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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】特開2020-128976(P2020-128976A)
(43)【公開日】2020年8月27日
(54)【発明の名称】臨床的な癌評価のためのＳＲＭ及びＤＩＡアッセイ
(51)【国際特許分類】
G01N 27/62 20060101AFI20200731BHJP
G01N 30/72 20060101ALI20200731BHJP
G01N 30/88 20060101ALI20200731BHJP
G01N 27/447 20060101ALI20200731BHJP
【ＦＩ】
G01N27/62 V
G01N27/62 X
G01N30/72 C
G01N30/88 J
G01N27/447 331E
G01N27/447 315K
G01N27/447 315Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】16
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
【全頁数】20
(21)【出願番号】特願2020-2922(P2020-2922)
(22)【出願日】2020年1月10日
(31)【優先権主張番号】62/791,495
(32)【優先日】2019年1月11日
(33)【優先権主張国】US
(71)【出願人】
【識別番号】517069284
【氏名又は名称】ナントオミックス， エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100091487
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 行孝
(74)【代理人】
【識別番号】100105153
【弁理士】
【氏名又は名称】朝倉 悟
(74)【代理人】
【識別番号】100120617
【弁理士】
【氏名又は名称】浅野 真理
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(74)【代理人】
【識別番号】100172557
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 啓靖
(72)【発明者】
【氏名】トッド、エー．ヘンブロー
(72)【発明者】
【氏名】ファビオラ、チェッキ
(72)【発明者】
【氏名】ケリー、ミーナ、スコット
【テーマコード（参考）】
2G041
【Ｆターム（参考）】
2G041CA01
2G041DA04
2G041EA04
2G041FA12
2G041GA03
2G041GA06
2G041GA08
2G041GA09
2G041HA01
2G041HA02
2G041JA02
2G041LA08
(57)【要約】 （修正有）
【課題】直接的に患者組織中の１種又は２種以上タンパク質由来の特定のフラグメントペプチドを検出及び／又は定量するための方法を提供する。【解決手段】１種又は２種以上のタンパク質由来のフラグメントペプチドを、質量分析を使用して定量する。１種又は２種以上のタンパク質は、ＣＢＬ、ＦＰＧＳ、ＨＳＰ９０Ａ、ＨＳＰ９０Ｂ、ＩＮＳＲ、ＭＣＬ１及びＴｒｋＡからなる群から選択される。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ホルマリン固定組織の生体試料中のタンパク質の量を測定する方法であって、
前記方法が、質量分析を使用して、前記生体試料から調製されるタンパク質消化物中の前記タンパク質由来の１種又は２種以上のフラグメントペプチドを検出及び／又は定量すること、並びに、前記試料中の前記タンパク質の量を計算することを含み、
前記タンパク質が、ＣＢＬ、ＦＰＧＳ、ＨＳＰ９０Ａ、ＨＳＰ９０Ｂ、ＩＮＳＲ、ＭＣＬ１、及びＴｒｋＡからなる群から選択される、前記方法。
前記方法が、質量分析を使用して、前記生体試料から調製されるタンパク質消化物中の前記タンパク質由来の１種又は２種以上のフラグメントペプチドを検出及び／又は定量すること、並びに、前記試料中の前記タンパク質の量を計算することを含み、
前記タンパク質が、ＣＢＬ、ＦＰＧＳ、ＨＳＰ９０Ａ、ＨＳＰ９０Ｂ、ＩＮＳＲ、ＭＣＬ１、及びＴｒｋＡからなる群から選択される、前記方法。
【請求項2】
前記１種又は２種以上のフラグメントペプチドを検出及び／又は定量する前に、前記タンパク質消化物を分画する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記分画工程が、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、及び逆相高速液体クロマトグラフィーからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記タンパク質消化物が、プロテアーゼ消化物、好ましくはトリプシン消化物を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記質量分析が、タンデム質量分析、イオントラップ質量分析、トリプル四重極質量分析、イオントラップ／四重極ハイブリッド質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、ＭＡＬＤＩ質量分析、及び／又は飛行時間型質量分析を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
使用される質量分析のモードが、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、及び／又は多重選択反応モニタリング（ｍＳＲＭ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
使用される質量分析のモードが、データ独立所得（ＤＩＡ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記タンパク質がＣＢＬ、かつ、前記フラグメントペプチドが配列番号１のペプチドであり、
前記タンパク質がＦＰＧＳ、かつ、前記フラグメントペプチドが配列番号２のペプチドであり、
前記タンパク質がＨＳＰ９０Ａ、かつ、前記フラグメントペプチドが配列番号３のペプチドであり、
前記タンパク質がＨＳＰ９０Ｂ、かつ、前記フラグメントペプチドが配列番号４のペプチドであり、
前記タンパク質がＩＮＳＲ、かつ、前記フラグメントペプチドが配列番号５のペプチドであり、
前記タンパク質がＭＣＬ１、かつ、前記フラグメントペプチドが配列番号６のペプチドであり、かつ／あるいは、
前記タンパク質がＴｒｋＡ、かつ、前記フラグメントペプチドが配列番号７のペプチドである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
前記タンパク質がＦＰＧＳ、かつ、前記フラグメントペプチドが配列番号２のペプチドであり、
前記タンパク質がＨＳＰ９０Ａ、かつ、前記フラグメントペプチドが配列番号３のペプチドであり、
前記タンパク質がＨＳＰ９０Ｂ、かつ、前記フラグメントペプチドが配列番号４のペプチドであり、
前記タンパク質がＩＮＳＲ、かつ、前記フラグメントペプチドが配列番号５のペプチドであり、
前記タンパク質がＭＣＬ１、かつ、前記フラグメントペプチドが配列番号６のペプチドであり、かつ／あるいは、
前記タンパク質がＴｒｋＡ、かつ、前記フラグメントペプチドが配列番号７のペプチドである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記組織がパラフィン包埋組織である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記組織が、腫瘍、例えば、原発性又は続発性腫瘍から取得される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記１種又は２種以上のフラグメントペプチドの定量が、前記生体試料中の前記１種又は２種以上のフラグメントペプチドの量を、異なる別個の生体試料中の同一の１種又は２種以上のフラグメントペプチドの量と比較することを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記１種又は２種以上のフラグメントペプチドの定量が、生体試料中の前記１種又は２種以上のフラグメントペプチドの量を、同一のアミノ酸配列を有する既知量の添加された内部標準ペプチドとの比較によって決定することを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記内部標準ペプチドが、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈ及びそれらの組合せから選択される同位体標識されたペプチドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記タンパク質消化物中の前記１種又は２種以上のフラグメントペプチドの検出及び／又は定量が、対応するタンパク質の存在を示すとともに、対象における癌の診断上のステージ／グレード／ステータスとの関連を示す、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記１種又は２種以上のフラグメントペプチド又は前記対応するタンパク質の検出及び／又は定量の結果を相関させ、前記対象に対する最適な癌処置療法の情報を提供することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記相関が、マルチプレックスフォーマットにおいて、他のタンパク質又は他のタンパク質由来のペプチドを検出及び／又は定量することと組み合わされる、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照この特許出願は、２０１９年１月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／７９１，４９５号の優先権を主張し、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
