特開 2021-106580 陽イオン性ポリマーおよび安定剤を用いる核酸トランスフェクションのための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2021-106580(P2021-106580A)

(43)【公開日】2021年7月29日

(54)【発明の名称】陽イオン性ポリマーおよび安定剤を用いる核酸トランスフェクションのための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/864 20060101AFI20210702BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/864 100Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】57

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

【全頁数】64

(21)【出願番号】特願2020-209897(P2020-209897)

(22)【出願日】2020年12月18日

(31)【優先権主張番号】62/950,464

(32)【優先日】2019年12月19日

(33)【優先権主張国】US

(71)【出願人】

【識別番号】593141953

【氏名又は名称】ファイザー・インク

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100107386

【弁理士】

【氏名又は名称】泉谷 玲子

(72)【発明者】

【氏名】ソーラバ・カント・バードワージ

(72)【発明者】

【氏名】チア・フン・チュウ

(57)【要約】      （修正有）

【課題】高いトランスフェクション効率を維持しながらＤＮＡ−陽イオン性ポリマー複合体を含有するトランスフェクションカクテルを長時間安定化するための組成物および方法を提供する。
【解決手段】細胞に１種類以上の核酸をトランスフェクションするための方法であって、以下の工程：
（ｉ）１種類以上の陽イオン性ポリマー、安定剤および１種類以上の核酸を含むトランスフェクションカクテルを調製し、
（ｉｉ）工程（ｉ）で調製されたトランスフェクションカクテルを、トランスフェクションされるべき細胞と接触させて混合物を形成し、そして
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）における混合物をインキュベートし、それにより該細胞に該１種類以上の核酸をトランスフェクションする；
を含む方法。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞に１種類以上の核酸をトランスフェクションするための方法であって、以下の工程：
（ｉ） １種類以上の陽イオン性ポリマー、安定剤および１種類以上の核酸を含むトランスフェクションカクテルを調製し、
（ｉｉ） 工程（ｉ）で調製されたトランスフェクションカクテルを、トランスフェクションされるべき細胞と接触させて混合物を形成し、そして
（ｉｉｉ） 工程（ｉｉ）における混合物をインキュベートし、それにより該細胞に該１種類以上の核酸をトランスフェクションする；
を含む方法。

【請求項2】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを産生する細胞を作製するための方法であって、以下の工程：
（ｉ） １種類以上の陽イオン性ポリマー、安定剤および１種類以上の核酸を含むトランスフェクションカクテルを調製し、
（ｉｉ） 工程（ｉ）で調製されたトランスフェクションカクテルをトランスフェクションされるべき細胞と接触させて混合物を形成し、そして
（ｉｉｉ） 工程（ｉｉ）の混合物をインキュベートし、それによりｒＡＡＶベクターを産生するトランスフェクションされた細胞を作製する；
を含む方法。

【請求項3】

１種類以上の核酸を有する細胞のトランスフェクションを増大させるための方法であって、以下の工程：
（ｉ）１種以上の陽イオン性ポリマー、安定剤および１種以上の核酸を含むトランスフェクションカクテルを調製し、
（ｉｉ） 工程（ｉ）で調製されたトランスフェクションカクテルを、トランスフェクションされるべき細胞と接触させて混合物を形成し、そして
（ｉｉｉ） 工程（ｉｉ）の混合物をインキュベートし、それにより該１種類以上の核酸を用いる細胞のトランスフェクションが、該安定剤の非存在下であること以外同じ条件下で実施される該細胞のトランスフェクションと比較して増大する；
を含む方法。

【請求項4】

高力価組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを生産するための方法であって、以下の工程：
（ｉ） １種類以上の陽イオン性ポリマー、安定剤および１種類以上の核酸を含むトランスフェクションカクテルを調製し、
（ｉｉ） 工程（ｉ）で調製されたトランスフェクションカクテルをトランスフェクションされるべき細胞と接触させて混合物を形成し、
（ｉｉｉ） 工程（ｉｉ）の混合物をインキュベートしてｒＡＡＶベクターを産生するトランスフェクトされた細胞を作製し、そして
（ｉｖ） 工程（ｉｉｉ）で生産されたトランスフェクションされた細胞からｒＡＡＶベクターを単離および／または精製する；
を含み、
ここにおいて、工程（ｉ）の開始〜工程（ｉｉ）の完了の時間が、１０秒よりも長く、かつここで、ｒＡＡＶ力価が、該安定剤の非存在下であること以外同じ条件下でもたらされるｒＡＡＶ力価と比較して、少なくとも２倍、かつ／または少なくとも５％増大する、
前記方法。

【請求項5】

請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、工程（ｉ）の開始〜工程（ｉｉ）の完了の時間が、約１０秒〜約１０日である方法。

【請求項6】

請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法であって、工程（ｉ）の開始〜工程（ｉｉ）の完了の時間が、１０分より長い方法。

【請求項7】

請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、工程（ｉ）のトランスフェクションカクテルが、工程（ｉｉ）の前に約１０秒〜約１０日、約１５秒〜約５日、約３０秒〜約２日、約６０秒〜約１日、約９０秒〜約１０時間、約９０秒〜約８時間、約２分〜約４時間、約４分〜約２時間、約６分〜約１時間または約１０分〜約３０分インキュベートされる方法。

【請求項8】

請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法であって、該トランスフェクションカクテルが、まず該１種類以上の陽イオン性ポリマーを該安定剤と混合して結果として生じる混合物を形成し、次いでそれが該１種類以上の核酸に添加される、ことによって調製される方法。

【請求項9】

請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法であって、該トランスフェクションカクテルが、まず該安定剤を該１種類以上の核酸と混合して結果として生じる混合物を形成し、次いでそれが該１種類以上の陽イオン性ポリマーに添加される、ことによって調製される方法。

【請求項10】

請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法であって、該トランスフェクションカクテルが、まず該１種類以上の陽イオン性ポリマーを該１種類以上の核酸と混合して結果として生じる混合物を形成し、次いでそれが該安定剤に添加される、ことによって調製される方法。

【請求項11】

請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法であって、該細胞が、工程（ｉｉ）において該トランスフェクションカクテルと接触させられる際に、少なくとも１×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも２×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも４×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも６×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも８×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも０．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも１×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも２×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも６×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも８×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも１０×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも１２×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも１４×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも１６×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも１８×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも２０×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも２２×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも２４×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも２６×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも２８×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも３０×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも３２×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも３４×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも３６×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも３８×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも４０×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも４２×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも４４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４６×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４８×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも５０×１０^６細胞／ｍＬまたは少なくとも５２×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度である方法。

【請求項12】

請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法であって、該１種類以上の陽イオン性ポリマーが、細胞１００万個あたり約０．０５μｇ、細胞１００万個あたり約０．１μｇ、細胞１００万個あたり約０．２μｇ、細胞１００万個あたり約０．４μｇ、細胞１００万個あたり約０．６μｇ、細胞１００万個あたり約０．８μｇ、細胞１００万個あたり約１．０μｇ、細胞１００万個あたり約１．５μｇ、細胞１００万個あたり約２μｇ、細胞１００万個あたり約２．１μｇ、細胞１００万個あたり約２．２μｇ、細胞１００万個あたり約２．３μｇ、細胞１００万個あたり約２．４μｇ、細胞１００万個あたり約２．５μｇ、細胞１００万個あたり約２．６μｇ、細胞１００万個あたり約２．７μｇ、細胞１００万個あたり約２．８μｇ、細胞１００万個あたり約２．９μｇ、細胞１００万個あたり約３．０μｇ、細胞１００万個あたり約３．５μｇ、細胞１００万個あたり約４．０μｇ、細胞１００万個あたり約４．５μｇ、細胞１００万個あたり約５μｇ、細胞１００万個あたり約５．５μｇ、細胞１００万個あたり約６．０μｇ、細胞１００万個あたり約６．５μｇ、細胞１００万個あたり約７．０μｇ、細胞１００万個あたり約７．５μｇ、細胞１００万個あたり約８．０μｇ、細胞１００万個あたり約１０μｇの量で使用される方法。

【請求項13】

請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法であって、該トランスフェクションカクテル中の安定剤の量が、該１種類以上の陽イオン性ポリマーの量と比較して、約１％、約２％、約２．５％、約５％、約７．５％、約１０％、約１２．５％、約１５％、約１７．５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約９０％、約１００％、約２００％、約３００％、約４００％または約５００％である方法。

【請求項14】

請求項１３に記載の方法であって、該細胞が、工程（ｉｉ）において該トランスフェクションカクテルと接触させられる際に低い（例えば約１８×１０^６細胞／ｍＬ未満の）細胞密度であり、かつ該トランスフェクションカクテル中の該安定剤の量が、該１種類以上の陽イオン性ポリマーの量と比較して約７．５％〜約１０％である方法。

【請求項15】

請求項１３に記載の方法であって、該細胞が、工程（ｉｉ）において該トランスフェクションカクテルと接触させられる際に高い（例えば約１８×１０^６細胞／ｍＬより大きい）細胞密度であり、かつ該トランスフェクションカクテル中の安定剤の量が、該１種類以上の陽イオン性ポリマーの量と比較して約１５％〜約３０％である方法。

【請求項16】

請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法であって、該１種類以上の核酸が、細胞１００万個あたり約０．０５μｇ、細胞１００万個あたり約０．１μｇ、細胞１００万個あたり約０．２μｇ、細胞１００万個あたり約０．４μｇ、細胞１００万個あたり約０．５μｇ、細胞１００万個あたり約０．６μｇ、細胞１００万個あたり約０．８μｇ、細胞１００万個あたり約１．０μｇ、細胞１００万個あたり約１．５μｇ、細胞１００万個あたり約２．０μｇ、細胞１００万個あたり約２．５μｇ、細胞１００万個あたり約３．０μｇ、細胞１００万個あたり約３．５μｇ、細胞１００万個あたり約４．０μｇ、細胞１００万個あたり約４．５μｇ、細胞１００万個あたり約５μｇ、細胞１００万個あたり約５．５μｇ、細胞１００万個あたり約６．０μｇ、細胞１００万個あたり約６．５μｇ、細胞１００万個あたり約７．０μｇ、細胞１００万個あたり約７．５μｇ、細胞１００万個あたり約８．０μｇ、細胞１００万個あたり約８．５μｇ、細胞１００万個あたり約９．０μｇ、細胞１００万個あたり約９．５μｇまたは細胞１００万個あたり約１０μｇで使用される方法。

【請求項17】

請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、工程（ｉｉｉ）における混合物が、トランスフェクションされた細胞を作製するために約１５分〜約１５０時間インキュベートされる方法。

【請求項18】

請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法であって、該１種類以上の陽イオン性ポリマーが、キトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリアミン（ＰＡ）、ポリアルキレンイミン（ＰＡＩ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ［ａ−（−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸］、キトサン、ポリアミドアミンおよびポリ（２−ジメチルアミノ）エチル メタクリレートからなる群から選択される方法。

【請求項19】

請求項１８に記載の方法であって、該陽イオン性ポリマーが、分枝状または線状である方法。

【請求項20】

請求項１９に記載の方法であって、該陽イオン性ポリマーが、遊離塩基形態で約５００Ｄａ〜約１６０，０００Ｄａおよび／または約２，５００Ｄａ〜約２５０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する方法。

【請求項21】

請求項２０に記載の方法であって、該１種類以上の陽イオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である方法。

【請求項22】

請求項２１に記載の方法であって、該陽イオン性ポリマーが、遊離塩基形態で約４０，０００Ｄａおよび／または約２２，０００Ｄａの分子量を有する加水分解された線状ＰＥＩを含む方法。

【請求項23】

請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法であって、該安定剤が、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分をグラフトされた陽イオン性ポリマーを含む方法。

【請求項24】

請求項２３に記載の方法であって、該ＰＥＧが、約２５０Ｄａ〜３５，０００Ｄａの分子量を有する方法。

【請求項25】

請求項２４に記載の方法であって、該安定剤が、約２５０Ｄａ〜約３５，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧがグラフトされた約２，０００Ｄａ〜約６０，０００Ｄａの分子量を有する分枝状ＰＥＩを含む方法。

【請求項26】

請求項２５に記載の方法であって、該安定剤が、約５，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧがグラフトされた約２５，０００Ｄａの分子量を有する分枝状ＰＥＩを含む方法。

【請求項27】

請求項２６に記載の方法であって、陽イオン性ポリマーの１分子あたりにグラフトされたＰＥＧ部分の数が、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはより多い方法。

【請求項28】

請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法であって、該１種類以上の核酸分子が、（ａ）ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸および／もしくはヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１種類以上のプラスミドならびに／または（ｂ）対象の導入遺伝子をコードする核酸を含むプラスミドを含む方法。

【請求項29】

請求項２８に記載の方法であって、（ａ）の１種類以上のプラスミドが、ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸を含む第１プラスミドおよびヘルパータンパク質をコードする核酸を含む第２プラスミドを含む方法。

【請求項30】

請求項２８〜２９のいずれか１項に記載の方法であって、該コードされたＡＡＶパッケージングタンパク質が、ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはＡＡＶ ｃａｐタンパク質を含む方法。

【請求項31】

請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の方法であって、コードされたヘルパータンパク質が、アデノウイルスＥ２および／もしくはＥ４、ＶＡＲＮＡタンパク質ならびに／または非ＡＡＶヘルパータンパク質を含む方法。

【請求項32】

請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の方法であって、該導入遺伝子が、野生型または機能性バリアント血液凝固因子、ミニジストロフィン、Ｃ１エステラーゼ阻害因子、銅輸送Ｐ型ＡＴＰアーゼ（ＡＴＰ７Ｂ）または銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）をコードしている方法。

【請求項33】

請求項１〜３、５〜３２のいずれか１項に記載の方法であって、さらに工程（ｉｉｉ）で生産されたトランスフェクションされた細胞からｒＡＡＶベクターを単離および／または精製する工程（ｉｖ）を含む方法。

【請求項34】

請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法であって、該１種類以上の核酸による該細胞のトランスフェクションが、該安定剤の非存在下であること以外同じ条件下で実施される該細胞のトランスフェクションと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％または少なくとも５０％増加する方法。

【請求項35】

請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法であって、該トランスフェクションされた細胞から単離／精製されるｒＡＡＶベクターの量が、該安定剤の非存在下であること以外同じ条件下でトランスフェクションされた細胞から単離／精製されるｒＡＡＶベクターの量と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％もしくは少なくとも５０％またはより大きく増加する方法。

【請求項36】

請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法であって、該トランスフェクションされた細胞から単離／精製されるｒＡＡＶベクターの量が、該安定剤の非存在下であること以外同じ条件下でトランスフェクションされた細胞から単離／精製されるｒＡＡＶベクターの量と比較して、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも８０倍、少なくとも１００倍またはより大きく増加する方法。

【請求項37】

請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法であって、該ｒＡＡＶ力価が、該安定剤の非存在下であること以外同じ条件下でもたらされるｒＡＡＶ力価と比較して、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも８０倍、少なくとも１００倍またはより大きく増大する方法。

【請求項38】

請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法であって、該ｒＡＡＶ力価が、該安定剤の非存在下であること以外同じ条件下でもたらされるｒＡＡＶ力価と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％もしくは少なくとも５０％またはより大きく増大する方法。

【請求項39】

請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法であって、該細胞が、哺乳類細胞、酵母細胞または昆虫細胞を含む方法。

【請求項40】

請求項３９に記載の方法であって、該細胞が、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または昆虫由来のＳｆ９細胞である方法。

【請求項41】

請求項４０に記載の方法であって、該細胞が、ＨＥＫ ２９３Ｅ、ＨＥＫ ２９３ＦまたはＨＥＫ ２９３Ｔ細胞である方法。

【請求項42】

請求項４１に記載の方法であって、該ＨＥＫ ２９３細胞が、懸濁状態での無血清増殖に適応している方法。

【請求項43】

請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法であって、該細胞が、安定的に、または一過性にトランスフェクションされる方法。

【請求項44】

請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法であって、該細胞が、懸濁培養状態である、または接着性である方法。

【請求項45】

請求項１〜４４のいずれか１項に記載の方法であって、該細胞が、ローラーボトルまたは拡張されたローラーボトル中で増殖する、または維持される方法。

【請求項46】

請求項１〜４４のいずれか１項に記載の方法であって、該細胞が、バイオリアクター（例えばＷＡＶＥバイオリアクター、撹拌槽バイオリアクター）、バッグまたはフラスコ中で増殖させられる方法。

【請求項47】

１種類以上の陽イオン性ポリマーおよび安定剤を含む組成物。

【請求項48】

請求項４９に記載の組成物であって、さらに１種類以上の核酸および／または細胞を含む組成物。

【請求項49】

安定剤および１種類以上の核酸を含む組成物。

【請求項50】

請求項４９に記載の組成物であって、さらに１種類以上の陽イオン性ポリマーおよび／または細胞を含む組成物。

【請求項51】

１種類以上の陽イオン性ポリマー、安定剤、１種類以上の核酸および細胞を含む組成物。

【請求項52】

請求項４７〜４８、５０〜５１のいずれか１項に記載の組成物であって、該１種類以上の陽イオン性ポリマーの量が、約０．０１μｇ、約０．０２μｇ、約０．０４μｇ、約０．０６μｇ、約０．０８μｇ、約１．０μｇ、約１．２μｇ、約１．４μｇ、約１．６μｇ、約１．８μｇ、約２．０μｇ、約２．２μｇ、約２．４μｇ、約２．６μｇ、約２．８μｇ、約３．０μｇ、約３．２μｇ、約３．４μｇ、約３．６μｇ、約３．８μｇ、約４．０μｇ、約４．２μｇ、約４．６μｇ、約４．８μｇ、約５．０μｇ、約５．５μｇ、約６．０μｇ、約６．５μｇ、約７μｇ、約７．５μｇ、約８．０μｇ、約８．５μｇ、約９．０μｇ、約９．５μｇ、約１０μｇ、約１２μｇ、約１４μｇ、約１６μｇ、約１８μｇ、約２０μｇ、約４０μｇ、約６０μｇ、約８０μｇ、約１００μｇ、約０．１ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約４ｍｇ、約６ｍｇ、約８ｍｇまたは約１０ｍｇである組成物。

【請求項53】

請求項４７〜５２のいずれか１項に記載の組成物であって、該安定剤の量が、約０．０１μｇ、約０．０２μｇ、約０．０４μｇ、約０．０６μｇ、約０．０８μｇ、約１．０μｇ、約１．２μｇ、約１．４μｇ、約１．６μｇ、約１．８μｇ、約２．０μｇ、約２．２μｇ、約２．４μｇ、約２．６μｇ、約２．８μｇ、約３．０μｇ、約３．２μｇ、約３．４μｇ、約３．６μｇ、約３．８μｇ、約４．０μｇ、約４．２μｇ、約４．６μｇ、約４．８μｇ、約５．０μｇ、約５．５μｇ、約６．０μｇ、約６．５μｇ、約７μｇ、約７．５μｇ、約８．０μｇ、約８．５μｇ、約９．０μｇ、約９．５μｇ、約１０μｇ、約１２μｇ、約１４μｇ、約１６μｇ、約１８μｇ、約２０μｇ、約４０μｇ、約６０μｇ、約８０μｇ、約１００μｇ、約０．１ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約４ｍｇ、約６ｍｇ、約８ｍｇまたは約１０ｍｇである組成物。

【請求項54】

請求項４８〜５３のいずれか１項に記載の組成物であって、該１種類以上の核酸の量が、約０．０１μｇ、約０．０２μｇ、約０．０４μｇ、約０．０６μｇ、約０．０８μｇ、約１．０μｇ、約１．２μｇ、約１．４μｇ、約１．６μｇ、約１．８μｇ、約２．０μｇ、約２．２μｇ、約２．４μｇ、約２．６μｇ、約２．８μｇ、約３．０μｇ、約３．２μｇ、約３．４μｇ、約３．６μｇ、約３．８μｇ、約４．０μｇ、約４．２μｇ、約４．６μｇ、約４．８μｇ、約５．０μｇ、約５．５μｇ、約６．０μｇ、約６．５μｇ、約７μｇ、約７．５μｇ、約８．０μｇ、約８．５μｇ、約９．０μｇ、約９．５μｇ、約１０μｇ、約１２μｇ、約１４μｇ、約１６μｇ、約１８μｇ、約２０μｇ、約４０μｇ、約６０μｇ、約８０μｇ、約１００μｇ、約０．１ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約４ｍｇ、約６ｍｇ、約８ｍｇまたは約１０ｍｇである組成物。

【請求項55】

請求項４８、５０〜５４のいずれか１項に記載の組成物であって、該細胞が、少なくとも１×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも２×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも４×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも６×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも８×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも０．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも１×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも２×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも６×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも８×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも１０×１０^６細胞／ｍＬ。少なくとも１２×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも１４×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも１６×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも１８×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも２０×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも２２×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも２４×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも２６×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも２８×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも３０×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも３２×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも３４×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも３６×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも３８×１０^６細胞／ｍｌ。少なくとも４０×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも４２×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも４４×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも４６×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも４８×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも５０×１０^６細胞／ｍｌまたは少なくとも５２×１０^６細胞／ｍｌの細胞密度である組成物。

【請求項56】

約１２×１０^６細胞／ｍＬ、細胞１００万個あたり約２．２μｇの１種類以上の陽イオン性ポリマー、該１種類以上の陽イオン性ポリマーと比較して約１０％の安定剤および細胞１００万個あたり約１μｇの１種類以上の核酸を含む組成物。

【請求項57】

約２４×１０^６細胞／ｍＬ、細胞１００万個あたり約２．２μｇの１種類以上の陽イオン性ポリマー、該１種類以上の陽イオン性ポリマーと比較して約２５％の安定剤および細胞１００万個あたり約１μｇの１種類以上の核酸を含む組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、２０１９年１２月１９日に出願された米国仮出願第６２／９５０，４６４号の利益を主張し、それは、参照によりそのまま本明細書に援用される。

【0002】

本発明は、核酸（例えばプラスミド）を用いる細胞トランスフェクションの分野に関する。具体的には、本発明は、トランスフェクションされた細胞を生産するための組成物および方法に関し、前記の細胞は、場合により遺伝子療法に有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを産生する。

【背景技術】

【0003】

近年、ｒＡＡＶベクターを含む様々な生物療法分子を生産するための細胞の一過性トランスフェクションが、ペースを上げてきている。このアプローチは、典型的にはより長くより困難なプロセスを含む安定した細胞株の作製を必要としない予備研究および臨床試験両方のための大規模な材料の生産を可能にする。陽イオン性ポリマーのような様々なトランスフェクション試薬は、細胞をトランスフェクションする能力を有することが確認されている。陽イオン性ポリマー、例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、プラスミドＤＮＡと複合体（“ポリプレックス”と呼ばれる）を形成し、細胞に対する低い毒性を伴なって最も効率的に細胞をトランスフェクションすることができる。

【0004】

しかし、ポリプレックスの主な欠点は、コロイド安定性の欠如であり、それは、時間の経過と共に、特に高いＤＮＡ濃度において、ＤＮＡ−ＰＥＩ複合体の大きな粒子への凝集をもたらし、それによりそれらが細胞をトランスフェクションする能力を著しく損なう（例えばSharma et al., (2005) Mechanistic studies on aggregation of polyethylenimine-DNA complexes and its prevention, Biotechnol Bioeng. 90(5):614-20; Ito et al. (2008) Efficient in vivo gene transfection by stable DNA/PEI complexes coated by hyaluronic acid, Journal of Drug Targeting, 16:4, 276-281参照）。陽イオン性ポリマーをポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分にコンジュゲートすることを含むいくつかのアプローチが、この問題を克服するために試みられてきた（例えばWolfert et al., (1996) Characterization of vectors for gene therapy formed by self-assembly of DNA with synthetic block co-polymers, Hum Gene Ther., 7(17):2123-33参照）。しかし、ＰＥＧによる陽イオン性ポリマーの修飾は、トランスフェクション効率に負の影響を有する。

【0005】

従って、高いトランスフェクション効率を維持しながら長時間安定なＤＮＡ−ＰＥＩ複合体を提供する組成物および方法に関する必要性が存在することは、明らかである。これは、大量の生物療法分子、例えば高力価ｒＡＡＶベクターを産生することができる細胞の大規模な製造を可能にするであろう。

【0006】

本明細書で引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許、および特許出願がそのように参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示された場合と同程度まで、全ての目的に関して参照によりそのまま本明細書に援用される。援用される文献および類似の資料の１つ以上が、定義された用語、用語の使用法、記載された技法等を含め（それらに限定されない）、本出願と異なるかまたは矛盾している場合、本出願が支配する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Sharma et al., (2005) Mechanistic studies on aggregation of polyethylenimine-DNA complexes and its prevention, Biotechnol Bioeng. 90(5):614-20

【非特許文献2】Ito et al. (2008) Efficient in vivo gene transfection by stable DNA/PEI complexes coated by hyaluronic acid, Journal of Drug Targeting, 16:4, 276-281

【非特許文献3】Wolfert et al., (1996) Characterization of vectors for gene therapy formed by self-assembly of DNA with synthetic block co-polymers, Hum Gene Ther., 7(17):2123-33

【発明の概要】

【0008】

高いトランスフェクション効率を維持しながらＤＮＡ−陽イオン性ポリマー複合体を含有するトランスフェクションカクテルを長時間安定化するための組成物および方法が、本明細書において開示される。そのような安定化されたトランスフェクションカクテルは、ウイルス産生の重要な属性、例えば力価、ＤＮＡをパッケージ化したｒＡＡＶ粒子の割合およびｒＡＡＶベクター精製プロファイルに影響を与えることなく、大規模に例えばｒＡＡＶベクターを産生することができるトランスフェクションされた細胞を生産するために使用されることができる。

【0009】

トランスフェクトされた細胞を生産するための組成物および方法が、本明細書で開示および例示される。当業者は、ルーチン的な実験操作より多くを用いずに、本明細書で記載される本発明の特定の態様に対する多くの均等物を認識する、または確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の態様（Ｅ）によって包含されることが意図されている。

【0010】

Ｅ１． 以下の工程を含む、細胞に１種類以上の核酸をトランスフェクションするための方法：
（ｉ） １種類以上の陽イオン性ポリマー、安定剤および１種類以上の核酸を含むトランスフェクションカクテルを調製し、
（ｉｉ） 工程（ｉ）で調製されたトランスフェクションカクテルを、トランスフェクションされるべき細胞と接触させて混合物を形成し、そして
（ｉｉｉ） 工程（ｉｉ）における混合物をインキュベートし、それにより細胞に１種類以上の核酸をトランスフェクションする。

【0011】

Ｅ２． 以下の工程を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを産生する細胞を作製するための方法：
（ｉ） １種類以上の陽イオン性ポリマー、安定剤および１種類以上の核酸を含むトランスフェクションカクテルを調製し、
（ｉｉ） 工程（ｉ）で調製されたトランスフェクションカクテルをトランスフェクションされるべき細胞と接触させて混合物を形成し、そして
（ｉｉｉ） 工程（ｉｉ）の混合物をインキュベートし、それによりｒＡＡＶベクターを産生するトランスフェクションされた細胞を作製する。

