特開 2021-118717 シングルセル解析を行う方法およびそのための装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2021-118717(P2021-118717A)

(43)【公開日】2021年8月12日

(54)【発明の名称】シングルセル解析を行う方法およびそのための装置

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6844 20180101AFI20210716BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20210716BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20210716BHJP

   C12Q 1/6848 20180101ALI20210716BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20210716BHJP

   C12Q 1/6876 20180101ALI20210716BHJP

   C12N 15/10 20060101ALI20210716BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/6844 Z

   C12N15/09 ZZNA

   C12M1/00 A

   C12Q1/6848 Z

   C12M1/34 Z

   C12Q1/6876 Z

   C12N15/10 100Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】28

(21)【出願番号】特願2021-71934(P2021-71934)

(22)【出願日】2021年4月21日

(62)【分割の表示】特願2020-509545(P2020-509545)の分割

【原出願日】2019年4月26日

(31)【優先権主張番号】特願2018-89259(P2018-89259)

(32)【優先日】2018年5月7日

(33)【優先権主張国】JP

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＢＲＩＪ

３．ＴＷＥＥＮ

４．ＮＯＮＩＤＥＴ

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２４年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、戦略的創造研究推進事業 チーム型研究（ＣＲＥＳＴ） 海洋生物多様性および生態系の保全・再生に資する基盤技術の創出 「シングルセルゲノム情報に基づいた海洋難培養微生物メタオミックス解析による環境リスク数理モデルの構築」委託研究、及び、平成２７年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、戦略的創造研究推進事業 個人型研究（さきがけ） 統合１細胞解析の革新的技術基盤 「組織内の細胞多様性を明らかにする超並列ゲノム解析技術の創成」委託研究、産業技術力強化法第１

(71)【出願人】

【識別番号】519035229

【氏名又は名称】ｂｉｔＢｉｏｍｅ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100118371

【弁理士】

【氏名又は名称】▲駒▼谷 剛志

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】細川 正人

(72)【発明者】

【氏名】竹山 春子

(72)【発明者】

【氏名】西川 洋平

(72)【発明者】

【氏名】小川 雅人

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B029AA07

4B029AA23

4B029BB01

4B029CC05

4B029DG01

4B029FA12

4B029GA02

4B029GA08

4B029GB01

4B029HA05

4B063QA13

4B063QQ05

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR66

4B063QR83

4B063QS24

4B063QS36

4B063QX02

(57)【要約】      （修正有）

【課題】簡易な操作で細胞の溶解とゲノム増幅を行うゲノムライブラリーの作製方法を提供する。
【解決手段】２つ以上の細胞または細胞様構造物を含む試料を用い、該細胞または細胞様構造物を１細胞または構造物単位ずつ液滴中に封入する工程と、該液滴をゲル化してゲルカプセルを生成する工程と、該ゲルカプセルを１種以上の溶解用試薬に浸漬して前記細胞または細胞様構造物を溶解する工程であって、該細胞中のポリヌクレオチドが該ゲルカプセル内に溶出し該ポリヌクレオチドに結合する物質が除去された状態で前記ゲルカプセル内に保持される、工程と、該ポリヌクレオチドを増幅用試薬に接触させて該ポリヌクレオチドをゲルカプセル内で増幅する工程とを含む、細胞中のポリヌクレオチドを増幅する方法を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

本明細書に記載の発明。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、シングルセル解析を行う方法およびそのための装置に関するものである。

【背景技術】

【0002】

多様な細胞を含有する様々な生物学的サンプルにおいて、シングルセル毎の解析を行うことが近年少しずつ可能になっている。しかしながら、このような解析には、依然として、細胞の効果的な分離、単一細胞の溶解、全ゲノムの均一増幅、単一細胞増幅ゲノム（SAG）の品質評価、配列決定ライブラリー調製、および配列決定分析を含めたサンプル調製プロセスにおけるいくつかの技術的課題が存在している。そのため、品質とスループットを最大化するために、大規模並列解析を可能にする新規な技術に対する大きな需要がある。

【0003】

環境微生物のうち培養が可能なものはわずか１％に限られており、地球上の微生物の多様性の大部分は未知である。ゲノム配列情報は、生物を理解するための基本情報であり、ゲノム解読により系統、進化、疾患、生物地球化学的循環に関連する微生物の多様性と機能の理解が可能となる。このため、難培養性の機能理解には全ゲノム解析が必要不可欠とされている。この難培養微生物ゲノム解析の方法としては、試料から種々の微生物ゲノムを一括抽出し配列解読するメタゲノム解析が主流であった。

【0004】

しかし、メタゲノム解析法では、様々な微生物ゲノム配列の情報が混在するデータが得られることになる。このため、その中から興味のある微生物のゲノム情報を取り出して個別に再構築することは容易ではなく、大規模なデータ取得と計算処理が必要とされている。

【0005】

一方、１細胞解析では細胞一つ一つを始めに分けた後、処理を開始する。単一の細胞に由来する遺伝情報のみを直接的に取得するため、例えばゲノム情報を再構成するための計算難易度はメタゲノム解析に比べて圧倒的に易しい。しかし、細胞内の極小量のゲノム配列を漏れなく解読するためには、高精度な細胞操作と核酸反応が求められる。

【0006】

１細胞ゲノム解析のステップは、(１)微生物１細胞の分取、(２)微生物の溶解、(３)全ゲノム増幅、(４)増幅ゲノムのシークエンス解析、に大きく分けることができる。しかし、従来の分子生物学実験で用いられてきた数十マイクロリットルの反応系は、１細胞という極小の試料を上記の流れにしたがい精密に扱う上で不適切であった。具体的には、小さく不定形の多様な微生物をフローサイトメトリーなどで分取する際には、生物以外の粒子と微生物を分けて認識し回収することが困難であった。分取した微生物試料の扱いにおいても、実験環境や試料、実験者からの核酸のコンタミネーションが大容量の反応系においては高頻度に生じ、正常な増幅産物が得られる歩留まりは低く、解読した配列の大部分が無関係のコンタミネーション由来になるケースが非常に大きかった。

【0007】

さらに、正しい配列のみを情報処理により抽出しても、３０％程度のゲノム解読率に留まっていた。オープンな実験環境ではエアロゾルなどからのコンタミネーションを完全に防ぐことは難しいため、１細胞ゲノム解析実験専用の清浄実験環境が必要とされている。また細胞一つ一つからシークエンスを実行する必要性に対して、反応系のスループット性が極めて低いことも課題であり、高価な分注ロボットなどが実験操作に使用されてきた。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明の一局面では、細胞中のポリヌクレオチドを増幅する方法が提供される。方法は、２つ以上の細胞または細胞様構造物を含む試料を用い、細胞または細胞様構造物を１細胞または構造物単位ずつ液滴中に封入する工程と、液滴をゲル化してゲルカプセルを生成する工程と、ゲルカプセルを１種以上の溶解用試薬に浸漬して前記細胞または細胞様構造物を溶解する工程であって、細胞中のポリヌクレオチドがゲルカプセル内に溶出しポリヌクレオチドに結合する物質が除去された状態でゲルカプセル内に保持される、工程と、ポリヌクレオチドを増幅用試薬に接触させてポリヌクレオチドをゲルカプセル内で増幅する工程とを含み得る。本発明の他の局面では、かかる方法において用いられる、組成物または装置が提供され得る。

【0009】

本発明の方法、組成物または装置は、細胞のゲノム配列をシングルセルレベルで決定するためのものとしてさらに規定され得る。また、本発明の方法、組成物または装置は、ゲノムライブラリーの作製のためのものとしてさらに規定され得る。

