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特開2021-119149二重特異性四価抗体並びにその製作及び使用方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2021-119149(P2021-119149A)

(43)【公開日】2021年8月12日

(54)【発明の名称】二重特異性四価抗体並びにその製作及び使用方法

(51)【国際特許分類】

C07K 16/46 20060101AFI20210716BHJP

C12N 15/13 20060101ALN20210716BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46

C12N15/13ZNA

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

【全頁数】42

(21)【出願番号】特願2021-68859(P2021-68859)

(22)【出願日】2021年4月15日

(62)【分割の表示】特願2017-551580(P2017-551580)の分割

【原出願日】2015年12月19日

(31)【優先権主張番号】62/095,348

(32)【優先日】2014年12月22日

(33)【優先権主張国】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】517218697

【氏名又は名称】システィミューン，インク．

【氏名又は名称原語表記】ＳＹＳＴＩＭＭＵＮＥ，ＩＮＣ．

(71)【出願人】

【識別番号】519457719

【氏名又は名称】シーチュアンバイリファーマスーティカルシーオー．エルティーディー．

【氏名又は名称原語表記】ＳＩＣＨＵＡＮＢＡＩＬＩＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＣＯ．ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】110001139

【氏名又は名称】ＳＫ特許業務法人

(74)【代理人】

【識別番号】100130328

【弁理士】

【氏名又は名称】奥野彰彦

(74)【代理人】

【識別番号】100130672

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤寛之

(72)【発明者】

【氏名】ガオ，ツェレン

(72)【発明者】

【氏名】タン，フィル

(72)【発明者】

【氏名】コヴァセヴィチ，ブライアン

(72)【発明者】

【氏名】レンショー，ブレア

(72)【発明者】

【氏名】アダモ，ジェフリー

(72)【発明者】

【氏名】マック，ガーシーアマンダ

(72)【発明者】

【氏名】ツオ，シ

(72)【発明者】

【氏名】チェン，ラン

【テーマコード（参考）】

4H045

【Ｆターム（参考）】

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA75

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】（修正有）

【課題】2つの重鎖及び2つの軽鎖を有する免疫グロブリンG(IgG)部分ならびに重鎖又は軽鎖のC又はN末端に共有結合的に結合した2つのscFv部分を有する、二重特異性四価抗体を提供する。
【解決手段】IgG1重鎖及びカッパー軽鎖は、EGFRファミリーの第一メンバーに結合特異性を有するIgG部分を形成し、2つのscFvドメインは、EGFRファミリーの第二メンバーに結合特異性を有し、各scFvドメインはコネクターによって前記IgG1重鎖のどちらかのC末端に接続されて、各scFvドメインは、N末端-可変重鎖-リンカー-可変軽鎖-C末端又はN末端-可変軽鎖-リンカー-可変軽鎖-C末端の順序の構造を有する、二重特異性四価抗体。
【選択図】図３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

2つのIgG1重鎖と、
2つのカッパー軽鎖と、
2つの単鎖Fv(scFv)ドメインと、を有する、二重特異性四価抗体であって、
前記2つのIgG1重鎖及びカッパー軽鎖は、EGFRファミリーの第一メンバーに結合特異性を有するIgG部分を形成し、
前記2つのscFvドメインは、EGFRファミリーの第二メンバーに結合特異性を有し、
各scFvドメインは、(gly-gly-gly-gly-ser)nのアミノ酸配列を有するコネクターによって前記IgG1重鎖のどちらかのC末端に接続されて、IgG1-コネクター接続をもたらし、
nは、整数であり且つ少なくとも1であり、
各scFvドメインは、N末端-可変重鎖-リンカー-可変軽鎖-C末端又はN末端-可変軽鎖-リンカー-可変軽鎖-C末端の順序の構造を有し、
前記リンカーは、(gly-gly-gly-gly-ser)mのアミノ酸配列を含み、
mは、整数である且つ少なくとも3である、二重特異性四価抗体。

【請求項2】

nは、1から10の整数である、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項3】

mは、3、4、5又は6である、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項4】

前記IgG1重鎖のうちの少なくとも1つは、ヒト化又はヒトIgG1重鎖である、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項5】

