結合親和性の比率を示すデータ
を要約する。ＥＬＩＳＡアッセイによって決定した場合に、ＥＧＦＲに対する結合が減少
した（１０ｎＭタンパク質によって処置したとき、Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２親に関して観
察されたシグナルの６５％未満）システインコンジュゲートを更なる分析から除外した：
Ｐ２Ｃ、Ａ３Ｃ、Ｐ４Ｃ、Ｋ５Ｃ、Ｌ７Ｃ、Ｄ２３Ｃ、Ｗ２５Ｃ、Ｆ２７Ｃ、Ｙ２８Ｃ、
Ｆ３１Ｃ、Ｓ５５Ｃ、Ｇ７３Ｃ、Ｈ７５Ｃ、Ｖ７７Ｃ、Ｙ７８Ｃ、Ｔ８１Ｃ、Ｎ８２Ｃ、
Ｍ８３Ｃ、及びＧ８５Ｃ。

【0219】

【表9-1】

【0220】

【表9-2】

【0221】

熱安定性
システイン−ＮＥＭコンジュゲートの熱安定性を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によっ
て評価した。試験したコンジュゲートは、高レベルでコンジュゲートを効率よく発現し、
ＥＧＦＲ結合を保持することが決定されたコンジュゲートであった。加えて、ＢＣ及びＦ
Ｇループ内のシステイン変種は除外した。安定性データは、ＶＰ−ＤＳＣ機器（Ｍｉｃｒ
ｏＣａｌ）で毎分１℃の走査速度で、変種のアリコート４００μＬを２５℃から１００℃
まで加熱することによって得られた。その試料に関して、熱によるフォールディング／ア
ンフォールディングの可逆性を評価するために、第２の同一の走査を行った。融解温度を
計算するために、データを２状態アンフォールディングモデルにフィットさせた（表１０
）。融解温度が低下した（６３℃以下又はＰ５４ＡＲ４−８３ｖ２の親より８℃超下）、
又は非可逆的アンフォールディングを示したシステイン変種を更なる分析から除外した：
Ｖ９Ｃ、Ｖ１２Ｃ、Ｔ１３Ｃ、Ｒ１８Ｃ、Ｅ２９Ｃ、Ｅ３９Ｃ、Ｇ４２Ｃ、Ｖ４９Ｃ、Ｐ
５０Ｃ、Ｇ５１Ｃ、Ｐ６３Ｃ。

【0222】

【表10-1】

【表10-2】

【0223】

細胞障害性アッセイ
Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２システイン変種を、ＮＥＭコンジュゲーションに関して記述さ
れる方法論を用いて、酵素切断可能なＶａｌ−Ｃｉｔリンカー又は非切断型ＰＥＧ_４リン
カー（ＶＣ−ＭＭＡＦ７；図２を参照されたい）を介して、細胞障害性チューブリン阻害
剤であるモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）にコンジュゲートした。先の段階で除
外後に残っている３２個の変種を、Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２親（配列番号２１７及び２５
５）、及び陰性対照としてのＴｅｎｃｏｎ（配列番号２６５）と共にコンジュゲートした
。

【0224】

殺細胞を、システイン変種−細胞毒素コンジュゲートに暴露後のＥＧＦＲ過剰発現ヒト
腫瘍細胞株Ｈ１５７３の生存率を測定することによって評価した。細胞を黒色ウェルの透
明底の組織培養処置プレート（Ｆａｌｃｃｏｎ ３５３２１９）に、５％ウシ胎児血清（
Ｇｉｂｃｏ）を含むフェノールレッド不含ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ １１８３５−０３
０）１００μＬ／ウェル中で７０００個／ウェルで播種した。細胞を、３７℃の湿潤５％
ＣＯ_２環境で終夜接着させた。９６ウェルプレートから培地を吸引して、細胞を新しい培
地５０μＬ、及び新しい培地中に溶解した２×阻害剤５０μＬで処置した。細胞の生存率
を、７０時間でＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によるエンドポイントアッ
セイによって決定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆ
ｔｗａｒｅ）を用いて、様々な勾配を有するシグモイド用量反応曲線の等式にデータをフ
ィットさせることによって、ＩＣ_５０値を決定した。表１１は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌ
ｏデータの分析から得られたＩＣ_５０値を報告する。８３ｖ２−ｃｙｓ／ｖｃＭＭＡＦコ
ンジュゲートの２つの複製物の平均ＩＣ_５０値は、０．７ｎＭであった。試験したコンジ
ュゲート３２個中４個が、親の値（約１．４ｎＭ）より２倍超高いＩＣ_５０値を有したこ
とから、廃棄した：Ｌ３２Ｃ、Ｔ６８Ｃ、Ｙ７２Ｃ、及びＶ７４Ｃ。加えて、３つのコン
ジュゲートが親より２倍超強力なＩＣ_５０値を与え、薬物コンジュゲートに処方するため
に特に適切であり得る：Ｎ６Ｃ、Ｅ５３Ｃ、及びＴ９３Ｃ。

【0225】

【表11】

【0226】

最終的なシステイン変種
試験した９６個の位置の中で、システイン変種２８個が、大腸菌における高い発現レベ
ルの保持、チオール−マレイミド化学を介した効率的なコンジュゲーション、標的抗原Ｅ
ＧＦＲに対する結合の保持、熱安定性の保持、及び可逆的アンフォールディング特性、並
びにシステイン変種を細胞障害剤にコンジュゲートしたときに高いＥＧＦＲ発現を有する
細胞の障害性の保持に関する基準を満たすことが判明した。これらの位置は、Ｎ６Ｃ（配
列番号２１０及び２４８）、Ｖ８Ｃ（配列番号１８９及び２２７）、Ｓ１０Ｃ（配列番号
１９０及び２２８）、Ｅ１１Ｃ（配列番号１９１及び２２９）、Ｅ１４Ｃ（配列番号１９
２及び２３０）、Ｄ１５Ｃ（配列番号１９３及び２３１）、Ｓ１６Ｃ（配列番号１９４及
び２３２）、Ｓ２０Ｃ（配列番号１９５及び２３３）、Ｓ３０Ｃ（配列番号１９６及び２
３４）、Ｑ３４Ｃ（配列番号１９７及び２３５）、Ｓ３８Ｃ（配列番号１９８及び２３６
）、Ｋ４０Ｃ（配列番号１９９及び２３７）、Ｖ４１Ｃ（配列番号２００及び２３８）、
Ｉ４５Ｃ（配列番号２０１及び２３９）、Ｌ４７Ｃ（配列番号２０２及び２４０）、Ｔ４
８Ｃ（配列番号２０３及び２４１）、Ｅ５３Ｃ（配列番号２０４及び２４２）、Ｒ５４Ｃ
（配列番号２０５及び２４３）、Ｔ５９Ｃ（配列番号２０６及び２４４）、Ｇ６０Ｃ（配
列番号２０７及び２４５）、Ｋ６２Ｃ（配列番号２０８及び２４６）、Ｇ６４Ｃ（配列番
号２０９及び２４７）、Ｔ６８Ｃ（配列番号２１０及び２４８）、Ｓ７０Ｃ（配列番号２
１１及び２４９）、Ｌ８８Ｃ（配列番号２１２及び２５０）、Ｓ８９Ｃ（配列番号２１３
及び２５１）、Ａ９０Ｃ（配列番号２１４及び２５２）、Ｉ９１Ｃ（配列番号２１５及び
２５３）、並びにＴ９３Ｃ（配列番号２１６及び２５４）である。８３ｖ２タンパク質の
構造におけるこれらの２８の位置の場所を図３に示す。

【0227】

実施例６：ｃ−Ｍｅｔに結合してＨＧＦ結合を阻害するフィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆ
Ｎ３）ドメインの選択
ヒトｃ−Ｍｅｔに関するパニング
ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合することができるＦＮ３ドメインを同定するために、ＴＣＬ
１４ライブラリを、ビオチニル化ヒトｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメイン（ｂｔ−ｃ−Ｍｅｔ）に
対してスクリーニングした。選択するために、ＴＣＬ１４ライブラリ３μｇを、大腸菌Ｓ
３０ Ｌｉｎｅａｒ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）中でイ
ンビトロで転写及び翻訳し、発現させたライブラリをＣｉｓブロック（２％ ＢＳＡ（Ｓ
ｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１００μｇ／ｍｌニシン精子Ｄ
ＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１ ｍｇ／ｍＬヘパリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））に
よってブロックした。選択するために、ｂｔ−ｃ−Ｍｅｔを４００ｎＭ（ラウンド１）、
２００ｎＭ（ラウンド２及び３）、及び１００ｎＭ（ラウンド４及び５）の濃度で添加し
た。結合したライブラリメンバーを、ニュートラアビジン磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆ
ｉｓｈｅｒ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）（ラウンド１、３及び５）、又はストレプトアビ
ジン磁気ビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（ラウンド２及び４）を用いて回収し、ビーズを５０
０μＬのＰＢＳ−Ｔで５〜１４回洗浄した後、５００μＬのＰＢＳで２回洗浄することに
よって、非結合ライブラリメンバーを除去した。

【0228】

改善された親和性を有するＦＮ３ドメイン分子を同定するために、追加の選択ラウンド
を行った。簡単に説明すると、ラウンド５からの生成物を、上記のように調製して、以下
の変更を加えて追加の反復選択ラウンドに供した：ｂｔ−ｃ−Ｍｅｔとのインキュベーシ
ョンを１時間から１５分に減少させて、ビーズ捕獲を２０分から１５分に減少させ、ｂｔ
−ｃ−Ｍｅｔを２５ｎＭ（ラウンド６又は７）又は２．５ｎＭ（ラウンド８及び９）に減
少させ、更に１時間の洗浄を過剰量の非ビオチニル化ｃ−Ｍｅｔの存在下で行った。これ
らの変更の目的は、おそらくより早いオンレートとより遅いオフレートを有する結合体を
同時に選択して、実質的により低いＫ_Ｄを生じることであった。

【0229】

ラウンド５、７及び９の生成物を、ＴＣＯＮ６（配列番号３０）及びＴＣＯＮ５ Ｅ８
６Ｉショート（配列番号３１）プライマーを用いてリガーゼ非依存的クローニングサイト
（ｐＥＴ１５−ＬＩＣ）を含む改変ｐＥＴ１５ベクター（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）にＰＣＲクローニングして、標準的なプロトコールを用
いて、形質転換及びＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ、３０°℃で１６時間）誘導後にＣ−末端
Ｈｉｓ６タグタンパク質として、タンパク質を発現させた。細胞を遠心沈降によって回収
した後、０．２ｍｇ／ｍＬニワトリ卵白リゾチーム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添
加したＢｕｇｂｕｓｔｅｒ ＨＴ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって溶解した
。細菌溶解物を遠心沈降によって澄明化して、上清を新しい９６ウェル深底プレートに移
した。

【0230】

ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦ結合を阻害するＦＮ３ドメインのスクリーニング
大腸菌溶解物に存在するＦＮ３ドメインを、生化学フォーマットで精製ｃ−Ｍｅｔ細胞
外ドメインに対するＨＧＦ結合の阻害能に関してスクリーニングした。組み換え型ヒトｃ
−Ｍｅｔ Ｆｃキメラ（ＰＢＳ中で０．５μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル）を９６ウェ
ル白色Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）にコーティングして、４℃で終夜インキュ
ベートした。プレートを、Ｂｉｏｔｅｋプレート洗浄器において、０．０５％ Ｔｗｅｅ
ｎ ２０（ＴＢＳ−Ｔ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水３
００μＬ／ウェルによって２回洗浄した。アッセイプレートを、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏ
ｃｋ Ｔ２０（２００μＬ／ウェル、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＩＬ）によって振とうさせながら室温（ＲＴ）で１時間ブロック
して、ＴＢＳ−Ｔ ３００μＬによって２回洗浄した。ＦＮ３ドメイン溶解物を、Ｈａｍ
ｉｌｔｏｎ ＳＴＡＲｐｌｕｓロボットシステムを用いて、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ
Ｔ２０（１：１０〜１：１００，０００）中で希釈した。溶解物（５０μＬ／ウェル）
を、アッセイプレートにおいてＲＴで振とうさせながら１時間インキュベートした。プレ
ートを洗浄せずに、ｂｔ−ＨＧＦ（ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｔ２０中で１μｇ／ｍ
Ｌ、５０μＬ／ウェル、ビオチニル化）を、振とうさせながらＲＴで３０分間プレートに
添加した。Ｔｅｎｃｏｎ２７溶解物を含む対照ウェルに、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ
Ｔ２０又は希釈したｂｔ−ＨＧＦのいずれかを添加した。プレートを３００μＬ／ウェル
のＴＢＳ−Ｔによって４回洗浄して、１００μＬ／ウェルのストレプトアビジン−ＨＲＰ
（ＴＢＳ−Ｔ中で１：２０００、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅ
ｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）と共に、ＲＴで振とうさせながら３０〜４０分間インキュベー
トした。再度、プレートをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄した。シグナルを発生させるために、製
造元の指示に従って調製したＰＯＤケミルミネッセンス基質（５０μＬ／ウェル、Ｒｏｃ
ｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）をプレートに添加し
て、およそ３分以内に、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏを用いてＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉ
ｃｅｓ Ｍ５において発光を読み取った。％阻害は、以下の計算式を用いて決定した：１
００−（（ＲＬＵ_{ｓａｍｐｌｅ}−ＲＬＵ平均値_{Ｎｏ ｂｔ−ＨＧＦ ｃｏｎｔｒｏｌ}）／
（ＲＬＵ平均値_{ｂｔ−ＨＧＦ ｃｏｎｔｒｏｌ}−ＲＬＵ平均値_{Ｎｏ ｂｔ−ＨＧＦ ｃｏ
ｎｔｒｏｌ}）^＊１００）５０％又はそれより高い％阻害の値は、ヒットであると考えられ
た。