患者の腫瘍組織中のＣＢＬ、ＦＰＧＳ、ＨＳＰ９０Ａ、ＨＳＰ９０Ｂ、ＩＮＳＲ、ＭＣＬ１及びＴｒｋＡの群から選択されるタンパク質の１種又は２種以上のタンパク質発現レベルが、それぞれの全長タンパク質の部分配列由来の特定のペプチドを定量することにより決定される。各ペプチドは、質量分析の基づく選択反応モニタリング（ＳＲＭ：Selected Reaction Monitoring）（多重反応モニタリング（ＭＲＭ：Multiple Reaction Monitoring）とも呼ばれ、本明細書ではＳＲＭアッセイと呼ぶ）を使用して、あるいは、データ独立取得（ＤＩＡ：Data Independent Acquisition）により決定される。ＳＲＭアッセイを使用して、癌患者の組織、例えば、ホルマリン固定された癌組織から得られた細胞において、直接的に、特定のフラグメントペプチドの存在を検出するとともに、その量を定量的に測定する。
【背景技術】
【0003】
個々のタンパク質に対する単一のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するための候補ペプチドは、理論上は、完全な全長タンパク質の完全なプロテアーゼ消化、例えば、トリプシンによる消化から生じるいずれの個々のペプチドであり得る。しかしながら、驚くことに、多くのペプチドは、所与のタンパク質の確実な検出及び定量に対して不適切である。実際、いくつかのタンパク質に対して適切なペプチドは、未だ見出されていない。したがって、所与のタンパク質に対するＳＲＭ／ＭＲＭをアッセイするための最も有利なペプチドを予測することは不可能であり、そのため、各ペプチドについて特異的に定義されるアッセイの特徴は、実験的に発見及び決定されなければならない。これは、タンパク質溶解液、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋組織からのＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）溶解液における分析のための最良のＳＲＭ／ＭＲＭペプチドを同定する場合、特に当てはまる。本明細書に記載のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、各タンパク質に対してプロテアーゼ消化された１種又は２種以上のペプチド（トリプシン消化されたペプチド）を示し、それにより、各ペプチドは、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ、特に、ホルマリン固定された患者組織から調製されたペプチドのために有利なペプチドであることが見出されている。そのペプチドは、相対定量による発現の検出のためのデータ独立取得（ＤＩＡ）アッセイにも有用である。
【0004】
定量は、相対的又は絶対的である。絶対定量が必要とされる場合、各ペプチドの測定レベルは、測定されるペプチドと同一のアミノ酸配列を有する標識された参照ペプチドの既知量と比較される。ペプチドは、特定のタンパク質に対して固有であるため、１つのペプチド分子は、１つのタンパク質分子由来であり、したがって、ペプチドの定量レベルは、ペプチドが由来する完全なタンパク質の定量を可能にする。タンパク質発現の測定は、癌の診断、癌の病期分類、癌の進行の予後診断、並びに様々な癌の処置及び療法に対する臨床応答の可能性の予測等のために使用可能である。
【発明の概要】
【0005】
癌患者の腫瘍組織から直接調製されるプロテオーム用溶解液中の特定のタンパク質を検出及びそのレベルを定量するために使用可能なＳＲＭ／ＭＲＭ及びＤＩＡアッセイが提供される。これらのタンパク質は、癌治療法の選択に情報を与えるために使用可能であり、治療計画の一部として使用可能である。今回記載のＳＲＭ／ＭＲＭ及びＤＩＡアッセイは、患者の腫瘍組織において直接的に腫瘍細胞の個別化分子プロファイルを開発するために有用である。これらのタンパク質の発現状態が、決定されると、次いで、特定の治療薬が、患者に投与可能となる。これは、そのような薬剤が、今回記載のアッセイによって検出及び測定されるタンパク質と相互作用することができ、それらのタンパク質の機能を阻害又は促進することにより、腫瘍細胞を死滅させることができるためである。加えて、癌患者自身の免疫系を誘導することにより患者自身の腫瘍細胞を死滅させる治療薬が、この治療計画の一部として癌患者に投与可能である。腫瘍関連タンパク質を特異的に標的とする治療薬、及び免疫系を標的とする治療薬（immune system-directed therapeutic agents）の両方は、今回記載の方法により決定される癌患者の分子プロファイルに直接照合され、標的化及び免疫ベースの癌処置の両方のための個別化戦略を提供することができる。
【0006】
直接的に患者組織中の１種又は２種以上タンパク質由来の特定のフラグメントペプチドを検出及び／又は定量するための方法が提供される。１種又は２種以上のタンパク質は、ＣＢＬ、ＦＰＧＳ、ＨＳＰ９０Ａ、ＨＳＰ９０Ｂ、ＩＮＳＲ、ＭＣＬ１及びＴｒｋＡからなる群から選択される。生体試料が取得された患者又は対象に治療上有効な量の癌治療薬を投与される、改善された処置法であって、癌治療薬及び／又は癌治療薬の投与量が、１種又は２種以上のタンパク質のフラグメントペプチドのいずれか１種又は２種以上（マルチプレックスにおいて）の検出及び／又は量に基づいており、癌治療薬が、患者の免疫応答を惹起、増強、操作及び／又はそれ以外の点で調節することにより、患者の腫瘍細胞を攻撃し、死滅させる機能を有する免疫調節性の癌治療薬である、改善された処置法が提供される。フラグメントペプチドは、例えば、配列番号１〜７のペプチドであってもよい。
【0007】
具体的に、ヒト生体試料、例えば、ホルマリン固定組織試料中の１種又は２種以上のタンパク質を検出及びそれらのレベルを測定するための方法が提供される。ここで、その方法は、質量分析によって、生体試料から調製されたタンパク質消化物中の１種又は２種以上のタンパク質フラグメントペプチドを検出及び定量して、試料中の１種又は２種以上のタンパク質レベルを計算することを含み、その量は、相対量又は絶対量である。タンパク質消化物は、１種又は２種以上のフラグメントペプチドを検出及び／又は定量する前に、例えば、液体クロマトグラフィー、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー及び／又は逆相高速液体クロマトグラフィーによって分画可能である。タンパク質消化物は、プロテアーゼ消化物、例えば、トリプシン消化物を含んでもよい。タンパク質消化物は、有利には、Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅプロトコルによって調製可能である。
【0008】
質量分析の方法は、タンデム質量分析、イオントラップ質量分析、トリプル四重極質量分析、オービトラップ質量分析、ハイブリッドイオントラップ／四重極質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、ＭＡＬＤＩ質量分析、及び／又は飛行時間型質量分析を含んでいてもよい。１種又は２種以上のタンパク質の絶対量を決定するために使用される質量分析のモードは、例えば、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、インテリジェント選択反応モニタリング（intelligent Selected Reaction Monitoring）（ｉＳＲＭ）、並列反応モニタリング（Parallel Reaction Monitoring）（ＰＲＭ）、及び／又は多重選択反応モニタリング（multiple Selected Reaction Monitoring）（ｍＳＲＭ）であってもよい。質量分析の方法は、データ独立取得法であってもよい。測定される１種又は２種以上タンパク質フラグメントペプチドは、例えば、配列番号１〜７に記載の１種又は２種以上のペプチドであってもよい。
【0009】
消化物を調製するために使用される組織は、パラフィン包埋組織であってもよく、腫瘍、例えば、原発性又は続発性腫瘍から取得されてもよい。
【0010】
