特開 2021-108659 標的ヌクレオチド配列を増幅及び確定する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2021-108659(P2021-108659A)

(43)【公開日】2021年8月2日

(54)【発明の名称】標的ヌクレオチド配列を増幅及び確定する方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/686 20180101AFI20210705BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20210705BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20210705BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/686 Z

   C12Q1/6869 ZZNA

   C12N15/11 Z

【審査請求】有

【請求項の数】15

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

【全頁数】31

(21)【出願番号】特願2020-218414(P2020-218414)

(22)【出願日】2020年12月28日

(31)【優先権主張番号】62/954,673

(32)【優先日】2019年12月30日

(33)【優先権主張国】US

(71)【出願人】

【識別番号】390023582

【氏名又は名称】財團法人工業技術研究院

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】230118913

【弁護士】

【氏名又は名称】杉村 光嗣

(74)【代理人】

【識別番号】100196298

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 高雄

(72)【発明者】

【氏名】江 佩馨

(72)【発明者】

【氏名】范 振業

(72)【発明者】

【氏名】簡 虹▲チ▼

(72)【発明者】

【氏名】林 ▲ユ▼宇

(72)【発明者】

【氏名】林 志龍

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA13

4B063QA17

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR32

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS36

4B063QX02

(57)【要約】

【課題】標的ヌクレオチド配列を増幅及び確定する方法を提供する。
【解決手段】
前記標的ヌクレオチド配列を増幅する方法は、次を含む。第１結合器と第２結合器を、それぞれ標的ヌクレオチド配列を有する二本鎖核酸分子の両端に接続し、核酸テンプレートを形成し、第１結合器はＹ型結合器又はヘアピン型（ｈａｉｒ−ｐｉｎ）結合器を含み、且つ第２結合器はヘアピン型結合器である。次に、核酸テンプレートに対してＰＣＲ増幅サイクルを行い、標的ヌクレオチド配列のＰＣＲアンプリコンを取得する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）第１結合器と第２結合器を、それぞれ標的ヌクレオチド配列を有する二本鎖核酸分子の両端に接続して、核酸テンプレートを形成し、前記標的ヌクレオチド配列は、順方向鎖及び逆方向鎖を含み、前記第１結合器は、Ｙ型結合器又はヘアピン型（ｈａｉｒ−ｐｉｎ）結合器を含み、且つ前記第２結合器は、ヘアピン型結合器であり、
（ｂ）前記核酸テンプレートに対して変性反応を行い、
（ｃ）前記標的ヌクレオチド配列でＰＣＲ増幅を実行し、第１プライマー、第２プライマー、ＤＮＡポリメラーゼを前記核酸テンプレートに接触させ、前記第１プライマーは、前記順方向鎖の近くの前記第１結合器に特異的にアニーリングした第１配列を含み、第２プライマーには逆方向鎖の近くの第１結合器に特異的にアニーリングした第２配列を含み、
（ｄ）ステップ（ｃ）を繰り返して、１つ又は複数回のＰＣＲ増幅サイクルを実行し、前記標的ヌクレオチド配列のＰＣＲアンプリコンを得る、
ステップを含む、標的ヌクレオチド配列を増幅する方法。

【請求項2】

前記核酸テンプレートに対して前記変性反応を行うステップは、前記核酸テンプレートを重亜硫酸塩処理に供することを含む、請求項１に記載の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法。

【請求項3】

前記第１結合器は、ヘアピン型結合器であり、対をなす二本鎖部分と対をなさない一本鎖部分を含み、
前記一本鎖部分は、前記第１配列と同じ又は相補的な配列と、前記第２配列と同じ又は相補的な配列を含む、請求項１又は２に記載の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法。

【請求項4】

前記第１結合器は、Ｙ型結合器であり、対をなす二本鎖部分と対をなさない一本鎖部分を含み、前記一本鎖部分は、第１不対鎖及び第２不対鎖を含み、
前記第１不対鎖は、前記第１配列と相補的な配列を含み、前記第２不対鎖は、前記第２配列と相補的な配列を含む、請求項１〜３の何れか一項に記載の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法。

【請求項5】

前記第１結合器は、ヘアピン型結合器であり、対をなす二本鎖部分と対をなさない一本鎖部分を含み、前記一本鎖部分は、少なくとも１つのウラシル（Ｕ）塩基を含み、
ステップ（ｂ）を実行する前に、ウラシル‐ＤＮＡグリコシラーゼ及びＤＮＡグリコシラーゼ‐リアーゼエンドヌクレアーゼＶＩＩＩをもって前記Ｕ塩基の位置で前記一本鎖部分を切断し、第１鎖及び第２鎖を形成し、前記第１鎖は、前記第１配列と相補的な配列を含み、且つ前記第２鎖は、前記第２配列と相補的な配列を含む、請求項１〜４の何れか一項に記載の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法。

【請求項6】

前記第１結合器は、ヘアピン型結合器であり、対をなす二本鎖部分と対をなさない一本鎖部分を含み、
前記一本鎖部分は、前記第１配列と相補的な配列及び前記第２配列と相補的な配列を含み、
ステップ（ｃ）を行う前に、前記核酸テンプレートを増幅することを更に含む、請求項１〜５の何れか一項に記載の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法。

【請求項7】

前記増幅は、ローリングサークル増幅（Ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＲＣＡ）である、請求項６に記載の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法。

【請求項8】

前記ローリングサークル増幅は、少なくとも１つの相補プライマーを使用し、前記相補プライマーは、前記標的ヌクレオチド配列と相補的である、請求項７に記載の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法。

【請求項9】

前記ローリングサークル増幅が少なくとも１つの相補プライマーを使用し、前記相補プライマーは、前記第１結合器及び前記第２結合器の少なくとも１つと相補的である、請求項７に記載の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法。

【請求項10】

前記標的ヌクレオチド配列の前記ＰＣＲアンプリコンは、核酸シーケンシングに用いられ、
前記第１結合器が、前記核酸シーケンシングに用いられる第１シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列、及び前記核酸シーケンシングに用いられる第２シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を含むか、又は、
前記第１プライマーが、前記第１シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を含み、前記第２プライマーが、前記第２シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を含む、請求項１〜９の何れか一項に記載の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法。

【請求項11】

前記標的ヌクレオチド配列の前記ＰＣＲアンプリコンは、核酸シーケンシングに用いられ、
前記第１結合器の前記一本鎖部分が、前記核酸シーケンシングに用いられる第１シーケンシングプライマーと同じ又は相補的である配列、及び前記核酸シーケンシングに用いられる第２シーケンシングプライマーと同じ又は相補的である配列を含むか、又は、
前記第１プライマーが、前記第１シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を含み、且つ前記第２プライマーが、前記第２シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を含む、請求項３に記載の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法。

【請求項12】

前記標的ヌクレオチド配列の前記ＰＣＲアンプリコンは、核酸シーケンシングに用いられ、
前記第１不対鎖が、前記核酸シーケンシングに用いられる第１シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を含み、且つ前記第２不対鎖が、前記核酸シーケンシングに用いられる第２シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を含むか、又は、
前記第１プライマーが、前記第１シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を含み、前記第２プライマーが、前記第２シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を含む、請求項４に記載の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法。

【請求項13】

前記標的ヌクレオチド配列の前記ＰＣＲアンプリコンは、核酸シーケンシングに用いられ、
前記第１鎖が、前記核酸シーケンシングに用いられる第１シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を含み、且つ前記第２鎖が、前記核酸シーケンシングに用いられる第２シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を含むか、又は、
前記第１プライマーが、前記第１シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を含み、且つ前記第２プライマーが、前記第２シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を含む、請求項５に記載の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法。

【請求項14】

前記標的ヌクレオチド配列の前記ＰＣＲアンプリコンは、核酸シーケンシングに用いられ、
前記第１結合器の前記一本鎖部分が、前記核酸シーケンシングに用いられる第１シーケンシングプライマーと同じ又は相補的である配列、及び前記核酸シーケンシングに用いられる第２シーケンシングプライマーと同じ又は相補的である配列を含むか、又は、
前記第１プライマーが、前記第１シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を含み、前記第２プライマーが、前記第２シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を含む、請求項６に記載の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法。

【請求項15】

請求項１〜１４の何れか一項に記載の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法を使用して得られる前記標的ヌクレオチド配列の前記ＰＣＲアンプリコンを提供することと、
前記標的ヌクレオチド配列の前記ＰＣＲアンプリコンに核酸シーケンシングを実行し、前記標的ヌクレオチド配列の配列情報を取得することと、
を含む、標的ヌクレオチド配列を確定する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、ゲノミクスの方法に関するものであり、特に、標的ヌクレオチド配列を増幅及び確定する方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

１０年以上の技術発展を経て、次世代シーケンシング（Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＮＧＳ）のコストは、大幅に低減され、更にビッグデータ分析能力の急速な進化が加わったため、多くの国が精密医療を大幅に推進し、巨大なビジネスチャンスが徐々に形成されている。精密医療では、「病気の変化の早期発見」が診断と治療の重要な基礎及び指標となる。特に癌の進行過程においては、ＤＮＡ突然変異が薬剤耐性等の患者に不利な状況を招く可能性があるため、早期に発見できれば、医療チームが患者に最適な処置を施すことができる。

【0003】

例えば、人体の約２０，０００個の遺伝子のうち、大体３００個以上の遺伝子が癌と高い関連性を有し、同じ種類の癌を患っている患者でも、遺伝子変異点が同じではない。従って、同じ癌の病期であっても、同じ薬を投与した場合の効果は大きく異なる。「包括的ゲノムプロファイリング」（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）のような方法を使用して、癌の類別に関係なく一度に３００個の遺伝子をテストし、全ての変異を一度に見つけ、患者を適切な治療オプションと照合することができれば、貴重な時間と金銭を有効に節約することを期待できる。また、癌の種類や病期で区別するのではなく、遺伝子変異を調べて治療することは、「精密医療」の精神でもある。