【0231】

ＦＮ３ドメインのハイスループット発現及び精製
ＨｉｓタグＦＮ３ドメインを Ｈｉｓ ＭｕｌｔｉＴｒａｐ（商標）ＨＰプレート（Ｇ
Ｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって澄明化大腸菌溶解物から精製して、２０ｍＭリン酸
ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、及び２５０ｍＭイミダゾールを含むｐＨ７．４
の緩衝液で溶出した。精製試料を、ＰＤ ＭｕｌｔｉＴｒａｐ（商標）Ｇ−２５プレート
（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる分析のために、ｐＨ７．４のＰＢＳに交換した
。

【0232】

ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦ結合の阻害のＩＣ_５０決定
選択されたＦＮ３ドメインを、ＨＧＦ競合アッセイにおいて更に特徴を調べた。精製Ｆ
Ｎ３ドメインの用量反応曲線を、上記のアッセイを利用して作製した（開始濃度５μＭ）
。％阻害の値を計算した。データを、ＦＮ３ドメインモル濃度の対数に対する％阻害とし
てプロットして、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４を用いて、様々な勾配を有するシグ
モイド用量反応曲線にデータをフィットさせることによって、ＩＣ_５０値を決定した。

【0233】

ラウンド５から、１：１０の希釈で活性を示す３５個のユニーク配列が同定され、ＩＣ
_５０値は、０．５〜１５００ｎＭの範囲であった。ラウンド７は、１：１００の希釈で活
性を示す３９個のユニーク配列を生じ、ＩＣ_５０値は、０．１６〜２．９ｎＭの範囲であ
った。ラウンド９からは６６個のユニーク配列が同定されたが、この場合、ヒットは、１
：１０００の希釈で活性であると定義された。ラウンド９では、０．２ｎＭもの低いＩＣ
_５０値が観察された（表１３）。

【0234】

実施例７：ｃ−Ｍｅｔに結合して、ＨＧＦ結合を阻害するＦＮ３ドメインの特徴づけ
ＦＮ３ドメインを、実施例２において先に記述したように発現及び精製した。サイズ排
除クロマトグラフィー及び速度論分析をそれぞれ、実施例１及び２において先に記述した
ように行った。表１２は、Ｃ鎖、ＣＤループ、Ｆ鎖、及びＦＧループの配列、並びに各ド
メインに関する完全なアミノ酸配列の配列番号を示す。

【0235】

【表12】

Ｃループ残基は、表記の配列番号の２８〜３７番目の残基に対応する。
ＣＤ鎖残基は、表記の配列番号の３８〜４３番目の残基に対応する。
Ｆループ残基は、表記の配列番号の６５〜７４番目の残基に対応する。
ＦＧ鎖残基は、表記の配列番号の７５〜８１番目の残基に対応する。

【0236】

細胞におけるｃ−Ｍｅｔに対する選択されたｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの結合
ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞（カタログ番号ＨＴＢ−１７４，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、２０，０００個
／ウェルでポリ−Ｄ−リジンコーティングした黒色透明底の９６ウェルプレート（ＢＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に播種して、３７℃、５％ ＣＯ_２
で終夜接着させた。精製ＦＮ３ドメイン（５０μＬ／ウェル；０〜１０００ｎＭ）を、同
じプレートを２枚ずつ作製して、４℃で１時間細胞に添加した。上清を除去して、細胞を
、ＦＡＣＳ染色緩衝液（１５０μＬ／ウェル、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ
番号５５４６５７）によって３回洗浄した。細胞を、ビオチニル化抗ＨＩＳ抗体（ＦＡＣ
Ｓ染色緩衝液中で１：１６０倍希釈、５０μＬ／ウェル、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタ
ログ番号ＢＡＭ０５０）と共に４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ染色
緩衝液（１５０μＬ／ウェル）で３回洗浄後、ウェルを抗マウスＩｇＧ１−Ａｌｅｘａ４
８８コンジュゲート抗体（ＦＡＣＳ染色緩衝液中で１：８０倍希釈、５０μＬ／ウェル、
Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号Ａ２１１２１）と共に４℃で３０分
間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ染色緩衝液（１５０μＬ／ウェル）によって３回
洗浄し、ＦＡＣＳ染色緩衝液（５０μＬ／ウェル）中で放置した。総蛍光を、Ａｃｕｍｅ
ｎ ｅＸ３リーダーを用いて決定した。データを、ＦＮ３ドメインモル濃度の対数に対し
て未加工の蛍光シグナルとしてプロットして、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４（Ｇｒ
ａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、様々な勾配を有するシグモイド用量反応曲
線にフィットさせて、ＥＣ_５０値を計算した。ＦＮ３ドメインは、結合活性の範囲を示す
ことが見いだされ、表１３に示されるようにＥＣ_５０値は、１．４〜２２．０であった。

【0237】

ＨＧＦ刺激ｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害
精製ＦＮ３ドメインを、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｇａｉｔｈｅｒ
ｓｂｕｒｇ，ＭＤ）のｃ−Ｍｅｔ ｐｈｏｓｐｈｏ（Ｔｙｒ１３４９）キットを用いて、
ＮＣＩ−Ｈ４４１におけるｃ−ＭｅｔのＨＧＦ刺激リン酸化の阻害能に関して試験した。
細胞を、透明な９６ウェル組織培養処置プレートにおいて、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ
，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したＲＰＭＩ培地１００μＬ／ウェル中
で２０，０００個／ウェルで播種し、３７℃、５％ ＣＯ_２で終夜接着させた。培養培地
を完全に除去して、細胞を３７℃、５％ ＣＯ_２で、無血清ＲＰＭＩ培地（１００μＬ／
ウェル）中で終夜枯渇させた。次に、細胞に、濃度２０μＭ以下のＦＮ３ドメインを含む
新しい無血清ＲＰＭＩ培地（１００μＬ／ウェル）を、３７℃、５％ ＣＯ_２で１時間添
加した。対照は、培地のみで処置した。細胞を、１００ｎｇ／ｍＬ組み換え型ヒトＨＧＦ
（１００μＬ／ウェル、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２９４−ＨＧＮ）によっ
て刺激して、３７℃、５％ ＣＯ_２で１５分間インキュベートした。一組の対照ウェルは
、陰性対照として刺激しないままであった。培地を完全に除去して、細胞を、製造元の指
示に従って、ＲＴで振とうさせながらＣｏｍｐｌｅｔｅ溶解緩衝液（５０μＬ／ウェル、
Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）によって１０分間溶解した。リン酸化ｃ−
Ｍｅｔを測定するように構成されたアッセイプレートを、製造元の指示に従って、提供さ
れたブロッキング溶液によって室温で１時間ブロックした。次に、プレートを、Ｔｒｉｓ
洗浄緩衝液（２００μＬ／ウェル、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）によっ
て３回洗浄した。細胞溶解物（３０μＬ／ウェル）をアッセイプレートに移して、振とう
させながらＲＴで１時間インキュベートした。次に、アッセイプレートをＴｒｉｓ洗浄緩
衝液によって４回洗浄した後、氷冷の検出抗体溶液（２５μＬ／ウェル、Ｍｅｓｏ Ｓｃ
ａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を、振とうさせながらＲＴで各ウェルに１時間添加した。
プレートをＴｒｉｓ洗浄緩衝液によって４回すすいだ。１５０読み取り緩衝液（１５０μ
Ｌ／ウェル、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を添加して、製造元のインス
トールしたアッセイ特異的デフォルト設定を用いて、ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｉｍａｇ
ｅｒ ６０００機器（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）において読み取るこ
とにより、シグナルを検出した。データを、ＦＮ３ドメインモル濃度の対数に対するエレ
クトロケミルミネッセンスシグナルとしてプロットして、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ
４を用いて、様々な勾配を有するシグモイド用量反応曲線にデータをフィットさせるこ
とによって、ＩＣ_５０値を決定した。ＦＮ３ドメインは、表１３に示されるように、４．
６〜１４１５ｎＭの範囲のＩＣ５０値でリン酸化ｃ−Ｍｅｔを阻害することが見いだされ
た。

【0238】

ヒト腫瘍細胞増殖の阻害
ｃ−Ｍｅｔ依存的細胞増殖の阻害を、ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインに対する暴露後の
Ｕ８７−ＭＧ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ、カタログ番号ＨＴＢ−１４）の生存率を測定することによって評価した。細胞を、不
透明な白色９６ウェル組織培養処置プレート（Ｎｕｎｃ）において１０％ ＦＢＳを添加
したＲＰＭＩ培地１００μＬ／ウェル中で８０００個／ウェルで播種し、３７℃、５％
ＣＯ_２で終夜接着させた。播種後２４時間で、培地を吸引して、細胞に無血清ＲＰＭＩ培
地を添加した。血清枯渇の２４時間後、ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを含む無血清培地
（３０μＬ／ウェル）を添加することによって、細胞を処置した。細胞を、３７℃、５％
ＣＯ_２で７２時間インキュベートした。生存細胞を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登
録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）１００μＬ／ウェルを添加した後、プレートシェーカー
において１０分間混合することによって検出した。プレートを、ルミネッセンスモードに
設定したＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉ
ｃｅｓ）で読み取り、読み取り時間は、０．５秒／ウェルであった。データをＦＮ３ドメ
インモル濃度の対数に対する未加工発光単位（ＲＬＵ）としてプロットした。Ｇｒａｐｈ
Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ４を用いて、様々な勾配を有するシグモイド用量反応曲線の等式に
データをフィットさせることによって、ＩＣ_５０値を決定した。表１３は、１ｎＭ〜１０
００ｎＭ超の範囲のＩＣ_５０値を報告する。

【0239】

【表13】

【0240】

ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの熱安定性

【0241】

ＰＢＳ中での示差走査熱量測定を用いて、各ＦＮ３ドメインの安定性を評価した実験の
結果を表１４に示す。

【0242】

【表14】

【0243】

実施例８二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の作製及び特徴づけ
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の作製
実施例１〜６に記述したＥＧＦＲとｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの多数の組み合わせ
を合わせて、ＥＧＦＲとｃ−Ｍｅｔの両方に結合することができる二重特異性分子を作製
した。更に、配列番号１０７〜１１０に示されるアミノ酸配列を有するＥＧＦＲ結合ＦＮ
３ドメイン、及び配列番号１１１〜１１４に示されるアミノ酸配列を有するｃ−Ｍｅｔ結
合ＦＮ３ドメインを作製して、二重特異性分子に結合した。以下のフォーマットが維持さ
れるように配列番号５０〜７２、及び１０６（表１５）に記載のアミノ酸配列をコードす
るように、合成遺伝子を作製した：ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの後にペプチドリンカー
、その後にｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン。精製を助けるために、Ｃ−末端にポリヒスチ
ジンタグを組み入れた。表１５に記述される分子に加えて、２つのＦＮ３ドメイン間のリ
ンカーを、表１６に記載の内容に従って、長さ、配列組成、及び構造に従って変化させた
。そのようなＦＮ３ドメインを連結させるために、多数の他のリンカーを用いることがで
きると予想される。二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子を発現させて、単特異性ＥＧＦ
Ｒ又はｃ−ＭｅｔＦＮ３ドメインに関して記述したように、ＩＭＡＣ及びゲル濾過クロマ
トグラフィー工程を用いて、大腸菌から精製した。

【0244】

【表15】

【0245】

【表16】

【0246】

二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は単特異性分子単独と比較して効力を増強し、結
合力を示唆する
ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を、９６ウェルプレートにおいて、１０％ ＦＢＳを含むＲＰＭ
Ｉ培地中で播種した。２４時間後、培地を無血清ＲＰＭＩに交換した。血清枯渇の２４時
間後、細胞を多様な濃度のＦＮ３ドメインによって処置した：高親和性単特異性ＥＧＦＲ
ＦＮ３ドメイン（Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２）、弱親和性単特異性ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ド
メイン（Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５）、２つの単特異性ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔ ＦＮ
３ドメインの混合物、又は高親和性ＥＧＦＲ ＦＮ３ドメインに連結させた低親和性ｃ−
Ｍｅｔ ＦＮ３ドメインからなる二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子（ＥＣＢ１）。細
胞を、単特異性又は二重特異性分子によって１時間処置した後、ＥＧＦ、ＨＧＦ、又はＥ
ＧＦとＨＧＦの組み合わせによって３７℃、５％ ＣＯ_２で１５分間刺激した。細胞をＭ
ＳＤ溶解緩衝液によって溶解して、適当なＭＳＤアッセイプレートを用いて、上記のよう
に製造元の指示に従って、細胞のシグナリングを評価した。