【0012】

Ｅ３． 以下の工程を含む、１種類以上の核酸を有する細胞のトランスフェクションを増大させるための方法：
（ｉ）１種以上の陽イオン性ポリマー、安定剤および１種以上の核酸を含むトランスフェクションカクテルを調製し、
（ｉｉ） 工程（ｉ）で調製されたトランスフェクションカクテルを、トランスフェクションされるべき細胞と接触させて混合物を形成し、そして
（ｉｉｉ） 工程（ｉｉ）の混合物をインキュベートし、それにより１種類以上の核酸を用いる細胞のトランスフェクションが、安定剤の非存在下であること以外同じ条件下で実施される細胞のトランスフェクションと比較して増大する。

【0013】

Ｅ４． 以下の工程を含む、高力価組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを生産するための方法：
（ｉ） １種類以上の陽イオン性ポリマー、安定剤および１種類以上の核酸を含むトランスフェクションカクテルを調製し、
（ｉｉ） 工程（ｉ）で調製されたトランスフェクションカクテルをトランスフェクションされるべき細胞と接触させて混合物を形成し、
（ｉｉｉ） 工程（ｉｉ）の混合物をインキュベートしてｒＡＡＶベクターを産生するトランスフェクトされた細胞を作製し、そして
（ｉｖ） 工程（ｉｉｉ）で生産されたトランスフェクションされた細胞からｒＡＡＶベクターを単離および／または精製する、
ここにおいて、工程（ｉ）の開始〜工程（ｉｉ）の完了の時間は、１０秒よりも長く、かつここで、ｒＡＡＶ力価は、安定剤の非存在下であること以外同じ条件下でもたらされるｒＡＡＶ力価と比較して、少なくとも２倍、かつ／または少なくとも５％増大する。

【0014】

Ｅ５． Ｅ１〜Ｅ４のいずれか１つに記載の方法であって、工程（ｉ）の開始〜工程（ｉｉ）の完了の時間が約１０秒〜約１０日である方法。
Ｅ６． Ｅ５に記載の方法であって、工程（ｉ）の開始〜工程（ｉｉ）の完了の時間が、約１５秒〜約５日、約３０秒〜約２日、約６０秒〜約１日、約９０秒〜約１０時間、約９０秒〜約８時間、約２分〜約４時間、約４分〜約２時間、約６分〜約１時間または約１０分〜約３０分である方法。

【0015】

Ｅ７． Ｅ１〜Ｅ６のいずれか１つに記載の方法であって、工程（ｉ）の開始〜工程（ｉｉ）の完了の時間が、約１分より長い、約２分より長い、約６分より長い、約８分より長い、約１０分より長い、約１５分より長い、約３０分より長い、約１時間より長い、約２時間より長い、約６時間より長い、約８時間より長い、約１０時間より長い、約１２時間より長い、約２４時間より長い、または２日より長い方法。

【0016】

Ｅ８． Ｅ１〜Ｅ７のいずれか１つに記載の方法であって、工程（ｉ）の開始〜工程（ｉｉ）の完了の時間が、１０分より長い方法。
Ｅ９． Ｅ１〜Ｅ８のいずれか１つに記載の方法であって、工程（ｉ）の開始〜工程（ｉｉ）の完了の時間が、約３０分である方法。

【0017】

Ｅ１０． Ｅ１〜Ｅ９のいずれか１つに記載の方法であって、工程（ｉ）のトランスフェクションカクテルが、工程（ｉｉ）の前に約１０秒〜約１０日、約１５秒〜約５日、約３０秒〜約２日、約６０秒〜約１日、約９０秒〜約１０時間、約９０秒〜約８時間、約２分〜約４時間、約４分〜約２時間、約６分〜約１時間または約１０分〜約３０分インキュベートされる方法。

【0018】

Ｅ１１． Ｅ１〜Ｅ１０のいずれか１つに記載の方法であって、工程（ｉ）のトランスフェクションカクテルが、工程（ｉｉ）の前に約１分より長い時間、約２分より長い時間、約６分より長い時間、約８分より長い時間、約１０分より長い時間、約１５分より長い時間、約３０分より長い時間、約１時間より長い時間、約２時間より長い時間、約６時間より長い時間、約８時間より長い時間、約１０時間より長い時間、約１２時間より長い時間、約２４時間より長い時間または２日より長い時間インキュベートされる方法。

【0019】

Ｅ１２． Ｅ１〜Ｅ１１のいずれか１つに記載の方法であって、トランスフェクションカクテルが、まず１種類以上の陽イオン性ポリマーを安定剤と混合して結果として生じる混合物を形成し、次いでそれが１種類以上の核酸に添加される、ことによって調製される方法。

【0020】

Ｅ１３． Ｅ１〜Ｅ１１のいずれか１つに記載の方法であって、トランスフェクションカクテルが、まず安定剤を１種類以上の核酸と混合して結果として生じる混合物を形成し、次いでそれが１種類以上の陽イオン性ポリマーに添加される、ことによって調製される方法。

【0021】

Ｅ１４． Ｅ１３に記載の方法であって、細胞が、工程（ｉｉ）においてトランスフェクションカクテルと接触させられる際に高い（例えば約１８×１０^６細胞／ｍＬより大きい）細胞密度である方法。

【0022】

Ｅ１５． Ｅ１〜Ｅ１１のいずれか１つに記載の方法であって、トランスフェクションカクテルが、まず１種類以上の陽イオン性ポリマーを１種類以上の核酸と混合して結果として生じる混合物を形成し、次いでそれが安定剤に添加される、ことによって調製される方法。

【0023】

Ｅ１６． Ｅ１〜Ｅ１５のいずれか１つに記載の方法であって、細胞が、工程（ｉｉ）においてトランスフェクションカクテルと接触させられる際に、少なくとも１×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも２×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも４×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも６×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも８×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも０．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも１×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも２×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも６×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも８×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも１０×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも１２×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも１４×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも１６×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも１８×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも２０×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも２２×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも２４×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも２６×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも２８×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも３０×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも３２×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも３４×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも３６×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも３８×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも４０×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも４２×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも４４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４６×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４８×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも５０×１０^６細胞／ｍＬまたは少なくとも５２×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度である方法。

【0024】

Ｅ１７． Ｅ１６に記載の方法であって、細胞が、工程（ｉｉ）においてトランスフェクションカクテルと接触させられる際に、少なくとも１２×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも１４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも１６×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも１８×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも２０×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも２２×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも２４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも２６×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも２８×１０^６細胞／ｍＬまたは少なくとも３０×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも３２×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも３４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも３６×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも３８×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４０×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４２×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４６×１０^６細胞／ｍＬまたは少なくとも４８×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度である方法。

【0025】

Ｅ１８． Ｅ１３に記載の方法であって、細胞が、工程（ｉｉ）においてトランスフェクションカクテルと接触させられる際に、少なくとも２４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも２６×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも２８×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも３０×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも３２×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも３４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも３６×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも３８×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４０×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４２×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４６×１０^６細胞／ｍＬまたは少なくとも４８×１０^６細胞／ｍＬの密度である方法。

【0026】

Ｅ１９． Ｅ１８に記載の方法であって、細胞が、工程（ｉｉ）においてトランスフェクションカクテルと接触させられる際に少なくとも２４×１０^６細胞／ｍＬの密度である方法。

【0027】

Ｅ２０． Ｅ１〜Ｅ１９のいずれか１つに記載の方法であって、１種類以上の陽イオン性ポリマーが、細胞１００万個あたり約０．０５μｇ、細胞１００万個あたり約０．１μｇ、細胞１００万個あたり約０．２μｇ、細胞１００万個あたり約０．４μｇ、細胞１００万個あたり約０．６μｇ、細胞１００万個あたり約０．８μｇ、細胞１００万個あたり約１．０μｇ、細胞１００万個あたり約１．５μｇ、細胞１００万個あたり約２μｇ、細胞１００万個あたり約２．１μｇ、細胞１００万個あたり約２．２μｇ、細胞１００万個あたり約２．３μｇ、細胞１００万個あたり約２．４μｇ、細胞１００万個あたり約２．５μｇ、細胞１００万個あたり約２．６μｇ、細胞１００万個あたり約２．７μｇ、細胞１００万個あたり約２．８μｇ、細胞１００万個あたり約２．９μｇ、細胞１００万個あたり約３．０μｇ、細胞１００万個あたり約３．５μｇ、細胞１００万個あたり約４．０μｇ、細胞１００万個あたり約４．５μｇ、細胞１００万個あたり約５μｇ、細胞１００万個あたり約５．５μｇ、細胞１００万個あたり約６．０μｇ、細胞１００万個あたり約６．５μｇ、細胞１００万個あたり約７．０μｇ、細胞１００万個あたり約７．５μｇ、細胞１００万個あたり約８．０μｇ、細胞１００万個あたり約１０μｇの量で使用される方法。

【0028】

Ｅ２１． Ｅ２０に記載の方法であって、１種類以上の陽イオン性ポリマーが、細胞１００万個あたり約２．２μｇの量で使用される方法。
Ｅ２２． Ｅ１〜Ｅ２１のいずれか１つに記載の方法であって、トランスフェクションカクテル中の安定剤の量が、１種類以上の陽イオン性ポリマーの量と比較して、約１％、約２％、約２．５％、約５％、約７．５％、約１０％、約１２．５％、約１５％、約１７．５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約９０％、約１００％、約２００％、約３００％、約４００％または約５００％である方法。

【0029】

Ｅ２３． Ｅ１〜Ｅ２２のいずれか１つに記載の方法であって、トランスフェクションカクテル中の安定剤の量が、１種類以上の陽イオン性ポリマーの量と比較して、約０．０１倍、約０．０５倍、約０．１倍、約０．２倍、約０．４倍、約０．６倍、約０．８倍、約１倍、約５倍、約１０倍、約１００倍、約２００倍、約３００倍、約４００倍、約５００倍または約６００倍である方法。

【0030】

Ｅ２４． Ｅ２２に記載の方法であって、トランスフェクションカクテル中の安定剤の量が、１種類以上の陽イオン性ポリマーの量と比較して、約７．５％、約１０％、約１２．５％、約１５％、約１７．５％、約２０％、約２５％、約３０％または約４０％である方法。

【0031】

Ｅ２５． Ｅ１〜Ｅ２４のいずれか１つに記載の方法であって、トランスフェクションカクテル中の安定剤の量が、約０．０１μｇ、約０．０２μｇ、約０．０４μｇ、約０．０６μｇ、約０．０８μｇ、約１．０μｇ、約１．２μｇ、約１．４μｇ、約１．６μｇ、約１．８μｇ、約２．０μｇ、約２．２μｇ、約２．４μｇ、約２．６μｇ、約２．８μｇ、約３．０μｇ、約３．２μｇ、約３．４μｇ、約３．６μｇ、約３．８μｇ、約４．０μｇ、約４．２μｇ、約４．６μｇ、約４．８μｇ、約５．０μｇ、約５．５μｇ、約６．０μｇ、約６．５μｇ、約７μｇ、約７．５μｇ、約８．０μｇ、約８．５μｇ、約９．０μｇ、約９．５μｇ、約１０μｇ、約１２μｇ、約１４μｇ、約１６μｇ、約１８μｇ、約２０μｇ、約４０μｇ、約６０μｇ、約８０μｇ、約１００μｇ、約０．１ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約４ｍｇ、約６ｍｇ、約８ｍｇまたは約１０ｍｇである方法。

【0032】

Ｅ２６． Ｅ１〜Ｅ２５のいずれか１つに記載の方法であって、細胞が、工程（ｉｉ）においてトランスフェクションカクテルと接触させられる際に低い（例えば約１８×１０^６細胞／ｍＬ未満の）細胞密度であり、かつトランスフェクションカクテル中の安定剤の量が、１種類以上の陽イオン性ポリマーの量と比較して約７．５％〜約１０％である方法。

【0033】

Ｅ２７． Ｅ１〜Ｅ２５のいずれか１つに記載の方法であって、細胞が、工程（ｉｉ）においてトランスフェクションカクテルと接触させられる際に高い（例えば約１８×１０^６細胞／ｍＬより大きい）細胞密度であり、かつトランスフェクションカクテル中の安定剤の量が、１種類以上の陽イオン性ポリマーの量と比較して約１５％〜約３０％である方法。

【0034】

Ｅ２８． Ｅ２６に記載の方法であって、細胞が、工程（ｉｉ）においてトランスフェクションカクテルと接触させられる際に約１２×１０^６細胞／ｍＬの密度であり、かつトランスフェクションカクテル中の安定剤の量が、１種類以上の陽イオン性ポリマーの量と比較して約１０％である方法。

【0035】

Ｅ２９． Ｅ２７に記載の方法であって、細胞が、工程（ｉｉ）においてトランスフェクションカクテルと接触させられる際に約２４×１０^６細胞／ｍＬの密度であり、かつトランスフェクションカクテル中の安定剤の量が、１種類以上の陽イオン性ポリマーの量と比較して約２５％である方法。

【0036】

Ｅ３０． Ｅ１〜Ｅ２９のいずれか１つに記載の方法であって、トランスフェクションカクテル中の安定剤の量が、単独で（すなわち１種類以上の陽イオン性ポリマーなしで）使用された場合には細胞をトランスフェクションするのに不十分である方法。

【0037】

Ｅ３１． Ｅ１〜Ｅ３０のいずれか１つに記載の方法であって、１種類以上の核酸が、細胞１００万個あたり約０．０５μｇ、細胞１００万個あたり約０．１μｇ、細胞１００万個あたり約０．２μｇ、細胞１００万個あたり約０．４μｇ、細胞１００万個あたり約０．５μｇ、細胞１００万個あたり約０．６μｇ、細胞１００万個あたり約０．８μｇ、細胞１００万個あたり約１．０μｇ、細胞１００万個あたり約１．５μｇ、細胞１００万個あたり約２．０μｇ、細胞１００万個あたり約２．５μｇ、細胞１００万個あたり約３．０μｇ、細胞１００万個あたり約３．５μｇ、細胞１００万個あたり約４．０μｇ、細胞１００万個あたり約４．５μｇ、細胞１００万個あたり約５μｇ、細胞１００万個あたり約５．５μｇ、細胞１００万個あたり約６．０μｇ、細胞１００万個あたり約６．５μｇ、細胞１００万個あたり約７．０μｇ、細胞１００万個あたり約７．５μｇ、細胞１００万個あたり約８．０μｇ、細胞１００万個あたり約８．５μｇ、細胞１００万個あたり約９．０μｇ、細胞１００万個あたり約９．５μｇまたは細胞１００万個あたり約１０μｇで使用される方法。

【0038】

Ｅ３２． Ｅ３１に記載の方法であって、１種類以上の核酸が、細胞１００万個あたり約１．０μｇの量で使用される方法。
Ｅ３３． Ｅ１〜Ｅ３２のいずれか１つに記載の方法であって、１種類以上の核酸および１種類以上の陽イオン性ポリマーが、約１：０．０１〜約１：１００の範囲の重量（またはモル）比で、または約０．０１：１〜約１００：１の重量（またはモル）比で使用される方法。

【0039】

Ｅ３４． Ｅ１〜Ｅ３３のいずれか１つに記載の方法であって、工程（ｉ）におけるトランスフェクションカクテルが、約４℃〜およそ室温で調製される方法。
Ｅ３５． Ｅ３４に記載の方法であって、工程（ｉ）におけるトランスフェクションカクテルが、およそ室温で調製される方法。

【0040】

Ｅ３６． Ｅ１０〜Ｅ３５のいずれか１つに記載の方法であって、トランスフェクションカクテルが、工程（ｉｉ）の前に約４℃〜およそ室温でインキュベートされる方法。
Ｅ３７． Ｅ３６に記載の方法であって、トランスフェクションカクテルが、工程（ｉｉ）の前におよそ室温でインキュベートされる方法。

【0041】

Ｅ３８． Ｅ１２〜Ｅ３７のいずれか１つに記載の方法であって、結果として生じる混合物が、１種類以上の核酸、１種類以上の陽イオン性ポリマーまたは安定剤に混合なしで添加される方法。

【0042】

Ｅ３９． Ｅ１２〜Ｅ３７のいずれか１つに記載の方法であって、結果として生じる混合物が、１種類以上の核酸、１種類以上の陽イオン性ポリマーまたは安定剤に添加され、約１０の毎分回転数（ｒｐｍ）、約２０ｒｐｍ、約２５ｒｐｍ、約３０ｒｐｍ、約３５ｒｐｍ、約４０ｒｐｍ、約４５ｒｐｍ、約５０ｒｐｍ、約５５ｒｐｍ、約６０ｒｐｍ、約６５ｒｐｍ、約７０ｒｐｍ、約７５ｒｐｍ、約８０ｒｐｍ、約８５ｒｐｍ、約９０ｒｐｍ、約９５ｒｐｍ、約１００ｒｐｍ、約１１０ｒｐｍ、約１２０ｒｐｍ、約１３０ｒｐｍ、約１４０ｒｐｍ、約１５０ｒｐｍ、約２００ｒｐｍ、約３００ｒｐｍ、約４００ｒｐｍまたは約５００ｒｐｍで混合される方法。

【0043】

Ｅ４０． Ｅ３９に記載の方法であって、結果として生じる混合物が、１種類以上の核酸、１種類以上の陽イオン性ポリマーまたは安定剤に添加され、約１２０ｒｐｍで混合される方法。

【0044】

Ｅ４１． Ｅ１〜Ｅ４０のいずれか１つに記載の方法であって、工程（ｉｉｉ）における混合物が、トランスフェクションされた細胞を作製するために約１５分〜約１５０時間インキュベートされる方法。

【0045】

Ｅ４２． Ｅ４１に記載の方法であって、工程（ｉｉｉ）における混合物が、トランスフェクションされた細胞を作製するために約１５分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、２０時間、４０時間、６０時間、８０時間、１００時間、１２０時間、１４０時間または１５０時間インキュベートされる方法。

【0046】

Ｅ４３． Ｅ４２に記載の方法であって、工程（ｉｉｉ）における混合物が、トランスフェクションされた細胞を作製するために１時間、２時間、３時間、４時間または５時間インキュベートされる方法。

【0047】

Ｅ４４． Ｅ１〜Ｅ４３のいずれか１つに記載の方法であって、１種類以上の陽イオン性ポリマーが、キトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリアミン（ＰＡ）、ポリアルキレンイミン（ＰＡＩ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ［ａ−（−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸］、ポリアミドアミン、ポリ（２−ジメチルアミノ）エチル メタクリレート、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、ポリ（４−ビニルピリジン）、ポリ（ビニルアミン）およびポリ（４−ビニル−Ｎ−アルキルピリジニウムハライド）からなる群から選択される方法。

【0048】

Ｅ４５． Ｅ１〜Ｅ４４のいずれか１つに記載の方法であって、陽イオン性ポリマーが、分枝状または線状である方法。
Ｅ４６． Ｅ１〜Ｅ４５のいずれか１つに記載の方法であって、陽イオン性ポリマーが、遊離塩基形態で約５００Ｄａ〜約１６０，０００Ｄａおよび／または約２，５００Ｄａ〜約２５０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する方法。

【0049】

Ｅ４７． Ｅ１〜Ｅ４６のいずれか１つに記載の方法であって、１種類以上の陽イオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である方法。
Ｅ４８． Ｅ４７に記載の方法であって、ＰＥＩが、約２，０００Ｄａ〜約６０，０００Ｄａの分子量を有する分枝状ＰＥＩを含む方法。

【0050】

Ｅ４９． Ｅ４７に記載の方法であって、ＰＥＩが、約２，０００Ｄａ〜約６０，０００Ｄａの分子量を有する線状ＰＥＩを含む方法。
Ｅ５０． Ｅ４９に記載の方法であって、陽イオン性ポリマーが、遊離塩基形態で約４０，０００Ｄａおよび／または約２２，０００Ｄａの分子量を有する加水分解された線状ＰＥＩを含む方法。

【0051】

Ｅ５１． Ｅ４７〜Ｅ５０のいずれか１つに記載の方法であって、ＰＥＩが、完全に脱プロピオニル化された構造を有する方法。
Ｅ５２． Ｅ４７〜Ｅ５２のいずれか１つに記載の方法であって、ＰＥＩが、ＰＥＩｍａｘである方法。

【0052】

Ｅ５３． Ｅ１〜Ｅ５２のいずれか１つに記載の方法であって、安定剤が、中性部分をグラフトされた陽イオン性ポリマーを含む方法。
Ｅ５４． Ｅ５３に記載の方法であって、中性部分が、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）またはアルブミンを含む方法。

【0053】

Ｅ５５． Ｅ１〜Ｅ５４のいずれか１つに記載の方法であって、安定剤が、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分をグラフトされた陽イオン性ポリマーを含む方法。
Ｅ５６． Ｅ５４〜Ｅ５５のいずれか１つに記載の方法であって、ＰＥＧが、約２５０Ｄａ〜３５，０００Ｄａの分子量を有する方法。

【0054】

Ｅ５７． Ｅ５３〜Ｅ５６のいずれか１つに記載の方法であって、中性部分（例えばＰＥＧ）をグラフトされた陽イオン性ポリマーが、キトサン、ポリ−Ｌ−リジン（ｐＬＬ）、ポリアミン（ＰＡ）、ポリアルキレンイミン（ＰＡＩ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ［ａ−（−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸］、ポリアミドアミン、ポリ（２−ジメチルアミノ）エチル メタクリレート、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、ポリ（４−ビニルピリジン）、ポリ（ビニルアミン）およびポリ（４−ビニル−Ｎ−アルキルピリジニウムハライド）からなる群から選択される方法。

【0055】

Ｅ５８． Ｅ５７に記載の方法であって、陽イオン性ポリマーが、遊離塩基形態で約５００Ｄａ〜約１６０，０００Ｄａおよび／または約２，５００Ｄａ〜約２５０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する方法。

【0056】

Ｅ５９． Ｅ５３〜Ｅ５８のいずれか１つに記載の方法であって、陽イオン性ポリマーが、分枝状または線状である方法。
Ｅ６０． Ｅ５３〜Ｅ５９のいずれか１つに記載の方法であって、陽イオン性ポリマーが、ＰＥＩである方法。

【0057】

Ｅ６１． Ｅ５３〜Ｅ６０のいずれか１つに記載の方法であって、安定剤が、約２，０００Ｄａ〜約６０，０００Ｄａの分子量を有する分枝状ＰＥＩに約２５０Ｄａ〜約３５，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧがグラフトされたものを含む方法。

【0058】

Ｅ６２． Ｅ６１に記載の方法であって、安定剤が、約２０，０００Ｄａ〜約２５，０００Ｄａの分子量を有する分枝状ＰＥＩに約２５０Ｄａ〜約５，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧがグラフトされたものを含む方法。

【0059】

Ｅ６３． Ｅ６２に記載の方法であって、安定剤が、約２５，０００Ｄａの分子量を有する分枝状ＰＥＩに約５，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧがグラフトされたものを含む方法。

【0060】

Ｅ６４． Ｅ６２に記載の方法であって、安定剤が、約２５，０００Ｄａの分子量を有する分枝状ＰＥＩに約５００Ｄａの分子量を有するＰＥＧがグラフトされたものを含む方法。

【0061】

Ｅ６５． Ｅ５３〜Ｅ６０のいずれか１つに記載の方法であって、安定剤が、約２，０００Ｄａ〜約６０，０００Ｄａの分子量を有する線状ＰＥＩに約２５０Ｄａ〜約３５，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧがグラフトされたものを含む方法。

【0062】

Ｅ６６． Ｅ６５に記載の方法であって、安定剤が、約２０，０００Ｄａの分子量を有する線状ＰＥＩに約５，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧがグラフトされたものを含む方法。

【0063】

Ｅ６７． Ｅ６５に記載の方法であって、安定剤が、約２０，０００Ｄａの分子量を有する線状ＰＥＩに約５００Ｄａの分子量を有するＰＥＧがグラフトされたものを含む方法。

【0064】

Ｅ６８． Ｅ５３〜Ｅ５９のいずれか１つに記載の方法であって、安定剤が、約５０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧにコンジュゲートされた約２６０００Ｄａの分子量を有するｐＬＬを含む方法。

【0065】

Ｅ６９． Ｅ５４〜Ｅ６８のいずれか１つに記載の方法であって、陽イオン性ポリマーの１分子あたりにグラフトされたＰＥＧ部分の数が、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはより多い方法。

【0066】

Ｅ７０． Ｅ６９に記載の方法であって、陽イオン性ポリマーの１分子あたりにグラフトされたＰＥＧ部分の数が、１、５、１５または５５である方法。
Ｅ７１． Ｅ１〜Ｅ７０のいずれか１つに記載の方法であって、１種類以上の核酸分子が、１種類以上のプラスミドを含む方法。

【0067】

Ｅ７２． Ｅ７１に記載の方法であって、１種類以上の核酸分子が、（ａ）ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸および／もしくはヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１種類以上のプラスミドならびに／または（ｂ）対象の導入遺伝子をコードする核酸を含むプラスミドを含む方法。

【0068】

Ｅ７３． Ｅ７２に記載の方法であって、（ａ）の１種類以上のプラスミドが、ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸を含む第１プラスミドおよびヘルパータンパク質をコードする核酸を含む第２プラスミドを含む方法。

【0069】

Ｅ７４． Ｅ７３に記載の方法であって、導入遺伝子を含むプラスミド対ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸を含む第１プラスミド対ヘルパータンパク質をコードする核酸を含む第２プラスミドのモル比が、約１〜１０：１：１または１：１〜１０：１または１：１：１〜１０の範囲である方法。

【0070】

Ｅ７５． Ｅ７２〜Ｅ７４のいずれか１つに記載の方法であって、コードされたＡＡＶパッケージングタンパク質が、ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはＡＡＶ ｃａｐタンパク質を含む方法。

【0071】

Ｅ７６． Ｅ７２〜Ｅ７５のいずれか１つに記載の方法であって、コードされたヘルパータンパク質が、アデノウイルスＥ２および／もしくはＥ４、ＶＡＲＮＡタンパク質ならびに／または非ＡＡＶヘルパータンパク質を含む方法。

【0072】

Ｅ７７． Ｅ７２〜Ｅ７６のいずれか１つに記載の方法であって、導入遺伝子が、野生型または機能性バリアント血液凝固因子、ミニジストロフィン、Ｃ１エステラーゼ阻害因子、銅輸送Ｐ型ＡＴＰアーゼ（ＡＴＰ７Ｂ）または銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）をコードしている方法。

【0073】

Ｅ７８． Ｅ７７に記載の方法であって、野生型または機能性バリアント血液凝固因子が、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子である方法。
Ｅ７９． Ｅ１〜Ｅ３、Ｅ５〜Ｅ７８のいずれか１つに記載の方法であって、さらに１種類以上の核酸をトランスフェクションされている細胞を培養、拡張、単離または選択する工程（ＩＶ）を含む方法。