【0004】

しかしながら、従来のＮＧＳのエラー率は約１％であり、最良の場合は、０．１％まで低下できるが、依然として「少量変異遺伝子の検出」の要求を満たすことができない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

既存のＮＧＳ技術では、従来のＮＧＳのエラー率は約１％であり、最良の場合は、０．１％まで低下できるが、依然として「少量変異遺伝子の検出」の要求を満たすことができない。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本開示は、標的ヌクレオチド配列を増幅する方法を提供し、得られたアンプリコンは、何れか１つの鎖に順方向標的ヌクレオチド配列及び逆方向標的ヌクレオチド配列を有する。

【0007】

本開示は、相補的な二本鎖のＤＮＡ鎖の配列情報を得ることができる標的ヌクレオチド配列を確定する方法を提供する。

【0008】

本開示は、標的ヌクレオチド配列を増幅する方法を提案し、それは、以下のステップを含む。（ａ）第１結合器と第２結合器を、標的ヌクレオチド配列を有する二本鎖核酸分子の両端に接続し、核酸テンプレートを形成し、標的ヌクレオチド配列は、順方向鎖と逆方向鎖を含み、第１結合器は、Ｙ型結合器又はヘアピン型（ｈａｉｒ−ｐｉｎ）結合器を含み、且つ第２結合器は、ヘアピン型結合器である。（ｂ）核酸テンプレートに対して変性反応を行う。（ｃ）標的ヌクレオチド配列をＰＣＲ増幅するのに十分な条件下で、第１プライマー、第２プライマー、ＤＮＡポリメラーゼを核酸テンプレートと接触させ、第１プライマーは、順方向鎖の近くの第１結合器に特異的にアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）する第１配列を含み、前記第２プライマーは、逆方向鎖の近くの第１結合器に特異的にアニールする第２配列を含む。（ｄ）ステップ（ｃ）を繰り返し、１つ又は複数回のＰＣＲ増幅サイクルを行い、標的ヌクレオチド配列ＰＣＲアンプリコンを取得する。

【0009】

本開示は、標的ヌクレオチド配列を確定する方法を提供し、それは、以下のステップを含む。上記の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法で得られる標的ヌクレオチド配列ＰＣＲアンプリコンを提供する。標的ヌクレオチド配列のＰＣＲアンプリコンに核酸シーケンシングを実行し、それにより、標的ヌクレオチド配列の配列情報を取得する。

【発明の効果】

【0010】

本発明は、元の標的ヌクレオチド配列の精度を向上させ、シーケンシングのコストを低減する。

【0011】

上記に基づいて、本開示は、ヘアピン型の第２結合器と標的ヌクレオチド配列の相補的な二本鎖のＤＮＡ（即ち、順方向鎖及び逆方向鎖）を核酸テンプレートとして１つに接続し、第１結合器上に位置するプライマーを使用して核酸テンプレートにＰＣＲ増幅サイクルを行う。従って、得られたＰＣＲアンプリコンの何れの鎖にも順方向標的ヌクレオチド配列と逆方向標的ヌクレオチド配列を有する。また、ＰＣＲアンプリコンの何れの鎖にも順方向標的ヌクレオチド配列と逆方向標的ヌクレオチド配列を含むため、核酸シーケンシング分析を実行する時、何れの端からシーケンシングを行っても相補的な二本鎖のＤＮＡ領域の配列を取得でき、且つ取得した相補的な二本鎖のＤＮＡ領域の配列を比較することで、元の標的ヌクレオチド配列の精度を向上させることができる。更に、本開示は、相補的な二本鎖のＤＮＡを１つに接続してシーケンシング及び分析するため、シーケンシングのコストを低減することができる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】本開示による第１実施形態の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法のフローチャートである。

【図2】本開示による第２実施形態の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法のフローチャートである。

【図3】本開示による第３実施形態の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法のフローチャートである。

【図4】本開示による第４実施形態の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法のフローチャートである。

【図5】本開示による第５実施形態の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法のフローチャートである。

【図6】ヘアピン型構造体の例示的な構造を示す図である。

【図7】配列番号８と配列番号９のヌクレオチド配列アライメントを示す図である。

【図8】配列番号８、配列番号９及び配列番号１０のヌクレオチド配列アライメントを示す図である。

【図9】設計されたヘアピン型構造体の順方向配列とその逆方向相補配列の配列アライメントを示す図である。

【図10】インシリコバイサルファイト変換したヘアピン型構造体の順方向配列とその逆方向相補配列の配列アライメントを示す図である。

【図11】ＤＮＡメチル化を分析する規則を示す図である。

【図12】配列番号９、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４の配列アライメントを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

［用語の定義］
本実施例において、互換可能に用いられる「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドポリマーを指し、且つＤＮＡとＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド又は塩基及び／又はそれらの類似体、或いはＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼによってポリマーに組み込むことができる任意のマトリックスであることができる。ポリヌクレオチドには、メチル化ヌクレオチドやその類似体等の修飾ヌクレオチドを含むことができる。

【0014】

本実施形態において、「オリゴヌクレオチド」は通常、より短い一本鎖の合成ポリヌクレオチドを指し、その長さは一般に約２００個のヌクレオチドを超えないが、本開示はこれに限定するものではない。本実施形態では、「オリゴヌクレオチド」と「ポリヌクレオチド」という用語は相互に排他的ではない。以上のポリヌクレオチドに関する説明は、オリゴヌクレオチドにも同様に完全に適用される。

【0015】

「５’」及び「３’」という用語は通常、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドにおける同じポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの方向性における両端を指す。一般的に、５’は上流に位置し、３’は下流に位置し、ヌクレオチドｉｎｖｉｖｏは、５’から３’の方向の合成である。

【0016】

本実施形態において、互換可能に使用される「ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」と「アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）」は、２つの核酸分子が互いの間で高度な相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を有することが必須であり、それにより、ヌクレオチドグループの塩基の間の水素結合によって安定した複合体となることを表している。本実施形態において、核酸分子の一部が別の核酸分子上の相補的な配列と特異的にハイブリダイゼーション又はアニーリングすることができる。例えば、核酸分子の５’末端に一部分のハイブリダイゼーションしていないヌクレオチドが存在し、同じ核酸分子の３’末端の一部分の配列は、別の核酸分子と特異的にハイブリダイゼーション又はアニーリングすることができる。

【0017】

本実施形態において、「核酸テンプレート」は、標的濃縮及びシーケンシングの開始材料としての核酸サンプル中のヌクレオチドを指す。核酸テンプレートは、一本鎖又は二本鎖であることができる。

【0018】

本実施形態において、「変性（ｄｅｎａｔｕｒｅ）」とは、核酸テンプレートを処理し、相補的な二本鎖核酸分子を一本鎖の分子に分割し、オリゴヌクレオチドプライマー（例えば、第１プライマーや第２プライマー）等にアニーリングすることに用いることができるようにすることを指す。

【0019】

本実施形態では、「プライマー」は、通常、比較的短い一本鎖ポリヌクレオチドであり、且つ通常は、遊離した３’‐ＯＨ基を有する。プライマーは、標的配列とハイブリダイゼーションして対象の標的に結合し、標的と相補的なポリヌクレオチドの重合を促進する。

【0020】

本実施形態では、「シーケンシングプライマー」は、オリゴヌクレオチドであり、核酸分子内のプライマー接続及びシーケンシング反応における延伸に適した位置に接続し、配列情報を生成することができる。

【0021】

本実施形態において、「結合器（ａｄａｐｔｏｒ）」とは、ポリヌクレオチドのフラグメントに接続することができるオリゴヌクレオチドを指す。

【0022】

「解離温度（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）」は、核酸の半分が溶液中で解離状態であり、核酸の残りの半分が解離していない状態である温度を表す。結合器がヘアピン型（ｈａｉｒｐｉｎ）を形成できる場合、解離温度は、半分の結合器が部分的にセルフハイブリダイゼーションした「ヘアピン型」となる時の温度である。

【0023】

核酸結合器及び核酸サンプルが、前記核酸結合器と核酸サンプルとの間に他の挿入された繰り返し配列を有さない場合、前記核酸結合器及び核酸サンプルは、互いのすぐ上流又は下流にある。一本鎖分子では、上流は、５’末端方向を意味し、下流は３’末端方向を意味する。二本鎖分子では、この極性はそれ自体で決定することも、指向性を有する構成要素（例えば、プロモーター、コーディング配列等）の極性に基づいて決定することもできる。例えば、プロモーターの極性は、ＲＮＡポリメラーゼが合成を開始する方向から下流に延伸する。コーディング配列の極性は、開始コドンから停止コドンへの方向に下流に向かって延伸する。

【0024】

本実施形態では、「増幅（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」とは、所望の配列の２つ以上のコピーを生成する過程を指す。増幅反応の成分は、プライマー、核酸テンプレート、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、ｄＮＴＰを含み得るが、本開示は、それに限定するものではない。

【0025】

「増幅した生成物」、「増幅生成物」又は「アンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）」とは、ＰＣＲ増幅反応によって生成されるオリゴヌクレオチドを指し、特定の標的テンプレート核酸及び／又はその相補配列の一部のコピーであり、ヌクレオチド配列において、核酸テンプレート配列及び／又はその相補配列に対応する。増幅生成物は、プライマーに特異的な配列を更に含むことができ、且つ前記配列は、標的核酸の配列及び／又はその相補配列に隣接する。本明細書に記載のアンプリコンは、通常、二本鎖ＤＮＡであるが、一本鎖として引用することもできる。