両IgG1重鎖は、ヒト化又はヒトIgG1重鎖である、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項6】

前記カッパー軽鎖のうちの少なくとも1つは、ヒト化又はヒトカッパー軽鎖である、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項7】

両カッパー軽鎖は、ヒト化又はヒトカッパー軽鎖である、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項8】

前記EGFRファミリーの前記第一又は第二メンバーは、HER3、EGFR、その断片又は誘導体を含む、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項9】

前記EGFRファミリーの前記第一又は第二メンバーは、独立して、HER3、EGFR、その断片又は誘導体からなる群より選択される、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項10】

前記IgG部分は、HER3に結合特異性を有する、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項11】

前記scFvドメインは、EGFRに結合特異性を有する、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項12】

前記IgG部分は、HER3に結合特異性を有し、且つ、前記scFvドメインは、EGFRに結合特異性を有する、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項13】

前記IgG部分は、EGFRに結合特異性を有する、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項14】

前記scFvドメインは、HER3に結合特異性を有する、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項15】

前記IgG部分は、EGFRに結合特異性を有し、且つ、前記scFvドメインは、HER3に結合特異性を有する、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項16】

前記IgG1重鎖のうちの少なくとも1つのC末端は、アミノ酸残基が欠如している、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項17】

前記アミノ酸残基は、リジンである、請求項6に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項18】

前記IgG1-コネクター接続は、プロテアーゼ活性に耐性である、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項19】

前記IgG1重鎖のうちの少なくとも1つは、前記CH3ドメインに2つの変異を有し、
前記2つの変異は、ヒトCH3ドメインにおける共通残基への復帰変異である、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項20】

前記IgG1重鎖のうちの少なくとも1つは、配列番号7、15、23、31、39、47及び127を含むアミノ酸を有する、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項21】

前記IgG1重鎖、コネクター及びscFvドメインは、配列番号56、66、76、86、98、108、118及び136を含むアミノ酸を有する、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項22】

前記カッパー軽鎖のうちの少なくとも1つは、配列番号3、11、19、27、35、43、51、61、71、81、92、103、113、123及び131を含むアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項23】

少なくとも一つの可変軽鎖は、配列番号4、12、20、28、36、44、52、62、72、82、93、104、114、124及び132を含むアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項24】

少なくとも一つの可変重鎖は、配列番号8、16、24、32、40、48、57、67、77、87、99、109、119、128及び137を含むアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項25】

前記IgG部分は、HER3に結合特異性を有し、
前記scFvドメインは、EGFRに結合特異性を有し、
前記IgG1重鎖、コネクター及びscFvドメインは、配列番号56のアミノ酸配列を有し、
前記カッパー軽鎖は、配列番号51のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項26】

前記IgG部分は、HER3に結合特異性を有し、
前記scFvドメインは、EGFRに結合特異性を有し、
前記IgG1重鎖、コネクター及びscFvドメインは、配列番号76のアミノ酸配列を有し、
前記カッパー軽鎖は、配列番号71のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項27】

前記IgG部分は、HER3に結合特異性を有し、
前記scFvドメインは、EGFRに結合特異性を有し、
前記IgG1重鎖、コネクター及びscFvドメインは、配列番号108のアミノ酸配列を有し、
前記カッパー軽鎖は、配列番号103のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項28】

前記IgG部分は、EGFRに結合特異性を有し、
前記scFvドメインは、HER3に結合特異性を有し、
前記IgG1重鎖、コネクター及びscFvドメインは、配列番号66のアミノ酸配列を有し、
前記カッパー軽鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項29】

前記IgG部分は、EGFRに結合特異性を有し、
前記scFvドメインは、HER3に結合特異性を有し、
前記IgG1重鎖、コネクター及びscFvドメインは、配列番号86のアミノ酸配列を有し、
前記カッパー軽鎖は、配列番号81のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項30】

前記IgG部分は、EGFRに結合特異性を有し、
前記scFvドメインは、HER3に結合特異性を有し、
前記IgG1重鎖、コネクター及びscFvドメインは、配列番号98のアミノ酸配列を有し、
前記カッパー軽鎖は、配列番号92のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項31】