【0010】

本発明の実施形態の例として、以下のものが挙げられる。
（項目Ａ１） ２つ以上の細胞または細胞様構造物を含む試料を用い、該細胞または細胞様構造物を１細胞または構造物単位ずつ液滴中に封入する工程と、
該液滴をゲル化してゲルカプセルを生成する工程と、
該ゲルカプセルを１種以上の溶解用試薬に浸漬して前記細胞または細胞様構造物を溶解する工程であって、該細胞中のポリヌクレオチドが該ゲルカプセル内に溶出し該ポリヌクレオチドに結合する物質が除去された状態で前記ゲルカプセル内に保持される、工程と、
該ポリヌクレオチドを増幅用試薬に接触させて該ポリヌクレオチドをゲルカプセル内で増幅する工程と
を含む、細胞または細胞様構造物中のポリヌクレオチドを増幅する方法。
（項目Ａ２） 前記項目に記載の方法によって増幅したポリヌクレオチドから、前記細胞のゲノムＤＮＡの全配列を決定する工程を含む、細胞のゲノム配列をシングルセルレベルで決定する方法。
（項目Ａ３） 前記項目のいずれかに記載の方法によって前記ポリヌクレオチドが増幅されたゲルカプセルを１個毎に選別し、分別収集する工程を含む、ゲノムライブラリーの作製方法。
（項目Ａ４） 前記細胞が、微生物細胞を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ５） 前記ゲルカプセルを前記溶解用試薬に浸漬した後、前記ゲルカプセルから前記溶解用試薬及び夾雑物質が除去されることを特徴とする、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ６） 前記細胞または細胞様構造物の懸濁液をマイクロ流路中に流動させ、オイルで前記懸濁液をせん断することにより前記細胞または細胞様構造物を封入した前記液滴が作製されることを特徴とする、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ７） 前記液滴の直径が１〜２５０μｍであることを特徴とする、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ８） 前記ゲルカプセルの直径が１〜２５０μｍであることを特徴とする、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ９） 前記ゲルカプセルがアガロース、アクリルアミド、光硬化性樹脂、ＰＥＧ、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、マトリゲル、又はコラーゲンから形成されることを特徴とする、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ１０） 前記溶解用試薬がリゾチーム、ラビアーゼ、ヤタラーゼ、アクロモペプチダーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、ザイモリアーゼ、キチナーゼ、リソスタフィン、ムタノライシン、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、フェノール、クロロホルム、グアニジン塩酸塩、尿素、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、TCEP-HCl、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、Tween 20、Tween 80、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、CHAPS、CHAPSO、ドデシル-β-D-マルトシド、Nonidet P-40、およびZwittergent 3-12からなる群から少なくとも１種選択されることを特徴とする、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ１１） 前記ゲルカプセルがヒドロゲルカプセルであることを特徴とする、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ１２） 前記増幅する工程が、恒温鎖置換増幅反応によって行われることを特徴とする、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ｂ１） 細胞または細胞様構造物を１細胞または構造物単位ずつ液滴中に封入する液滴作製部と、
前記液滴をゲル化してゲルカプセルを生成するゲルカプセル生成部と、
前記ゲルカプセルを溶解用試薬に浸漬する溶解用試薬浸漬部と、
前記ゲルカプセルから夾雑物質を除去する除去部と、
前記ゲルカプセルを増幅用試薬に浸漬する増幅用試薬浸漬部と、
を備えることを特徴とする、細胞中のポリヌクレオチドを増幅するための装置。
（項目Ｂ１−１） 前記項目のいずれか１つまたは複数に記載の特徴を備える、前記項目に記載の装置。
（項目Ｂ２） 増幅用試薬浸漬部において増幅されたポリヌクレオチド中の核酸配列の配列決定を行う配列決定部をさらに備え、細胞のゲノム配列をシングルセルレベルで決定するためのものであることをさらに特徴とする、前記項目のいずれかに記載の装置。
（項目Ｂ３） 前記ゲルカプセルを選別し、前記ゲルカプセルを収容容器に収容する選別部をさらに備え、ゲノムライブラリーの作製のためのものであることをさらに特徴とする、前記項目のいずれかに記載の装置。
（項目Ｂ４） 前記液滴作製部が、マイクロ流路を備える、前記項目のいずれかに記載の装置。
（項目Ｃ１） ゲルカプセルまたはその材料を含む、細胞中の核酸をシングルセルレベルで増幅するための組成物。
（項目Ｃ２） ゲルカプセルまたはその材料を含む、ゲノムライブラリーを作製するための組成物。
（項目Ｃ３） ゲルカプセルまたはその材料と、シングルセル状態の細胞とを含む、細胞中の核酸をシングルセルレベルで増幅するための組成物。
（項目Ｃ４） ゲルカプセルまたはその材料、シングルセル状態の細胞とを含む、ゲノムライブラリーを作製するための組成物。
（項目Ｃ５） ゲルカプセルまたはその材料、シングルセル状態の細胞とを含む、シングルセルレベルで、細胞中の核酸を配列決定するための組成物。
（項目Ｄ１） 細胞中の核酸をシングルセルレベルで増幅するための、溶解用試薬を含む組成物であって、該溶解用試薬が、リゾチーム、ラビアーゼ、ヤタラーゼ、アクロモペプチダーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、ザイモリアーゼ、キチナーゼ、リソスタフィン、ムタノライシン、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、フェノール、クロロホルム、グアニジン塩酸塩、尿素、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、TCEP-HCl、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、Tween 20、Tween 80、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、CHAPS、CHAPSO、ドデシル-β-D-マルトシド、Nonidet P-40、およびZwittergent 3-12からなる群から選択される少なくとも１つを含む、組成物。
（項目Ｄ１−１） 前記項目のいずれか１つまたは複数に記載の特徴を備える、前記項目のいずれかに記載の組成物。
（項目Ｅ１） 細胞中の核酸をシングルセルレベルで増幅するための、ゲルカプセルの材料と、必要に応じて、１以上の試薬を含む、キット。
（項目Ｅ２） 前記１以上の試薬が、溶解用試薬を含む、前記に記載のキット。
（項目Ｅ３） 前記溶解用試薬が、リゾチーム、ラビアーゼ、ヤタラーゼ、アクロモペプチダーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、ザイモリアーゼ、キチナーゼ、リソスタフィン、ムタノライシン、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、フェノール、クロロホルム、グアニジン塩酸塩、尿素、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、TCEP-HCl、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、Tween 20、Tween 80、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、CHAPS、CHAPSO、ドデシル-β-D-マルトシド、Nonidet P-40、およびZwittergent 3-12からなる群から選択される少なくとも１つを含む、前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目Ｅ３−１） 前記項目のいずれか１つまたは複数に記載の特徴を備える、前記項目のいずれかに記載のキット。

【0011】

本発明において、上記の１つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。

【発明の効果】

【0012】

本発明によれば、細胞集団において個々のシングルセルの解析を簡便に行うことができる。とりわけ、本発明によれば、細胞集団におけるシングルセルレベルでのゲノム増幅およびその配列決定を簡便に行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】本発明の実施例１のマイクロ流路を示す図である。

【図2】同上、チューブに収容した微小液滴を示す図である。

【図3】同上、チューブに収容したゲルカプセルを示す図である。

【図4】同上、１細胞増幅ゲノムライブラリーの作製工程を示す図である。

【図5】同上、ＳＹＢＲグリーンにより染色したゲルカプセル内のゲノムＤＮＡを示す図である。

【図6】同上、ゲノムライブラリーの作製装置を示す略図である。

【図7】同上、１Ｔｂ塩基配列データから得られる微生物ゲノム数の比較図である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

以下、本発明を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。

【0015】

（定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。

【0016】

本明細書において、「細胞」とは、遺伝情報を有する分子を内包する粒子であって、（単独で可能かどうかにかかわらず）複製されることが可能である任意の粒子を指す。本明細書における「細胞」としては、単細胞生物の細胞、細菌、多細胞生物由来の細胞、真菌などが包含される。

【0017】

本明細書において、「細胞様構造物」とは、遺伝情報を有する分子を内包する任意の粒子を指す。本明細書における「細胞様構造物」としては、細胞内小器官、例えば、ミトコンドリア、細胞核、および葉緑体、ならびにウイルスなどが包含される。

【0018】

本明細書において、「ゲル」とは、コロイド溶液(ゾル)において、高分子物質またはコロイド粒子がその相互作用により全体として網目構造をつくり，溶媒あるいは分散媒である液相を多量に含んだまま流動性を失った状態のことをいう。本明細書において、「ゲル化」とは、溶液を「ゲル」の状態に変化させることをいう。

【0019】

本明細書において、「ゲルカプセル」とは、その中に細胞または細胞様構造物を保持することが可能なゲル状の微粒子状構造体を指す。

【0020】

本明細書において、「遺伝子分析」とは生体サンプル中の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）の状態を調べることをいう。１つの実施形態では、遺伝子分析は、核酸増幅反応を利用するものを挙げることができる。これらを含め、遺伝子分析の例としては、配列決定、遺伝子型判定・多型分析（ＳＮＰ分析、コピー数多型、制限酵素断片長多型、リピート数多型）、発現解析、蛍光消光プローブ（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ Ｐｒｏｂｅ：Ｑ−Ｐｒｏｂｅ）、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ法、融解曲線分析、リアルタイムＰＣＲ、定量ＲＴ−ＰＣＲ、デジタルＰＣＲなどを挙げることができる。

【0021】

本明細書において、「シングルセルレベル」とは、１つの細胞または細胞様構造物に含まれる遺伝情報に対して、他の細胞または細胞様構造物に含まれる遺伝情報と区別した状態で処理を行うことをいう。例えば、「シングルセルレベル」でのポリヌクレオチドを増幅する場合、ある細胞中のポリヌクレオチドと、他の細胞中のポリヌクレオチドが区別可能な状態でそれぞれの増幅が行われる。

【0022】

本明細書において、「シングルセル解析」とは、１つの細胞または細胞様構造物に含まれる遺伝情報を、他の細胞または細胞様構造物に含まれる遺伝情報と区別した状態で解析することを指す。

【0023】

（好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。これらの実施形態について、当業者は適宜、任意の実施形態を組み合わせ得る。

【0024】

（細胞中のポリヌクレオチド増幅方法）
一つの局面において、本発明は、細胞中のポリヌクレオチドを増幅する方法を提供する。この増幅方法は、２つ以上の細胞または細胞様構造物（例えば、ウイルス、小器官（Mt,Nuc）等を含む）を含む試料を用い、該細胞または細胞様構造物を１細胞または構造物単位ずつ液滴中に封入する工程と、該液滴をゲル化してゲルカプセルを生成する工程と、該ゲルカプセルを１種以上の溶解用試薬に浸漬して前記細胞または細胞様構造物を溶解する工程であって、該細胞中のポリヌクレオチドが該ゲルカプセル内に溶出し該ポリヌクレオチドに結合する物質が除去された状態で前記ゲルカプセル内に保持される、工程と、該ポリヌクレオチドを増幅用試薬に接触させて該ポリヌクレオチドをゲルカプセル内で増幅する工程とを含む。本発明の増幅方法は、いわゆるシングルセルレベルでのゲノムまたはそれに類似する遺伝子集合物を個別に増幅し得るものである。本発明の増幅方法は、個別のゲノム増幅を、非常に簡便な手法で実現するものであり、そのため、100個単位、1000個単位、1万個単位、10万個単位あるいはそれ以上の単位の細胞について一時期にゲノム情報を取得することができ、それゆえライブラリーとすることもできるものである。

【0025】

本発明の方法における液滴中への封入工程は、下記（液滴生成）の項または他の項に詳述されている任意の実施形態を採用することができる。

【0026】

１つの実施形態では、本発明の増幅方法において対象としうる細胞または細胞様構造物は、２つ以上の任意の数字であり、例えば、１０個以上、５０個以上、１００個以上、５００個以上、１０００個以上、５０００個以上、１万個以上、５万個以上、１０万個以上、５０万個以上、１００万個以上、５００万個以上、１０００万個以上であり得る。本発明の増幅方法は、従来のシングルセル反応系、例えば、0.2mL、1.5mLマイクロチューブ反応系を用いるよりも多数の細胞を対象とし得る。

【0027】

本発明の増幅方法において対象とし得る細胞または細胞様構造物は、（細胞および細胞様構造物）の項に説明されている任意のものを採用することができる。１つの好ましい実施形態では、細胞が対象とされ得る。別の実施形態では、細胞様構造物が対象とされ、その中でも、ウイルス、あるいはミトコンドリア、核等の細胞小器官等を対象とすることができる。

【0028】

本発明の増幅方法において、提供される細胞または細胞様構造物を含む試料は、どのような形で提供されてもよい。試料に含まれる媒体は、（細胞および細胞様構造物）の項から選択した任意の細胞または細胞様構造物に対して適切な媒体（バッファー、塩、栄養素や他の成分等を含む）を選択することができる。このような成分としては、液滴生成に適した成分であればどのような成分を使用してもよい。ゲル化する際にも適切な成分であることが好ましい。そのような成分としては、ＰＢＳ、Tris-HCl、TE、HEPESなどの緩衝液のほか、滅菌水、海水、人工海水、各種液体培地等を挙げることができるがこれらに限定されない。液滴を生成するためには、界面活性剤を含まない水またはバッファーなどの媒体が好ましい場合がある。

【0029】

本明細書において、細胞または細胞様構造物を１細胞または構造物単位ずつの液滴中への封入は、（液滴作製）の項に記載される任意の実施形態を採用することができる。代表的には、マイクロ流路を用い、細胞または細胞様構造物の懸濁液をマイクロ流路中に流動させ、懸濁液をせん断することにより、１つずつの細胞または細胞様構造物を封入した液滴を作製することができ、（液滴作製）での説明の他、実施例において例示される代表例を参考に、当業者は、適宜成分やパラメータを調製して実施することができる。