１種又は２種以上のタンパク質を定量する一つの方法は、ある生体試料中のフラグメントペプチドの量を、異なる別個の生体試料中の同一フラグメントペプチドの量と比較することを含む。１種又は２種以上のタンパク質を定量するさらなる方法は、生体試料中のフラグメントペプチドの量を、同一の生体試料中の他の異なるタンパク質由来となる他の異なるフラグメントペプチドの量と比較することを含む。１種又は２種以上のタンパク質を定量するさらなる方法は、生体試料中のフラグメントペプチドの量を、同一のアミノ酸配列を有する既知量の添加された内部標準ペプチドとの比較によって決定することを含む。内部標準ペプチドは、同位体標識されたペプチドであってもよく、それは、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈ又はそれらの組合せから選択される重安定同位体を含んでもよい。
【0011】
これらの方法において、タンパク質消化物中のタンパク質フラグメントペプチドの少なくとも１種を検出及び定量することは、対応するタンパク質の存在を示すとともに、患者又は対象の癌との関連とを示す。本方法は、さらに、１種又は２種以上のフラグメントペプチド、又は対応するタンパク質の検出及び定量の結果を、癌の診断上の組織像／ステージ／グレード／ステータスと相関させることを含み得る。フラグメントペプチドの少なくとも１種の検出及び定量の結果を、癌の診断上の組織像／ステージ／グレード／ステータスと相関させることは、マルチプレックスフォーマットにおいて、他のタンパク質又は他のタンパク質由来のフラグメントペプチドを検出及び／又は定量することと組み合わされて、癌の診断上の組織像／ステージ／グレード／ステータスに関連する追加の情報を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【0012】
詳細な説明患者組織、例えば、ホルマリン固定組織中のタンパク質ＣＢＬ、ＦＰＧＳ、ＨＳＰ９０Ａ、ＨＳＰ９０Ｂ、ＩＮＳＲ、ＭＣＬ１及びＴｒｋＡを測定するための方法が提供される。それぞれのタンパク質の測定レベルは、単独又は組み合わされて、癌処置法の改善の一部としての診断ツールとして使用可能である。例えば、タンパク質の１種又は２種以上のレベルは、試料が取得された対象において、癌の診断上のステージ／グレード／ステータスと相関させることができる。相関はまた、マルチプレックスフォーマットにおいて、他のタンパク質、又は他のタンパク質由来のペプチドを検出及び／又は定量することと組み合わせて、対象に対する癌処置法の改善を提供することができる。
【0013】
測定されるタンパク質ＣＢＬ（別名、ＦＲＡ１１Ｂ、ＮＳＬＬ及びＲＮＦ５５）は、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼであり、細胞のシグナル伝達及びタンパク質のユビキチン化に関与する。ＣＢＬは、Ｅ３リガーゼとして機能するため、ユビキチンと、そのタンパク質基質（典型的には、受容体チロシンキナーゼ）との間の共有結合の形成を触媒することができる。ＣＢＬは、細胞表面受容体の活性化によって誘発される多くのシグナル伝達経路の負の調節因子として機能し、活性化した受容体チロシンキナーゼ、例えば、ＫＩＴ、ＦＬＴ１、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＥＧＦＲ、ＣＳＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ８及びＫＤＲを認識することにより、細胞のシグナル伝達の終結をもたらす。ＣＢＬは、膜結合性のＨＣＫ、ＳＲＣ及びＳＲＣファミリーのその他のキナーゼを認識し、それらのユビキチン化及び分解を調節する。ＣＢＬは、造血細胞におけるシグナル伝達に関与し、骨芽細胞の分化及びアポトーシスの制御に重要な役割を果たし、その制御は、破骨細胞性骨吸収に必須である。
【0014】
ＦＰＧＳ（別名ホリルポリ−γ−グルタミン酸合成酵素及びホリルポリグルタミン酸合成酵素）は、葉酸からポリグルタミン酸誘導体への変換を触媒するタンパク質であり、細胞中に葉酸化合物を蓄積させ、これらの補助因子を細胞内に保持させる。これらの補助因子は、葉酸依存性酵素のほとんどに対する重要な基質であり、それらの酵素は、プリン、ピリミジン及びアミノ酸の合成に関わる一炭素転移反応（one-carbon transfer reactions）に関与している。非置換の還元された葉酸は、好ましい基質である。ＦＰＧＳは、メトトレキサート（ＭＴＸ）をポリグルタミン酸に代謝する際にも役割を果たしている。
【0015】
熱ショックタンパク質９０Ａ（ＨＳＰ９０Ａ）及び熱ショックタンパク質９０Ｂ（ＨＳＰ９０Ｂ）は、同一の機能を有するほぼ同一のタンパク質であり、シャペロンタンパク質として作用する。シャペロンタンパク質は、他のタンパク質が適切に折り畳まるのを補助し、熱ストレスに対してタンパク質を安定させ、タンパク質の分解を補助する。これらのタンパク質はまた、腫瘍の成長のために必要なその他の多くのタンパク質を安定させ、このことが、ＨＳＰ９０Ａ及びＨＳＰ９０Ｂに対する阻害剤が、抗癌剤として研究されている理由である。クラスとしての熱ショックタンパク質は、あらゆる種にわたって最も高発現の細胞タンパク質の一つであり、一般に、温度上昇によるストレスの際に機能して細胞を保護し、ストレスのない細胞において総タンパク質の１〜２％を占める。しかしながら、細胞に熱が加えられると、熱ショックタンパク質の割合は、細胞タンパク質の４〜６％に上昇する。ＨＳＰ９０Ａタンパク質は、２つのアイソフォームを有し、両方とも細胞質中に見られる。ＨＳＰ９０ＡＡの発現は、誘導性である一方で、ＨＳＰ９０ＡＢは、恒常的に発現される。ＨＳＰ９０Ｂタンパク質は、１フォームのみ有し、小胞体に局在する。ＨＳＰ９０Ａ及びＨＳＰ９０Ｂを薬剤によって標的とすることは、臨床試験において、見込みのある効果を示している。ＨＳＰ９０Ｂはまた、ヒトの卵巣自己免疫疾患に関与する自己抗原のバイオマーカー及び標的の一つとしても同定されていて、その自己免疫疾患は、卵巣障害及びそれによる不妊を引き起こす。
【0016】
ＩＮＳＲ（別名インスリン受容体、ＩＲ）は、インスリン、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩによって活性化され、チロシンキナーゼ受容体の大きなクラスに属する膜貫通受容体である。代謝的には、インスリン受容体は、グルコースの恒常性の制御において重要な役割を果たし、悪化した状態下の機能的なプロセスによって、様々な臨床症状、例えば、糖尿病及び癌を生じ得る。インスリン受容体は、単一のＩＮＳＲ遺伝子によってコードされ、転写の間の選択的スプライシングによって、その遺伝子からＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂアイソフォームが生じる。いずれかのアイソフォームのその後の翻訳後のイベントにより、タンパク質分解性に切断されたα及びβサブユニットを生じ、それらのサブユニットは組み合わされて、最終的に、ホモ二量体又はヘテロ二量体化し、ジスルフィド結合で結合された約３２０ｋＤａの膜貫通インスリン受容体が形成される。
【0017】
ＭＣＬ１（別名骨髄細胞白血病１（myeloid cell leukemia 1）及びＢＣＬ２ファミリーアポトーシス制御因子）は、ＢＣＬ−２タンパク質ファミリーのタンパク質である。２つの区別可能なＭＣＬ１のアイソフォームが同定されている。長い方の遺伝子産物は、このタンパク質のより長いフォーム（アイソフォーム１）を生じ、それは、アポトーシスを阻害することにより細胞の生存を増強する一方で、選択的スプライシングされた短い方の遺伝子産物（アイソフォーム２）は、アポトーシスを促進し、細胞死を誘導する。
【0018】
ＴｒｋＡ（別名トロポミオシン受容体キナーゼＡ）は、チロシンキナーゼＴｒｋ受容体ファミリーのメンバーであり、それらは、哺乳動物の神経系においてシナプスの強度及び可塑性を制御する。Ｔｒｋ受容体は、いくつかのシグナル伝達カスケードを通じて神経の生存及び分化に作用する。しかしながら、これらの受容体の活性化は、神経の機能的特性に重大な影響を及ぼす。ニューロトロフィンが結合することによるＴｒｋ受容体の活性化は、シグナルカスケードの活性化を導き、細胞の生存及びその他の機能的制御の促進をもたらし得る。ＴｒｋＡは、神経成長因子（ＮＧＦ）の結合に対して、最も高い親和性を有する。ＮＧＦは、局所作用及び核内作用の両方において重要であり、錐状体の成長、運動性、及び神経伝達物質に対する生合成酵素（biosynthesis of enzymes for neurotransmitters）をコードする遺伝子の発現を制御する。ＴｒｋＡは、その他のチロシンキナーゼ受容体がするように、リガンドの結合に応答して二量体になる。これらの二量体は、互いにリン酸化し、キナーゼの触媒活性を増強することにより、異なるシグナル伝達カスケードの活性化を介して神経の成長及び分化に作用する。３つの既知の経路は、ＰＬＣ、Ｒａｓ／ＭＡＰＫ（mitogen-activated protein kinase）及びＰＩ３Ｋ（phosphatidylinositol 3-kinase）経路である。これらの経路は、核及びミトコンドリアの細胞死プログラムの妨害に関与し、結局は、転写因子、ＣＲＥＢ（cAMP response element-binding）の活性化に至り、次いで、ＣＲＥＢは、腫瘍発生を促進する特定の遺伝子を活性化する。
【0019】