前記IgG部分は、EGFRに結合特異性を有し、
前記scFvドメインは、HER3に結合特異性を有し、
前記IgG1重鎖、コネクター及びscFvドメインは、配列番号118のアミノ酸配列を有し、
前記カッパー軽鎖は、配列番号113のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項32】

前記IgG部分は、EGFRに結合特異性を有し、
前記scFvドメインは、HER3に結合特異性を有し、
前記IgG1重鎖、コネクター及びscFvドメインは、配列番号136のアミノ酸配列を有し、
前記カッパー軽鎖は、配列番号131のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項33】

前記抗体は、がん細胞の成長を阻害する、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項34】

前記抗体は、50nM未満のKdでEGRF及びHERSに結合する、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項35】

前記抗体は、50nM未満のKdでEGRFに結合し、且つ、50nM未満のKdでHER3に結合する、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。

【請求項36】

配列番号7、15、23、31、39、47及び127から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の二重特異性四価抗体のIgG1重鎖。

【請求項37】

配列番号3、11、19、27、35、43、51、61、71、81、92、103、113、123及び131から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の二重特異性四価抗体のカッパー軽鎖。

【請求項38】

配列番号4、12、20、28、36、44、52、62、72、82、93、104、114、124及び132から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の二重特異性四価抗体の可変軽鎖。

【請求項39】

配列番号8、16、24、32、40、48、57、67、77、87、99、109、119、128及び137から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の二重特異性四価抗体の可変重鎖。

【請求項40】

請求項1に記載の抗体、
請求項36に記載のIgG1重鎖、
請求項37に記載のカッパー軽鎖、
請求項38に記載の可変軽鎖、又は
請求項39に記載の可変重鎖、をエンコードしている単離された核酸。

【請求項41】

請求項40に記載の単離された核酸を含む発現ベクター。

【請求項42】

前記ベクターは、細胞において発現可能である、請求項41に記載の発現ベクター。

【請求項43】

請求項40に記載の核酸を含む宿主細胞。

【請求項44】

請求項43に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。

【請求項45】

前記宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞である、請求項44に記載の宿主細胞。

【請求項46】

前記抗体が生産されるように請求項43-45のいずれかに記載の宿主細胞を培養するステップを有する、抗体生産方法。

【請求項47】

請求項1に記載の抗体及び細胞毒性薬剤を含む免疫複合体。

【請求項48】

請求項1に記載の二重特異性四価抗体と、医薬的に許容可能なキャリアと、を有する、医薬組成物。

【請求項49】

ラジオアイソトープ、放射性核種、毒素、治療薬剤、化学療法薬剤又はその組み合わせを有する、請求項48に記載の医薬組成物。

【請求項50】

請求項47に記載の免疫複合体と、医薬的に許容可能なキャリアと、を有する、医薬組成物。

【請求項51】

対象に請求項1に記載の二重特異性四価抗体を有効量で投与するステップを有する、がんを患っている対象を治療する方法。

【請求項52】

前記がんは、EGFRファミリーの少なくとも2つのメンバーを発現している細胞を含む、請求項51に記載の方法。

【請求項53】

前記がんは、乳がん、大腸がん、膵臓がん、頭頸部がん、メラノーマ、卵巣がん、前立腺がん、非小細胞肺がん、膠腫、食道がん、鼻咽頭がん、肛門がん、直腸がん、胃がん、膀胱がん、子宮頸がん又は脳がんを含む、請求項51に記載の方法。

【請求項54】

治療薬剤を有効量で共投与するステップを更に有する、請求項51に記載の方法。

【請求項55】

前記治療薬剤は、抗体、化学療法薬剤、酵素又はその組み合わせを含む、請求項54に記載の方法。

【請求項56】

前記治療薬剤は、抗エストロゲン薬剤、受容体チロシン阻害剤又はその組み合わせを含む、請求項54に記載の方法。

【請求項57】

前記治療薬剤は、カペシタビン、シスプラチン、トラスツズマブ、フルベストラント、タモキシフェン、レトロゾール、エクセメスタン、アナストロゾール、アミノグルテチミド、テストラクトン、ボロゾール、ホルメスタン、ファドロゾール、レトロゾール、エルロチニブ、ラパチニブ(lafatinib)、ダサチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、パゾパニブ(pazopinib)、ラパチニブ、スニチニブ、ニロチニブ、ソラフェニブ、ナブパクリタキセル、その誘導体又は組み合わせを含む、請求項54に記載の方法。

