特開 2020-176080 ネグサレ線虫を忌避させるための忌避剤及びその製造方法並びにその忌避剤を用いた忌避方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2020-176080(P2020-176080A)

(43)【公開日】2020年10月29日

(54)【発明の名称】ネグサレ線虫を忌避させるための忌避剤及びその製造方法並びにその忌避剤を用いた忌避方法

(51)【国際特許分類】

   A01N 63/20 20200101AFI20201002BHJP

   A01P 17/00 20060101ALI20201002BHJP

   A01M 29/34 20110101ALI20201002BHJP

   C12P 1/02 20060101ALI20201002BHJP

   C12N 1/14 20060101ALI20201002BHJP

【ＦＩ】

   A01N63/02 P

   A01P17/00

   A01M29/34

   C12P1/02 Z

   C12N1/14 B

【審査請求】未請求

【請求項の数】9

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】14

(21)【出願番号】特願2019-78519(P2019-78519)

(22)【出願日】2019年4月17日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ２０１９年度（平成３１年度）日本農芸化学会大会 講演要旨集（公開日：平成３１年３月５日）ｈｔｔｐｓ：／／ｊｓｂｂａ．ｂｉｏｗｅｂ．ｎｅ．ｊｐ／ｊｓｂｂａ２０１９／ｄｏｗｎｌｏａｄ＿ｐｄｆ．ｐｈｐ？ｐ＿ｃｏｄｅ＝３Ｃ３ｐ１４ 日本農芸化学会２０１９年度（平成３１年度）大会（講演日：平成３１年３月２６日）

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３０年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、研究成果展開事業 研究成果最適展開支援プログラム 「細胞性粘菌が産生する線虫忌避物質を用いた植物保護資材の開発」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

(71)【出願人】

【識別番号】502350504

【氏名又は名称】学校法人上智学院

(71)【出願人】

【識別番号】591100448

【氏名又は名称】パネフリ工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100099793

【弁理士】

【氏名又は名称】川北 喜十郎

(72)【発明者】

【氏名】齊藤 玉緒

(72)【発明者】

【氏名】永松 ゆきこ

(72)【発明者】

【氏名】細野 翔平

【テーマコード（参考）】

2B121

4B064

4B065

4H011

【Ｆターム（参考）】

2B121CC21

2B121EA26

2B121FA13

4B064CA05

4B064CE08

4B064DA11

4B064DA12

4B065AA57X

4B065AC15

4B065BD16

4B065CA47

4B065CA53

4B065CA60

4H011AC06

4H011BB21

(57)【要約】

【課題】農作物や作業者に悪影響を与えることなくネグサレ線虫を忌避させる新規な忌避剤を提供する。
【解決手段】ネグサレ線虫を忌避させるための忌避剤は、Dictyostelium属に属する細胞性粘菌から分泌された物質を有効成分とする。細胞性粘菌から分泌された物質は、例えば、細胞性粘菌を子実体に培養し、細胞性粘菌を分離して抽出して得られる。細胞性粘菌として、D.discoideum，D.purpureum，D.mucoroides，D.fasciculatum，D.monochasioides，D.lacteumまたはD.giganteumを使用し得る。イチゴやダイコンなどの農作物をネグサレ線虫から安全に駆除することができる。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ネグサレ線虫を忌避させるための忌避剤であって、Dictyostelium属に属する細胞性粘菌から分泌された物質を有効成分とすることを特徴とする忌避剤。

【請求項2】

前記細胞性粘菌から分泌された物質が、多細胞期の前記細胞性粘菌から分泌された物質であることを特徴とする請求項１に記載の忌避剤。

【請求項3】

前記多細胞期の細胞性粘菌が、細胞性粘菌の子実体であることを特徴とする請求項２に記載の忌避剤。

【請求項4】

前記細胞性粘菌が、D.discoideum、 D.purpureum、D.mucoroides、D.fasciculatum、D.monochasioides、D.lacteum及びD.giganteumからなる群から選ばれる一種であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の忌避剤。

【請求項5】

前記細胞性粘菌から分泌された物質は、Dictyostelium属に属する細胞性粘菌を培地で培養させ、培養した細胞性粘菌を培地から除去した後に、培地から抽出して得られることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の忌避剤。

【請求項6】

前記培地からの抽出が、有機溶媒による抽出であることを特徴とする請求項５に記載の忌避剤。

【請求項7】

さらに、前記細胞性粘菌を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の忌避剤。

【請求項8】

請求項１〜７のいずれか一項に記載の忌避剤を、ネグサレ線虫が存在するエリアに適用することでネグサレ線虫を忌避させる方法。

【請求項9】

ネグサレ線虫を忌避させるための忌避剤の製造方法であって、
Dictyostelium属に属する細胞性粘菌を培養して多細胞期の細胞性粘菌に変化させ、
前記多細胞期の細胞性粘菌から有機溶媒によって前記多細胞期の細胞性粘菌の分泌物質を抽出することを含む前記忌避剤の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、農作物の根に寄生するネグサレ線虫を忌避させるための物質及びその製造方法並びにその忌避剤を用いた忌避方法に関する。

