知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
特開2021-100437アスタキサンチン製造のためのヘマトコッカスの培養方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】特開2021-100437(P2021-100437A)
(43)【公開日】2021年7月8日
(54)【発明の名称】アスタキサンチン製造のためのヘマトコッカスの培養方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/12 20060101AFI20210611BHJP
C12P 23/00 20060101ALI20210611BHJP
【ＦＩ】
C12N1/12 A
C12P23/00
【審査請求】有
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
【全頁数】13
(21)【出願番号】特願2021-65527(P2021-65527)
(22)【出願日】2021年4月7日
(62)【分割の表示】特願2018-513543(P2018-513543)の分割
【原出願日】2016年9月9日
(31)【優先権主張番号】15184899.1
(32)【優先日】2015年9月11日
(33)【優先権主張国】EP
(71)【出願人】
【識別番号】508366916
【氏名又は名称】ウニベルジテート ツー ケルン
(74)【代理人】
【識別番号】100079049
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100084995
【弁理士】
【氏名又は名称】加藤 和詳
(72)【発明者】
【氏名】ポドラ、 ビョルン
(72)【発明者】
【氏名】メルコニアン、 ミハエル
(72)【発明者】
【氏名】コスタ キパーストック、 アリス
(72)【発明者】
【氏名】セベスチェン、 ペトラ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AH01
4B064CA08
4B064CC30
4B064DA10
4B064DA20
4B065AA83X
4B065AC14
4B065BC42
4B065BC48
4B065CA05
4B065CA18
4B065CA41
4B065CA52
(57)【要約】
【課題】改善されたアスタキサンチン生産を提供し、従来の２段階手順の欠点を回避する。【解決手段】基材を用意する工程、前記基材表面上にヘマトコッカスを配置する工程、並びに前記ヘマトコッカスを低光エネルギーに暴露して初期培養を行う第１段階と、その後に前記第１段階で適用されたものよりも高い光エネルギーに前記ヘマトコッカスを暴露してアスタキサンチン形成を誘導することにより前記ヘマトコッカスを引き続き培養する第２段階とを含むヘマトコッカスの２段階培養プロセスを行わずに、前記基材上に配置された前記ヘマトコッカスを培養プロセスの開始から高光強度に暴露する工程、を含み、さらに 培養された前記ヘマトコッカスを回収する工程、及び／又はアスタキサンチンを単離する工程、を所望により含む、アスタキサンチン製造のためのヘマトコッカスの培養方法。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
基材を用意する工程、
前記基材表面上にヘマトコッカスを配置する工程、並びに
前記ヘマトコッカスを低光エネルギーに暴露して初期培養を行う第１段階と、その後に前記第１段階で適用されたものよりも高い光エネルギーに前記ヘマトコッカスを暴露してアスタキサンチン形成を誘導することにより前記ヘマトコッカスを引き続き培養する第２段階とを含むヘマトコッカスの２段階培養プロセスを行わずに、前記基材上に配置された前記ヘマトコッカスを培養プロセスの開始から高光強度に暴露する工程、
を含み、さらに
培養された前記ヘマトコッカスを回収する工程、及び／又は
アスタキサンチンを単離する工程、
を所望により含む、アスタキサンチン製造のためのヘマトコッカスの培養方法。
前記基材表面上にヘマトコッカスを配置する工程、並びに
前記ヘマトコッカスを低光エネルギーに暴露して初期培養を行う第１段階と、その後に前記第１段階で適用されたものよりも高い光エネルギーに前記ヘマトコッカスを暴露してアスタキサンチン形成を誘導することにより前記ヘマトコッカスを引き続き培養する第２段階とを含むヘマトコッカスの２段階培養プロセスを行わずに、前記基材上に配置された前記ヘマトコッカスを培養プロセスの開始から高光強度に暴露する工程、
を含み、さらに
培養された前記ヘマトコッカスを回収する工程、及び／又は
アスタキサンチンを単離する工程、
を所望により含む、アスタキサンチン製造のためのヘマトコッカスの培養方法。
【請求項2】