【請求項58】

前記治療薬剤は、チェックポイント阻害剤を含む、請求項54に記載の方法。

【請求項59】

前記治療薬剤は、PD1、PDL1、CTLA4、4-1BB、OX40、GITR、TIM3、LAG3、TIGIT、CD40、CD27、HVEM、BTLA、VISTA、B7H4、その誘導体又は組み合わせを含む、請求項54に記載の方法。

【請求項60】

前記対象は、ヒトである、請求項51に記載の方法。

【請求項61】

HER受容体の生物活性を阻害するために対象に請求項1に記載の抗体を有効量で投与するステップを有する、対象におけるHER受容体の生物活性を阻害する方法。

【請求項62】

請求項1に記載の二重特異性四価抗体を有効濃度で含む溶液であって、
前記溶液は、対象の血漿である、溶液。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連特許出願の相互参照
この出願は、2014年12月22日に出願された「BISPECIFIC ANTIBODIES」というタイトルの米国仮出願番号第62095348号に対する優先権を主張し、その全てを参照によって本願明細書に援用する。

【0002】

配列表
この出願に関連した配列表は、紙形式の代わりにテキスト形式にて提供し、参照によって本願明細書に援用する。配列表を含むテキストファイルの名前は、Sequence Listing_ST25_0003PCT2.txtである。テキストファイルは、約227KBであり、2015年12月18日に作成され、EFS-ウェブで電子的に提出されている。

【0003】

技術分野
本開示は、概して、抗体治療剤の技術分野に関するものであり、より詳しくは、EGFRファミリーの2つの異なるメンバーに対する二重特異性四価抗体に関する。

【0004】

背景技術
EGFR、HER2、HER3、HER4のようなErbB/HER受容体ファミリーのメンバーの過剰発現又は脱制御は、がんの腫瘍形成に重要な役割を果たすことが示されている。EGFR又はHER2の変異及び増幅は、腫瘍形成に関与している下流のシグナル伝達経路を活性化する異常増殖信号を生む。EGFR及びHER2に対する治療抗体及び低分子阻害剤は、がん治療用に承認されている(Arteaga et al., Nature Reviews Clinical Oncology 9 16-32, January 2012)。EGFRファミリーのメンバー(例えばEGFR及びHER2)に対するモノクローナル抗体は、良好な臨床反応が結腸がん(Price et al., The Lancet Oncology 15(6), Pages 569-579, May 2014)、頭頸部の扁平上皮癌腫(Cohen, Cancer Treatment Reviews 40 (2014) 567=577)、胸部及び胃がん(Arteaga et al., Nature Reviews Clinical Oncology 9 16-32, January 2012)において証明されている。セツキシマブ、パニツムマブ及びニモツズマブを含むいくつかの治療用抗EGFR抗体は、転移性大腸がん、頭頸部扁平上皮癌腫及び膠腫を含むいくつかのがんについて承認された治療薬である(Price and Cohen, Curr Treat Options Oncol. 2012 Mar;13(1):35-46; Bode et al., Expert Opin Biol Ther. 2012 Dec;12(12):1649-59)。残念なことに、これらの治療薬剤に最初に反応する多くの腫瘍は、薬剤に対して獲得された抵抗性に起因して最終的には進行してしまう(Jackman et al. J Clin Oncol 2010; 28:357=60)。従って、より良好ながん治療薬の必要性が存在する。