これらのタンパク質はそれぞれ、現在の臨床業務における癌治療薬、又は臨床的に開発中の癌治療薬のための標的であるため、患者の腫瘍細胞において、これらのタンパク質のそれぞれの発現レベルを決定することは、癌治療法について決定するプロセスの一部として使用可能である。
【0020】
アッセイ法以下の方法は、定量的なプロテオミクスベースのアッセイを提供し、そのアッセイを使用して、癌患者からのホルマリン固定組織中の測定されるそれぞれのタンパク質を定量することができる。アッセイからのデータを使用して、例えば、癌療法のための処置決定を改善することができる。
【0021】
タンパク質は、以下に詳細に記載されるように、ＳＲＭアッセイ又はＤＩＡ法によって測定されてもよい。ＳＲＭアッセイを使用して、測定されるそれぞれのタンパク質からの特定のペプチドの相対定量レベル又は絶対定量レベルを測定することができる一方で、ＤＩＡは、タンパク質の相対レベルのみを測定することができる。いずれのタイプのアッセイも、生体試料から取得された所与のタンパク質調製物中のタンパク質のそれぞれの量を、質量分析によって測定する方法を提供する。より具体的には、アッセイは、患者の腫瘍組織、例えば、ホルマリン固定された癌患者組織から得られた細胞から調製された複雑なタンパク質溶解液試料中のこれらのタンパク質を、直接的に測定することができる。ホルマリン固定組織からタンパク質試料を調整する方法は、米国特許第７，４７３，５３２号に記載され、その内容の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。米国特許第７，４７３，５３２号に記載の方法は、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から市販されているＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ試薬及びプロトコルを使用して簡便に実施可能である。
【0022】
癌患者組織からの組織の最も広範かつ有利に利用可能な形態は、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織である。外科的に切除された組織のホルムアルデヒド／ホルマリン固定は、断然世界中で最も一般的な癌組織試料を保存する方法であり、標準的な病理プラクティス（pathology practice）において許容される慣例である。ホルムアルデヒドの水溶液はホルマリンと呼ばれる。「１００％」ホルマリンは、酸化及び重合度を制限するために少量の安定剤（通常はメタノール）を含む、ホルムアルデヒドの飽和水溶液（体積基準で約４０％又は質量基準で３７％）からなる。組織を保存するための最も一般的な方法は、組織全体を長時間（８時間〜４８時間）、ホルムアルデヒド水溶液（一般的に１０％中性緩衝ホルマリンと呼ばれる）に浸漬し、次いで、室温での長期間保存のために、固定された組織全体をパラフィンワックスに包埋する。このようなホルマリン固定された癌組織を分析するための分子分析法は、癌患者組織の分析のために最も受容され、頻繁に利用されている方法であろう。
【0023】
ＳＲＭ又はＤＩＡアッセイからの結果を使用して、組織（生体試料）が回収及び保存された患者又は対象の特定の組織試料（例えば、癌組織試料）中の特定のタンパク質のそれぞれの正確かつ精密な相対的な定量レベルを、相関させることができる。これにより、癌に関連する診断情報が提供されるだけでなく、医師又は他の医療専門家が患者に対する好適な療法を決定することもできる。そのようなアッセイは、疾患のある組織又はその他の患者試料におけるタンパク質発現のレベルに関連する診断及び治療上の重要な情報を提供し、コンパニオン診断アッセイと呼ばれる。例えば、そのようなアッセイを、癌のステージ又は程度（degree）を診断し、患者が最も応答しそうな治療薬を決定するように設計することができる。
【0024】
本明細書に記載のアッセイによって、特定のタンパク質に由来する特定の非修飾のペプチドの相対レベル又は絶対レベルが測定されるとともに、特定のタンパク質のそれぞれに由来する特定の修飾されたペプチドの相対レベル又は絶対レベルも測定可能である。修飾の例には、ペプチドに存在するリン酸化されたアミノ酸残基及びグルコシル化されたアミノ酸残基が挙げられる。
【0025】
タンパク質のそれぞれの相対定量レベルは、ＳＲＭ又はＤＩＡ法によって決定される。ＳＲＭアッセイに関して、異なる試料中のタンパク質に由来する個々のフラグメントペプチドのＳＲＭシグネチャピーク面積（signature peak area）（例えば、シグネチャピーク面積又はフラグメントイオン強度の積分値）を比較される。あるいは、各ペプチドがその独自の特定のＳＲＭシグネチャピークを有する場合、複数のシグネチャペプチド（signature peptide）に対する複数のＳＲＭシグネチャピーク面積を比較することが可能であり、ある生体試料中の相対的なタンパク質量を、追加の又は異なる１つ又は複数の生体試料中の同一の１種又は２種以上のタンパク質の量に関して決定することが可能である。このようにして、対象の１種以上のタンパク質由来の特定の１種又は２種以上のペプチドの量、したがって、１種又は２種以上の選択された（designated）タンパク質の量が、同一の実験条件下で複数の生体試料にわたって、同一の１種又は２種以上のペプチドに対して相対的に決定される。加えて、単一試料中の所与のタンパク質に由来する所与の１種又は２種以上のペプチドに対する相対定量は、ＳＲＭ法によるそのペプチドに対するシグネチャピーク面積を、その生体試料からの同一タンパク質調製物における異なる１種又は２種以上のタンパク質に由来する他の異なる１種又は２種以上のペプチドに対するシグネチャピーク面積と比較することによって、決定可能である。このようにして、選択されたタンパク質由来の特定のペプチドの量、したがって、そのタンパク質の量は、同一試料中の一方に対する相対的なものとして決定される。これらのアプローチは、試料間及び試料中において、選択されたタンパク質に由来する個々の１種又は２種以上のペプチドの定量を、他の１種又は２種以上のペプチドに対して可能にする。その際、シグネチャピーク面積によって決定される量は、一方に対する相対的なものであり、生体試料からのタンパク質調製物中の選択されたペプチドの容量に対する絶対重量又は重量に対する絶対重量を問わない。異なる試料間における個々のシグネチャピーク面積に関する相対定量データは、試料当たりの分析されたタンパク質量に標準化される。相対定量を、単一試料中の及び／又は多くの試料にわたる複数のタンパク質及び１種又は２種以上の選択されたタンパク質に由来する多くのペプチドにわたって同時に実施することができ、相対的なタンパク質量、例えば、その他のペプチド／タンパク質に対するある１種のペプチド／タンパク質への知見を得ることができる。
【0026】
ＳＲＭアッセイとは異なって、ＤＩＡは、標的ペプチドの事前選択を必要としない。代わりに、プリカーサー質量範囲（precursor mass range）が選択され、次いで、その範囲は、一連の単離ウインドウ（isolation window）へと分割される。ＭＳ／ＭＳデータは、最初の単離ウインドウにおいて、検出されたプリカーサーイオン全てから取得される。それは、プリカーサー質量範囲全体が対象とされるまで、連続して隣接する単離ウインドウに対して繰り返される。ＭＳ／ＭＳスペクトルライブラリを使用して、以下に詳細に記載されるように、取得されたデータから目的のペプチドを同定する。
【0027】
選択されたタンパク質の絶対定量レベルは、例えば、ＳＲＭ法によって決定される。そこでは、生体試料中の選択されたタンパク質に由来する個々のペプチドのＳＲＭシグネチャピーク面積は、スパイクされた（spiked）内部標準のＳＲＭシグネチャピーク面積と比較される。一実施形態において、内部標準は、選択されたタンパク質に由来する全く同一のペプチドの合成バージョンであり、それは、１種又は２種以上の重同位体によって標識された１つ又は複数のアミノ酸残基を含む。このような同位体標識された内部標準は、質量分析によって分析される際、標準が予測可能かつ一貫したＳＲＭシグネチャピークを生じ、そのピークは、天然の（native）ペプチドのシグネチャピークと異なり、区別でき、そのピークを比較ピークとして使用可能であるように合成される。したがって、内部標準が生体試料からのタンパク質調製物に既知量でスパイクされ、質量分析によって分析される際、天然のペプチドのＳＲＭシグネチャピーク面積は、内部標準ペプチドのＳＲＭシグネチャピーク面積と比較され、この数値比較によって、生体試料からの元の（original）タンパク質調製物中に存在する天然のペプチドの絶対モル濃度及び／又は絶対重量が示される。フラグメントペプチドに対する絶対定量データは、試料当たりの分析されたタンパク質量に従って表される。絶対定量を、単一試料中の及び／又は多くの試料にわたる多くのペプチド、したがって、多くのタンパク質にわたって同時に実施することができ、個々の生体試料及び個々の試料のコホート全体において絶対的なタンパク質量への知見を得ることができる。
【0028】