【0247】

低親和性ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメインは、６１０ｎＭのＩＣ_５０でｃ−Ｍｅｔのリン酸
化を阻害した（図６）。予想されるように、ＥＧＦＲ ＦＮ３ドメインは、ｃ−Ｍｅｔリ
ン酸化を阻害することができず、単特異性分子の混合物は、ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン
単独と同一であるように思われた。しかし、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、１
ｎＭのＩＣ_５０でｃ−Ｍｅｔのリン酸化を阻害し（図６）、ｃ−Ｍｅｔ単特異性分子単独
と比較して効力の改善の２対数を超えるシフトをもたらした。

【0248】

結合力の効果を通してｃ−Ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲリン酸化の阻害を増強する二重特
異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の可能性を、多様なｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲ密度及び比率
を有する多数の細胞タイプにおいて評価した（図７）。ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＮＣＩ−Ｈ４
４１、又はＮＣＩ−Ｈ５９６細胞を、９６ウェルプレートにおいて、１０％ ＦＢＳを含
むＲＰＭＩ培地中で播種した。２４時間後、培地を無血清ＲＰＭＩに交換した。血清枯渇
の２４時間後、細胞を多様な濃度の単特異性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン、単特異性ｃ−
Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン、又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子（ＥＣＢ５、Ｐ５３
Ａ１Ｒ５−１７ｖ２及びＰ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３からなる）によって処置した。細胞
を、単特異性又は二重特異性分子によって１時間処置した後、ＥＧＦ、ＨＧＦ、又はＥＧ
ＦとＨＧＦの組み合わせによって３７℃、５％ ＣＯ_２で１５分間刺激した。細胞をＭＳ
Ｄ溶解緩衝液によって溶解して、適当なＭＳＤアッセイプレートを用いて、上記のように
製造元の指示に従って、細胞のシグナリングを評価した。

【0249】

図７（Ａ〜Ｃ）は、３つの異なる細胞株における二重特異性ＥＧＦＲ／ｃＭｅｔ分子と
比較して、単特異性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを用いたＥＧＦＲの阻害を示す。ＥＧＦ
Ｒリン酸化アッセイにおける結合力を評価するために、中等度の親和性のＥＧＦＲ結合Ｆ
Ｎ３ドメイン（１．９ｎＭ）（Ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２）を、高親和性ｃ−Ｍｅｔ結合
ＦＮ３ドメインに連結させた同じＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン（０．４ｎＭ）（Ｐ１１４
ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３）を含む二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子と比較した。Ｈ２９２
及びＨ５９６細胞において、ＥＧＦＲのリン酸化の阻害は、単特異性分子と二重特異性分
子とで同等であり（図７Ａ及び７Ｂ）、その理由はおそらく、これらの細胞株がＥＧＦＲ
対ｃ−Ｍｅｔ受容体の高い比率を有するためであった。この理論を試験するために、ＥＧ
ＦＲリン酸化の阻害を、ＥＧＦＲより多くのｃ−Ｍｅｔ受容体を示すＮＣＩ−Ｈ４４１細
胞において評価した。ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子に
よって処置すると、単特異性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと比較してＥＧＦＲリン酸化の
阻害に関するＩＣ_５０を３０倍減少させた（図７Ｃ）。

【0250】

二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子によって効力が増加する可能性を、ＥＧＦＲに対
して高い親和性（０．２６ｎＭ）及びｃ−Ｍｅｔ（１０．１ｎＭ）に対して中等度の親和
性を有する分子を用いて、ｃ−Ｍｅｔリン酸化アッセイにおいて評価した。ＮＣＩ−Ｈ２
９２及びＮＣＩ−Ｈ５９６細胞の両方において、ｃ−Ｍｅｔのリン酸化の阻害は、単特異
的ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインと比較して二重特異性分子ではそれぞれ、１３４倍及び
１０１２倍増強された（図７Ｄ及び７Ｅ）。

【0251】

二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子によるＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害に
関する効力の増加は、シグナリング及び増殖の阻害の増強に言い換えられることが確認さ
れた。これらの実験に関して、ＦＮ３ ＥＧＦＲ結合及びｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン
の混合物を二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子と比較した。表１７及び１８に記述され
るように、ＥＲＫリン酸化のＩＣ_５０（表１７）及びＨ２９２細胞の増殖（表１８）は、
単特異性結合体の混合物と比較して、細胞を二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子で処置
すると、減少した。二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子に関するＥＲＫリン酸化の阻害
のＩＣ_５０は、単特異性ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメインの混合物と比較して１
４３倍低く、このアッセイにおける分子の効力に対する結合力の効果を示した。表１７に
おいて、単特異性ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、完全に活性を阻害せず
、それゆえ示されたＩＣ_５０値は、下限であるとみなすべきである。増殖アッセイを、混
合物又は二重特異性フォーマットで連結された形のいずれかとして、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍ
ｅｔ結合ＦＮ３ドメインの異なる組み合わせを用いて行った。二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−
Ｍｅｔ分子の阻害又は増殖のＩＣ_５０は、単特異性の親ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ
３ドメインの混合物と比較して３４〜２３６倍低かった。このことは受容体のレベルで観
察された結合力の効果（図６及び図７）が、細胞シグナリングの阻害（表１７）及び細胞
増殖の阻害（表１８）の改善に言い換えられることを確認した。

【0252】

【表17】

【0253】

【表18】

【0254】

インビトロ腫瘍異種移植片：ＰＫ／ＰＤ
単特異性及び二重特異性ＦＮ３ドメイン分子のインビボでの効能を決定するために、腫
瘍細胞を、ヒトＨＧＦを分泌するように改変した（マウスＨＧＦはヒトＨＧＦに結合しな
い）。ヒトＨＧＦを、レンチウイルス感染を用いてＮＣＩ−Ｈ２９２細胞において安定に
発現させた（ヒトＨＧＦを発現するレンチウイルスＤＮＡベクター（受託番号Ｘ１６３２
２）及びＧｅｎｅｃｏｐｏｅｉａからのレンチウイルスパッケージングキット）。感染後
、ＨＧＦ発現細胞を４μｇ／ｍＬピューロマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって選
択した。ヒトＨＧＦタンパク質を、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙのアッセ
イプレートを用いてプールした細胞の条件培地で検出した。

【0255】

ＳＣＩＤ Ｂｅｉｇｅマウスに、ヒトＨＧＦを発現するＮＣＩ−Ｈ２９２細胞（容積２
００μＬのＣｕｌｔｒｅｘ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）中で２．０×１０^６個）を各動物の背側
脇腹に皮下接種した。腫瘍の測定は、腫瘍の体積が１５０〜２５０ｍｍ^３の範囲となるま
で週に２回行った。次に、マウスに、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子（半減期を増
加させるためにアルブミン結合ドメインに連結させた）又はＰＢＳビヒクルの１回腹腔内
投与を行った。投与後６時間又は７２時間目に、腫瘍を摘出して、直ちに液体窒素中で凍
結した。心穿刺により、血液試料を、プロテアーゼ阻害剤を含む３．８％クエン酸中に採
取した。採取後直ちに、血液試料を遠心沈降させて、得られた血漿を試験管に移し、−８
０℃で保存した。腫瘍の重量を測定し、小片に切断して、ＨＡＬＴプロテアーゼ／ホスフ
ァターゼ阻害剤（Ｐｉｅｒｃｅ）、５０ｍＭフッ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭ活
性化オルトバナジン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、及び１ｍＭ ＰＭＳＦ（Ｍｅｓｏ Ｓ
ｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を有するＲＩＰＡ緩衝液を含むＬｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒ
ｉｘ Ａ試験管（ＬＭＡ）中で溶解した。溶解物をＬＭＡマトリクスから取り出して、遠
心沈降して不溶性タンパク質を除去した。可溶性の腫瘍タンパク質を、ＢＣＡタンパク質
アッセイによって定量して、腫瘍溶解緩衝液中で同等のタンパク質レベルに希釈した。リ
ン酸化ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、及びＥＲＫを、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ
ｙのアッセイプレートを用いて測定した（製造元のプロトコルに従って、及び上記のよう
に）。

【0256】

図８は、実験の結果を示す。各二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、６時間及び７
２時間の両方で、リン酸化ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、及びＥＲＫレベルを有意に減少させた
。図８に示したデータは、ｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲの両方を同時に阻害する重要性、及び
各受容体に関する二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の親和性が下流のＥＲＫの阻害に
おいてどのような役割を果たすかを示している。高親和性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを
含む分子（Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２；図において「８３」で示す、Ｋ_Ｄ＝０．２６ｎＭ）
は、６時間及び７２時間の両方で中等度親和性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを含む分子（
Ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２；図において「１７」で示す、Ｋ_Ｄ＝１．９ｎＭ）と比較して
大きい程度にＥＧＦＲのリン酸化を阻害した。試験した４つ全ての二重特異性分子は、親
和性によらず、６時間の時点でＥＲＫのリン酸化を完全に阻害した。７２時間の時点で、
高親和性ｃ−Ｍｅｔ結合ドメインを含む分子（Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３；図において
「Ａ３」として示す、Ｋ_Ｄ＝０．４ｎＭ）は、中等度親和性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイ
ンを含む分子（Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５；図において「Ａ５」として示す、Ｋ_Ｄ＝１
０．１ｎＭ；Ｆｉｇｕｒｅ ６）と比較してＥＲＫのリン酸化を有意に阻害した。

【0257】

各二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の濃度を、投与後６時間及び７２時間の血液中
及び腫瘍中で測定した（図９）。興味深いことに、中等度親和性ＥＧＦＲ結合ドメイン（
Ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２；Ｋ_Ｄ＝１．９ｎＭ）は、他の分子と比較して６時間で有意に
より多くの腫瘍での蓄積を示したが、高親和性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン（Ｐ１１４
ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３；Ｋ_Ｄ＝０．４ｎＭ）は示さず、その差は７２時間までに消失した。
腫瘍外の細胞は、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔ両方の表面発現レベルがより低く、それゆえ、
中等度親和性ＥＧＦＲ分子は、高親和性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと比較して、正常組
織に堅固に結合しないという仮説を立てることができる。それゆえ、より多くの遊離の中
等度親和性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインが腫瘍との結合に利用できる。それゆえ、各受容
体に対して適切な親和性を同定することにより、全身毒性の減少及び腫瘍蓄積の増加を有
する治療薬を同定することができる。

【0258】

二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子による腫瘍の効能試験
ＳＣＩＤ Ｂｅｉｇｅマウスに、ヒトＨＧＦを発現するＮＣＩ−Ｈ２９２細胞（２００
μＬのＣｕｌｔｒｅｘ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）中で２．０×１０^６個）を各動物の背側脇腹
に皮下接種した。植え込みの１週間後、マウスを同等の腫瘍体積（平均腫瘍体積＝７７．
９±１．７ｍｍ^３）を有する群に分けた。マウスに、二重特異性分子を週に３回投与して
、腫瘍の体積を週に２回記録した。腫瘍の増殖阻害（ＴＧＩ）を、ｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦ
Ｒに対して様々な親和性を有する４つの異なる二重特異性分子について観察した。図１０
は、ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインが中等度親和性を有するとき、中等度親和性ＥＧＦＲ
結合ＦＮ３ドメインと比較して高親和性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを含む分子で処置し
たマウスでは腫瘍増殖の遅れが観察されたことから、ｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲの両方を阻
害する恩典を示す（△対▲、Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２−Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５をＰ
５３Ａ１Ｒ５−１７−Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５と比較）。加えて、データは、高又は
中等度親和性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのいずれかを含む二重特異性分子として高親和
性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを有する重要性を示しているが、高親和性ｃ−Ｍｅｔ結
合ＦＮ３ドメインは、最も高い効能を示した（灰色の点線と黒色の実線、Ｐ５４ＡＲ４−
８３ｖ２−Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３とＰ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２−Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ
９４−Ａ３）。

【0259】

二重特異性分子並びにＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔの他の阻害剤の効能
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子（ＥＣＢ３８）及び低分子阻害剤クリゾチニブ（
ｃ−Ｍｅｔ阻害剤）及びエルロチニブ（ＥＧＦＲ阻害剤）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ抗
体）のそれぞれ単剤としての、並びにクリゾチニブとエルロチニブの併用のインビボ治療
効能を、ＳＣＩＤ／ＢｅｉｇｅマウスにおけるＨ２９２−ＨＧＦヒト肺がん皮下異種移植
片モデルの処置において評価した（図１１）。

【0260】

Ｈ２９２−ＨＧＦ細胞を、ウシ胎児血清（１０％ｖ／ｖ）及びＬ−グルタミン（２ｍＭ
）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で、５％ ＣＯ２を含む空気環境下で３７℃でイン
ビトロで維持した。細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡ処置によって週に２回サブクローニン
グした。指数増殖相で増殖する細胞を回収して、腫瘍接種のために計数した。