【0030】

本発明の増幅方法において、液滴をゲル化してゲルカプセルを生成する工程は、下記（ゲル化）の項に記載される任意の実施形態を採用することができる。

【0031】

１つの実施形態では、ゲル化は、液滴あるいは液滴の材料（例えば、細胞または細胞様構造物を含む試料）にゲルカプセルの材料が含まれるように構成した作製した液滴を冷却することによって行うことができるし、あるいは、光等の刺激を与えることでゲル化させることもできる。

【0032】

ゲルカプセルの材料としては、下記（ゲル化）の項に記載される任意の材料を用いることができる。

【0033】

本発明において、細胞または細胞様構造物を溶解する工程は、ゲルカプセルを１種以上の溶解用試薬に浸漬して実現することができ、下記（溶解）の項目に記載される任意の実施形態を採用することができる。

【0034】

ここで、細胞または細胞様構造物を溶解する工程では、細胞中のポリヌクレオチドが該ゲルカプセル内に溶出しそのポリヌクレオチドに結合する物質が除去された状態でこのゲルカプセル内に保持されるように処理されることが重要である。

【0035】

このように、ポリヌクレオチドに結合する物質が除去された状態を維持するためには、多種類の溶解剤を段階的あるいは同時に加えることで、細胞または細胞様構造物の細胞壁・細胞膜構造を確実に破壊し、細胞内に含まれるタンパク質、ポリヌクレオチドに結合する物質までを変性させることが必要である。溶解は細胞外層の破壊から段階的に試薬を加えて達成される。さらに、溶解操作後にゲルカプセル内に残存する溶解物および前記溶解試薬は、後段のポリヌクレオチド増幅を阻害するため、適切な洗浄液を用いてゲルカプセル内を通液させ、前記阻害物質をゲルカプセル外に放出することが望ましい場合がある。これらの操作をゲルカプセル内で完遂するために、ポリヌクレオチドをゲルカプセル内に保持しながら、各種薬液と細胞溶解物の浸透・放出を達成するヒドロゲル構造を取ることが望ましい場合がある。ゲルカプセルを用いることにより、遺伝物質を保持したまま、残留試薬を希薄化することができる。このステップは繰り返すことも可能である。阻害が出ないレベルにまで試薬を希薄化することで、下流の操作、例えば、増幅反応をスムーズに行うことができる。

【0036】

本発明において、ポリヌクレオチドをゲルカプセル内で増幅する工程は、ポリヌクレオチドを増幅用試薬に接触させることにより実現することができ、下記（増幅）に規定される任意の実施形態を採用することができる。

【0037】

（液滴生成）
本発明は、２つ以上の細胞または細胞様構造物を含む試料を用い、細胞または細胞様構造物を１細胞または構造物単位ずつ液滴中に封入することを包含し得る。また、本発明において、装置は、細胞または細胞様構造物を１細胞または構造物単位ずつ液滴中に封入する液滴作製部を備え得る。

【0038】

液滴作製は、例えば、マイクロ流路を用いて行うことができる。液滴作製部は、マイクロ流路を備え得る。細胞または細胞様構造物の懸濁液をマイクロ流路中に流動させ、懸濁液をせん断することにより、１つずつの細胞または細胞様構造物を封入した液滴を作製し得る。せん断は、一定間隔で行い得る。懸濁液のせん断は、オイルを用いて行うことができる。オイルとしては、例えば、鉱物油（例えば、ライトミネラルオイル）、植物油、シリコーンオイル、フッ素化オイル、を用い得る。懸濁液の濃度、流路中の流速、せん断の間隔を調整し、当業者は、液滴あたり１つ以上の細胞または細胞様構造物が封入されないように液滴作製を行うことが可能である。

【0039】

液滴の直径は、約１〜２５０μｍ、より好ましくは約１０〜２００μｍであってよく、例えば、液滴の直径は、約１μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約１５μｍ、約２０μｍ、約２５μｍ、約３０μｍ、約４０μｍ、約５０μｍ、約８０μｍ、約１００μｍ、約１５０μｍ、約２００μｍ、または約２５０μｍであってよい。

【0040】

（ゲル化）
本発明は、液滴をゲル化してゲルカプセルを生成する工程を包含し得る。また、本発明において、装置は、液滴をゲル化してゲルカプセルを生成するゲルカプセル生成部を備え得る。液滴のゲル化は、液滴にゲルカプセルの材料が含まれるように構成し、作製した液滴を冷却することによって行うことができる。あるいは、液滴に対して光等の刺激を与えることによってゲル化を行うこともできる。液滴にゲルカプセルの材料が含まれるようにするには、例えば、細胞または細胞様構造物の懸濁液にゲルカプセルの材料を含めておくことによって行うことができる。

【0041】

ゲルカプセルの直径は、約１〜２５０μｍ、より好ましくは約１０〜２００μｍであってよく、例えば、約１μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約１５μｍ、約２０μｍ、約２５μｍ、約３０μｍ、約４０μｍ、約５０μｍ、約８０μｍ、約１００μｍ、約１５０μｍ、約２００μｍ、または約２５０μｍであってよい。ゲルカプセルの直径は、作製する液滴と同じであってもよいが、ゲル化に際して直径が変化してもよい。

【0042】

ゲルカプセルの材料は、アガロース、アクリルアミド、光硬化性樹脂（例えば、ＰＥＧ-ＤＡ）、ＰＥＧ、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、マトリゲル、コラーゲンなどを含み得る。

【0043】

ゲルカプセルは、ヒドロゲルカプセルであってよい。本明細書において、「ヒドロゲル」とは、高分子物質またはコロイド粒子の網目構造によって保持されている溶媒あるいは分散媒が水であるものを指す。

【0044】

大量の細胞からまとめてＤＮＡを取り出す際などは、フェノール・クロロホルム抽出とエタノール沈殿によってＤＮＡを精製し得る。しかしながら、単一細胞からの遺伝物質の取得・分析を企図する場合、１細胞毎の遺伝物質の量は非常に微量であり、ロスなく個別に核酸のみの状態に変換する必要がある。単一細胞に対しては、一般的なバルクスケールでの手順で核酸精製を試みても、全く核酸が取り出せないか、あるいは、夾雑物由来の核酸しか抽出できない結果になる。１細胞実験ではコンタミや標的遺伝物質のロスは大きな問題となるが、単一の細胞または細胞様構造物を封入したゲルカプセルを用いることによって、精製した遺伝物質（例えば、ＤＮＡ）をゲルカプセル中に保持することができ、また、外部からの分子の夾雑の可能性を排除することができる。また、操作面でも非常に簡単な操作で、大量の１細胞を並列処理することができる。ゲル化した液滴を含む試験管を遠心し、上清を除去し、洗浄液に置換するというステップを行うことができる。あるいは、ゲル化した液滴をフィルターでろ過し、上清を除去したのち、洗浄液を通液させ、最後にゲルカプセルを回収するというステップでも行うことができる。ゲルカプセルを用いることにより、遺伝物質を保持したまま、残留試薬を希薄化することができる。このステップは繰り返すことも可能である。阻害が出ないレベルにまで試薬を希薄化することで、下流の操作、例えば、増幅反応をスムーズに行うことができる。

【0045】

本発明の１つの局面において、ゲルカプセルまたはその材料を含む組成物が提供され得る。上述または後述の点から、かかる組成物は、細胞中の核酸をシングルセルレベルで増幅するために有用であり得る。また、かかる組成物は、ゲノムライブラリーを作製するために有用であり得る。さらなる実施形態において、ゲルカプセルまたはその材料と、シングルセル状態の細胞とを含む組成物が提供され得る。上述または後述の点から、かかる組成物は、細胞中の核酸をシングルセルレベルで増幅するために有用であり得る。また、かかる組成物は、ゲノムライブラリーを作製するために有用であり得る。かかる組成物は、シングルセルレベルで細胞中の核酸を配列決定するために有用であり得る。

【0046】

（溶解）
本発明は、ゲルカプセルを１種以上の溶解用試薬に浸漬して前記細胞または細胞様構造物を溶解することを包含し得る。また、本発明において、装置は、ゲルカプセルを溶解用試薬に浸漬する溶解用試薬浸漬部を備え得る。溶解の際、細胞中のポリヌクレオチドがゲルカプセル内に溶出しポリヌクレオチドに結合する物質が除去された状態でゲルカプセル内に保持され得る。溶解用試薬には、例えば、酵素、界面活性剤、その他変性剤、還元剤およびｐＨ調節剤があり、それらの組み合わせもまた用いることができる。本発明の１つの局面では、細胞中の核酸をシングルセルレベルで増幅するための、溶解用試薬を含む組成物が提供され得る。

【0047】

溶解用試薬は、リゾチーム、ラビアーゼ、ヤタラーゼ、アクロモペプチダーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、ザイモリアーゼ、キチナーゼ、リソスタフィン、ムタノライシン、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、フェノール、クロロホルム、グアニジン塩酸塩、尿素、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、TCEP-HCl、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、Tween 20、Tween 80、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、CHAPS、CHAPSO、ドデシル-β-D-マルトシド、Nonidet P-40、Zwittergent 3-12からなる群から選択される少なくとも１つを含み得る。溶解用試薬は、リゾチーム、アクロモペプチダーゼ、プロテアーゼ、ドデシル硫酸ナトリウム及び水酸化カリウムからなる群から少なくとも１種選択される場合がある。

【0048】

細胞または細胞様構造物における一部の配列の有無を検出することのみを目的とする場合には、積極的な細胞または細胞様構造物の溶解を行う必要は必ずしもなく、物理的な刺激または熱的な刺激による、細胞または細胞様構造物からの核酸の漏出に基づいて検出を行うことも可能である。しかしながら、ゲノム全域などの大量の情報を単一細胞から得るためには、積極的に細胞または細胞様構造物を破壊し、その中の遺伝物質を完全な状態で細胞から単離することが好ましい。また、ゲルカプセルを用いている場合、熱的・機械的な刺激は、ゲルカプセルの崩壊につながるおそれもあり、溶解試薬を用いることが好ましい場合があり得る。

【0049】

多様な微生物について、細胞ごとに核酸の増幅または分析を行う場合、溶解試薬または溶解試薬の組合せとして、ある程度強力なものを用いることが望ましい。例えば、グラム陽性菌は厚いペプチドグリカン層を有する細胞壁を有するため、緩和なもののみでは細胞が十分に溶解できない可能性がある。

