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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】特開2020-129984(P2020-129984A)
(43)【公開日】2020年8月31日
(54)【発明の名称】酵素活性の測定方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/00 20060101AFI20200803BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20200803BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/00 Z
C12M1/34 B
C12M1/34 E
【審査請求】未請求
【請求項の数】14
【出願形態】ＯＬ
【全頁数】24
(21)【出願番号】特願2019-23880(P2019-23880)
(22)【出願日】2019年2月13日
(71)【出願人】
【識別番号】519050842
【氏名又は名称】インテグラムヘルスデザイン株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100106909
【弁理士】
【氏名又は名称】棚井 澄雄
(74)【代理人】
【識別番号】100149548
【弁理士】
【氏名又は名称】松沼 泰史
(74)【代理人】
【識別番号】100175824
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100171446
【弁理士】
【氏名又は名称】高田 尚幸
(72)【発明者】
【氏名】礒田 隆聡
(72)【発明者】
【氏名】吉田 雄貴
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029BB02
4B029BB16
4B029FA01
4B029FA13
4B029GA03
4B029GB01
4B029GB02
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ06
4B063QQ21
4B063QR58
(57)【要約】
【課題】マイクロプレートリーダーのない環境下でも、発色検査法によって、簡便にかつ目視よりも精度よく酵素活性を測定する方法、及び当該方法に用いるチップ等の提供。【解決手段】酵素活性を、発色反応を利用して測定する方法であって、底部が光透過性部材からなる平底のウェルを備えるマイクロウェルチップのウェル内で、発色性基質を担持した光透過性部材からなる多孔質膜と被検試料とを接触させ、又は、被検試料を担持した光透過性部材からなる多孔質膜と発色性基質とを接触させ、所定時間反応させた後、前記ウェルをその天面又は底面から撮影し、撮像された画像中の前記ウェル領域の色強度に基づいて、前記被検試料の酵素活性を測定する、酵素活性の測定方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
酵素活性を、発色反応を利用して測定する方法であって、
底部が光透過性部材からなる平底のウェルを備えるマイクロウェルチップのウェル内で、発色性基質を担持した光透過性部材からなる多孔質膜と被検試料とを接触させ、又は、被検試料を担持した光透過性部材からなる多孔質膜と発色性基質とを接触させ、所定時間反応させた後、
前記ウェルをその天面又は底面から撮影し、撮像された画像中の前記ウェル領域の色強度に基づいて、前記被検試料の酵素活性を測定する、
酵素活性の測定方法。
底部が光透過性部材からなる平底のウェルを備えるマイクロウェルチップのウェル内で、発色性基質を担持した光透過性部材からなる多孔質膜と被検試料とを接触させ、又は、被検試料を担持した光透過性部材からなる多孔質膜と発色性基質とを接触させ、所定時間反応させた後、
前記ウェルをその天面又は底面から撮影し、撮像された画像中の前記ウェル領域の色強度に基づいて、前記被検試料の酵素活性を測定する、
酵素活性の測定方法。
【請求項2】
前記多孔質膜がセルロース膜である、請求項１に記載の酵素活性の測定方法。
【請求項3】
前記画像がＲＧＢ画像であり、前記画像中の前記ウェル領域の色強度が、Ｒ成分、Ｇ成分、及びＢ成分のいずれかの色成分の強度値である、請求項１又は２に記載の酵素活性の測定方法。
【請求項4】
前記画像は、接写可能な撮像装置で撮影される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵素活性の測定方法。
【請求項5】
前記画像は、面発光型光源からの光を前記マイクロウェルチップの底面から照射した状態で、前記面発光型光源から放出される光以外の光が遮断された環境下で、前記マイクロウェルチップの天面側から、接写可能な撮像装置により撮像される、請求項４に記載の酵素活性の測定方法。
【請求項6】
被検試料中の微生物が産生する酵素の活性を、請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵素活性の測定方法により測定し、測定結果に基づいて、前記被検試料中の前記微生物を検出する、微生物の検出方法。
【請求項7】
前記微生物が、大腸菌又は大腸菌群である、請求項６に記載の微生物の検出方法。
【請求項8】
底部が光透過性部材からなる平底のウェルを備えるマイクロウェルチップと、
光透過性部材からなる多孔質膜と、
発色性基質と、
を備える、の酵素活性測定用キット。
光透過性部材からなる多孔質膜と、
発色性基質と、
を備える、の酵素活性測定用キット。
【請求項9】
さらに、撮影補助具を備え、
前記撮影補助具は、前記マイクロウェルチップをウェルの深さ方向に光透過可能な状態に設置するチップ設置部を備える、請求項８に記載の酵素活性測定用キット。
前記撮影補助具は、前記マイクロウェルチップをウェルの深さ方向に光透過可能な状態に設置するチップ設置部を備える、請求項８に記載の酵素活性測定用キット。
【請求項10】
前記撮影補助具が、光透過不能な箱体を備え、
前記箱体内に、前記チップ設置部と面発光型光源とが配置されており、
前記面発光型光源は、前記チップ設置部に設置されたマイクロウェルチップの深さ方向の一方側に、当該マイクロウェルチップに光照射可能な状態で配置されており、
前記箱体のうち、前記面発光型光源に前記深さ方向で対向する壁部には、前記箱体の内外を貫通する貫通孔が形成され、
前記壁部の外面は、撮像装置のレンズが、前記貫通孔を通して前記チップ設置部に設置されたマイクロウェルチップを撮像可能な状態で、前記撮像装置が設置される撮像装置設置部を構成している、
請求項９に記載の酵素活性測定用キット。
前記箱体内に、前記チップ設置部と面発光型光源とが配置されており、
前記面発光型光源は、前記チップ設置部に設置されたマイクロウェルチップの深さ方向の一方側に、当該マイクロウェルチップに光照射可能な状態で配置されており、
前記箱体のうち、前記面発光型光源に前記深さ方向で対向する壁部には、前記箱体の内外を貫通する貫通孔が形成され、
前記壁部の外面は、撮像装置のレンズが、前記貫通孔を通して前記チップ設置部に設置されたマイクロウェルチップを撮像可能な状態で、前記撮像装置が設置される撮像装置設置部を構成している、
請求項９に記載の酵素活性測定用キット。
【請求項11】
前記貫通孔に、拡大レンズが設置されている、請求項１０に記載の酵素活性測定用キット。
【請求項12】
前記撮像装置設置部は、前記箱体の前記面発光型光源に対向する壁部に、前記撮像装置が嵌め込み可能に構成されている、請求項１０又は１１に記載の酵素活性測定用キット。
【請求項13】
前記撮影補助具が、光透過不能な箱体を備え、
前記箱体の天面の壁部に、前記箱体の内外を貫通し、前記マイクロウェルチップを嵌め込むチップ設置部が配置されており、
前記箱体内に、前記チップ設置部に設置されたマイクロウェルチップを撮像可能な状態で撮像装置が設置される撮像装置設置部が配置されている、