【背景技術】

【0002】

線虫は、線形動物門に属する動物の総称であり、極めて多くの種が実在している。これらの線虫の殆どは人間にとって無害であるが、植物に寄生して加害する線虫が知られている。例えば、ネコブ線虫類、シスト線虫類、ネグサレ線虫類が挙げられる。このうち、ネグサレ線虫は、ミナミネグサレ線虫やキタネグサレ線虫に代表され、寄生範囲はネコブ線虫よりも広い。ネグサレ線虫は、その成虫及び幼虫がイチゴ、ダイコン、ニンジン、ゴボウ、レタスなどの農作物の根や塊茎に侵入して加害する。根に寄生すると、２ｍｍ程度の褐色から黒褐色の微小条斑が生じ、次第に病斑が拡大して根全体に広がる。塊茎では小斑点が生じ、次第に大型化し病斑部が陥没したり、腐敗することがある。このようなネグサレ線虫による被害に対処するため、日本ではクロロピクリン、１，３−ジクロロプロペン等の毒性の高い農薬が使用されている。

【0003】

しかしながら、このような農薬の散布は、作物や作業者の安全性という見地から好ましくない。特に、作物の育成中に線虫の感染が見られた場合に、作物にそのような毒性が高い化学物質を使用することはできない。このため、作物や作業者の安全性を維持しつつ、ネグサレ線虫を駆除する方法が望まれている。

【0004】

特許文献１には、生コーヒー豆抽出物の有効成分を用いたネグサレ線虫の防除剤が開示されている。生コーヒー豆抽出物の有効成分として、例えば、クロロゲン酸等のフェノール化合物が含まれており、このような有効成分がネグサレ線虫の駆除に効果的であり、一方、天然由来成分であるために人体や作物に対する安全性が高いことが示されている。特許文献２には、アワユキセンダングサの抽出物を有効成分とするネグサレ線虫防除剤が開示されている。

【0005】

ところで、細胞性粘菌は、土壌に普遍的に生息する真核微生物であり、通常は単細胞状態でバクテリアを餌として増殖する。本願発明者は、Dictyostelium属に属する細胞性粘菌から分泌された物質を有効成分とするネコブ線虫を忌避させる忌避剤を開発している（特許文献３）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開２０１２−２３２９５０号公報

【特許文献2】特許第５３９４８７２号公報

【特許文献3】特許第６１７２５４５号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の目的は、農作物や作業者に悪影響を与えることなくネグサレ線虫を忌避させるための忌避剤及びそれを用いた方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明の第１の態様に従えば、ネグサレ線虫を忌避させるための忌避剤であって、Dictyostelium属に属する細胞性粘菌から分泌された物質を有効成分とすることを特徴とする忌避剤が提供される。

【0009】

本発明の忌避剤において、前記細胞性粘菌から分泌された物質が、多細胞期の細胞性粘菌、特に細胞性粘菌の子実体から分泌された物質でもよい。

【0010】

前記細胞性粘菌が、D.discoideum,D.purpureum,D.mucoroides，D.fasciculatum，D.monochasioides，D.lacteum及びD.giganteumからなる群から選ばれる一種、特には、D.discoideum,D.fasciculatumまたはD.giganteumであってもよい。

【0011】

本発明の忌避剤において、前記細胞性粘菌から分泌された物質は、Dictyostelium属に属する細胞性粘菌を培地で培養させ、培養した細胞性粘菌を培地から除去した後に、培地から抽出して得てもよい。この場合、前記培地からの抽出が、有機溶媒による抽出であるか、あるいは、吸着剤による吸着であってもよい。本発明の忌避剤は、さらに、前記細胞性粘菌を含んでいてもよい。

【0012】

本発明の第２の態様に従えば、本発明の第１の態様に従う忌避剤を、ネグサレ線虫が存在するエリアに適用することでネグサレ線虫を忌避させる方法が提供される。

【0013】

本発明の第３の態様に従えば、ネグサレ線虫を忌避させるための忌避剤の製造方法であって、Dictyostelium属に属する細胞性粘菌を培養して多細胞期の細胞性粘菌に変化させ、前記多細胞期の細胞性粘菌から有機溶媒によって前記多細胞期の細胞性粘菌の分泌物質を抽出することを含む前記忌避剤の製造方法が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１は、実験例１における操作と結果を示す図であり、図１（ａ）はシャーレ内におけるミナミネグサレ線虫とろ紙サンプルの配置を示す概念図であり、図１（ｂ）は顕微鏡画面におけるろ紙サンプルとミナミネグサレ線虫の両側に設定した領域１及び２の配置を示す図である。