【0026】

「濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）」という用語は、処理前に前記サンプルに最初に存在する全体的な核酸配列レベルに対して、サンプル中の特定の核酸配列の相対的な存在量を増加させる過程を指す。従って、濃縮ステップは、直接の増加量ではなく、相対的なパーセンテージ又は割合の増加量を提供している。濃縮ステップの後、分析されるサンプルは、濃縮又は選択されたポリヌクレオチドと称することができる。

【0027】

本開示は、標的配列に対して標的配列濃縮を有効に実行することができる標的ヌクレオチド配列を増幅する方法を提供する。具体的には、本開示は、次世代のシーケンシング技術を使用して標的ヌクレオチド配列を確定する前に、対象の標的ヌクレオチド配列を濃縮する方法を提供する。

【0028】

本開示は、標的ヌクレオチド配列を増幅する方法を提供し、それは、以下のステップを含む。（ａ）第１結合器と第２結合器を、それぞれ標的ヌクレオチド配列を有する二本鎖核酸分子の両端に接続し、核酸テンプレートを形成し、標的ヌクレオチド配列は、順方向鎖及び逆方向鎖を含み、第１結合器は、Ｙ型結合器又はヘアピン型（ｈａｉｒ−ｐｉｎ）結合器を含み、且つ第２結合器は、ヘアピン型結合器である。（ｂ）核酸テンプレートに対して変性反応を行う。（ｃ）標的ヌクレオチド配列をＰＣＲ増幅するのに十分な条件下で、第１プライマー、第２プライマー、ＤＮＡポリメラーゼを核酸テンプレートと接触させ、第１プライマーは、順方向鎖の近くの第１結合器に特異的にアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）する第１配列を含み、前記第２プライマーは、逆方向鎖の近くの第１結合器に特異的にアニールする第２配列を含む。（ｄ）ステップ（ｃ）を繰り返し、１つ又は複数回のＰＣＲ増幅サイクルを行い、標的ヌクレオチド配列ＰＣＲアンプリコンを取得する。

【0029】

本実施形態では、標的ヌクレオチド配列は、二本鎖標的ポリヌクレオチドの配列を指し、順方向鎖と逆方向鎖を含むことができる。

【0030】

本実施形態では、使用される結合器には、第１結合器と第２結合器を含み、第１結合器はＹ型結合器又はヘアピン型（ｈａｉｒ−ｐｉｎ）結合器を含み、第２結合器は、ヘアピン型結合器である。

【0031】

一実施形態では、Ｙ型結合器には、対をなす二本鎖部分と対をなさない一本鎖部分を含む。具体的には、Ｙ型結合器は、第１末端に接続可能な二本鎖部分を含み、第２端に非二本鎖部分のオリゴヌクレオチドを含み、二本鎖部分は、標的ヌクレオチド配列を有する二本鎖核酸分子に接続することができる。一実施形態では、Ｙ型結合器は、単独の第１鎖と第２鎖を含み、Ｙ型結合器の第１鎖は、３’末端が、Ｙ型結合器の第１末端（即ち、接続可能な末端）に位置する１つの鎖を指す。Ｙ型結合器の第２鎖は、５’末端がＹ型結合器の第１末端（即ち、接続可能な末端）に位置する別の鎖を指す。

【0032】

一実施形態において、Ｙ型結合器の第１鎖は、５’不対部分及び３’対部分を含み、Ｙ型結合器の第２鎖は、３’不対部分及び５’対部分を有する。一実施形態では、Ｙ型結合器の第１鎖と第２鎖の対をなす部分は、基本的に相補的であり、接続可能な二本鎖部分を含む第１末端を形成し、且つ二本鎖部分は、アニーリング温度で二本鎖形態を維持するのに十分な長さを有する。

【0033】

一実施形態では、Ｙ型結合器の非二本鎖部分は、第１不対鎖（例えば、第１鎖の５’不対部分）と第２不対鎖（第２鎖の３’不対部分）を含む。実施形態では、Ｙ型結合器の第１不対鎖の長さは、第２不対鎖の長さよりも短い、長い、又は等しいものであることができる。

【0034】

一実施形態では、Ｙ型結合器の第１不対鎖と第２不対鎖は基本的に相補的ではない。一実施形態では、Ｙ型結合器の第２鎖の第２不対鎖（即ち。３’不対部分）は、アニーリング温度（ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）で第１鎖の第１不対鎖（即ち、５’不対部分）に特異的にアニーリングしない。

【0035】

一実施形態では、Ｙ型結合器の二本鎖部分の長さは、約１０ｂｐ〜３０ｂｐであることができ、例えば、約１２ｂｐ〜２８ｂｐ、約１５ｂｐ〜２５ｂｐ、約１８ｂｐ、約２０ｂｐ等であり得るが、これらに限定するものではない。一実施形態では、Ｙ型結合器の第１不対鎖及び第２不対鎖の長さは、約１０ｂｐ〜６０ｂｐであることができ、例えば、約１５ｂｐ〜４５ｂｐ、約２０ｂｐ〜４０ｂｐ、約２５ｂｐ、約３０ｂｐ、約３５ｂｐ等であり得るが、これらに限定するものではない。一実施形態では、Ｙ型結合器の解離温度は、約３０℃〜９０℃であることができ、例えば、約３５℃〜９０℃、約４５℃〜８５℃、又は約５０℃〜８０℃、約５５℃〜７５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃等であり得るが、これらに限定するものではない。

【0036】

一実施形態では、Ｙ型結合器の第１不対鎖と第２不対鎖は、プライマーのアニーリング領域である。一実施形態では、プライマーは、増幅用のプライマーと核酸シーケンシング用のプライマーを含む。一実施形態では、Ｙ型結合器の第１不対鎖は、増幅用のプライマー（例えば、第１プライマー）と相補的な配列を含み、且つＹ型結合器の第２不対鎖は、増幅用の別のプライマー（例えば、第２プライマー）と相補的な配列を含む。

【0037】

一実施形態では、Ｙ型結合器の第１不対鎖及び第２不対鎖がプライマーと結合する温度範囲は、約２０℃〜７２℃であることができ、例えば、約２５℃〜７０℃、約３０℃〜６５℃、約３５℃〜６０℃、約４０℃〜５５℃、約５２℃〜７０℃、約５５℃〜６８℃、約４５℃、約５８℃、約６０℃、約６２℃、約６５℃等であり得るが、これらに限定するものではない。

【0038】

一実施形態では、ヘアピン型結合器は、部分的にセルフハイブリダイゼーションし且つヘアピン型（ｈａｉｒｐｉｎ）を形成することができる。一実施形態では、ヘアピン型結合器は、対をなす二本鎖部分（即ち、ステム領域（ｓｔｅｍ ｒｅｇｉｏｎ））と対をなさない一本鎖部分（即ち、ループ領域（ｌｏｏｐ ｒｅｇｉｏｎ））を含み、二本鎖部分は、標的ヌクレオチド配列を有する二本鎖核酸分子に接続することができ、対をなさない一本鎖部分は、ループ（ｌｏｏｐ）構造を有する。

【0039】

一実施形態では、ヘアピン型結合器の二本鎖部分の長さは、約１０ｂｐ〜３０ｂｐであることができ、例えば、約１２ｂｐ〜２８ｂｐ、約１５ｂｐ〜２５ｂｐ、約１８ｂｐ、約２０ｂｐ等であり得るが、これらに限定するものではない。ヘアピン型結合器の二本鎖部分の長さが過度に長いと、後続のＰＣＲ反応によって生成されるＰＣＲアンプリコンを抑制する。一実施形態では、ヘアピン型結合器の一本鎖部分の長さは、約５ｂｐ〜５０ｂｐであることができ、例えば、約１０ｂｐ〜４５ｂｐ、約１５ｂｐ〜４０ｂｐ、約２０ｂｐ〜３５ｂｐ、約２５ｂｐ、約３０ｂｐ等であり得るが、これらに限定するものではない。実施形態では、ヘアピン型結合器の解離温度は、約３０℃〜９０℃であることができ、例えば、約３５℃〜８５℃、約４０℃〜８０℃、約４５℃〜７５℃、約３５℃〜６５℃、約４０℃〜６０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６８℃、約７２℃、約８５℃等であり得るが、これらに限定するものではない。

【0040】

一実施形態では、ヘアピン型結合器の一本鎖部分がプライマーボンディング領域である。一実施形態では、プライマーは、増幅用のプライマーと核酸シーケンシング用のプライマーを含む。一実施形態では、ヘアピン型結合器の一本鎖部分は、増幅用のプライマー対（例えば、第１プライマーと第２プライマー）と同じ又は相補的な配列を含む。

【0041】

一実施形態では、ヘアピン型結合器の一本鎖部分がプライマーに結合する温度範囲は、約２０℃〜７２℃であることができ、例えば、約２５℃〜７０℃、約３０℃〜６５℃、約３５℃〜６０℃、約４０℃〜５５℃、約５２℃〜７０℃、約５５℃〜６８℃、約２６℃、約３７℃、約４６℃、約５８℃、約６０℃、約６２℃、約６５℃等であり得るが、これらに限定するものではない。