請求項９に記載の酵素活性測定用キット。
前記箱体の天面の壁部に、前記箱体の内外を貫通し、前記マイクロウェルチップを嵌め込むチップ設置部が配置されており、
前記箱体内に、前記チップ設置部に設置されたマイクロウェルチップを撮像可能な状態で撮像装置が設置される撮像装置設置部が配置されている、
請求項９に記載の酵素活性測定用キット。
【請求項14】
前記チップ設置部が、前記マイクロウェルチップを嵌め込む保持枠と、前記保持枠を下方から支持する脚部と、を備え、
前記脚部には、撮像装置をチップの下方まで進入させる開口部が形成されている、
請求項９に記載の酵素活性測定用キット。
前記脚部には、撮像装置をチップの下方まで進入させる開口部が形成されている、
請求項９に記載の酵素活性測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、発色性基質を用いた発色検査法により微生物が産生する酵素の活性を測定する方法、及び当該方法に用いるチップ等に関する。
【背景技術】
【0002】
飲食品の安全のため、飲食品を製造する工場や製造された飲食品、水道設備等において、人体に対して有害な微生物の有無を検出する検査が行われている。特に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、糞便に多く存在しているため、食品衛生における糞便又は腸管系病原菌の汚染指標菌となっている。飲食品中から大腸菌が検出された場合には、当該飲食品の製造工程又は市場での流通工程において、非衛生的な取り扱いや腸管系病原菌による汚染の可能性が推測される。
【0003】
微生物を検出する方法としては、例えば、培養してコロニー数を計数する培養法、微生物ゲノム中の特定のＤＮＡ配列からなる領域を定量的に検出するリアルタイムＰＣＲ法、微生物の表面抗原に対する抗原抗体反応を利用したＥＬＩＳＡ法やイムノクロマト法等がある。しかし、培養法は培養に長時間を要するため検査に時間がかかる。リアルタイムＰＣＲ法では、目的の微生物を特異的かつ高感度に検出できるものの、試薬コストが高く、リアルタイムＰＣＲのための大型の装置が必要である。ＥＬＩＳＡ法は洗浄処理等の操作が煩雑であり、イムノクロマト法は比較的簡便であるが、感度と定量性に欠けるという問題がある。
【0004】
そこで、現在の大腸菌等の微生物汚染検査には、測定に要する時間が短く、かつ操作が簡便であることから、酵素基質培地を用いた発色検査法が主流である（特許文献１）。発色検査法は、微生物が産生する酵素により発色物質を産生する発色性基質を含有する培地で被検試料を培養し、培養物中の発色物質の量を比色定量する方法である。例えば大腸菌検査の場合、β−グルクロニダーゼによって加水分解されると発色物質を産生する発色性基質を含有する培地で被検試料を培養する。当該被検試料中に大腸菌が含まれている場合には、大腸菌が産生したβ−グルクロニダーゼによって発色物質が産生される。したがって、培養物中の発色物質の量を比色定量することにより、当該被検試料中に大腸菌が含まれていたかどうかを検査することができる。酵素反応は特異的であり、発色性基質を含有する培地で培養することにより、飲食品中の大腸菌の有無を、迅速かつ容易に知ることができる。
【0005】
また、自然界には、糞便由来の大腸菌以外にも多くの菌種が存在している。なかでも、大腸菌と同様に、グラム陰性の無芽胞桿菌であり、乳糖を分解して酸とガスを産生する好気性又は通性嫌気性の細菌の一群は、大腸菌群として一括されている。大腸菌群は共通してβ−ガラクトシダーゼを産生する。一方で、β−グルクロニダーゼは、腸内細菌の中で一部のサルモネラ、赤痢菌、エルシニアに認められるものの、原則として大腸菌のみが産生する。そこで、培地中にβ−グルクロニダーゼの発色性基質とβ−ガラクトシダーゼの発色性基質を含有させておくことにより、大腸菌群の有無と大腸菌の有無の両方を同時に検出することができる（特許文献２）。β−グルクロニダーゼの発色性基質としては、５−ブロモ−４−クロロ−３―インドリル−β−Ｄ−グルクロニドへキシル（Ｘ−Ｇｌｕｃ）が汎用されている。β−ガラクトシダーゼの発色性基質としては、５−ブロモ−４−クロロ−３―インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）が汎用されており、用途に合わせて様々な合成基質や添加物が工夫されている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特許第５６３９７９１号公報
【特許文献2】特許第４３３１５８２号公報
【特許文献3】特許第４４０９０６８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
発色検査法では一般的に、マイクロプレートリーダーを利用して反応液の発色強度を測定している。マイクロプレートリーダーにより各反応液の発色強度を精度よく定量的に測定できるものの、マイクロプレートリーダーの多くは持ち運びが難しい大きさである。このため、マイクロプレートリーダーが設置されていない環境では、目視による評価となり、精度に問題がある。
【0008】
本発明は、マイクロプレートリーダーのない環境下でも、発色検査法によって、簡便にかつ目視よりも精度よく酵素活性を測定する方法、及び当該方法に用いるチップ等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、マイクロウェルチップの各ウェルで発色反応を行った後、各ウェルの発色物質による発色の強度を、当該チップを撮影した画像の各ウェルの色強度に基づいて解析すること、これにより、マイクロプレートリーダーがなくとも発色検査法を実施できること、を見出した。さらに、当該マイクロウェルチップのウェル内に、発色用基質と被検試料のいずれか一方を多孔質膜に担持させておくことにより、より信頼性の高い検査結果が得られることを見出し、本発明を完成させた。
【0010】
すなわち、本発明は、以下の方法等を提供するものである。［１］ 酵素活性を、発色反応を利用して測定する方法であって、
底部が光透過性部材からなる平底のウェルを備えるマイクロウェルチップのウェル内で、発色性基質を担持した光透過性部材からなる多孔質膜と被検試料とを接触させ、又は、被検試料を担持した光透過性部材からなる多孔質膜と発色性基質とを接触させ、所定時間反応させた後、
前記ウェルをその天面又は底面から撮影し、撮像された画像中の前記ウェル領域の色強度に基づいて、前記被検試料の酵素活性を測定する、
酵素活性の測定方法。
［２］ 前記多孔質膜がセルロース膜である、前記［１］の酵素活性の測定方法。
［３］ 前記画像がＲＧＢ画像であり、前記画像中の前記ウェル領域の色強度が、Ｒ成分、Ｇ成分、及びＢ成分のいずれかの色成分の強度値である、前記［１］又は［２］の酵素活性の測定方法。
［４］ 前記画像は、接写可能な撮像装置で撮影される、前記［１］〜［３］のいずれかの酵素活性の測定方法。
［５］ 前記画像は、面発光型光源からの光を前記マイクロウェルチップの底面から照射した状態で、前記面発光型光源から放出される光以外の光が遮断された環境下で、前記マイクロウェルチップの天面側から、接写可能な撮像装置により撮像される、前記［４］の酵素活性の測定方法。
［６］ 被検試料中の微生物が産生する酵素の活性を、前記［１］〜［５］のいずれかの酵素活性の測定方法により測定し、測定結果に基づいて、前記被検試料中の前記微生物を検出する、微生物の検出方法。
［７］ 前記微生物が、大腸菌又は大腸菌群である、前記［６］の微生物の検出方法。
［８］ 底部が光透過性部材からなる平底のウェルを備えるマイクロウェルチップと、
光透過性部材からなる多孔質膜と、
発色性基質と、
を備える、の酵素活性測定用キット。
［９］ さらに、撮影補助具を備え、
前記撮影補助具は、前記マイクロウェルチップをウェルの深さ方向に光透過可能な状態に設置するチップ設置部を備える、前記［８］の酵素活性測定用キット。
［１０］ 前記撮影補助具が、光透過不能な箱体を備え、