【0050】

強力な溶解試薬は、ＤＮＡ増幅等の反応を阻害する可能性があり、下流の反応の前に十分に除去されることが好ましい。ゲルカプセルを用いている場合には、ゲルカプセルによって解析または増幅の対象となる遺伝物質が保持されるため、遺伝物質が少量である単一細胞解析においても溶解試薬の除去を行うことができ、そのため、強力な溶解試薬または溶解試薬の組合せを用いることが可能である。そして、強力な溶解試薬または溶解試薬の組合せを用いることは、多様な細胞（細胞壁を有するものやその他の種類の微生物を含む）の種類を問わず、網羅的な核酸の増幅またはゲノム解析を可能にし得る。方法は、ゲルカプセルから溶解用試薬および／または夾雑物質を除去する工程を含み得る。また、溶解用試薬浸漬部は、ゲルカプセルから溶解用試薬および／または夾雑物質を除去する手段を備える。

【0051】

標的分子が細胞表面マーカーや核酸の一部であり、その存在自体を検知することが目的である場合には、溶解操作が部分的、あるいは溶解操作がなされなくても、目的を達成できる可能性がある。他方で、ゲノムＤＮＡの全長の増幅を企図する場合、ゲノムＤＮＡは、細胞中に１分子しか存在しないことが通常であるため、完全に細胞または細胞様構造物の溶解が進み、またＤＮＡから結合タンパク質類を十分に除去する必要がある。これにより、腸内微生物のような数百種以上の微生物からなる検体を対象とした際にも、そのすべてを均質に溶解し、その全てから全ゲノム増幅を行うことが可能となる。また、それにより、ライブラリ調製を行い、最終的に全ゲノム配列情報を得ることが可能となる。

【0052】

（増幅）
本発明は、ポリヌクレオチドを増幅用試薬に接触させてポリヌクレオチドをゲルカプセル内で増幅することを包含し得る。また、本発明において、装置は、ゲルカプセルを増幅用試薬に浸漬する増幅用試薬浸漬部を備え得る。増幅用試薬浸漬部は、増幅用試薬への浸漬後、必要に応じて、ゲルカプセルの温度を調節するための手段を備え得る。

【0053】

加熱処理（８０度以上）を伴う反応はゲル（例えば、アガロースゲル）の再溶解を招く可能性があるため、個別粒子化していた形状を崩壊させ、単一細胞隔離を無効化してしまう場合がある。この場合、約６０度以下の酵素反応がゲル液滴形状を保つために望ましい。恒温鎖置換増幅反応（multiple displacement amplification）は、この温度の範囲内で実行可能であり、また、ゲノムDNA全域の増幅が可能である点で好ましい。用いる酵素としては、例えば、phi29ポリメラーゼ、Bstポリメラーゼ、Aacポリメラーゼ、リコンビナーゼポリメラーゼが挙げられる。

【0054】

特定の細胞（例えば、特定の微生物）を検出することを目的としたＰＣＲを実施する場合、その微生物に応じた特定プライマーを使用することが一般的である。しかしながら、ゲノム全体の増幅を行う場合には、ランダムプライマーを用いることが好ましい。

【0055】

ｍＲＮＡはゲノムＤＮＡを元に細胞内に数千から数万種存在し、個々の分子量も多い。このためＲＮＡを対象とした発現解析では、遺伝子の種類や発現量を絶対（相対）的に求めることが目的となるため、遺伝子の一部（数十塩基）だけを読み取って、どの遺伝子がどれだけ発現しているかを定量することが可能である。ゲノムＤＮＡを対象とする場合、原則的にゲノムＤＮＡは１細胞に１分子しか存在しないため、その１分子しか無い配列情報を漏らさず増やすことが、その数百万塩基の全てを解読するためには必要となり得る。ゲルカプセル中での処理は、そのような増幅にとって有利である。また、配列決定のための核酸を、１細胞から一部ずつの断片的な情報ではなく、全体として得られることはシングルセル解析において有利である。

【0056】

（細胞および細胞様構造物）
本発明において対象とする細胞または細胞様構造物は、特段限定されるものではないが、例えば、微生物（例えば、細菌、真菌、単細胞動物）、多細胞生物の細胞（例えば、体細胞、生殖細胞、培養細胞、腫瘍細胞、動物細胞、植物細胞）、細胞内器官（ミトコンドリア、核、葉緑体）、ウイルスが挙げられる。

【0057】

ゲノム配列既知の生物の細胞については、その中でどの遺伝子が発現しているかＲＮＡ を計測するという意図が発生し得るが、ゲノム配列および／または遺伝子の情報が未知の生物の解析の場合には、ＲＮＡ解析の前に、ゲノム自体の情報を得る必要がある。その場合には、ゲルカプセルを用いる本発明の方法によるシングルセルレベルでのゲノム配列の増幅は有利である。

【0058】

本発明においては、２つ以上の細胞または細胞様構造物を含む試料を用いることができる。２つ以上の細胞は、複数の生物に由来するものであってもよい。試料として、例えば、微生物試料、組織試料、共生微生物および宿主生物の混合試料、動物・ヒト検体より取り出した微生物および細胞を含む試料が挙げられる。微生物試料としては、細菌叢試料の他、２種以下の細胞または細胞様構造物を含有する試料、真菌等の細菌以外の細胞または細胞用構造物が含有される試料が挙げられる。ヒト検体より取り出した微生物および細胞を含む試料としては、糞便、唾液、喀痰、手術洗浄液、血液、皮膚・身体粘膜の拭い液やスワブなどが挙げられ、直接的に利用することも可能であるが、細胞や微生物を分離する操作を行ってから使用してもよい。

【0059】

本発明において、対象とし得る微生物は、限定されるものではないが、真正細菌、大腸菌、枯草菌、藍色細菌、球菌、桿菌、ラセン菌、グラム陰性菌、グラム陽性菌、古細菌、真菌などが挙げられる。本発明で対象とし得る細菌は、例えば、Negibacteria、Eobacteria、Deinococci、Deinococci、Deinococcales、Thermales、Chloroflexi、Anaerolineae、Anaerolineales、Caldilineae、Chloroflexales、Herpetosiphonales、Thermomicrobia、Thermomicrobiales、Sphaerobacterales、Ktedonobacteria、Ktedonobacterales、Thermogemmatisporales、Glycobacteria、Cyanobacteria、Gloeobacterophyceae、Gloeobacterales、Nostocophyceae、Synechococcophycidae、Synechococcales、Nostocophycidae、Chroococcales、Oscillatoriales、Nostocales、Pseudanabaenales、Spirochaetes、Spirochaetes、Spirochaetales、Fibrobacteres、Fibrobacteria、Gemmatimonadetes、Gemmatimonadetes、Gemmatimonadales、Chlorobi、Chlorobea、Chlorobiales、Ignavibacteria、Ignavibacteriales、Bacteroidetes、Bacteroidia、Bacteroidales、Flavobacteriia、Flavobacteriales、Sphingobacteriia、Sphingobacteriales、Cytophagia、Cytophagales、Planctomycetes、Planctomycea、Planctomycetales、Phycisphaerae、Phycisphaerales、Chlamydiae、Chlamydiae、Chlamydiales、Verrucomicrobia、Verrucomicrobiae、Verrucomicrobiales、Opitutae、Opitutales、Puniceicoccales、Spartobacteria、Chthoniobacterales、Lentisphaerae、Lentisphaeria、Lentisphaerales、Victivallales、Proteobacteria、Alphaproteobacteria、Rhodospirillales、Rickettsiales、Rhodobacterales、Sphingomonadales、Caulobacterales、Rhizobiales、Parvularculales、Kordiimonadales、Sneathiellales、Kiloniellales、Betaproteobacteria、Burkholderiales、Hydrogenophilales、Methylophilales、Neisseriales、Nitrosomonadales、Rhodocyclales、Procabacteriales、Gammaproteobacteria、Chromatiales、Acidithiobacillales、Xanthomonadales、Cardiobacteriales、Thiotrichales、Legionellales、Methylococcales、Oceanospirillales、Pseudomonadales、Alteromonadales、Vibrionales、Aeromonadales、Enterobacteriales、Pasteurellales、Deltaproteobacteria、Desulfurellales、Desulfovibrionales、Desulfobacterales、Desulfarculales、Desulfuromonadales、Syntrophobacterales、Bdellovibrionales、Myxococcales、Epsilonproteobacteria、Campylobacterales、Nautiliales、Acidobacteria、Acidobacteria、Acidobacteriales、Holophagae、Holophagales、Acanthopleuribacterales、Aquificae、Aquificae、Aquificales、Deferribacteres、Deferribacteres、Geovibriales、Thermodesulfobacteria、Thermodesulfobacteria、Thermodesulfobacteriales、Nitrospirae、Nitrospira、Nitrospirales、Fusobacteria、Fusobacteriia、Fusobacteriales、Synergistetes、Synergistia、Synergistales、Caldiserica、Caldisericia、Caldisericales、Elusimicrobia、Elusimicrobia、Elusimicrobiales、Armatimonadetes、Armatimonadia、Armatimonadales、Chthonomonadetes、Chthonomonadales、Fimbriimonadia、Fimbriimonadales、Posibacteria、Thermotogae、Thermotogae、Thermotagales、Firmicutes、Bacilli、Bacillales、Lactobacillales、Clostridia、Clostridiales、Halanaerobiales、Thermoanaerobacterales、Natranaerobiales、Negativicutes、Selenomonadales、Erysipelotrichia、Erysipelotrichales、Thermolithobacteria、Thermolithobacterales、Tenericutes、Mollicutes、Mycoplasmatales、Entomoplasmatales、Acholeplasmatales、Anaeroplasmatales、Actinobacteria、Actinobacteria、Actinomycetales、Actinopolysporales、Bifidobacteriales、Catenulisporales、Corynebacteriales、Frankiales、Glycomycetales、Jiangellales、Kineosporiales、Micrococcales、Micromonosporales、Propionibacteriales、Pseudonocardiales、Streptomycetales、Streptosporangiales、Dictyoglomi、Dictyoglomia、Dictyoglomales、Chrysiogenetes、Chrysiogenetes、Chrysiogenales、Haloplasmatalesなどの細菌が挙げられる。また、それらのうちの複数が混在する試料において、細胞毎の網羅的な解析を行うことができる。