【0042】

一実施形態では、ヘアピン型結合器の一本鎖部分は、少なくとも１つのウラシル（Ｕ）塩基を含む。一実施形態では、ウラシルの特異的消化酵素（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ）によってヘアピン型結合器の一本鎖部分のウラシル（Ｕ）塩基の位置で消化を行い、２つの単独の鎖（例えば、第１鎖と第２鎖）を形成することができ、第１鎖と第２鎖は、Ｙ型を形成する。一実施形態では、ウラシル特異的切除試薬（Ｕｒａｃｉｌ‐Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｅｘｃｉｓｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ，ＵＳＥＲ）酵素（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ；ＮＥＢから入手可能）を使用し、ヘアピン型結合器のＵ塩基を含む一本鎖部分を消化し、ウラシル位置に１つの単一のヌクレオチドのギャップを生成することができる。ＵＳＥＲ酵素は、ウラシル‐ＤＮＡグリコシラーゼ（Ｕｒａｃｉｌ-ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ，ＵＤＧ）とＤＮＡグリコシラーゼリアーゼエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ（ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ−ｌｙａｓｅ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＶＩＩＩ，ｅｎｄｏＶＩＩＩ）の混合物である。ＵＤＧは、ウラシル塩基の除去を触媒し、脱塩基部位（ａｂａｓｉｃ ｓｉｔｅ，ＡＰ ｓｉｔｅ）（ピリミジンジオン）を形成し、同時にホスホジエステル骨格を完全に保持する。エンドヌクレアーゼＶＩＩＩリアーゼ活性は、脱塩基部位の３’及び５’のホスホジエステル骨格を破壊し、次に脱塩基デオキシリボースを放出する。上記の実施形態では、ウラシル‐ＤＮＡグリコシラーゼとＤＮＡグリコシラーゼリアーゼ−エンドヌクレアーゼＶＩＩＩを先に混合し（ＵＳＥＲ酵素等）、次にヘアピン型結合器のＵ塩基を含む一本鎖部分を消化するが、本開示はこれに限定するものではない。別の実施形態では、先ず、ヘアピン型結合器のＵ塩基を含む一本鎖部分にウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼを処理させ、次にＤＮＡグリコシラーゼ−リアーゼエンドヌクレアーゼＶＩＩＩを処理することができる。一実施形態では、第１鎖は、増幅用のプライマー（例えば、第１プライマー）と相補的な配列を含み、第２鎖は、増幅用の別のプライマー（例えば、第２プライマー）と相補的な配列を含む。

【0043】

一実施形態では、プライマーの長さは、少なくとも約１０個のヌクレオチドであるが、約２００個ヌクレオチドを超えない。

【0044】

本実施形態では、プライマーは、核酸テンプレートの既知のヌクレオチド配列に特異的にアニーリングするように設計される。一実施形態では、プライマーは、核酸テンプレートと基本的に相補な配列を含むため、プライマーは、核酸テンプレートに特異的にアニーリングすることができる。一実施形態では、プライマー中の核酸テンプレートとハイブリダイゼーションする配列は、プライマー配列の３’末端に位置する。プライマーとその相補体は、アニーリングし、２本鎖のポリヌクレオチドを形成することができる。

【0045】

本実施形態では、第１プライマーは、順方向鎖の近くの第１結合器に特異的にアニーリングすることができる第１配列を含み、第２プライマーは、逆方向鎖の近くの第１結合器に特異的にアニーリングすることができる第２配列を含む。

【0046】

一実施形態では、第１結合器は、ヘアピン型結合器であり、第１プライマーは、一本鎖部分の順方向鎖の近くの領域に特異的にアニーリングすることができ、第２プライマーは、一本鎖部分の逆方向鎖の近くの領域に特異的にアニーリングすることができる。より具体的には、一本鎖部分の順方向鎖の近くの領域は、第１配列と相補的な配列を含み、一本鎖部分の逆方向鎖の近くの領域は、第２配列と相補的な配列を含む。

【0047】

一実施形態では、第１結合器は、Ｙ型結合器であり、第１プライマーは、順方向鎖の近くの第１不対鎖に特異的にアニーリングすることができ、第２プライマーは、逆方向鎖の近くの第２不対鎖に特異的にアニーリングすることができる。より具体的には、順方向鎖の近くの第１不対鎖は、第１配列と相補的である配列を含み、逆方向鎖の近くの第２不対鎖は、第２配列と相補的である配列を含む。

【0048】

一実施形態では、第１結合器は、核酸マーカー又は分子バーコード（ｂａｒｃｏｄｅ）を含む。一実施形態では、第１結合器の一本鎖部分に核酸マーカー又は分子バーコードを含む。一実施形態では、第１結合器の二本鎖部分に核酸マーカー又は分子バーコードを含む。核酸マーカー又は分子バーコードを使用し、同じ核酸テンプレートのアンプリコンアンプリコンから派生したシーケンスリード（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｓ）を比較し、ＰＣＲ増幅サイクルによって引き起こされるエラーを訂正させることができる。即ち、核酸マーカー又は分子バーコードは、同じ初期核酸テンプレートをマークすることに用いることができるため、分析のエラー率を低減することができる。一実施形態では、分子バーコードは一本鎖である。一実施形態では、Ｙ型の第１結合器の第１鎖は、対になっていない部分の３’末端に分子バーコードを含む。一実施形態では、分子バーコードは、二本鎖である。

【0049】

本実施形態では、第２結合器は、ヘアピン型結合器である。一実施形態では、第１結合器は、ヘアピン型結合器であり、且つ第２結合器は、第１結合器とは異なるヘアピン型結合器である。一実施形態では、第２結合器は、第１プライマー及び第２プライマーと基本的に相補的ではないか、同じではない。

【0050】

一実施形態では、結合器と標的ヌクレオチド配列を有する二本鎖核酸分子との接続は、当技術分野で知られている任意の方法、例えば、平滑末端（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄ）接続又は粘着末端（ｓｔｉｃｋｙ−ｅｎｄ）接続によって行うことができる。

【0051】

一実施形態では、先に、第１結合器を、標的ヌクレオチド配列を有する二本鎖核酸分子の一端に接続し、次に第２結合器を、標的ヌクレオチド配列を有する二本鎖核酸分子の他端に接続することができる。別の実施形態では、先に第２結合器を、標的ヌクレオチド配列を有する二本鎖核酸分子の一端に接続し、次に第１結合器を、標的ヌクレオチド配列を有する二本鎖核酸分子の他端に接続することができる。

【0052】

一実施形態では、変性反応は、核酸テンプレートを十分に高い温度で加熱することによって実現される。一実施形態では、十分に高い温度は、約９０℃〜１００℃であり、例えば、約９２℃、約９５℃、約９８℃等であるが、これに限定するものではない。一実施形態では、核酸テンプレートの変性反応は、例えば、核酸テンプレートをバイサルファイト処理することである。バイサルファイト処理は、核酸テンプレートのシトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）に変換し、それによって塩基対の特異性を変えることができる。具体的には、元のシトシン（Ｃ）は、グアニン（Ｇ）と対をなす（Ｃ−Ｇ対）が、バイサルファイト変換後、シトシンはウラシル（Ｕ）に変換され、ウラシル（Ｕ）とグアニン（Ｇ）が非相補的な塩基対（Ｇ−Ｕ対）を形成するため、核酸テンプレートを一本鎖に変性させることができる。一実施形態では、バイサルファイト処理の変換率は６０％以上である。一実施形態では、バイサルファイト処理の変換率は、約７０％から１００％であることができ、例えば、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％等であり得るが、これらに限定するものではない。

【0053】

一実施形態では、第１結合器は、ヘアピン型結合器であり、ステップ（ｃ）の前に更に核酸テンプレートを増幅することができる。一実施形態では、ローリングサークル増幅（Ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＲＣＡ）を使用して核酸テンプレートを増幅し、大量の核酸テンプレート配列を有する相補複製物に合成する。具体的には、第１結合器と第２結合器は、何れもヘアピン型結合器であるため、変性後の核酸テンプレートは、環状核酸分子（第１結合器配列、順方向配列、第２結合器配列及び逆方向鎖配列を含む）であり、この環状核酸分子をローリングサークル増幅のテンプレートとして使用することができる。一実施形態では、ローリングサークル増幅は、少なくとも２つの核酸テンプレート配列の核酸分子生成物に合成することができる。

【0054】

一実施形態では、少なくとも１つの相補プライマーを使用してローリングサークル増幅を行う。一実施形態では、相補プライマーは、核酸テンプレートの標的ヌクレオチド配列と相補である。一実施形態では、相補プライマーは、核酸テンプレートの第１結合器と第２結合器の少なくとも一方と相補である。一実施形態では、ローリングサークル増幅は、多重プライマーローリングサークル増幅である。本実施形態では、当技術分野で知られている方法を使用してローリングサークル増幅を行い、ここでは、更に詳細に記載しない。

【0055】

本実施形態では、標的ヌクレオチド配列にＰＣＲ増幅を行うのに十分な条件下で、増幅用のプライマー（即ち、第１プライマー及び第２プライマー）を使用し、上記の核酸テンプレート又は相補複製物に１つ以上のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅サイクルを実行する。ＰＣＲ増幅サイクルは、標的ヌクレオチド配列の存在量を指数関数的に増加させる可能性がある。一実施形態では、前記方法は、少なくとも２回以上のＰＣＲ増幅サイクル、例えば、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０回の何れか又はそれ以上の反復されるＰＣＲ増幅サイクルを含む。一実施形態では、前記方法は、約３０回〜５０回のＰＣＲ増幅サイクルを含むことができる。各ＰＣＲ増幅サイクルは、次のステップを含む。１）鎖分離（例えば、熱変性）、２）第１プライマーと第２プライマーを核酸テンプレートに結合、及び３）アニーリングを経たプライマーのＤＮＡポリメラーゼの増大。当業者は、これらの各ステップに必要な条件及び時間を設計することができる。

【0056】

一実施形態では、以下の例示的な条件下でＰＣＲ増幅サイクルを実行する。１）９５℃で５分間維持する。２）次に、１０〜２５回のサイクルを実行し、９５℃で３０秒間変性し、それから５６℃でアニーリングし、７２℃で１分間の延伸させることを含む。３）ＰＣＲ反応終了後、４℃に保持する。但し、本開示は、これに限定するものではなく、他の適切な反応条件も使用することができる。