【図2】実験例１において、ろ紙サンプルに対するミナミネグサレ線虫の移動軌跡を顕微鏡用デジタルカメラを用いて撮影した画像を示し、図２（ａ）は、粘菌抽出液を含むろ紙サンプルを用いた場合を示し、図２（ｂ）はControlろ紙サンプルを用いた場合を示す。

【図3】領域１及び２におけるミナミネグサレ線虫の存在を定量的に表したグラフであり、右側が粘菌抽出液を含むろ紙サンプルを用いた場合を示し左側がControlろ紙サンプルを用いた場合を示す。

【図4】実験例２において、D. discoideumからの粘菌抽出物の異なる固形分量に対するミナミネグサレ線虫の移動軌跡を領域１及び２で比較したグラフである。

【図5】実験例３において、D. discoideumからの粘菌抽出物の異なる固形分量に対するキタネグサレ線虫の移動軌跡を領域１及び２で比較したグラフである。

【図6】実験例４において、D. discoideumからの粘菌抽出物の異なる固形分量に対するシスト線虫の移動軌跡を領域１及び２で比較したグラフである。

【図7】実験例５において、プレート上に、粘菌抽出物の付いたろ紙サンプルに接近したミヤコグサ試料Ｎｏ．１とそこから３５ｍｍ隔てて置かれたミヤコグサ試料Ｎｏ．２とそれぞれのミヤコグサ試料の下方に置かれたミナミネグサレ線虫の配置を示す概念図である。

【図8】図８（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ、実験例５においてミヤコグサ試料Ｎｏ．１及びＮｏ．２の根中のミナミネグサレ線虫による感染状態を示す拡大写真である。

【図9】実験例５における２本のミヤコグサの根のミナミネグサレ線虫による感染数を表すグラフであり、左がcontrolろ紙サンプルを用いた場合であり、右側がD. discoideumからの粘菌抽出物を含むろ紙サンプルを用いた場合である。

【図10】細胞性粘菌としてD.giganteumを用いた実験例６において、ろ紙サンプルに対するミナミネグサレ線虫の移動軌跡を顕微鏡用デジタルカメラを用いて撮影した画像を示し、図１０（ａ）は、D.giganteumからの抽出液を含むろ紙サンプルを用いた場合を示し、図１０（ｂ）はControlろ紙サンプルを用いた場合を示す。

【図11】実験例６における領域１及び２におけるミナミネグサレ線虫の存在を定量的に表したグラフであり、右側がD.giganteumからの抽出液を含むろ紙サンプルを用いた場合を示し、左側がControlろ紙サンプルを用いた場合を示す。

【図12】細胞性粘菌としてD.fasciculatumを用いた実験例７において、ろ紙サンプルに対するミナミネグサレ線虫の移動軌跡を顕微鏡用デジタルカメラを用いて撮影した画像を示し、図１２（ａ）は、D.fasciculatumからの抽出液を含むろ紙サンプルを用いた場合を示し、図１２（ｂ）はControlろ紙サンプルを用いた場合を示す。

【図13】実験例７における領域１及び２におけるミナミネグサレ線虫の存在を定量的に表したグラフであり、右側がD.fasciculatumからの抽出液を含むろ紙サンプルを用いた場合を示し、左側がControlろ紙サンプルを用いた場合を示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下、本発明のネグサレ線虫の忌避剤及びそれを用いるネグサレ線虫を忌避させる方法の実施形態について説明する。

【0016】

＜忌避対象物＞
本発明では、ネグサレ線虫を忌避対象とし、ネグサレ線虫には、ミナミネグサレ線虫（P. coffeae）、キタネグサレ線虫（P. penetrans）、ノコギリネグサレ線虫（P. crenatus）、クルミネグサレ線虫（P. vulnus）のようなネグサレ線虫が知られている。これらのネグサレ線虫は、いちご、だいこん、にんじん、ごぼう、レタス等の農作物の根の皮を破って侵入し、皮層に寄生する。根に寄生すると、黒褐色の微小条班を生じ、次第に病斑が拡大して根全体に広がる。