【0074】

Ｅ８０． Ｅ１〜Ｅ３、Ｅ５〜Ｅ７８のいずれか１つに記載の方法であって、さらに工程（ｉｉｉ）で生産されたトランスフェクションされた細胞および／または工程（ｉｉｉ）で生産されたトランスフェクションされた細胞からの培養培地を回収して細胞および／または培養培地回収物を生産する工程（ｉｖ）を含む方法。

【0075】

Ｅ８１． Ｅ１〜Ｅ３、Ｅ５〜Ｅ７８のいずれか１つに記載の方法であって、さらに工程（ｉｉｉ）で生産されたトランスフェクションされた細胞からｒＡＡＶベクターを単離および／または精製する工程（ｉｖ）を含む方法。

【0076】

Ｅ８２． Ｅ１〜Ｅ８１のいずれか１つに記載の方法であって、１種類以上の核酸による細胞のトランスフェクションが、安定剤の非存在下であること以外同じ条件下で実施される細胞のトランスフェクションと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％または少なくとも５０％増加する方法。

【0077】

Ｅ８３． Ｅ１〜Ｅ８１のいずれか１つに記載の方法であって、トランスフェクションされた細胞から単離／精製されるｒＡＡＶベクターの量が、安定剤の非存在下であること以外同じ条件下でトランスフェクションされた細胞から単離／精製されるｒＡＡＶベクターの量と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％もしくは少なくとも５０％またはより大きく増加する方法。

【0078】

Ｅ８４． Ｅ１〜Ｅ８１のいずれか１つに記載の方法であって、トランスフェクションされた細胞から単離／精製されるｒＡＡＶベクターの量が、安定剤の非存在下であること以外同じ条件下でトランスフェクションされた細胞から単離／精製されるｒＡＡＶベクターの量と比較して、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも８０倍、少なくとも１００倍またはより大きく増加する方法。

【0079】

Ｅ８５． Ｅ１〜Ｅ８１のいずれか１つに記載の方法であって、ｒＡＡＶ力価が、安定剤の非存在下であること以外同じ条件下でもたらされるｒＡＡＶ力価と比較して、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも８０倍、少なくとも１００倍またはより大きく増大する方法。

【0080】

Ｅ８６． Ｅ１〜Ｅ８１のいずれか１つに記載の方法であって、ｒＡＡＶ力価が、安定剤の非存在下であること以外同じ条件下でもたらされるｒＡＡＶ力価と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％もしくは少なくとも５０％またはより大きく増大する方法。

【0081】

Ｅ８７． Ｅ１〜Ｅ８１のいずれか１つに記載の方法であって、ｒＡＡＶ完全ベクターの数が、安定剤の非存在下であること以外同じ条件下で生産されるｒＡＡＶ完全ベクターの数と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％もしくは少なくとも５０％またはより大きく増加する方法。

【0082】

Ｅ８８． Ｅ１〜Ｅ８１のいずれか１つに記載の方法であって、ｒＡＡＶ空ベクターの数が、安定剤の非存在下であること以外同じ条件下で生産されるｒＡＡＶ空ベクターの数と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％もしくは少なくとも５０％またはより大きく減少する方法。

【0083】

Ｅ８９． Ｅ１〜Ｅ８１のいずれか１つに記載の方法であって、安定剤の存在下で単離および／または精製されたｒＡＡＶベクターが、約１．０〜約１．２の２６０：２８０比を有し、一方で安定剤の非存在下であること以外同じ条件下で単離および／または精製されたｒＡＡＶベクターが、約０．６の２６０：２８０比を有する方法。

【0084】

Ｅ９０． Ｅ１〜Ｅ８９のいずれか１つに記載の方法であって、細胞が、哺乳類細胞、酵母細胞または昆虫細胞を含む方法。
Ｅ９１． Ｅ９０に記載の方法であって、細胞が、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または昆虫由来のＳｆ９細胞である方法。

【0085】

Ｅ９２． Ｅ９１に記載の方法であって、細胞が、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞を含む方法。
Ｅ９３． Ｅ９２に記載の方法であって、細胞が、ＨＥＫ ２９３Ｅ、ＨＥＫ ２９３ＦまたはＨＥＫ ２９３Ｔ細胞である方法。

【0086】

Ｅ９４． Ｅ９２に記載の方法であって、ＨＥＫ ２９３細胞が、懸濁状態での無血清増殖に適応している方法。
Ｅ９５． Ｅ１〜Ｅ９４のいずれか１つに記載の方法であって、細胞が、安定的に、または一過性にトランスフェクションされる方法。

【0087】

Ｅ９６． Ｅ１〜Ｅ９５のいずれか１つに記載の方法であって、細胞が、懸濁培養状態である方法。
Ｅ９７． Ｅ１〜Ｅ９５のいずれか１つに記載の方法であって、細胞が、接着性である方法。

【0088】

Ｅ９８． Ｅ１〜Ｅ９７のいずれか１つに記載の方法であって、細胞が、無血清培養培地中で増殖させられる、または維持される方法。
Ｅ９９． Ｅ１〜Ｅ９８のいずれか１つに記載の方法であって、細胞が、ローラーボトルまたは拡張された（ｅｘｐａｎｄｅｄ）ローラーボトル中で増殖する、または維持される方法。

【0089】

Ｅ１００． Ｅ１〜Ｅ９８のいずれか１つに記載の方法であって、細胞が、バイオリアクター中で増殖させられる方法。
Ｅ１０１． Ｅ１〜Ｅ９８のいずれか１つに記載の方法であって、細胞が、バッグまたはフラスコ中で増殖させられる方法。

【0090】

Ｅ１０２． Ｅ１００に記載の方法であって、細胞が、ＷＡＶＥバイオリアクター中で増殖させられる方法。
Ｅ１０３． Ｅ１００に記載の方法であって、細胞が、撹拌槽バイオリアクター中で増殖させられる方法。

【0091】

Ｅ１０４． １種類以上の陽イオン性ポリマーおよび安定剤を含む組成物。
Ｅ１０５． Ｅ１０４に記載の組成物であって、さらに１種類以上の核酸を含む組成物。

【0092】

Ｅ１０６． Ｅ１０５に記載の組成物であって、さらに細胞を含む組成物。
Ｅ１０７． 安定剤および１種類以上の核酸を含む組成物。
Ｅ１０８． Ｅ１０７に記載の組成物であって、さらに１種類以上の陽イオン性ポリマーを含む組成物。

【0093】

Ｅ１０９． Ｅ１０８に記載の組成物であって、さらに細胞を含む組成物。
Ｅ１１０． １種類以上の陽イオン性ポリマー、安定剤、１種類以上の核酸および細胞を含む組成物。

【0094】

Ｅ１１１． Ｅ１０４〜Ｅ１０６、Ｅ１０８〜Ｅ１１０のいずれか１つに記載の組成物であって、１種類以上の陽イオン性ポリマーの量が、約０．０１μｇ、約０．０２μｇ、約０．０４μｇ、約０．０６μｇ、約０．０８μｇ、約１．０μｇ、約１．２μｇ、約１．４μｇ、約１．６μｇ、約１．８μｇ、約２．０μｇ、約２．２μｇ、約２．４μｇ、約２．６μｇ、約２．８μｇ、約３．０μｇ、約３．２μｇ、約３．４μｇ、約３．６μｇ、約３．８μｇ、約４．０μｇ、約４．２μｇ、約４．６μｇ、約４．８μｇ、約５．０μｇ、約５．５μｇ、約６．０μｇ、約６．５μｇ、約７μｇ、約７．５μｇ、約８．０μｇ、約８．５μｇ、約９．０μｇ、約９．５μｇ、約１０μｇ、約１２μｇ、約１４μｇ、約１６μｇ、約１８μｇ、約２０μｇ、約４０μｇ、約６０μｇ、約８０μｇ、約１００μｇ、約０．１ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約４ｍｇ、約６ｍｇ、約８ｍｇまたは約１０ｍｇである組成物。

【0095】

Ｅ１１２． Ｅ１１１に記載の組成物であって、１種類以上の陽イオン性ポリマーの量が、約２０μｇ、約２２μｇ、約２４μｇ、約２６μｇ、約２６．４μｇ、約２８μｇ、約３０μｇ、約３２μｇ、約３４μｇ、約３６μｇ、約３８μｇ、約４０μｇ、約４２μｇ、約４４μｇ、約４６μｇ、約４８μｇ、約５０μｇ、約５２μｇ、約５２．８μｇ、約５４μｇ、約５６μｇ、約５８μｇまたは約６０μｇである組成物。

【0096】

Ｅ１１３． Ｅ１０４〜Ｅ１１２のいずれか１つに記載の組成物であって、安定剤の量が、約０．０１μｇ、約０．０２μｇ、約０．０４μｇ、約０．０６μｇ、約０．０８μｇ、約１．０μｇ、約１．２μｇ、約１．４μｇ、約１．６μｇ、約１．８μｇ、約２．０μｇ、約２．２μｇ、約２．４μｇ、約２．６μｇ、約２．８μｇ、約３．０μｇ、約３．２μｇ、約３．４μｇ、約３．６μｇ、約３．８μｇ、約４．０μｇ、約４．２μｇ、約４．６μｇ、約４．８μｇ、約５．０μｇ、約５．５μｇ、約６．０μｇ、約６．５μｇ、約７μｇ、約７．５μｇ、約８．０μｇ、約８．５μｇ、約９．０μｇ、約９．５μｇ、約１０μｇ、約１２μｇ、約１４μｇ、約１６μｇ、約１８μｇ、約２０μｇ、約４０μｇ、約６０μｇ、約８０μｇ、約１００μｇ、約０．１ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約４ｍｇ、約６ｍｇ、約８ｍｇまたは約１０ｍｇである組成物。

【0097】

Ｅ１１４． Ｅ１１３に記載の組成物であって、安定剤の量が、約１．０μｇ、約１．２μｇ、約１．４μｇ、約１．６μｇ、約１．８μｇ、約２．０μｇ、約２．２μｇ、約２．４μｇ、約２．６μｇ、約２．６４μｇ、約２．８μｇ、約３．０μｇ、約３．２μｇ、約３．４μｇ、約３．６μｇ、約３．８μｇ、約４．０μｇ、約４．２μｇ、約４．６μｇ、約４．８μｇ、約５．０μｇ、約５．５μｇ、約６．０μｇ、約６．５μｇ、約７μｇ、約７．５μｇ、約８．０μｇ、約８．５μｇ、約９．０μｇ、約９．５μｇ、約１０μｇ、約１２μｇ、約１３μｇ、約１４μｇ、約１６μｇ、約１８μｇまたは約２０μｇである組成物。

【0098】

Ｅ１１５． Ｅ１０５〜Ｅ１１４のいずれか１つに記載の組成物であって、１種類以上の核酸の量が、約０．０１μｇ、約０．０２μｇ、約０．０４μｇ、約０．０６μｇ、約０．０８μｇ、約１．０μｇ、約１．２μｇ、約１．４μｇ、約１．６μｇ、約１．８μｇ、約２．０μｇ、約２．２μｇ、約２．４μｇ、約２．６μｇ、約２．８μｇ、約３．０μｇ、約３．２μｇ、約３．４μｇ、約３．６μｇ、約３．８μｇ、約４．０μｇ、約４．２μｇ、約４．６μｇ、約４．８μｇ、約５．０μｇ、約５．５μｇ、約６．０μｇ、約６．５μｇ、約７μｇ、約７．５μｇ、約８．０μｇ、約８．５μｇ、約９．０μｇ、約９．５μｇ、約１０μｇ、約１２μｇ、約１４μｇ、約１６μｇ、約１８μｇ、約２０μｇ、約４０μｇ、約６０μｇ、約８０μｇ、約１００μｇ、約０．１ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約４ｍｇ、約６ｍｇ、約８ｍｇまたは約１０ｍｇである組成物。

【0099】

Ｅ１１６． Ｅ１１５に記載の組成物であって、１種類以上の核酸の量が、約１２μｇまたは約２４μｇである組成物。
Ｅ１１７． Ｅ１０６、Ｅ１０９〜Ｅ１１６のいずれか１つに記載の組成物であって、細胞が、少なくとも１×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも２×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも４×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも６×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも８×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも０．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも１×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも２×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも６×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも８×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも１０×１０^６細胞／ｍＬ。少なくとも１２×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも１４×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも１６×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも１８×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも２０×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも２２×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも２４×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも２６×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも２８×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも３０×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも３２×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも３４×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも３６×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも３８×１０^６細胞／ｍｌ。少なくとも４０×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも４２×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも４４×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも４６×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも４８×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも５０×１０^６細胞／ｍｌまたは少なくとも５２×１０^６細胞／ｍｌの細胞密度である組成物。

【0100】

Ｅ１１８． Ｅ１１７に記載の組成物であって、細胞が、少なくとも１２×１０^６細胞／ｍＬまたは少なくとも２４×１０^６細胞／ｍＬの密度である組成物。
Ｅ１１９． 約１２×１０^６細胞／ｍＬ、細胞１００万個あたり約２．２μｇの１種類以上の陽イオン性ポリマー、１種類以上の陽イオン性ポリマーと比較して約１０％の安定剤および細胞１００万個あたり約１μｇの１種類以上の核酸を含む組成物。

【0101】

Ｅ１２０． 約２４×１０^６細胞／ｍＬ、細胞１００万個あたり約２．２μｇの１種類以上の陽イオン性ポリマー、１種類以上の陽イオン性ポリマーと比較して約２５％の安定剤および細胞１００万個あたり約１μｇの１種類以上の核酸を含む組成物。

【図面の簡単な説明】

【0102】

【図1】図１は、正に荷電したＰＥＩの中性に荷電したＰＥＧとの構造比較を示す。

【図2】図２は、安定剤を用いて、および用いずに調製されたトランスフェクションカクテルの濁度プロファイルを示す。

【図3】図３は、トランスフェクションカクテル中の安定剤の量の増加に伴う平均粒径の減少を示す動的光散乱法（ＤＬＳ）ベースの実験を示す。

【図4】図４は、トランスフェクションカクテル中の安定剤の（ＰＥＩと比較した）百分率を増加させた場合のトランスフェクションの２４時間、４８時間および７２時間後の細胞生存度の比較を示す。

【図5】図５は、ドロップレット・デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）を用いて測定されたＡＡＶ力価データ（ｖｇ／ｍｌ）を示す。Ｙ軸は、ＡＡＶ力価（ｖｇ／ｍｌ）を示し、Ｘ軸は、トランスフェクションカクテル中の安定剤の（ＰＥＩと比較した）増加する量を示す。力価は、トランスフェクション後の希釈に関して調整されている。

【図6】図６は、ＰＥＩと比較した安定剤（分枝状および線状）の百分率を増加させた場合のトランスフェクションの２４時間、４８時間および７２時間後の細胞生存度の比較を示す。

【図7】図７は、ｄｄＰＣＲを用いて測定されたＡＡＶ力価データ（ｖｇ／ｍｌ）を示す。Ｙ軸は、ＡＡＶ力価（ｖｇ／ｍｌ）を示し、Ｘ軸は、ＰＥＩと比較した安定剤（分枝状対線状）の増加する量を示す。力価は、トランスフェクション後の希釈に関して調整されている。

【図8】図８は、ＰＥＩと比較した安定剤（ｂＰＥＩあたり１５対５５のＰＥＧを含有する）の百分率を増加させた場合のトランスフェクションの２４時間、４８時間および７２時間後の細胞生存度の比較を示す。

【図9】図９は、ｄｄＰＣＲを用いて測定されたＡＡＶ力価データ（ｖｇ／ｍｌ）を示す。Ｙ軸は、ＡＡＶ力価（ｖｇ／ｍｌ）を示し、Ｘ軸は、ＰＥＩと比較した安定剤（ｂＰＥＩあたり１５対５５のＰＥＧを含有する）の増加する量を示す。力価は、トランスフェクション後の希釈に関して調整されている。

【図10】図１０は、トランスフェクションカクテルのインキュベーション時間を増加させた場合のＡＡＶ力価の比較を示す。トランスフェクションカクテル（ＰＥＩ−ＤＮＡ）は、安定剤（ｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋ）を用いて、および用いずに調製された。

【図11】図１１は、図９に対応する２６０：２８０の比率のグラフを示す。

【図12】図１２は、ｄｄＰＣＲを用いて測定されたＡＡＶ力価データ（ｖｇ／ｍｌ）を示す。Ｙ軸は、ＡＡＶ力価（ｖｇ／ｍｌ）を示し、Ｘ軸は、安定剤（ｂＰＥｉ１５ｋ．ＰＥＧ５ｋ）およびＰＥＧ（ＰＥＧ３５ｋ）の増加する量を示す。最初の２つの列における棒は、陽性トランスフェクション対照であり、ここで、トランスフェクションカクテルは、プラスミドＤＮＡおよびＰＥＩ単独（すなわち安定剤なし）で調製され、次いで細胞培養物への添加の前に２分インキュベートされた。力価は、トランスフェクション後の希釈に関して調整されている。実験は、ＰＥＧ３５ｋおよびｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋに関して別々に実施された。グラフは、２つの実験を比較するために一緒にプロットされている。

【図13】図１３は、ｄｄＰＣＲを用いて測定されたＡＡＶ力価データ（ｖｇ／ｍｌ）を示す。Ｙ軸は、ＡＡＶ力価（ｖｇ／ｍｌ）を示し、一方でＸ軸は、２．２ｕｇのＰＥＩ単独（すなわち安定剤なし）（棒１および棒２）、０．２２ｕｇの安定剤を伴う２．２ｕｇのＰＥＩ（棒３および４）、２．４２ｕｇの安定剤単独（すなわちＰＥＩなし）（棒５および６）、１１ｕｇの安定剤単独（すなわちＰＥＩなし）（棒７および８）または０．４ｕｇの安定剤を伴う４ｕｇのＰＥＩ（棒９および１０）のいずれかを含有するトランスフェクションカクテルを用いて実施されたトランスフェクションを示す。様々なトランスフェクションカクテルが、調製され、細胞培養物への添加の前に２分または６０分のどちらかでインキュベートされた。

【図14】図１４は、ｄｄＰＣＲを用いて測定されたトランスフェクション安定剤を用いた２リットルのバイオリアクターの運転に関するＡＡＶ力価データ（ｖｇ／ｍｌ）を示す。Ｙ軸は、ＡＡＶ力価（ｖｇ／ｍｌ）を示し、Ｘ軸は、トランスフェクションカクテルのインキュベーション時間の増加する長さを示す。以前に決定された力価を有する試料が、ｄｄＰＣＲアッセイに関する陽性対照として使用された。

【図15】図１５は、ｄｄＰＣＲを用いて測定されたＡＡＶ力価データ（ｖｇ／ｍｌ）を示す。Ｙ軸は、ＡＡＶ力価（ｖｇ／ｍｌ）を示し、Ｘ軸は、トランスフェクションカクテルのインキュベーション時間の増加する長さを示す。力価は、トランスフェクション後の希釈に関して調整されている。以前に決定された力価を有する試料が、ｄｄＰＣＲアッセイに関する陽性対照として使用された。

【図16】図１６は、ＰＥＩと比較した安定剤（ｐＬＬ．ＰＥＧ＿１対ｐＬＬ．ＰＥＧ＿２）の百分率を増加させた場合のトランスフェクションの２４時間、４８時間および７２時間後の細胞生存度の比較を示す。

【図17】図１７は、ｄｄＰＣＲを使用して測定された、別のトランスフェクション安定剤化合物を使用したＡＡＶ力価データ（ｖｇ／ｍｌ）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0103】

陽イオン性ポリマー、例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、細胞をトランスフェクションするための簡単、安価かつ有効な試薬である。トランスフェクションに関する古典的なプロトコルによれば、ＰＥＩおよびＤＮＡは、トランスフェクションの前にポリプレックスを形成するために予め混合され、しばらくインキュベートされる（“トランスフェクションカクテルのインキュベーション時間”）。しかし、これらのポリプレックスは、不安定であり、トランスフェクションカクテルのインキュベーション時間の長さに応じて、ＤＮＡ−ＰＥＩ複合体は、凝集して大きな粒子になる可能性があり、それは、細胞をトランスフェクションするそれらの能力を蝕む。実際、トランスフェクションカクテルのインキュベーション時間とは無関係に、トランスフェクションカクテルの調製およびトランスフェクションのための細胞との接触の間のあらゆるタイムラグは、ＤＮＡ−ＰＥＩ複合体の凝集の可能性を増大させる。理論により束縛されるわけではないが、凝集の速度もまた、温度、混合条件、細胞密度および／またはＤＮＡ濃度に依存するという仮説が、立てられている。より高い温度、強い混合条件、より高い細胞密度およびＤＮＡ濃度は、ＤＮＡ−ＰＥＩ複合体のより速い凝集に寄与し得る。これは、細胞をトランスフェクションして例えばＡＡＶベクターを大規模に生産するために陽イオン性ポリマーを使用する能力を著しく損なう。

【0104】

高いトランスフェクション効率を維持しながらＤＮＡ−陽イオン性ポリマー複合体を含有するトランスフェクションカクテルを長時間安定化するための組成物および方法が、本明細書において開示される。そのような安定化されたトランスフェクションカクテルは、ウイルス産生の重要な属性、例えば力価、ＤＮＡをパッケージ化したｒＡＡＶ粒子の割合およびｒＡＡＶベクター精製プロファイルに影響を与えることなく大規模に例えばｒＡＡＶベクターを産生することができるトランスフェクションされた細胞を生成するために使用されることができる。特に、本発明者らは、比較可能なｒＡＡＶ力価を得ながら（例えば実施例３〜１０を参照）ＤＮＡ−ＰＥＩ複合体を少なくとも８時間安定化する（すなわち凝集して大きな粒子になるのを防ぐ）ことができた（実施例９を参照）。加えて、本発明者らは、高細胞密度トランスフェクションおよび低細胞密度トランスフェクションの両方に関して最大限のｒＡＡＶ力価をもたらすために必要とされるトランスフェクションカクテル中の安定剤の最適な濃度および添加順序を決定した。

【0105】

一般的な技法
本発明の実施は、別途示されない限り、当該技術の技法の範囲内である分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技法を採用するであろう。そのような技法は、文献、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版(Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, 編者, 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis,編者, 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, 編者, 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. MatherおよびP.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, およびD.G. Newell, 編者, 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. WeirおよびC.C. Blackwell, 編者); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. MillerおよびM.P. Calos, 編者, 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., 編者, 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., 編者, 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., 編者, 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)において完全に説明されている。

【0106】

定義
用語“核酸”および“ポリヌクレオチド”は、本明細書において、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含む核酸、オリゴヌクレオチドの全ての形態を指すために互換的に使用される。核酸およびポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびアンチセンスＤＮＡ、プラスミド、ならびにスプライシングされた、またはスプライシングされていないｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡならびに阻害性ＤＮＡまたはＲＮＡ（ＲＮＡｉ、例えば小分子もしくは短鎖ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小分子もしくは短鎖干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ）を含む。核酸およびポリヌクレオチドは、天然に存在する配列、合成配列および意図的に改変または変更された配列（例えばバリアント核酸）を含む。

【0107】

“プラスミド”は、典型的にはプラスミドの発現（例えば転写、複製等）または繁殖（複製）のための追加の要素を有する核酸またはポリヌクレオチドの形態である。本明細書で使用されるようなプラスミドは、核酸配列およびポリヌクレオチド配列を参照するために使用されることもできる。従って、全ての側面において、本発明の組成物および方法は、例えばプラスミド、核酸またはポリヌクレオチドを細胞中に導入するために、細胞にプラスミド、核酸またはポリヌクレオチドを形質導入（トランスフェクション）するために、プラスミド、核酸またはポリヌクレオチドを有する形質導入（トランスフェクション）された細胞を生産するために、ウイルス（例えばＡＡＶ）ベクターを産生する細胞を生産するために、ウイルス（例えばＡＡＶ）ベクターを生産するために、ウイルス（例えばＡＡＶ）ベクターを有する細胞培養培地を生産するために、等でプラスミド、核酸およびポリヌクレオチドに適用可能である。

【0108】

ある態様において、核酸またはプラスミドは、タンパク質をコードする配列を指す。そのようなタンパク質は、野生型タンパク質またはバリアントタンパク質、改変タンパク質もしくはキメラタンパク質であり得る。‘バリアントタンパク質’は、改変タンパク質が野生型タンパク質と比較してアミノ酸の変更を有するような改変タンパク質を意味することができる。

【0109】

核酸またはプラスミドによってコードされるタンパク質は、療法用タンパク質を含む。限定的でない例は、血液凝固因子（例えば第ＸＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子またはプロテインＣ）、ミニジストロフィン、Ｃ１エステラーゼ阻害剤、銅輸送Ｐ型ＡＴＰアーゼ（ＡＴＰ７Ｂ）、銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、ａｐｏＥ２、アルギニノコハク酸シンターゼ、酸性アルファ−グルコシダーゼ、β−グルコセレブロシダーゼ、ａ−ガラクトシダーゼ、ＣＩ阻害因子セリンプロテアーゼ阻害因子、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜貫通制御タンパク質）、抗体、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）、エリスロポエチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β−グロビン、ａ−グロビン、スペクトリン、ａ−アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、金属トランスポーター（ＡＴＰ７ＡまたはＡＴＰ７）、スルフアミダーゼ（ｓｕｌｆａｍｉｄａｓｅ）、リソソーム蓄積症に関わる酵素（ＡＲＳＡ）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β−２５グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼ、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、ホルモン、成長因子（例えばインスリン様成長因子１および２、血小板由来成長因子、上皮成長因子、神経成長因子、神経栄養因子−３および−４、脳由来神経栄養因子、グリア由来成長因子、形質転換成長因子ａおよびβ等）、サイトカイン（例えばａ−インターフェロン、β−インターフェロン、インターフェロン−γ、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン１２、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシン等）、自殺遺伝子産物（例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、シトクロムＰ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、腫瘍壊死因子等）、薬剤耐性タンパク質（例えば癌療法において使用される薬剤に対する耐性を提供するもの）、腫瘍抑制因子タンパク質（例えばｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ−１、ＮＦ１、フォン・ヒッペル・リンドウ（ＶＨＬ）、腺腫様多発結腸ポリープ（ＡＰＣ））、免疫調節特性を有するペプチド、寛容原性または免疫原性ペプチドまたはタンパク質Ｔレジト−プ（Ｔｒｅｇｉｔｏｐｅｓ）またはｈＣＤＲｌ、インスリン、グルコキナーゼ、グアニル酸シクラーゼ２Ｄ（ＬＣＡ−ＧＵＣＹ２Ｄ）、Ｒａｂエスコートタンパク質１（コロイデレミア）、ＬＣＡ５（ＬＣＡ−レベルシリン）、オルニチンケト酸アミノトランスフェラーゼ（脳回転状萎縮症）、レチノスキシン１（Ｘ連鎖性網膜分離症）、ＵＳＨ１Ｃ（アッシャー症候群１Ｃ）、Ｘ連鎖性網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ（ＸＬＲＰ）、ＭＥＲＴＫ（ＲＰ：網膜色素変性症のＡＲ形態）、ＤＦＮＢ１（コネキシン２６難聴）、ＡＣＨＭ２、３および４（色盲）、ＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２（多嚢胞性腎臓病）、リソソーム蓄積症の原因となる遺伝子欠損（例えばスルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−ｌ−リン酸トランスフェラーゼ、カテプシンＡ、ＧＭ２−ＡＰ、ＮＰＣ１、ＶＰＣ２、スフィンゴ脂質活性化因子タンパク質等）、ゲノム編集のための１種類以上のジンクフィンガーヌクレアーゼまたはゲノム編集のための修復鋳型として使用されるドナー配列を含む。