回収されたヘマトコッカスから前記アスタキサンチンが単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ヘマトコッカスがヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）である、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記第１段階における前記低光エネルギーが約５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上約２００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１未満である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記第２段階における前記高い光エネルギーが約２００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上であり、特に約５００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上である、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記基材がシート状の材料であり、特に多孔質シートである、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記シート状の材料が、紙、セルロースエステル、特に酢酸セルロース、セルロース混合エステル、セルロース、硝酸セルロース、ポリアミド、ポリエステル及び／又はポリオレフィンからなる群から選択される、請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アスタキサンチン製造のためのヘマトコッカスの改良された培養方法に関する。
【背景技術】
【0002】
微細藻類であるヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）は、高い色素性と抗酸化性を有するその二次代謝化合物、すなわちアスタキサンチンによって知られている。アスタキサンチンの着色性は主に、サケ及びエビの肉のピンク色がかった色を強めるために、水産養殖に使用されている（Ｌｏｒｅｎｚ ＆ Ｃｙｓｅｗｓｋｉ ２０００）。抗酸化剤としては、アスタキサンチンはヒトの健康補助製品として市販されている（アスタリール社（ＡｓｔａＲｅａｌ）、アルガテクノロジーズ社（Ａｌｇａｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ）、シアノテック社（Ｃｙａｎｏｔｅｃｈ Ｌｔｄ）、ニュートレックスハワイ社（Ｎｕｔｒｅｘ Ｈａｗａｉｉ Ｌｔｄ）、フジヘルスサイエンス社（Ｆｕｊｉ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）を参照）。現在のアスタキサンチンの主な供給源は化学合成である（ＣＡＲＤＡＸ社及びＢＡＳＦ社を参照、動物用飼料としての目的にのみ許可）。
【0003】
しかしながら、より良好なバイオアベイラビリティ及び抗酸化能を示すいくつかの研究、並びに天然製品又は「バイオ」製品に対する消費者の一般的な嗜好により、天然源由来のアスタキサンチンが関心を集めつつあり、高い価値を有している（Ｎｇｕｙｅｎ ２０１３）。
【0004】
それにもかかわらず、ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈ． ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）によるアスタキサンチンの生産は未だに高価で難易度の高い技術である。これはある程度、ヘマトコッカス・プルビアリスによるアスタキサンチン生産は通常細胞分裂が停止する際に起こることに起因する。アスタキサンチン生産は、高光強度（２００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１超）、塩ストレス及び養分欠乏などの、特定のストレス因子によって誘導される（Ａｆｌａｌｏ ｅｔ ａｌ． ２００７）。
【0005】
そのため、従来の培養方法は以下の２段階からなる：（ｉ）培養パラメーターを、高い細胞密度を生んで十分なバイオマスを得るのに最適なものとする、「グリーンフェーズ」（光強度：５０〜２００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１；温度：２０〜２５℃；ｐＨ６．５〜８）；並びに、（ｉｉ）ストレスを加えることで、細胞分裂の著しい減少又は停止を伴いつつも、アスタキサンチンの生産及び蓄積を増強する、「レッドフェーズ」。結果として、製品としてのアスタキサンチンという観点からは、確立された技術では、総生産期間の約５０％を占める非生産的なグリーンフェーズが問題とされる（Ｓｕｈ ｅｔ ａｌ． ２００６； Ａｆｌａｌｏ ｅｔ ａｌ． ２００７）。さらに、２段階の手順は、２つの別々のバイオリアクター系を必要とするため、より高度な技術的努力を必要とする。すなわち、グリーンフェーズは低光強度を与えるために主に屋内に設置され、光化学的ストレスを避けながら人工光源による照射を受ける一方、レッドフェーズは屋外のフォトバイオリアクターにみられるような高い太陽放射照度の恩恵を受ける。
【0006】