【0005】

概要
本開示は、二重特異性四価抗体を提供する。二重特異性四価抗体は、2つの重鎖及び2つの軽鎖を有する免疫グロブリンG(IgG)部分及び重鎖又は軽鎖のC又はN末端に共有結合的に結合した2つのscFv部分を有することができる。IgG部分は、EGFRファミリーの第一メンバーに対する結合特異性を有することができる。scFv部分は、EGFRファミリーの第二メンバーに対する結合特異性を有することができる。IgG部分及び2つのscFv部分は、二重特異性四価抗体として機能的であるように共有結合的に結合している。開示の対象及び利点は、添付の図面に関連して、以下のその好ましい実施形態の詳細な説明から明らかになる。

【0006】

本開示による好ましい実施形態は、図に関して以下に記載し、参照符号は、同じ要素を意味する。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】図1は、例示的な二価の一重特異性免疫グロブリンG(IgG)抗体のドメイン構造を示している図である。

【図2】図2は、本発明の一実施形態による、IgG部分及び2つのscFv部分を含む例示的な四価の二重特異性抗体のドメイン構造を示している図である。

【図3】図3は、例示的な四価の二重特異性抗体1X1、1X2、1X3、1X4、1X4.2、1X5及び1X6のドメイン構造の図を示している。

【図4】図4は、SI-1X4とSI-1X4.2との間のVHドメイン配列の比較を示しており、5つのアミノ酸の相違を示している。

【図5】図5は、BLIによるモノマーEGFR結合を示しているグラフである。

【図6】図6は、BLIによるモノマーEGFR結合を示しているグラフである。

【図7】図7は、二重特異性ELI結合を示しているグラフである。

【図8】図8は、二重特異性ELI結合を示しているグラフである。

【図9】図9は、二重特異性ELI結合を示しているグラフである。

【図10】図10は、二量体EGFRに関するELISAを示しているグラフである。

【図11】図11は、Octet分析にて、モノマーEGFRとSI-1C5.2及びSI-1X4.2との結合速度論を示している。

【図12】図12は、A431細胞に結合しているSI-1X抗体のフローサイトメトリー解析を示している。

【図13】図13は、BxPC3細胞に結合しているSI-1X抗体のフローサイトメトリー解析を示している。

【図14】図14は、Fadu細胞に結合しているSI-1X4.2抗体のフローサイトメトリー解析を示している。

【図15】図15は、A431細胞を結合しているSI-1X4.2抗体のフローサイトメトリー解析を示している。

【図16】図16は、A431細胞の増殖に対するSI-1X抗体の効果を示している。

【図17】図17は、A431細胞の増殖に対するSI-1X抗体の効果を示している。

【図18】図18は、BxPC3細胞の増殖に対するSI-1X抗体の効果を示している。

【図19】図19は、BxPC3細胞の増殖に対するSI-1X抗体の効果を示している。

【図20】図20は、Fadu細胞の増殖に対するSI-1X4.2抗体の効果を示している。

【図21】図21は、A431細胞の増殖に対するSI-1X4.2抗体の効果を示している。

【図22】図22は、Fadu細胞に対するSI-1X抗体のADCC活性を示している。

【図23】図23は、NCI-H1975細胞に対するSI-1X抗体のADCC活性を示している。

【図24】図24は、SI-1X抗体の安定性を証明するSI-1X抗体の熱溶融を示している。

【図25】図25は、7日間にわたるSI-1X抗体の血清安定性を示している。

【図26】図26は、ラットに関するPK調査のための、EGFRをコートしたELISAの結果を示すグラフである。

【図27】図27は、ラットに関するPK調査のための、HER3をコートしたELISAの結果を示すグラフである。

【図28】図28は、ラットに関するPK調査のためのサンドイッチELISAの結果を示すグラフである。

【図29】図29は、マウス異種移植片調査における平均腫瘍体積対日のプロットを示すグラフである。

【図30】図30は、マウス異種移植片調査における相対的体重対週のプロットを示しているグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0008】

詳細な説明
本開示は、現在知られている抗EGFR抗体よりも優れた治療特性又は効果を有する二重特異性四価抗体を提供する。一実施形態において、本抗体は、限定するものではないが、EFFR及びHER3を含むEGFRファミリーの2つのメンバーを目標とする。二重特異性四価抗体は、EGFR及びHER3媒介シグナルを同時に阻害することができることから、EGFR阻害剤又はモノクローナル抗体治療における抵抗性を克服し得る。