【0261】

各マウスの右脇腹領域に、腫瘍を発達させるためのｃｕｌｔｒｅｘを含むＰＢＳ（１：
１）０．１ｍＬ中のＨ２９２−ＨＧＦ腫瘍細胞（２×１０^６個）を皮下接種した。平均腫
瘍サイズが１３９ｍｍ^３に達したときに処置を開始した。各試験群における試験物質の投
与及び動物番号を、以下の実験計画表に示す（表２６）。腫瘍細胞接種日を０日目とした
。

【0262】

【表19】

Ｎ：動物数ｐ．ｏ．：経口投与ｉ．ｐ．：腹腔内注射を週に３回；用量は、週の１、３
、及び５日目に投与する。
ＱＤ：１日１回。Ｑ４ｄ：４日ごとに１回クリゾチニブとエルロチニブの併用の間隔は
０．５時間であった。投与体積は、体重に基づいて調節した（１０ｌ／ｇ）。ａ：群分け
後の１４日目には投与を行わなかった。

【0263】

処置開始前、全ての動物の体重を測定して、腫瘍体積を測定した。腫瘍体積は任意の所
定の処置の有効性に影響を及ぼし得ることから、その腫瘍体積に基づく無作為ブロックデ
ザインを用いてマウスを群分けした。これによって、全ての群がベースラインで確実に同
等となる。無作為化ブロックデザインを用いて、実験動物を群に割り付けした。第一に、
実験動物をその初回腫瘍体積に従って均一ブロックに分けた。次に、各ブロック内で処置
に対する実験動物の無作為化を行った。実験動物を割り付けするために無作為化ブロック
デザインを用いることにより、各動物が、所定の処置に割り付けられる確率が同じである
ことが確保され、それゆえ、系統的誤差が減少した。

【0264】

通常のモニタリング時に、動物を、運動性、飼料及び水の摂取の目視での推定、体重増
加／減少（体重は週に２回測定した）、つやのない眼／毛、及び他の任意の異常な効果な
どの、通常行動に及ぼす腫瘍増殖及び処置の任意の影響に関してチェックした。

【0265】

主要なエンドポイントは、腫瘍の増殖を遅らせることができるか否か、又は腫瘍を有す
るマウスを治癒できるか否かであった。腫瘍の大きさは、カリパスを用いて２つの寸法を
週に２回測定して、ａ及びｂがそれぞれ、腫瘍の長径及び短径である、式：Ｖ＝０．５ａ
×ｂ^２を用いて体積をｍｍ^３で表記した。次に、腫瘍サイズをＴ−Ｃ及びＴ／Ｃ値の計算
のために用いた。Ｔ−Ｃは、処置群の平均腫瘍サイズが１０００ｍｍ^３に達するのに要す
る時間（日数）としてＴから計算され、Ｃは、対照群の平均腫瘍サイズが同じサイズに達
するまでの時間（日数）であった。Ｔ／Ｃ値（％）は、抗腫瘍効能の指標であった。Ｔ及
びＣはそれぞれ、所定の日の処置群及び対照群の平均体積であった。完全な腫瘍の退縮（
ＣＲ）は、触診下限（６２．５ｍｍ^３）より下まで低減された腫瘍として定義される。部
分的な腫瘍退縮（ＰＲ）は、初回の腫瘍体積から低減された腫瘍として定義される。少な
くとも３回以上連続した腫瘍測定でＣＲ又はＰＲが持続することは、ＣＰ又はＰＲが持続
可能であると考えられるために必要である。

【0266】

体重減少が２０％を超える動物、又は群の平均腫瘍サイズが２０００ｍｍ^３を超える動
物は安楽死させた。最終投与後２週間の観察後に試験を終了した。

【0267】

各時点の各群の腫瘍体積に関して、平均値及び平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を含む要約
統計量を提供する（以下の表１９に示す）。群における腫瘍体積の差の統計分析は、一元
配置ＡＮＯＶＡの後にＧａｍｅｓ−Ｈｏｗｅｌｌ（等分散を仮定しない）を用いる個々の
比較を用いることによって評価した。データは全て、ＳＰＳＳ １８．０を用いて分析し
た。ｐ＜０．０５は、統計学的に有意であると考えられた。

【0268】

【表20】

【0269】

ビヒクル処置群（群１）の平均腫瘍サイズは、腫瘍接種後２３日目に１，７５８ｍｍ^３
に達した。用量レベル２５ｍｇ／ｋｇの二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子によって処
置すると（群２）、全てのマウスにおいて完全な腫瘍の退縮（ＣＲ）が起こり、これは３
回より多くの連続腫瘍測定の間持続した（平均値ＴＶ＝２３ｍｍ^３、Ｔ／Ｃ値＝１％、２
３日目でのビヒクル群と比較してｐ＝０．００４）。

【0270】

用量レベル５０ｍｇ／ｋｇの単剤としてのクリゾチニブによる処置（群３）は、抗腫瘍
活性を示さなかった；平均腫瘍サイズは２３日目に２，１０２ｍｍ^３であった（Ｔ／Ｃ値
＝１２０％、ビヒクル群と比較してｐ＝０．９４４）。

【0271】

用量レベル５０ｍｇ／ｋｇの単剤としてのエルロチニブによる処置（群４）は、軽微な
抗腫瘍活性を示したが、ビヒクル群と比較して有意差は認められなかった。平均腫瘍サイ
ズは２３日目で１，１２２ｍｍ^３であり（Ｔ／Ｃ値＝６４％、ビヒクル群と比較してｐ＝
０．４２９）、１，０００ｍｍ^３の腫瘍サイズではビヒクル群と比較して腫瘍増殖の４日
間の遅れを示した。

【0272】

クリゾチニブ（５０ｍｇ／ｋｇ、群５）とエルロチニブ（５０ｍｇ／ｋｇ、群５）の併
用は、有意な抗腫瘍活性を示した。平均腫瘍サイズは２３日目で２６５ｍｍ^３であり（Ｔ
／Ｃ値＝１５％、ｐ＝０．００８）、１，０００ｍｍ^３の腫瘍サイズではビヒクル群と比
較して腫瘍増殖の１７日間の遅れを示した。

【0273】

単剤としての用量レベル１ｍｇ／マウスのセツキシマブ（群６）は、有意な抗腫瘍活性
を示した。平均腫瘍サイズは２３日目で４８５ｍｍ^３であり（Ｔ／Ｃ値＝２８％、ｐ＝０
．０１８）、１，０００ｍｍ^３の腫瘍サイズではビヒクル群と比較して腫瘍増殖の１７日
間の遅れを示した。図１１は、様々な治療の抗腫瘍活性を示す。

【0274】

【表21】

【0275】

ビヒクル群では中等度から重度の体重減少が観察され、これは腫瘍の負荷の増加による
ものであり得る。マウス３匹が死亡し、２３日目までにＢＷＬ＞２０％となったマウス１
匹を安楽死させた。群２では二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の軽度の毒性が観察さ
れた。処置機関の間にＢＷＬ＞２０％となったマウス３匹を安楽死させた。２週間の観察
期間の間処置を中止すると、体重は徐々に回復した。クリゾチニブ又はエルロチニブ単剤
治療群では、ビヒクル群と比較してより重度の体重減少が観察され、処置関連毒性を示唆
した。クリゾチニブとエルロチニブの併用は、投与相の間、一般的に認容されたが、試験
終了時には重度の体重減少が観察され、これは非処置期間での急速な腫瘍増殖の再開によ
るものであり得る。セツキシマブの単剤治療は、試験において良好に認容された。腫瘍増
殖の再開により、試験終了時に限って体重減少が観察された。

【0276】

要約すると、２５ｍｇ／ｋｇの二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子（週に３回×３週
間）は、ＳＣＩＤ／ＢｅｉｇｅマウスのＨ２９２−ＨＧＦヒト肺がん異種移植片モデルに
おいて完全奏功をもたらした。処置は、マウス１０匹中７匹において認容され、マウス１
０匹中３匹には重度の体重減少が起こった。図１１及び表２０は、処置後の時点での腫瘍
サイズに及ぼす様々な治療の影響を示す。

【0277】

実施例９：二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の半減期延長
タンパク質の腎臓での濾過を低減させ、このようにタンパク質の血清半減期を増加させ
るために様々な方法が記述されており、これには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又
は他のポリマーによる修飾、アルブミンとの結合、アルブミン又は他の血清タンパク質に
結合するタンパク質ドメインとの融合、アルブミンとの遺伝的融合、ＩｇＧ ｆｃドメイ
ンとの融合、及び長い非構造アミノ酸配列との融合が挙げられる。

【0278】

流体力学半径を増加させるために、分子のＣ−末端で遊離のシステインを組み入れるこ
とによって、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子をＰＥＧによって修飾した。最も一般
的に、システイン残基の遊離のチオール基を用いて、標準的な方法を用いてマレイミド又
はヨードアセテミド（iodoacetemide）基で官能化したＰＥＧ分子に結合させる。１００
０、２０００、５０００、１０，０００、２０，０００、又は４０，０００ｋＤａの直鎖
状ＰＥＧを含む様々な型のＰＥＧを用いて、タンパク質を修飾することができる。これら
の分子量の分枝状ＰＥＧもまた、修飾のために用いることができる。ＰＥＧ基はまた、い
くつかの例において二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子中の一級アミンを通して結合さ
せることもできる。

【0279】

ＰＥＧ化に加えて、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の半減期は、天然に存在する
３−へリックスバンドルの血清アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）又はコンセンサスアル
ブミン結合ドメイン（ＡＢＤＣｏｎ）との融合分子としてこれらのタンパク質を産生する
ことによって延長した。これらのタンパク質ドメインを、表１６に記述される任意のリン
カーを介してｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインのＣ−末端に連結させた。ＡＢＤ又はＡＢＤ
Ｃｏｎドメインもまた、一次配列のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインとｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３
ドメインの間に配置され得る。

【0280】

実施例１０：選択した二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の特徴づけ
選択したＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子を、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔの両方に対するその親
和性、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔ自己リン酸化のその阻害能、並びにＨＧＦ細胞の増殖に及
ぼすその効果に関して特徴を調べた。組み換え型ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔ細胞外ド
メインに対する二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の結合親和性を、実施例３に記述さ
れるプロトコルに従ってＰｒｏｔｅｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ）を用い
る表面プラズモン共鳴法によって調べた。特徴づけの結果を表２１に示す。

【0281】

【表22】

【0282】

実施例１１：システイン改変二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の作製及び特徴づけ
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の作製
Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２変異体（実施例５）のシステインスキャニングから得られたデ
ータに基づき、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子において、Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２
（配列番号２７）、ｃＭｅｔ結合体Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５−Ｃ５ｖ２（配列番号１１４）
、及び半減期延長のためのアルブミン結合ドメインからなるＥＣＢ１４７（配列番号２１
８及び２５６）と表示されるシステイン変異体も設計した。これらの３つのドメインは、
（Ａｌａ−Ｐｒｏ）_５リンカー（配列番号８１）によって接続される。１個、２個、又は
４個のシステインを有する変種を、ＦＮ３ドメインの１つのＣ−末端、リンカー領域、又
はＬｙｓ−６２位置での置換によって設計した（配列番号２１９〜２２５及び２５７〜２
６３）。別の二重特異性変種ＥＣＢ８２ｃｙｓ（配列番号２２６及び２６４）は、３つ全
てのドメインがＡＰリンカーによって接続されたＰ５４ＡＲ４−８３ｖ２（配列番号２７
）、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３ｖ２２（配列番号１１１）、及びアルブミン結合ドメイ
ンの変種、並びに１つのＣ−末端システインからなる。非標的化Ｔｅｎｃｏｎ足場構造（
配列番号２６５）の追加のシステイン変種もまた、対照コンジュゲートの構築のために用
いた。変種は全て、先の実施例に記述されるように構築して、発現させ、精製した。純度
はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって評価した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ５／１５０カラム
（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる分析的サイズ排除クロマトグラフィーは、ＦＮ
３ドメイン調製物が凝集物を含まず、単量体タンパク質と一貫する時間で溶出することを
示している。質量分析により、理論的質量と一致した質量が決定された（表２２）。