非連続的な２段階法のこのような明らかな欠点に加えて、従来の培養系は、チューブラー型リアクター及びオープンポンドでの懸濁増殖をベースとしている（Ｌｏｒｅｎｚ ａｎｄ Ｃｙｓｅｗｓｋｉ ２０００）。しかしながら、これらの系は、建設費、運用費及び維持費等のコストが高いことがよく知られている（Ｏｚｋａｎ ｅｔ ａｌ． ２０１２）。バイオリアクター設計における最近の進歩により、バイオフィルムベースのバイオリアクターが、これらの懸濁型バイオリアクターの欠点の一部を克服する可能性があることが示された（例えば、Ｂｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１４）。具体的には、低光強度で多孔質基材バイオリアクターを利用して、ヘマトコッカス・プルビアリスのバイオフィルム内での増殖が成功した（Ｗａｎ ｅｔ ａｌ． ２０１４； Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ． ２０１５； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１４）。アスタキサンチン形成は、ゾル−ゲル法による固定化された生微細藻類においても報告されている（Ｆｉｅｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ ２００７）。
【発明の概要】
【0007】
本発明の目的は、高光強度を利用し、１段階の手順でのヘマトコッカスのバイオフィルム（固定化）培養を使用して、バイオマス生産性を増加させ、アスタキサンチン生産を誘導及び増加させることによる、改善されたアスタキサンチン生産を提供することである。本発明のさらなる目的は、従来の２段階手順の欠点を回避することである。
【0008】
本発明の根底にある前記目的は、基材を用意する工程、
前記基材表面上にヘマトコッカスを配置する工程、及び
前記基材上に配置されたヘマトコッカスを培養プロセスの開始から高光強度に暴露する工程、ただし
前記ヘマトコッカスを低光エネルギーに暴露して初期培養を行う第１段階と、その後に前記第１段階で適用されたものよりも高い光エネルギーに前記ヘマトコッカスを暴露してアスタキサンチン合成を誘導することにより前記ヘマトコッカスを引き続き培養する第２段階とを含むヘマトコッカスの２段階培養プロセスを行わないこと、
を含み、さらに
培養されたヘマトコッカスを回収する工程、及び／又は
前記アスタキサンチンを単離する工程、
を所望により含む、アスタキサンチン製造のためのヘマトコッカスの培養方法によって解決される。
【0009】
本発明は、低光量暴露の下、第１段階（グリーンフェーズ）で十分な量のヘマトコッカス細胞集団を作製し、十分な量の細胞集団の形成後に、高光強度でアスタキサンチン形成を誘導することは必須ではないという予想外の発見に基づいている。
【0010】
従来の２段階の培養によるヘマトコッカス、特にヘマトコッカス・プルビアリスの培養とは対照的に、本発明の製造方法は、特にバイオフィルムフォトバイオリアクターを適用することで維持費及び回収費を低減するとともに、バイオマス及びアスタキサンチンの両方を、高光強度下で１段階で培養することを可能にする。
【0011】
本発明において、高光強度という用語は、当業者には、相対的な用語としてではなく、具体的な用語として理解され、例えば、少なくとも約１５０、２００、２５０又は５００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上に相当する。
【0012】
ストレス因子とは、ヘマトコッカス、特にヘマトコッカス・プルビアリスにおけるアスタキサンチン生産を誘導する、例えば１５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１超の光強度、塩分（０．８％ＮａＣｌ）、３０℃を超える温度、及び栄養飢餓（特に窒素及びリン、ただし他の欠乏も関与し得る）などの環境的影響である。特に、本明細書に記載のようにバイオフィルム内で増殖したヘマトコッカス、特にヘマトコッカス・プルビアリスの細胞内のアスタキサンチン含量は、高光強度に加えて、窒素源又はリン源を含有しない培地に細胞を曝した場合、さらに約５０％増加し得る。同じ設定において、成長表面当たりの総アスタキサンチン生産性は、窒素欠乏及び／又はリン欠乏の適用によって、さらに最大約１５％増加し得る。
【0013】
ヘマトコッカス・プルビアリスの培養に使用される光は、通常、３００ｎｍ〜７８０ｎｍのＵＶ及び可視域の光である。
【0014】