【0110】

ある態様において、核酸またはプラスミドは、転写された際に転写産物を生成する配列を指す。そのような転写産物は、ＲＮＡ、例えば阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ、例えば小分子もしくは短鎖ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小分子もしくは短鎖干渉性（ｓｉ）ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ）であることができる。

【0111】

限定的でない例は、以下：ハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ｄｅｎｔａｔｏｒｕｂｒｏｐａｌｌｉｄｏｌｕｓｙａｎ ａｔｒｏｐｙ）と関係する遺伝子（例えばアトロフィン１、ＡＴＮ１）；球脊髄性筋萎縮症におけるＸ染色体上のアンドロゲン受容体、ヒトアタキシン−１、−２、−３および−７、（ＣＡＣＮＡ１Ａ）によりコードされているＣａｖ２．１ Ｐ／Ｑ電位依存性カルシウムチャンネル、ＴＡＴＡ結合タンパク質、ＡＴＸＮ８０Ｓとしても知られているアタキシン８の逆ストランド、脊髄小脳失調症（１型、２型、３型、６型、７型、８型、１２型、１７型）におけるセリン／スレオニン−プロテインホスファターゼ２Ａ ５５ｋＤａ調節サブユニットＢ ベータイソ型、脆弱性Ｘ症候群におけるＦＭＲ１（脆弱性Ｘ精神遅滞１）、脆弱性Ｘ関連振戦／失調症候群におけるＦＭＲ１（脆弱性Ｘ精神遅滞１）、脆弱性ＸＥ精神遅滞におけるＦＭＲ１（脆弱性Ｘ精神遅滞２）もしくはＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー２；筋緊張性ジストロフィーにおけるミオトニン−プロテインキナーゼ（ＭＴ−ＰＫ）；フリードライヒ失調症におけるフラタキシン；筋萎縮性側索硬化症におけるスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子の変異体；パーキンソン病および／もしくはアルツハイマー病の病因に関わる遺伝子；アポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯＢ）およびプロタンパク質変換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、高コレステロール血症（ｈｙｐｅｒｃｏｌｏｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）；ＨＩＶ感染症におけるＨＩＶ Ｔａｔ、転写遺伝子のヒト免疫不全ウイルストランス活性化因子；ＨＩＶ感染症におけるＨＩＶ ＴＡＲ、ＨＩＶ ＴＡＲ、ヒト免疫不全ウイルストランス活性化因子応答要素遺伝子；ＨＩＶ感染症におけるＣ−Ｃケモカイン受容体（ＣＣＲ５）；ＲＳＶ感染症におけるラルス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ヌクレオカプシドタンパク質、Ｃ型肝炎ウイルス感染症における肝臓特異的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１２２）；ｐ５３、急性腎障害もしくは遅延移植片機能腎移植（ｄｅｌａｙｅｄ ｇｒａｆｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｋｉｄｎｅｙ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）もしくは腎障害急性腎不全；進行性（ａｄｖａｎｃｅ）、再発性もしくは転移性の固形悪性腫瘍におけるプロテインキナーゼＮ３（ＰＫＮ３）；ＬＭＰ２（ＬＭＰ２は、プロテアソームサブユニットベータ９型（ＰＳＭＢ ９）としても知られている）、転移性メラノーマ；ＬＭＰ７（プロテアソームサブユニットベータ８型（ＰＳＭＢ ８）としても知られている）、転移性メラノーマ；ＭＥＣＬ１（プロテアソームサブユニットベータ１０型（ＰＳＭＢ １０）としても知られている）、転移性メラノーマ；固形腫瘍における血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；固形腫瘍におけるキネシン紡錘タンパク質、慢性骨髄性白血病におけるアポトーシスサプレッサーＢ細胞ＣＬＬ／リンパ腫（ＢＣＬ−２）；固形腫瘍におけるリボヌクレオチドレダクターゼＭ２（ＲＲＭ２）；固形腫瘍におけるフューリン；肝臓腫瘍におけるポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）、Ｃ型肝炎感染症におけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１（ＤＧＡＴ１）、家族性腺腫性ポリポーシスにおけるベータカテニン；ベータ２アドレナリン受容体、緑内障；糖尿病黄斑浮腫（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｍａｃｕｌａｒ ｏｅｄｍａ）（ＤＭＥ）もしくは加齢関連黄斑変性症におけるＲＴＰ８０１／Ｒｅｄｄｌ（ＤＡＮ損傷誘導性転写産物４タンパク質としても知られている）；加齢黄斑変性症もしくは脈絡膜血管新生における血管内皮成長因子受容体Ｉ（ＶＥＧＦＲ１）、非動脈炎性虚血性視神経症におけるカスパーゼ２；先天性爪肥厚症（ｐａｃｈｙｏｎｙｃｈｉａ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ）におけるケラチン６Ａ Ｎ１７Ｋ変異体タンパク質；インフルエンザ感染症におけるインフルエンザＡウイルスゲノム／遺伝子配列；重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）感染症におけるＳＡＲＳコロナウイルスゲノム／遺伝子配列；呼吸器多核体ウイルス感染症における呼吸器多核体ウイルスゲノム／遺伝子配列；エボラ感染症におけるエボラフィロウイルスゲノム／遺伝子配列；Ｂ型およびＣ型肝炎感染症におけるＢ型およびＣ型肝炎ウイルスゲノム／遺伝子配列；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染症におけるＨＳＶゲノム／遺伝子配列、コクサッキーウイルスＢ３感染症におけるコクサッキーウイルスＢ３ゲノム／遺伝子配列；原発性ジストニアにおけるトーシンＡ（ＴＯＲ１Ａ）のような遺伝子の病原性アレルのサイレンシング（アレル特異的サイレンシング）、移植におけるｐａｎ−クラスＩおよびＨＬＡアレル特異的；常染色体優性遺伝性網膜色素変性症（ａｄＲＰ）における変異ロドプシン遺伝子（ＲＨＯ）の発現を阻害する阻害性核酸；または前記の遺伝子もしくは配列のいずれかの転写産物に結合する阻害性核酸を含む。

【0112】

核酸（プラスミド）は、一重、二重または三重、線状または環状であることができ、あらゆる長さであることができる。核酸（プラスミド）の議論において、特定のポリヌクレオチドの配列または構造は、５’〜３’方向に配列を提供する慣習に従って本明細書で記載され得る。

【0113】

本明細書で述べられるようなトランスフェクションカクテルと接触させられる細胞は、“宿主細胞”と呼ばれ得る。“宿主細胞”は、例えばパッケージングタンパク質、例えばＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸（プラスミド）、ヘルパータンパク質をコードする核酸（プラスミド）、タンパク質をコードしているかもしくは対象の転写産物へと転写される核酸（プラスミド）または他の転移核酸（プラスミド）のレシピエントとして使用されることができるかまたは使用されていた微生物、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞を意味する。その用語は、形質導入またはトランスフェクションされた元の細胞の子孫を含む。従って、本明細書で使用される“宿主細胞”は、一般に外因性核酸配列を形質導入またはトランスフェクションされている細胞を指す。単一の親細胞の子孫は、自然、偶発的または意図的な変異のために、形態においてまたはゲノムもしくは総核酸相補配列（ｔｏｔａｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）において元の親と必ずしも完全に同一であるとは限らない可能性があることは、理解されている。

【0114】

用語“形質導入する”および“トランスフェクションする”は、核酸（プラスミド）のような分子の宿主細胞中への導入を指す。細胞は、外因性の核酸が細胞膜の内側に導入されている場合、“形質導入されている”、または“トランスフェクションされている”。従って、“形質導入された細胞”または“トランスフェクションされた細胞”は、核酸もしくはポリヌクレオチドが導入されている細胞または外因性核酸が導入されているその子孫である。

【0115】

“形質導入された”または“トランスフェクションされた”細胞において、核酸（プラスミド）は、レシピエント細胞のゲノム核酸中に組み込まれていてもいなくてもよい。導入された核酸がレシピエント細胞または生物の核酸（ゲノムＤＮＡ）中に組み込まれた状態になる場合、それは、その細胞または生物において安定に維持されることができ、さらにレシピエント細胞または生物の子孫細胞または生物に移されるか、または遺伝することができる。最後に、導入された核酸は、レシピエント細胞または宿主生物において染色体外に、または一過性にのみ存在することができる。

【0116】

用語“ベクター”は、小さなキャリヤー核酸分子、プラスミド、ウイルス（例えばＡＡＶベクター）または核酸の挿入もしくは組み込みによって操作されることができる他のビヒクルを指す。そのようなベクターは、遺伝子操作（すなわち“クローニングベクター”）のために、ポリヌクレオチドを細胞中に導入する／移すために、そして挿入されたポリヌクレオチドを細胞中で転写または翻訳するために使用されることができる。

【0117】

“発現ベクター”は、宿主細胞における発現に必要とされる必要な調節領域を有する遺伝子または核酸配列を含有する特殊なベクターである。ベクター核酸配列は、一般に少なくとも細胞中での繁殖のための複製起点および場合により追加の要素、例えば異種ポリヌクレオチド配列、発現制御要素（例えばプロモーター、エンハンサー）、イントロン、ＩＴＲ（単数または複数）、選択可能なマーカー（例えば抗生物質耐性）、ポリアデニル化シグナルを含有する。本発明の目的に関して、“ベクター”は、本明細書で述べられる際、この用語が本明細書で使用されるように“プラスミド”の範囲内である。

【0118】

ウイルスベクターは、ウイルスゲノムを含む１つ以上の核酸要素に由来するか、またはそれに基づいている。特定のウイルスベクターは、レンチウイルス、シュードタイプレンチウイルスおよびパルボウイルスベクター、例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。ＡＡＶベクターは、天然（すなわち野生型）または非天然（例えば組換え）ＡＡＶ血清型（例えばＡＡＶ１〜１２であるがそれらに限定されない）、ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２および／もしくはＶＰ３カプシドタンパク質、または改変もしくはバリアントＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２および／もしくはＶＰ３カプシドタンパク質、または野生型ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２および／もしくはＶＰ３カプシドタンパク質のいずれを含むこともできる。

【0119】

ベクター、例えば組換えウイルス、例えばレンチウイルスまたはパルボウイルス（例えばＡＡＶ）ベクターの修飾語ならびに組換えポリヌクレオチドおよびポリペプチドのような配列の修飾語としての“組み換え”という用語は、組成物が、一般に天然では発生しない様式で操作されている（すなわち工学的に操作されている）ことを意味する。ＡＡＶベクターのような組換えベクターの特定の例は、野生型ウイルス（例えばＡＡＶ）ゲノム中に通常は存在しないポリヌクレオチドがウイルスゲノム内に挿入されている、すなわち異種である場合であろう。用語“組み換え”は、本明細書において常にベクター、例えばウイルスベクターおよびＡＡＶベクターならびに配列、例えばポリヌクレオチドを参照して使用されるわけではないが、ポリヌクレオチドを含む組換え形態は、あらゆるそのような省略にもかかわらず、明確に含まれる。

【0120】

組換えウイルスベクターまたはＡＡＶベクターは、ウイルス、例えばＡＡＶの野生型ゲノムから、そのウイルス（例えばＡＡＶ）から野生型ゲノムを除去して非天然核酸、例えば転写産物へと転写される核酸またはタンパク質をコードする核酸で置き換える分子的方法を用いることにより得られる。典型的には、ＡＡＶに関して、ＡＡＶゲノムの一方または両方の逆位末端反復（ＩＴＲ）配列が、ＡＡＶベクター中に保持される。組換えウイルスベクター（例えばＡＡＶ）は、ウイルスゲノムの全部または一部がウイルス（例えばＡＡＶ）ゲノム核酸に関して非天然（すなわち異種）の配列で置き換えられているため、ウイルス（例えばＡＡＶ）ゲノムとは区別される。従って、非天然配列の組み込みは、ウイルスベクター（例えばＡＡＶ）を組換えベクターとして定義し、それは、ＡＡＶの場合にはｒＡＡＶベクターと呼ばれ得る。

【0121】

組換えベクター（例えばレンチ、パルボ、ＡＡＶ）配列は、エキソビボ、インビトロまたはインビボでの細胞のその後の感染（形質導入）のためにパッケージングされることができる（本明細書において粒子と呼ばれる）。組換えベクター配列がカプシド形成またはパッケージングされてＡＡＶ粒子になる場合、粒子はまた、ｒＡＡＶとも呼ばれ得る。そのような粒子は、ベクターゲノムをカプシド形成またはパッケージングするタンパク質を含む。特定の例は、ウイルスエンベロープタンパク質、ＡＡＶの場合にはカプシドタンパク質、例えばＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を含む。

【0122】

ベクターゲノムは、最終的にパッケージングまたはカプシド形成されてウイルス（例えばＡＡＶ）粒子を形成する組換えプラスミド配列の部分を指す。組換えプラスミドを用いて組換えベクターを構築または製造する場合、ベクターゲノムは、組換えプラスミドのベクターゲノム配列に対応しないプラスミドの部分を含まない。組換えプラスミドのこの非ベクターゲノム部分は、プラスミド骨格と呼ばれ、それは、繁殖および組換えウイルスの産生に必要なプロセスであるプラスミドのクローニングおよび増幅のために重要であるが、それ自体はウイルス（例えばＡＡＶ）粒子中にパッケージングまたはカプシド形成されない。従って、ベクターゲノムは、ウイルス（例えばＡＡＶ）によってパッケージングまたはカプシド形成される核酸を指す。

【0123】

用語“空のカプシド”および“空の粒子”は、ＡＡＶタンパク質シェルを含むがタンパク質をコードする核酸の全部もしくは一部を欠いているかまたはＡＡＶ ＩＴＲによって隣接された対象の転写産物へと転写されるＡＡＶビリオンを指す。従って、空のカプシドは、タンパク質をコードする核酸または対象の転写産物へと転写される核酸を宿主細胞中に移すように機能しない。しかし、空カプシド配合物は、他の適用において有用性を有する。

【0124】

本明細書で使用される際、ＡＡＶパッケージングタンパク質は、生産的なＡＡＶ複製のためにトランスで機能するＡＡＶ由来の配列を指す。従って、ＡＡＶパッケージングタンパク質は、主要なＡＡＶのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であるｒｅｐおよびｃａｐによってコードされる。ｒｅｐタンパク質は、とりわけ、ＡＡＶのＤＮＡ複製起点の認識、結合およびニッキング；ＤＮＡヘリカーゼ活性；ならびにＡＡＶ（または他の異種）プロモーターからの転写の調節を含む多くの機能を有することが示されている。キャップ（カプシド）タンパク質は、必要なパッケージング機能を供給する。ＡＡＶパッケージングタンパク質は、本明細書において、ＡＡＶベクターから欠けているＡＡＶ機能をトランスで補完するために用いられる。

【0125】

ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸は、一般に、形質導入する組換えＡＡＶベクターを生成するために使用されるべきＡＡＶベクターから削除されたＡＡＶ機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子を指す。ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸は、一般にＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子の一過性発現を提供してＡＡＶ複製に必要である欠けているＡＡＶ機能を補完するために使用される；しかし、核酸コンストラクトは、ＡＡＶ ＩＴＲを欠いており、それら自体を複製することもパッケージングすることもできない。ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルスまたはビリオンの形態であり得る。ＲｅｐおよびＣａｐ発現産物の両方をコードする一般的に使用されているプラスミドｐＡＡＶ／ＡｄおよびｐＩＭ２９＋４５のようないくつかの核酸コンストラクトが、記載されている。例えば、Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828;およびMcCarty et al. (1991) J. Virol. 65:2936-2945を参照。ＲｅｐおよびＣａｐ発現産物をコードするいくつかのベクターが、記載されている（例えば米国特許第５，１３９，９４１号および第６，３７６，２３７号）。

【0126】

ヘルパータンパク質をコードする核酸という用語は、一般に、ヘルパー機能（単数または複数）を提供するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子（単数または複数）を指す。ヘルパータンパク質（単数または複数）をコードする核酸（単数または複数）を有するベクターは、適切な宿主細胞中にトランスフェクションされることができ、ここで、ベクターは、次いで宿主細胞中でのＡＡＶビリオン産生を支持することができる。その用語から明確に除外されるのは、天然に存在するままの感染性ウイルス粒子、例えばアデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス粒子である。

【0127】

ヘルパータンパク質ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾンまたはコスミドの形態であり得る。特に、アデノウイルス遺伝子の完全相補配列はヘルパー機能に必要ではないことが、実証されている。例えばＤＮＡ複製および後期遺伝子合成ができないアデノウイルス変異体は、ＡＡＶ複製に関して許容的（ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ）であることが示されている。Ito et al., (1970) J. Gen. Virol. 9:243; Ishibashi et al, (1971) Virology 45:317。

【0128】

Ｅ２ＢおよびＥ３領域内の変異体は、ＡＡＶ複製を支持することが示されており、これは、Ｅ２ＢおよびＥ３領域がおそらくヘルパー機能の提供に関わっていないことを示している。Carter et al:, (1983) Virology 126:505。しかし、Ｅｌ領域において欠陥がある、または欠失したＥ４領域を有するアデノウイルスは、ＡＡＶ複製を支持することができない。従って、アデノウイルスヘルパータンパク質に関して、ＥＩＡおよびＥ４領域は、おそらく直接的または間接的のどちらかでＡＡＶ複製に必要とされている。Laughlin et al., (1982) J. Virol. 41:868; Janik et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1925; Carter et al., (1983) Virology 126:505。他の特性付けられたＡｄ変異体は、以下の変異体を含む：ＥＩＢ(Laughlin et al. (1982), 上記; Janik et al. (1981), 上記; Ostrove et al., (1980) Virology 104:502); Ｅ２Ａ(Handa et al., (1975) J. Gen. Virol. 29:239; Strauss et al., (1976) J. Virol. 17: 140; Myers et al., (1980) J. Virol. 35:665; Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2927; Myers et al., (1981) J. Biol. Chem. 256:567); Ｅ２Ｂ(Carter, Adeno-Associated Virus Helper Functions, I CRC Handbook of Parvoviruses中 (P. Tijssen 編者, 1990)); Ｅ３(Carter et al. (1983), 上記);およびＥ４(Carter et al.(1983), 上記; Carter (1995))。

【0129】

ＥＩＢ中に変異を有するアデノウイルスによって提供されるヘルパータンパク質の研究は、Ｅｌ Ｂ５５ｋがＡＡＶビリオン産生に必要であり、一方でＥＩＢ １９ｋは必要ではないことを報告している。加えて、国際公開９７／１７４５８号およびMatshushita et al., (1998) Gene Therapy 5:938-945は、様々なＡｄ遺伝子をコードするヘルパー機能ベクターを記載している。ヘルパーベクターの例は、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡコード領域、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６コード領域、アデノウイルスＥ２Ａ ７２ｋＤコード領域、アデノウイルスＥＩＡコード領域および完全なＥＩ ＢＳ５ｋコード領域を欠くアデノウイルスＥＩＢ領域を含む（例えば国際公開第０１／８３７９７号を参照）。

【0130】

導入遺伝子は、本明細書において、細胞または生物中に導入されることが意図されている、または導入された核酸を便宜的に指すために使用されている。導入遺伝子は、あらゆる核酸、例えば転写産物へと転写される遺伝子または対象のポリペプチドもしくはタンパク質をコードする遺伝子を含む。

【0131】

発現制御要素は、作動可能に連結された核酸の発現に影響を与える核酸配列（単数または複数）を指す。制御要素は、プロモーター、エンハンサー等のような本明細書で述べられる発現制御要素を含む。ＡＡＶベクターを含むベクター配列は、１以上の発現制御要素を含むことができる。典型的には、そのような要素は、適切な異種ポリヌクレオチドの転写および適切な場合には翻訳を促進するために含まれる（例えばプロモーター、エンハンサー、イントロンに関するスプライシングシグナル、ｍＲＮＡのインフレーム翻訳を可能にするための遺伝子の正しいリーディングフレームの維持および停止コドン等）。そのような要素は、典型的にはシスで作用し、“シス作用性”要素と呼ばれるが、トランスでも作用し得る。

【0132】

発現制御は、転写、翻訳、スプライシング、メッセージ安定性等のレベルであり得る。典型的には、転写を調節する発現制御要素は、転写される核酸の５’末端（すなわち上流）付近に並置される。発現制御要素は、転写される配列の３’末端（すなわち下流）に、または転写産物内（例えばイントロン中）にも位置し得る。発現制御要素は、転写される配列に隣接して、または転写される配列からある距離（例えばポリヌクレオチドから１〜１０、１０〜２５、２５〜５０、５０〜１００、１００〜５００またはより多くのヌクレオチド）離れて位置することができ、かなりの距離離れて位置することさえできる。それでもなお、ＡＡＶベクターのような特定のベクターの長さ制限のために、発現制御要素は、典型的には転写される核酸から１〜１０００ヌクレオチドの範囲内にあるであろう。

【0133】

機能的には、作動可能に連結された核酸の発現は、その要素（例えばプロモーター）によって、その要素が核酸の転写を調節し、そして適切な場合にはその転写産物の翻訳を調節するように、少なくとも部分的に制御可能である。発現制御要素の具体的な例は、プロモーターであり、それは、通常は転写される配列の５’に配置されている。プロモーターは、典型的にはプロモーターが存在しない場合に発現される量と比較して、作動可能に連結された核酸から発現される量を増加させる。

【0134】

本明細書で使用されるエンハンサーは、異種ポリヌクレオチドに隣接して位置する配列を指すことができる。エンハンサー要素は、典型的にはプロモーター要素の上流に位置するが、機能し、核酸配列の下流または内部に位置することもできる。従って、エンハンサー要素は、核酸の１００塩基対、２００塩基対または３００塩基対以上上流または下流に位置することができる。エンハンサー要素は、典型的には作動可能に連結された核酸の発現をプロモーター要素によって与えられる発現よりも増加させる。

【0135】

発現コンストラクトは、特定の細胞または組織型における発現を駆動する役目を果たす調節要素を含むことができる。発現制御要素（例えばプロモーター）は、特定の組織または細胞型において活性なものを含み、それは、本明細書において“組織特異的発現制御要素／プロモーター”と呼ばれる。組織特異的発現制御要素は、典型的には特定の細胞または組織（例えば肝臓）において活性である。発現制御要素は、典型的にはそれらが特定の細胞、組織または器官のタイプに特有である転写活性化因子タンパク質または他の転写の調節因子によって認識されるため、特定の細胞、組織または器官において活性である。そのような調節要素は、当業者には既知である（例えばSambrook et al. (1989)およびAusubel et al. (1992)を参照）。 [0173] 本発明のプラスミドにおける組織特異的調節要素の組み込みは、核酸の発現に関する少なくとも部分的な組織指向性を提供する。肝臓で活性なプロモーターの例は、とりわけＴＴＲプロモーター（例えば変異体ＴＴＲプロモーター）、ヒトアルファ１−アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター；アルブミン、Miyatake, et al. J. Virol., 71:5124-32 (1997)；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Sandig, et al., Gene Ther. 3: 1002-9 (1996)；アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Arbuthnot, et al., Hum. Gene. Ther., 7: 1503-14 (1996)］である。肝臓で活性なエンハンサーの例は、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）ＨＣＲ−１およびＨＣＲ−２である(Allan et al., J. Biol. Chem., 272:29113-19 (1997))。

【0136】

発現制御要素は、多くの異なる細胞型においてポリヌクレオチドの発現を駆動することができるユビキタスまたは無差別（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）プロモーター／エンハンサーも含む。そのような要素は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター／エンハンサー配列、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター／エンハンサー配列および様々な哺乳類細胞型において活性な他のウイルスプロモーター／エンハンサー、または天然には存在しない合成要素（例えばBoshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)参照）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、細胞質β−アクチンプロモーターおよびホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを含むが、それらに限定されない。

【0137】

ベクターに関する追加の要素は、限定ではなく、転写終結シグナルもしくは停止コドン、１コピー以上のＡＡＶ ＩＴＲ配列のような配列に隣接する５’もしくは３’非翻訳領域（例えばポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）配列）、フィラー（ｆｉｌｌｅｒ）もしくはスタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）ポリヌクレオチド配列またはイントロンを含む。

【0138】

フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、パッケージングを向上させ、混入する核酸の存在を低減する。ＡＡＶベクターは、典型的には、一般に約４ｋｂ〜約５．２ｋｂまたはそれよりわずかに大きいサイズ範囲を有するＤＮＡの挿入断片を受け入れる。従って、より短い配列に関して、ＡＡＶベクターのウイルス粒子中へのパッケージングに許容可能なウイルスゲノム配列の通常のサイズ付近または通常のサイズに長さを調整するために、スタッファーまたはフィラーを含める。様々な態様において、フィラー／スタッファー核酸配列は、核酸の非翻訳（タンパク質をコードしていない）セグメントである。４．７Ｋｂ未満の核酸配列に関して、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、その配列と組み合わせられた（例えばベクター中に挿入された）際に約３．０〜５．５Ｋｂ、または約４．０〜５．０Ｋｂ、または約４．３〜４．８Ｋｂの全長を有する長さを有する。

【0139】

イントロンは、ＡＡＶベクターのウイルス粒子中へのパッケージングのための長さを達成するためのフィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列としても機能し得る。フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列として機能するイントロンおよびイントロンフラグメントは、発現を増強することもできる。

【0140】

作動可能に連結されているという用語は、コード配列の発現に必要な調節配列が、コード配列の発現をもたらすようにコード配列に関して適切な位置に配置されていることを意味する。この同じ定義は、発現ベクター中のコード配列および転写制御要素（例えばプロモーター、エンハンサーおよび終結要素）の配置に時々適用される。この定義は、ハイブリッド核酸分子が生成される第１および第２の核酸分子の核酸配列の配置にも時々適用される。

【0141】

核酸と作動可能に連結された発現制御要素の例において、その関係は、制御要素が核酸の発現を調節するようなものである。より具体的には、例えば作動可能に連結された２つのＤＮＡ配列は、２つのＤＮＡがＤＮＡ配列の少なくとも一方が他方の配列に対して生理的作用を発揮することができるような関係で（シスまたはトランスで）配置されていることを意味する。

【0142】

単離されたという用語は、組成物の修飾語として使用される場合、組成物が人の手によって作られているか、または完全にもしくは少なくとも部分的にそれらの天然に存在するインビボ環境から分離されていることを意味する。一般に、単離された組成物は、それらが通常天然において会合している１種類以上の物質、例えばタンパク質、核酸、脂質、炭水化物、細胞膜のような１種類以上の混入物質を実質的に含まない。