【0283】

【表23】

【0284】

化学コンジュゲーション
精製二重特異性システイン変種をマレイミド含有分子に化学的にコンジュゲートするた
めに、タンパク質を最初にＴＣＥＰで還元して遊離のチオールを生成した。各二重特異性
システイン変種１〜２ｍｇを、中性ｐＨで過剰量のＴＣＥＰ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号
６４６５４７）と混合して、ＲＴで３０〜６０分間インキュベートした。３倍量の飽和硫
酸アンモニウム溶液（４．０２Ｍ）を添加して、システイン変種を沈殿させることによっ
て、ＴＣＥＰを除去した。１６０００〜２００００×ｇで４℃で２０分間遠心沈降して上
清を除去後、タンパク質沈降物をＰＢＳ又はリン酸ナトリウム緩衝液に溶解して、マレイ
ミド含有分子の５〜１０倍過剰量と直ちに混合した。反応を室温で３０〜６０分間インキ
ュベートした後、過剰量のマレイミドを除去するために、システイン又はβ−メルカプト
エタノールなどの過剰量の遊離のチオールによって停止させた。非結合マレイミドを、Ｚ
ｅｂａ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号８９８９０）で、Ｔｏｓｏｈ Ｇ３００
０ＳＷｘｌカラム（＃Ｐ４６１９−１４Ｎ；７．８ｍｍ×３０ｃｍ；５μｍ）を備えた分
取用ＳＥＣによって、又はシステイン変種をＮｉ−ＮＴＡ樹脂に結合させて、洗浄して、
本質的に上記のように溶出させることによって除去した。コンジュゲートの特徴を、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ及び質量分析によって調べた。この一般法を用いて、二重特異性システイン
変種を、蛍光マレイミド（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号６２２４５）、ＰＥＧ２４−マレ
イミド（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ、カタログ番号１０３１９）、及びマレイミ
ド−細胞毒素分子に、様々なリンカー（図２の構造を参照）によってコンジュゲートした
。

【0285】

ＥＧＦ刺激ＥＧＦＲリン酸化の阻害
精製二重特異性ＰＥＧ２４−マレイミドコンジュゲートを、ヒト腫瘍細胞株ＮＣＩ−Ｈ
２９２（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、カタロ
グ番号ＣＲＬ−１８４８）において、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）のＥＧＦＲ ｐｈｏｓｐｈｏ（Ｔｙｒ１１７３）キットを
用いて、実施例３に記述されるように、ＥＧＦＲのＥＧＦ刺激リン酸化の阻害能に関して
試験した。コンジュゲートを、ＥＣＢ１４７とはアミノ酸２個が異なる非修飾ＥＣＢ３８
（配列番号１０９）と比較した。コンジュゲート及びＥＣＢ３８は、表２３に示されるよ
うに、類似のＩＣ_５０値でＥＧＦＲを阻害し、設計された部位での修飾が標的の結合に有
意に影響を及ぼさないことを証明した。

【0286】

【表24】

【0287】

ＨＧＦ刺激ｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害
精製二重特異性ＰＥＧ２４−マレイミドコンジュゲートをまた、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ
Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）のｃ−Ｍｅｔ ｐｈｏｓｐｈ
ｏｒ（Ｔｙｒ１３４９）キットを用いて、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞におけるｃ−ＭｅｔのＨ
ＧＦ刺激リン酸化の阻害能に関して、実施例７に記述されるように試験した。コンジュゲ
ート及びＥＣＢ３８は、表２４に示されるように、類似のＩＣ_５０でｃＭｅｔを阻害し、
これらの部位での修飾が標的の結合に有意に影響を及ぼさないことを証明した。

【0288】

【表25】

【0289】

細胞障害性アッセイ
ＥＣＢ１４７システイン変種、８３ｖ２−ｃｙｓ、又はアウリスタチンファミリーの細
胞障害性チューブリン阻害剤に連結されたＴｅｎｃｏｎ−ｃｙｓからなるコンジュゲート
（図２）を、がん細胞における標的依存的細胞障害性に関して試験した。阻害剤を、非切
断型ＰＥＧ_４リンカー、又は酵素切断型バリン−シトルリン又はバリン−リジンリンカー
を介してシステイン含有タンパク質に連結させた。殺細胞を、実施例４に記述される技法
を用いて、タンパク質−細胞毒素コンジュゲートに暴露後のＥＧＦＲ過剰発現ヒト腫瘍細
胞株Ｈ１５７３及びＡ４３１並びにＥＧＦＲ陰性腫瘍細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５の生存
率を測定することによって評価した。表２５は、６６、７２、又は９０時間の時点で、Ｃ
ｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ又はＩｎｃｕＣｙｔｅオブジェクトカウントデータの分析から得
られたＩＣ_５０を報告する。タンパク質−薬物コンジュゲートは、標的抗原ＥＧＦＲを発
現する細胞の強力な殺細胞を示した。多数の薬物のコンジュゲートもまた、調べた多くの
細胞株において細胞障害性の増加を示した。

【0290】

【表26】

【0291】

【表27-1】

【0292】

【表27-2】

【0293】

【表27-3】

【0294】

【表27-4】

【0295】

【表27-5】

【0296】

【表27-6】

【0297】

配列番号７３，ＰＲＴ，ヒト，ＥＧＦＲ
１ ｍｒｐｓｇｔａｇａａ ｌｌａｌｌａａｌｃｐ ａｓｒａｌｅｅｋｋｖ ｃｑｇｔ
ｓｎｋｌｔｑ ｌｇｔｆｅｄｈｆｌｓ ｌｑｒｍｆｎｎｃｅｖ
６１ ｖｌｇｎｌｅｉｔｙｖ ｑｒｎｙｄｌｓｆｌｋ ｔｉｑｅｖａｇｙｖｌ ｉａｌ
ｎｔｖｅｒｉｐ ｌｅｎｌｑｉｉｒｇｎ ｍｙｙｅｎｓｙａｌａ
１２１ ｖｌｓｎｙｄａｎｋｔ ｇｌｋｅｌｐｍｒｎｌ ｑｅｉｌｈｇａｖｒｆ ｓｎ
ｎｐａｌｃｎｖｅ ｓｉｑｗｒｄｉｖｓｓ ｄｆｌｓｎｍｓｍｄｆ
１８１ ｑｎｈｌｇｓｃｑｋｃ ｄｐｓｃｐｎｇｓｃｗ ｇａｇｅｅｎｃｑｋｌ ｔｋ
ｉｉｃａｑｑｃｓ ｇｒｃｒｇｋｓｐｓｄ ｃｃｈｎｑｃａａｇｃ
２４１ ｔｇｐｒｅｓｄｃｌｖ ｃｒｋｆｒｄｅａｔｃ ｋｄｔｃｐｐｌｍｌｙ ｎｐ
ｔｔｙｑｍｄｖｎ ｐｅｇｋｙｓｆｇａｔ ｃｖｋｋｃｐｒｎｙｖ
３０１ ｖｔｄｈｇｓｃｖｒａ ｃｇａｄｓｙｅｍｅｅ ｄｇｖｒｋｃｋｋｃｅ ｇｐ
ｃｒｋｖｃｎｇｉ ｇｉｇｅｆｋｄｓｌｓ ｉｎａｔｎｉｋｈｆｋ
３６１ ｎｃｔｓｉｓｇｄｌｈ ｉｌｐｖａｆｒｇｄｓ ｆｔｈｔｐｐｌｄｐｑ ｅｌ
ｄｉｌｋｔｖｋｅ ｉｔｇｆｌｌｉｑａｗ ｐｅｎｒｔｄｌｈａｆ
４２１ ｅｎｌｅｉｉｒｇｒｔ ｋｑｈｇｑｆｓｌａｖ ｖｓｌｎｉｔｓｌｇｌ ｒｓ
ｌｋｅｉｓｄｇｄ ｖｉｉｓｇｎｋｎｌｃ ｙａｎｔｉｎｗｋｋｌ
４８１ ｆｇｔｓｇｑｋｔｋｉ ｉｓｎｒｇｅｎｓｃｋ ａｔｇｑｖｃｈａｌｃ ｓｐ
ｅｇｃｗｇｐｅｐ ｒｄｃｖｓｃｒｎｖｓ ｒｇｒｅｃｖｄｋｃｎ
５４１ ｌｌｅｇｅｐｒｅｆｖ ｅｎｓｅｃｉｑｃｈｐ ｅｃｌｐｑａｍｎｉｔ ｃｔ
ｇｒｇｐｄｎｃｉ ｑｃａｈｙｉｄｇｐｈ ｃｖｋｔｃｐａｇｖｍ
６０１ ｇｅｎｎｔｌｖｗｋｙ ａｄａｇｈｖｃｈｌｃ ｈｐｎｃｔｙｇｃｔｇ ｐｇ
ｌｅｇｃｐｔｎｇ ｐｋｉｐｓｉａｔｇｍ ｖｇａｌｌｌｌｌｖｖ
６６１ ａｌｇｉｇｌｆｍｒｒ ｒｈｉｖｒｋｒｔｌｒ ｒｌｌｑｅｒｅｌｖｅ ｐｌ
ｔｐｓｇｅａｐｎ ｑａｌｌｒｉｌｋｅｔ ｅｆｋｋｉｋｖｌｇｓ
７２１ ｇａｆｇｔｖｙｋｇｌ ｗｉｐｅｇｅｋｖｋｉ ｐｖａｉｋｅｌｒｅａ ｔｓ
ｐｋａｎｋｅｉｌ ｄｅａｙｖｍａｓｖｄ ｎｐｈｖｃｒｌｌｇｉ
７８１ ｃｌｔｓｔｖｑｌｉｔ ｑｌｍｐｆｇｃｌｌｄ ｙｖｒｅｈｋｄｎｉｇ ｓｑ
ｙｌｌｎｗｃｖｑ ｉａｋｇｍｎｙｌｅｄ ｒｒｌｖｈｒｄｌａａ
８４１ ｒｎｖｌｖｋｔｐｑｈ ｖｋｉｔｄｆｇｌａｋ ｌｌｇａｅｅｋｅｙｈ ａｅ
ｇｇｋｖｐｉｋｗ ｍａｌｅｓｉｌｈｒｉ ｙｔｈｑｓｄｖｗｓｙ
９０１ ｇｖｔｖｗｅｌｍｔｆ ｇｓｋｐｙｄｇｉｐａ ｓｅｉｓｓｉｌｅｋｇ ｅｒ
ｌｐｑｐｐｉｃｔ ｉｄｖｙｍｉｍｖｋｃ ｗｍｉｄａｄｓｒｐｋ
９６１ ｆｒｅｌｉｉｅｆｓｋ ｍａｒｄｐｑｒｙｌｖ ｉｑｇｄｅｒｍｈｌｐ ｓｐ
ｔｄｓｎｆｙｒａ ｌｍｄｅｅｄｍｄｄｖ ｖｄａｄｅｙｌｉｐｑ
１０２１ ｑｇｆｆｓｓｐｓｔｓ ｒｔｐｌｌｓｓｌｓａ ｔｓｎｎｓｔｖａｃｉ ｄ
ｒｎｇｌｑｓｃｐｉ ｋｅｄｓｆｌｑｒｙｓ ｓｄｐｔｇａｌｔｅｄ
１０８１ ｓｉｄｄｔｆｌｐｖｐ ｅｙｉｎｑｓｖｐｋｒ ｐａｇｓｖｑｎｐｖｙ ｈ
ｎｑｐｌｎｐａｐｓ ｒｄｐｈｙｑｄｐｈｓ ｔａｖｇｎｐｅｙｌｎ
１１４１ ｔｖｑｐｔｃｖｎｓｔ ｆｄｓｐａｈｗａｑｋ ｇｓｈｑｉｓｌｄｎｐ ｄ
ｙｑｑｄｆｆｐｋｅ ａｋｐｎｇｉｆｋｇｓ ｔａｅｎａｅｙｌｒｖ
１２０１ ａｐｑｓｓｅｆｉｇａ