【0060】

（組成物・キット）
本発明の１つの局面は、本発明の方法において用いられ得る組成物またはキットを提供する。本発明において、細胞中の核酸をシングルセルレベルで増幅するための組成物が提供され得る。組成物は、ゲルカプセルまたはその材料を含み得る。ゲルカプセルを用いることは、本明細書の他の箇所に記載されるとおり、細胞中の核酸をシングルセルレベルで増幅することについて有利であり得る。本発明において、ゲノムライブラリーを作製するための組成物が提供され得る。ゲルカプセルを用いることは、本明細書の他の箇所に記載されるとおり、ゲノムライブラリーを作製するために有利であり得る。

【0061】

本発明において、ゲルカプセルまたはその材料と、シングルセル状態の細胞とを含む、細胞中の核酸をシングルセルレベルで増幅するための組成物が提供され得る。組成物は、本明細書の他の箇所に記載される方法の工程に供され、シングルセルレベルでの核酸増幅に用いられ得る。本発明において、ゲルカプセルまたはその材料、シングルセル状態の細胞とを含む、ゲノムライブラリーを作製するための組成物が提供され得る。組成物は、明細書の他の箇所に記載される方法の工程に供され、ゲノムライブラリーを作製に用いられ得る。本発明において、ゲルカプセルまたはその材料、シングルセル状態の細胞とを含む、シングルセルレベルで、細胞中の核酸を配列決定するための組成物が提供され得る。組成物は、明細書の他の箇所に記載される方法の工程に供され、シングルセルレベルでの細胞中の核酸の配列決定に用いられ得る。

【0062】

本発明の１つの局面において、細胞中の核酸をシングルセルレベルで増幅するための、溶解用試薬を含む組成物が提供される。溶解用試薬は、リゾチーム、ラビアーゼ、ヤタラーゼ、アクロモペプチダーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、ザイモリアーゼ、キチナーゼ、リソスタフィン、ムタノライシン、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、フェノール、クロロホルム、グアニジン塩酸塩、尿素、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、TCEP-HCl、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、Tween 20、Tween 80、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、CHAPS、CHAPSO、ドデシル-β-D-マルトシド、Nonidet P-40、Zwittergent 3-12からなる群から選択される少なくとも１つを含み得る。

【0063】

細胞中の核酸をシングルセルレベルで増幅するためのキットが提供され得る。キットは、例えば、ゲルカプセルの材料と、必要に応じて、１以上の試薬を含み得る。前記１以上の試薬としては、溶解用試薬が挙げられる。

【0064】

（ゲノムライブラリーの作製方法及びゲノムライブラリーの作製装置）
本発明は、多様な微生物からポリヌクレオチドをゲルカプセル内に精製し、ゲルカプセル内で増幅したポリヌクレオチドをゲノムライブラリー化する方法を提供し得る。本発明の１つの局面において、簡易な操作で細胞の溶解とゲノム増幅を行うゲノムライブラリーの作製方法及びゲノムライブラリーの作製装置が提供され得る。

【0065】

微生物１細胞からゲノム解析を行う際には、１細胞毎にゲノム増幅反応を行うために細胞を一つずつ反応容器に移し替える操作が必要である。従来の細胞分取技術のフローサイトメトリーでは、小さな非生物粒子と微生物を分けて反応に供することが難しく、容器中の反応液量が微生物体積の数十億倍以上のマイクロリットルで過度に大きい。このため、反応時にコンタミネーションや増幅エラーを頻繁に生じ、純粋な１細胞からの増幅核酸サンプルが得られる歩留まりが低かった。

【0066】

また、最大並列処理能力も数百反応が限度であり、環境中の何千種以上の微生物からゲノムＤＮＡを１細胞単位で網羅的に解析することは困難であった。課題解決には、微生物１個に合わせたスケールで大量の反応環境を作りだし、そこで細胞溶解や酵素反応を順次行い、微量なゲノムＤＮＡを精製したのち並列増幅させて、保管と再解析が可能な形状で増幅核酸試料を調達する方法が必要である。

【0067】

ＷＯ２０１７／２１８４８６号公報には、マイクロ流路を使用してゲルビーズを作製し、単一細胞分析をすることが記載されている。しかしながら、ＷＯ２０１７／２１８４８６号公報には微生物試料へ対応した詳細な条件等が規定されていない。

【0068】

特表２０１７−５３２０２４号公報には、個々の細胞から核酸をハイスループットに単離し、溶解、バーコード化などの調製を行う方法と装置が記載されている。しかしながら、特表２０１７−５３２０２４号公報に記載の方法と装置が対象としているのはｍＲＮＡであり、ゲノムＤＮＡではない。また、硬い細胞壁をもつ微生物試料への適用は不可能である。

【0069】

Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｔ ｕｌｔｒａ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｗｉｔｈ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｒｏｐｌｅｔ ｂａｒｃｏｄｉｎｇ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. ２０１７Ｊｕｌ； ３５（７）：６４０−６４６には、マイクロ流路を使用してゲルビーズを作製し、単一微生物細胞のゲノム解析をすることが記載されている。当該文献に記載の方法では、微生物試料を酵素液で消化したのち、ゲノムＤＮＡにバーコード配列を付加するため、ゲル内部でのＤＮＡ増幅は行っていない。ＤＮＡ増幅を行っていないため、再解析が不可能であり、興味のあるサンプルについて詳細な評価を行えない。また、ゲノム解読率は０．１％以下にとどまっている。

【0070】

Ｖｉｒｔｕａｌ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ｆｏｒ ｄｉｇｉｔａｌ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｖｏｌｕｍｅ １３，ｐａｇｅｓ ７５９−７６２（２０１６）には、腸内微生物を分散させた溶媒全体をゲル化させ、ゲル中で微生物を溶解したのちゲノム増幅を行うことが記載されている。また、蛍光色素で標識したゲノム増幅スポットを針で打ち抜き回収し、再度ゲノム増幅を行って全ゲノム解読を行うことが記載されている。しかし、当該文献に記載のゲル本体はサイズが大きいため溶菌とＤＮＡ増幅反応が不十分であり、ゲノム解読率は平均１０％と低い。

【0071】

Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｄｒｏｐｌｅｔ ｍｉｃｒｏ ｆｌｕｉｄｉｃｓには、微生物細胞を溶菌液とともに液滴に閉じ込め、ついで全ゲノム増幅試薬を含む第２の液滴と融合する特殊なマイクロ流路を用いた微生物１細胞のゲノム増幅法が記載されている。当該文献のゲノム増幅法では、ゲルビーズ化しないため、弱い溶菌条件しか適用できず、一部の微生物にしか適用できない。また、ゲル化を行わないため、ライブラリー化のための分別収集が容易でない。

【0072】

本発明のゲノムライブラリーの作製方法は、１以上の微生物を含む試料を用い、該微生物の細胞を１細胞ずつ液滴中に封入する工程と、前記液滴をゲル化してゲルカプセルを生成する工程と、前記ゲルカプセルを１種以上の溶解用試薬に浸漬して前記細胞を溶解し、ポリヌクレオチドを前記ゲルカプセル内に溶出し前記ゲルカプセル内に保持する工程と、前記ゲルカプセルを増幅用試薬に浸漬して前記ポリヌクレオチドをゲルカプセル内で増幅する工程と、前記ポリヌクレオチドが増幅されたゲルカプセルを１個毎に選別し、分別収集する工程と、を有する場合がある。

【0073】

また、本発明のゲノムライブラリーの作製方法は、前記細胞の懸濁液をマイクロ流路中に流動させ、オイルで前記懸濁液をせん断することにより前記細胞を封入した前記液滴を作製する場合がある。また、本発明のゲノムライブラリーの作製方法は、前記液滴の直径が１〜２５０μｍである場合がある。また、本発明のゲノムライブラリーの作製方法は、前記ゲルカプセルの直径が１〜２５０μｍである場合がある。また、本発明のゲノムライブラリーの作製方法は、前記ゲルカプセルがアガロース、アクリルアミド、光硬化性樹脂、ＰＥＧ、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、マトリゲル、又はコラーゲンから形成される場合がある。また、本発明のゲノムライブラリーの作製方法は、前記ゲルカプセルがヒドロゲルカプセルである場合がある。

【0074】

また、本発明のゲノムライブラリーの作製方法は、前記ゲルカプセルを前記溶解用試薬に浸漬した後、前記ゲルカプセルから前記溶解用試薬及び夾雑物質を除去する工程を有する場合がある。

【0075】

また、本発明のゲノムライブラリーの作製方法は、前記溶解用試薬がリゾチーム、ラビアーゼ、ヤタラーゼ、アクロモペプチダーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、ザイモリアーゼ、キチナーゼ、リソスタフィン、ムタノライシン、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、フェノール、クロロホルム、グアニジン塩酸塩、尿素、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、TCEP-HCl、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、Tween 20、Tween 80、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、CHAPS、CHAPSO、ドデシル-β-D-マルトシド、Nonidet P-40、Zwittergent 3-12からなる群から少なくとも１種選択される場合がある。

【0076】

また、本発明のゲノムライブラリーの作製方法は、前記ゲノムライブラリーの作製方法が、未培養微生物由来１細胞ゲノムのライブラリー化と全ゲノム解析のための細胞操作方法である場合がある。

【0077】

また、本発明のゲノムライブラリーの作製装置は、細胞を１細胞ずつ液滴中に封入する液滴作製部と、前記液滴をゲル化してゲルカプセルを生成するゲルカプセル生成部と、前記ゲルカプセルを溶解用試薬に浸漬する溶解用試薬浸漬部と、前記ゲルカプセルから夾雑物質を除去する除去部と、前記ゲルカプセルを増幅用試薬に浸漬する増幅用試薬浸漬部と、前記ゲルカプセルを選別し、前記ゲルカプセルを収容容器に収容する選別部と、を備える場合がある。