【0017】

＜細胞性粘菌及びその入手＞
細胞性粘菌は、主に、Dictyostelium属、Polysphondylium属、及びAcytostelium属の三つの属に分類され、本発明で用いる細胞性粘菌は、Dictyostelium属（以下、適宜、D.またはＤ属と略することがある）に属する細胞性粘菌であり、例えば、D.discoideum、D.purpureum、D.mucoroides、D.fasciculatum、D.monochasioides、D.lacteum、D.giganteumが挙げられる。これらのうち、D.discoideum、D.fasciculatum、D.lacteum、D.giganteumが、培養がしやすく、高密度でも子実体を作り易い点で好ましく、同様の観点で特に、D.discoideumまたはD.giganteumが好ましい。D.giganteumは和名セイタカタマホコリカビと呼ばれ、大きな子実体を作ることが知られている。

【0018】

Dictyostelium属は、形態的に枝分かれしておらず、細胞性のしっかりした柄を持ち、柄が１本で胞子塊を支えることができる。これに対して、Ploysphondylium属（以下、適宜、P.またはＰ属と略することがある）は、横方向にWhorl（輪生枝）と呼ばれる枝分かれ構造を持ち、柄が細く、Acytostelium属（以下、適宜、A.またはＡ属と略することがある）は細胞性の柄を持たずセルロースのチューブ状の柄を持つ。胞子は休眠状態でいるため活動を停止しているが、柄細胞は遺伝的には死んでいても生理学的には生きており、化合物を合成・分泌している。

【0019】

なお、細胞性粘菌は遺伝子的な分類方法（ＤＮＡの塩基配列よる分類）ではグループＩからIVに分けることもできる（P.Schaap et al. Science, 27 OCTOBER 2006, Vol. 314 no. 5799 pp. 661-663）。例えば、D.discoideum， D.purpureum, D.mucoroides， D.giganteumはグループIVに属し、D.lacteumはグループIIIに属し、Acytostelium属に属するA.subglobosumやPolysphondylium属に属するP.pallidumはグループIIに属し、D.fasciculatumはグループＩに属する。これらの細胞性粘菌は、例えば、ナショナルバイオリソースプロジェクト（ＮＢＲＰ）から胞子の状態で入手し、培養することができる。あるいは、土壌から採取したものを分離して用いることができる。

【0020】

＜細胞性粘菌分泌物＞
本発明者は、後述する実施例の結果より、ネグサレ線虫を忌避させる物質(忌避剤の有効成分)は、細胞性粘菌そのものではなく、細胞性粘菌から分泌される物質（細胞性粘菌分泌物）が線虫に対して忌避性を示すことを見出した。細胞性粘菌は、胞子の状態で入手した場合、発芽して、単細胞化し、次いで、飢餓状態において多細胞化し、さらに、子実体が形成される。細胞性粘菌分泌物は、細胞性粘菌による代謝産物であると考えられるが、その化合物（または生体物質、微生物）などは現段階では特定できていない。しかしながら、細胞性粘菌からネグサレ線虫を忌避させる物質（忌避剤）を生成することができることは後述する実施例で実証されている。

【0021】

＜細胞性粘菌分泌物の抽出方法(製造方法)＞
ネグサレ線虫を忌避させる細胞性粘菌分泌物は、例えば、以下のような方法で得ることができる。細胞性粘菌は、通常、粉末（胞子）状で入手することができる。このような粉末状の細胞性粘菌を、寒天内に大腸菌と共に培養する。寒天培地内で細胞性粘菌の胞子が発芽してアメーバ(単細胞)となる。アメーバは大腸菌を餌として増殖するが、餌が尽きると飢餓状態となり集合して多細胞化し、その後、子実体となる。得られた子実体を回収し、メタノールやエタノール等の有機溶媒中に加えて静置する。子実体は有機溶液中で沈殿し、エタノールの上層（上澄液）には子実体から分泌された物質のうち、疎水性物質が溶解または分散している。この上澄液を子実体からろ過等により分離して取り出すことで細胞性粘菌分泌物溶液が得られる。必要に応じて細胞性粘菌分泌物溶液を乾燥することで固形分として取り出すこともできる。

【0022】

＜ネグサレ線虫を忌避させる方法＞
上記のようにして得られた細胞性粘菌分泌物またはその溶液を、農地など土壌や植物に適用することでネグサレ線虫を忌避させることができる。農地は、いちご、だいこん、にんじん、ごぼう、レタス、サツマイモ、ジャガイモ、ピーマン、ナス、ハクサイ、サトイモ、ダイズ、トマト、スイカ、メロン、タマネギ、落花生、ニンジン、ゴボウ、ナガイモ、トウモロコシ、アスパラガス、ブドウなどを栽培する農地が挙げられるが、これらに限定されず、ネグサレ線虫が存在するまたは存在するであろういかなるエリアでもよい。