前記箱体内に、前記チップ設置部と面発光型光源とが配置されており、
前記面発光型光源は、前記チップ設置部に設置されたマイクロウェルチップの深さ方向の一方側に、当該マイクロウェルチップに光照射可能な状態で配置されており、
前記箱体のうち、前記面発光型光源に前記深さ方向で対向する壁部には、前記箱体の内外を貫通する貫通孔が形成され、
前記壁部の外面は、撮像装置のレンズが、前記貫通孔を通して前記チップ設置部に設置されたマイクロウェルチップを撮像可能な状態に、前記撮像装置が設置される撮像装置設置部を構成している、
前記［９］の酵素活性測定用キット。
［１１］ 前記貫通孔に、拡大レンズが設置されている、前記［１０］の酵素活性測定用キット。
［１２］ 前記撮像装置設置部は、前記撮像装置設置部は、前記箱体の前記面発光型光源に対向する壁部に、前記撮像装置が嵌め込み可能に構成されている、前記［１０］又は［１１］の酵素活性測定用キット。
［１３］ 前記撮影補助具が、光透過不能な箱体を備え、
前記箱体の天面の壁部に、前記箱体の内外を貫通し、前記マイクロウェルチップを嵌め込むチップ設置部が配置されており、
前記箱体内に、前記チップ設置部に設置されたマイクロウェルチップを撮像可能な状態で撮像装置が設置される撮像装置設置部が配置されている、
前記［９］の酵素活性測定用キット。
［１４］ 前記チップ設置部が、前記マイクロウェルチップを嵌め込む保持枠と、前記保持枠を下方から支持する脚部と、を備え、
前記脚部には、撮像装置をチップの下方まで進入させる開口部が形成されている、前記［９］の酵素活性測定用キット。
【発明の効果】
【0011】
本発明に係る酵素活性の測定方法及びこれに用いるキットにより、マイクロプレートリーダーがなくとも、発色検査法によって酵素活性を簡便かつ精度よく測定することができる。また、当該方法等を利用することにより、大腸菌等の微生物を簡便かつ精度よく検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】本発明の第１の実施形態に係る撮影補助具１Ａの、単体の断面図（Ａ）及び使用時の断面図（Ｂ）である。
【図2】本発明の第１の実施形態の変形例である撮影補助具１Ｂの断面図である。
【図3】本発明の第１の実施形態の変形例である撮影補助具１Ｃの変形例の斜視図（Ａ）及び断面図（Ｂ）である。
【図4】本発明の第２の実施形態に係る撮影補助具１０Ａの使用時の斜視図である。
【図5】製造例１で用いたマイクロウェルチップの斜視図である。
【図6】製造例１で用いたマイクロウェルチップのウェル部分の断面図である。
【図7】実施例１において、ウェル内の反応液のβ−ガラクトシダーゼ濃度とマイクロウェルチップ画像中の当該ウェルのＲ値の関係を示した図である。
【図8】実施例３において、ウェル内の反応液のβ−グルクロニダーゼ濃度とマイクロウェルチップ画像中の当該ウェルの補正後のＲ値の関係を示した図である。
【図9】実施例４において、マイクロウェルチップを有機ＥＬパネルを備えた撮影補助具を用いてＡｕｔｏモードで撮影した場合の、ウェル内の反応液のβ−グルクロニダーゼ濃度とマイクロウェルチップ画像中の当該ウェルの補正後のＲ値の関係を示した図である。
【図10】実施例４において、マイクロウェルチップを有機ＥＬパネルを備えた撮影補助具を用いて曇りモードで撮影した場合の、ウェル内の反応液のβ−グルクロニダーゼ濃度とマイクロウェルチップ画像中の当該ウェルの補正後のＲ値の関係を示した図である。
【図11】実施例４において、マイクロウェルチップを白色ＬＥＤパネルを備えた撮影補助具を用いてＡｕｔｏモードで撮影した場合の、ウェル内の反応液のβ−グルクロニダーゼ濃度とマイクロウェルチップ画像中の当該ウェルの補正後のＲ値の関係を示した図である。
【図12】実施例４において、マイクロウェルチップを白色ＬＥＤパネルを備えた撮影補助具を用いて曇りモードで撮影した場合の、ウェル内の反応液のβ−グルクロニダーゼ濃度とマイクロウェルチップ画像中の当該ウェルの補正後のＲ値の関係を示した図である。
【図13】実施例５において、マイクロウェルチップを有機ＥＬパネル又は白色ＬＥＤパネルを備えた撮影補助具を用いて、Ａｕｔｏモード又は曇りモードで撮影した場合の、マイクロウェルチップ画像中の大腸菌試料を入れたウェル及びブランクウェルの補正後のＲ値の経時的変化を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【0013】
以下、本発明の実施の形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変形が可能である。
【0014】
＜酵素活性の測定方法＞本実施形態の酵素活性の測定方法は、測定対象の酵素に対する発色性基質を使用し、反応液の発色強度に基づいて当該酵素の活性を測定する方法であって、マイクロウェルチップのウェル内で発色反応を行った後、反応液の発色強度を、当該マイクロウェルチップを撮像した画像の画像解析により求めることを特徴とする。当該方法は、汎用されている小型の撮像装置と画像解析装置を利用できる点が大きな利点である。
【0015】
例えば従来は、被検試料の酵素活性を測定する場合には、マイクロプレートリーダーのような専用機器のある施設に送られ、当該施設内で発色検査が行われていた。これに対して、本実施形態の酵素活性の測定方法では、サンプリングした被検試料は直ちにその場で発色反応を行い、撮像装置で画像を取得することができる。取得された画像の解析は、発色反応を行った場に画像解析アプリケーションが格納されたパーソナルコンピュータ、又は外部の画像解析装置にネットワークを介して接続可能なパーソナルコンピュータがあれば、その場で画像解析を行い、検査結果を得ることもできる。
【0016】
本実施形態の酵素活性の測定方法において活性を測定する酵素は、特に限定されるものではないが、特定の種類の微生物に特有の酵素であって、当該微生物の検出に利用されるものが好ましい。本実施形態の酵素活性の測定方法は、従来の発色検査と同様に、微生物検出に有用である。なかでも、飲食品を製造する工場や製造された飲食品、水道設備等において、人体への安全性確保の点から検査が必要とされている微生物の検出に利用できる酵素であることが好ましい。当該微生物としては、例えば、大腸菌を含む大腸菌群、黄色ブドウ球菌、ウェルシュ菌、サルモネラ属菌、腸炎ビブリオ等が挙げられる。なかでも、従来の発色検査法が汎用されている大腸菌又は大腸菌群であることが好ましい。
【0017】
大腸菌の検出を目的とする場合、本実施形態の酵素活性の測定方法において活性を測定する酵素としては、例えば、β−グルクロニダーゼが挙げられる。大腸菌群の検出を目的とする場合、本実施形態の酵素活性の測定方法において活性を測定する酵素としては、例えば、β−ガラクトシダーゼが挙げられる。
【0018】
発色性基質としては、測定対象の酵素の基質に発色物質を結合したものであれば、特に限定されるものではなく、従来の発色検査法で使用されている発色性基質又はその改変体から適宜選択して用いることができる。例えば、β−グルクロニダーゼの酵素活性を測定する場合には、当該酵素による加水分解によって発色するＸ−Ｇｌｕｃ、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、５−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド、又はこれらの塩が挙げられる。また、大腸菌群を検出する場合には、β−ガラクトシダーゼによる加水分解によって発色するＸ−Ｇａｌ、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、又はこれらの塩が挙げられる。
【0019】
本実施形態の酵素活性の測定方法に供される被検試料は、活性を測定する目的の酵素を含む可能性のある試料であれば特に限定されるものではなく、液状であってもよく、固体であってもよい。本実施形態の酵素活性の測定方法としては、被検試料は、生物汚染が疑われる試料であることが好ましい。微生物汚染が疑われる被検試料としては、例えば、飲食品自体、飲食品等の製造工場や上水道設備の配管等のスメアや洗浄液などが挙げられる。