高光強度（約１，０００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１）でのヘマトコッカス・プルビアリスのバイオマス生産に関していくつかのデータが存在するが、アスタキサンチンの蓄積は少なく、高光強度と栄養制限とが組み合わされた場合にしか起こらない（Ｄｅｌ Ｒｉｏ ｅｔ ａｌ． ２００５； Ｇａｒｃｉａ−Ｍａｌｅａ Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ． ２００６）。本発明によれば、全培養プロセスを、高強度の（自然）照明の下で１段階で実行可能であり、さらに、回収方法に応じて、高いバイオマス生産性、高いアスタキサンチン含量、及び高いアスタキサンチン生産性を達成する連続的な生産プロセスのために最適化することができる。７８５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１の光強度で１０日間かけて、バイオマス生産性は乾燥物質で１６ｇ ｍ−２ｄ−１にも達し、アスタキサンチン含量は乾燥物質の２〜２．５％になり得る。すなわち、アスタキサンチン生産性は０．３９ｍｇ ｍ−２ｄ−１に達し得る。従来の２段階アプローチでは、第２段階、すなわちレッドフェーズについてのみで見た場合でも、これらの値はより低い傾向がある。Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）により確認されたように、両段階の期間全体を考慮に入れたより正確な計算ではさらに低くなるであろう。
【0015】
本発明の一実施形態では、ヘマトコッカスはヘマトコッカス・プルビアリスである。本発明はヘマトコッカス・プルビアリスへ言及することよってより詳細に説明される。ヘマトコッカス・プルビアリスに関する本開示が、アスタキサンチンを生産できるヘマトコッカスの他の種に対しても有効であることは、当業者によって理解される。
【0016】
本発明の別の実施形態では、第１段階（グリーンフェーズ）における低光エネルギーは、約５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上約２００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１未満である。
【0017】
さらに別の実施形態では、第２段階（レッドフェーズ）におけるより高い光エネルギーは、約２００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上であり、特に、約５００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上である。
【0018】
本発明の別の実施形態では、ヘマトコッカスは材料（基材）の表面上で培養される。
【0019】
本発明のさらに別の実施形態では、前記材料はシート状の材料である。
【0020】
本発明の別の実施形態では、前記シート状の材料は多孔質である。
【0021】
本発明の別の実施形態では、前記シート状の材料は、紙、セルロースエステル、特に酢酸セルロース、セルロース混合エステル、セルロース、硝酸セルロース、ポリアミド、ポリエステル及び／又はポリオレフィンからなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【発明を実施するための形態】
【0023】
国際公開第２００５／０１０１４０号には、バイオフィルム中の微細藻類の培養、微細藻類の増殖、及びアスタキサンチンの回収の特に有用な方法が記述されており、具体的には、本発明で使用される多孔質基材が記述されている。この参考文献は参照によって援用される。図１には、種々の光及びＣＯ２条件下で生物膜において微細藻類を培養するための、Ｓｃｈｕｌｔｚｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）に提案されたような、実験室規模の二層試験管、ａｌｇ（固定化された微細藻類）、ｐｃｍ（微細藻類の担体としてのポリカーボネート膜）、ｇｆ（グラスファイバーマット）、空気供給用の空気膜ポンプ、ｃｍ（培地）が図示されている。国際公開第２００５／０１０１４０号に記載された原理を実現する、多孔質基材バイオリアクターの他の実験室規模の変更形態が、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）；Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．（２０１２）；Ｎｏｗａｃｋ ｅｔ ａｌ．（２００５））により報告されており、これらは参照によって援用される。
【0024】
バイオフィルム培養用の数平方メートルに達する基材表面を提供する、この特定技術のスケールアップされた発展がＮａｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）及びＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）により報告されており、これらは全て参照によって援用される。
【0025】
ヘマトコッカス・プルビアリスは、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）、Ｗａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）及びＹｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）によって提案されたデバイスを利用して、低光強度で、多孔質基材バイオリアクターを用いて増殖された。これらは全て参照によって援用される。
【0026】