本明細書に記載のアッセイ法を使用して、例えば、直接的に患者由来の組織（例えば、ホルマリン固定された組織）において、癌のステージの診断を補助することができ、その患者を処置する際の使用に最も有利である治療薬を決定する際に補助することができる。手術（例えば、腫瘍の部分的な又は腫瘍全体の治療的な切除）又は生検工程（疑いのある疾患の存在もしくは非存在を決定するために実施される工程）のいずれかによって患者から切除された癌組織を分析して、特定の１種又は２種以上のタンパク質がその患者の組織に存在するか否かとともに、その患者の組織に存在するタンパク質のフォームを決定する。さらに、１種又は２種以上のタンパク質の発現レベルを、健康な組織で見られる「正常」又は対照レベルに対して、決定し、比較することができる。健康な組織で見られるタンパク質の正常又は対照レベルは、例えば、癌を有していない１又は複数の個体の対応する組織に由来していてもよい。あるいは、癌を有する個体に対する正常又は対照レベルは、癌に影響されない対応する組織の分析によって取得されてもよい。
【0029】
１種、いくつか又は全ての選択されたタンパク質からのタンパク質レベルのアッセイを使用して、タンパク質レベルを利用することにより、癌を有すると診断された患者又は対象における癌のステージを診断することもできる。選択されたタンパク質に由来する個々のペプチドの絶対レベルは、分析されたタンパク質溶解液の総量当たりのＳＲＭアッセイによって決定されるペプチドのモル量として定義される。そのため、１種又は２種以上の選択されたタンパク質に関する情報を、１種又は２種以上のタンパク質（又はタンパク質のフラグメントペプチド）のレベルを、正常組織で見られるレベルと比較することによって、癌のステージ又はグレードを決定する際の補助のために使用することができる。１種又は２種以上の選択されたタンパク質の定量的な量が、癌細胞において決定されると、その情報を、例えば、アッセイされた１種又は２種以上のタンパク質の異常な発現によって特徴付けられる癌組織を特異的に処置するために開発された（化学的及び生物学的）治療薬のリストに照合することができる。例えば、タンパク質のアッセイの情報を、選択されたタンパク質又は選択されたタンパク質を発現している細胞／組織を特異的に標的とする治療薬のリストに照合することは、疾患の処置への個別化医療アプローチと呼ばれているものを表す。本明細書に記載のアッセイ法は、診断上及び処置上の決定の情報源として患者自身の組織に由来するタンパク質の分析を使用することによる個別化医療アプローチの基礎を形成する。
【0030】
原理的には、選択されたタンパク質由来のあらゆる予測されるペプチドを、代理レポーター（surrogate reporter）として使用して、質量分析ベースのＳＲＭ又はＤＩＡアッセイを使用する試料において選択されたタンパク質の量を決定することができる。そのペプチドは、例えば、特異性既知のプロテアーゼ（例えば、トリプシン）による消化によって調製される。同様に、選択されたタンパク質において修飾される可能性があると知られる部位のアミノ酸残基を含むあらゆる予測されるペプチドの配列を使用して、試料中の選択されたタンパク質の修飾の程度をアッセイすることができる可能性もある。
【0031】
選択されたタンパク質に由来する適切なフラグメントペプチドは、米国特許第７，４７３，５３２号に提供されているＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅプロトコルの使用を含む様々な方法によって生成することができる。Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅプロトコル及び試薬によって、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から、組織／生体試料中のタンパク質のタンパク質消化により、質量分析による分析に適切なペプチド試料を作製することができる。Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅプロトコルにおいて、組織／生体試料を、緩衝液中で長期間加熱して（例えば、約１０分〜約４時間の期間、約８０℃〜約１００℃）、タンパク質のクロスリンクを逆転させるか又は解除する。使用される緩衝液は、中性緩衝液（例えば、トリスベースの緩衝液又は界面活性剤を含む緩衝液）である。熱処理の後、組織／生体試料を、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン及びエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃを含むが、これらに限定されない１種又は２種以上のプロテアーゼによって、生体試料の組織及び細胞構造を破壊するのに十分な時間で処理する。加熱及びタンパク質分解の結果として、液体で可溶性の希釈可能な生体分子溶解液が得られる。
【0032】
驚くことに、上記されたタンパク質の多くの潜在的なペプチド配列は、容易には明らかにならない理由によって、質量分析ベースのアッセイにおける使用には適切でない又は非効率的であることが見出された。アッセイに対して最も適切なペプチドを予測することができなかったため、実際のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解液における修飾された及び非修飾のペプチドを実験的に同定し、各選択されたタンパク質の信頼性のある精密なアッセイを開発する必要があった。いかなる理論に縛られることを望まないものの、例えば、あるペプチドは、あまりイオン化しないか、又は他のタンパク質と区別することができるフラグメントを生じないために、質量分析によって検出することが困難であると考えられている。また、ペプチドは、分離（例えば、液体クロマトグラフィー）においてあまり分離しないか、又はガラスもしくはプラスチック製品に吸着することもあり得る。
【0033】
表１に記載のペプチドは、ホルマリン固定された癌組織から得られた細胞から調製された複雑なＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解液内の全てのタンパク質のプロテアーゼ消化によって、それぞれの選択されたタンパク質から得られた。特に断りの無い限り、各例において、プロテアーゼはトリプシンであった。次いで、Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解液を質量分析によって分析して、質量分析によって検出され、分析される選択されたタンパク質由来のペプチドを決定した。質量分析による分析のための特定の好ましい一群のペプチドの同定は、１）Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解液の質量分析による分析において、タンパク質に由来する１種又は２種以上のイオン化するペプチドの種類の実験的な決定、及び２）Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解液を調製する際に使用されるプロトコル及び実験的な条件を通して残存するためのペプチドの能力に基づく。この後者の特性は、ペプチドのアミノ酸配列のみならず、ペプチド中の修飾されたアミノ酸残基が、試料調製の間に修飾された形態で残存するための能力にまで拡大される。
【0034】
ホルマリン（ホルムアルデヒド）固定された組織から直接得られた細胞のタンパク質溶解液を、Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ試薬及びプロトコルを使用して調製した。そのプロトコルは、組織の顕微解剖を経て、細胞を試料管に回収し、次いで、Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ緩衝液中で細胞を長期間加熱することを伴う。ホルマリン誘導性のクロスリンクを逆に作用させ、次いで、組織／細胞を、例えば、プロテアーゼであるトリプシンを含むが、それに限定されないような、プロテアーゼを使用して予測可能な方法で完全に消化する。各タンパク質溶解液を、プロテアーゼによる完全なポリペプチドの消化によって一群のペプチドに変換する。各Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解液を（例えば、イオントラップ質量分析によって）分析し、ペプチドの複数の網羅的プロテオミクス調査を実施し、データを各タンパク質溶解液に存在する全ての細胞性タンパク質の質量分析によって同定可能な限り多くのペプチドを同定したものとして提示した。単一の複雑なタンパク質／ペプチド溶解液から可能な限り多くのペプチドを同定するために、網羅的なプロファイリングを実施可能なイオントラップ質量分析又はその他の形態の質量分析を、一般的には使用する。しかしながら、イオントラップ質量分析計が、ペプチドの網羅的なプロファイリングを実施するために最良のタイプの質量分析計であり得る。
【0035】
ＳＲＭアッセイは、いずれのタイプの質量分析計、例えば、ＭＡＬＤＩ、イオントラップ、又はトリプル四重極で開発及び実施可能であるが、ＳＲＭアッセイのために最も有利な機器プラットフォームは、多くの場合、トリプル四重極機器プラットフォームであると考えられる。できる限り多くのペプチドが、使用される条件下で単一の溶解液の単一のＭＳ解析において同定されると、次に、ペプチドリストを照合し、その溶解液中で検出されたタンパク質を決定するために使用した。このプロセスを複数のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解液に対して繰り返し、極めて大きなペプチドリストを単一のデータセットに並べた。このタイプのデータセットは、分析された生体試料のタイプにおいて（プロテアーゼ消化後）、具体的には、生体試料のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解液において検出され得るペプチドを表すと考えることができるため、選択されたタンパク質のそれぞれに対するペプチドを含む。