【0020】
被検試料は、発色反応に供される前に、反応用溶媒で希釈しておくことが好ましい。反応用溶媒としては、発色反応や発色性基質から産生される発色物質の発色に影響しない水系溶媒であれば特に限定されるものではなく、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等のリン酸バッファーや、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）等のトリスバッファーなどが挙げられる。
【0021】
本実施形態の酵素活性の測定方法において、マイクロウェルチップ中の個々のウェルが、発色反応の反応容器となる。当該ウェルの形状や大きさは特に限定されるものではなく、例えば、内径が５〜１５ｍｍ、深さ５〜２０ｍｍの円柱形とすることができる。また、マイクロウェルチップ１個当たり、複数のウェルを備えることが好ましく、チップ１個当たりのウェルの数は、４個以上が好ましく、４〜２５個がより好ましい。例えば、４０ｍｍ四方の大きさのマイクロウェルチップに、内径５ｍｍのウェルでは４〜２５個程度、６０ｍｍ四方の大きさのマイクロウェルチップに、内径１５ｍｍのウェルでは４〜９個程度、設けることができる。
【0022】
本実施形態の酵素活性の測定方法においては、発色性基質と被検試料のいずれか一方を、予め多孔質膜に担持させておく。発色性基質又は被検試料を担持させた多孔質膜は、マイクロウェルチップのウェル内のうち、平底に平行に置かれることが好ましく、ウェルの内底面に接するように置かれることが好ましい。これにより、発色性基質と被検試料を反応用溶媒に添加した反応溶液中で発色反応を行った場合よりも、再現性が高く信頼性の高い測定結果が得られる。この理由は明らかではないが、多孔質膜に照射された光は膜内部で乱反射し、均一な強度となって透過するため、複数のウェルの光強度を一定にする効果があるためと推察される。そのため、面発光型光源の光強度のムラに起因する測定値のばらつきを低減できる。
【0023】
多孔質膜への発色性基質の担持は、例えば、発色性基質を溶解させた溶液を多孔質膜に吸収させた後、溶媒を除去することにより行うことができる。溶媒の除去は、例えば、加熱乾燥処理により行うことができる。加熱乾燥処理における加熱温度は、発色性基質を損なわず、かつ溶媒を蒸発させることが可能な温度で行う。
【0024】
被検試料を担持させる多孔質膜としては、その膜細孔の孔径が、被検試料中に含まれている酵素や微生物を捕捉可能な程度の大きさのものを用いる。具体的には、細孔の孔径が０．１〜１０μｍ程度のいわゆるミクロフィルター（ＭＦ）膜を用いることが好ましい。当該多孔質膜としては、具体的には、セルロース膜、ニトロセルロース膜、酢酸セルロース膜、ポリエーテルスルホン酸膜、ポリアクリロニトリル膜、ポリプロピレン膜、ポリスルホン膜、ポリエチレン膜等のＭＦ膜を用いることができる。
【0025】
多孔質膜への被検試料の担持は、例えば、ＰＢＳ等の溶媒で希釈した被検試料を、多孔質膜で濾過するメンブレンフィルター法により行うことができる。濾過処理により、被検試料中の液性成分と希釈に用いた溶媒は多孔質膜を透過し、酵素や微生物は多孔質膜の細孔に捕捉される。濾過処理は、自然濾過であってもよく、加圧濾過であってもよく、減圧濾過であってもよい。
【0026】
本実施形態の酵素活性の測定方法においては、発色反応後のウェルを撮像するため、底部が光透過性部材からなる平底のウェルを備えるマイクロウェルチップのウェル内で発色反応を行う。ウェルの底部を構成する光透過性部材は、当該マイクロウェルチップを撮像した画像において、ウェル領域の輝度が、当該ウェル内の反応液の着色変化が解析できる程度であればよく、使用する撮像装置、光源の照度、ウェルの底部におく多孔質膜の種類等を考慮して適宜選択される。すなわち、底部の部材は、遮光性部材でなければよく、当該ウェルの底部に何も担持していない多孔質膜を置いた状態で撮像装置により撮像した場合に、撮像された画像中のウェル部分の輝度値が６０〜２００となるものであれば、特に限定されるものではない。例えば、無色透明なガラス板や樹脂板であってもよく、半透明や白色不透明な樹脂薄膜であってもよい。底部が半透明又は不透明なウェルの場合には、底部が無色透明なウェルの場合よりも、光源からの照度を強くすることにより、画像解析に十分な輝度を確保することができる。
【0027】
同様に、発色性基質又は被検試料を担持させる多孔質膜も、光透過性部材からなる。当該多孔質膜を構成する光透過性部材は、ウェルの底部に何も担持していない多孔質膜を置いた状態で当該マイクロウェルチップを撮像した画像において、ウェル領域の輝度が、当該ウェル内の反応液の着色変化が解析できる程度、具体的には輝度値が６０〜２００となるものであればよく、使用する撮像装置、光源の照度、ウェルの底部の光透過度等を考慮して適宜選択される。充分な光透過性があり、かつ発色性基質又は被検試料中の微生物の保持性も良好であることから、本実施形態の酵素活性の測定方法において用いられる多孔質膜としては、セルロース膜が好ましく、白色濾紙がより好ましい。
【0028】
発色反応は、マイクロウェルチップのウェル内で、発色性基質を担持した多孔質膜と被検試料とを接触させ、又は、被検試料を担持した多孔質膜と発色性基質とを接触させ、所定時間反応させることにより行う。具体的には、発色性基質を担持した多孔質膜が内底部に置かれたウェルに、反応用溶媒で希釈した被検試料を注入する、又は、被検試料を担持した多孔質膜が内底部に置かれたウェルに、発色性基質を反応用溶媒に溶解させた溶液を注入することにより行う。発色反応は、発色性基質を担持した多孔質膜と被検試料を担持した多孔質膜を重ねて内底部に置かれたウェルに、反応用溶媒を注入してもよい。ウェルに注入する溶液は、内底部の多孔質膜を完全に浸漬させるために必要十分な量であることが好ましい。
【0029】
発色反応の反応時間は、５分間〜３６時間が好ましく、１０分間〜２４時間がより好ましい。また、発色反応は、恒温装置内で行ってもよく、温度制御をしていない環境下（例えば、室温）で行ってもよい。恒温装置内で行う場合、反応温度は、２０〜４２℃が好ましく、２８〜３７℃がより好ましい。
【0030】
発色反応の終了後、反応溶液の発色強度を、マイクロウェルチップのウェルをその天面又は底面から撮影し、撮像された画像を画像解析することにより測定する。発色反応により産生された発色物質の量依存的に、撮像された画像中のウェル領域の色強度は強くなる。つまり、撮像された画像中の発色反応を行ったウェル領域の色強度に基づいて、当該被検試料の酵素活性を測定することができ、ひいては当該被検試料に含まれている微生物を検出することができる。
【0031】
マイクロウェルチップのウェルの撮影は、ＣＣＤ（Charge-Coupled Device）やＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）などの撮像素子を備えたカメラのような汎用されている撮像装置によって行うことができる。ウェルの画像解析の再現安定性の点から、各ウェルは、撮影倍率が比較的高い方が好ましい。このため、ウェルの撮影は、接写可能な撮像装置で行われることが好ましく、接写可能な撮像装置のカメラにさらに拡大レンズを設置してもよい。拡大レンズを設置することにより、より近接でも撮影が可能となる。また、光強度に合わせて、撮影モードを適宜調節することができる。
【0032】
マイクロウェルチップのウェルは、チップの深さ方向のうち、天面側から撮影してもよく、底面側から撮影してもよい。自然光を利用して撮影する場合、マイクロウェルチップの天面から自然光が入射する状態で、当該マイクロウェルチップの底面側から撮像される。ここで、自然光には、太陽光等の自然に由来する光のみならず、室内光のような撮影のために設けた光源以外の人工光源の光も含まれる。また、マイクロウェルチップのウェルは、チップの深さ方向のうちの一方側に光源を設置し、他方側から撮像することもできる。当該光源としては、チップ中のそれぞれのウェルに等量の光が照射されるように、面発光型光源であることが好ましい。面発光型光源としては、例えば、ＬＥＤ（Light Emitting Diode）パネルや有機ＥＬ（Electro Luminescence）パネル等が挙げられる。