多孔質基材バイオリアクターのこれらの変更形態においてヘマトコッカス・プルビアリスを培養する代わりに、ヘマトコッカス・プルビアリスは、２つの主面（ｍａｊｏｒ ｓｕｒｆａｃｅ）を示さない他の基材上のバイオフィルムに固定化して増殖可能である。これは、プラスチック製又はコンクリート製の構造物などであってよく、これらにバイオフィルムの表面に付与される培地が供給される。
【0027】
これらの培養方法を用いて、ヘマトコッカス・プルビアリスを培養し、高光強度に供することができる。
【0028】
図２は、後述の実施例１に記載の実験における、５％のＣＯ２補充下での種々の光レベルにおけるヘマトコッカス・プルビアリスの培養を示している。４５μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１（懸濁培養のグリーンフェーズと同等）の低光強度ではアスタキサンチン生産は達成されず、中程度のバイオマス生産性が達成されるのみである。約５３０及び７８５μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１の高光強度ではバイオマス及びアスタキサンチン生産性が並行して増加した。このことは、（ｉ）高光強度によるアスタキサンチン誘導は、懸濁型バイオリアクターで観察されるように増殖を妨げないこと、及び、（ｉｉ）アスタキサンチンの生産は連続的１段階プロセスで行うことができ、非生産的な（グリーン）増殖段階を経ずにすむこと、を示している。最も高いアスタキサンチンの生産性は７８５μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１で達成された。高光強度は約０．３９ｇ ｍ−２ｄ−１の総アスタキサンチン生産性を誘導し、これは実験期間中は直線的であり、増殖１０日後には３．３ｇ ｍ−２に達した。より長い培養期間では、アスタキサンチンは４ｇ ｍ−２を超えることができ、１，０１３μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１というより高い光強度でも、アスタキサンチン生産性は０．３２ｇ ｍ−２ｄ−１にも達する（データ未記載）。本発明による１段階の系に対して生産性を比較するために、仮定上の２段階のシナリオを構築した。
【0029】
図３は、光が適用される唯一のストレス因子である場合の１段階アプローチ及び２段階アプローチの効率を比較するために、本明細書に示される１６日間の１段階プロセスと、各々８日間の「グリーンフェーズ」及び「レッドフェーズ」を組み合わせたＰＳＢＲ２段階プロセスとの比較における、ヘマトコッカス・プルビアリスのバイオマス（ｇ ｍ−２±ＳＤ、ｎ＝３；図３Ａ）及び総アスタキサンチン（ｇ ｍ−２±ＳＤ、ｎ＝３；図３Ｂ）生産性を比較している。１段階アプローチは１，０００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１への１６日間の暴露（黒色の四角）からなり、一方、２段階アプローチは９０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１の８日間と１，０００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２の８日間とからなった（灰色の四角）。垂直の点線は、２段階アプローチでいつ光強度が切り替えられたかを示している。明暗サイクルは１４時間／１０時間であり、培養期間全体を通じて５％ＣＯ２を補充して通気が行われた。バイオマスは培養の各段階で直線的に増加したが、速度は大きく異なっていた（図３Ａ）。低光強度では５．４ｇ ｍ−２ｄ−１の増殖速度が観察され、高光強度に切り替えられると増殖速度は１７．２ｇ ｍ−２ｄ−１に増加した。この値は、１段階アプローチで直接１，０００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１に曝された培養の最初の８日間で得られた値と類似していた。また、８日目の現存量は、２段階アプローチの４８．２ｇ ｍ−２と比較すると、１段階アプローチでは３倍高く、その値は１４６ｇ ｍ−２であった。総アスタキサンチン値を解析した場合も類似の傾向が得られた。すなわち、２段階群における蓄積は高光強度でのみ起こり、１段階群の最初の８日間で観察された蓄積と同様の速度で起こった（それぞれ、０．３４ｇ ｍ−２ｄ−１及び０．３５ｇ ｍ−２ｄ−１）（図８Ｂ）。８日目のアスタキサンチン生産量は、１，０００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１で２．５ｇ ｍ−２、及び９０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１で０．０８ｇ ｍ−２であり、３２倍の増加がもたらされた。この差は高光強度への暴露後に消失し、アスタキサンチン生産は１６日目には両群で２．８ｇ ｍ−２に達した。しかし、２段階の系では、１段階アプローチの２倍の期間を必要とした。以上から、高照射量の効果は暴露の開始時点とは無関係であった。すなわち、低光強度のグリーンフェーズを用いると、同様の生産量に達するためにより長い培養期間を要し高い生産性を妨げた。これはコスト及び汚染リスクを増大させる。
【0030】