【0298】

【表28】

【0299】

配列番号７５，ＰＲＴ，ヒト，テナシン−Ｃ
１ ｍｇａｍｔｑｌｌａｇ ｖｆｌａｆｌａｌａｔ ｅｇｇｖｌｋｋｖｉｒ ｈｋｒｑ
ｓｇｖｎａｔ ｌｐｅｅｎｑｐｖｖｆ ｎｈｖｙｎｉｋｌｐｖ
６１ ｇｓｑｃｓｖｄｌｅｓ ａｓｇｅｋｄｌａｐｐ ｓｅｐｓｅｓｆｑｅｈ ｔｖｄ
ｇｅｎｑｉｖｆ ｔｈｒｉｎｉｐｒｒａ ｃｇｃａａａｐｄｖｋ
１２１ ｅｌｌｓｒｌｅｅｌｅ ｎｌｖｓｓｌｒｅｑｃ ｔａｇａｇｃｃｌｑｐ ａｔ
ｇｒｌｄｔｒｐｆ ｃｓｇｒｇｎｆｓｔｅ ｇｃｇｃｖｃｅｐｇｗ
１８１ｋｇｐｎｃｓｅｐｅｃ ｐｇｎｃｈｌｒｇｒｃ ｉｄｇｑｃｉｃｄｄｇ ｆｔｇ
ｅｄｃｓｑｌａ ｃｐｓｄｃｎｄｑｇｋ ｃｖｎｇｖｃｉｃｆｅ
２４１ ｇｙａｇａｄｃｓｒｅ ｉｃｐｖｐｃｓｅｅｈ ｇｔｃｖｄｇｌｃｖｃ ｈｄ
ｇｆａｇｄｄｃｎ ｋｐｌｃｌｎｎｃｙｎ ｒｇｒｃｖｅｎｅｃｖ
３０１ ｃｄｅｇｆｔｇｅｄｃ ｓｅｌｉｃｐｎｄｃｆ ｄｒｇｒｃｉｎｇｔｃ ｙｃ
ｅｅｇｆｔｇｅｄ ｃｇｋｐｔｃｐｈａｃ ｈｔｑｇｒｃｅｅｇｑ
３６１ ｃｖｃｄｅｇｆａｇｖ ｄｃｓｅｋｒｃｐａｄ ｃｈｎｒｇｒｃｖｄｇ ｒｃ
ｅｃｄｄｇｆｔｇ ａｄｃｇｅｌｋｃｐｎ ｇｃｓｇｈｇｒｃｖｎ
４２１ ｇｑｃｖｃｄｅｇｙｔ ｇｅｄｃｓｑｌｒｃｐ ｎｄｃｈｓｒｇｒｃｖ ｅｇ
ｋｃｖｃｅｑｇｆ ｋｇｙｄｃｓｄｍｓｃ ｐｎｄｃｈｑｈｇｒｃ
４８１ ｖｎｇｍｃｖｃｄｄｇ ｙｔｇｅｄｃｒｄｒｑ ｃｐｒｄｃｓｎｒｇｌ ｃｖ
ｄｇｑｃｖｃｅｄ ｇｆｔｇｐｄｃａｅｌ ｓｃｐｎｄｃｈｇｑｇ
５４１ ｒｃｖｎｇｑｃｖｃｈ ｅｇｆｍｇｋｄｃｋｅ ｑｒｃｐｓｄｃｈｇｑ ｇｒ
ｃｖｄｇｑｃｉｃ ｈｅｇｆｔｇｌｄｃｇ ｑｈｓｃｐｓｄｃｎｎ
６０１ ｌｇｑｃｖｓｇｒｃｉ ｃｎｅｇｙｓｇｅｄｃ ｓｅｖｓｐｐｋｄｌｖ ｖｔ
ｅｖｔｅｅｔｖｎ ｌａｗｄｎｅｍｒｖｔ ｅｙｌｖｖｙｔｐｔｈ
６６１ ｅｇｇｌｅｍｑｆｒｖ ｐｇｄｑｔｓｔｉｉｑ ｅｌｅｐｇｖｅｙｆｉ ｒｖ
ｆａｉｌｅｎｋｋ ｓｉｐｖｓａｒｖａｔ ｙｌｐａｐｅｇｌｋｆ
７２１ ｋｓｉｋｅｔｓｖｅｖ ｅｗｄｐｌｄｉａｆｅ ｔｗｅｉｉｆｒｎｍｎ ｋｅ
ｄｅｇｅｉｔｋｓ ｌｒｒｐｅｔｓｙｒｑ ｔｇｌａｐｇｑｅｙｅ
７８１ ｉｓｌｈｉｖｋｎｎｔ ｒｇｐｇｌｋｒｖｔｔ ｔｒｌｄａｐｓｑｉｅ ｖｋ
ｄｖｔｄｔｔａｌ ｉｔｗｆｋｐｌａｅｉ ｄｇｉｅｌｔｙｇｉｋ
８４１ ｄｖｐｇｄｒｔｔｉｄ ｌｔｅｄｅｎｑｙｓｉ ｇｎｌｋｐｄｔｅｙｅ ｖｓ
ｌｉｓｒｒｇｄｍ ｓｓｎｐａｋｅｔｆｔ ｔｇｌｄａｐｒｎｌｒ
９０１ ｒｖｓｑｔｄｎｓｉｔ ｌｅｗｒｎｇｋａａｉ ｄｓｙｒｉｋｙａｐｉ ｓｇ
ｇｄｈａｅｖｄｖ ｐｋｓｑｑａｔｔｋｔ ｔｌｔｇｌｒｐｇｔｅ
９６１ ｙｇｉｇｖｓａｖｋｅ ｄｋｅｓｎｐａｔｉｎ ａａｔｅｌｄｔｐｋｄ ｌｑ
ｖｓｅｔａｅｔｓ ｌｔｌｌｗｋｔｐｌａ ｋｆｄｒｙｒｌｎｙｓ
１０２１ ｌｐｔｇｑｗｖｇｖｑ ｌｐｒｎｔｔｓｙｖｌ ｒｇｌｅｐｇｑｅｙｎ ｖ
ｌｌｔａｅｋｇｒｈ ｋｓｋｐａｒｖｋａｓ ｔｅｑａｐｅｌｅｎｌ
１０８１ ｔｖｔｅｖｇｗｄｇｌ ｒｌｎｗｔａａｄｑａ ｙｅｈｆｉｉｑｖｑｅ ａ
ｎｋｖｅａａｒｎｌ ｔｖｐｇｓｌｒａｖｄ ｉｐｇｌｋａａｔｐｙ
１１４１ ｔｖｓｉｙｇｖｉｑｇ ｙｒｔｐｖｌｓａｅａ ｓｔｇｅｔｐｎｌｇｅ ｖ
ｖｖａｅｖｇｗｄａ ｌｋｌｎｗｔａｐｅｇ ａｙｅｙｆｆｉｑｖｑ
１２０１ ｅａｄｔｖｅａａｑｎ ｌｔｖｐｇｇｌｒｓｔ ｄｌｐｇｌｋａａｔｈ ｙ
ｔｉｔｉｒｇｖｔｑ ｄｆｓｔｔｐｌｓｖｅ ｖｌｔｅｅｖｐｄｍｇ
１２６１ ｎｌｔｖｔｅｖｓｗｄ ａｌｒｌｎｗｔｔｐｄ ｇｔｙｄｑｆｔｉｑｖ ｑ
ｅａｄｑｖｅｅａｈ ｎｌｔｖｐｇｓｌｒｓ ｍｅｉｐｇｌｒａｇｔ
１３２１ ｐｙｔｖｔｌｈｇｅｖ ｒｇｈｓｔｒｐｌａｖ ｅｖｖｔｅｄｌｐｑｌ ｇ
ｄｌａｖｓｅｖｇｗ ｄｇｌｒｌｎｗｔａａ ｄｎａｙｅｈｆｖｉｑ
１３８１ ｖｑｅｖｎｋｖｅａａ ｑｎｌｔｌｐｇｓｌｒ ａｖｄｉｐｇｌｅａａ ｔ
ｐｙｒｖｓｉｙｇｖ ｉｒｇｙｒｔｐｖｌｓ ａｅａｓｔａｋｅｐｅ
１４４１ ｉｇｎｌｎｖｓｄｉｔ ｐｅｓｆｎｌｓｗｍａ ｔｄｇｉｆｅｔｆｔｉ ｅ
ｉｉｄｓｎｒｌｌｅ ｔｖｅｙｎｉｓｇａｅ ｒｔａｈｉｓｇｌｐｐ
１５０１ ｓｔｄｆｉｖｙｌｓｇ ｌａｐｓｉｒｔｋｔｉ ｓａｔａｔｔｅａｌｐ ｌ
ｌｅｎｌｔｉｓｄｉ ｎｐｙｇｆｔｖｓｗｍ ａｓｅｎａｆｄｓｆｌ
１５６１ ｖｔｖｖｄｓｇｋｌｌ ｄｐｑｅｆｔｌｓｇｔ ｑｒｋｌｅｌｒｇｌｉ ｔ
ｇｉｇｙｅｖｍｖｓ ｇｆｔｑｇｈｑｔｋｐ ｌｒａｅｉｖｔｅａｅ
１６２１ ｐｅｖｄｎｌｌｖｓｄ ａｔｐｄｇｆｒｌｓｗ ｔａｄｅｇｖｆｄｎｆ ｖ
ｌｋｉｒｄｔｋｋｑ ｓｅｐｌｅｉｔｌｌａ ｐｅｒｔｒｄｉｔｇｌ
１６８１ ｒｅａｔｅｙｅｉｅｌ ｙｇｉｓｋｇｒｒｓｑ ｔｖｓａｉａｔｔａｍ ｇ
ｓｐｋｅｖｉｆｓｄ ｉｔｅｎｓａｔｖｓｗ ｒａｐｔａｑｖｅｓｆ
１７４１ ｒｉｔｙｖｐｉｔｇｇ ｔｐｓｍｖｔｖｄｇｔ ｋｔｑｔｒｌｖｋｌｉ ｐ
ｇｖｅｙｌｖｓｉｉ ａｍｋｇｆｅｅｓｅｐ ｖｓｇｓｆｔｔａｌｄ
１８０１ ｇｐｓｇｌｖｔａｎｉ ｔｄｓｅａｌａｒｗｑ ｐａｉａｔｖｄｓｙｖ ｉ
ｓｙｔｇｅｋｖｐｅ ｉｔｒｔｖｓｇｎｔｖ ｅｙａｌｔｄｌｅｐａ
１８６１ ｔｅｙｔｌｒｉｆａｅ ｋｇｐｑｋｓｓｔｉｔ ａｋｆｔｔｄｌｄｓｐ ｒ
ｄｌｔａｔｅｖｑｓ ｅｔａｌｌｔｗｒｐｐ ｒａｓｖｔｇｙｌｌｖ
１９２１ ｙｅｓｖｄｇｔｖｋｅ ｖｉｖｇｐｄｔｔｓｙ ｓｌａｄｌｓｐｓｔｈ ｙ
ｔａｋｉｑａｌｎｇ ｐｌｒｓｎｍｉｑｔｉ ｆｔｔｉｇｌｌｙｐｆ
１９８１ ｐｋｄｃｓｑａｍｌｎ ｇｄｔｔｓｇｌｙｔｉ ｙｌｎｇｄｋａｅａｌ ｅ
ｖｆｃｄｍｔｓｄｇ ｇｇｗｉｖｆｌｒｒｋ ｎｇｒｅｎｆｙｑｎｗ
２０４１ ｋａｙａａｇｆｇｄｒ ｒｅｅｆｗｌｇｌｄｎ ｌｎｋｉｔａｑｇｑｙ ｅ
ｌｒｖｄｌｒｄｈｇ ｅｔａｆａｖｙｄｋｆ ｓｖｇｄａｋｔｒｙｋ
２１０１ ｌｋｖｅｇｙｓｇｔａ ｇｄｓｍａｙｈｎｇｒ ｓｆｓｔｆｄｋｄｔｄ ｓ
ａｉｔｎｃａｌｓｙ ｋｇａｆｗｙｒｎｃｈ ｒｖｎｌｍｇｒｙｇｄ
２１６１ ｎｎｈｓｑｇｖｎｗｆ ｈｗｋｇｈｅｈｓｉｑ ｆａｅｍｋｌｒｐｓｎ ｆ
ｒｎｌｅｇｒｒｋｒ ａ