【0033】
撮像された画像中のウェル領域の色強度は、撮像時の光照射条件によって影響を受ける。このため、方法の再現安定性の点から、各ウェルへの光照射条件は一定であることが好ましい。例えば、ウェルの天面側又は底面側から入射する光の照射条件を一定とし、かつウェルの天面側及び底面側以外の方向から入射する光を遮断することにより、各ウェルへの光照射条件を揃えることができる。中でも、面発光型光源からの光をマイクロウェルチップの底面から照射した状態で、当該面発光型光源から放出される光以外の光が遮断された環境下で、当該マイクロウェルチップの天面側から、接写可能な撮像装置により撮像することが好ましい。マイクロウェルチップは、面発光型光源に直接載せ置くか、近接して置くことが好ましい。
【0034】
ウェル領域の色強度は、撮像された画像がＲＧＢ画像の場合には、当該画像中のウェル領域の色強度が、Ｒ成分、Ｇ成分、及びＢ成分のいずれかの色成分の強度値として測定できる。いずれの色成分とするかは、発色反応により産生される発色物質の色に基づいて決定してもよい。例えば、発色物質が黄色のｏ−ニトロフェノールの場合には、Ｒ成分の強度値に基づいて、ウェル領域の色強度を決定することができる。また、発色物質が青色のブロモクロロインジゴの場合には、ウェル領域の色強度の決定を、Ｂ成分の強度値に基づいて行ってもよく、画像の色相を増大させた後に階調を反転させた補正画像のＲ成分の強度値に基づいて行ってもよい。画像中のウェル領域の色強度の解析は、イメージセンシング２０１９（アーズ社製）、Adobe（登録商標） Photoshop（Adobe Systems社製）、ImageJ (Image Processing and Analysis in Java)などの汎用されている画像解析ソフトウェアを用いて常法により行うことができる。
【0035】
ウェル領域の色強度は、当該ウェル内で行われた発色反応により産生された発色物質の量に依存し、反応溶液内の酵素量に依存する。そして、反応に供した被検試料に含まれている微生物の量が多いほど、反応溶液内の酵素量が多くなり、ウェル領域の色強度が強くなる。このため、反応溶液内の酵素量（unit/mL）とウェル領域の色強度との関係を示す検量線に基づいて、当該ウェル領域の色強度値から被検試料に含まれている酵素活性の強度を測定することができ、ひいては被検試料に含まれている微生物の量を定量することができる。当該検量線は、予め作成されていたものを用いてもよく、検量線作成のための発色反応を、被検試料を添加した発色反応を行うウェルと同じチップ中の別のウェルにて同時に行ってもよい。検量線は、濃度既知の精製酵素を用いて、発色反応やその後の撮像及び画像解析を被検試料と同じ条件で行い、作製することができる。
【0036】
被検試料に所定の量の目的の微生物が存在しているか否かを検出する場合には、当該所定量の目的の微生物を含む反応溶液の色強度値を予め設定し、この設定された色強度値を閾値として設定する。被検試料を添加したウェルの色強度値が、当該閾値以上の場合には、当該被検試料には当該所定の量の目的の微生物が存在していると判定し、当該閾値未満の場合には、当該被検試料には所定の量の目的の微生物は存在していない、と判定する。
【0037】
また、被検試料間のばらつきや、チップにおけるウェルの位置によるばらつきを解消するために、被検試料の測定は、サンプル数（ｎ）を２以上で行うことが好ましい。被検試料のウェル領域の色強度値は、全てのサンプルの平均値とすることができる。
【0038】
撮像されたマイクロウェルチップの画像の画像解析は、画像解析部及び結果表示部を備える情報処理装置を用いて行うことができる。当該情報処理装置としては、例えば、画像解析ソフトウェアが搭載された表示部を備えるパーソナルコンピュータが挙げられる。
【0039】
画像解析部は、画像解析ソフトウェアを使用して撮像された画像データを解析する装置である。当該画像解析部において、撮像された画像中のウェル領域のＲ成分、Ｇ成分、及びＢ成分のいずれかの色成分の強度値を測定する。画像解析部においては、さらに、得られた色成分の強度値に基づいて、被検試料の酵素活性の強さを測定することができ、目的の微生物が検出されたか否かを決定することもできる。
【0040】
結果表示部は、画像解析部において得られた結果を表示する表示装置である。当該表示装置としては、液晶ディスプレイ、有機ＥＬディスプレイ等の汎用されている表示装置を使用することができる。
【0041】
マイクロウェルチップを撮影する撮像装置は、画像解析部及び結果表示部を備えていてもよい。マイクロウェルチップの撮影を、画像解析部及び結果表示部を備える撮像装置を用いて行うことにより、撮影後に速やかに画像解析を行い、被検試料に含まれている測定対象の酵素の活性を評価することができる。画像解析部及び結果表示部を備える撮像装置としては、例えば、カメラ機能と画像解析ソフトウェアが搭載された表示部を備えるパーソナルコンピュータが挙げられる。
【0042】
また、マイクロウェルチップを撮影する撮像装置は、通信部及び結果表示部を備えるものであってもよい。通信部及び結果表示部を備える撮像装置としては、例えば、カメラ機能が搭載されたスマートフォンやタブレットコンピュータ等が挙げられる。
【0043】
当該撮像装置により撮像された画像は、通信インタフェースからなる通信部からネットワークを介して外部の画像解析装置へ送信される。この外部の画像解析装置において、マイクロウェルチップの画像中のウェル領域のＲ成分、Ｇ成分、及びＢ成分のいずれかの色成分の強度値を測定し、得られた色成分の強度値に基づいて、被検試料の酵素活性を測定することができ、さらに当該被検試料から目的の微生物が検出されたか否かも決定できる。得られた結果は、当該画像解析装置から撮像装置の通信部へ送信され、送信された結果が、結果表示部に表示される。
【0044】
＜撮影補助具＞前記酵素活性の測定方法において、前記マイクロウェルチップを接写可能な撮像装置で撮影する際には、マイクロウェルチップをウェルの深さ方向に光透過可能な状態に設置するチップ設置部を備える撮影補助具を用いることができる。このような撮影補助具を用いることにより、撮像条件を一定にし、測定間誤差を小さくすることができる。
【0045】
図１（Ａ）に、第１の実施形態に係る撮影補助具１Ａを図示する。図１（Ｂ）は、撮影補助具１Ａにマイクロウェルチップ３と撮像装置２を設置した、撮影時の態様の断面図である。図１に示す撮影補助具１Ａは、光透過不能な箱体５ａの内部に、マイクロウェルチップ３と面発光型光源６ａを配置し、当該面発光型光源の光のみを利用して撮像装置２で撮像する。外部からの光を排除した箱体５ａ内で撮影するため、撮影時のマイクロウェルチップへの光照射条件が制御でき、より測定間のばらつきが小さく、信頼性の高い検出結果が得られる。
【0046】
面発光型光源６ａは、チップ設置部４に設置されたマイクロウェルチップ３の深さ方向の一方側に、当該マイクロウェルチップに光照射可能な状態で配置される。図１に示すように、面発光型光源６ａは、マイクロウェルチップ３の底面側に配置することが好ましく、面発光型光源６ａの発光面とマイクロウェルチップ３の底面とが接するように配置することがより好ましい。発光型光源６ａの発光面にマイクロウェルチップ３を載せ置いた場合、面発光型光源６ａの発光面がチップ設置部４として機能する。面発光型光源６ａの発光面の特定の位置にマイクロウェルチップ３を設置するように、当該発光面上に別途、マイクロウェルチップを嵌め込む枠や固定爪からなるチップ設置部４を設けてもよい。
【0047】