【0057】

一実施形態では、ＰＣＲ増幅サイクルを実行した後、ＰＣＲアンプリコンを更に精製することができる。一実施形態では、ＰＣＲアンプリコンを更に分析することができ、例えば、核酸シーケンシング、ＤＮＡマイクロアレイ分析（ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）等であるが、本開示は、これらに限定するものではない。一実施形態では、標的ヌクレオチド配列のＰＣＲアンプリコンを次世代シーケンシング（Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ, ＮＧＳ）に使用することができる。

【0058】

一実施形態では、第１結合器は、核酸シーケンシングの第１シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列及び核酸シーケンシングの第２シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を含む。

【0059】

一実施形態では、Ｙ型の第１結合器の第１不対鎖には、核酸シーケンシング用の第１シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を含み、且つ第２不対鎖は、核酸シーケンシング用の第２シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を含む。

【0060】

一実施形態では、ヘアピン型第１結合器の一本鎖部分は、シーケンシング用の第１シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列及びシーケンシング用の第２シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を含む。

【0061】

一実施形態では、ウラシル‐ＤＮＡグリコシラーゼ及びＤＮＡグリコシラーゼリアーゼ-エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ（ＵＳＥＲ酵素等）の消化によって形成される第１鎖は、シーケンシング用の第１シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を含み、第２鎖は、シーケンシング用の第２シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を含む。

【0062】

一実施形態では、第１結合器は、ヘアピン型結合器であり、第１シーケンシングプライマーは、一本鎖部分の順方向鎖の近くの領域に特異的にアニーリングすることができ、第２シーケンシングプライマーは、一本鎖部分の逆方向鎖の近くの領域に特異的にアニーリングすることができる。一実施形態では、一本鎖部分の順方向鎖の近くの領域は、第１シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を含み、一本鎖部分の逆方向鎖の近くの領域は、第２シーケンシングプライマー列と同じ又は相補的な配列を含む。

【0063】

一実施形態では、第１結合器は、Ｙ型結合器であり、第１シーケンシングプライマーは、順方向鎖の近くの第１不対鎖に特異的にアニーリングし、且つ第２シーケンシングプライマーは、逆方向鎖の近くの第２不対鎖に特異的にアニーリングする。

【0064】

一実施形態では、第１結合器は、ヘアピン型結合器であり、一本鎖部分の順方向鎖の近くの領域及び／又は第１プライマーは、第１シーケンシングプライマーの配列と同じ又は相補的である配列を含むことができ、且つ一本鎖部分の逆方向鎖の近くの領域及び／又は第２プライマーは、第２シーケンシングプライマーの配列と同じ又は相補的な配列を含むことができる。

【0065】

一実施形態では、第１結合器は、Ｙ型結合器であり、第１不対鎖及び／又は第１プライマーは、第１シーケンシングプライマーの配列と同じ又は相補的な配列を含むことができ、第２不対鎖及び／又は第２プライマーは、第２シーケンシングプライマーの配列と同じ又は相補的である配列を含むことができる。

【0066】

一実施形態では、第１プライマーは、第１シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を含み、第２プライマーは、第２シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を含む。実施形態では、第１プライマーの５’末端に第１シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を含み、第２プライマーの５’末端に第２シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を含む。

【0067】

一実施形態では、第１シーケンシングプライマーのシーケンシング方向は、第２シーケンシングプライマーのシーケンシング方向の反対である。一実施形態では、第１シーケンシングプライマーと第２シーケンシングプライマーが次世代のシーケンシングに用いられる。一実施形態では、第１シーケンシングプライマーと第２シーケンシングプライマーは、次世代のシーケンシング技術に基づくプライマー配列を含む。

【0068】

一実施形態では、第２結合器は、第１シーケンシングプライマー及び第２シーケンシングプライマーと基本的に相補的ではないか、基本的に同じではない。一実施形態では、第２結合器は、第１プライマー、第２プライマー、第１シーケンシングプライマー及び第２シーケンシングプライマーと基本的に相補的ではないか、基本的に同じではない。

【0069】

本実施形態では、ヘアピン型第２結合器によって標的ヌクレオチド配列の相補的な二本鎖のＤＮＡ（即ち、順方向鎖と逆方向鎖）を１つに結合し、核酸テンプレートとし、第１結合器上に位置するプライマーを使用して核酸テンプレートにＰＣＲ増幅サイクルを行う。従って、得られたＰＣＲアンプリコンの任意の１つの鎖は、何れも順方向標的ヌクレオチド配列、第２結合器配列、逆方向標的ヌクレオチド配列、及び両端に位置する第１結合器配列を有し、第２結合器配列は、順方向標的ヌクレオチド配列と逆方向標的ヌクレオチド配列を１つに接続する。ＰＣＲアンプリコンの何れの鎖にも順方向標的ヌクレオチド配列と逆方向標的ヌクレオチド配列を含むため、後続の核酸シーケンシング分析を行う時、どちらの端からも相補的な二本鎖のＤＮＡ領域の配列を得ることができ、且つ得られた相補的な二本鎖のＤＮＡ領域の配列を比較することができ、それにより元の配列の精度を向上させることができる。また、本実施形態では、相補的な二本鎖のＤＮＡを１つに接続してシーケンシング及び分析を行うため、シーケンシングのコストを低減することができる。更に、本開示は、標的ヌクレオチド配列の濃縮期間に核酸シーケンシングに特異性を有する配列を導入するため（例えば、第１結合器又は第１プライマー及び第２プライマー上の配列設計）、上記設計によって、シーケンシングから得られるシーケンシング方向を識別することができる。

【0070】

本開示は、また、以下のステップを含む、標的ヌクレオチド配列を確定する方法を提供する。先ず、上記の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法によって得られる標的ヌクレオチド配列のＰＣＲアンプリコンを提供する。次に、標的ヌクレオチド配列ＰＣＲアンプリコンで核酸シーケンシングを実行し、標的ヌクレオチド配列の配列情報を取得する。

【0071】

一実施形態では、核酸シーケンシングは、次世代のシーケンシングである。

【0072】

一実施形態では、前記方法は、核酸シーケンシングを実行する前に、標的ヌクレオチド配列のＰＣＲアンプリコンを使用してシーケンシングＤＮＡライブラリを調製することを更に含む。一実施形態では、前記方法には、複数のサンプルから標的ヌクレオチド配列のＰＣＲアンプリコンを定量化し、標的ヌクレオチド配列のＰＣＲアンプリコンを１つに併合して単一のシーケンシングＤＮＡライブラリとすることを含む。一実施形態では、標的ヌクレオチド配列のＰＣＲアンプリコンを結合器に接続し、それにより、シーケンシングステップ用のシーケンシングＤＮＡライブラリを構築する。一実施形態では、ＰＣＲアンプリコンを更に断片化することができる。

【0073】

本開示の上記方法は、多様な用途に用いることができ、例えば、臨床診断又は遺伝子工学のためのツールであるが、本発明は、これに限定するものではない。一実施形態では、上記方法を使用して、対象の遺伝子座の標的ヌクレオチド配列を確定し、標的ヌクレオチド配列内の配列変異体を検出することができる。一実施形態では、配列変異体は、疾患（例えば、遺伝性疾患や癌）に関連する配列変異体である。

【0074】

本開示を完全に理解するために、前記標的ヌクレオチド配列を増幅するステップを以下に詳細に説明する。但し、本開示を制限することを避けるために、周知の組成又はプロセスステップは詳細に説明しない。本開示の好ましい実施形態について以下に詳細に説明するが、本開示はこれに限定するものではなく、本開示は、他の実施形態にも広く実施することができ、本開示の範囲は限定されず、後述の特許請求の範囲に準ずるものである。

【0075】

図１は、本開示による第１実施形態の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法のフローチャートである。第１実施形態の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法は、以下のステップを含む。

【0076】

先ず、ステップａ）を行い、Ｙ型の第１結合器１０１とヘアピン型の第２結合器１０２を、それぞれ標的ヌクレオチド配列を有する二本鎖核酸分子１００の両端に接続し、核酸テンプレート１０を形成し、標的ヌクレオチド配列は、順方向鎖と逆方向鎖を含む。Ｙ型の第１結合器１０１は、対をなさないＹ５鎖１０５とＹ３鎖１０３を有する。Ｙ５鎖１０５とＹ３鎖１０３は、指向性を有することができ、例えば、Ｙ５鎖１０５は、Ｙ型の第１結合器の５’末端であることができ、Ｙ３鎖１０３は、Ｙ型第１結合器の３’末端であることができるが、これに限定するものではない。本実施形態では、核酸テンプレート１０は、ヘアピン型構造体（Ｈａｉｒ−ｐｉｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）である。

【0077】

次に、ステップｂ）を行い、核酸テンプレート１０に対して変性反応を行って、二本鎖核酸テンプレート１０を一本鎖に解離させる。本実施形態では、核酸テンプレート１０の変性反応は、例えば、核酸テンプレート１０に対してバイサルファイト処理することである。

【0078】

次に、ステップｃ）を行い、第１結合器１０１のＹ５鎖１０５に位置する第１プライマー１０６と第１結合器１０１のＹ３鎖１０３に位置する第２プライマー１０４を使用して複数会のＰＣＲ増幅サイクルを実行し、標的ヌクレオチド配列のＰＣＲアンプリコン２０を取得する。本実施形態では、第１プライマー１０６は、順方向鎖の近くのＹ５鎖１０５に特異的にアニーリングした第１配列を含み、第２プライマー１０４は、逆方向鎖の近くのＹ３鎖１０３に特異的にアニーリングした第２配列を含む。本実施形態では、ＰＣＲアンプリコン２０は、順方向標的ヌクレオチド配列１００ａと逆方向標的ヌクレオチド配列１００ｂを含む。