【0023】

農地などの土壌に適用するには、細胞性粘菌分泌物の溶液や分散液を噴霧したり、潅水または点滴潅水してもよく、粉体としての散布など、任意の形態で散布することができる。噴霧や散布方法は任意の方法及び装置を用い得る。細胞性粘菌分泌物を粉体として散布する際、細胞性粘菌分泌物を担体に担持させてもよい。そのような担体は、細胞性粘菌をその分泌物から分離させるときに使用したろ紙やビーズであってもよく、あるいは農地などに散布する観点からゼオライトなどの土壌改質剤に担持させてもよい。或いは農薬や肥料に混合して農地などに散布してもよい。細胞性粘菌分泌物またはその溶液の使用量は、土壌中に生息するネグサレ線虫を十分に忌避させる量であればよく、特に限定されず、例えば、土壌１リットル当たり、細胞性粘菌分泌物を１００〜５００ｍｇ使用することができる。あるいは、細胞性粘菌分泌物の溶液に植物の根を浸漬したり、根に溶液を散布することで直接、細胞性粘菌分泌物またはその溶液を植物に適用してもよい。細胞性粘菌分泌物は、自然界に存在している物質を分離抽出したものであるために、農作物を枯れさせたり生物を殺すことなく、ネグサレ線虫を有効に忌避させることができる。

【0024】

上記のようにして得られる細胞性粘菌分泌物をネグサレ線虫の忌避剤の有効成分として用いることができる。忌避剤は細胞性粘菌分泌物単独でもよく、他の成分が添加されていてもよい。他の成分として、例えば、肥料、農薬、土壌改質剤、細胞性粘菌分泌物を担持する担体などが挙げられる。また、忌避剤には、製造の容易性や忌避効果という観点からすれば、細胞性粘菌自体が含まれていてもよい。但し、前述のようにネグサレ線虫を忌避する有効成分を濃縮して使用する場合には、細胞性粘菌や脂質などが除去された細胞性粘菌分泌物だけを使用するのが望ましい。

【0025】

以下、本発明の忌避剤の実施例を、以下の実験例１〜７を通じて具体的に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。

【0026】

＜実験例１：D. discoideum分泌物に対するミナミネグサレ線虫の忌避特性＞
細胞性粘菌として、ＮＢＲＰから入手した粉末（胞子）状のD. discoideumを、大腸菌ないしはクレブシエラとともに寒天培地に数日程度設置した。この間に、細胞性粘菌の胞子が発芽してアメーバ(単細胞)となり、アメーバが大腸菌ないしはクレブシエラを餌として増殖した。ここから、増殖期の細胞性粘菌を薬サジなどで回収して、餌をとなる大腸菌ないしはクレブシエラとともにリン酸バッファに懸濁させた後、２５ｃｍ x ２５ｃｍのシャーレに載置し、１週間程度経過させて完全に子実体に変化させた。子実体を回収し１００％エタノール１０ｍｌを入れた容器に加え、４℃で１０日間保管した。子実体は有機溶液中で沈殿し、エタノールの上層（上澄液）には子実体から分泌された物質が溶解または分散していると考えられる。この上澄液をろ過により子実体から分離し、分離した液体をナス型フラスコに移してロータリエバポレータで水を除去して乾燥することで固形分を得た。この固形分の重量を秤量し、８０ｍｇ/ｍＬ の濃度になるように４０％メタノールに加えて溶液（粘菌抽出液）を調製した。この溶液は黄色みを帯びた透明な液であった。粘菌抽出液１００μＬをろ紙(半月型ろ紙)に含ませてクリーンベンチ内で１時間風乾させた。これにより８ｍｇの抽出物を有するろ紙サンプルとした。なお、Controlとして、固形分を加えていない４０％メタノールを含ませたろ紙サンプル（以下、適宜「Controlろ紙サンプル」という）も同じ条件で作製した。

【0027】

次に、図１（ａ）に示すように、ゲランガムを充填したシャーレの端近くにろ紙サンプルを置き、ろ紙サンプルからシャーレの中央に向かって１２ｍｍ離れた地点にミナミネグサレ線虫を１０匹播種した。播種から１６時間後に、次のようにして顕微鏡を用いてミナミネグサレ線虫の行動を定量的に解析した。図１（ｂ）に示すように、ミナミネグサレ線虫の両側に領域１及び２を設定した。各領域のサイズは０．９６ｃｍ(横)×１．３ｃｍ(縦)であり、領域１と領域２の間隔は０．２７ｃｍであった。二つの領域について顕微鏡用デジタルカメラ(顕微鏡：Ｎｉｋｏｎ ＡＺ１００、カメラ：Ｎｉｋｏｎ ＦＲ４００Ｃ)を用いて、ミナミネグサレ線虫の播種から１６時間経過後に画像を撮影した。結果を図２（ａ）に示す。図２（ａ）の画像から、ミナミネグサレ線虫は、ろ紙サンプル（左側の黒い部分）に近い領域１には殆ど侵入しておらず、領域２に移動軌跡が偏っていることが分かる。これに対して、Controlろ紙サンプルでは、図２（ｂ）に示すように、二つの領域でほぼ均等に移動軌跡が現われている。