【0078】

本発明によれば、簡易な操作で細胞の溶解とゲノム増幅を行うゲノムライブラリーの作製方法及びゲノムライブラリーの作製装置を提供することができる。

【0079】

ゲノムライブラリーの作製方法及びゲノムライブラリーの作製装置の実施形態の例として、以下の実施形態を挙げることができる。
（実施形態１） １以上の微生物を含む試料を用い、該微生物の細胞を１細胞ずつ液滴中に封入する工程と、
前記液滴をゲル化してゲルカプセルを生成する工程と、
前記ゲルカプセルを１種以上の溶解用試薬に浸漬して前記細胞を溶解し、ポリヌクレオチドを前記ゲルカプセル内に溶出し前記ゲルカプセル内に保持する工程と、
前記ゲルカプセルを増幅用試薬に浸漬して前記ポリヌクレオチドをゲルカプセル内で増幅する工程と、
前記ポリヌクレオチドが増幅されたゲルカプセルを１個毎に選別し、分別収集する工程と、
を有することを特徴とするゲノムライブラリーの作製方法。
（実施形態２） 前記ゲルカプセルを前記溶解用試薬に浸漬した後、前記ゲルカプセルから前記溶解用試薬及び夾雑物質を除去する工程を有することを特徴とする実施形態１に記載のゲノムライブラリーの作製方法。
（実施形態３） 前記細胞の懸濁液をマイクロ流路中に流動させ、オイルで前記懸濁液をせん断することにより前記細胞を封入した前記液滴を作製することを特徴とする実施形態１又は２に記載のゲノムライブラリーの作製方法。
（実施形態４） 前記液滴の直径が１〜２５０μｍであることを特徴とする実施形態３に記載のゲノムライブラリーの作製方法。
（実施形態５） 前記ゲルカプセルの直径が１〜２５０μｍであることを特徴とする実施形態１〜４の何れか１つに記載のゲノムライブラリーの作製方法。
（実施形態６） 前記ゲルカプセルがアガロース、アクリルアミド、光硬化性樹脂、ＰＥＧ、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、マトリゲル、又はコラーゲンから形成されることを特徴とする実施形態１〜５の何れか１つに記載のゲノムライブラリーの作製方法。
（実施形態７） 前記溶解用試薬がリゾチーム、ラビアーゼ、ヤタラーゼ、アクロモペプチダーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、ザイモリアーゼ、キチナーゼ、リソスタフィン、ムタノライシン、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、フェノール、クロロホルム、グアニジン塩酸塩、尿素、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、TCEP-HCl、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、Tween 20、Tween 80、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、CHAPS、CHAPSO、ドデシル-β-D-マルトシド、Nonidet P-40、Zwittergent 3-12からなる群から少なくとも１種選択されることを特徴とする実施形態１〜６のいずれか１つに記載のゲノムライブラリーの作製方法。
（実施形態８） 前記ゲルカプセルがヒドロゲルカプセルであることを特徴とする実施形態１〜７の何れか１つに記載のゲノムライブラリーの作製方法。
（実施形態９） 前記ゲノムライブラリーの作製方法が、未培養微生物由来１細胞ゲノムのライブラリー化と全ゲノム解析のための細胞操作方法であることを特徴とする実施形態１〜８の何れか１つに記載のゲノムライブラリーの作製方法。
（実施形態１０） 細胞を１細胞ずつ液滴中に封入する液滴作製部と、
前記液滴をゲル化してゲルカプセルを生成するゲルカプセル生成部と、
前記ゲルカプセルを溶解用試薬に浸漬する溶解用試薬浸漬部と、
前記ゲルカプセルから夾雑物質を除去する除去部と、
前記ゲルカプセルを増幅用試薬に浸漬する増幅用試薬浸漬部と、
前記ゲルカプセルを選別し、前記ゲルカプセルを収容容器に収容する選別部と、を備え
ることを特徴とするゲノムライブラリーの作製装置。

【0080】

（データ・データベース・データ処理）
多数の細胞または細胞様構造物の集合、および前記細胞または細胞様構造物に由来するゲルカプセルまたはゲノムライブラリーの集合から、データ取得または解析に供するものを選択することが可能である。例えば、本発明において、細胞または細胞様構造物を２以上含む集合から、当該細胞または細胞様構造物の核酸配列に基づいて、細胞または細胞様構造物を少なくとも１つを含むサブ集団を生成する工程を包含する、細胞または細胞様構造物を含むサブ集団を生成してもよい。サブ集団の生成は、配列決定や、配列決定リードに基づくゲノムドラフトの作成などの工程の労力を低減することができる。

【0081】

本開示の１つの実施形態において、別々に提供された２つ以上の細胞または細胞様構造物を、当該細胞または細胞様構造物に由来する核酸情報に基づいて選別することができる。必要に応じて、当該選別された細胞または細胞様構造物を分析することが可能である。選別は、例えば、PCRから配列決定を行い、部分配列を解読すること、特定の遺伝子配列の有無を確認すること、DNA収量を参照することなど、いくつかの選別を行うことが可能である。

【0082】

本開示の１つの実施形態において、配列決定後に、２つ以上の細胞または細胞様構造物に由来する核酸情報を選別してもよい。２つ以上の細胞または細胞様構造物に由来する核酸情報を、当該細胞または細胞様構造物ごとの核酸情報の集合として提供した後、当該核酸情報の全部または一部に基づいて、当該核酸情報を該細胞または細胞様構造物ごとに選別することができる。必要に応じて、選別された核酸情報を分析することができる。

【0083】

本開示の１つの実施形態において、得られた配列情報は、データベースとして記録することができる。データベースは、データの自動的構築・提供システム上で記録され得る。データベースは、１つの細胞または細胞様構造物に由来する配列情報をそれぞれ区別して格納することができる。それぞれの配列情報は、分類してまとめることが可能である。分類としては、生物種ごとに分類することが望ましい。分類したクラスターは、他種生物の配列情報のコンタミネーションがなく、それに基づいてクラスター内での完全な配列情報の構築を行うことができる。完全な配列情報の構築の際に、再分類を行うこともできる。分析で得られた情報は、新たに得られた１つの細胞または細胞様構造物に由来する配列情報の分類の精緻化に用いることも可能である。

【0084】

本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。

【0085】

本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。

【0086】

以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。

【実施例】

【0087】

以下、本発明の実施例について、添付の図１〜図７を参照して説明する。以下に説明する実施例は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を限定するものではない。また、以下に説明される構成の全てが、本発明の必須要件であるとは限らない。

【0088】

１．マウス腸内微生物由来の１細胞増幅ゲノムライブラリーの作製
試料であるマウス糞便より採集したマウス腸内微生物から１細胞増幅ゲノムライブラリー１７を作製した。本実施例では、ゲノムＤＮＡ１４を採取し増幅してゲノムライブラリー１７を作製するが、メッセンジャーＲＮＡやその他のポリヌクレオチドを採取し増幅してそれらのポリヌクレオチドライブラリーを作製することもできる。なお試料は、同種の微生物のみが含まれているもの又は異種の微生物が含まれているものの何れでもよく、少なくとも一つの微生物が含まれていればよい。

【0089】

実験は、雄性ＩＣＲマウス（６６週齢）(東京実験動物社)の糞便を容量１．５ｍＬのチューブ（1212-10, SSIbio）（図示せず）に採取し、５００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 14190-144, Thermo Fisher Scientific社）中で破砕機(ASPES-50、ASONE社)を用いて固形物がなくなるまですり潰した。２，０００×ｇで２秒間遠心分離し（himac CF15RX, 工機ホールディングス社）、上清を回収する操作を２回繰り返した後、１５，０００×ｇで３分間遠心することでマウス腸内微生物を集菌した。

【0090】

菌体のペレットをＰＢＳで２回遠心洗浄した後、ＰＢＳ中に懸濁することでマウス腸内微生物の細胞懸濁液を取得した。調製した細胞懸濁液中の細胞濃度を測定し（顕微鏡：CKX41, OLYMPUS社、バクテリア計算盤A161,2-5679-01, アズワン社）、終濃度１．５％になるように超低融点アガロース（A5030-10G, SIGMA-ALDRICH社）を加えることで、ゲルカプセル１１作製に用いる腸内微生物懸濁液１を調製した（細胞終濃度：１．５×１０^３ｃｅｌｌｓ／μＬ）。

【0091】

ポリジメチルシロキサン(Sylgard 184: Dow Corning社)を用いて自作したマイクロ流路２を用いて、微小液滴３の作製および微小液滴３内へのマウス腸内微生物１細胞４の封入を行った。図１に示すように、本実施例では、第一流路５、第二流路６、第三流路７及び第四流路８からなり、隣接する流路が直角に配置されたマイクロ流路２を用いたが、略Ｔ字状に接続したマイクロ流路２を使用することも可能である。本実施例のマイクロ流路２は、幅３４μｍ、高さ５０μｍのものを使用したが、作製する微小液滴３の大きさや封入する１細胞４の大きさによりマイクロ流路２のサイズは適宜変更可能である。

【0092】

次に、第一流路５（水相インレット）から腸内微生物懸濁液１を導入し、第二流路６及び第四流路８（油相インレット）からＰｉｃｏ−Ｓｕｒｆ１（２％ ｉｎ Ｎｏｖｅｃ７
５００）(Sphere Fluidics社)（以下、「オイル１０」という）を導入して腸内微生物懸濁液１をせん断することで、直径５０μｍの微小液滴３を作製し、第三流路７を流動させて容量０．２ｍＬのチューブ９に回収した。微小液滴３は、５００液滴／秒の速度で約４５万個作製した。微小液滴３内の細胞濃度は、０．１ｃｅｌｌｓ／ｄｒｏｐｌｅｔである。

【0093】

本実施例では、微小液滴３の直径を５０μｍと均一にすることで、１細胞４ずつ微小液滴３に封入され易くしている。１細胞４の大きさを考慮すると、微小液滴３の直径は、例えば１〜２５０μｍであり、２０〜２００μｍであることが好ましい。

【0094】

図２に示すように、チューブ９内には複数の微小液滴３とオイル１０が収容されるが、微小液滴３はオイル１０よりも比重が軽いため上層に集積する。

【0095】

次に、チューブ９を氷上で１５分間冷却し、超低融点アガロースにより微小液滴３をゲル化した。ゲル化した微小液滴３がゲルカプセル１１である。微小液滴３の直径が５０μｍであることからゲルカプセル１１の直径も５０μｍとなる。また、ゲルカプセル１１の直径は、例えば１〜２５０μｍであり、２０〜２００μｍであることが好ましい。ゲルカプセル１１の直径を均一とすることにより、後述する溶菌試薬１３の各ゲルカプセル１１内への浸透率をより均一化することができる。

【0096】

次に、チューブ９に２０μＬの１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロ−１−オクタノール(SIGMA-ALDRICH社)を加え、下層のオイル１０を取り除いた後、アセトン(富士フイルム和光純薬社)（５００μＬ）、イソプロパノール（５００μＬ）(富士フイルム和光純薬社)のを順に加えて遠心洗浄し、オイル１０の除去を行った。オイル１０を除去するための遠心洗浄は後述の除去部２５により行う。本実施例では、ゲルカプセル１１に浸透したオイル１０も夾雑物質に含まれるものとする。さらに、５００μＬのＰＢＳを添加して遠心洗浄を３回行い、ゲルカプセル１１を水層（ＰＢＳ）１２に懸濁した状態とした。図３に示すように、ゲルカプセル１１は水層１２よりも比重が重いため下層に集積する。

【0097】

続いて、溶解用試薬としての溶菌試薬１３にゲルカプセル１１を順次浸漬し、ゲルカプセル１１内部で細胞４の細胞壁等の収集目的物以外の部分を溶解し、ゲルカプセル１１内にゲノムＤＮＡ１４を溶出させた。