【0036】
データ独立取得（ＤＩＡ）と呼ばれる新たな方法は、ＳＲＭの再現性と、網羅的なショットガンプロテオーム解析において同定される膨大なタンパク質／ペプチドとを組み合わせることにより、網羅的なプロテオーム法及びターゲット法（targeted methods）の両方の長所を利用する。一般にＤＩＡ法には、分析中に個々のプリカーサーイオンを検出する必要がなく、それは、ＭＳ／ＭＳスキャンが、取得プロセスを通して体系的に（先行する情報なしに独立して）収集されるからである。マルチプルＤＩＡフォーマットが、使用中及び／又は現在開発中であり、以下のいずれにおいても、今回記載の方法において適用可能である。
【0037】
ＤＩＡのデータ作成は、ＤＤＡ又はＳＲＭ実験と比較して、より柔軟かつ単純である。サーベイスキャン（survey scan）又は全ＭＳスキャン（full MS scan）からのプリカーサーイオンの選択に関係なく、ＤＩＡは、全てのＭＳ／ＭＳスキャンを収集する一方で、ＤＤＡはその選択を必要とする。標的フラグメントペプチドの事前定義（predefinition）は、ＳＲＭ／ＰＲＭにおいて必要とされるが、ＤＩＡ実験に必要ない。プリカーサー及び対応するトランジション（transition）の広い範囲が、データの入手後に抽出可能である。したがって、ターゲットプロテオミクスにおいて、ＤＩＡは、ターゲットデータ抽出戦略を使用する包括的なプロテオーム規模の定量を目標とする。しかしながら、ＳＲＭと比較する場合、ＤＩＡベースのターゲット法は、一般に、より低い感度、特異性及び再現性に加えてタンパク質の定量におけるより狭いダイナミックレンジを提供する。
【0038】
ＤＩＡ法は、元々、事前定義されたｍ／ｚ範囲の連続的な単離及び断片化を実施するために広いプリカーサー単離ウインドウ（１０ｍ／ｚ）の適用を備えるＬＴＱリニアイオントラップ（ＬＩＴ）質量分析計を使用して導入された。ＭＳレベルの定量と比較して、信号対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）は、良好な線形ダイナミックレンジで大幅に改善された（３５０％より高い）ことが見出された。ＤＩＡ定量のＭＳ／ＭＳレベルにおけるイオン抽出（ion extractions）の適用も、実施された。しかしながら、広いプリカーサー単離ウインドウを備えるそのような低分解能のＤＩＡ ＭＳ／ＭＳは、質量確度（mass accuracy）、及びペプチド同定における信頼性を低下させ、それにより、潜在的に偽陽性率（false positive discovery rate）を増加させる結果となった。
【0039】
それ以降、その他の修正されたＤＩＡが、導入されている。ＭＳＥは、これまでに導入され、ＱｑＴＯＦ機器で効率的に作動可能である。より狭い単離ウインドウ（２．５ｕ）の使用により、タンパク質の同定の改善につながったが、標的の質量範囲全体を対象にする全データ取得には、複数回のインジェクション（５日間で６７インジェクション）を必要とした。非常に速くスキャンするイオントラップＭＳ（例えば、ＬＴＱオービトラップ Ｖｅｌｏｓ ＭＳ）によって、全データ取得時間が約２日まで短縮された。卓上のＥｘａｃｔｉｖｅ ＭＳの導入は、全イオン断片化（all-ion fragmentation）（ＡＩＦ）の適用を実施するために使用された。そこでは、ペプチドが、プリカーサーの選択なしに、断片化のためにＨＣＤ衝突セル（HCD collision cell）に注入され、フラグメントが、Ｃ−トラップに戻され、オービトラップ質量分析部によって分析された。共溶出するプリカーサーイオンに対するフラグメントイオンの割当（assignment）は、高分解能（ｍ／ｚ ２００において１０００００）及び高い質量確度によって増強された。このコンセプトは、デューティサイクル時間を大幅に減少させるが、ある程度の保持時間において、ＡＩＦからのより大きな干渉をもたらす。別のＤＩＡアプローチが、続いて導入され、拡張独立データ取得（extended data-independent acquisition）（ＸＤＩＡ）と呼ばれ、電子移動解離（ＥＴＤ）機能を備えた様々なタイプのオービトラップＭＳで実施された。ＤＤＡベースのＥＴＤ解析と比較した場合、ＤＩＡベースのＥＴＤアプローチは、スペクトルの同定数（約２５０％）及び固有のペプチド数（約３０％）を有意に増加させた。これは、低存在量のＰＴＭ研究を促進することができる可能性があった。
【0040】
最近、ＤＩＡにおける大きな改善が、高速スキャンＨＲ／ＡＭ機器の開発と併せて達成された。そこでは、ＳＷＡＴＨと呼ばれるＤＩＡのバリエーションが、ＱｑＴＯＦ ＭＳを使用して実施され、概念的には、複数のスペクトルからなる広い単離ウインドウ（典型的には２５ｍ／ｚ）の利用が言及されている。ＱｑＴＯＦ ＭＳを使用する一つの重要な特徴は、最速のデータ取得速度である。別のＤＩＡ戦略が、ＱｑＯｒｂｉ ＭＳの使用によって導入された。そこでは、ＭＳＸと呼ばれる新規の取得法が、取り入れられ、機器の速度、選択性及び感度を改善した。ＤＩＡデータ取得及びプロセスにおける最近の改善は、新しいバージョンのオービトラップＭＳ機器によって支援されている。ｐＳＭＡＲＴと呼ばれるその最初の一つは、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＭＳで実施され、質量範囲にわたって、非対称の（asymmetric）単離ウインドウ：４００〜８００ｍ／ｚを対象にする５Ｄａウインドウ、８００〜１０００ｍ／ｚを対象にする１０Ｄａウインドウ、及び１０００〜１２００ｍ／ｚを対象にする２０Ｄａウインドウを利用する。広選択イオンモニタリングＤＩＡ（wide selected-ion monitoring DIA）（ｗｉＳＩＭ−ＤＩＡ）と呼ばれ、新しいハイブリッドＱ−ＨＣＤ−オービトラップ−ＬＩＴ ＭＳ（すなわち、オービトラップＦｕｓｉｏｎ及びＬｕｍｏｓ）で実施される別のＤＩＡ法では、２００Ｄａの単離ウインドウによる３回のＨＲ／ＡＭ ＳＩＭスキャンが、４００〜１０００ｍ／ｚの全プリカーサーイオンを対象にして使用される。各ＳＩＭスキャンと平行して、１２Ｄａの単離ウインドウによる１７回の連続したイオントラップＭＳ／ＭＳが、関連する２００ＤａのＳＩＭ質量範囲を対象にして取得された。標準的な広いウインドウのＭＳ／ＭＳのみのＤＩＡ法とは異なる、ｐＳＭＡＲＴ及びｗｉＳＩＭ−ＤＩＡのためのＭＳ１データ（すなわち、より長い充填時間（fill time）によるＨＲ／ＡＭプリカーサーデータ、及びＬＣ溶出プロファイルにわたって十分なプリカーサーイオンのデータポイント）が、高感度の検出及び定量のために使用され、一方で、高速イオントラップＭＳ／ＭＳスキャンからのＭＳ／ＭＳデータが、ペプチドの同定／確認にのみ使用される。
【0041】
検出可能なペプチドプリカーサーの全フラグメントイオンの完全な記録を有するが、高度なデータ解析を伴う標準的なＤＩＡ法と比較して、ｐＳＭＡＲＴ及びｗｉＳＩＭ−ＤＩＡは、比較的簡単なデータ解析によって、検出可能なペプチドプリカーサーに対する小数のＭＳ／ＭＳスペクトルのみを提供することができ、その理由は、デューティサイクル時間の大部分が、高品質のＭＳ１データを生成するために使用されるためである。したがって、それらの感度及び精度は、標準的なＤＩＡ法によって提供されるものよりも高く、一方で、それらの定量確度（quantification accuracy）（すなわち、特異性又は選択性）は、標準的なＤＩＡ法の定量確度よりもいくらか低く、それは、ＭＳ１からの共溶出による干渉（co-eluting interference）を有する機会がＭＳ／ＭＳよりも増加するためである。ごく最近、ハイパー反応モニタリング（hyper reaction monitoring）（ＨＲＭ）と呼ばれる新規のＤＩＡ法が、実施された。それは、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＭＳプラットフォ−ムによる包括的なＤＩＡ取得と、保持時間の標準化された（ｉＲＴ）スペクトルライブラリを有するターゲットデータ解析とからなる。ＨＲＭは、複数の測定にわたって、一致して同定されるペプチド数、及び異なる豊富なタンパク質の定量の信頼性の両方において、網羅的なショットガンプロテオミクスより優れていることが実証されている。
【0042】