【0028】

図２（ａ）及び（ｂ）に示すような撮影画像を画像解析ソフトImageJを用い、各領域でどの程度、ミナミネグサレ線虫が移動した跡があるかについてドット数をカウントして数値化した。画像解析により得られた結果を、図３のグラフに示す。同グラフ中、左側はControlろ紙サンプルを用いた場合であり、右側は粘菌抽出物を含むろ紙サンプルを用いた結果である。Controlろ紙サンプルを用いた場合には、領域１、２で大きな差は見られなかったが、粘菌抽出物を含むろ紙サンプルを用いた場合には、領域１の値が明らかに領域２より低く、ミナミネグサレ線虫がD.discoideumからの抽出物を忌避したことが定量的に確認することができる。なお、図の縦軸の相対値（％）は、線虫が移動した移動軌跡について、全てのドット数の合計に対するそれぞれの領域のドット数の割合をパーセントで表したものである。

【0029】

＜実験例２：D.discoideum分泌物に対するミナミネグサレ線虫の忌避特性の濃度依存性＞
実験例１の結果より、ミナミネグサレ線虫を忌避させているのは細胞性粘菌から分泌または放出された物質であることが明らかとなった。この実験例では、そのような物質の忌避特性に対する濃度依存性を調査した。

【0030】

実験例１では、細胞性粘菌からの抽出物固形分を８０ｍｇ/ｍＬ の濃度になるように４０％メタノールに溶解して粘菌抽出液１００μＬを調製した。この実験例では、この濃度の粘菌抽出液を４０％メタノールで２倍（４０ｍｇ/ｍＬ）、４倍（２０ｍｇ/ｍＬ）、８倍（１０ｍｇ/ｍＬ）、８０倍（１ｍｇ/ｍＬ）及び８００倍（０．１ｍｇ/ｍＬ）にそれぞれ希釈した粘菌抽出液を調製し、４ｍｇ、２ｍｇ、１ｍｇ、０．１ｍｇ及び０．０１ｍｇの抽出固形分を含むろ紙サンプルを作製した。これらの各ろ紙サンプルについて、実験例１と同様にして、ゲランガム上でろ紙サンプルから１２ｍｍ離れた地点にミナミネグサレ線虫を１０匹播種して、ミナミネグサレ線虫の移動軌跡を撮影した。固形分量が多いろ紙サンプルほど領域１より領域２における移動軌跡が多いことが撮影画像から観察された。各撮影画像から実験例１と同様にして画像解析ソフトImageJを用い、ミナミネグサレ線虫の移動跡を数値化した。固形分量４ｍｇ、２ｍｇ、１ｍｇ、０．１ｍｇ、０．０１ｍｇのろ紙サンプルを用いた場合の結果を、実験例１における固形分量８ｍｇ及びControlろ紙サンプルの結果と共に図４のグラフに示す。図４のグラフより、固形分量が多いほど領域２におけるミナミネグサレ線虫の移動軌跡が多く、少なくとも固形分量１ｍｇまでは領域１及び２における有意差のある移動軌跡が確認された。このことから、固形分量、すなわち、粘菌からの抽出液の濃度が高いほど、ミナミネグサレ線虫の忌避効果が顕著に表れることが分かった。

【0031】

＜実験例３：D.discoideum分泌物に対するキタネグサレ線虫の忌避特性と濃度依存性＞
ネグサレ線虫の種類を、ミナミネグサレ線虫に代えてキタネグサレ線虫を使用して実験例１と同様の実験を行った。キタネグサレ線虫もまた、細胞性粘菌D. discoideumからの分泌物を忌避する移動軌跡が観察された。また、実験例２と同様にして、D.discoideumからの分泌物固形分量を変化させてキタネグサレ線虫の忌避特性を顕微鏡画像から観察した。固形分量８ｍｇ、４ｍｇ、２ｍｇ、１ｍｇ、０．１ｍｇ、０．０１ｍｇのろ紙サンプルを用いた場合の結果を、Controlろ紙サンプルの結果と共に図５のグラフに示す。キタネグサレ線虫もまた、固形分量が多いほど領域２における移動軌跡が多く、少なくとも固形分量０．１ｍｇまでは領域１及び２における有意差のある移動軌跡が確認された。よって、キタネグサレ線虫もD.discoideumからの粘菌抽出液の濃度が高いほど、顕著な忌避特性を示すことが分かる。