【0143】

単離されたという用語は、人の手によって生成された組み合わせ、例えば組換えベクター（例えばｒＡＡＶ）配列またはベクターゲノムをパッケージングもしくはカプシド形成したウイルス粒子および医薬配合物を除外しない。用語“単離された”はまた、組成物の代替の物理的形態、例えばハイブリッド／キメラ、マルチマー／オリゴマー、修飾（例えばリン酸化、糖鎖付加、脂質付加）もしくは誘導体化された形態、または人の手によって生成された宿主細胞中で発現された形態を除外しない。

【0144】

実質的に純粋という用語は、対象の化合物（例えば核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質等）を少なくとも５０〜６０重量％含む調製物を指す。調製物は、少なくとも７５重量％または約９０〜９９重量％の対象の化合物を含むことができる。純度は、対象の化合物に適した方法（例えばクロマトグラフィー的方法、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析等）によって測定される。

【0145】

本明細書での値またはパラメータに関する言及は、それ自体がその値またはパラメータに向けられている態様を含む（および記載する）。例えば、“約Ｘ”に言及する記載は、“Ｘ”の記載を含む。数値範囲は、範囲を定める数を含む。一般的に言って、用語“約”は、変数の示された値および示された値の実験的誤差内（例えば平均値の９５％信頼区間内）または示された値の１０パーセント以内（いずれかより大きい方）である変数の全ての値を指す。

【0146】

本発明の側面または態様が代替物のマーカッシュ群または他のグループ分けに関して記載されている場合、本発明は、全体として列挙されている群全体だけでなく、群の各メンバーを個別に、そして主な群の全ての可能な下位群だけでなく群のメンバーの１つ以上を欠いた主な群も包含する。本発明は、特許請求される発明において、群のメンバーのいずれかの１つ以上の明示的な除外も想定している。

【0147】

本発明またはその好ましい態様（単数または複数）の要素を導入する場合、“ａ”、“ａｎ”、“ｔｈｅ”および“ｓａｉｄ”は、要素の１つ以上が存在することを意味することが意図されている。用語“含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”、“含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）”、“含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）”、“含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）”および“有すること”は、包括的であることが意図されており、列挙された要素以外の追加の要素が存在し得ることを意味する。本明細書において態様が“含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”という言葉を用いて記載されている場合はどこでも、“からなる”および／または“から本質的になる”の用語で記載されているその他の点では類似の態様も提供されることは、理解されている。

【0148】

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技法用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本明細書が、支配するであろう。文脈によって別途要求されない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。

【0149】

例示的な方法および材料が、本明細書で記載されているが、本明細書で記載された方法および材料と類似した、または均等な方法および材料も、本発明の実施または試験において使用されることができる。材料、方法、および実施例は、単に例示的なものであり、限定することは意図されていない。

【0150】

組成物および方法
ある側面において、細胞に１種類以上の核酸をトランスフェクションするための方法が、提供される。その方法は、以下の工程を含む：（ｉ）１種類以上の陽イオン性ポリマー、安定剤および１種類以上の核酸を含むトランスフェクションカクテルを調製し、（ｉｉ）工程（ｉ）で調製されたトランスフェクションカクテルを、トランスフェクションされるべき細胞と接触させて混合物を形成し、そして（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の混合物をインキュベートし、それにより細胞に１種類以上の核酸をトランスフェクションする。

【0151】

ある側面において、細胞に１種類以上の核酸をトランスフェクションするための方法が、提供される。その方法は、以下の工程：（ｉ）トランスフェクションカクテルを、トランスフェクションされるべき細胞と接触させて混合物を形成し、そして（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の混合物をインキュベートし、それにより細胞に１種類以上の核酸をトランスフェクションする；を含み、ここで、トランスフェクションカクテルは、１種類以上の陽イオン性ポリマー、安定剤および１種類以上の核酸を含む。

【0152】

ある側面において、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを産生する細胞を作製するための方法が、提供される。その方法は、以下の工程を含む：（ｉ）１種類以上の陽イオン性ポリマー、安定剤および１種類以上の核酸を含むトランスフェクションカクテルを調製し、（ｉｉ）工程（ｉ）で調製されたトランスフェクションカクテルをトランスフェクションされるべき細胞と接触させて混合物を形成し、そして（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の混合物をインキュベートし、それによりｒＡＡＶベクターを産生するトランスフェクションされた細胞を作製する。

【0153】

ある側面において、１種類以上の核酸を有する細胞のトランスフェクションを増大させるための方法が、提供される。その方法は、以下の工程を含む：（ｉ）１種以上の陽イオン性ポリマー、安定剤および１種以上の核酸を含むトランスフェクションカクテルを調製し、（ｉｉ）工程（ｉ）で調製されたトランスフェクションカクテルを、トランスフェクションされるべき細胞と接触させて混合物を形成し、そして（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の混合物をインキュベートし、それにより１種類以上の核酸を用いる細胞のトランスフェクションが、安定剤の非存在下であること以外同じ条件下で実施される細胞のトランスフェクションと比較して増大する。

【0154】

ある側面において、高力価組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを生産するための方法が、提供される。その方法は、以下の工程：（ｉ）１種類以上の陽イオン性ポリマー、安定剤および１種類以上の核酸を含むトランスフェクションカクテルを調製し、（ｉｉ）工程（ｉ）で調製されたトランスフェクションカクテルをトランスフェクションされるべき細胞と接触させて混合物を形成し、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の混合物をインキュベートしてｒＡＡＶベクターを産生するトランスフェクトされた細胞を作製し、そして（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で生産されたトランスフェクションされた細胞からｒＡＡＶベクターを単離および／または精製する；を含み、
ここにおいて、工程（ｉ）の開始〜工程（ｉｉ）の完了の時間は、１０秒よりも長く、かつここで、ｒＡＡＶ力価は、安定剤の非存在下であること以外同じ条件下でもたらされるｒＡＡＶ力価と比較して、少なくとも２倍、かつ／または少なくとも５％増大する。

【0155】

工程（ｉ）の開始（すなわちトランスフェクションカクテルの調製）〜工程（ｉｉ）の完了（すなわち工程（ｉ）で調製されたトランスフェクションカクテルをトランスフェクションされるべき細胞と接触させて混合物を形成すること）の時間は、約１０秒〜約１０日のどの時間であることもできる。ある態様において、工程（ｉ）の開始〜工程（ｉｉ）の完了の時間は、約１５秒〜約５日、約３０秒〜約２日、約６０秒〜約１日、約９０秒〜約１０時間、約９０秒〜約８時間、約２分〜約４時間、約４分〜約２時間、約６分〜約１時間または約１０分〜約３０分である。ある態様において、工程（ｉ）の開始〜工程（ｉｉ）の完了の時間は、約１分より長く、約２分より長く、約６分より長く、約８分より長く、約１０分より長く、約１５分より長く、約３０分より長く、約１時間より長く、約２時間より長く、約６時間より長く、約８時間より長く、約１０時間より長く、約１２時間より長く、約２４時間より長く、または２日より長い。

【0156】

ある態様において、工程（ｉ）の開始〜工程（ｉｉ）の完了の時間は、２分である。ある態様において、工程（ｉ）の開始〜工程（ｉｉ）の完了の時間は、１０分である。ある態様において、工程（ｉ）の開始〜工程（ｉｉ）の完了の時間は、３０分である。ある態様において、工程（ｉ）の開始〜工程（ｉｉ）の完了の時間は、２分より長く、１０分より長く、または３０分より長い。

【0157】

ある態様において、工程（ｉ）の開始〜工程（ｉｉ）の完了の時間は、トランスフェクションカクテルのインキュベーション時間を含まない。ある態様において、工程（ｉ）の開始〜工程（ｉｉ）の完了の時間は、トランスフェクションカクテルのインキュベーション時間を含む。本明細書で使用される際、用語“トランスフェクションカクテルのインキュベーション時間”は、工程（ｉ）の調製されたトランスフェクションカクテルが、トランスフェクションされるべき細胞と接触させられる前にインキュベートされる時間を指す。ある態様において、工程（ｉ）におけるトランスフェクションカクテルは、工程（ｉｉ）の前に約１０秒〜約１０日、約１５秒〜約５日、約３０秒〜約２日、約６０秒〜約１日、約９０秒〜約１０時間、約９０秒〜約８時間、約２分〜約４時間、約４分〜約２時間、約６分〜約１時間または約１０分〜約３０分インキュベートされる。ある態様において、工程（ｉ）のトランスフェクションカクテルは、工程（ｉｉ）の前に約１分より長い時間、約２分より長い時間、約６分より長い時間、約８分より長い時間、約１０分より長い時間、約１５分より長い時間、約３０分より長い時間、約１時間より長い時間、約２時間より長い時間、約６時間より長い時間、約８時間より長い時間、約１０時間より長い時間、約１２時間より長い時間、約２４時間より長い時間または２日より長い時間インキュベートされる。

【0158】

ある態様において、トランスフェクションカクテルは、工程（ｉｉ）の前に約４℃〜およそ室温でインキュベートされる。ある態様において、トランスフェクションカクテルは、工程（ｉｉ）の前におよそ室温でインキュベートされる。

【0159】

トランスフェクションカクテルは、１種類以上の陽イオン性ポリマー、安定剤および１種類以上の核酸を含む。ある態様において、トランスフェクションカクテルは、まず１種類以上の陽イオン性ポリマーを安定剤と混合して結果として生じる混合物を形成し、次いでそれが１種類以上の核酸に添加される、ことによって調製される。ある態様において、トランスフェクションカクテルは、まず安定剤を１種類以上の核酸と混合して結果として生じる混合物を形成し、次いでそれが１種類以上の陽イオン性ポリマーに添加される、ことによって調製される。ある態様において、トランスフェクションカクテルは、まず１種類以上の陽イオン性ポリマーを１種類以上の核酸と混合して結果として生じる混合物を形成し、次いでそれが安定剤に添加される、ことによって調製される。高い（例えば約１８×１０^６細胞／ｍＬより大きい）細胞密度においてトランスフェクションされる細胞に関して、トランスフェクションカクテルは、まず安定剤を１種類以上の核酸と混合して結果として生じる混合物を形成し、次いでそれが１種類以上の陽イオン性ポリマーに添加される、ことによって調製されることができる。低い（例えば約１８×１０^６細胞／ｍＬ未満）細胞密度においてトランスフェクションされる細胞に関して、トランスフェクションカクテルは、その構成要素（すなわち核酸、陽イオン性ポリマーおよび安定剤）をあらゆる順序で混合することによって調製されることができる。

【0160】

ある態様において、結果として生じる混合物は、１種類以上の核酸、１種類以上の陽イオン性ポリマーまたは安定剤に混合を伴わずに添加される。ある態様において、結果として生じる混合物は、１種類以上の核酸、１種類以上の陽イオン性ポリマーまたは安定剤に添加され、約１０の毎分回転数（ｒｐｍ）、約２０ｒｐｍ、約２５ｒｐｍ、約３０ｒｐｍ、約３５ｒｐｍ、約４０ｒｐｍ、約４５ｒｐｍ、約５０ｒｐｍ、約５５ｒｐｍ、約６０ｒｐｍ、約６５ｒｐｍ、約７０ｒｐｍ、約７５ｒｐｍ、約８０ｒｐｍ、約８５ｒｐｍ、約９０ｒｐｍ、約９５ｒｐｍ、約１００ｒｐｍ、約１１０ｒｐｍ、約１２０ｒｐｍ、約１３０ｒｐｍ、約１４０ｒｐｍ、約１５０ｒｐｍ、約２００ｒｐｍ、約３００ｒｐｍ、約４００ｒｐｍまたは約５００ｒｐｍで混合される。ある態様において、結果として生じる混合物は、１種類以上の核酸、１種類以上の陽イオン性ポリマーまたは安定剤に添加され、約１２０ｒｐｍで混合される。

【0161】

トランスフェクションカクテルは、約４℃〜およそ室温で調製されることができる。ある態様において、トランスフェクションカクテルは、およそ室温で調製される。用語‘室温’は、本明細書で使用される際、２０℃〜２５℃の範囲の温度を指す。

【0162】

本明細書で使用される際、用語“陽イオン性ポリマー”は、核酸（例えばＤＮＡ）を凝縮する能力を有する正に荷電したポリマーを指すことが意図される。陽イオン性ポリマーは、高分子電解質および陽イオン性ポリペプチドを含む。陽イオン性ポリマーの限定的でない例は、キトサン、ポリ−Ｌ−リジン（ｐＬＬ）、ポリアミン（ＰＡ）、ポリアルキレンイミン（ＰＡＩ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ［ａ−（−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸］、ポリアミドアミン、ポリ（２−ジメチルアミノ）エチル メタクリレート、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、ポリ（４−ビニルピリジン）、ポリ（ビニルアミン）およびポリ（４−ビニル−Ｎ−アルキルピリジニウムハライド）を含む。

【0163】

陽イオン性ポリマーは、分枝状または線状であることができる。ある態様において、陽イオン性ポリマーは、遊離塩基形態で約５００Ｄａ〜約１６０，０００Ｄａおよび／または約２，５００Ｄａ〜約２５０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。

【0164】

ある態様において、陽イオン性ポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはポリ−Ｌ−リジン（ｐＬＬ）である。ある態様において、陽イオン性ポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。ＰＥＩは、線状ＰＥＩまたは分枝状ＰＥＩであることができる。ＰＥＩは、塩の形態または遊離塩基であることができる。ある態様において、ＰＥＩは、線状ＰＥＩ、例えば場合により加水分解された線状ＰＥＩである。加水分解されたＰＥＩは、完全にまたは部分的に加水分解されていることができる。加水分解された線状ＰＥＩは、加水分解されていない線状ＰＥＩと比較してより大きい割合の遊離（プロトン化可能な）窒素を有し、典型的には加水分解されていない線状ＰＥＩと比較して少なくとも１〜５％多い遊離（プロトン化可能な）窒素を有し、より典型的には加水分解されていない線状ＰＥＩと比較して５〜１０％多い遊離（プロトン化可能な）窒素を有し、または最も典型的には加水分解されていない線状ＰＥＩと比較して１０〜１５％多い遊離（プロトン化可能な）窒素を有する。

【0165】

ある態様において、ＰＥＩは、約４，０００〜約１６０，０００の範囲および／または約２，５００〜約２５０，０００の範囲の分子量を遊離塩基形態で有することができる。ある態様において、ＰＥＩは、遊離塩基形態で約４０，０００の分子量および／または約２５，０００の分子量を有することができる。ある態様において、ＰＥＩは、遊離塩基形態で約４０，０００の分子量および／または約２２，０００の分子量を有することができる。ある態様において、陽イオン性ポリマーは、遊離塩基形態で約４０，０００の分子量および／または約２２，０００の分子量を有する加水分解された線状ＰＥＩを含む。さらに、化学的に修飾された線状ＰＥＩまたは分枝状ＰＥＩも、使用されることができる。ある態様において、ＰＥＩは、完全に脱プロピオニル化された構造を有する。ＰＥＩは、商業的に入手可能である（例えばＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．，米国ペンシルベニア州ワーリントン）。ある態様において、ＰＥＩは、ＰＥＩｍａｘである。

【0166】

本明細書で使用される際、用語“安定剤”は、中性部分をグラフトされた（すなわちコンジュゲートされた）陽イオン性ポリマーを含む。ある態様において、中性部分は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）またはアルブミンを含む。ある態様において、中性部分は、ＰＥＧを含む。中性部分にグラフトされた陽イオン性ポリマーは、本明細書で記載された陽イオン性ポリマーのいずれから選択されることもできる。

【0167】

ある態様において、安定剤は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分をグラフトされた陽イオン性ポリマーを含む。ある態様において、ＰＥＧは、約２５０Ｄａ〜約３５，０００Ｄａの分子量を有する。ある態様において、陽イオン性ポリマーは、ＰＥＩまたはｐＬＬである。ある態様において、ＰＥＧをグラフトされた陽イオン性ポリマーは、ＰＥＩではない。ある態様において、ＰＥＧをグラフトされた陽イオン性ポリマーは、ｐＬＬではない。

【0168】

ある態様において、安定剤は、約２，０００〜約６０，０００の分子量を有する分枝状ＰＥＩに約２５０Ｄａ〜約３５，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧがグラフトされたものを含む。ある態様において、安定剤は、約２０，０００Ｄａ〜約２５，０００Ｄａの分子量を有する分枝状ＰＥＩに約２５０Ｄａ〜約５，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧがグラフトされたものを含む。ある態様において、安定剤は、約２５，０００Ｄａの分子量を有する分枝状ＰＥＩに約５，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧがグラフトされたものを含む。ある態様において、安定剤は、約２５，０００Ｄａの分子量を有する分枝状ＰＥＩに約５００Ｄａの分子量を有するＰＥＧがグラフトされたものを含む。

【0169】

ある態様において、安定剤は、約２，０００Ｄａ〜約６０，０００Ｄａの分子量を有する線状ＰＥＩに約２５０Ｄａ〜約３５，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧがグラフトされたものを含む。ある態様において、安定剤は、約２０，０００Ｄａの分子量を有する線状ＰＥＩに約５，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧがグラフトされたものを含む。ある態様において、安定剤は、約２０，０００Ｄａの分子量を有する線状ＰＥＩに約５００Ｄａの分子量を有するＰＥＧがグラフトされたものを含む。ある態様において、安定剤は、約５０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧにコンジュゲートされた約２６０００Ｄａの分子量を有するｐＬＬを含む。

【0170】

ある態様において、陽イオン性ポリマーの１分子あたりにグラフトされたＰＥＧ部分の数は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはより多い。ある態様において、陽イオン性ポリマーの１分子あたりにグラフトされたＰＥＧ部分の数は、１、５、１５または５５である。

【0171】

本明細書で記載された方法のいずれかの工程（ｉｉ）においてトランスフェクションカクテルと接触させられる際、細胞は、少なくとも１×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも２×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも４×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも６×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも８×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも０．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも１×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも２×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも６×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも８×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも１０×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも１２×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも１４×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも１６×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも１８×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも２０×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも２２×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも２４×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも２６×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも２８×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも３０×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも３２×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも３４×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも３６×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも３８×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも４０×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４２×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４６×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４８×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも５０×１０^６細胞／ｍＬまたは少なくとも５２×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度であることができる。

【0172】

ある態様において、細胞は、工程（ｉｉ）においてトランスフェクションカクテルと接触させられる際、少なくとも１２×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも１４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも１６×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも１８×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも２０×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも２２×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも２４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも２６×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも２８×１０^６細胞／ｍＬ、または少なくとも３０×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも３２×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも３４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも３６×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも３８×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４０×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４２×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４６×１０^６細胞／ｍＬまたは少なくとも４８×１０^６細胞／ｍＬの密度である。

【0173】

ある態様において、細胞は、工程（ｉｉ）においてトランスフェクションカクテルと接触させられる際、少なくとも２４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも２６×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも２８×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも３０×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも３２×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも３４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも３６×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも３８×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４０×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４２×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４６×１０^６細胞／ｍＬ、または少なくとも４８×１０^６細胞／ｍＬの密度である。

【0174】

ある態様において、１種類以上の陽イオン性ポリマーは、細胞１００万個あたり約０．０５μｇ、細胞１００万個あたり約０．１μｇ、細胞１００万個あたり約０．２μｇ、細胞１００万個あたり約０．４μｇ、細胞１００万個あたり約０．６μｇ、細胞１００万個あたり約０．８μｇ、細胞１００万個あたり約１．０μｇ、細胞１００万個あたり約１．５μｇ、細胞１００万個あたり約２μｇ、細胞１００万個あたり約２．１μｇ、細胞１００万個あたり約２．２μｇ、細胞１００万個あたり約２．３μｇ、細胞１００万個あたり約２．４μｇ、細胞１００万個あたり約２．５μｇ、細胞１００万個あたり約２．６μｇ、細胞１００万個あたり約２．７μｇ、細胞１００万個あたり約２．８μｇ、細胞１００万個あたり約２．９μｇ、細胞１００万個あたり約３．０μｇ、細胞１００万個あたり約３．５μｇ、細胞１００万個あたり約４．０μｇ、細胞１００万個あたり約４．５μｇ、細胞１００万個あたり約５μｇ、細胞１００万個あたり約５．５μｇ、細胞１００万個あたり約６．０μｇ、細胞１００万個あたり約６．５μｇ、細胞１００万個あたり約７．０μｇ、細胞１００万個あたり約７．５μｇ、細胞１００万個あたり約８．０μｇ、細胞１００万個あたり約１０μｇの量で使用される。

【0175】

ある態様において、１種類以上の陽イオン性ポリマーは、細胞１００万個あたり約２．２μｇの量で使用される。
ある態様において、１種類以上の陽イオン性ポリマーは、約０．０１μｇ、約０．０２μｇ、約０．０４μｇ、約０．０６μｇ、約０．０８μｇ、約１．０μｇ、約１．２μｇ、約１．４μｇ、約１．６μｇ、約１．８μｇ、約２．０μｇ、約２．２μｇ、約２．４μｇ、約２．６μｇ、約２．８μｇ、約３．０μｇ、約３．２μｇ、約３．４μｇ、約３．６μｇ、約３．８μｇ、約４．０μｇ、約４．２μｇ、約４．６μｇ、約４．８μｇ、約５．０μｇ、約５．５μｇ、約６．０μｇ、約６．５μｇ、約７μｇ、約７．５μｇ、約８．０μｇ、約８．５μｇ、約９．０μｇ、約９．５μｇ、約１０μｇ、約１２μｇ、約１４μｇ、約１６μｇ、約１８μｇ、約２０μｇ、約４０μｇ、約６０μｇ、約８０μｇ、約１００μｇ、約０．１ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約４ｍｇ、約６ｍｇ、約８ｍｇまたは約１０ｍｇの量で使用される。ある態様において、約２０μｇ、約２２μｇ、約２４μｇ、約２６μｇ、約２６．４μｇ、約２８μｇ、約３０μｇ、約３２μｇ、約３４μｇ、約３６μｇ、約３８μｇ、約４０μｇ、約４２μｇ、約４４μｇ、約４６μｇ、約４８μｇ、約５０μｇ、約５２μｇ、約５２．８μｇ、約５４μｇ、約５６μｇ、約５８μｇまたは約６０μｇである。

【0176】

ある態様において、トランスフェクションカクテル中の安定剤の量は、１種類以上の陽イオン性ポリマーの量と比較して、約１％、約２％、約２．５％、約５％、約７．５％、約１０％、約１２．５％、約１５％、約１７．５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約９０％、約１００％、約２００％、約３００％、約４００％または約５００％である。

【0177】

ある態様において、トランスフェクションカクテル中の安定剤の量は、１種類以上の陽イオン性ポリマーの量と比較して、約０．０１倍、約０．０５倍、約０．１倍、約０．２倍、約０．４倍、約０．６倍、約０．８倍、約１倍、約５倍、約１０倍、約１００倍、約２００倍、約３００倍、約４００倍、約５００倍または約６００倍である。

【0178】

ある態様において、トランスフェクションカクテル中の安定剤の量は、１種類以上の陽イオン性ポリマーの量と比較して、約５％、約５．５％、約６％、約６．５％、約７％、約７．５％、約８％、約８．５％、約９％、約９．５％、約１０％、約１２．５％、約１５％、約１７．５％、約２０％、約２５％、約３０％または約４０％である。

【0179】

他の態様において、トランスフェクションカクテル中の安定剤の量は、１種類以上の陽イオン性ポリマーの量と比較して、約５％〜７．５％、５％〜１０％、５％〜１２．５％、または５％〜１５％である。他の態様において、トランスフェクションカクテル中の安定剤の量は、１種類以上の陽イオン性ポリマーの量と比較して、約７．５％〜１０％、７．５％〜１２．５％または７．５％〜１５％である。他の態様において、トランスフェクションカクテル中の安定剤の量は、１種類以上の陽イオン性ポリマーの量と比較して、約１０％〜約１２．５％または約１０％〜約１５％である。前記の態様のそれぞれにおいて、陽イオン性ポリマーは、ＰＥＩであることができ、安定剤は、ＰＥＧとコンジュゲートされた分枝状または線状ＰＥＩであることができる。前記の態様のそれぞれにおいて、陽イオン性ポリマーは、ＰＥＩであり、安定剤は、ＰＥＧとコンジュゲートされた分枝状ＰＥＩである。前記の態様のそれぞれにおいて、陽イオン性ポリマーは、ＰＥＩであり、安定剤は、ＰＥＧとコンジュゲートされた分枝状ＰＥＩであり、ここで、ＰＥＩあたりのＰＥＧ部分の平均数は、約５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０または１５未満である。前記の態様のそれぞれにおいて、陽イオン性ポリマーは、ＰＥＩであり、安定剤は、ＰＥＧとコンジュゲートされた分枝状ＰＥＩであり、ここでＰＥＩあたりのＰＥＧ部分の平均数は、約１５である。前記の態様のそれぞれに関して、本開示は、さらにトランスフェクションカクテルの組み合わせおよびそれを用いてトランスフェクションされるべき細胞を提供する。

【0180】

他の態様において、トランスフェクションカクテル中の安定剤の量は、１種類以上の陽イオン性ポリマーの量と比較して、約１０％〜２５％、１０％〜２０％または１０％〜１５％である。他の態様において、トランスフェクションカクテル中の安定剤の量は、１種類以上の陽イオン性ポリマーの量と比較して、約１５％〜２５％または１５％〜２０％である。前記の態様のそれぞれにおいて、陽イオン性ポリマーは、ＰＥＩであることができ、安定剤は、ＰＥＧとコンジュゲートされた分枝状または線状ＰＥＩであることができる。前記の態様のそれぞれにおいて、陽イオン性ポリマーは、ＰＥＩであり、安定剤は、ＰＥＧとコンジュゲートされた分枝状ＰＥＩである。前記の態様のそれぞれにおいて、陽イオン性ポリマーは、ＰＥＩであり、安定剤は、ＰＥＧとコンジュゲートされた分枝状ＰＥＩであり、ここで、ＰＥＩあたりのＰＥＧ部分の平均数は、約５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０または１５よりも少ない。前記の態様のそれぞれにおいて、陽イオン性ポリマーは、ＰＥＩであり、安定剤は、ＰＥＧとコンジュゲートされた分枝状ＰＥＩであり、ここでＰＥＩあたりのＰＥＧ部分の平均数は、約１５である。前記の態様のそれぞれに関して、本開示は、さらにトランスフェクションカクテルの組み合わせおよびそれを用いてトランスフェクションされるべき細胞を提供する。