ＤＩＡ解析のためのより効果的なバイオインフォマティクスのツールは、現在、開発中であり、以下のいずれにおいても、今回記載の方法において適用可能である。ＤＩＡスペクトルは、高度に多重化され、そのために、より精巧なデータ解釈アルゴリズムが、ＤＤＡ又はＳＲＭ／ＰＲＭと比較して必要とされる。現在、ＤＩＡスペクトルを解釈するために使用される３つのアプローチが存在する。一つ目のアプローチは、ＤＩＡスペクトルから疑似ＤＤＡスペクトル（pseudo-DDA spectra）を構築することである（例えば、Ｄｅｍｕｘ、ＭａｘＱｕａｎｔ、ＸＤＩＡプロセッサー及びＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｆｉｎｄｅｒ）。これらの再構築された疑似ＤＤＡスペクトルは、次いで、通常の検索エンジンツール、例えば、ＭＳＧＦ＋、ＭａｘＱｕａｎｔ、ＭＡＳＣＯＴ、又はその他のスペクトルライブラリを使用して処理される。スキームのいくつかは、クロマトグラフの溶出プロファイルを使用して、ペプチドの同定を改善した。Ｔｓｏｕ ｅｔ ａｌ．による最近の発表には、ＤＩＡ−Ｕｍｐｉｒｅと呼ばれるコンピュータによるアプローチの開発が記載されていた。ＤＩＡ−Ｕｍｐｉｒｅは、２つの側面（ｍ／ｚ及び保持時間）の特徴検出アルゴリズム（feature-detection algorithm）から開始して、ＭＳ及びＭＳ／ＭＳデータ中の全ての可能性のあるプリカーサー及びフラグメントイオンのシグナルを見出す。フラグメントイオンは、ＬＣ溶出ピークとピークの頂点における保持時間との相関を有するプリカーサーイオンによってグループ化される。次いで、各プリカーサー−フラグメントグループに対して生成された疑似ＭＳ／ＭＳスペクトルが、上記のツールを含む通常のデータベース検索エンジンにより処理される。Ｔｓｏｕ ｅｔ ａｌ．，“ＤＩＡ−Ｕｍｐｉｒｅ：ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｆｏｒ ｄａｔａ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，”Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２：２５８−２６４（２０１５）参照。
【0043】
３つ目のアプローチは、多重化されたＭＳ／ＭＳを、ペプチドの理論上のスペクトルに照合することである（例えば、ＰｒｏｂＩＤｔｒｅｅ、Ｉｏｎ Ａｃｃｏｕｎｔｉｎｇ、Ｍ−ＳＰＬＩＴ、ＭｉｘＤＢ、及びＦＴ−ＡＲＭ）。スコアリングアルゴリズム（scoring algorithms）は、配列データベース又はスペクトルライブラリからペプチドの理論上のフラグメントイオンが、高い質量確度を備える多重化されたスペクトルに関して見出される数に、直接的に基づいている。初めの２つのアプローチは、ＤＩＡスペクトルからのペプチドの、さらなる定量の前の同定に大いに取り組んできた。無償で利用可能な自動化又は半自動化されたツール、例えば、Ｓｋｙｌｉｎｅ、ｍＰｒｏｐｈｅｔ、ＯｐｅｎＳＷＡＴＨ及びＤＩ−ＡＮＡ、並びに、２つの市販のソフトウェア、ＡＢ／Ｓｃｉｅｘ社のＰｅａｋＶｉｅｗ（登録商標）及びＢｉｏｇｎｏｓｙｓ社のＳｐｅｃｔｒｏｎａｕｔ（商標）が、ターゲットデータ抽出戦略を使用する定量的なターゲットＤＩＡデータを処理するために使用されている。
【0044】
検出されたペプチド一実施形態において、選択されたタンパク質の絶対量又は相対量の決定において有用であると同定されたトリプシンペプチドを表１に記載する。これらのペプチドはそれぞれ、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から調製されたＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解液において質量分析によって検出された。したがって、各ペプチドを使用して、直接的にホルマリン固定患者組織を含むヒト生体試料中の選択されたタンパク質に対する定量的なアッセイを開発することができる。
【0045】
【表1】
【0046】
表１に記載のトリプシンペプチドは、通常、例えば、前立腺、結腸及び乳房を含む異なるヒトの器官の複数の異なるホルマリン固定組織の複数のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解液から検出された。
【0047】
ＳＲＭ又はＤＩＡアッセイを実施する際の一つの留意事項は、ペプチドの分析に使用され得る機器のタイプである。ＳＲＭアッセイは、いかなるタイプの質量分析計、例えば、ＭＡＬＤＩ、イオントラップ、又はトリプル四重極で開発及び実施可能であるが、ＳＲＭアッセイのために最も有利な機器プラットフォームは、多くの場合、トリプル四重極機器プラットフォームであると考えられる。そのタイプの質量分析計を、細胞内に含まれる総タンパク質からの数十万から数百万の個々のペプチドからなり得る非常に複雑なタンパク質溶解液内の単一の分離された標的ペプチド（single isolated target peptide）を分析するために最適な機器であると考えることができる。記載の方法を使用して、１）選択されたタンパク質のそれぞれに由来する候補ペプチドであって、選択されたタンパク質に対する質量分析ベースのＳＲＭアッセイのために使用可能な候補ペプチドを同定し、２）相関させるために、選択されたタンパク質に由来する標的ペプチドに対する単一又は複数のＳＲＭアッセイを開発し、かつ、３）定量的なアッセイを、癌診断及び／又は最適な療法の選択に適用した。ＤＩＡアッセイ法に関する詳細は、以下でさらに提供される。
【0048】
アッセイ法１．タンパク質に対するＳＲＭ候補フラグメントペプチドの同定
ａ．ホルマリン固定された生体試料からのＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅタンパク質溶解液を調製し、１種又は２種以上のプロテアーゼを使用して（プロテアーゼは、トリプシンを含んでいても、含んでいなくてもよい）、タンパク質を消化する。
ｂ．個々のフラグメントペプチドが、いかなるペプチド修飾、例えば、リン酸化又はグリコシル化も含まない場合、Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解液中の全てのタンパク質フラグメントをイオントラップタンデム質量分析計によって分析し、選択されたタンパク質に由来する全てのフラグメントペプチドを同定する。
ｃ．Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解液中の全てのタンパク質フラグメントをイオントラップタンデム質量分析計によって分析し、ペプチド修飾、例えば、リン酸化又はグリコシル化残基を有するタンパク質に由来する全てのフラグメントペプチドを同定する。
ｄ．特定の消化方法によって完全な全長タンパク質から生成される全てのペプチドを、潜在的には測定することができるが、ＳＲＭアッセイの開発に使用される好ましいペプチドは、ホルマリン固定された生体試料から調製された複雑なＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅタンパク質溶解液において直接的に質量分析によって同定されたペプチドである。
２．選択されたタンパク質に由来するフラグメントペプチドに対する質量分析アッセイ
ａ．Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅタンパク質溶解液において同定された個々のフラグメントペプチドに対するトリプル四重極質量分析計によるＳＲＭアッセイを、選択されたタンパク質に由来するペプチドに適用する。
ｉ．ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、又は逆相高速液体クロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない最適なクロマトグラフィー条件のためのフラグメントペプチドに対する最適な保持時間を決定する。
ｉｉ．各ペプチドに対するＳＲＭアッセイを開発するために、ペプチドのモノアイソトピック質量、各ペプチドに対するプリカーサー電荷状態、各ペプチドに対するプリカーサーｍ／ｚ値、各ペプチドに対するｍ／ｚ遷移イオン、及び各フラグメントペプチドに対する各遷移イオンのイオンタイプを決定する。
ｉｉｉ．次いで、各ペプチドが、特徴的かつ固有のＳＲＭシグネチャピークを有し、そのピークが、トリプル四重極質量分析計で実施される固有のＳＲＭアッセイを正確に規定する場合、ＳＲＭアッセイを、トリプル四重極質量分析計で（ｉ）及び（ｉｉ）からの情報を使用して実施することができる。
ｂ．検出されるタンパク質のフラグメントペプチドの量が、ＳＲＭ質量分析による分析からの固有のＳＲＭシグネチャピーク面積の関数（function）として、特定のタンパク質溶解液中のタンパク質の相対量及び絶対量の両方を示すことができるようにＳＲＭ／ＭＲＭ分析を実施する。
ｉ．相対定量は、下記によって達成され得る。
１．１つのホルマリン固定された生体試料からのＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解液において検出された所与のフラグメントペプチドからのＳＲＭシグネチャピーク面積を、少なくとも第２、第３、第４又はそれより多いホルマリン固定された生体試料からの少なくとも第２、第３、第４又はそれより多いＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解液中の同一のフラグメントペプチドの同一のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積と比較することによって、選択されたタンパク質の増加又は減少を決定する。