【0032】

＜実験例４：D.discoideum分泌物に対するシスト線虫の忌避特性＞
比較例としてネグサレ線虫に代えて、シスト線虫を使用して、D.discoideumからの分泌物の最大固形分量として１６ｍｇを使用し且つ最小固形分量０．０１ｍｇを使用しなかった以外は、実験例１〜３と同様の実験を行った。シスト線虫では、細胞性粘菌D.discoideumからの分泌物を忌避する移動軌跡が観察できなかった。固形分量１６ｍｇ、８ｍｇ、４ｍｇ、２ｍｇ、１ｍｇ、０．１ｍｇのろ紙サンプルを用いた場合の結果を、Controlろ紙サンプルの結果と共に図６のグラフに示す。固形分量を実験例１及び３の最大固形分量８ｍｇの２倍の１６ｍｇにしたにもかかわらずに、領域１及び２における有意差のある移動軌跡が確認できなかった。よって、シスト線虫は、D.discoideumの抽出物質に対して忌避特性を示さないことが分かる。

【0033】

＜実験例５：D.discoideum分泌物存在下における植物へのミナミネグサレ線虫の感染試験＞
この実験例では、実際の植物がミナミネグサレ線虫に感染される際に、細胞性粘菌からの分泌物がどのように作用するかを試験した。植物として、以下のようにして用意したマメ科に属するミヤコグサを用いた。予め保水及び滅菌を行ったミヤコグサ種子の外皮を取り除き、Ｃａ、Ｐ、クエン酸鉄、ＫＮＯ_３から調製した培地上に５ｍｍ以上の間隔をあけて種子を並べ、２２℃で保存した。２日後に、発芽したミヤコグサを新たな培地上に移し代えた。２本のミヤコグサ（試料Ｎｏ．１,２）を図７に示すように１つのプレート上に３５ｍｍの間隔で並べて感染実験用プレートとした。

【0034】

実験例１で得られた濃度８０ｍｇ／ｍｌの粘菌抽出液を、半径１ｃｍの半月状ろ紙に１００μｌ浸みこませ、クリーンベンチ内で１時間風乾させた。ろ紙を図７に示すように、感染実験用プレート上の左側に生育しているミヤコグサ（試料Ｎｏ．１）の根から左側２ｍｍの地点に置いた。それぞれのミヤコグサの根の先端から１０ｍｍ離れた地点に、ミナミネグサレ線虫を約３５匹播種し、４８時間２３℃で培養した。ミヤコグサの根を水で軽く洗浄し、２５%アンチホルミンに３分間浸した。根を水でよく洗浄し、酸性フクシンストックを加えた６ wellプレートのwellに入れた後、１００℃の恒温槽で５分間加熱を行った。その後、室温で１０分間放熱し、酸添加グリセリンを一面に広げたシャーレの中に浸し、９５℃で３０分間加熱した。染色したミナミネグサレ線虫を試料Ｎｏ．１及びＮｏ．２の根ごとカバーガラスで押しつぶし、顕微鏡を使ってミナミネグサレ線虫の数を数えた。図８（ａ）及び（ｂ）に２本のミヤコグサの根中のミナミネグサレ線虫による感染状態及びその拡大写真を示す。図８（ａ）が試料Ｎｏ．１の根の部分写真であり、図８（ｂ）が試料Ｎｏ．２の根の部分写真であり、いずれも下方にその拡大写真を付した。試料Ｎｏ．１及びＮｏ．２の拡大写真において、細長線状のものがミナミネグサレ線虫であり、試料Ｎｏ．１の拡大写真からは１匹だけ確認され、試料Ｎｏ．２の拡大写真からは複数匹が確認される。なお、写真中、黒い楕円及び円状のものは気泡である。

【0035】

また、試料Ｎｏ．１及び２のミヤコグサ根中のミナミネグサレ線虫による感染数を図９のグラフに示す。左側のControlのろ紙サンプルを用いた場合では、試料Ｎｏ．１及びＮｏ．２では有意の差が見られない。一方、グラフ右側の粘菌抽出液を含むろ紙サンプルを用いた場合、試料Ｎｏ．１中のミナミネグサレ線虫の数が著しく低下している。このことからミナミネグサレ線虫が粘菌抽出液に近いミヤコグサの根に侵入することを忌避したことが分かる。