箱体５のうち、マイクロウェルチップ３の深さ方向に対して面発光型光源６に対向する壁部には、箱体５の内外を貫通する貫通孔７が形成されている。撮像装置２のレンズは、貫通孔７を通して箱体５の内部を望む。つまり、貫通孔７とチップ設置部４は、撮像装置２のレンズが、貫通孔７を通してチップ設置部４に設置されたマイクロウェルチップ３を撮像可能な状態となる位置に設けられる。また、貫通孔７には、拡大レンズ９を設けてもよい。箱体５の貫通孔７が形成された壁部の外面は、撮像装置２のレンズが貫通孔７を通して箱体５の内部を撮像可能なように撮像装置２が設置される撮像装置設置部８ａを構成している。
【0048】
第１の実施形態に係る撮影補助具１においては、マイクロウェルチップ３に照射される光が面発光型光源６からの光のみであればよく、面発光型光源６はその一部が箱体５の内部にあればよく、必ずしも全体が箱体５の内部に存在していなくてもよい。例えば、図２に示す撮影補助具１Ｂのように、面発光型光源６ｂに、底面のない箱体５ｂを被せてもよい。
【0049】
撮像装置設置部８は、撮像装置２を設置した状態で、外部の光が貫通孔７を透過して箱体５の内部に照射されないように、撮像装置２が貫通孔７を塞ぐように設置できる形状であれば特に限定されるものではない。一例として、撮影補助具１Ｃの斜視図を図３（Ａ）に、断面図を図３（Ｂ）に示す。撮影補助具１Ｃにおいては、撮像装置設置部８ｃは、箱体５ｃの面発光型光源６ｃに対向する壁部に、撮像装置２が嵌め込み可能に凹部として構成されている。
【0050】
図４に、第２の実施形態に係る撮影補助具１０Ａを図示する。撮影補助具１０Ａは、チップ設置部１１が、マイクロウェルチップ３を嵌め込む保持枠１１ａと、保持枠１１ａを下方から支持する脚部１１ｂと、を備える。脚部１１ｂには、撮像装置２のレンズが保持枠１１ａに嵌め込まれたマイクロウェルチップ３を撮像可能なように、撮像装置２をマイクロウェルチップ３の下方まで進入させる開口部が形成されている。脚部１１ｂは、保持枠１１ａに保持されたマイクロウェルチップ３が、撮像装置２のカメラレンズに対して平行になるように支えることができる部材であればよい。図４に示す４本の柱状部材以外にも、３本の柱状部材であってもよく、板状部材であってもよい。
【0051】
マイクロウェルチップ３を保持枠１１ａに嵌め込まれた撮影補助具１０Ａを、撮像装置２のレンズに被せた状態で、マイクロウェルチップ３の天面から入射する自然光を利用してマイクロウェルチップ３のウェルを撮影する。マイクロウェルチップ３の天面からの入射光は、天面側に設置した人工光源から照射される光であってもよい。
【0052】
撮影補助具１の箱体５の高さ、及び撮影補助具１０の脚部１１ｂの高さは、撮像装置２がマイクロウェルチップ３を撮影する撮影距離を決定する。撮像装置２が接写可能な撮像装置の場合、箱体５及び脚部１１ｂの高さは、３〜１０ｃｍが好ましく、３〜６ｃｍがより好ましい。
【0053】
＜キット＞本実施形態の酵素活性の測定方法は、これに使用する被検試料以外の部材や試薬をキット化することにより、当該方法をより簡便に実施することができる。例えば、底部が光透過性部材からなる平底のウェルを備えるマイクロウェルチップと、光透過性部材からなる多孔質膜と、発色性基質とを、酵素活性測定用キットとしてキット化することができる。当該キットには、前記の撮影補助具を備えてもよい。その他、さらに、反応用溶媒や、被検試料を多孔質膜に担持させる際の濾過処理に使用される加圧濾過装置や吸引濾過装置等を備えていてもよい。
【実施例】
【0054】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0055】
なお、以降の実験において、使用したマイクロウェルチップの各ウェルは、行番号と列番号で特定した。具体的には、左からＸ行目の上からＹ番目のウェルをウェルＸＹ（ＸとＹは自然数）と表記した。
【0056】
［製造例１］マイクロウェルチップを作製し、ウェルの底部及び多孔質膜の光透過性を調べた。
まず、５０ｍｍ四方の厚み３ｍｍのアクリル板を加工して、直径１３ｍｍの貫通孔を２ｍｍ間隔で３列×３行の合計９個形成した基板を作製した。この基板の底面に、貫通孔を塞ぐようにポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）テープ（製品名：チューコーフローテープ、中興化成工業社製、厚み：８０μｍ）をはって固定した。この基板をマイクロウェルチップとし、一方の開口部をＰＴＦＥテープで塞いだ貫通孔がウェルとし、ＰＴＦＥテープがウェルの底部とした。作製されたマイクロウェルチップの上面図を図５に示す。
【0057】
作製したマイクロウェルチップの底部及びウェル内に入れる多孔質膜の光透過性を調べた。多孔質膜としては、セルロースシート（製品名：定量濾紙Ｎｏ.５Ａ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製、厚み２２０μｍ／細孔７μｍ）と、メンブランフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製、厚み３５μｍ／細孔１μｍ）を用いた。これらの多孔質膜を、ウェル（貫通孔）と同じ大きさに打ち抜き、ウェル内の底面に設置した。多孔質膜を内底面に敷いたウェルの断面図を図６に示す。
【0058】
マイクロウェルチップのウェルのうち、１つは底部となるＰＴＦＥテープを外し、１つは多孔質膜なしとし、１つは１枚のセルロースシートを底部に敷き、１つは１枚のセルロースシートと１枚のメンブランフィルターを重ねて底部に敷いた。次いで、このマイクロウェルチップを、図１に示す撮影補助具（ただし、箱体の高さ：７ｃｍ、面発光型光源：有機ＥＬパネル、拡大レンズなし）の有機ＥＬパネルに載せ置き、カメラ搭載の市販のスマートフォン（幅約７ｃｍ、長さ約１３ｃｍ）を用いて撮影した。スマートフォンのカメラレンズとマイクロウェルチップの間の撮影距離は約５ｃｍであった。
【0059】
撮像した画像中のウェル領域の輝度を、市販の画像解析ソフトウェア（製品名： Photoshop、Adobe Systems社製）を用いて測定した。測定結果を表１に示す。
【0060】
【表1】
【0061】
画像の輝度は一般的に、０（暗）〜２５６（明）の範囲内で相対値として表示される。即ち、測定環境が同じ条件下であれば、ウェルが光透過性の低い材料で充填される程、撮像した画像中のウェル領域の輝度は０へ減少する。一方、光透過性の高い材料で充填される程、輝度は２５６へ増加していく。ウェルの底部及び多孔質膜の光透過性は、ウェル領域の輝度値で相対的に評価した。ウェル領域の輝度値が小さ過ぎる画像や白過ぎる画像では、ウェル領域の着色変化の解析が困難となる。ＰＴＦＥテープを底部とし、多孔質膜としてセルロースシートとメンブランフィルターを使用したウェルは、撮像した画像の輝度値が６０〜２００であり、発色反応を行った場合に反応液の着色変化を画像解析で検出できることが確認された。
【0062】
［実施例１］５０ｍｍ四方のアクリル板に代えて４０ｍｍ四方のアクリル板を用い、ウェルとする貫通孔の内径を１３ｍｍから１０ｍｍとし、ＰＴＦＥテープで形成したウェルの内底部にウェルの内径と同じ大きさのセルロースシートを１枚置いた以外は製造例１と同様にして、３行×３列のウェルが形成されたマイクロウェルチップを作製した。このマイクロウェルチップを用いて、β−ガラクトシダーゼの酵素活性を測定した。β−ガラクトシダーゼは、ｐＨ７．３、３７℃で１分間に１μｍｏｌのｏ−ニトロフェノールを生成する酵素量を１ｕｎｉｔとする精製酵素を用いた。
【0063】
１．０×１０−２ＭのＯＮＰＧ溶液（ＯＮＰＧを１．０×１０−２Ｍとなるように、ｐＨ７．０〜７．５のＰＢＳに溶解させた溶液）を、１ウェル当たり５０μＬずつウェル内のセルロースシートに滴下し、７０℃で加熱して水分を蒸散させて、ＯＮＰＧを当該セルロースシートに担持させた。次いで、β−ガラクトシダーゼ溶液（所定の濃度となるようにβ−ガラクトシダーゼをＰＢＳに溶解させた溶液）を、１ウェル当たり２００μＬずつ注入した。ウェル１１及びウェル１２には１ｕｎｉｔ／ｍＬのβ−ガラクトシダーゼ溶液を、ウェル１３及びウェル２１には０．５ｕｎｉｔ／ｍＬのβ−ガラクトシダーゼ溶液を、ウェル２２及びウェル２３には０．１ｕｎｉｔ／ｍＬのβ−ガラクトシダーゼ溶液を、ウェル３１及びウェル３２には０．０１ｕｎｉｔ／ｍＬのβ−ガラクトシダーゼ溶液を、ウェル３３にはブランクとして等量のＰＢＳを、それぞれ注入した。β−ガラクトシダーゼ溶液注入後、室温で１０分間反応させた。反応終了後、当該マイクロウェルチップを、製造例１で使用した撮影補助具を用いて製造例１と同じ撮影条件で撮影した。