【0098】

具体的には、チューブ９に溶菌試薬１３の１種であるリゾチーム（１０Ｕ／μＬ）（R1804M、Epicentre）を加え、細胞４を溶解した。次に、チューブ９に溶菌試薬１３の１種であるアクロモペプチダーゼ（８５０Ｕ／ｍＬ）（015-09951、富士フイルム和光純薬社）を加えた。次に、チューブ９に溶菌試薬１３の１種であるプロテアーゼＫ（１ｍｇ／ｍＬ）（MC5005、Promega）及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）０．５％（71736-100ML、SIGMA-ALDRICH社）を加え、細胞４を溶解した後に遠心洗浄を５回行いプロテアーゼ及び溶解した細胞４のゲノムＤＮＡ１４以外の成分（夾雑物質）をチューブ９から除去した。続いて、溶菌試薬１３の１種である水酸化カリウムを含む水溶液であるＢｕｆｆｅｒ Ｄ２（ＱＩＡＧＥＮ社)にゲルカプセル１１を浸漬し、残存成分の溶解とゲノムＤＮＡ１４の変性を行った。本実施例で使用する溶菌試液１３は、上述のとおり、リゾチーム、アクロモペプチダーゼ、プロテアーゼＫ、ドデシル硫酸ナトリウム及びＢｕｆｆｅｒ Ｄ２である。なお、水酸化カリウムは通常のＤＮＡ増幅反応工程でも使用するが、溶菌の効果も兼ねていることから、本実施例では溶菌試薬１３の一つとしている。ゲルカプセル１１の溶菌試薬１３への浸漬は短時間であるため、溶出させたゲノムＤＮＡ１４が溶菌試薬１３によりゲルカプセル１１外に流出されることはなく、ゲルカプセル１１内に保持される。本実施例では、ゲルカプセル１１に浸透した溶菌試薬１３も夾雑物質に含まれるものとする。

【0099】

本実施例は、リゾチーム、アクロモペプチダーゼ及びプロテアーゼＫを順次加え、ドデシル硫酸ナトリウムを加えて細胞４を溶解した後、Ｂｕｆｆｅｒ Ｄ２を入れる前にのみ遠心洗浄を行うことで十分な洗浄効果を得ることができる。しかしながら、各溶菌試薬１３により細胞４を溶解した後に遠心洗浄を行ってもよい。

【0100】

このように、複数種類の溶菌試薬１３により細胞４の溶解を行うことで、目的のゲノムＤＮＡ１４を採取することができ、溶菌試薬１３への浸漬後に遠心洗浄を行うことで、溶菌試薬１３や溶解した細胞４のポリヌクレオチド以外の成分等の夾雑物質を除去し、続くゲノムＤＮＡ増幅反応を阻害することのなくゲノムＤＮＡ１４を精製することができる。

【0101】

水酸化カリウム溶液（Ｂｕｆｆｅｒ Ｄ２）中で変性したゲノムＤＮＡ１４を保持するゲルカプセル１１を含むチューブ９に増幅用試薬１５を加え、ゲルカプセル１１を増幅用試薬１５に浸漬した。具体的には、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素であるｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いたＭＤＡ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法を使用した。ここでは、全ゲノム増幅反応試薬ＲＥＰＬＩ−ｇ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社)に浸漬し、３時間の全ゲノム増幅反応を行った（S1000 サーマルサイクラー, Bio-Rad社）。増幅用試薬１５（ＲＥＰＬＩ−ｇ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｋｉｔ）には水酸化カリウム溶液（Ｂｕｆｆｅｒ Ｄ２）を中和する成分が含まれている。

【0102】

全ゲノム増幅後のゲルカプセル１１をＴｒｉｓ−ＥＤＴＡを用いて遠心洗浄した後、図５に示すように、染色用試薬であるＳＹＢＲグリーン（S7563、Thermo Fisher Scientific社）による蛍光性ＤＮＡインターカレーターで染色を行った。なお、染色はＥｖａｇｒｅｅｎ（３１０００、コスモ・バイオ株式会社）等、他の公知の染色用試薬を使用してもよい。

【0103】

フローサイトメーター３０(BD FACSMelody セルソーター, BD Biosciences社）により所定以上に増幅したゲノムＤＮＡ１４を保持するゲルカプセル１１を選別し、１μＬのＰＢＳを事前に添加した収容容器としてのプレート１６（PCR-96-FS-C、Axygen社）に個別に回収した。なお、ゲルカプセル１１の選別は、ゲルカプセル１１をスライドガラスに滴下して、顕微鏡観察の下で蛍光を示すゲルカプセル１１を、マイクロピペット(例えば、Microdispenser, Drummond Scientific社など)を用いて個別に採取してもよい。

【0104】

回収した個々のゲルカプセル１１に対して６５度で加熱（S1000 サーマルサイクラー, Bio-Rad社）を行うことによりゲルカプセル１１を溶解した後、各プレート１６のウェル内でＭＤＡ法による二次増幅を行った。このゲルカプセル１１を収容したプレート１６を多数蓄積することでマウス腸内微生物由来の１細胞増幅ゲノムライブラリー１７とすることができる。

【0105】

二次増幅を行う前のゲルカプセル１１集団は、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ中にて４℃で冷蔵保存した。１細胞増幅ゲノムライブラリー１７は後続の実験に用いるまで−２０℃又は−８０℃で冷凍することで長期保存することができる。

【0106】

ここで、図６を参照して１細胞増幅ゲノムライブラリー１７の作製装置１８について説明する。作製装置１８は、マイクロ流路２により１細胞４を微小液滴３中に封入する液滴作製部１９を備えている。生成された微小液滴３はチューブ９に収容される。

【0107】

また、作製装置１８は、微小液滴３をゲル化してゲルカプセル１１を生成するゲルカプセル生成部２０を備えている。ゲルカプセル生成部２０は冷却部２１を有し、微小液滴３をチューブ９に収容した状態で冷却可能となっている。また、ゲルカプセル生成部２０は微小液滴３をチューブ９に収容した状態で紫外線を照射する紫外線照射部２２を有しており、光硬化性樹脂を使用してゲルカプセル１１を生成することもできる。なお、冷却部２１か紫外線照射部２２の何れか一方のみを有していてもよい。

【0108】

また、作製装置１８は、ゲルカプセル１１を収容したチューブ９に溶菌試薬１３を注入し、ゲルカプセル１１を溶菌試薬１３に浸漬させる溶解用試薬浸漬部２３を備えている。溶菌試薬１３は溶解用試薬注入部２４からチューブ９内に注入される。

【0109】

また、作製装置１８は、ゲルカプセル１１からオイル１０や溶菌試薬１３を含む夾雑物質を除去する除去部２５を備えている。除去部２５は遠心洗浄部２６を有し、ゲルカプセル１１を溶菌試薬１３に所定時間浸漬させた後、遠心洗浄部２６により溶菌試薬１３及び夾雑物質をゲルカプセル１１内及びチューブ９内から除去する。

【0110】

また、作製装置１８は、ゲルカプセル１１内に保持されたゲノムＤＮＡ１４を増幅させる増幅用試薬１５に浸漬する増幅用試薬浸漬部２７を備える。増幅用試薬１５は、増幅用試薬注入部２８からチューブ９内に注入される。

【0111】

また、作製装置１８は、所定以上に増幅したゲノムＤＮＡ１４を保持するゲルカプセル１１を選別する選別部２９を備える。選別部２９は、フローサイトメーター３０を有し、所定以上に増幅したゲノムＤＮＡ１４を保持するゲルカプセル１１を選別しプレート１６に回収する。なお、所定以上に増幅したゲノムＤＮＡ１４を保持しないゲルカプセル１１は他の容器３１に回収する。

【0112】

２．１細胞増幅ゲノムライブラリーから全ゲノム解読
次に、１細胞増幅ゲノムライブラリー１７から全ゲノム解読を実施し解析した。具体的には、１細胞増幅ゲノムライブラリー１７中の各増幅ゲノムの一部を用いて、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３Ｖ４領域に対してＰＣＲ法を行った（6.25μL PrimeSTAR Max DNA Polymerase(R045B、タカラバイオ)、0.5μL 10μM Primer Forward(5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3’（配列番号１）)、0.5μL 10μM Primer Reverse(5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3’（配列番号２）), 1.0μL DNA希釈液, 4.25μL UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water(10977-015, Thermo Fisher Scientific）（S1000 サーマルサイクラー, Bio-Rad）。PCRの反応条件は、初期熱変性を95℃、5分、熱変性を98℃、10秒、アニーリング51℃、15秒、伸長反応を72℃、5秒で27サイクル行い、72℃、5分の反応後、4℃で保存した。アガロースゲル電気泳動（泳動槽：Mupid-exU, EXU-1, Mupid、マーカー：GeneRuler^TM 1kb DNA Ladder, #SM0318, Fermentas、染色：Midori Green Direct, NE-MG06,日本ジェネティクス、ローディングバッファー：6× Loading Buffer, 9157, タカラバイオ）（泳動条件：100V, 15 min）によってＰＣＲ産物の有無を確認後、増幅が見られたサンプルについてサンガー法（株式会社ファスマックのＤＮＡシーケンス外注サービス）を用いてシークエンス解析を行った。ＰＣＲ産物が取得できたサンプルについてＮｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社, FC-131-1096）によるライブラリー調製を行い、Ｍｉｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社, SY-410-1003）を用いた全ゲノムシークエンスによって２×７５ｂｐのペアエンドリード（３．９９Ｇｂ）を取得した。ＳＰＡｄｅｓ（Bankevich ｅｔ ａｌ. Journal of computational biology, 19(5), 455-477.2012（http://doi.org/10.1089/cmb.2012.0021)を用いてシークエンスデータのアセンブリを行った後、ＱＵＡＳＴ（Ｇｕｒｅｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ. Bioinformatics. 2013 29(8):1072-5. doi: 10.1093/bioinformatics/btt086.）を用いてアセンブリの評価を行った。ゲノム解読率(コンプリート率)およびコンタミネーション度の評価にはＣｈｅｃｋＭ（Ｐａｒｋｓ ｅｔ ａｌ., Genome Research 2015. 25: 1043-1055, doi:10.1101/gr.186072.114）を用いた。

【0113】

その結果、解析した全４４個のシングルセルゲノムでは、半数でゲノム解読率(コンプリート率)が５０％を超え、その中の４つでは９０％を超えた。またコンタミネーション度は平均１．９％と低値であった（表１参照）。