【0036】

＜実験例６：D. giganteum分泌物に対するミナミネグサレ線虫の忌避特性＞
上記実験例では、Dictyostelium属に属する細胞性粘菌としてD.discoideumを使用したが、この実験例ではD.discoideumに代えて、同じくDictyostelium属に属するD. giganteumを用いて実験例１と同様の実験を行った。D. giganteumの胞子について実験例１と同様の処理により子実体に培養し、子実体からメタノール抽出液を得た。メタノール抽出液から実験例１と同様にして８ｍｇの抽出物(固形分)を有するろ紙サンプルを作製し、ゲランガム上に設置後、ミナミネグサレ線虫を播種した後、両側の領域の画像を観察した。この結果、図１０（ａ）に示すように、ミナミネグサレ線虫は、ろ紙サンプル（左側の黒い部分）に近い領域１には殆ど侵入しておらず、領域２に移動軌跡が偏っていることが分かった。これに対して、Controlろ紙サンプル（４０％メタノールのみ）では、図１０（ｂ）に示すように、ミナミネグサレ線虫が領域１を回避したような軌跡は見られない。

【0037】

また、実験例１と同様に撮影画像からミナミネグサレ線虫の移動跡を数値化した結果を図１１のグラフに示す。同グラフ中、左側はControlろ紙サンプルを用いた場合を示し、右側はD.giganteumからの分泌物が含まれたろ紙サンプル（固形分量８ｍｇ）を用いた場合の結果である。Controlろ紙サンプルを用いた場合では領域１、２で有意の差は見られなかったが、D.giganteumからの分泌物を含むろ紙サンプルを用いた場合では、領域１の値が明らかに領域２より低く、ミナミネグサレ線虫がD.giganteum からの抽出物を忌避したことを確認することができる。

【0038】

＜実験例７：D.fasciculatum 分泌物に対するミナミネグサレ線虫の忌避特性＞
この実験例では、Dictyostelium属に属する細胞性粘菌としてD.fasciculatumを用いて、実験例１と同様の実験を行った。D.fasciculatum の胞子について実験例１と同様の処理により子実体に培養し、子実体からメタノール抽出液を得た。メタノール抽出液から実験例１と同様にして８ｍｇの抽出物を有するろ紙サンプルを作製し、ゲランガム上に設置後、ミナミネグサレ線虫を発生させた両側の領域の画像を観察した。この結果、図１２（ａ）に示すように、ミナミネグサレ線虫は、ろ紙サンプル（左側の黒い部分）に近い領域１には殆ど侵入しておらず、領域２に移動軌跡が偏っていることが分かった。これに対して、Controlろ紙サンプル（４０％メタノールのみ）を用いた場合では、図１２（ｂ）に示すように、二つの領域にミナミネグサレ線虫の移動軌跡がほぼ同等に現われている。

【0039】

また、実験例１と同様に撮影画像からミナミネグサレ線虫の移動跡を数値化した結果を図１３のグラフに示す。同グラフ中、左側はControlろ紙サンプルを用いた場合、右側はD.fasciculatum からの分泌物が含まれた試料（固形分量８ｍｇ）の結果である。Controlろ紙サンプルを用いた場合には領域１、２で有意の差は見られなかったが、D.fasciculatum からの分泌物を含むろ紙サンプルを用いた場合には、領域１の値が明らかに領域２より低く、ミナミネグサレ線虫がD.fasciculatum からの抽出物を忌避したことを確認することができる。

【0040】

以上、本発明を実験例(実施例)により具体的に説明してきたが、本発明はそれらに限定されず、特許請求の範囲に記載の技術的思想の範囲内で種々の改変・改良・代替され得るもの及び方法も包含する。例えば、細胞性粘菌からの抽出物を得る際に、上記実験例で有機溶媒としてメタノールを用いたが、エタノール、イソプロパノール、クロロホルム、酢酸エチルなどの他の有機溶媒でも構わない。また、単細胞培養のための培地や容器についても任意のものを用い得る。

【0041】

上記実施例の実験例１〜５では、細胞性粘菌としてD.discoideumからの分泌物を用いたが、実験例６及び７の結果からすればD.discoideum以外のＤ属に属する細胞性粘菌からの分泌物についても、ネグサレ線虫の忌避剤の有効成分となることが分かる。また、上記実験例１〜４の結果からすれば、D.discoideumからの分泌物は、シスト線虫の防除には有効ではなく、ネグサレ線虫の防除に特異的に作用することが分かる。

【産業上の利用可能性】

【0042】

本発明の細胞性粘菌分泌物は、自然界にもともと存在している細胞性粘菌から分離抽出したものであるために、農作物や生物に被害を与えることなくネグサレ線虫を有効に忌避させることができる。本発明は、農作物や作業者の安全性を維持しつつ、全世界のイチゴ、ダイコン、ニンジン、ゴボウ、レタスなどの農作物の生産性を高めることができるため、農業分野における著しい国際貢献が期待される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】