【0064】
撮像した画像を、画像解析ソフトウェア（製品名：イメージングセンシング２０１９、アーズ社製）を用いて解析し、それぞれのウェル領域のＲ成分の強度値（Ｒ値）を測定した。測定結果を表２に示す。
【0065】
【表2】
【0066】
表２の測定結果について、β−ガラクトシダーゼ濃度とＲ値の関係を図７に示す。図７（Ａ）は表２中のセットＡのサンプルの結果を、図７（Ｂ）は表２中のセットＢのサンプルの結果を、図７（Ｃ）は表２中のセットＡとセットＢのサンプルの平均の結果を、それぞれ示す。図７に示すように、セットＡとセットＢ（いずれもｎ＝１）のβ−ガラクトシダーゼ濃度とＲ値は、寄与率ｒ２が０．９５以上と高い相関があった。当該結果から、本実験で撮像した画像中のウェル領域のＲ値は、ｎ＝１であっても、ウェル中のβ−ガラクトシダーゼ濃度と高い相関があり、Ｒ値に基づいてβ−ガラクトシダーゼ濃度を測定できることが確認された。また、セットＡとセットＢにおいて、β−ガラクトシダーゼ濃度が同じウェル同士はＲ値も同程度であり、ウェルのチップ中の位置の影響もあまりないことも確認された。さらに、セットＡとセットＢの平均値（ｎ＝２）は、ｒ２がほぼ１であり、ｎ＝１のセットＡ及びセットＢよりも寄与率が大きかったことから、ｎ数が大きいほど相関も高くなることが確認された。
【0067】
［比較例１］実施例１で作製したマイクロウェルチップと同様にして作製されたマイクロウェルチップを用いて、実施例１で使用したβ−ガラクトシダーゼの酵素活性を測定した。具体的には、ウェルにセルロースシートをひかず、ＯＮＰＧをウェルの内底面に直接滴下し、水分を蒸散させてＯＮＰＧを内底面に直接固定した以外は、実施例１と同様にして発色反応を行い、反応終了後、当該マイクロウェルチップを、実施例１で使用した撮影補助具を用いて実施例１と同じ撮影条件で撮影した。撮像した画像を実施例１と同様にして解析し、それぞれのウェル領域のＲ成分の強度値（Ｒ値）を測定した。測定結果を表３に示す。
【0068】
【表3】
【0069】
表３の測定結果について、β−ガラクトシダーゼ濃度（ｙ）とＲ値（ｘ）の関係を調べたところ、回帰直線と寄与率は表４に示す通りとなった。このように、多孔質膜を使用せず、ウェル底面に直接発光性基質を固定した条件では、画像解析により得られるＲ値と発光反応の反応液中の酵素活性との相関性が低く、当該方法では酵素活性を精度よく測定することは困難であった。
【0070】
【表4】
【0071】
［比較例２］実施例１で作製したマイクロウェルチップと同様にして作製されたマイクロウェルチップを用いて、実施例１で使用したβ−ガラクトシダーゼの酵素活性を測定した。具体的には、ウェルにセルロースシートをひかず、ＯＮＰＧをウェルの内底面に直接滴下し、加熱蒸散させずにβ−ガラクトシダーゼ溶液を注入した以外は、実施例１と同様にして発色反応を行い、反応終了後、当該マイクロウェルチップを、実施例１で使用した撮影補助具を用いて実施例１と同じ撮影条件で撮影した。撮像した画像を実施例１と同様にして解析し、それぞれのウェル領域のＲ成分の強度値（Ｒ値）を測定した。測定結果を表５に示す。
【0072】
【表5】
【0073】
表５の測定結果について、β−ガラクトシダーゼ濃度（ｙ）とＲ値（ｘ）の関係を調べたところ、回帰直線と寄与率は表６に示す通りとなった。このように、多孔質膜を使用せず、発光性基質を固定せず、溶液中で発光性基質と酵素を接触させた条件では、画像解析により得られるＲ値と発光反応の反応液中の酵素活性との相関性が低く、当該方法では酵素活性を精度よく測定することは困難であった。
【0074】
【表6】
【0075】
［実施例２］実施例１で作製したマイクロウェルチップと同様にして作製されたマイクロウェルチップを用いて、実施例１で使用したβ−ガラクトシダーゼの酵素活性を測定した。具体的には、マイクロウェルチップの撮像時に、図４に示す撮影補助具（ただし、脚部の高さ：４ｃｍ、光源：チップ上方からの自然光）を用い、かつスマートフォンのカメラレンズに拡大レンズを装着した以外は実施例１と同様にして、発色反応を行い、反応終了後、当該マイクロウェルチップを実施例１と同じ撮影条件で撮影した。拡大レンズとマイクロウェルチップの間の撮影距離は約２ｃｍであった。撮像した画像を実施例１と同様にして解析し、それぞれのウェル領域のＲ成分の強度値（Ｒ値）を測定した。測定結果を表７に示す。
【0076】
【表7】
【0077】
表７の測定結果について、β−ガラクトシダーゼ濃度（ｙ）とＲ値（ｘ）の関係を調べたところ、回帰直線と寄与率は表８に示す通りとなった。セットＡはｒ２が０．８未満であったが、セットＢは０．９弱であり、かつセットＡとセットＢの平均値（ｎ＝２）もｒ２が０．９弱と高く、ウェル中のβ−ガラクトシダーゼ濃度と高い相関があった。これらの結果から、マイクロウェルチップの上面からの自然光の照射環境下で撮像された画像に基づいても、Ｒ値に基づいてβ−ガラクトシダーゼ濃度を測定できることが確認された。
【0078】
【表8】
【0079】
［実施例３］実施例１で作製したマイクロウェルチップと同様にして作製されたマイクロウェルチップを用いて、β−グルクロニダーゼの酵素活性を測定した。β−グルクロニダーゼは、ｐＨ５．０、３７℃で６０分間に１μｇのフェノールフタレインを生成する酵素量を１ｕｎｉｔとする精製酵素を用いた。
【0080】
１．０×１０−４ＭのＸ−Ｇｌｕｃ溶液（Ｘ−Ｇｌｕｃを１．０×１０−４Ｍとなるように、ｐＨ７．０〜７．５のＰＢＳに溶解させた溶液）を、１ウェル当たり２００μＬずつウェル内のセルロースシートに滴下し、７０℃で加熱して水分を蒸散させて、Ｘ−Ｇｌｕｃを当該セルロースシートに担持させた。次いで、β−グルクロニダーゼ溶液（所定の濃度となるようにβ−グルクロニダーゼをＰＢＳに溶解させた溶液）を、１ウェル当たり２００μＬずつ注入した。ウェル１１及びウェル２２には１０００ｕｎｉｔ／ｍＬのβ−グルクロニダーゼ溶液を、ウェル１２及びウェル３１には７５０ｕｎｉｔ／ｍＬのβ−グルクロニダーゼ溶液を、ウェル１３及びウェル２３には５００ｕｎｉｔ／ｍＬのβ−グルクロニダーゼ溶液を、ウェル２１及びウェル３２には１００ｕｎｉｔ／ｍＬのβ−グルクロニダーゼ溶液を、ウェル３３にはブランクとして等量のＰＢＳを、それぞれ注入した。β−グルクロニダーゼ溶液注入後、３７℃で６０分間反応させた。反応開始から１５分後、３０分後、及び６０分後に、当該マイクロウェルチップを、製造例１で使用した撮影補助具を用いて製造例１と同じ撮影条件で撮影した。
【0081】
撮像した画像を、画像解析ソフトウェア（製品名：イメージングセンシング２０１９、アーズ社製）を用いて、色相を増大させた後に階調反転を行い、画像を補正した。補正後の画像を解析してそれぞれのウェル領域のＲ成分の強度値（Ｒ値）を測定した。測定結果を表９に示す。
【0082】
【表9】
【0083】
表９の測定結果について、β−グルクロニダーゼ濃度と補正後の画像のＲ値の関係を図８に示す。図８（Ａ）は反応開始から１５分後のサンプルの結果を、図８（Ｂ）は３０分後のサンプルの結果を、図８（Ｃ）は６０分後のサンプルの平均の結果を、それぞれ示す。図８に示すように、反応開始から１５〜６０分後のいずれにおいても、撮像した画像中のウェル領域のＲ値は、ウェル中のβ−グルクロニダーゼ濃度と高い相関があり、Ｒ値に基づいてβ−グルクロニダーゼ濃度を測定できることが確認された。
【0084】