【0079】

本実施形態では、第１プライマー１０６は、第１シーケンシング方向１１２でシーケンシングを実行することができる第１シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を有し、第２プライマー１０４は、第２シーケンシング方向１１４でシーケンシングを実行することができる第２シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を有する。

【0080】

本実施形態では、ＰＣＲアンプリコン２０をもって更に核酸シーケンシングすることができる。本実施形態では、核酸シーケンシングは、例えば、次世代シーケンシングである。

【0081】

本実施形態では、ＰＣＲアンプリコン２０の何れの鎖にも順方向標的ヌクレオチド配列と逆方向標的ヌクレオチド配列を含むため、核酸シーケンシングを実行する場合、何れの端からシーケンシングを実行しても順方向標的ヌクレオチド配列と逆方向標的ヌクレオチド配列が得られる。また、得られた順方向標的ヌクレオチド配列と逆方向標的ヌクレオチド配列を比較することで、元の配列を復元する精度を向上させることができる。更に、本実施形態では、二本鎖の相補的なＤＮＡを１つに接続してシーケンシングと分析を行うため、シーケンシングのコストを低減することができる。

【0082】

図２は、本開示による第２実施形態の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法のフローチャートである。以下の実施形態では、前述の実施形態の一部の要素符号と一部の内容を用い、同じ符号で同じ要素を示し、同じ技術内容の説明を省略する。第２実施形態の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法は、以下のステップを含む。

【0083】

先ず、ステップａ）を行い、ヘアピン型の第１結合器１０１とヘアピン型の第２結合器１０２を、それぞれ標的ヌクレオチド配列を有する二本鎖核酸分子１００の両端に接続し、核酸テンプレート１０を形成し、標的ヌクレオチド配列は、順方向鎖と逆方向鎖を含む。本実施形態では、核酸テンプレート１０は、円形構造体（Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）である。本実施形態では、第１結合器１０１のループ構造を有する一本鎖部分に１つのＵ塩基を含む。

【0084】

次に、ステップb）ウラシル‐ＤＮＡグリコシラーゼとＤＮＡグリコシラーゼリアーゼ‐エンドヌクレアーゼＶＩＩＩによってループ構造を有する一本鎖部分のＵ塩基の位置で消化を行い、２つの単独のＹ５鎖１０５及びＹ３鎖１０３を形成する。本ステップでは、核酸テンプレート１０は、消化を経た後にヘアピン型構造体（Ｈａｉｒ−ｐｉｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を形成する。

【0085】

次に、ステップｃ）を行い、核酸テンプレート１０に対して変性反応を行って、二本鎖核酸テンプレート１０を一本鎖に解離させる。本実施形態では、核酸テンプレート１０の変性反応は、例えば、核酸テンプレート１０をバイサルファイト処理することである。

【0086】

次に、ステップｄ）を行い、第１結合器１０１のＹ５鎖１０５に位置する第１プライマー１０６と第１結合器１０１のＹ３鎖１０３に位置する第２プライマー１０４を使用し、複数回のＰＣＲ増幅サイクルを実行し、標的ヌクレオチド配列のＰＣＲアンプリコン２０を取得する。本実施形態では、第１プライマー１０６は、第１シーケンシング方向１１２を実行することができる第１シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を有し、第２プライマー１０４は、第２シーケンシング方向１１４を実行することができる第２シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を有する。本実施形態では、ＰＣＲアンプリコン２０は、順方向標的ヌクレオチド配列１００ａと逆方向標的ヌクレオチド配列１００ｂを含む。

【0087】

本実施形態では、ＰＣＲアンプリコン２０に対して更に核酸シーケンシングすることができる。

【0088】

図３は、本開示による第３実施形態の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法のフローチャートである。以下の実施形態では、前述の実施形態の一部の要素符号と一部の内容を使用し、同じ符号で同じ要素を示し、同じ技術内容の説明を省略する。第３実施形態の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法は、以下のステップを含む。

【0089】

先ず、ステップａ）を行い、ヘアピン第１結合器１０１とヘアピン第２結合器１０２を、それぞれ標的ヌクレオチド配列を有する二本鎖核酸分子１００の両端に接続し、核酸テンプレート１０を形成し、標的ヌクレオチド配列は、順方向鎖と逆方向鎖を含む。第１結合器１０１は、対をなす二本鎖部分と対をなさない一本鎖部分を含む。本実施形態では、核酸テンプレート１０は、円形構造（Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）である。

【0090】

次に、ステップｂ）を行い、核酸テンプレート１０に対して変性反応を実行し、二本鎖核酸テンプレート１０を一本鎖環状分子に解離させる。本実施形態では、核酸テンプレート１０の変性反応は、例えば、核酸テンプレート１０をバイサルファイト処理することである。

【0091】

次に、ステップｃ）を行い、順方向鎖の近くの第１結合器１０１領域に位置する第１プライマー１０６及び逆方向鎖の近くの第１結合器１０１領域に位置する第２プライマー１０４を使用して、複数回のＰＣＲ増幅サイクルを実行し、標的ヌクレオチド配列ＰＣＲアンプリコン２０を取得する。本実施形態において、第１プライマー１０６は、一本鎖部分に特異的にアニーリングした第１配列を含み、第２プライマー１０４は、一本鎖部分に特異的にアニーリングした第２配列を含む。本実施形態では、第１プライマー１０６は、第１シーケンシング方向１１２を実行することができる第１シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を有し、第２プライマー１０４には第２シーケンシング方向１１４を実行することができる第２シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を有する。本実施形態では、ＰＣＲアンプリコン２０は、順方向標的ヌクレオチド配列１００ａと逆方向標的ヌクレオチド配列１００ｂを含む。

【0092】

本実施形態では、ＰＣＲアンプリコン２０に対して更に核酸シーケンシングすることができる。

【0093】

図４は、本開示による第４実施形態の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法のフローチャートである。以下の実施形態では、前述の実施形態の一部の要素符号と一部の内容を使用し、同じ符号で同じ要素を示し、同じ技術内容の説明を省略する。第４実施形態の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法は、以下のステップを含む。

【0094】

先ず、ステップａ）を行い、ヘアピン型の第１結合器１０１とヘアピン型の第２結合器１０２を、それぞれ標的ヌクレオチド配列を有する二本鎖核酸分子１００の両端に接続し、核酸テンプレート１０を形成し、標的ヌクレオチド配列は、順方向鎖と逆方向鎖を含む。本実施形態では、核酸テンプレート１０は、円形構造（Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）である。

【0095】

次に、ステップｂ）を行い、核酸テンプレート１０に対して変性反応を実行して、二本鎖核酸テンプレート１０を一本鎖環状分子に解離させる。本実施形態では、核酸テンプレート１０の変性反応は、例えば、核酸テンプレート１０をバイサルファイト処理することである。

【0096】

次に、ステップｃ）を行い、標的ヌクレオチド配列上に位置する相補プライマー１０９を使用して一本鎖環状分子（核酸テンプレート１０）に対してローリングサークル増幅を行い、大量の核酸テンプレート配列有する相補複製物１１０を取得する。本実施形態では、相補プライマー１０９は、逆方向鎖に位置するが、本開示は、これに限定するものではない。他の実施形態では、相補プライマー１０９は、順方向鎖に位置する。本実施形態では、相補的な逆方向鎖配列、相補的な第１結合器配列、相補的な順方向鎖配列、及び相補的な第２結合器配列は、この順序で相補複製物１１０に繰り返して存在する。

【0097】

その後、ステップｄ）を行い、相補的な第１結合器配列の相補的な順方向鎖の近くの領域に位置する第１プライマー１０６と、相補的な第１結合器配列の相補的な逆方向鎖の近くの領域に位置する第２プライマー１０４を使用し、複数回のＰＣＲ増幅サイクルを実行し、標的ヌクレオチド配列のＰＣＲアンプリコン２０を取得する。本実施形態では、第１プライマー１０６は、一本鎖部分に特異的にアニーリングすることができる第１配列を含み、第２プライマー１０４は、一本鎖部分に特異的にアニーリングすることができる第２配列を含む。本実施形態では、第１プライマー１０６は、第１シーケンシング方向１１２を実行することができる第１シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を有し、第２プライマー１０４は、第２シーケンシング方向１１４を実行することができる第２シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を有する。本実施形態では、ＰＣＲアンプリコン２０は、順方向標的ヌクレオチド配列１００ａと逆方向標的ヌクレオチド配列１００ｂを含む。

【0098】

本実施形態では、ＰＣＲアンプリコン２０に対して更に核酸シーケンシングすることができる。

【0099】

図５は、本開示による第４実施形態の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法のフローチャートである。以下の実施形態では、前述の実施形態の一部の要素符号と一部の内容を使用し、同じ符号で同じ要素を示し、同じ技術内容の説明を省略する。第５実施形態の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法は、以下のステップを含む。

【0100】

先ず、ステップａ）を行い、ヘアピン第１結合器１０１とヘアピン第２結合器１０２を、それぞれ標的ヌクレオチド配列を有する二本鎖核酸分子１００の両端に接続し、核酸テンプレート１０を形成し、標的ヌクレオチド配列は、順方向鎖と逆方向鎖を含む。本実施形態では、核酸テンプレート１０は、円形構造（Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）である。

【0101】

次に、ステップｂ）を行い、核酸テンプレート１０に対して変性反応を実行し、二本鎖核酸テンプレート１０を一本鎖環状分子に解離させる。本実施形態では、核酸テンプレート１０の変性反応は、例えば、核酸テンプレート１０をバイサルファイト処理することである。