本発明によれば、培養後、ヘマトコッカス・プルビアリスは、物質を吹き飛ばすためのエアブレード若しくは他の適切なツールによる掻き取りや剥離等の機械的外力の作用によって、又は、界面活性剤処理及び／若しくは有機溶剤処理等の化学的処理によって、支持体、特に有孔の支持体から外すことができる。
【0031】
別の実施形態では、ヘマトコッカス・プルビアリスは、有孔の支持体と一緒に回収することができる。これは、例えば抽出によって成分を得るためにヘマトコッカス・プルビアリスが支持体上に残ったまま分解される場合に実用的であり得る。抽出されたヘマトコッカス・プルビアリス又は細胞片は、支持体と一緒に、抽出物から機械的に分離することができる。
【0032】
さらに別の実施形態では、（低）体積の液体（例えば水、培地）を用いて、固定化されたヘマトコッカス・プルビアリスを有孔の支持体から洗い出し、さらなる処理（アスタキサンチンの濃縮、乾燥、及び／又は抽出）のためのヘマトコッカス・プルビアリスの高濃度懸濁液を得ることができる。あるいは、流動培地中で外れたバイオマスを収集してヘマトコッカス・プルビアリスを得てもよい。
【0033】
具体的には、ヘマトコッカス・プルビアリスは、乾燥後に支持体から外してもよく、その後に収集してもよい。
【0034】
別の実施形態では、ヘマトコッカス・プルビアリスは、支持体から外され、乾燥後、若しくは乾燥せずに、又はアスタキサンチンの抽出を行わずに、使用され得る。
【0035】
さらなる別の実施形態では、ヘマトコッカス・プルビアリスが基材上に残っており、アスタキサンチンが化学薬品によりヘマトコッカス・プルビアリスから取り出される場合、アスタキサンチンの抽出は化学薬品（例えば溶媒、特に有機溶剤）での処理により行われ得る。
【0036】
具体的には、乾燥又は濃縮したヘマトコッカス・プルビアリス細胞からのアスタキサンチンの抽出は、塩酸の前処理とその後のアセトン抽出、ヘキサン／イソプロパノール混合物溶媒抽出、メタノール抽出とその後のアセトン抽出、又はダイズ油若しくはパーム油等の他の天然油などの、有機溶剤を利用する方法（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）により行われ得る。アスタキサンチンはさらに、ヘマトコッカス・プルビアリス細胞の破砕後に二酸化炭素を用いる超臨界抽出（例えば、Ｎｏｂｒｅ ｅｔ ａｌ．， ２００６）を行うことによって得ることができる。
【実施例】
【0037】
本発明を以下の非限定的な実施例によって説明する。
【0038】
実施例１実験設計
ベンチスケールのバイオフィルムフォトバイオリアクター
使用されたベンチスケールの二層フォトバイオリアクター（ＰＢＲ）は、Ｓｃｈｕｌｔｚｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）（参照によって援用される）に記載されたものであった。概要としては、この系は、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）製支持体上の透明なＰＭＭＡ管（長さ５０ｃｍ、直径１２ｃｍ）内に垂直に設置されたグラスファイバーマット（５０×１０ｃｍ）からなる。培地が蠕動ポンプ（ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ ｐｕｍｐ）によって一定に循環されている。培地はグラスファイバーの頂部から付与され、重力により下に拡散し、ＰＶＣ支持体内に設置された培地貯留槽に戻る。この系には１Ｌの培地が供給され、藻類の成長用の栄養が制限されることを防ぐため２〜３日毎に交換される。通気はＰＶＣ管内に供給される。
【0039】
バイオリアクターの播種用に、Ｎａｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）（参照によって援用される）に記載されるように、ヘマトコッカス・プルビアリス懸濁培養液を濃縮し、次いでポリカーボネート膜（ＰＣ４０、孔径０．４μｍ、直径２５ｍｍ、ワットマン社（Ｗｈａｔｍａｎ）、ダッセル、ドイツ）上で濾過して、５ｇ ｍ−２の初期バイオマス密度を得た。その後、フィルターをＰＢＲ上の濡れたグラスファイバーマット上に配置した。
【0040】
１段階アプローチ用に、栄養分に富んだ培地を実験期間の全体にわたって使用し、様々な光強度を評価した。比較用に、低光強度での２段階実験を行った。増殖のため始めは完全培地を使用した。６日後、培地を変更することで、すなわち、窒素源を除去、及び／又は塩を追加（０．８％）することで、ストレスを誘導した。
【0041】
サンプリング及び乾燥重量の測定各サンプリング時点において、少なくとも３枚のフィルターを各ＰＢＲから採取した。播種領域を超えて増殖したバイオマスを除去し、フィルターを凍結乾燥して恒量とした。乾燥重量を重量測定法で求め、アスタキサンチン解析までバイオマスを−２０℃で保存した。
【0042】