【0300】

【表29-1】

【表29-2】

【0301】

＞配列番号１０１
ＰＲＴ
ヒト
ｃＭｅｔ
１ ｍｋａｐａｖｌａｐｇ ｉｌｖｌｌｆｔｌｖｑ ｒｓｎｇｅｃｋｅａｌ ａｋｓｅ
ｍｎｖｎｍｋ ｙｑｌｐｎｆｔａｅｔ ｐｉｑｎｖｉｌｈｅｈ
６１ ｈｉｆｌｇａｔｎｙｉ ｙｖｌｎｅｅｄｌｑｋ ｖａｅｙｋｔｇｐｖｌ ｅｈｐ
ｄｃｆｐｃｑｄ ｃｓｓｋａｎｌｓｇｇ ｖｗｋｄｎｉｎｍａｌ
１２１ ｖｖｄｔｙｙｄｄｑｌ ｉｓｃｇｓｖｎｒｇｔ ｃｑｒｈｖｆｐｈｎｈ ｔａ
ｄｉｑｓｅｖｈｃ ｉｆｓｐｑｉｅｅｐｓ ｑｃｐｄｃｖｖｓａｌ
１８１ ｇａｋｖｌｓｓｖｋｄ ｒｆｉｎｆｆｖｇｎｔ ｉｎｓｓｙｆｐｄｈｐ ｌｈ
ｓｉｓｖｒｒｌｋ ｅｔｋｄｇｆｍｆｌｔ ｄｑｓｙｉｄｖｌｐｅ
２４１ ｆｒｄｓｙｐｉｋｙｖ ｈａｆｅｓｎｎｆｉｙ ｆｌｔｖｑｒｅｔｌｄ ａｑ
ｔｆｈｔｒｉｉｒ ｆｃｓｉｎｓｇｌｈｓ ｙｍｅｍｐｌｅｃｉｌ
３０１ ｔｅｋｒｋｋｒｓｔｋ ｋｅｖｆｎｉｌｑａａ ｙｖｓｋｐｇａｑｌａ ｒｑ
ｉｇａｓｌｎｄｄ ｉｌｆｇｖｆａｑｓｋ ｐｄｓａｅｐｍｄｒｓ
３６１ ａｍｃａｆｐｉｋｙｖ ｎｄｆｆｎｋｉｖｎｋ ｎｎｖｒｃｌｑｈｆｙ ｇｐ
ｎｈｅｈｃｆｎｒ ｔｌｌｒｎｓｓｇｃｅ ａｒｒｄｅｙｒｔｅｆ
４２１ ｔｔａｌｑｒｖｄｌｆ ｍｇｑｆｓｅｖｌｌｔ ｓｉｓｔｆｉｋｇｄｌ ｔｉ
ａｎｌｇｔｓｅｇ ｒｆｍｑｖｖｖｓｒｓ ｇｐｓｔｐｈｖｎｆｌ
４８１ ｌｄｓｈｐｖｓｐｅｖ ｉｖｅｈｔｌｎｑｎｇ ｙｔｌｖｉｔｇｋｋｉ ｔｋ
ｉｐｌｎｇｌｇｃ ｒｈｆｑｓｃｓｑｃｌ ｓａｐｐｆｖｑｃｇｗ
５４１ ｃｈｄｋｃｖｒｓｅｅ ｃｌｓｇｔｗｔｑｑｉ ｃｌｐａｉｙｋｖｆｐ ｎｓ
ａｐｌｅｇｇｔｒ ｌｔｉｃｇｗｄｆｇｆ ｒｒｎｎｋｆｄｌｋｋ
６０１ ｔｒｖｌｌｇｎｅｓｃ ｔｌｔｌｓｅｓｔｍｎ ｔｌｋｃｔｖｇｐａｍ ｎｋ
ｈｆｎｍｓｉｉｉ ｓｎｇｈｇｔｔｑｙｓ ｔｆｓｙｖｄｐｖｉｔ
６６１ ｓｉｓｐｋｙｇｐｍａ ｇｇｔｌｌｔｌｔｇｎ ｙｌｎｓｇｎｓｒｈｉ ｓｉ
ｇｇｋｔｃｔｌｋ ｓｖｓｎｓｉｌｅｃｙ ｔｐａｑｔｉｓｔｅｆ
７２１ ａｖｋｌｋｉｄｌａｎ ｒｅｔｓｉｆｓｙｒｅ ｄｐｉｖｙｅｉｈｐｔ ｋｓ
ｆｉｓｔｗｗｋｅ ｐｌｎｉｖｓｆｌｆｃ ｆａｓｇｇｓｔｉｔｇ
７８１ ｖｇｋｎｌｎｓｖｓｖ ｐｒｍｖｉｎｖｈｅａ ｇｒｎｆｔｖａｃｑｈ ｒｓ
ｎｓｅｉｉｃｃｔ ｔｐｓｌｑｑｌｎｌｑ ｌｐｌｋｔｋａｆｆｍ
８４１ ｌｄｇｉｌｓｋｙｆｄ ｌｉｙｖｈｎｐｖｆｋ ｐｆｅｋｐｖｍｉｓｍ ｇｎ
ｅｎｖｌｅｉｋｇ ｎｄｉｄｐｅａｖｋｇ ｅｖｌｋｖｇｎｋｓｃ
９０１ ｅｎｉｈｌｈｓｅａｖ ｌｃｔｖｐｎｄｌｌｋ ｌｎｓｅｌｎｉｅｗｋ ｑａ
ｉｓｓｔｖｌｇｋ ｖｉｖｑｐｄｑｎｆｔ ｇｌｉａｇｖｖｓｉｓ
９６１ ｔａｌｌｌｌｌｇｆｆ ｌｗｌｋｋｒｋｑｉｋ ｄｌｇｓｅｌｖｒｙｄ ａｒ
ｖｈｔｐｈｌｄｒ ｌｖｓａｒｓｖｓｐｔ ｔｅｍｖｓｎｅｓｖｄ
１０２１ ｙｒａｔｆｐｅｄｑｆ ｐｎｓｓｑｎｇｓｃｒ ｑｖｑｙｐｌｔｄｍｓ ｐ
ｉｌｔｓｇｄｓｄｉ ｓｓｐｌｌｑｎｔｖｈ ｉｄｌｓａｌｎｐｅｌ
１０８１ ｖｑａｖｑｈｖｖｉｇ ｐｓｓｌｉｖｈｆｎｅ ｖｉｇｒｇｈｆｇｃｖ ｙ
ｈｇｔｌｌｄｎｄｇ ｋｋｉｈｃａｖｋｓｌ ｎｒｉｔｄｉｇｅｖｓ
１１４１ ｑｆｌｔｅｇｉｉｍｋ ｄｆｓｈｐｎｖｌｓｌ ｌｇｉｃｌｒｓｅｇｓ ｐ
ｌｖｖｌｐｙｍｋｈ ｇｄｌｒｎｆｉｒｎｅ ｔｈｎｐｔｖｋｄｌｉ
１２０１ ｇｆｇｌｑｖａｋｇｍ ｋｙｌａｓｋｋｆｖｈ ｒｄｌａａｒｎｃｍｌ ｄ
ｅｋｆｔｖｋｖａｄ ｆｇｌａｒｄｍｙｄｋ ｅｙｙｓｖｈｎｋｔｇ
１２６１ ａｋｌｐｖｋｗｍａｌ ｅｓｌｑｔｑｋｆｔｔ ｋｓｄｖｗｓｆｇｖｌ ｌ
ｗｅｌｍｔｒｇａｐ ｐｙｐｄｖｎｔｆｄｉ ｔｖｙｌｌｑｇｒｒｌ
１３２１ ｌｑｐｅｙｃｐｄｐｌ ｙｅｖｍｌｋｃｗｈｐ ｋａｅｍｒｐｓｆｓｅ ｌ
ｖｓｒｉｓａｉｆｓ ｔｆｉｇｅｈｙｖｈｖ ｎａｔｙｖｎｖｋｃｖ
１３８１ ａｐｙｐｓｌｌｓｓｅ ｄｎａｄｄｅｖｄｔｒ ｐａｓｆｗｅｔｓ

【0302】

【表30-1】

【0303】

【表30-2】

【0304】

【表30-3】

【0305】

【表30-4】

【0306】

【表30-5】

【0307】

【表30-6】

【0308】

【表30-7】

【0309】

【表30-8】

【0310】

【表30-9】

【0311】

＞配列番号１７９
ＰＲＴ
人工
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのＦＧループ
ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ_９ＲＧＬ；
式中Ｘ_９は、Ｍ又はＩである
＞配列番号１８０
ＰＲＴ
人工
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのＦＧループ
ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬ（配列番号１８０），
＞配列番号１８１
ＰＲＴ
人工
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのＢＣループ
Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８（配列番号１８１）；式中、
Ｘ_１はＡ、Ｔ、Ｇ、又はＤであり、
Ｘ_２はＡ、Ｄ、Ｙ、又はＷであり、
Ｘ_３はＰ、Ｄ、又はＮであり、
Ｘ_４はＬであるか、又は存在せず、
Ｘ_５はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ、又はＷであり、
Ｘ_６はＧ、Ｄ、又はＡであり、
Ｘ_７はＡ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、又はＤであり、及び
Ｘ_８はＹ、Ｆ、又はＬである。
＞配列番号１８２
ＰＲＴ
人工
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８ＤＳ
ＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳ
ＩＹＧＶＨＮＶＹＫＤＴＮＸ_９ＲＧＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８２），
Ｘ_１はＡ、Ｔ、Ｇ、又はＤであり、
Ｘ_２はＡ、Ｄ、Ｙ、又はＷであり、
Ｘ_３はＰ、Ｄ、又はＮであり、
Ｘ_４はＬであるか、又は存在せず、
Ｘ_５はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ、又はＷであり、
Ｘ_６はＧ、Ｄ、又はＡであり、
Ｘ_７はＡ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、又はＤであり、
Ｘ_８はＹ、Ｆ、又はＬであり、及び
Ｘ_９はＭ又はＩである。
＞配列番号１８３
ＰＲＴ
人工
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８ＤＳ
ＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳ
ＩＹＧＶＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８３）の配列を更に含
み、
式中、
Ｘ_１はＡ、Ｔ、Ｇ、又はＤであり、
Ｘ_２はＡ、Ｄ、Ｙ、又はＷであり、
Ｘ_３はＰ、Ｄ、又はＮであり、
Ｘ_４はＬであるか、又は存在せず、
Ｘ_５はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ、又はＷであり、
Ｘ_６はＧ、Ｄ、又はＡであり、
Ｘ_７はＡ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、又はＤであり、及び
Ｘ_８はＹ、Ｆ、又はＬである。
＞配列番号１８４
ＰＲＴ
人工
Ｃ−ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインＣ鎖及びＣＤループ配列
ＤＳＦＸ_１０ＩＲＹＸ_１１ＥＸ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５ＧＸ_１６（配列番号１８４）、
式中
Ｘ_１０はＷ、Ｆ、又はＶであり、
Ｘ_１１はＤ、Ｆ、又はＬであり、
Ｘ_１２はＶ、Ｆ、又はＬであり、
Ｘ_１３はＶ、Ｌ、又はＴであり、
Ｘ_１４はＶ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、又はＳであり、
Ｘ_１５はＧ、Ｓ、Ａ、Ｔ、又はＫであり、及び
Ｘ_１６は、Ｅ、又はＤである。及び
＞配列番号１８５
ＰＲＴ
人工
ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインＦ鎖及びＦＧループ
ＴＥＹＸ_１７ＶＸ_１８ＩＸ_１９Ｘ_２０ＶＫＧＧＸ_２１Ｘ_２２ＳＸ_２３（配列番号１８５
）、式中
Ｘ_１７はＹ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ、又はＡであり、
Ｘ_１８はＮ、Ｔ、Ｑ、又はＧであり、
Ｘ_１９はＬ、Ｍ、Ｎ、又はＩであり、
Ｘ_２０は、Ｇ、又はＳであり、
Ｘ_２１は、Ｓ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ、又はＫであり、
Ｘ_２２はＩ、Ｖ、又はＬであり、及び
Ｘ_２３はＶ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、又はＬである。
＞配列番号１８６
ＰＲＴ
人工
ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ_１０ＩＲＹＸ_１
１ＥＸ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５ＧＸ_１６ＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴ
ＥＹＸ_１７ＶＸ_１８ＩＸ_１９Ｘ_２０ＶＫＧＧＸ_２１Ｘ_２２ＳＸ_２３ＰＬＳＡＥＦＴＴ（配
列番号１８６）を更に含み、
式中
Ｘ_１０はＷ、Ｆ、又はＶであり、及び
Ｘ_１１はＤ、Ｆ、又はＬであり、
Ｘ_１２はＶ、Ｆ、又はＬであり、
Ｘ_１３はＶ、Ｌ、又はＴであり、
Ｘ_１４はＶ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、又はＳであり、
Ｘ_１５はＧ、Ｓ、Ａ、Ｔ、又はＫであり、
Ｘ_１６は、Ｅ、又はＤであり、
Ｘ_１７はＹ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ、又はＡであり、
Ｘ_１８はＮ、Ｔ、Ｑ、又はＧであり、
Ｘ_１９はＬ、Ｍ、Ｎ、又はＩであり、
Ｘ_２０は、Ｇ、又はＳであり、
Ｘ_２１は、Ｓ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ、又はＫであり、
Ｘ_２２はＩ、Ｖ、又はＬであり、及び
Ｘ_２３はＶ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、又はＬである。
＞配列番号１８７
ＰＲＴ
人工
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子のＥＧＦＲ ＦＮ３ドメイ
ン
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＸ_２４ＶＴＸ_２５ＤＳＸ_２６ＲＬＳＷＤＤＰＸ_２７ＡＦＹＸ_２８
ＳＦＬＩＱＹＱＸ_２９ＳＥＫＶＧＥＡＩＸ_３０ＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴ
ＥＹＴＶＳＩＹＸ_３１ＶＨＮＶＹＫＤＴＮＸ_３２ＲＧＬＰＬＳＡＸ_３３ＦＴＴ（配列番号
１８７）であって、式中
Ｘ_２４は、Ｅ、Ｎ、又はＲであり、
Ｘ_２５は、Ｅ、又はＰであり、
Ｘ_２６は、Ｌ、又はＡであり、
Ｘ_２７は、Ｈ、又はＷであり、
Ｘ_２８は、Ｅ、又はＤであり、
Ｘ_２９は、Ｅ、又はＰであり、
Ｘ_３０は、Ｎ、又はＶであり、
Ｘ_３１はＧ、又はＹであり、
Ｘ_３２は、Ｍ、又はＩであり、及び
Ｘ_３３は、Ｅ、又はＩである
＞配列番号１８８
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子のｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメ
イン
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＸ_３４ＶＴＸ_３５ＤＳＸ_３６ＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＷＩ
ＲＹＦＸ_３７ＦＸ_３８Ｘ_３９Ｘ_４０ＧＸ_４１ＡＩＸ_４２ＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬ
ＫＰＧＴＥＹＶＶＮＩＸ_４３Ｘ_４４ＶＫＧＧＸ_４５ＩＳＰＰＬＳＡＸ_４６ＦＴＴ（配列番
号１８８）であって、式中、
Ｘ_３４は、Ｅ、Ｎ、又はＲであり、
Ｘ_３５は、Ｅ、又はＰであり、
Ｘ_３６は、Ｌ、又はＡであり、
Ｘ_３７は、Ｅ、又はＰであり、
Ｘ_３８は、Ｖ、又はＬであり、
Ｘ_３９は、Ｇ、又はＳであり、
Ｘ_４０は、Ｓ、又はＫであり、
Ｘ_４１は、Ｅ、又はＤであり、
Ｘ_４２は、Ｎ、又はＶであり、
Ｘ_４３は、Ｌ、又はＭであり、
Ｘ_４４は、Ｇ、又はＳであり、
Ｘ_４５は、Ｓ、又はＫであり、及び
Ｘ_４６は、Ｅ、又はＩである。