２．ペプチドフラグメントに関する２試料間のＳＲＭシグネチャピーク面積の比較を各試料において分析されたタンパク質量に対して標準化する場合、１つのホルマリン固定された生体試料からのＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解液において検出された所与のフラグメントペプチドからのＳＲＭシグネチャピーク面積を、異なる別個の生体試料源に由来する他の試料における、他のタンパク質に由来するフラグメントペプチドから開発されたＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積と比較することによって、選択されたタンパク質の増加又は減少を決定する。
３．タンパク質のレベルの変化を、様々な細胞条件下で発現レベルが変化しない他のタンパク質のレベルに対して標準化するために、所与のフラグメントペプチドに対するＳＲＭシグネチャピーク面積を、ホルマリン固定された生体試料からの同一のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解液中の異なるタンパク質由来の他のフラグメントペプチドからのＳＲＭシグネチャピーク面積と比較することによって、選択されたタンパク質の増加又は減少を決定する。
４．修飾が、リン酸化及び／又はグリコシル化を含むが、これらに限定されず、修飾されたペプチドの相対レベルが、非修飾のペプチドの相対量を決定するのと同一の方法で決定される場合、これらのアッセイを、タンパク質の非修飾のフラグメントペプチド及び修飾されたフラグメントペプチドの両方に適用することができる。
ｉｉ．所与のペプチドの絶対定量は、個々の生体試料中の選択されたタンパク質に由来する所与のフラグメントペプチドに対するＳＲＭシグネチャピーク面積を、その生体試料からのタンパク質溶解液にスパイクされた内部標準フラグメントペプチドのＳＲＭシグネチャピーク面積と比較することにより達成可能である。
１．内部標準は、試験されている選択されたタンパク質に由来するフラグメントペプチドの標識された合成バージョンである。この内部標準を試料に既知量でスパイクし、内部標準フラグメントペプチド及び生体試料中の天然のフラグメントペプチドの両方に対するＳＲＭシグネチャピーク面積を、別個に決定した後に、両方のピーク面積を比較する。
２．修飾がリン酸化及び／又はグリコシル化を含むが、これらに限定されず、修飾ペプチドの絶対レベルを、非修飾ペプチドの絶対レベルを決定するのと同一の方法で決定することができる場合、これを、タンパク質の非修飾のフラグメントペプチド及び修飾されたフラグメントペプチドに適用することができる。
３．癌診断及び処置に対するフラグメントペプチドの定量の適用
ａ．選択されたタンパク質のフラグメントペプチドレベルの相対定量及び／又は絶対定量を実施し、癌分野においてよく理解されているような、選択されたタンパク質の発現と患者の腫瘍組織における癌のステージ／グレード／ステータスとの以前に決定された関係が確認されることを実証する。
ｂ．選択されたタンパク質のフラグメントペプチドレベルの相対定量及び／又は絶対定量を実施し、異なる処置戦略による臨床転帰との相関を実証する。この場合、この相関は、患者のコホート及びこれらの患者からの組織にわたる相関研究を通じて、その分野で既に実証されている、あるいは、将来において実証することができる。以前に確立された相関又は将来において導き出される相関のいずれかが、このアッセイによって確認されると、次いで、このアッセイ法を使用して、最適な処置戦略を決定することができる。
【0049】
各選択されたタンパク質に由来する特定のフラグメントペプチドに関する特定かつ固有の特性を、イオントラップ及びトリプル四重極質量分析計の両方における全てのフラグメントペプチドの分析によって明らかにした。その情報は、ホルマリン固定された試料／組織からのＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解液において直接的に候補となるあらゆるＳＲＭペプチドにおいて実験的に決定される必要がある。なぜなら、興味深いことに、あらゆる選択されたタンパク質に由来する全てのペプチドを、本明細書に記載のＳＲＭを使用する溶解液において検出することができるとは限らないためであり、それは、検出されないフラグメントペプチドを、ホルマリン固定された試料／組織からのＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解液において直接的にペプチド／タンパク質を定量する際に使用するためのＳＲＭアッセイを開発するための候補ペプチドと見なすことはできないということを示す。
【0050】
特定のフラグメントペプチドに対する特定のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを、トリプル四重極質量分析計において実施する。特定のタンパク質のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイによって分析される実験的な試料は、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から調製されたＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅタンパク質溶解液である。そのようなアッセイからのデータは、ホルマリン固定された試料におけるこのフラグメントペプチドに固有のＳＲＭシグネチャピークの存在を示す。
【0051】
このペプチドに対する特異的な遷移イオンの特性を使用して、ホルマリン固定された生体試料中の特定のフラグメントペプチドを定量的に測定する。これらのデータは、分析されたタンパク質溶解液のマイクログラム当たりのペプチドのモル量の関数として、このフラグメントペプチドの絶対量を示す。ホルマリン固定された患者由来組織の分析に基づく、組織中の対応するタンパク質レベルの評価は、特定の患者のそれぞれに関する診断、予後、及び治療に関連する情報を提供することができる。一実施形態において、この開示によって、生体試料において表１に記載の各タンパク質のレベルを測定する方法であって、この方法は、生体試料から調製されたタンパク質消化物中の修飾された又は非修飾の１種又は２種以上のフラグメントペプチドを、質量分析を使用して検出及び／又は定量することを含み、その試料中の修飾された又は非修飾のタンパク質のレベルを算出し、そのレベルは相対レベル又は絶対レベルである、方法を記載する。関連する実施形態において、１種又は２種以上のフラグメントペプチドの定量は、既知量添加される内部標準ペプチドとの比較によって、生体試料中のフラグメントペプチドのそれぞれの量を決定することを含み、この場合、生体試料中のフラグメントペプチドのそれぞれは、同一のアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較される。いくつかの実施形態において、内部標準は、同位体標識された内部標準ペプチドであり、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈ又はそれらの組合せから選択される１種又は２種以上の重安定同位体を含む。
【0052】
本明細書に記載の生体試料中の選択されたタンパク質（又はそれらの代理となるフラグメントペプチド）のレベルを測定する方法を、患者又は対象の癌の診断上の指標として使用してもよい。一実施形態において、選択されたタンパク質レベルの測定結果を使用して、組織において見られる選択されたタンパク質レベルを、正常組織及び／又は癌組織又は前癌状態の組織で見られる選択されたタンパク質レベルと相関させる（例えば、比較する）ことによって、癌の診断上のステージ／グレード／ステータスを決定してもよい。
【0053】
核酸及びタンパク質の両方を、同一のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ生体分子調製物から分析することができるため、疾患の診断及び薬剤処置の決定に関するさらなる情報を、プロテオミクス解析に使用した同一試料の核酸から得ることができる。例えば、選択されたタンパク質がある細胞により高レベルで発現される場合、ＳＲＭによって分析した際、データは、細胞の状態と、制御できない増殖、潜在的な薬剤耐性及び癌の発生の可能性とに関する情報を提供することができる。同時に、対応する遺伝子並びに／又はそれらがコードする核酸及びタンパク質の状態（例えば、ｍＲＮＡ分子及びそれらの発現レベル又はスプライスバリエーション）に関する情報を、同一のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ生体分子調製物に存在する核酸から取得することができる。同一の生体分子調製物に存在する、選択されたタンパク質でない任意の遺伝子及び／又は核酸を、選択されたタンパク質のＳＲＭ分析と同時に評価することができる。一実施形態において、選択されたタンパク質及び／又は１種、２種、３種、４種又はより多くの追加のタンパク質に関する情報を、それらのタンパク質をコードする核酸を試験することによって評価してもよい。例えば、それらの核酸を、配列決定法、ポリメラーゼ連鎖反応法、制限断片多型解析、欠損もしくは挿入の同定、及び／又は一塩基対の多型、転移、塩基転換又はそれらの組合せを含むが、それらに限定されない変異の存在の判定のうち１種以上、２種以上、又は３種以上によって試験することができる。
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]
【外国語明細書】