【0181】

ある態様において、トランスフェクションカクテル中の安定剤の量は、約０．０１μｇ、約０．０２μｇ、約０．０４μｇ、約０．０６μｇ、約０．０８μｇ、約１．０μｇ、約１．２μｇ、約１．４μｇ、約１．６μｇ、約１．８μｇ、約２．０μｇ、約２．２μｇ、約２．４μｇ、約２．６μｇ、約２．８μｇ、約３．０μｇ、約３．２μｇ、約３．４μｇ、約３．６μｇ、約３．８μｇ、約４．０μｇ、約４．２μｇ、約４．６μｇ、約４．８μｇ、約５．０μｇ、約５．５μｇ、約６．０μｇ、約６．５μｇ、約７μｇ、約７．５μｇ、約８．０μｇ、約８．５μｇ、約９．０μｇ、約９．５μｇ、約１０μｇ、約１２μｇ、約１４μｇ、約１６μｇ、約１８μｇ、約２０μｇ、約４０μｇ、約６０μｇ、約８０μｇ、約１００μｇ、約０．１ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約４ｍｇ、約６ｍｇ、約８ｍｇまたは約１０ｍｇである
使用される安定剤の量は、トランスフェクション時の（すなわち、本明細書で記載される方法のいずれかの工程（ｉｉ）におけるトランスフェクションカクテルと接触させられる際の）細胞密度に依存し得る。ある態様において、細胞が低い細胞密度（例えば約１８×１０^６細胞／ｍＬ未満であるが、それに限定されない）でトランスフェクションされる場合、トランスフェクションカクテル中の安定剤の量は、方法で使用される１種類以上の陽イオン性ポリマーの量と比較して約７．５％〜約１５％である。ある態様において、細胞が低い細胞密度でトランスフェクションされる場合、トランスフェクションカクテル中の安定剤の量は、方法で使用される１種類以上の陽イオン性ポリマーの量と比較して、約７．５％、約１０％、約１２．５％または約１５％である。ある態様において、細胞が低い細胞密度でトランスフェクションされる場合、トランスフェクションカクテル中の安定剤の量は、方法で使用される１種類以上の陽イオン性ポリマーの量と比較して約７．５％〜約１０％である。ある態様において、細胞が低い細胞密度でトランスフェクションされる場合、トランスフェクションカクテル中の安定剤の量は、方法で使用される１種類以上の陽イオン性ポリマーの量と比較して１０％である。

【0182】

ある態様において、細胞は、工程（ｉｉ）においてトランスフェクションカクテルと接触させられる際、約１２×１０^６細胞／ｍＬの密度であり、トランスフェクションカクテル中の安定剤の量は、１種類以上の陽イオン性ポリマーの量と比較して約１０％である。ある態様において、安定剤は、約２５，０００Ｄａの分子量を有する分枝状ＰＥＩに約５，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧがグラフトされたものを含む。

【0183】

ある態様において、細胞が高い細胞密度（例えば約１８×１０^６細胞／ｍＬより高い細胞密度であるが、それに限定されない）でトランスフェクションされる場合、トランスフェクションカクテル中の安定剤の量は、方法で使用される１種類以上の陽イオン性ポリマーの量と比較して約１５％〜約３０％である。ある態様において、細胞が高い細胞密度でトランスフェクションされる場合、トランスフェクションカクテル中の安定剤の量は、方法で使用される１種類以上の陽イオン性ポリマーの量と比較して、約１５％、約２０％、約２５％または約３０％である。ある態様において、細胞が高い細胞密度でトランスフェクションされる場合、トランスフェクションカクテル中の安定剤の量は、方法で使用される１種類以上の陽イオン性ポリマーの量と比較して約２５％である。

【0184】

ある態様において、細胞は、工程（ｉｉ）においてトランスフェクションカクテルと接触させられる際に、少なくとも２４×１０^６細胞／ｍＬの密度であり、トランスフェクションカクテル中の安定剤の量は、１種類以上の陽イオン性ポリマーの量と比較して約２５％である。ある態様において、安定剤は、約２５，０００Ｄａの分子量を有する分枝状ＰＥＩに約５，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧがグラフトされたものを含む。

【0185】

他の態様において、高密度の細胞（従って、少なくとも約１８×１０^６細胞／ｍＬ、１９×１０^６細胞／ｍＬ、２０×１０^６細胞／ｍＬ、２１×１０^６細胞／ｍＬ、約２２×１０^６細胞／ｍＬ、２３×１０^６細胞／ｍＬ、２４×１０^６細胞／ｍＬ、２５×１０^６細胞／ｍＬ、２６×１０^６細胞／ｍＬ、２７×１０^６細胞／ｍＬ、２８×１０^６細胞／ｍＬ、２９×１０^６細胞／ｍＬ、３０×１０^６細胞／ｍＬまたはより高い密度）が、核酸（単数または複数）、陽イオン性ポリマーおよび安定剤を含むトランスフェクションカクテルを用いてトランスフェクションされることができ、ここで、トランスフェクションカクテル中の安定剤の量は、陽イオン性ポリマーの量と比較して、約１０％〜２５％、１０％〜２０％、１０％〜１５％、１５％〜２５％または１５％〜２０％である。前記の態様のそれぞれにおいて、陽イオン性ポリマーは、ＰＥＩであることができ、安定剤は、ＰＥＧとコンジュゲートされた分枝状または線状ＰＥＩであることができる。前記の態様のそれぞれにおいて、陽イオン性ポリマーは、ＰＥＩであり、安定剤は、ＰＥＧとコンジュゲートされた分枝状ＰＥＩである。前記の態様のそれぞれにおいて、陽イオン性ポリマーは、ＰＥＩであり、安定剤は、ＰＥＧとコンジュゲートされた分枝状ＰＥＩであり、ここで、ＰＥＩあたりのＰＥＧ部分の平均数は、約５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０または１５未満である。前記の態様のそれぞれにおいて、陽イオン性ポリマーは、ＰＥＩであり、安定剤は、ＰＥＧとコンジュゲートされた分枝状ＰＥＩであり、ここでＰＥＩあたりのＰＥＧ部分の平均数は、約１５である。前記の態様のそれぞれにおいて、トランスフェクションカクテルは、細胞と接触する前に、少なくとも７分、少なくとも８分、少なくとも９分、少なくとも１０分またはより長い時間インキュベートされる。前記の態様のそれぞれにおいて、トランスフェクションカクテルは、核酸（例えばプラスミド）および細胞増殖培地を含む混合物Ａが調製され、別々に陽イオン性ポリマー（例えばＰＥＩ）および細胞増殖培地を含む混合物Ｂが調製され、その後安定剤が混合物Ａに添加されてそれと混合され、その後にのみ混合物Ｂが添加され、混合物Ａおよび安定剤の先の組み合わせと混合されるように、下位混合物の組み合わせとして調製されることができる。次いで、混合物Ａ、安定剤および混合物Ｂの組み合わせが、トランスフェクションのために細胞に接触させられる。

【0186】

特定の他の態様によれば、本開示は、細胞を少なくとも約１８×１０^６細胞／ｍＬ，、または約２０×１０^６細胞／ｍＬ〜２８×１０^６細胞／ｍＬ、または約２２×１０^６細胞／ｍＬ〜２６×１０^６細胞／ｍＬ、または約２４×１０^６細胞／ｍＬの密度でプラスミドＤＮＡ、ＰＥＩおよび安定剤を含むトランスフェクションカクテルと接触させることを含む、細胞トランスフェクションの方法を提供し、ここで、トランスフェクションカクテル中の安定剤の量は、ＰＥＩの量と比較して、少なくとも１０％、または約２０％〜３０％、または約２２．５％〜２７．５％、または約２５％であり、かつここで、安定剤は、ＰＥＧとコンジュゲートされた分枝状ＰＥＩであり、ここで、ＰＥＩあたりのＰＥＧ部分の平均数は、約３０、２５、２０もしくは１５未満であり、またはここで、ＰＥＩあたりのＰＥＧ部分の平均数は、約１５である。前記の態様のそれぞれにおいて、トランスフェクションカクテルは、細胞と接触させられる前に少なくとも７分インキュベートされる。さらに、前記の態様のそれぞれにおいて、トランスフェクションカクテルは、プラスミドおよび細胞増殖培地を含む混合物Ａが調製され、別々にＰＥＩおよび細胞増殖培地を含む混合物Ｂが調製され、その後安定剤が混合物Ａに添加されてそれと混合され、その後にのみ混合物Ｂが添加され、混合物Ａおよび安定剤の先の組み合わせと混合されるように、下位混合物の組み合わせとして調製されることができる。次いで、混合物Ａ、安定剤および混合物Ｂの組み合わせが、トランスフェクションのために細胞に（１回のボーラスでまたはトランスフェクションカクテルの量が使い切られるまで連続的にのどちらかで）接触させられる。前記の態様のそれぞれにおいて、トランスフェクションカクテルは、特定の追加の態様において、ｒｅｐ、ｃａｐ、アデノウイルスまたは他のウイルスのヘルパー機能および逆位末端反復を含むベクターゲノムを含むがそれらに限定されない組換えＡＡＶベクターの産生に必要な遺伝子配列を含む１種類以上のプラスミドを含む。前記の方法に関連して、本開示は、さらにトランスフェクションカクテルおよびそれを用いてトランスフェクションされるべき細胞の組み合わせを提供する。他の態様において、トランスフェクションカクテルは、抗体またはその抗原結合フラグメントを含むがそれらに限定されない組換え療法用タンパク質の発現のための発現コンストラクトとして設計されたプラスミドまたは他の核酸を含む。

【0187】

ある態様において、トランスフェクションカクテル中の安定剤の量は、単独で（すなわち１種類以上の陽イオン性ポリマーを用いずに）使用された場合、細胞をトランスフェクションするには不十分である。例えば、安定剤単独で得られるトランスフェクション効率は、陽イオン性ポリマー（例えばＰＥＩ）単独で得られるトランスフェクション効率と比較して（例えば少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍または少なくとも１０倍）低い。

【0188】

１種類以上の核酸は、本明細書で記載された方法のいずれかにおいて、細胞１００万個あたり約０．０５μｇ、細胞１００万個あたり約０．１μｇ、細胞１００万個あたり約０．２μｇ、細胞１００万個あたり約０．４μｇ、細胞１００万個あたり約０．５μｇ、細胞１００万個あたり約０．６μｇ、細胞１００万個あたり約０．８μｇ、細胞１００万個あたり約１．０μｇ、細胞１００万個あたり約１．５μｇ、細胞１００万個あたり約２．０μｇ、細胞１００万個あたり約２．５μｇ、細胞１００万個あたり約３．０μｇ、細胞１００万個あたり約３．５μｇ、細胞１００万個あたり約４．０μｇ、細胞１００万個あたり約４．５μｇ、細胞１００万個あたり約５μｇ、細胞１００万個あたり約５．５μｇ、細胞１００万個あたり約６．０μｇ、細胞１００万個あたり約６．５μｇ、細胞１００万個あたり約７．０μｇ、細胞１００万個あたり約７．５μｇ、細胞１００万個あたり約８．０μｇ、細胞１００万個あたり約８．５μｇ、細胞１００万個あたり約９．０μｇ、細胞１００万個あたり約９．５μｇ、細胞１００万個あたり約１０μｇの量で使用されることができる。ある態様において、１種類以上の核酸は、細胞１００万個あたり約１．０μｇの量で使用される。ある態様において、１種類以上の核酸は、約１２μｇまたは約２４μｇの量で使用される。

【0189】

１種類以上の陽イオン性ポリマーおよび１種類以上の核酸は、限定されない比率で混合される。例えば、１種類以上の核酸および１種類以上の陽イオン性ポリマーは、約１：０．０１〜約１：１００の範囲の重量（またはモル）比で使用され、または約０．０１：１〜約１００：１の重量（またはモル）比で使用される。ある態様において、１種類以上の陽イオン性ポリマーおよび１種類以上の核酸は、約１：１〜５０：１の範囲の重量（またはモル）比で存在する。ある態様において、１種類以上の核酸および１種類以上の陽イオン性ポリマーは、約１：１〜１：５の範囲の重量（またはモル）比で存在する。ある態様において、１種類以上の核酸および１種類以上の陽イオン性ポリマーは、約１：２．２の重量（またはモル）比で存在する。

【0190】

本発明の方法において、トランスフェクションカクテルは、トランスフェクションされるべき細胞と接触させられて混合物を形成し、その混合物がインキュベートされて細胞トランスフェクションを達成する。細胞がトランスフェクションカクテルと接触させられた後のインキュベーション時間は、数秒〜数日の範囲であり得る。ある態様において、混合物は、トランスフェクションされた細胞を作製するために、約２分〜約１５０時間インキュベートされる。ある態様において、混合物は、トランスフェクションされた細胞を作製するために、約１５分〜約１５０時間インキュベートされる。

【0191】

ある態様において、本発明の方法の工程（ｉｉｉ）における混合物は、トランスフェクションされた細胞を作製するために、約１５分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、２０時間、４０時間、６０時間、８０時間、１００時間、１２０時間、１４０時間または１５０時間インキュベートされる。ある態様において、工程（ｉｉｉ）における混合物は、トランスフェクションされた細胞を作製するために、１時間、２時間、３時間、４時間または５時間インキュベートされる。

【0192】

細胞のトランスフェクションカクテルとのインキュベーション時間が長いほど、細胞が陽イオン性ポリマー（例えばＰＥＩ）の細胞毒性の影響を受け得る可能性がより高くなり、結果として増大した量の死（生存不能）細胞をもたらし、それによりトランスフェクション効率を低減する。

【0193】

ＰＥＩの細胞毒性を低減するため、細胞をトランスフェクションカクテルと接触させた後、培養培地は、新鮮な培養培地で置き換えられることができる。トランスフェクション後の培養培地の置き換えは、細胞のトランスフェクション効率を著しく損なうことなくＰＥＩの細胞毒性を最小限にすることができる。

【0194】

細胞の生存可能性を維持する、または細胞の成長および／もしくは増殖を提供するのに適した数多くの成長培地が、商業的に入手可能であるか、または容易に生産されることができる。そのような培地の例は、無血清の真核生物増殖培地、例えば哺乳類（例えばヒト）細胞の生存可能性を維持する、または増殖を提供するための培地を含む。限定的でない例は、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２またはＦ１２Ｋ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）（ＦＳ）Ｆ１７培地（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびそれらの混合物を含む。そのような培地は、ビタミンおよび／または微量鉱質および／または塩類および／またはアミノ酸、例えば哺乳類（例えばヒト）細胞のための必須アミノ酸等を補われることができる。

【0195】

本発明の方法および組成物によってトランスフェクションされるべき細胞（すなわち“宿主細胞”）は、微生物、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞（例えばヒト細胞）を含むが、それらに限定されない。そのような細胞は、インビトロで増殖する、もしくは生存可能性を維持することができる、またはインビトロでの組織培養に適応している初代細胞またはは細胞株であることができる。細胞株の例は、ＨＥＫ（ヒト胎児腎臓）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または昆虫由来のＳｆ９細胞を含む。ある態様において、細胞は、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞を含む。ある態様において、細胞は、ＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３ＦまたはＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含む。

【0196】

細胞（例えばＨＥＫ２９３細胞）は、懸濁培養状態であることができ、または接着していることができる。細胞は、懸濁状態での無血清増殖に適応していることができる。ある態様において、細胞は、無血清培養培地中で増殖させられる、または維持される。ある態様において、細胞は、安定的に、または一過性にトランスフェクションされる。

【0197】

細胞は、ローラーボトルまたは拡張されたローラーボトル中で増殖させられる、または維持されることができる。ある態様において、細胞は、バイオリアクター中で増殖させられる。ある態様において、細胞は、バッグまたはフラスコ中で増殖させられる。ある態様において、細胞は、ＷＡＶＥバイオリアクター中で増殖させられる。ある態様において、細胞は、撹拌槽バイオリアクター中で増殖させられる。

【0198】

本発明の方法で使用される１種類以上の核酸分子は、１種類以上のプラスミドを含むことができる。ある態様において、１種類以上の核酸または１種類以上のプラスミドは、療法的部分をコードしている。ある態様において、療法的部分は、タンパク質または転写産物を含む。療法的タンパク質の限定的でない例は、本明細書で記載されており、抗体、サイトカイン、受容体、成長因子、凝固因子、トランスポーター等を含む。転写産物の限定的でない例は、本明細書で記載されており、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ、例えば小分子もしくは短鎖ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小分子もしくは短鎖干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ）を含む。

【0199】

ある態様において、１種類以上の核酸分子は、（ａ）ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸および／もしくはヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１種類以上のプラスミドならびに／または（ｂ）対象の導入遺伝子をコードする核酸を含むプラスミドを含む。ある態様において、（ａ）の１種類以上のプラスミドは、ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸を含む第１プラスミドおよびヘルパータンパク質をコードする核酸を含む第２プラスミドを含む。

【0200】

導入遺伝子を含むプラスミド対ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸を含む第１プラスミド対ヘルパータンパク質をコードする核酸を含む第２プラスミドのモル比は、約１〜１０：１：１または１：１〜１０：１または１：１：１〜１０の範囲であることができる。

【0201】

ある態様において、コードされたＡＡＶパッケージングタンパク質は、ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはＡＡＶ ｃａｐタンパク質を含む。
ある態様において、コードされたヘルパータンパク質は、アデノウイルスＥ２および／もしくはＥ４、ＶＡＲＮＡタンパク質ならびに／または非ＡＡＶヘルパータンパク質を含む。

【0202】

導入遺伝子は、あらゆる核酸、例えば転写産物へと転写される遺伝子または対象のポリペプチドもしくはタンパク質をコードする遺伝子を含む。例えば、それらに限定されないが、導入遺伝子は、野生型または機能性バリアント血液凝固因子、ミニジストロフィン、Ｃ１エステラーゼ阻害因子、銅輸送Ｐ型ＡＴＰアーゼ（ＡＴＰ７Ｂ）または銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）をコードしている。ある態様において、野生型または機能性バリアント血液凝固因子は、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子である。

【0203】

本明細書で記載される方法は、さらに１種類以上の核酸をトランスフェクションされている細胞を培養、拡張、単離または選択する工程を含むことができる。そうして生産されたトランスフェクションされた細胞および／またはそうして生産されたトランスフェクションされた細胞からの培養培地は、回収されることができる。

【0204】

本明細書で記載される方法は、そうして生産されたトランスフェクションされた細胞からｒＡＡＶベクターを単離および／または精製する工程をさらに含むこともできる。本明細書で記載されるような細胞トランスフェクションおよび／または組換えウイルス（例えばＡＡＶ）ベクターの生産に続いて、所望であれば、ウイルス（例えばｒＡＡＶ）ビリオンは、細胞／細胞培養物から収集／回収され、場合により様々な従来の方法を用いてトランスフェクションされた細胞から精製および／または単離されることができる。そのような方法は、カラムクロマトグラフィー、ＣｓＣＩ勾配等を含む。例えば、複数のカラム精製工程、例えば陰イオン交換カラム、アフィニティカラムおよび／または陽イオン交換カラム上での精製が、使用されることができる。（例えば、国際公開第０２／１２４５５５号および米国特許出願公開第２００３０２０７４３９号を参照）。あるいは、または加えて、ＣｓＣＩ勾配工程が、使用されることができる。（例えば、米国特許出願公開第２０１２０１３５５１５号；および第２０１３００７２５４８号を参照）。さらに、パッケージングおよび／またはヘルパータンパク質を発現させるために感染性ウイルスの使用が採用される場合、残留ウイルスは、様々な方法を用いて不活化されることができる。例えば、アデノウイルスは、おおよそ６０℃の温度に例えば２０分以上加熱することによって不活化されることができる。この処理は、ＡＡＶが熱安定性である一方でヘルパーアデノウイルスは熱不安定性であるため、ヘルパーウイルスを効果的に不活化する。

【0205】

本明細書で記載される方法は、１種類以上の核酸による細胞のトランスフェクションを、安定剤の非存在下であること以外同じ条件下で実施される細胞のトランスフェクションと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％または少なくとも５０％増加させることができる。

【0206】

本明細書で記載される方法は、トランスフェクションされた細胞から単離／精製されるｒＡＡＶベクターの量を、安定剤の非存在下であること以外同じ条件下でトランスフェクションされた細胞から単離／精製されるｒＡＡＶベクターの量と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％もしくは少なくとも５０％またはより大きく増加させることができる。

【0207】

本明細書で記載される方法は、トランスフェクションされた細胞から単離／精製されるｒＡＡＶベクターの量を、安定剤の非存在下であること以外同じ条件下でトランスフェクションされた細胞から単離／精製されるｒＡＡＶベクターの量と比較して、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも８０倍、少なくとも１００倍またはより大きく増加させることができる。

【0208】

本明細書で記載される方法は、ｒＡＡＶ力価を、安定剤の非存在下であること以外同じ条件下でもたらされるｒＡＡＶ力価と比較して、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも８０倍、少なくとも１００倍またはより大きく増大させることができる。

【0209】

本明細書で記載される方法は、ｒＡＡＶ力価を、安定剤の非存在下であること以外同じ条件下でもたらされるｒＡＡＶ力価と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％もしくは少なくとも５０％またはより大きく増大させることができる。

【0210】

本明細書で記載される方法は、ｒＡＡＶ完全ベクターの数を、安定剤の非存在下であること以外同じ条件下で生産されるｒＡＡＶ完全ベクターの数と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％もしくは少なくとも５０％またはより大きく増加させることができる。

【0211】

本明細書で記載される方法は、ｒＡＡＶ空ベクターの数を、安定剤の非存在下であること以外同じ条件下で生産されるｒＡＡＶ空ベクターの数と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％もしくは少なくとも５０％またはより大きく減少させることができる。

【0212】

完全／空の比率の数値は、２６０：２８０の比率を測定することによって決定されることができる。例えば、ｒＡＡＶベクターは、サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）を用いて精製されることができ、空ベクター対完全ベクターの比率を決定するために、溶離ピークが、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの間で比較されることができる（例えば、Sommer et al. (2003) Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Molecular Therapy, Vol 7, Issue 1, P122-128を参照）。空ベクター、中間ベクターおよび完全ベクターの２６０：２８０比の比較は、空ベクターが０．６に近い２６０：２８０比を有し、中間ベクターが０．９〜１．１の２６０：２８０比を有し、一方で完全ベクターが１．３〜１．４に近い２６０：２８０比を有することを明らかにした。

【0213】

ある態様において、安定剤の存在下で単離および／または精製されたｒＡＡＶベクターは、約１．０〜約１．２の２６０：２８０比を有し、一方で安定剤の非存在下であること以外同じ条件下で単離および／または精製されたｒＡＡＶベクターは、約０．６の２６０：２８０比を有する。

【0214】

本開示のある側面は、組成物も含む。ある態様において、１種類以上の陽イオン性ポリマーおよび安定剤を含む組成物が、提供される。ある態様において、組成物は、さらに１種類以上の核酸および／または細胞（例えばトランスフェクションされるべき細胞）を含む。

【0215】

ある態様において、安定剤および１種類以上の核酸を含む組成物が、提供される。ある態様において、組成物は、さらに１種類以上の陽イオン性ポリマーおよび／または細胞（例えばトランスフェクションされるべき細胞）を含む。

【0216】

ある態様において、１種類以上の陽イオン性ポリマー、安定剤、１種類以上の核酸および細胞（例えばトランスフェクションされるべき細胞）を含む組成物が、提供される。
ある態様において、本明細書で記載される組成物中の１種類以上の陽イオン性ポリマーの量は、約０．０１μｇ、約０．０２μｇ、約０．０４μｇ、約０．０６μｇ、約０．０８μｇ、約１．０μｇ、約１．２μｇ、約１．４μｇ、約１．６μｇ、約１．８μｇ、約２．０μｇ、約２．２μｇ、約２．４μｇ、約２．６μｇ、約２．８μｇ、約３．０μｇ、約３．２μｇ、約３．４μｇ、約３．６μｇ、約３．８μｇ、約４．０μｇ、約４．２μｇ、約４．６μｇ、約４．８μｇ、約５．０μｇ、約５．５μｇ、約６．０μｇ、約６．５μｇ、約７μｇ、約７．５μｇ、約８．０μｇ、約８．５μｇ、約９．０μｇ、約９．５μｇ、約１０μｇ、約１２μｇ、約１４μｇ、約１６μｇ、約１８μｇ、約２０μｇ、約４０μｇ、約６０μｇ、約８０μｇ、約１００μｇ、約０．１ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約４ｍｇ、約６ｍｇ、約８ｍｇまたは約１０ｍｇである。ある態様において、本明細書で記載される組成物中の１種類以上の陽イオン性ポリマーの量は、約２０μｇ、約２２μｇ、約２４μｇ、約２６μｇ、約２６．４μｇ、約２８μｇ、約３０μｇ、約３２μｇ、約３４μｇ、約３６μｇ、約３８μｇ、約４０μｇ、約４２μｇ、約４４μｇ、約４６μｇ、約４８μｇ、約５０μｇ、約５２μｇ、約５２．８μｇ、約５４μｇ、約５６μｇ、約５８μｇまたは約６０μｇである。

【0217】

ある態様において、本明細書で記載される組成物中の１種類以上の陽イオン性ポリマーの量は、トランスフェクションされる細胞の数に関係する。例えば、ある態様において、本明細書で記載される組成物中の１種類以上の陽イオン性ポリマーの量は、細胞１００万個あたり約０．０５μｇ、細胞１００万個あたり約０．１μｇ、細胞１００万個あたり約０．２μｇ、細胞１００万個あたり約０．４μｇ、細胞１００万個あたり約０．６μｇ、細胞１００万個あたり約０．８μｇ、細胞１００万個あたり約１．０μｇ、細胞１００万個あたり約１．５μｇ、細胞１００万個あたり約２μｇ、細胞１００万個あたり約２．１μｇ、細胞１００万個あたり約２．２μｇ、細胞１００万個あたり約２．３μｇ、細胞１００万個あたり約２．４μｇ、細胞１００万個あたり約２．５μｇ、細胞１００万個あたり約２．６μｇ、細胞１００万個あたり約２．７μｇ、細胞１００万個あたり約２．８μｇ、細胞１００万個あたり約２．９μｇ、細胞１００万個あたり約３．０μｇ、細胞１００万個あたり約３．５μｇ、細胞１００万個あたり約４．０μｇ、細胞１００万個あたり約４．５μｇ、細胞１００万個あたり約５μｇ、細胞１００万個あたり約５．５μｇ、細胞１００万個あたり約６．０μｇ、細胞１００万個あたり約６．５μｇ、細胞１００万個あたり約７．０μｇ、細胞１００万個あたり約７．５μｇ、細胞１００万個あたり約８．０μｇ、細胞１００万個あたり約１０μｇである。ある態様において、本明細書で記載される組成物中の１種類以上の陽イオン性ポリマーの量は、細胞１００万個あたり約２．２μｇである。