【0114】

【表1-1】

【表1-2】

【0115】

以上の値を国際基準Ｍｉｎｉｍｕｍ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｂｏｕｔ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｇｅｎｏｍe（ＭＩＳＡＧ）(Bowers ｅｔ ａｌ., Nature Biotechnology 2017 35(8):725-731. doi: 10.1038/nbt.3893.4）に照らし合わせた結果、マウス糞便から獲得した１細胞由来のゲノム情報は、中品質から高品質として評価されるゲノム情報であった。本実施例の手法によって、グラム陽性菌についてもゲノム情報を得ることが可能であった。

【0116】

特に、フィルミクテス門モリクテス綱マイコプラズマ目を近縁とする新規微生物について、９５％以上のコンプリート率を有する１．７６Ｍｂのゲノム情報が取得された。さらに、取得された新規ゲノムは、一般的なモリクテス綱微生物と同様に脂質およびアミノ酸の合成系を欠損していることが確認され、マウスに対する寄生生物であることが推測された。一方で、大部分のモリクテス綱微生物では欠損しているペプチドグリカン合成系が保存されており、既知のモリクテス綱微生物と異なる性状を示すことも予想された。

【0117】

なお、今回の実験系において１ＴＢのシークエンスデータが得られると仮定した場合、ゲノム解読率(コンプリート率)が５０％超えるサンプルの取得率は、５５００シングルセルゲノムデータ、２２００微生物種となる。これは、従来のメタゲノムシークエンスで同等のデータ量から解析した場合の５〜１７倍にも昇るものである(図７参照）。

【0118】

以上のように、本実施例のゲノムライブラリー１７の作製方法は、１以上の微生物を含む試料を用い、該微生物の細胞を１細胞４ずつ微小液滴３中に封入する工程と、微小液滴３をゲル化してゲルカプセル１１を生成する工程と、ゲルカプセル１１を１種以上の溶菌試薬１３に浸漬して細胞４を溶解し、ゲノムＤＮＡ１４をゲルカプセル１１内に溶出しゲルカプセル１１内に保持する工程と、ゲルカプセル１１を増幅用試薬１５に浸漬してゲノムＤＮＡ１４をゲルカプセル１１内で増幅する工程と、ゲノムＤＮＡ１４が増幅されたゲルカプセル１１を１個毎に選別し、分別収集する工程と、を有することにより、微生物を多量生産されるゲルカプセル１１にランダムに封入して個別にゲノムＤＮＡ１４を増幅することができる。また、簡易な操作で細胞４の溶解とゲノム増幅を続けて行うことができる。また、従来法での１反応相当の試薬量で、数十〜数百万個の並列的な１細胞ゲノム増幅反応が実現でき、ランニングコストを圧倒的に安価とすることができる。また、二次増幅時には、増幅が進行したゲルカプセル１１のみを選抜することができるため、非生物粒子を対象とした不要な反応操作を避けることができる。また、１細胞増幅ゲノムライブラリー１７の作製時には、ゲルカプセル１１に含まれる十分な鋳型量(ピコグラム相当)で増幅が再開するため、コンタミネーション分子の増幅によるデータ劣化を極めて効果的に抑制できる。また、１細胞増幅ゲノムライブラリー１７はマイクログラム容量(細胞百万個以上に相当する量)が得られ、従来法での正常な増幅ゲノム獲得の歩留まりの問題を解消することができる。また、１細胞増幅ゲノムライブラリー１７は冷蔵・冷凍条件での長期保管が可能であり、全ゲノム配列解読にとどまらず特定遺伝子配列のスクリーニング等の再解析を行うことができる。貴重な環境微生物試料の生物情報を増幅核酸サンプルとして永続的に再解析可能とする点は、ＤＮＡシークエンス技術がまだなお進展する中で大きな利点となる。また、微生物のゲノムだけではなく、細胞内に保持されているプラスミド情報も同時に解析することが可能であるため、プラスミド上の物質生産遺伝子や耐性遺伝子の検出なども可能となる。

【0119】

また、本実施例のゲノムライブラリー１７の作製方法は、ゲルカプセル１１を溶菌試薬１３に浸漬した後、ゲルカプセル１１から溶菌試薬１３及び夾雑物質を除去する工程を有することにより、通常の反応ではゲノム増幅反応を阻害するような強力な複数種の試薬群から構成される溶菌試薬１３を使用しても、当該溶菌試薬１３の洗浄除去が可能である。さらにコンタミネーション分子を同時に除去してデータ劣化を極めて効果的に抑制できる。

【0120】

また、本実施例のゲノムライブラリー１７の作製方法は、細胞４の腸内微生物懸濁液１をマイクロ流路２中に流動させ、オイル１０で腸内微生物懸濁液１をせん断することにより細胞４を封入した微小液滴３を作製することにより、直径が均一な微小液滴３を作製することができる。

【0121】

また、本実施例のゲノムライブラリー１７の作製方法は、微小液滴３の直径が１〜２５０μｍ、例えば、２０〜２００μｍであることにより、細胞４が微小液滴３に１細胞ずつ封入される確率を高めることができる。

【0122】

また、本実施例のゲノムライブラリー１７の作製方法は、ゲルカプセル１１の直径が１〜２５０μｍ、例えば、２０〜２００μｍであることにより、細胞４がゲルカプセル１１に１細胞ずつ封入される確率を高めることができる。

【0123】

また、本実施例のゲノムライブラリー１７の作製方法は、ゲルカプセル１１がアガロース、アクリルアミド、光硬化性樹脂、ＰＥＧ、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、マトリゲル、又はコラーゲンから形成されることにより、容易にゲルカプセル１１を作製することができる。

【0124】

また、本実施例のゲノムライブラリー１７の作製方法は、溶菌試薬１３がリゾチーム、ラビアーゼ、ヤタラーゼ、アクロモペプチダーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、ザイモリアーゼ、キチナーゼ、リソスタフィン、ムタノライシン、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、フェノール、クロロホルム、グアニジン塩酸塩、尿素、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、TCEP-HCl、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、Tween 20、Tween 80、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、CHAPS、CHAPSO、ドデシル-β-D-マルトシド、Nonidet P-40、およびZwittergent 3-12からなる群から少なくとも１種選択されることにより、細胞４の一部を溶解しゲノムＤＮＡ１４を採取することができる。

【0125】

また、本実施例のゲノムライブラリー１７の作製方法は、ゲルカプセル１１がヒドロゲルカプセルであることにより、微小液滴３からゲルカプセル１１を生成することができる。

【0126】

また、本実施例のゲノムライブラリー１７の作製方法が、未培養微生物由来１細胞ゲノムのライブラリー化と全ゲノム解析のための細胞操作方法であることにより、貴重な環境微生物試料の生物情報を増幅核酸サンプルとして永続的に再解析可能とする。

【0127】

また、本実施例のゲノムライブラリー１７の作製装置１８が、細胞４を１細胞ずつ微小液滴３中に封入する液滴作製部１９と、微小液滴３をゲル化してゲルカプセル１１を生成するゲルカプセル生成部２０と、ゲルカプセル１１を溶菌試薬１３に浸漬する溶解用試薬浸漬部２３と、ゲルカプセル１１から夾雑物質を除去する除去部２５と、ゲルカプセル１１を増幅用試薬１５に浸漬する増幅用試薬浸漬部２７と、ゲルカプセル１１を選別し、ゲルカプセル１１をプレート１６に収容する選別部２９と、を備えることにより、微生物を多量生産されるゲルカプセル１１にランダムに封入して個別にゲノムＤＮＡ１４を増幅することができる。また、簡易な操作で細胞４の溶解とゲノム増幅を続けて行うことができる。また、従来法での１反応相当の試薬量で、数十〜数百万個の並列的な１細胞ゲノム増幅反応が実現でき、ランニングコストを圧倒的に安価とすることができる。また、二次増幅時には、増幅が進行したゲルカプセル１１のみを選抜することができるため、非生物粒子を対象とした不要な反応操作を避けることができる。また、１細胞増幅ゲノムライブラリー１７の作製時には、ゲルカプセル１１に含まれる十分な鋳型量(ピコグラム相当)で増幅が再開するため、コンタミネーション分子の増幅によるデータ劣化を極めて効果的に抑制できる。また、１細胞増幅ゲノムライブラリー１７はマイクログラム容量(細胞百万個以上に相当する量)が得られ、従来法での正常な増幅ゲノム獲得の歩留まりの問題を解消することができる。また、１細胞増幅ゲノムライブラリー１７は冷蔵・冷凍条件での長期保管が可能であり、全ゲノム配列解読にとどまらず特定遺伝子配列のスクリーニング等の再解析を行うことができる。貴重な環境微生物試料の生物情報を増幅核酸サンプルとして永続的に再解析可能とする点は、ＤＮＡシークエンス技術がまだなお進展する中で大きな利点となる。また、微生物のゲノムだけではなく、細胞内に保持されているプラスミド情報も同時に解析することが可能であるため、プラスミド上の物質生産遺伝子や耐性遺伝子の検出なども可能となる。

【0128】

なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内において、種々の変形実施が可能である。例えば、チューブ９やプレート１６は他の公知の容器を使用することができる。また、海水、土壌、唾液、喀痰、手術洗浄液、血液、皮膚・口腔から採取した組織及び動植物組織破砕液などを試料として用いることもできる。

【0129】

（注記）
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は、日本国特許出願第２０１８-０８９２５９号（２０１８年５月６日出願）に対して優先権を主張するものであり、その内容の全体は、本願において参考として援用される。

【産業上の利用可能性】

【0130】

本発明は、生物学的研究、医療、環境、ヘルスケアなどの分野において利用可能である。

【符号の説明】

【0131】

１ 腸内微生物懸濁液
２ マイクロ流路
３ 微小液滴（液滴）
４ マウス腸内微生物１細胞
５ 第一流路
６ 第二流路
７ 第三流路
８ 第四流路
９ チューブ
１０ オイル
１１ ゲルカプセル
１２ 水層
１３ 溶菌試薬
１４ ゲノムＤＮＡ（ポリヌクレオチド）
１５ 増幅用試薬
１６ プレート（収容容器）
１７ １細胞増幅ゲノムライブラリー
１８ 作製装置
１９ 液滴作製部
２０ ゲルカプセル生成部
２１ 冷却部
２２ 紫外線照射部
２３ 溶解用試薬浸漬部
２４ 溶解用試薬注入部
２５ 除去部
２６ 遠心洗浄部
２７ 増幅用試薬浸漬部
２８ 増幅用試薬注入部
２９ 選別部
３０ フローサイトメーター
３１ 容器

【配列表フリーテキスト】

【0132】

配列番号１：フォワードプライマー
配列番号２：リバースプライマー

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]