［実施例４］実施例１で作製したマイクロウェルチップと同様にして作製されたマイクロウェルチップ８枚を用いて、実施例３で使用したβ−グルクロニダーゼの酵素活性を測定した。撮影補助具としては、実施例１で用いた撮影補助具（箱体の高さ：７ｃｍ、面発光型光源：有機ＥＬパネル、拡大レンズなし）、又は図２に記載の撮影補助具（ただし、箱体の高さ：７ｃｍ、面発光型光源：白色ＬＥＤパネル、拡大レンズなし）を用いた。いずれも、スマートフォンのカメラレンズとマイクロウェルチップの間の撮影距離は約５ｃｍであった。
【0085】
１．０×１０−４ＭのＸ−Ｇｌｕｃ溶液（Ｘ−Ｇｌｕｃを１．０×１０−４Ｍとなるように、ｐＨ７．０〜７．５のＰＢＳに溶解させた溶液）を、１ウェル当たり２００μＬずつウェル内のセルロースシートに滴下し、７０℃で加熱して水分を蒸散させて、Ｘ−Ｇｌｕｃを当該セルロースシートに担持させた。次いで、ウェル１１、ウェル１３、ウェル３１、及びウェル３３にはβ−グルクロニダーゼ溶液（所定の濃度となるようにβ−グルクロニダーゼをＰＢＳに溶解させた溶液）を、ウェル１２、ウェル２１、ウェル２３、及びウェル３２にはＰＢＳを、それぞれ１ウェル当たり２００μＬずつ注入した（ｎ＝４）。マイクロウェルチップ８枚のうち、２枚には１０００ｕｎｉｔ／ｍＬのβ−グルクロニダーゼ溶液を、２枚には７５０ｕｎｉｔ／ｍＬのβ−グルクロニダーゼ溶液を、２枚には５００ｕｎｉｔ／ｍＬのβ−グルクロニダーゼ溶液を、残る２枚には１００ｕｎｉｔ／ｍＬのβ−グルクロニダーゼ溶液を、それぞれ注入した。β−グルクロニダーゼ溶液注入後、３７℃で６０分間反応させた。反応開始から１５分後、３０分後、及び６０分後に、当該マイクロウェルチップを、製造例１で使用した撮影補助具又は図２に記載の撮影補助具を用いて、Ａｕｔｏ（自動補正）モード又は曇りモードで撮影した。
【0086】
撮像した画像を実施例３と同様にして補正し、補正後の画像を解析してそれぞれのウェル領域のＲ成分の強度値（Ｒ値）を測定した。マイクロウェルチップごとに、β−グルクロニダーゼを含む反応液を注入した４ウェルのＲ値の平均値と、ブランクの４ウェルのＲ値の平均値とを求め、ブランクのＲ値を１とした相対Ｒ値を求めた。図９には、有機ＥＬパネルを備えた撮影補助具を用いてＡｕｔｏモードで撮影した補正後の画像の相対Ｒ値を、図１０には、有機ＥＬパネルを備えた撮影補助具を用いて曇りモードで撮影した補正後の画像の相対Ｒ値を、図１１には、白色ＬＥＤパネルを備えた撮影補助具を用いてＡｕｔｏモードで撮影した補正後の画像の相対Ｒ値を、図１２には、白色ＬＥＤパネルを備えた撮影補助具を用いて曇りモードで撮影した補正後の画像の相対Ｒ値を、それぞれ示す。図９〜１２中、（Ａ）は反応開始から１５分後のサンプルの結果を、（Ｂ）は３０分後のサンプルの結果を、（Ｃ）は６０分後のサンプルの平均の結果を、それぞれ示す。図９〜１２に示すように、いずれの撮影条件であっても、反応開始から１５〜６０分後のいずれにおいても、反応開始から１５〜６０分後のいずれにおいても、撮像した画像中のウェル領域の相対Ｒ値は、ウェル中のβ−グルクロニダーゼ濃度と高い相関があり（ｒ２が０．８以上）、Ｒ値に基づいてβ−グルクロニダーゼ濃度を測定できることが確認された。
【0087】
［実施例５］実施例１で作製したマイクロウェルチップと同様にして作製されたマイクロウェルチップ２枚を用い、実施例４で使用した２種類の撮影補助具を用いて、大腸菌を含む試料の酵素活性を測定した。
【0088】
マスタープレートから帯状に生育した大腸菌をスパーテルで採取し、５ｍＬ容チューブ（２ｍＬのＰＢＳ入り）に入れて撹拌したものを、大腸菌試料原液とした。表１０に示すように、１質量％塩化バリウム水溶液と１質量％硫酸水溶液とを適宜混合してマクファーランド濁度標準液（Ｎｏ ０．５、１、２、３）を調製した。各濁度標準液の濁度を分光光度計で測定し、検量線を作成した。この検量線に基づいて、大腸菌試料原液をＰＢＳで適宜希釈して、推定生菌数９．０×１０８ＣＦＵ／ｍＬの大腸菌試料を作製した。
【0089】
【表10】
【0090】
１．０×１０−４ＭのＸ−Ｇｌｕｃ溶液（Ｘ−Ｇｌｕｃを１．０×１０−４Ｍとなるように、ｐＨ７．０〜７．５のＰＢＳに溶解させた溶液）を、１ウェル当たり２００μＬずつウェル内のセルロースシートに滴下し、７０℃で加熱して水分を蒸散させて、Ｘ−Ｇｌｕｃを当該セルロースシートに担持させた。次いで、ウェル１１、ウェル１３、ウェル３１、及びウェル３３には大腸菌試料を、ウェル１２、ウェル２１、ウェル２３、及びウェル３２にはＰＢＳを、それぞれ１ウェル当たり３５０μＬずつ注入した（ｎ＝４）。β−グルクロニダーゼ溶液注入後、３７℃で８時間反応させた。反応開始から０．５時間後、２時間後、４時間後、６時間後、及び８時間後に、当該マイクロウェルチップを、実施例４で使用した２種類の撮影補助具を用いて、Ａｕｔｏ（自動補正）モード又は曇りモードで撮影した。
【0091】
有機ＥＬパネルを用いた撮影補助具を用いた測定では、発色反応開始２時間では僅かに目視で確認できる程度の着色であったが、反応開始４時間以降では鮮明に青色の呈色が確認できた。白色ＬＥＤパネルを用いた撮影補助具を用いた測定では、発色反応開始２時間でも目視で青色の呈色が確認できた。すなわち、目視による定性的な検査であれば、白色ＬＥＤパネルを用いた撮影補助具のほうがより短時間で大腸菌を検出できた。
【0092】
撮像した画像を実施例３と同様にして補正し、補正後の画像を解析してそれぞれのウェル領域のＲ成分の強度値（Ｒ値）を測定した。マイクロウェルチップごとに、β−グルクロニダーゼを含む反応液を注入した４ウェルのＲ値の平均値と、ブランクの４ウェルのＲ値の平均値とを求めた。図１３に各反応液のＲ値の経時的変化を示す。この結果、有機ＥＬパネルを用いた撮影補助具を用いた測定は、白色ＬＥＤパネルを用いた撮影補助具を用いた測定よりも、ブランクとのＲ値の差が大きく、色相変化の検出感度が高かった。特に、有機ＥＬパネルを用いた撮影補助具を用いた測定では、発色反応開始０．５時間では、目視では大腸菌試料とブランクのウェル間の発色の差が区別できなかったが、画像解析により得られたＲ値では差が明確に検出できた。
【0093】
また、発色反応開始４時間後には、いずれの測定条件であっても、大腸菌試料とブランクのＲ値は充分な差があり、大腸菌試料中の酵素活性が測定できた。すなわち、これらの測定方法により、９．０×１０８ＣＦＵ／ｍＬの大腸菌を検出できることが確認された。この菌濃度は、飲食品工場や給食設備における一般生菌検査で検出が要求されている濃度とほぼ同じオーダーである。つまり、本実施例の測定方法は、飲食品工場等で実用に足る測定感度であることが確認できた。
【0094】
なお、Ｘ−Ｇｌｕｃを担持させたセルロースシートに代えて、大腸菌を捕捉させたセルロースシートをウェルの内底面にしき、１．０×１０−４ＭのＸ−Ｇｌｕｃ溶液（Ｘ−Ｇｌｕｃを１．０×１０−４Ｍとなるように、ｐＨ７．０〜７．５のＰＢＳに溶解させた溶液）を、１ウェル当たり２００μＬずつ注入した後、３７℃で発色反応を開始させることもできる。また、Ｘ−Ｇｌｕｃを担持させたセルロースシートに、大腸菌を捕捉させたセルロースシートを重ねて置き、ＰＢＳを１ウェル当たり２００μＬずつ注入した後、３７℃で発色反応を開始させることもできる。なお、セルロースシートを濾過膜として、９．０×１０８ＣＦＵ／ｍＬの大腸菌試料３５０μＬを加圧濾過することにより、当該セルロースシートに大腸菌を捕捉させることができる。
【産業上の利用可能性】
【0095】
本実施形態のマイクロウェルチップ、キット、及びこれらを用いた方法により、大腸菌等の微生物を検出するための発色検査を、マイクロプレートリーダーのない環境下でも実施することができる。したがって、当該チップ等は、飲食品自体やその製造工場、水道設備などにおける微生物汚染の検査に特に有用である。
【符号の説明】
【0096】
１Ａ、１Ｂ、１Ｃ…撮影補助具、２…撮像装置、３…マイクロウェルチップ、４…チップ設置部、５ａ、５ｂ、５ｃ…箱体、６ａ、６ｂ、６ｃ…面発光型光源、７…貫通孔、８ａ、８ｃ…撮像装置設置部、９…拡大レンズ、１０Ａ…撮影補助具、１１…チップ設置部、１１ａ…保持枠、１１ｂ…脚部、１２…アクリル板、１３…ＰＴＦＥテープ、１４…多孔質膜。