アスタキサンチン測定アスタキサンチンをＬｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２）に記載されるように分光測定した。凍結乾燥されたバイオマス試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、メルク社、ダルムシュタット、ドイツ）で抽出し、７０℃で５分間インキュベートし、次いで４０００Ｇで５分間遠心した。無色のペレットが得られるまで抽出を繰り返した。上清を集め、５３０ｎｍでＯＤを測定した（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００プレートリーダー、テカン社（Ｔｅｃａｎ）、メンネドルフ、スイス）。完全な抽出に必要な場合、砂ですりつぶして細胞を破砕した。ＤＭＳＯに溶解及び希釈したアスタキサンチン標準物質（純度９８．６％、ドクトル・エレンストルファー社（Ｄｒ． Ｅｈｒｅｎｓｔｏｒｆｅｒ）、アウクスブルク、ドイツ）を用いて作成した検量線に基づいて、アスタキサンチン濃度を決定した。
【0043】
さらに、微細藻類の増殖を促進するのに適する他の人工又は天然培地も、ヘマトコッカス・プルビアリス培養に使用することができる。
【0044】
補充のＣＯ２は特に高光強度条件下でバイオマス成長を促進するのに有利であるが、必須ではない。
【0045】
光源は、通常は人工照明でも太陽光の使用としてもよいが、経済的な理由から太陽光の使用が好ましい場合がある（特に、高強度が求められる場合）。
【0046】
参考文献Aflalo C, Meshulam Y, Zarka A, Boussiba S (2007) On the Relative Efficiency of Two- vs. One-stage Production of Astaxanthin by the Green Alga Haematococcus pluvialis. Biotechnol Bioeng 98: 300-305. doi: 10.1002/bit.21391
Berner F, Heimann K, Sheehan M (2014) Microalgal biofilms for biomass production. J Appl Phycol. doi: 10.1007/s10811-014-0489-x
Del Rio E, Acien FG, Garcia-Malea MC, et al (2005) Efficient one-step production of astaxanthin by the microalga Haematococcus pluvialis in continuous culture. Biotechnol Bioeng 91: 808-815. doi: 10.1002/bit.20547
Dong, S., Huang, Y., Zhang, R., Wang, S., & Liu, Y. (2014). Four Different Methods Comparison for Extraction of Astaxanthin from Green Alga Haematococcus pluvialis, 2014
Fiedler, D., Hager, U., Franke, H., Soltmann, U., Bottcher, H., (2007) Algae biocers: astaxanthin formation in sol-gel immobilised living microalgae. J. Mater. Chem. 2007, 17, 261-266
Garcia-Malea LopezMC, Sanchez EDR, Casas Lopez JL, et al (2006) Comparative analysis of the outdoor culture of Haematococcus pluvialis in tubular and bubble column photobioreactors. J Biotechnol 123: 329-342. doi: 10.1016/j.jbiotec.2005.11.010
Li Y, Miao F, Geng Y, et al (2012) Accurate quantification of astaxanthin from Haematococcus crude extract spectrophotometrically. Chinese J Oceanol Limnol 30: 627-637. doi: 10.1007/s00343-012-1217-5
Liu T, Wang J, Hu Q, et al (2013) Attached cultivation technology of microalgae for efficient biomass feedstock production. Bioresour Technol 127: 216-222. doi: 10.1016/j.biortech.2012.09.100
Lorenz RT, Cysewski GR (2000) Commercial potential for Haematococcus microalgae as a natural source of astaxanthin. Trends Biotechnol 18: 160- 167.