【0218】

ある態様において、本明細書で記載される組成物中の安定剤の量は、約０．０１μｇ、約０．０２μｇ、約０．０４μｇ、約０．０６μｇ、約０．０８μｇ、約１．０μｇ、約１．２μｇ、約１．４μｇ、約１．６μｇ、約１．８μｇ、約２．０μｇ、約２．２μｇ、約２．４μｇ、約２．６μｇ、約２．８μｇ、約３．０μｇ、約３．２μｇ、約３．４μｇ、約３．６μｇ、約３．８μｇ、約４．０μｇ、約４．２μｇ、約４．６μｇ、約４．８μｇ、約５．０μｇ、約５．５μｇ、約６．０μｇ、約６．５μｇ、約７μｇ、約７．５μｇ、約８．０μｇ、約８．５μｇ、約９．０μｇ、約９．５μｇ、約１０μｇ、約１２μｇ、約１４μｇ、約１６μｇ、約１８μｇ、約２０μｇ、約４０μｇ、約６０μｇ、約８０μｇ、約１００μｇ、約０．１ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約４ｍｇ、約６ｍｇ、約８ｍｇまたは約１０ｍｇである。

【0219】

ある態様において、本明細書で記載される組成物中の安定剤の量は、約１．０μｇ、約１．２μｇ、約１．４μｇ、約１．６μｇ、約１．８μｇ、約２．０μｇ、約２．２μｇ、約２．４μｇ、約２．６μｇ、約２．６４μｇ、約２．８μｇ、約３．０μｇ、約３．２μｇ、約３．４μｇ、約３．６μｇ、約３．８μｇ、約４．０μｇ、約４．２μｇ、約４．６μｇ、約４．８μｇ、約５．０μｇ、約５．５μｇ、約６．０μｇ、約６．５μｇ、約７μｇ、約７．５μｇ、約８．０μｇ、約８．５μｇ、約９．０μｇ、約９．５μｇ、約１０μｇ、約１２μｇ、約１３μｇ、約１４μｇ、約１６μｇ、約１８μｇまたは約２０μｇである。

【0220】

ある態様において、本明細書で記載される組成物中の安定剤の量は、１種類以上の陽イオン性ポリマーの量に関係する。例えば、ある態様において、本明細書で記載される組成物中の安定剤の量は、１種類以上の陽イオン性ポリマーの量と比較して、約１％、約２％、約２．５％、約５％、約７．５％、約１０％、約１２．５％、約１５％、約１７．５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約９０％、約１００％、約２００％、約３００％、約４００％または約５００％である。ある態様において、本明細書で記載される組成物中の安定剤の量は、１種類以上の陽イオン性ポリマーの量と比較して、約７．５％、約１０％、約１２．５％、約１５％、約１７．５％、約２０％、約２５％、約３０％または約４０％である。

【0221】

ある態様において、本明細書で記載される組成物中の１種類以上の核酸の量は、約０．０１μｇ、約０．０２μｇ、約０．０４μｇ、約０．０６μｇ、約０．０８μｇ、約１．０μｇ、約１．２μｇ、約１．４μｇ、約１．６μｇ、約１．８μｇ、約２．０μｇ、約２．２μｇ、約２．４μｇ、約２．６μｇ、約２．８μｇ、約３．０μｇ、約３．２μｇ、約３．４μｇ、約３．６μｇ、約３．８μｇ、約４．０μｇ、約４．２μｇ、約４．６μｇ、約４．８μｇ、約５．０μｇ、約５．５μｇ、約６．０μｇ、約６．５μｇ、約７μｇ、約７．５μｇ、約８．０μｇ、約８．５μｇ、約９．０μｇ、約９．５μｇ、約１０μｇ、約１２μｇ、約１４μｇ、約１６μｇ、約１８μｇ、約２０μｇ、約４０μｇ、約６０μｇ、約８０μｇ、約１００μｇ、約０．１ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約４ｍｇ、約６ｍｇ、約８ｍｇまたは約１０ｍｇである。ある態様において、１種類以上の核酸の量は、約１２μｇまたは約２４μｇである。

【0222】

ある態様において、本明細書で記載される組成物中の１種類以上の核酸の量は、トランスフェクションされる細胞の数に関係する。例えば、ある態様において、本明細書で記載される組成物中の１種類以上の核酸の量は、細胞１００万個あたり約０．０５μｇ、細胞１００万個あたり約０．１μｇ、細胞１００万個あたり約０．２μｇ、細胞１００万個あたり約０．４μｇ、細胞１００万個あたり約０．５μｇ、細胞１００万個あたり約０．６μｇ、細胞１００万個あたり約０．８μｇ、細胞１００万個あたり約１．０μｇ、細胞１００万個あたり約１．５μｇ、細胞１００万個あたり約２．０μｇ、細胞１００万個あたり約２．５μｇ、細胞１００万個あたり約３．０μｇ、細胞１００万個あたり約３．５μｇ、細胞１００万個あたり約４．０μｇ、細胞１００万個あたり約４．５μｇ、細胞１００万個あたり約５μｇ、細胞１００万個あたり約５．５μｇ、細胞１００万個あたり約６．０μｇ、細胞１００万個あたり約６．５μｇ、細胞１００万個あたり約７．０μｇ、細胞１００万個あたり約７．５μｇ、細胞１００万個あたり約８．０μｇ、細胞１００万個あたり約８．５μｇ、細胞１００万個あたり約９．０μｇ、細胞１００万個あたり約９．５μｇ、または細胞１００万個あたり約１０μｇである。ある態様において、本明細書で記載される組成物中の１種類以上の核酸の量は、細胞１００万個あたり約１．０μｇである。

【0223】

ある態様において、本明細書で記載される組成物中の細胞は、少なくとも１×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも２×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも４×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも６×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも８×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも０．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも１×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも２×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも６×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも８×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも１０×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも１２×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも１４×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも１６×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも１８×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも２０×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも２２×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも２４×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも２６×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも２８×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも３０×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも３２×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも３４×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも３６×１０^６細胞／ｍｌ、少なくとも３８×１０^６細胞／ｍｌ少なくとも４０×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４２×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４６×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも４８×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも５０×１０^６細胞／ｍＬまたは少なくとも５２×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度である。ある態様において、細胞は、少なくとも１２×１０^６細胞／ｍＬまたは少なくとも２４×１０^６細胞／ｍＬの密度である。

【0224】

ある側面において、約１２×１０^６細胞／ｍＬ、細胞１００万個あたり約２．２μｇの１種類以上の陽イオン性ポリマー、１種類以上の陽イオン性ポリマーと比較して約１０％の安定剤および細胞１００万個あたり約１μｇの１種類以上の核酸を含む組成物が、提供される。

【0225】

ある側面において、約２４×１０^６細胞／ｍＬ、細胞１００万個あたり約２．２μｇの１種類以上の陽イオン性ポリマー、１種類以上の陽イオン性ポリマーと比較して約２５％の安定剤および細胞１００万個あたり約１μｇの１種類以上の核酸を含む組成物が、提供される。

【0226】

本開示の組成物に含まれる１種類以上の陽イオン性ポリマー、安定剤、１種類以上の核酸および細胞は、本明細書で記載された通りである。ある態様において、１種類以上の陽イオン性ポリマーは、ＰＥＩｍａｘを含む。ある態様において、安定剤は、約２５，０００Ｄａの分子量を有する分枝状ＰＥＩに約５，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧがグラフトされたものを含む。ある態様において、１種類以上の核酸は、（ａ）ＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸および／もしくはヘルパータンパク質をコードする核酸を含む１種類以上のプラスミドならびに／または（ｂ）対象の導入遺伝子をコードする核酸を含むプラスミドを含む。ある態様において、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞を含む。

【0227】

ある側面において、本明細書で記載された方法を用いて生産されたトランスフェクションされた細胞が、提供される。ある側面において、本明細書で記載された方法を用いて生産されたｒＡＡＶベクターが、提供される。

【0228】

本開示は、包装材料およびその中の１つ以上の構成要素を有するキットも、提供する。キットは、典型的には構成要素の記載またはその中の構成要素の使用に関する指示を含むラベルまたは添付文書を含む。キットは、そのような構成要素、例えば核酸（プラスミド）、陽イオン性ポリマー（例えばＰＥＩ）、安定剤（例えばｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋ、分子量（Ｍｎ）２５，０００を有する分枝状ＰＥＩがＭ_ｎ５，０００を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートされたもの）および／または細胞の集合体を含有することができる。

【0229】

キットは、キットの１つ以上の構成要素を収容している物理的構造体を指す。包装材料は、構成要素を無菌様式で維持することができ、そのような目的のために一般的に使用される材料（例えば紙、段ボール、ガラス、プラスチック、箔、アンプル、バイアル、チューブ等）で作られていることができる。

【0230】

ラベルまたは添付文書は、その中の１つ以上の構成要素の識別情報を含むことができる。ラベルまたは添付文書は、製造業者、ロット番号、製造場所および日付、有効期限を識別する情報を含むことができる。ラベルまたは添付文書は、製造業者情報、ロット番号、製造業者の場所および日付を識別する情報を含むことができる。ラベルまたは添付文書は、方法、使用または製造プロトコルにおいてキットの構成要素の１つ以上を使用するための指示を含むことができる。指示は、組成物を生産する、または本明細書で記載された方法のいずれかを実施するための指示を含むことができる。

【0231】

ラベルまたは添付文書は、“印刷物”、例えば紙もしくはボール紙、または構成要素、キットもしくは包装材（例えば箱）と別個もしくはそれに貼り付けられたもの、またはキットの構成要素を含有するアンプル、チューブもしくはバイアルに取り付けられたものを含む。ラベルまたは添付文書は、さらにコンピューターで読み取り可能な媒体、例えばバーコードが印刷されたラベル、ディスク、光ディスク、例えばＣＤ−もしくはＤＶＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭ、ＤＶＤ、ＭＰ３、磁気テープまたは電気的記憶媒体、例えばＲＡＭおよびＲＯＭまたはこれらのハイブリッド、例えば磁気／光学記憶媒体、フラッシュメディアもしくは記憶型カード（ｍｅｍｏｒｙ ｔｙｐｅ ｃａｒｄ）を含むことができる。

【0232】

以下の実施例は、説明目的のためだけに提供されており、本発明の範囲を何らかの方法で制限することは決して意図されていない。実際、本発明の様々な改変が、本明細書で示され、記載されたものに加えて、前記の説明から当業者に明らかになり、添付された特許請求の範囲の範囲内に入るであろう。

【実施例】

【0233】

実施例１．安定剤（ＰＥＧにコンジュゲートされた分枝状ＰＥＩ）のスパイクによるＤＮＡ−ＰＥＩ複合体の安定化
本研究の目的は、非常に少量のＰＥＧにコンジュゲートされたＰＥＩ（安定剤）によるトランスフェクションカクテルのスパイクがＤＮＡ−ＰＥＩ複合体の粒径の増大または凝集を抑止できるかどうかを試験することであった。

【0234】

材料および方法：
１．プラスミドＤＮＡ（ＤＮＡ）：組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）を生産することができる３種類のプラスミド（対象の導入遺伝子をコードするプラスミド、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードするパッケージングプラスミドならびにアデノウイルスＥ２、Ｅ４およびＶＡＲＮＡ遺伝子をコードするアデノウイルスヘルパープラスミド）が、本明細書で記載される全ての研究において使用された。

【0235】

２．陽イオン性ポリマー：線状完全脱プロピオニル化ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；１ｍｇ／ｍｌ ストック濃度）４０ＫＤａが、トランスフェクション試薬として使用された。

【0236】

３．培地：ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）Ｆ１７（Ｆ１７）発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａ１３８３５０１）が、トランスフェクションカクテルを作製するために使用された。

【0237】

４．安定剤：中性ポリマーにコンジュゲートされた陽イオン性ポリマーが、これらの研究に関して安定剤として使用された。具体的には、この研究に関して、我々は、ｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ， ９００７４３；分子量（Ｍｎ）２５，０００を有する分枝状ＰＥＩがＭ_ｎ５，０００を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートされたもの）を用いた。

【0238】

５．分光光度法に基づく濁度試験：Ｆ１７中のプラスミドＤＮＡ（ＤＮＡ）およびＰＥＩのみでは、ナノドロップ上で６５０ｎｍ波長で一切シグナルを与えない。しかし、ＤＮＡおよびＰＥＩが一緒に混合された場合、培地は、ＤＮＡおよびＰＥＩが複合体形成するために濁り、ナノドロップ上で６５０ｎｍにおいて信号が観察される。時間の経過と共に、ＤＮＡ−ＰＥＩ複合体の連続的な凝集は、濁度を低下させ、６５０ｎｍにおけるナノドロップのシグナルの低下につながる。このアプローチが、安定剤を用いて、および用いずにＤＮＡ−ＰＥＩを含有するトランスフェクションカクテルの安定性を試験するために使用された。

【0239】

６．トランスフェクションカクテルの調製：トランスフェクションカクテルは、以下を含有する等量の混合物からなる：混合物Ａ−０．１２ｍｇ／ｍｌの終濃度で予め決定された比率でＦ１７培地に添加されたプラスミドＤＮＡ（上記）、および混合物Ｂ−Ｆ１７培地中の０．０２６４ｍｇ／ｍｌの終濃度の安定剤を伴なわない、または伴う０．２６４ｍｇ／ｍｌのＰＥＩ（これは、陽イオン性ポリマーＰＥＩと比較した１０％の安定剤に相当する）。最終的なトランスフェクションカクテルは、混合物Ｂを混合物Ａに室温（約２５℃）で添加することによって調製される。混合は、トランスフェクションカクテルをシェーカーにおいて１２０ＲＰＭで連続的に振盪することによって達成される。

【0240】

結果：ＤＮＡおよびＰＥＩを含有するトランスフェクションカクテルを、上で材料および方法において記載されたように、安定剤（ｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋ）を用いずに、および用いて、Ｆ１７培地中で調製した。加えて、ＤＮＡおよび安定剤を含有するがＰＥＩを含まない溶液を、陰性対照として用いた。３つの溶液を６５０ｎｍにおいてナノドロップ上で分析し、濁度を試験した（図２）。安定剤を含まないトランスフェクションカクテル（四角）は、１０分に至るまで高いシグナルを与え、これは、ＤＮＡ−ＰＥＩ複合体の形成を示している。しかし、１０分後には信号は非常に低いレベルまで急速に低下し、約２０分でベースラインレベル付近に達した。安定剤を含むトランスフェクションカクテル（丸）は、最初の約１０分は安定剤を含まないトランスフェクションカクテルよりも低い信号を示したが、重要なことに、より遅い時点に関して（少なくとも５５分まで）信号を保持していた。ＤＮＡおよび安定剤を含むがＰＥＩを含まない陰性対照溶液（三角）は、ベースライン信号を示し、これは、安定剤のＤＮＡとの複合体形成がない〜非常に低いことを示唆している。

【0241】

結論：濁度プロファイルは、ＤＮＡおよびＰＥＩが安定剤の非存在下で複合体を形成したが、約１０分後に凝集を開始したことを示唆している。しかし、安定剤の存在下では、ＤＮＡおよびＰＥＩの複合体形成は、少なくともこの研究で試験された最大時間（すなわち５５分に至るまで）の間安定化された（すなわち、凝集しなかった）。

【0242】

実施例２．ＤＮＡ−ＰＥＩ複合体の粒径に対する安定剤（ｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋ）の影響
本研究の目的は、安定剤（ｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋ）の存在下でのトランスフェクションカクテル中のＤＮＡ−ＰＥＩ複合体の平均粒径をチェックすることであった。

【0243】

材料および方法：
１．プラスミドＤＮＡ、陽イオン性ポリマー、培地および安定剤：実施例１で記載されたものと同じ。

【0244】

２．トランスフェクションカクテルの調製：トランスフェクションカクテルは、以下のものを含有する等量混合物からなる：混合物Ａ−０．１２ｍｇ／ｍｌの終濃度で予め決定された比率でＦ１７培地に添加されたプラスミドＤＮＡ（実施例１で記載された）、ならびに混合物Ｂ−Ｆ１７培地中の０．２６４ｍｇ／ｍｌのＰＥＩならびに０、０．０１９８、０．０２６４、０．０３１６８および０．０３９６ｍｇ／ｍｌ（それは、陽イオン性ポリマーＰＥＩと比較して、０％、７．５％、１０％、１２．５％および１５％に相当する）の終濃度の安定剤。最終的なトランスフェクションカクテルは、室温（約２５℃）で混合物Ｂを混合物Ａに添加することによって調製される。

【0245】

３．動的光散乱（ＤＬＳ）実験：変動する量の安定剤（ＰＥＩと比較して０〜１５％）を用いたトランスフェクションカクテルを、ＤＬＳを用いて分析した。一度トランスフェクションカクテルを調製したら、読み取りを５分ごとに３０分間行った。

【0246】

結果：図３は、安定剤の量の増加に伴なってＤＮＡ−ＰＥＩ複合体の平均粒径（ｎｍ）が低減したことを示している。
結論：安定剤は、ＤＮＡ−ＰＥＩ複合体の粒径を制御し（図３）、それによりトランスフェクションカクテル中の大きな凝集体の形成を抑制している。

【0247】

実施例３．安定剤（ｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋ）のＤＮＡ−ＰＥＩ複合体のトランスフェクション効率への影響。
本研究の目的は、安定剤（ｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋ）の存在下でのトランスフェクションカクテルのトランスフェクション効率をチェックすることであった。

【0248】

材料および方法：
１．プラスミドＤＮＡ、陽イオン性ポリマー、培地および安定剤：実施例１で記載されたものと同じ。

【0249】

２．トランスフェクションカクテルの調製：トランスフェクションカクテルは、以下のものを含有する等量混合物からなる：混合物Ａ−０．１２ｍｇ／ｍｌの終濃度で予め決定された比率でＦ１７培地に添加されたプラスミドＤＮＡ（実施例１で記載された）、ならびに混合物Ｂ−Ｆ１７培地中の０．２６４ｍｇ／ｍｌのＰＥＩならびに０、０．０１３２、０．０１９８、０．０２６４、０．０３１６８、０．０３９６、０．０４４８８、０．０５２８、０．０６６および０．０７９２ｍｇ／ｍｌの終濃度の安定剤（これは、陽イオン性ポリマーＰＥＩと比較して、０％、５％、７．５％、１０％、１２．５％、１５％、１７．５％、２０％、２５％および３０％に相当する）。最終的なトランスフェクションカクテルは、室温（約２５℃）で混合物Ｂを混合物Ａに添加することによって調製される。混合は、トランスフェクションカクテルをシェーカー中で１２０ＲＰＭで連続的に振盪することによって達成される。トランスフェクションカクテルは、全細胞培養量の１０％であり、使用されたＤＮＡ量は、細胞１００万個あたり１ｕｇに相当する。

【0250】

３．トランスフェクションおよびＡＡＶの生産性試験：ＨＥＫ２９３細胞を、６ウェルプレート中でＦ１７培地中で３７℃、５％ＣＯ_２で１２×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度まで増殖させた。トランスフェクションの前に、トランスフェクションカクテル（上で（２）において記載されたように調製された）を調製後室温で１時間インキュベートし（“トランスフェクションカクテルのインキュベーション時間”）、次いで細胞培養物に添加した。トランスフェクションの３時間後に、培養物を１×１０^６細胞／ｍＬに希釈し、細胞増殖およびＡＡＶの産生を可能にした。細胞および細胞培養培地を含む試料を、（Ｖｉ−ｃｅｌｌを使用する）細胞計数および細胞生存度のために、トランスフェクション後２４、４８および７２時間の時点で採取した。細胞をトランスフェクション後７２時間の時点で回収し、溶解させ、溶解物をｄｄＰＣＲを用いてＡＡＶ力価に関して分析した。

【0251】

結果：図４において示されている高い生存度のデータにより示されるように、培養物への安定剤の添加は細胞に対して毒性ではないことがわかった。また、安定剤のトランスフェクションカクテルへの添加は、ＡＡＶ力価を少なくとも４倍増大させた（図５）。最高レベルのｒＡＡＶ産生（約１０倍の増加）が、（陽イオン性ポリマーＰＥＩと比較して）約７．５％〜１０％の安定剤を用いて得られた。

【0252】

結論：安定剤の使用は、ｒＡＡＶ力価により測定されるようなＤＮＡ−ＰＥＩ複合体のトランスフェクション効率を増大させた。ｒＡＡＶ力価の最適範囲は、トランスフェクションカクテル中で約７．５％〜１５％の安定剤をＰＥＩと共に用いて得られた。より低い、またはより高い量の安定剤（ポリマーＰＥＩと比較）は、結果としてｒＡＡＶ力価の低下をもたらしたが、安定剤の添加は、安定剤の非存在下で得られたｒＡＡＶ力価と比較して、ｒＡＡＶ力価を増大させた。

【0253】

実施例４．安定剤としてのＰＥＧにコンジュゲートされた線状ＰＥＩ対ＰＥＧにコンジュゲートされた分枝状ＰＥＩの比較
この研究の目的は、ＰＥＩ−ＤＮＡトランスフェクションカクテルの安定化におけるＰＥＧにコンジュゲートされた線状ＰＥＩの能力をＰＥＧにコンジュゲートされた分枝状ＰＥＩの能力に対して比較することであった。

【0254】

材料および方法：
１．プラスミドＤＮＡ、陽イオン性ポリマーおよび培地：実施例１で記載されたものと同じ。

【0255】

２．安定剤：この研究に関して、我々は、以下の安定剤を使用した：ｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋ（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｍ_ｎ５０００にコンジュゲートされた分枝状ＰＥＩ、Ｍ_ｎ２５０００）およびＬＰＥＩ２０ｋ．ＰＥＧ５ｋ（ＰＥＧ、Ｍ_ｎ５０００にコンジュゲートされた線状ＰＥＩ、Ｍ_ｎ２００００）。

【0256】

３．トランスフェクションカクテルの調製：トランスフェクションカクテルは、以下のものを含有する等量混合物からなる：混合物Ａ−予め決定された比率でＦ１７培地に添加されたプラスミドＤＮＡ（実施例１で記載された）、ならびに混合物Ｂ−Ｆ１７培地中の細胞１００万個あたり２．２ｕｇのＰＥＩならびにＰＥＩと比較して、０％、１％、２．５％および１０％の安定剤（ｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋまたはＬＰＥＩ２０ｋ．ＰＥＧ５ｋ）。最終的なトランスフェクションカクテルは、室温（約２５℃）で混合物Ｂを混合物Ａに添加することによって調製される。混合は、トランスフェクションカクテルをシェーカー中で１２０ＲＰＭで連続的に振盪することによって達成される。トランスフェクションカクテルの体積は、培養体積の１０パーセントであり、使用されたＤＮＡの量は、細胞１００万個あたり１ｕｇに相当する。

【0257】

４．トランスフェクションおよびＡＡＶの生産性試験：ＨＥＫ２９３細胞を、６ウェルプレート中でＦ１７培地中で３７℃、５％ＣＯ_２で１２×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度まで増殖させた。トランスフェクションの前に、トランスフェクションカクテル（上で（３）において記載されたように調製された）を調製後室温で１時間インキュベートし（“トランスフェクションカクテルのインキュベーション時間”）、次いで細胞培養物に添加した。トランスフェクションの３時間後に、培養物を１×１０^６細胞／ｍＬに希釈し、細胞増殖およびＡＡＶの産生を可能にした。細胞および細胞培養培地を含む試料を、（Ｖｉ−ｃｅｌｌを使用する）細胞計数および細胞生存度のために、トランスフェクション後２４、４８および７２時間の時点で採取した。細胞をトランスフェクション後７２時間の時点で回収し、溶解させ、溶解物をｄｄＰＣＲを用いてＡＡＶ力価に関して分析した。

【0258】

結果：上記のように、細胞を（ＰＥＩと比較して）０％〜１０％の分枝状（ｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋ）または線状（ＬＰＥＩ２０ｋ．ＰＥＧ５ｋ）安定剤のどちらかを含有するトランスフェクションカクテルを用いてトランスフェクションした。分枝状安定剤および線状安定剤の両方とも細胞に対して毒性ではないことが分かった（図６）。また、両方の安定剤のトランスフェクションカクテルへの添加は、ｒＡＡＶの力価を増大させたが、収率は、線状安定剤と比較して分枝状安定剤でより高かった（図７）。最高レベルのｒＡＡＶ産生（４倍の増大）が、（陽イオン性ポリマー、ＰＥＩと比較して）約１０％の分枝状安定剤を用いて得られた。

【0259】

結論：分枝状（ｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋ）および線状（ＬＰＥＩ２０ｋ．ＰＥＧ５ｋ）安定剤は、両方とも細胞に対して毒性ではなく、安定剤の非存在下での収率と比較して２〜４倍の力価の向上を示した。線状安定剤および分枝状安定剤のサイズは比較可能であるが、分枝状安定剤は、線状安定剤と比較してより高いｒＡＡＶ力価を与えた（ＰＥＩと比較して１０％の安定剤が使用された場合に４倍の向上）。

【0260】

実施例５．分枝状ＰＥＩあたりにコンジュゲートされたＰＥＧ分子の数の比較
この研究の目的は、分枝状ＰＥＩあたりのＰＥＧ分子の大きさおよび数が異なるＰＥＧ化されたＰＥＩ化合物の安定化能力を比較することであった。

【0261】

材料および方法：
１．プラスミドＤＮＡ、陽イオン性ポリマーおよび培地：実施例１で記載されたものと同じ。

【0262】

２．安定剤：この研究に関して、我々は、以下のものを使用した：（ｉ）ｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋ（ＰＥＧ、Ｍ_ｎ５０００にコンジュゲートされた分枝状ＰＥＩ、Ｍ_ｎ２５０００）。この安定剤は、ｂＰＥＩあたり１５個のＰＥＧ分子を有する。（ｉｉ）ｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ０．５ｋ（ＰＥＧ、Ｍ_ｎ５００にコンジュゲートされた分枝状ＰＥＩ、Ｍ_ｎ２５０００）。この安定剤は、ｂＰＥＩあたり５５個のＰＥＧ分子を有する。

【0263】

３．トランスフェクションカクテルの調製：トランスフェクションカクテルは、以下のものを含有する等量混合物からなる：混合物Ａ−予め決定された比率でＦ１７培地に添加されたプラスミドＤＮＡ（実施例１で記載された）、ならびに混合物Ｂ−Ｆ１７培地中の細胞１００万個あたり２．２ｕｇのＰＥＩならびにＰＥＩと比較して、０％、７．５％もしくは１２．５％のｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋまたは５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％のｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ０．５ｋ。最終的なトランスフェクションカクテルは、室温（約２５℃）で混合物Ｂを混合物Ａに添加することによって調製される。混合は、トランスフェクションカクテルをシェーカー中で１２０ＲＰＭで連続的に振盪することによって達成される。トランスフェクションカクテルの体積は、培養体積の１０パーセントであり、使用されたＤＮＡの量は、細胞１００万個あたり１ｕｇに相当する。

【0264】

４．トランスフェクションおよびＡＡＶの生産性試験：ＨＥＫ２９３細胞を、６ウェルプレート中でＦ１７培地中で３７℃、５％ＣＯ_２で１２×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度まで増殖させた。トランスフェクションの前に、トランスフェクションカクテル（上で（３）において記載されたように調製された）を調製後室温で１時間インキュベートし（“トランスフェクションカクテルのインキュベーション時間”）、次いで細胞培養物に添加した。トランスフェクションの３時間後に、培養物を１×１０^６細胞／ｍＬに希釈し、細胞増殖およびＡＡＶの産生を可能にした。細胞および細胞培養培地を含む試料を、（Ｖｉ−ｃｅｌｌを使用する）細胞計数および細胞生存度のために、トランスフェクション後２４、４８および７２時間の時点で採取した。細胞をトランスフェクション後７２時間の時点で回収し、溶解させ、溶解物をｄｄＰＣＲを用いてＡＡＶ力価に関して分析した。