【0102】

次に、ステップｃ）を行い、第１結合器１０１上に位置する相補プライマー１０９を使用して一本鎖環状分子（核酸テンプレート１０）に対してローリングサークル増幅を行い、大量の核酸テンプレート配列を有する相補複製物１１０を取得する。本実施形態では、相補プライマー１０９は、第１結合器１０１に位置するが、本開示は、これに限定するものではない。別の実施形態では、相補プライマー１０９は、第２結合器１０２に位置する。本実施形態では、相補的な第１結合器配列、相補的な順方向鎖配列、相補的な第２結合器配列、及び相補的な逆方向鎖配列が、この順序で相補複製物１１０中に繰り返して存在する。

【0103】

その後、ステップｄ）を行い、相補的な第１結合器配列の相補的な順方向鎖の近くの領域に位置する第１プライマー１０６と、相補的な第１結合器配列の相補的な逆方向鎖の近くの領域に位置する第２プライマー１０４を使用し、複数回のＰＣＲ増幅サイクルを実行して標的ヌクレオチド配列のＰＣＲアンプリコン２０を取得する。本実施形態では、第１プライマー１０６は、一本鎖部分に特異的にアニーリングすることができる第１配列を含み、第２プライマー１０４は、一本鎖部分に特異的にアニーリングすることができる第２配列を含む。本実施形態では、第１プライマー１０６は、第１シーケンシング方向１１２を実行することができる第１シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を有し、第２プライマー１０４は、第２シーケンシング方向１１４を実行することができる第２シーケンシングプライマーと同じ又は相補的な配列を有する。本実施形態では、ＰＣＲアンプリコン２０は、順方向標的ヌクレオチド配列１００ａと逆方向標的ヌクレオチド配列１００ｂを含む。

【0104】

本実施形態では、ＰＣＲアンプリコン２０に対して更に核酸シーケンシングすることができる。

【0105】

以下、本発明をより具体的に実証するために、本開示の実験例を記載する。但し、本発明の精神から逸脱することなく、以下の実験例に示す材料、使用方法等を適切に変更することができる。従って、本発明の範囲は、以下に示す実験例によって限定解釈されるべきではない。

【0106】

実験例1：ヘアピン型構造体の構築（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈａｉｒ−ｐｉｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）

【0107】

図６は、ヘアピン型の構築物の例示的な構造を示している。本実施形態では、ヘアピン型構造体は、Ｙ型構造体２０１、標的二本鎖核酸分子２０２、及びステムループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造体２０３の３つの部分を含み、Ｙ型構造体２０１は、Ｙ型結合器から派生し、ステムループ構造体２０３は、ヘアピン型結合器から派生し、且つ標的二本鎖核酸分子２０３は、標的ヌクレオチド配列を有する。このヘアピン型構造体の３つの部分について、以下で詳しく説明する。

【0108】

［Ｙ型構造体の設計］
本実施形態では、Ｙ型構造体２０１のステム部分（即ち、対をなす二本鎖ＤＮＡ部分）の長さは、１２ｂｐで、２つの６塩基制限消化部位（ＳａｃＩとＥｃｏＲＩ）、即ちｇａｇｃｔｃｇａａｔｔｃ（配列番号１）を含む。Ｙ型構造体２０１の対をなさない部分は、Ｙ５鎖（５’末端の対をなさない鎖）とＹ３鎖（３’末端の対をなさない鎖）を含み、それぞれの長さは２５ｂｐである。本実施形態では、Ｙ５鎖とＹ３鎖の配列はヒトゲノム（ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ）に特定の配列（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）であり、且つＰＣＲプライマーがＰＣＲを行うのに適した領域配列である。

【0109】

［ステムループ構造体の設計］
本実施形態では、ステムループ構造体２０３のステム部分（即ち、対をなす二本鎖ＤＮＡ部分）の長さは１２ｂｐであり、２つの６塩基制限消化部位（ＢａｍＨＩとＸｂａＩ）、即ちｇｇａｔｃｃｔｃｔａｇａ（配列番号２）を含む。ステムループ構造体２０３のループ部分の長さは２５ｂｐである。本実施形態では、ステムループ構造体２０３のループ部分の配列は、ヒトゲノム（ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ）に特定の配列（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）であり、且つＰＣＲプライマーがＰＣＲを行うのに適した領域配列である。

【0110】

［ 標的二本鎖核酸分子デザイン］
本実施形態では、標的二本鎖核酸分子２０２の長さは、１００ｂｐであり、配列番号３のヌクレオチド配列を有する。

【0111】

［ヘアピン型構造体の構築］
表１に示すように、２つのオリゴヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏ‐１８６及びＯｌｉｇｏ‐１３７）を提供する。

【0112】

【表1】

【0113】

オリゴヌクレオチドＯｌｉｇｏ‐１８６は、Ｙ５鎖、Ｙ型構造体のステム部分（順方向）、標的二本鎖核酸分子（順方向）、ステムループ構造体のステム部分（順方向）、Ｙ型構造体の環部分及びステムループ構造体のステム部分（逆方向）の領域を順に含む。オリゴヌクレオチドＯｌｉｇｏ‐１３７は、標的二本鎖核酸分子（逆）、Ｙ型構造体のステム部分（逆）及びＹ３鎖の領域を順に含む。本実施形態では、ｉＭｅ‐ｄＣは、メチル化したシトシンを表す。オリゴヌクレオチドＯｌｉｇｏ‐１８６とオリゴヌクレオチドＯｌｉｇｏ‐１３７は、メッド社（Ｍｅｄｃｌｕｂ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｔａｉｗａｎ）によって合成されたものである。

【0114】

オリゴヌクレオチドＯｌｉｇｏ‐１８６とオリゴヌクレオチドＯｌｉｇｏ‐１３７をもってアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）反応を行った。１０μＬのオリゴヌクレオチドＯｌｉｇｏ‐１３７、１０μＬのオリゴヌクレオチドＯｌｉｇｏ‐１８６、３μＬの１０Ｘ Ｔ４リガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；ＮＥＢ）及び７μＬの再蒸留水（ｄｄＨ_２Ｏ）を混合し、総体積３０μＬのアニーリング混合溶液を得た（表２）。アニーリング混合溶液を９５℃で５分間変性させた。その後、室温（約２５℃）でゆっくりと温度を下げ、アニーリング反応を行った。

【0115】

【表2】

【0116】

２μＬの１０Ｘ Ｔ４リガーゼ緩衝液、２．５μＬのＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；ＮＥＢ）及び１５．５μＬのｄｄＨ２Ｏを上記の結合混合溶液（３０μＬ）に加え、総体積５０μＬのライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）混合溶液を取得する（表３）。ライゲーション混合溶液を室温（約２５℃）で３０分間、ライゲーション反応させて、核酸テンプレートとしてヘアピン型構造体を形成した。ここまでで、図１のステップａ）及び図６に示す構造が得られた。

【0117】

【表3】

【0118】

実験例２：ヘアピン型構造体のバイサルファイト処理
本実施形態では、カイジエ社（ＱＩＡＧＥＮ Ｔａｉｗａｎ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｔｄ）のＥｐｉＴｅｃｔＦａｓｔＢｉｓｕｌｆｉｔｅＫｉｔ（１０）（ＱＩＡＧＥＮカタログ番号／ＩＤ：５９８０２）を使用し、実験例１のヘアピン型構造体にバイサルファイト処理を行った。具体的には、１０μＬのライゲーション混合溶液（１９．９９１２ｎｇのＤＮＡを含む）、１０μＬのＲＮａｓｅフリー水（ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ）、８５μＬの重亜硫酸溶液（Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）及び１０μＬのＤＮＡ保護緩衝液（ＤＮＡ ｐｒｏｔｅｃｔ ｂｕｆｆｅｒ）をもって、総体積１４０μＬのバイサルファイト変換（Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）溶液を得た（表４）。

【0119】

【表4】

【0120】

上記のバイサルファイト変換溶液を９５℃で５分間変性させた後、バイサルファイト変換反応を６０℃で１０分間行った。その後、９５℃で５分間変性させた後、６０℃で１０分間のバイサルファイト変換反応を行った。その後、反応後のバイサルファイト変換溶液を後で使用するために２０℃に置いた。ここまでで、図１のステップｂ）に示す構造が得られた。

【0121】

実験例３：バイサルファイト変換されたヘアピン型構造体のメチル化を検出するシミュレーション
［バイサルファイトで形質転換したヘアピン型構造体のＰＣＲ反応］
本実施形態では、バイサルファイト変換されたヘアピン型構造体（以下、ＢＳＤＮＡと称する）にプライマーＦ（配列番号６のヌクレオチド配列）とプライマーＲ（配列番号７のヌクレオチド配列）を使用してＰＣＲ反応を行い、標的ヌクレオチド配列のＰＣＲアンプリコンを得た。プライマーＦとプライマーＲの配列を表５に示す。得られたＰＣＲアンプリコンの長さは３２０ｂｐである。

【0122】

【表5】

【0123】

ＰＣＲ反応溶液の成分を以下の表６に示す。

【0124】

【表6】

【0125】

ＰＣＲ反応溶液をもって次のプロセスによってＰＣＲ反応を実行する。（１）９５℃で１０分間維持する。（２）次の４０回のサイクルを実行する［９５℃で２０秒；５６℃で３０秒；７２℃で４０秒］；（２）７２℃で７分間維持する。

【0126】

［インシリコバイサルファイト変換（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）のコンピューターシミュレーションとその配列アライメント］
本実施形態では、実験例１で設計されたヘアピン型構造体はＹ５鎖からシーケンシングを開始し、配列番号８のヌクレオチド配列を有することができる。実験例２では、インシリコバイサルファイト変換されたヘアピン型構造体は、Ｙ５鎖からシーケンシングを開始し、配列番号９のヌクレオチド配列を有することができる。