【0312】

【表31-1】

【0313】

【表31-2】

【0314】

【表31-3】

【0315】

【表31-4】

【0316】

【表31-5】

【0317】

【表31-6】

【表31-7】

【表31-8】

【表31-9】

本発明は次の実施態様を含む。
（１）配列番号１に基づくＦＮ３ドメインの６、８、１０、１１、１４、１５、１６、２
０、３０、３４、３８、４０、４１、４５、４７、４８、５３、５４、５９、６０、６２
、６４、７０、８８、８９、９０、９１、及び９３番目の残基からなる群より選択される
位置で少なくとも１つのシステイン置換を含む、単離されたシステイン改変フィブロネク
チンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン。
（２）システイン置換が、配列番号１１１〜１１４又は１２２〜１３７の６、８、１０、
１１、１４、１５、１６、２０、３０、３４、３８、４０、４１、４５、４７、４８、５
３、５４、５９、６０、６２、６４、７０、８８、８９、９０、９１、及び９３番目の残
基からなる群より選択される位置にある、上記（１）に記載のシステイン改変フィブロネ
クチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン。
（３）配列番号２７のアミノ酸配列から少なくとも１つのシステイン置換を有する配列番
号２７のアミノ酸配列を含む単離システイン改変フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ド
メインであって、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合して、ＥＧＦＲに対す
る上皮成長因子（ＥＧＦ）の結合を遮断する、単離システイン改変ＦＮ３ドメイン。
（４）配列番号１１４のアミノ酸配列から少なくとも１つのシステイン置換を有する配列
番号１１４のアミノ酸配列を含む単離システイン改変フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３
）ドメインであって、肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）に特異的に結合して、ｃ−Ｍ
ｅｔに対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の結合を遮断する、単離システイン改変ＦＮ３ド
メイン。
（５）半減期延長部分を更に含む、上記（１）に記載のシステイン改変フィブロネクチン
ＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン。
（６）前記半減期延長部分が、アルブミン結合分子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
、又は免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部である、上記（６）に記載のシステイ
ン改変フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン。
（７）（ｉ）１つ又は２つ以上のヌクレオチド残基を、システイン改変ＦＮ３ドメインを
コードするようにシステインアミノ酸残基をコードするヌクレオチド残基に交換すること
によって、親ＦＮ３ドメインの核酸配列を変異させることと、
（ｉｉ）前記システイン改変ＦＮ３ドメインを発現させることと、
（ｉｉｉ）前記システイン改変ＦＮ３ドメインを回収することと、
を含む、システイン改変ＦＮ３ドメインを調製する方法。
（８）前記ＦＮ３ドメインが配列番号１に基づくものであり、前記変異させる工程が部位
特異的変異誘発を行うことを含む、上記（７）に記載の方法。
（９）前記システイン改変ＦＮ３ドメインを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現させる
ことを含む、上記（８）に記載の方法。
（１０）前記回収する工程の後に、前記システイン改変ＦＮ３ドメインを、チオール反応
性化学試薬と反応させて、化学的にコンジュゲートされたシステイン改変ＦＮ３ドメイン
を生成することを更に含む、上記（８）に記載の方法。
（１１）前記反応させる工程の後に、前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変
ＦＮ３ドメインのＥＧＦＲ結合を測定することを更に含む、上記（１０）に記載の方法。
（１２）前記反応させる工程の後に、前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変
ＦＮ３ドメインの付加後のＥＧＦＲ過剰発現腫瘍細胞株の細胞増殖阻害を測定することを
更に含む、上記（１１）に記載の方法。
（１３）前記反応させる工程の後に、前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変
ＦＮ３ドメインのｃ−Ｍｅｔ結合を測定することを更に含む、上記（１１）に記載の方法
。
（１４）前記反応させる工程の後に、前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変
ＦＮ３ドメインの付加後のｃ−Ｍｅｔ発現腫瘍細胞株の細胞増殖阻害を測定することを更
に含む、上記（１１）に記載の方法。
（１５）前記チオール反応性試薬がマレイミド部分を含む、上記（１１）に記載の方法。
（１６）前記マレイミド部分を含むチオール反応性試薬が、ＮＥＭ、ＭＭＡＥ、及びＭＭ
ＡＦからなる群より選択される、上記（１５）に記載の方法。
（１７）前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変ＦＮ３ドメインが、ＥＧＦＲ
過剰発現Ｈ１５７３細胞において測定されるとき、約１．７×１０^-10Ｍ〜約１．３×１
０^-9Ｍの細胞増殖ＩＣ₅₀を有する、上記（１６）に記載の方法。
（１８）配列番号１８９〜２１６、及び２２７〜２５４からなる群より選択されるアミノ
酸配列を含む、単離システイン改変フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン。
（１９）第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインと第２のＦＮ３ドメインと
を含む、単離システイン改変二重特異性ＦＮ３分子であって、前記第１のＦＮ３ドメイン
が、前記第１のＦＮ３ドメインの６、８、１０、１１、１４、１５、１６、２０、３０、
３４、３８、４０、４１、４５、４７、４８、５３、５４、５９、６０、６２、６４、７
０、８８、８９、９０、９１、及び９３番目の残基からなる群から選択される位置でシス
テイン置換を含み、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合して、ＥＧＦＲに対
する上皮成長因子（ＥＧＦ）の結合を遮断し、前記第２のＦＮ３ドメインが肝細胞増殖因
子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）に特異的に結合して、ｃ−Ｍｅｔに対する肝細胞増殖因子（ＨＧ
Ｆ）の結合を遮断する、単離システイン改変二重特異性ＦＮ３分子。
（２０）前記第２のＦＮ３ドメインが、前記第２のＦＮ３ドメインの６、８、１０、１１
、１４、１５、１６、２０、３０、３４、３８、４０、４１、４５、４７、４８、５３、
５４、５９、６０、６２、６４、７０、８８、８９、９０、９１、及び９３番目の残基か
らなる群より選択される位置でシステイン置換を含む、上記（１９）に記載の単離システ
イン改変二重特異性ＦＮ３分子。
（２１）配列番号２１９〜２２６、及び２５７〜２６４からなる群より選択されるアミノ
酸配列を含む、上記（２０）に記載の単離システイン改変二重特異性ＦＮ３分子。
（２２）前記分子がチオール反応性試薬に化学的にコンジュゲートされている、上記（２
０）に記載の単離システイン改変二重特異性分子。
（２３）前記チオール反応性試薬がマレイミド部分である、上記（２２）に記載の単離シ
ステイン改変二重特異性分子。
（２４）前記マレイミド部分が、ＮＥＭ、ＰＥＧ２４−マレイミド、フルオレセインマレ
イミド、ＭＭＡＥ、及びＭＭＡＦからなる群より選択される、上記（２３）に記載の単離
システイン改変二重特異性分子。
（２５）前記第１のＦＮ３ドメインが、５０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦを用いてＮＣＩ−Ｈ２
９２細胞において測定されるとき、約０．９×１０^-9Ｍ〜約２．３×１０^-9ＭのＩＣ₅₀値
でＥＧＦＲの１１７３番目のチロシン残基でＥＧＦによって誘発されるＥＧＦＲのリン酸
化を阻害し、前記第２のＦＮ３ドメインが、１００ｎｇ／ｍＬヒトＨＧＦを用いてＮＣＩ
−Ｈ２９２細胞において測定されるとき、約４×１０^-10Ｍ〜約１．３×１０^-9ＭのＩＣ_5
0値でｃ−Ｍｅｔの１３４９番目のチロシン残基でＨＧＦによって誘発されるｃ−Ｍｅｔ
のリン酸化を阻害する、上記（２４）に記載のシステイン改変二重特異性分子。
（２６）前記システイン改変二重特異性分子が、
（ｉ）ＥＧＦＲ過剰発現Ｈ１５７３細胞において測定されるとき、約５．０×１０^-11
Ｍ〜約５．８×１０^-10Ｍと、
（ｉｉ）ＥＧＦＲ過剰発現Ａ７３１細胞において測定されるとき、約７．８×１０^-12
Ｍ〜約１．１×１０^-9Ｍと、
からなる群より選択される細胞増殖ＩＣ₅₀値を有する、上記（２５）に記載のシステイ
ン改変二重特異性分子。
（２７）半減期延長部分を更に含む、上記（２６）に記載のシステイン改変二重特異性分
子。
（２８）前記半減期延長部分が、アルブミン結合分子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）、又は免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部である、上記（２７）に記載のシス
テイン改変二重特異性分子。
（２９）（ｉ）１つ又は２つ以上のヌクレオチド残基を、システイン改変二重特異性分子
をコードするようにシステイン残基をコードするヌクレオチド残基に交換することによっ
て、親二重特異性分子の核酸配列を変異させることと、
（ｉｉ）前記システイン改変二重特異性分子を発現させることと、
（ｉｉｉ）前記システイン改変二重特異性分子を回収することと、
を含む、単離システイン改変二重特異性分子を調製する方法。
（３０）前記変異させる工程が、部位特異的変異誘発を行うことを含む、上記（２９）に
記載の方法。
（３１）前記システイン改変二重特異性分子を大腸菌において発現させることを含む、上
記（３０）に記載の方法。
（３２）前記回収する工程の後に、前記システイン改変二重特異性分子を、チオール反応
性化学試薬と反応させて、化学的にコンジュゲートされたシステイン改変二重特異性分子
を生成することを更に含む、上記（３０）に記載の方法。
（３３）（ｉ）前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変二重特異性分子のＥＧ
ＦＲ結合を測定することと、
（ｉｉ）前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変二重特異性分子による、細
胞株におけるＥＧＦ刺激ＥＧＦＲリン酸化の阻害を測定することと、
（ｉｉｉ）前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変二重特異性分子による、
細胞株におけるＨＧＦ刺激ｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害を測定することと、
（ｉｖ）前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変二重特異性分子の添加後の
ＥＧＦＲ過剰発現腫瘍細胞株の増殖阻害を測定することと、
からなる群より選択される工程を更に含む、上記（３２）に記載の方法。
（３４）本明細書に記載されたいずれかの発明。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]

【手続補正書】

【提出日】2019年10月3日

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１１１〜１１４のいずれかのアミノ酸配列における６、８、１０、１１、１４、１５、１６、２０、３０、３４、３８、４０、４１、４５、４７、４８、５３、５４、５９、６０、６２、６４、７０、８３、８４、８５、８６、及び８８番目の位置からなる群より選択される位置で少なくとも１つのシステイン置換を含む、単離されたシステイン改変フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン。

【請求項2】

配列番号１１４のアミノ酸配列において少なくとも１つのシステイン置換を有するアミノ酸配列を含む単離システイン改変フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインであって、肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）に特異的に結合して、ｃ−Ｍｅｔに対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の結合を遮断する、単離システイン改変ＦＮ３ドメイン。

【請求項3】

半減期延長部分を更に含む、請求項１又は２に記載のシステイン改変フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン。

【請求項4】

前記半減期延長部分が、アルブミン結合分子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又は免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部である、請求項３に記載のシステイン改変フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン。

【請求項5】

（ｉ）配列番号１１１〜１１４のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸配列において、１つ又は２つ以上のヌクレオチド残基を、請求項１に記載のシステイン改変ＦＮ３ドメインをコードするようにシステインアミノ酸残基をコードするヌクレオチド残基に交換することによって、前記核酸配列を変異させることと、
（ｉｉ）前記システイン改変ＦＮ３ドメインを発現させることと、
（ｉｉｉ）前記システイン改変ＦＮ３ドメインを回収することと、
を含む、システイン改変ＦＮ３ドメインを調製する方法。

【請求項6】

前記変異させる工程が部位特異的変異誘発を行うことを含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記システイン改変ＦＮ３ドメインを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現させることを含む、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

前記回収する工程の後に、前記システイン改変ＦＮ３ドメインを、チオール反応性化学試薬と反応させて、化学的にコンジュゲートされたシステイン改変ＦＮ３ドメインを生成することを更に含む、請求項５に記載の方法。

【請求項9】

前記反応させる工程の後に、前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変ＦＮ３ドメインのｃ−Ｍｅｔ結合を測定することを更に含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記反応させる工程の後に、前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変ＦＮ３ドメインの付加後のｃ−Ｍｅｔ発現腫瘍細胞株の細胞増殖阻害を測定することを更に含む、請求項８に記載の方法。

【請求項11】

前記チオール反応性試薬がマレイミド部分を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項12】

前記マレイミド部分を含むチオール反応性試薬が、ＮＥＭ、ＭＭＡＥ、及びＭＭＡＦからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。