【0265】

結果：上記のように、細胞を、ＰＥＩと比較して０％〜１２．５％のｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋ（ｂＰＥＩあたり１５ＰＥＧを有する）または０％〜５０％のｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ０．５ｋ（ｂＰＥＩあたり５５ＰＥＧ）安定剤を含有するトランスフェクションカクテルでトランスフェクションした。生存度データ（図８）は、ｂＰＥＩあたり１５または５５ＰＥＧを含有する安定剤の培養物への添加は細胞に対して毒性ではないことを示唆した。トランスフェクションカクテルへのｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋ（ｂＰＥＩあたり１５ＰＥＧを有する）の添加は、ｒＡＡＶ力価を４倍に増大させ、一方でｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ０．５ｋ（ｂＰＥＩあたり５５ＰＥＧ）の添加は、安定剤の非存在下でのｒＡＡＶの収率と比較してｒＡＡＶ力価を２．４倍に増大させた（図９）。

【0266】

結論：両方の安定剤（ｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋ（ｂＰＥＩあたり１５ＰＥＧを有する）およびｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ０．５ｋ（ｂＰＥＩあたり５５ＰＥＧを有する））は、細胞に対して毒性ではなく、６０分のトランスフェクションカクテルのインキュベーション時間の後でさえも安定している力価収率により証明されるように、トランスフェクションカクテルを安定化することができた。ｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋの使用は、ｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ０．５ｋと比較してより高いｒＡＡＶ力価収率をもたらした（それぞれ４倍対２．４倍）。

【0267】

実施例６．トランスフェクションカクテルのインキュベーション時間のＡＡＶ力価への影響
この研究の目的は、安定剤（ｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋ）を用いる、および用いないトランスフェクションカクテルのインキュベーション時間の影響を比較することであった。

【0268】

材料および方法：
１．プラスミドＤＮＡ、陽イオン性ポリマー、培地および安定剤：実施例１で記載されたものと同じ。

【0269】

２．トランスフェクションカクテルの調製：トランスフェクションカクテルは、以下のものを含有する等量混合物からなる：混合物Ａ−予め決定された比率でＦ１７培地に添加されたプラスミドＤＮＡ（実施例１で記載された）、ならびに混合物Ｂ−Ｆ１７培地中の細胞１００万個あたり２．２ｕｇのＰＥＩおよびＰＥＩと比較して０％または１０％のどちらかの安定剤（ｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋ）。最終的なトランスフェクションカクテルは、室温（約２５℃）で混合物Ｂを混合物Ａに添加することによって調製される。混合は、トランスフェクションカクテルをシェーカー中で１２０ＲＰＭで連続的に振盪することによって達成される。トランスフェクションカクテルの体積は、培養体積の１０パーセントであり、使用されたＤＮＡの量は、細胞１００万個あたり１ｕｇに相当する。

【0270】

３．トランスフェクションおよびＡＡＶの生産性試験：ＨＥＫ２９３細胞を、ａｍｂｒ（登録商標）１５バイオリアクター中でＦ１７培地中で３７℃、５％ＣＯ_２で１２×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度まで増殖させた。トランスフェクションの前に、トランスフェクションカクテル（上で（２）において記載されたように調製された）を調製後室温で３０秒、２分、７分、２０分、４０分、６０分、９０分、１２０分インキュベートし（“トランスフェクションカクテルのインキュベーション時間”）、次いで細胞培養物に添加した。トランスフェクションの３時間後に、トランスフェクションを停止させた（ｑｕｅｎｃｈｅｄ）。細胞を増殖相で維持し、ＡＡＶの産生を可能にした。細胞および細胞培養培地を含む試料を、（Ｖｉ−ｃｅｌｌを使用する）細胞計数および細胞生存度のために、トランスフェクション後２４、４８および７２時間の時点で採取した。細胞をトランスフェクション後７２時間の時点で回収し、溶解させ、溶解物をｄｄＰＣＲを用いてＡＡＶ力価に関して分析した。

【0271】

４．空の粒子対完全な粒子の分析：細胞溶解物をサイズ排除高圧液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）を用いて精製し、溶離ピークを２６０ｎｍ〜２８０ｎｍで比較して、空ベクター対完全ベクターの比率を決定した（例えばSommer et al. (2003) Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Molecular Therapy, Vol 7, Issue 1, P122-128を参照）。空ベクター、中間ベクターおよび完全ベクターの２６０：２８０比の比較は、空ベクターは０．６に近い２６０：２８０比を有し、中間ベクターは０．９〜１．１の２６０：２８０比を有し、一方で完全ベクターは１．３〜１．４に近い２６０：２８０比を有することを明らかにした。

【0272】

結果：上記のように、（ＰＥＩと比較して）０％または１０％のどちらかのｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋを含有するトランスフェクションカクテルを調製し、０．５〜１２０分インキュベートした後、細胞培養物に添加した。最初の約７分は、安定剤の添加はｒＡＡＶ力価に対する影響を有しなかった（図１０）。しかし、約７分後には、安定剤の非存在下で産生されたｒＡＡＶの量は減少し、一方で安定剤の存在下で産生されたｒＡＡＶの量は依然として影響を受けなかった（図１０）。従って、安定剤を用いると、ｒＡＡＶの力価は、少なくとも１２０分のトランスフェクションカクテルのインキュベーション時間における増大による影響を受けなかった。完全ＡＡＶベクター対空ＡＡＶベクター（すなわちＤＮＡを担持しているＡＡＶ粒子対ＤＮＡを担持していないＡＡＶ粒子）の間接的な尺度である２６０：２８０比も、測定された（図１１）。安定剤を用いない（すなわちトランスフェクションがＰＥＩ単独の存在下で実施された）場合、２６０：２８０比における連続的な低下が、観察され、一方で安定剤を用いた（すなわちトランスフェクションがＰＥＩおよびｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋを使用して実施された）場合、高い比率が維持された。

【0273】

結論：この研究は、この実験で試験された最長のトランスフェクションカクテルのインキュベーション時間（すなわち１２０分）に関する２６０：２８０比（１．０〜１．２）により証明されるように、安定剤がＡＡＶの力価および空ベクターに対して比較した完全ベクターのより高い数の両方を維持することができることを実証している。安定剤の非存在下では、トランスフェクションカクテルのインキュベーション時間を増加させるとｒＡＡＶの力価は有意に（約７〜８倍）低下し、一方で２６０：２８０比は約０．６に減少し、これは、空ベクターの数の増加を示している。

【0274】

実施例７．ＰＥＩの非存在下での安定剤単独のトランスフェクション効率。
この研究の目的は、トランスフェクション試薬として単独で（すなわち陽イオン性ポリマーの非存在下で）使用された場合の安定剤のトランスフェクション効率を決定することであった。

【0275】

材料および方法：
１．プラスミドＤＮＡおよび培地：実施例１で記載されたものと同じ。
２．トランスフェクション試薬：この研究に関して、我々は、（ｉ）ＰＥＩ（実施例１で記載された通り；陽性対照）（ｉｉ）ｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋ（ＰＥＧ、Ｍ_ｎ５０００にコンジュゲートされた分枝状ＰＥＩ、Ｍ_ｎ２５０００）または（ｉｉｉ）ＰＥＧ Ｍ_ｎ３５０００（ＰＥＧ３５ｋ）のいずれかをトランスフェクション試薬として使用した。

【0276】

３．トランスフェクションカクテルの調製：トランスフェクションカクテルは、以下のものを含有する等量混合物からなる：混合物Ａ−予め決定された比率でＦ１７培地に添加されたプラスミドＤＮＡ（実施例１で記載された）、ならびに混合物Ｂ−以下のいずれかを含有する：（ｉ）ＰＥＩ（陽性対照；細胞１００万個あたり２．２ｕｇ）、（ｉｉ）ｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋ（細胞１００万個あたり１〜１５ｕｇ）または（ｉｉｉ）ＰＥＧ３５ｋ（細胞１００万個あたり１〜１５ｕｇ）。最終的なトランスフェクションカクテルは、室温（約２５℃）で混合物Ｂを混合物Ａに添加することによって調製される。混合は、トランスフェクションカクテルをシェーカー中で１２０ＲＰＭで連続的に振盪することによって達成される。トランスフェクションカクテルの体積は、培養体積の１０パーセントであり、使用されたＤＮＡの量は、細胞１００万個あたり１ｕｇに相当する。

【0277】

５．トランスフェクションおよびＡＡＶの生産性試験：ＨＥＫ２９３細胞を、６ウェルプレート中でＦ１７培地中で３７℃、５％ＣＯ_２で１２×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度まで増殖させた。トランスフェクションの前に、トランスフェクション試薬としてＰＥＩ単独を含有するトランスフェクションカクテル（上で（３）において記載されたように調製された）を室温で２分インキュベートし、一方でトランスフェクション試薬として異なる量のｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋまたはＰＥＧ３５ｋのどちらかを含有するトランスフェクションカクテルを、調製後室温で１時間インキュベートし（“トランスフェクションカクテルのインキュベーション時間”）、次いで細胞培養物に添加した。トランスフェクションの３時間後に、培養物を１×１０^６細胞／ｍＬに希釈し、細胞増殖およびＡＡＶの産生を可能にした。細胞および細胞培養培地を含む試料を、（Ｖｉ−ｃｅｌｌを使用する）細胞計数および細胞生存度のために、トランスフェクション後２４、４８および７２時間の時点で採取した。細胞をトランスフェクション後７２時間の時点で回収し、溶解させ、溶解物をｄｄＰＣＲを用いてＡＡＶ力価に関して分析した。

【0278】

結果：トランスフェクションプロセスにおけるＰＥＧおよびｂＰＥＩの役割を理解するため、ＤＮＡのトランスフェクションを、増加する量のｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋ単独またはＰＥＧ３５ｋ単独のどちらかを用いて（６０分のトランスフェクションカクテルのインキュベーション時間後に）行い、トランスフェクション効率（ｒＡＡＶ力価として測定した）をＰＥＩ単独（２分のトランスフェクションカクテルのインキュベーション時間）に対して比較した（図１２）。ＰＥＧ３５ｋのトランスフェクション試薬としての使用は、結果としてｒＡＡＶ力価における増大を一切もたらさなかったが、ｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋの細胞１００万個あたり約１１〜１３ｕｇの濃度での使用は、結果として最大力価をもたらし、それは、なお陽性対照（すなわちトランスフェクション試薬としてＰＥＩ単独）よりも約１０倍低かった。

【0279】

結論：この研究は、ｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋが分枝状ＰＥＩ部分（ｂＰＥＩ）を介して、かつＰＥＧ分子によらずにＰＥＩ−ＤＮＡ複合体と相互作用することを実証している。ＰＥＧ単独では、安定化することも細胞にトランスフェクションすることさえもできない。ＰＥＩのような陽イオン性ポリマーにコンジュゲートされたＰＥＧ分子の組み合わせが、トランスフェクションカクテルを安定化する鍵である。これらの研究に基づいて、ｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋのＰＥＩ部分が安定剤をＤＮＡに結合させる一方で、ＰＥＧ分子がＤＮＡ−ＰＥＩ複合体の表面電荷を低減し、凝集体形成を最小限にすることによりＤＮＡ−ＰＥＩ複合体を安定化するという仮説が立てられている。

【0280】

実施例８．陽イオン性ポリマー単独と比較した場合の、陽イオン性ポリマーおよび安定剤の組み合わせのトランスフェクション効率
この研究の目的は、陽イオン性ポリマー単独と比較した場合の陽イオン性ポリマーおよび安定剤の組み合わせのトランスフェクション効率を決定することであった。

【0281】

材料および方法：
１．プラスミドＤＮＡ、陽イオン性ポリマー、培地および安定剤：実施例１で記載された通り。

【0282】

２．トランスフェクションカクテルの調製：トランスフェクションカクテルは、以下のものを含有する等量混合物からなる：混合物Ａ−予め決定された比率でＦ１７培地に添加されたプラスミドＤＮＡ（実施例１で記載された通り）、ならびに混合物Ｂ−以下のものを含有する：（ｉ）ＰＥＩ（細胞１００万個あたり２．２ｕｇ）、（ｉｉ）ＰＥＩ（細胞１００万個あたり２．２ｕｇ）および安定剤（ｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋ）（細胞１００万個あたり０．２２ｕｇ、それはＰＥＩと比較して１０％に相当する）、（ｉｉｉ）安定剤（ｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋ）（細胞１００万個あたり２４ｕｇまたは１１ｕｇ）または（ｉｖ）ＰＥＩ（細胞１００万個あたり４ｕｇ）および安定剤（ｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋ）（細胞１００万個あたり０．４ｕｇ、それはＰＥＩと比較して１０％に相当する）。最終的なトランスフェクションカクテルは、室温（約２５℃）で混合物Ｂを混合物Ａに添加することによって調製される。混合は、トランスフェクションカクテルをシェーカー中で１２０ＲＰＭで連続的に振盪することによって達成される。トランスフェクションカクテルの体積は、培養体積の１０パーセントであり、使用されたＤＮＡの量は、細胞１００万個あたり１ｕｇに相当する。

【0283】

３．トランスフェクションおよびＡＡＶの生産性試験：ＨＥＫ２９３細胞を、６ウェルプレート中でＦ１７培地中で３７℃、５％ＣＯ_２で１２×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度まで増殖させた。トランスフェクションの前に、トランスフェクションカクテル（上で（２）において記載されたように調製された）を室温で２分または６０分インキュベートし（“トランスフェクションカクテルのインキュベーション時間”）、次いで細胞培養物に添加した。トランスフェクションの３時間後に、培養物を１×１０^６細胞／ｍＬに希釈し、細胞増殖およびＡＡＶの産生を可能にした。細胞および細胞培養培地を含む試料を、（Ｖｉ−ｃｅｌｌを使用する）細胞計数および細胞生存度のために、トランスフェクション後２４、４８および７２時間の時点で採取した。細胞をトランスフェクション後７２時間の時点で回収し、溶解させ、溶解物をｄｄＰＣＲを用いてＡＡＶ力価に関して分析した。

【0284】

結果：ＰＥＩ単独をトランスフェクション試薬として使用した場合、トランスフェクションカクテルのインキュベーション時間が２分から６０分に増加した際にｒＡＡＶ力価は約１０倍低下した（２分を６０分に対して比較する：棒１対２、図１３）。対照的に、１０％のｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ２５ｋのＰＥＩへの添加は、２分〜６０分の間に高い力価を維持した（棒３および４を棒１および２に対して比較する）。ｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋ単独（ＰＥＩなし）を前の条件で使用したＰＥＩおよびｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋの量と同等の量で（棒５および６、図１３）、または棒１および２で示されている前の条件で単独で使用したＰＥＩの量より５倍高い量で（棒７および８、図１３）トランスフェクションに使用した場合、ｒＡＡＶの力価は、２分および６０分の両方に関して１０〜２０倍を超えて低かった（棒１および２に対して比較した棒５〜８、図１６）。これは、それ自体のみで使用される安定剤はＤＮＡ−ＰＥＩ複合体を安定化するが、その力価は単独で使用されるＰＥＩと比較して非常に低いことを示唆している。ＰＥＩおよび安定剤の独特の組み合わせは、トランスフェクションカクテル中のＤＮＡ−ＰＥＩ複合体を安定化することができ、結果として高い力価をもたらす。最後に、安定剤のレベルをＰＥＩと比較して１０％で保ちながらＰＥＩの量も変更する場合、トランスフェクションカクテルは安定なままであり、結果として高い力価をもたらすことが、決定された（棒９〜１０、図１３）。

【0285】

結論：安定剤単独（すなわち陽イオン性ポリマーであるＰＥＩの非存在下）のトランスフェクション効率は、ＰＥＩと比較して非常に乏しい（１５〜２０倍低い）。トランスフェクションカクテルを長時間（７〜１０分より長く）インキュベートした場合、安定剤の非存在下では、力価が著しく（１０〜１５倍より大きく）低下する。ＰＥＩの安定剤との組み合わせは、ＤＮＡ−ＰＥＩ複合体を安定化するのを助け、結果として高いｒＡＡＶ力価をもたらす。

【0286】

実施例９．トランスフェクションカクテルのスケーラビリティおよび長期安定性
この研究の目的は、トランスフェクションカクテルのスケーラビリティおよび延長されたトランスフェクションカクテルのインキュベーション時間を試験することであった。

【0287】

材料および方法：
１．プラスミドＤＮＡ、陽イオン性ポリマー、培地および安定剤：実施例１で記載された通り。

【0288】

２．トランスフェクションカクテルの調製：トランスフェクションカクテルは、以下のものを含有する等量混合物からなる：混合物Ａ−予め決定された比率でＦ１７培地に添加されたプラスミドＤＮＡ（実施例１で記載された通り）、ならびに混合物Ｂ−Ｆ１７培地中の細胞１００万個あたり２．２ｕｇのＰＥＩおよび１０％の安定剤（ｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋ）。最終的なトランスフェクションカクテルは、室温（約２５℃）で混合物Ｂを混合物Ａに添加することによって調製される。混合は、トランスフェクションカクテルをシェーカー中で１２０ＲＰＭで連続的に振盪することによって達成される。トランスフェクションカクテルの体積は、培養体積の２０パーセントであり、ＤＮＡの量は、細胞１００万個あたり１ｕｇである。

【0289】

３．トランスフェクションおよびＡＡＶの生産性試験：ＨＥＫ２９３細胞を、２Ｌのバイオリアクター中でＦ１７培地中で３７℃、５％ＣＯ_２で１２×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度まで増殖させた。トランスフェクションの前に、トランスフェクションカクテル（上で（２）において記載されたように調製された）を室温で１、４または８時間インキュベートし（“トランスフェクションカクテルのインキュベーション時間”）、次いで細胞培養物に添加した。トランスフェクションの３時間後に、トランスフェクションを停止させた。細胞を７２時間増殖相で維持し、ＡＡＶの産生を可能にした。細胞および細胞培養培地を含む試料を、（Ｖｉ−ｃｅｌｌを使用する）細胞計数および細胞生存度のために、トランスフェクション後２４、４８および７２時間の時点で採取した。細胞をトランスフェクション後７２時間の時点で回収し、溶解させ、溶解物をｄｄＰＣＲを用いてＡＡＶ力価に関して分析した。

【0290】

結果：トランスフェクションカクテルのインキュベーション時間（１、４または８時間）とは無関係に、比較可能なｒＡＡＶ力価が得られた（図１４）。
結論：この研究は、トランスフェクションカクテルが少なくとも８時間に至るまで安定であり、結果として高いｒＡＡＶ力価をもたらすことを実証している。

【0291】

実施例１０．より高い細胞密度のためのトランスフェクションカクテルの安定化
この研究の目的は、高細胞密度トランスフェクション（２４×１０^６細胞／ｍＬ）のための安定剤を含有するトランスフェクションカクテルの安定性を試験することであった。

【0292】

材料および方法：
１．プラスミドＤＮＡ、陽イオン性ポリマー、培地および安定剤：実施例１で記載された通り。

【0293】

２．トランスフェクションカクテルの調製：トランスフェクションカクテルは、以下のものを含有する等量混合物からなる：混合物Ａ−予め決定された比率でＦ１７培地に添加されたプラスミドＤＮＡ（実施例１で記載された通り）およびＰＥＩの量と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％または５０％のｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋ、ならびに混合物Ｂ−Ｆ１７培地中の細胞１００万個あたり２．２ｕｇのＰＥＩ。最終的なトランスフェクションカクテルは、室温（約２５℃）で混合物Ｂを混合物Ａに添加することによって調製される。混合は、トランスフェクションカクテルをシェーカー中で１２０ＲＰＭで連続的に振盪することによって達成される。トランスフェクションカクテルの体積は、培養体積の１０パーセントであり、使用されたＤＮＡの量は、細胞１００万個あたり１ｕｇに相当する。

【0294】

３．トランスフェクションおよびＡＡＶの生産性試験：ＨＥＫ２９３細胞を、６ウェルプレート中でＦ１７培地中で３７℃、５％ＣＯ_２で２４×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度まで増殖させた。トランスフェクションの前に、トランスフェクションカクテル（上で（２）において記載されたように調製された）を室温で１時間インキュベートし（“トランスフェクションカクテルのインキュベーション時間”）、次いで細胞培養物に添加した。トランスフェクションの３時間後に、培養物を２×１０^６細胞／ｍＬに希釈し、細胞増殖およびＡＡＶの産生を可能にした。細胞および細胞培養培地を含む試料を、（Ｖｉ−ｃｅｌｌを使用する）細胞計数および細胞生存度のために、トランスフェクション後２４、４８および７２時間の時点で採取した。細胞をトランスフェクション後７２時間の時点で回収し、溶解させ、溶解物をｄｄＰＣＲを用いてＡＡＶ力価に関して分析した。

【0295】

結果：高い細胞密度（２４×１０^６細胞／ｍＬ）では、安定剤の添加は、陽性対照と比較して、試験した全ての量でｒＡＡＶの力価を増大させた（図１５）。最高のｒＡＡＶの力価レベルは、（ＰＥＩと比較して）約２５％の安定剤の存在下で得られた（図１５）。

【0296】

結論：この研究は、高い細胞密度（例えば２４×１０^６細胞／ｍＬ）のトランスフェクションに関して、トランスフェクションカクテル（実施例１〜９で使用した濃度の２倍の濃度のＤＮＡを含有する）は、安定剤ｂＰＥＩ２５ｋ．ＰＥＧ５ｋを使用して安定化されることができ、最高のｒＡＡＶの力価レベルは、ＰＥＩと比較して約２５％の安定剤を使用して得られたことを実証している。また、トランスフェクションカクテル中の安定剤の添加の順序が、重要であることが分かった。高い細胞密度（例えば２４×１０^６細胞／ｍＬ）のトランスフェクションに関しては、プラスミドを含有する混合物Ａに安定剤を添加することが重要であるが、低い細胞密度（例えば１２×１０^６細胞／ｍＬ）のトランスフェクションに関しては、安定剤の添加の順序は、重要ではなかった（すなわち、安定剤は、混合物Ａ（プラスミドＤＮＡを含有する）または混合物Ｂ（ＰＥＩを含有する）に添加されることができる）。

【0297】

実施例１１．代替の安定剤であるポリＬ−リジンにコンジュゲートされたＰＥＧ（ｐＬＬ．ＰＥＧ）を用いたＤＮＡ−ＰＥＩ複合体の安定化
この研究の目的は、ＰＥＧ化ポリＬ−リジン（ｐＬＬ）化合物の安定化能力を比較することであった。

【0298】

材料および方法：
１．プラスミドＤＮＡ、陽イオン性ポリマーおよび培地：実施例１で記載されたものと同じ。

【0299】

２．安定剤：この研究に関して、我々は以下のものを使用した：（ｉ）ｐＬＬ．ＰＥＧ＿１（ＰＥＧ、Ｍ_ｎ５０００にコンジュゲートされたｐＬＬ、Ｍ_ｎ２６０００）。（ｉｉ）ｐＬＬ．ＰＥＧ＿２（ＰＥＧ、Ｍ_ｎ５０００にコンジュゲートされたｐＬＬ、Ｍ_ｎ１５０００）
３．トランスフェクションカクテルの調製：トランスフェクションカクテルは、以下のものを含有する等量混合物からなる：混合物Ａ−予め決定された比率でＦ１７培地に添加されたプラスミドＤＮＡ（実施例１で記載された通り）ならびに混合物Ｂ−Ｆ１７培地中の細胞１００万個あたり２．２ｕｇのＰＥＩおよびＰＥＩと比較して、０％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％または５０％のｐＬＬ．ＰＥＧ＿１もしくはｐＬＬ．ＰＥＧ＿２のどちらか。最終的なトランスフェクションカクテルは、室温（約２５℃）で混合物Ｂを混合物Ａに添加することによって調製される。混合は、トランスフェクションカクテルをシェーカー中で１２０ＲＰＭで連続的に振盪することによって達成される。トランスフェクションカクテルの体積は、培養体積の１０パーセントであり、使用されたＤＮＡの量は、細胞１００万個あたり１ｕｇに相当する。

【0300】

４．トランスフェクションおよびＡＡＶの生産性試験：ＨＥＫ２９３細胞を、６ウェルプレート中でＦ１７培地中で３７℃、５％ＣＯ_２で１２×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度まで増殖させた。トランスフェクションの前に、トランスフェクションカクテル（上で（３）において記載されたように調製された）を調製後室温で１時間インキュベートし（“トランスフェクションカクテルのインキュベーション時間”）、次いで細胞培養物に添加した。トランスフェクションの３時間後に、培養物を１×１０^６細胞／ｍＬに希釈し、細胞増殖およびＡＡＶの産生を可能にした。細胞および細胞培養培地を含む試料を、（Ｖｉ−ｃｅｌｌを使用する）細胞計数および細胞生存度のために、トランスフェクション後２４、４８および７２時間の時点で採取した。細胞をトランスフェクション後７２時間の時点で回収し、溶解させ、溶解物をｄｄＰＣＲを用いてＡＡＶ力価に関して分析した。

【0301】

結果：上記のように、細胞を、ＰＥＩと比較して０％〜５０％のｐＬＬ．ＰＥＧ＿１または０％〜５０％のｐＬＬ．ＰＥＧ＿２安定剤を含有するトランスフェクションカクテルでトランスフェクションした。生存度データ（図１６）は、ｐＬＬ．ＰＥＧ＿１またはｐＬＬ．ＰＥＧ＿２を含有する安定剤の培養物への添加は細胞に対して毒性ではないことを示唆した。ｐＬＬ．ＰＥＧ＿１またはｐＬＬ．ＰＥＧ＿２のトランスフェクションカクテルへの添加は、ｒＡＡＶ力価を６倍に増大させた（図１７）。

【0302】

結論：安定剤ｐＬＬ．ＰＥＧ＿１およびｐＬＬ．ＰＥＧ＿２は、両方とも細胞に対して毒性ではなかったが、ｐＬＬ．ＰＥＧ＿１およびｐＬＬ．ＰＥＧ＿２の使用は、結果として安定剤なしの条件と比較した場合に高いｒＡＡＶ力価収率をもたらした。

【0303】

上記の個々の節で言及された本発明の様々な特徴および態様は、適宜他の節にも必要な変更を加えて適用される。従って、ある節で明記された特徴は、他の節で明記された特徴と適宜組み合わせられることができる。特許、特許出願、論文、教本および引用された配列アクセッション番号を含む本明細書で引用された全ての参考文献ならびにそこで引用された参考文献は、参照により本明細書にそのまま援用される。援用された文献および類似の資料の１つ以上が、定義された用語、用語の使用法、記載された技法等を含め（それらに限定されない）、本出願と異なるか矛盾する場合、本出願が支配する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【外国語明細書】

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