【0127】

図７は、配列番号８と配列番号９のヌクレオチド配列アライメントを示している。図７に示すように、設計されたヘアピン型構造体（配列番号８）は、１１個のメチル化シトシン（▲でマークする箇所）を有し、そのうちの３つは、標的核酸分子領域にあり、８つは、プライマー領域（Ｙ５鎖及びＹ３鎖）にあり、バイサルファイト変換されることができるシトシン（即ち、元々メチル化されていないシトシン）は、計７１箇所を有する。インシリコバイサルファイト変換されたヘアピン型構造体の配列（配列番号９）は、配列中のメチル化されていないシトシン（Ｃ）を全てウラシル（Ｕ）／チミン（Ｔ）に変換する。

【0128】

［バイサルファイト変換率（ＢＳ−ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｒａｔｅ）の分析］
バイサルファイトシーケンシング（Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）法を用いてメチル化を検出することは、原則として、メチル化されていないシトシン（Ｃ）を全てウラシル（Ｕ）／チミン（Ｔ）に変換するが、メチル化されているシトシン（Ｃ）は変化せずに維持され、それによって、配列中のシトシン（Ｃ）のメチル化の状況を識別することができる。従って、全ての「元々メチル化されていなかったシトシン（Ｃ）」を「ウラシル（Ｕ）／チミン（Ｔ）」に変換することは１つの重要なステップである。

【0129】

本実施形態で使用される推定方法は、先ず個別に取得されたシーケンシング結果（配列）の「元々メチル化されていなかったＣの位置」をマークし、次にその変換（Ｃ‐＞Ｔ又はＣ‐＞Ｃ）の割合を計算することである。本実施形態では、比較に用いられる配列は、「ペアエンドシーケンス（ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」方式で整理される。具体的には、Ｙ５鎖とＹ３鎖からＰＣＲアンプリコンの順方向シーケンシング（ｆｏｒｗａｒｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）と逆方向シーケンシング（ｂａｃｋｗａｒｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を実行し、順方向配列と逆方向配列を使用して比較する。又は、逆方向配列を逆方向相補シーケンス配列（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に変換してから、順方向配列と比較する。本実施形態では、逆方向シーケンシング（逆方向プライマーを用いてシーケンシングする）後のＰＣＲアンプリコンの逆方向相補配列（配列番号１０）、設計されたヘアピン型構造体の配列（配列番号８）及びインシリコバイサルファイト変換されたヘアピン型構造体の配列（配列番号９）を比較し、バイサルファイト変換率を計算することができる。

【0130】

図８は、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０のヌクレオチド配列の比較を示している。図８中の矢印箇所は、メチル化されたＣの位置である。表７は、計算後の順方向配列及び逆方向相補配列（配列番号１０）のバイサルファイト変換率を示している。表７の結果から、順方向配列と逆方向相補配列のバイサルファイト変換率が何れも１００％であることがわかる。

【0131】

【表7】

【0132】

［相補的両側シーケンシング法を用いたＤＮＡメチル化の位置の分析］
本実施形態では、次のステップを用いてＤＮＡメチル化の位置を分析する。
（１）設計されたヘアピン型構造体の順方向配列（配列番号８）とその逆方向相補配列（配列番号１１）を配列アライメントする。
（２）インシリコバイサルファイト変換されたヘアピン型構造体の順方向配列（配列番号９）とその逆方向補体配列（配列番号１２）を配列アライメントする。
（３）「相補的両側シーケンシング」法を用いてＤＮＡメチル化の規則を分析する。
（４）上記の規則を用いて、シーケンシング後のＰＣＲアンプリコンの配列を分析し、元のＤＮＡ配列を復元し、メチル化されたＣの位置を確定する。

【0133】

［ヘアピン型構造体の順方向配列とその逆方向相補配列の配列アライメント］
図９は、設計されたヘアピン型構造体の順方向配列とその逆方向相補配列の配列アライメントを示している。図９では、ヘアピン型構造体の順方向配列（配列番号８）は「Ｙ５鎖から実行を開始したシーケンシング」を表し、ヘアピン型構造体の逆方向相補配列（配列番号１１）は「Ｙ３鎖から実行を開始したシーケンシング」を表す。図９から分かるように、二本鎖ＤＮＡ領域の配列（標的二本鎖核酸分子とステム領域）は同じであり、一本鎖のＹ３鎖と一本鎖のＹ５鎖のＤＮＡ領域の配列は異なり、一本鎖のＹ３鎖は「Ｙ３鎖からのシーケンシング」によって得られた配列を示し、一本鎖のＹ５鎖は「Ｙ５鎖からのシーケンシング」から得られた配列を示す。

【0134】

［インシリコバイサルファイト変換されたヘアピン型構造体の順方向配列とその逆方向相補配列の配列アライメント］
図１０は、インシリコバイサルファイト変換されたヘアピン型構造体の順方向配列とその逆方向相補配列の配列アライメントを示している。図１０において、インシリコバイサルファイト変換されたヘアピン型構造の順方向配列（配列番号９）は、「Ｙ５鎖から実行を開始したシーケンシング」を表し、インシリコバイサルファイト変換されたヘアピン型構造体の逆方向相補配列（配列番号１２）は「Ｙ３鎖から実行を開始したシーケンシング」を表す。図１０から分かるように、二本鎖のＤＮＡ領域の配列（標的二本鎖核酸分子及びステム領域）では、バイサルファイト変換を経た位置の塩基が異なり、一本鎖のＹ３鎖と一本鎖のＹ５鎖のＤＮＡ領域の配列が異なり、一本鎖のＹ３鎖は「Ｙ３鎖から実行を開始したシーケンシング」によって得られた配列を示し、一本鎖のＹ５鎖は「Ｙ５鎖から実行を開始したシーケンシング」によって得られた配列を示す。

【0135】

［「相補的両側シーケンシング」法を用いたＤＮＡメチル化の分析の規則］
図１０の配列アライメントデータから、ＤＮＡメチル化分析の規則を取得することができる。図１１は、ＤＮＡメチル化を分析する規則を示している。図１１の（ａ）は、配列中のＣがメチル化されているため、バイサルファイトによって変換されない塩基に属することを示している。従って、Ｙ５順方向プライマー又はＹ３逆方向プライマーの何れによってシーケンシングを実行するかにかかわらず、何れも５’‐ＡＴＣＧ‐３’の配列を取得することができる。図１１（ｂ）は、配列中のＣがメチル化されておらず、バイサルファイトによって変換される塩基に属することを示している。従って、バイサルファイト変換を経た後、Ｙ５順方向プライマーとＹ３逆方向プライマーによってシーケンシングを行えば、特定の塩基対（即ち、Ｃ−Ｔ及びＧ−Ａ）が得られる。

【0136】

［上記の規則を用いて、シーケンシング後のＰＣＲアンプリコンの配列を分析し、元のＤＮＡ配列を復元し、メチル化されたＣの位置を決定する］
インシリコバイサルファイト変換されたヘアピン型構造体の順方向配列（配列番号９）、インシリコバイサルファイト変換されたヘアピン型構造体の逆方向相補配列（配列番号１２）、順方向シーケンシング後のＰＣＲアンプリコンの順方向配列（配列番号１３）及び逆方向シーケンシング後のＰＣＲアンプリコンの逆方向配列（配列番号１４）を配列対比する。図１２は、配列番号９、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４の配列対比を示している。

【0137】

上記のＤＮＡメチル化を分析する規則により、それぞれ配列を比較した各塩基に特定の塩基対（即ち、Ｃ−ＴとＧ−Ａ）を有する場合、規則に従って元のＤＮＡ配列に復元することができる。それぞれ配列を比較した対応する位置の塩基が全て同じである場合、元のＤＮＡの対応する位置は、その一致する塩基であることを示している。例えば、４つの配列の対応する位置の塩基が何れもＡである場合、元のＤＮＡのその対応する位置にある塩基はＡであることを表す。従って、上記の規則によれば、ヘアピン構築物の標的核酸分子領域におけるメチル化の位置、即ち、図１２の方形フレームによって示される位置は、計３つのメチル化されたシトシンを有することを確定することができる。

【0138】

要約すると、本開示の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法によって得られるＰＣＲアンプリコンの任意の鎖は、順方向標的ヌクレオチド配列及び逆方向標的ヌクレオチド配列を含むので、核酸シーケンシングを実行する場合、いずれかの端からシーケンシングを実行しても、順方向標的ヌクレオチド配列及び逆方向標的ヌクレオチド配列を得ることができる。また、得られた順方向標的ヌクレオチド配列と逆方向標的ヌクレオチド配列を比較することで、元の配列を復元する精度を向上させることができる。更に、本実施形態では、二本鎖の相補的なＤＮＡを１つに接続してシーケンシングと分析を行うため、シーケンシングのコストを低減することができる。

【0139】

本開示は、実施形態をもって上記のとおり開示しているが、本開示を限定するためのものではなく、当業者は、本開示の精神と範囲から逸脱することなく、いくつかの変更や修飾を行うことができ、故に、本開示の保護範囲は、後述の特許請求の範囲に従うものとする。

【産業上の利用可能性】

【0140】

本開示は、得られるアンプリコンが任意の鎖に順方向標的ヌクレオチド配列及び逆方向標的ヌクレオチド配列を有する、標的ヌクレオチド配列を増幅する方法を提供する。

【符号の説明】

【0141】

１０ 核酸テンプレート
１００ 二本鎖核酸分子
１００ａ 順方向標的ヌクレオチド配列
１００ｂ 逆方向標的ヌクレオチド配列
１０１ 第１結合器
１０２ 第２結合器
１０３ Ｙ３鎖
１０４ 第２プライマー
１０５ Ｙ５鎖
１０６ 第１プライマー
１０９ 相補プライマー
１１０ 相補複製物
１１２ 第１シーケンシング方向
１１４ 第２シーケンシング方向
２０１ Ｙ型構造体
２０２ 標的二本鎖核酸分子
２０３ ステムループ構造体

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

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【外国語明細書】

2021108659000001.pdf