Murphy T, Fleming E, Bebout L, et al (2012) A Novel Microbial Cell Cultivation Platform for Space Applications. In: 1st Annual International Space Station Research and Develop- ment Conference. Denver, CO: American Astronomical Society (AAS). pp 335-339
Naumann T, Cebi Z, Podola B, Melkonian M (2013) Growing microalgae as aquaculture feeds on twin-layers: a novel solid-state photobioreactor. J Appl Phycol 25: 1413-1420. doi: 10.1007/s10811-012-9962-6
Nguyen K (2013) Astaxanthin: a comparative case of synthetic vs. natural production. Chem Biomol Eng Publ Other Work 1: 1-11.
Nobre, B., Marcelo, F., Passos, R., Beirao, L, Palavra, A., Gouveia, L, & Mendes, R. (2006). Supercritical carbon dioxide extraction of astaxanthin and other carotenoids from the microalga Haematococcus pluvialis. European Food Research and Technology, 223, 787-790. Retrieved from http://dx.doi .org/10.1007/s00217-006-0270-8
Nowack ECM, Podola B, Melkonian M (2005) The 96-well Twin-Layer system: A novel approach in the cultivation of microalgae. Protist 156: 239-251. doi: 10.1016/j.protis.2005.04.003
Olivieri G, Salatino P, Marzocchella A (2014) Advances in photobioreactors for intensive microalgal production: configurations, operating strategies and applications. J Chem Technol Biotechnol 89: 178-195. doi: 10.1002/jctb.4218
Ozkan A, Kinney K, Katz L, Berberogiu H (2012) Reduction of water and energy requirement of algae cultivation using an algae biofilm photobioreactor. Bioresour Technol 114: 542-8. doi: 10.1016/j.biortech.2012.03.055
Schultze LKP, Simon M-V, Li T, et al (2015) High light and carbon dioxide optimize surface productivity in a Twin-Layer biofilm photobioreactor. Algal Res 8C: 37-44. doi: 10.1016/j. algal.2015.01.007
Suh IS, Joo H-N, Lee C-G (2006) A novel double-layered photobioreactor for simultaneous Haematococcus pluvialis cell growth and astaxanthin accumulation. J Biotechnol 125: 540-6. doi: 10.1016/j.jbiotec.2006.03.027
Wan M, Hou D, Li Y, et al (2014) The effective photoinduction of Haematococcus pluvialis for accumulating astaxanthin with attached cultivation. Bioresour Technol 163C: 26-32. doi: 10.1016/j. biortech.2014.04.017
Wang J, Sommerfeld MR, Lu C, Hu Q (2013) Combined effect of initial biomass density and nitrogen concentration on growth and astaxanthin production of. Algae 28: 193-202.
Yin S, Wang J, Chen L, Liu T (2015) The water footprint of biofilm cultivation of Haematococcus pluvialis is greatly decreased by using sealed narrow chambers combined with slow aeration rate. Biotechnol Lett, doi: 10.1007/s10529-015- 1864-7
Zhang L, Chen L, Wang J, et al (2015) Attached cultivation for improving the biomass productivity of Spirulina platensis. Bioresour Technol 181: 136-142. doi: 10.1016/j. biortech.2015.01.025
Zhang W, Wang JJ, Wang JJ, Liu T (2014) Attached cultivation of Haematococcus pluvialis for astaxanthin production. Bioresour Technol 158C: 329-335. doi: 10.1016/j. biortech.2014.02.044
【手続補正書】
【提出日】2021年4月30日
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
基材上でヘマトコッカスを高光強度における１段階プロセスでバイオフィルム培養して、バイオマス生産性を増加させると共にアスタキサンチンの生産を誘導及び増加させることを含み、前記高光強度が約２００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上である、アスタキサンチン生産を改善するためのプロセス。
【請求項2】
回収されたヘマトコッカスから前記アスタキサンチンが単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ヘマトコッカスがヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）である、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記基材がシート状の材料である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記基材が多孔質シートである、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記シート状の材料が、紙、セルロースエステル、セルロース、ポリアミド、ポリエステル、及びポリオレフィンからなる群から選択される、請求項４又は請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記セルロースエステルが、酢酸セルロース、セルロース混合エステル、及び硝酸セルロースからなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
培養期間中は１４時間／１０時間の明暗サイクル及び５％ＣＯ２を使用する、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
アスタキサンチン生産量が４ｇｍ−２を超える、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上２００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１未満である低光量への曝露が必須ではない、請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の方法。