【0009】

本願明細書及び特許請求の範囲において用いられている通り、本願明細書及び特許請求の範囲全体での単数形「a」、「及び」、「並びに」、「the」、用語「含む」又はバリエーション(例えば「有する」又は「備える」)は、文脈で別途明記しない限り、明言された整数又は整数のグループの包含を意味するが、任意の他の整数の除外を意味するものでも、複数の指示対象を含む整数のグループの除外を意味するものでもないことを理解するよう注意すべきである。

【0010】

「抗体断片」は、完全な抗体の一部、好ましくは完全な抗体の抗原結合部位又は可変領域を含む。抗体断片の例として、Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、Fab'-SH;二重特異性抗体;線形抗体(米国特許第5,641,870号、実施例2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)を参照);単鎖抗体分子(例えばscFv)が挙げられる。本記述において、及び、明細書の全体にわたって、抗体及び抗体の様々な特性に関して参照している一方で、同様の開示は、機能的な抗体断片(例えば二重作用Fab断片)にも当てはまる。

【0011】

一態様において、二重特異性四価抗体は、2つの重鎖及び2つの軽鎖を有する免疫グロブリンG(IgG)部分及び重鎖又は軽鎖のC末端又はN末端に共有結合的に接続した2つのscFv部分を含んでいてもよい。IgG部分は、EGFRファミリーの第一メンバーに対して結合特異性を有することができる。scFv部分は、EGFRファミリーの第二メンバーに対して結合特異性を有することができる。IgG部分は、scFv部分に対する安定性をもたらすことができる。二重特異性四価抗体は、AKT及びMAPK/ERK経路に関するシグナルをブロックすることができ、一方又は両方の抗原を発現している細胞への抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)を媒介することができる。一実施形態において、二重特異性四価抗体は、同時に両方の抗原に結合することができる。いくつかの実施形態において、二重特異性四価抗体は、インビトロ及びインビボでの増殖アッセイにおいて一重特異性抗体親コントロール又は一重特異性抗体親コントロールの組み合わせよりも強い腫瘍阻害をもたらす。

【0012】

一実施形態において、本開示は、2つのIgG1重鎖、2つのカッパー軽鎖及び2つの単鎖Fv(scFv)ドメインを有する二重特異性四価抗体を提供する。2つのIgG1重鎖及びカッパー軽鎖は、EGFRファミリーの第一メンバーに対する結合特異性を有するIgG部分を形成する。2つのscFvドメインは、EGFRファミリーの第二メンバーに対する結合特異性を有し、各scFvドメインは、アミノ酸配列(gly-gly-gly-gly-ser)n(別名(G4S)n)を有するコネクターによってIgG1重鎖のどちらかのC末端に接続して、IgG1-コネクター接続を提供する。nは、少なくとも1の整数である。例えば、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、又は17であってもよい。各scFvドメインは、N末端-可変重鎖-リンカー-可変軽鎖-C末端の順序の構造を有する。リンカーは、(gly-gly-gly-gly-ser)m(別名(G4S)m)のアミノ酸配列を有することができる。mは、少なくとも2又は少なくとも3の整数であってもよい。例えば、mは、3、4、5、6、11、又は12であってもよい。いくつかの実施形態において、IgG1重鎖の少なくとも一方又は両方は、ヒト化又はヒトである。いくつかの実施形態において、カッパー軽鎖の少なくとも一方又は両方は、ヒト化又はヒトである。

【0013】

EGFRファミリーのメンバーとしては、EGFR、HER2、HER3、その断片又は誘導体を挙げることができる。いくつかの実施形態において、EGFRファミリーの第一メンバーは、EGFR、HER2、その断片又は誘導体であってもよい。いくつかの実施形態において、EGFRファミリーの第二メンバーは、HER3、その断片又は誘導体であってもよい。一実施形態において、IgG部分は、HER3に結合特異性を有することができる。一実施形態において、scFvドメインは、EGFRに結合特異性を有することができる。一実施形態において、IgG部分は、HER3に結合特異性を有することができ、scFvドメインは、EGFRに結合特異性を有することができる。一実施形態において、IgG部分は、EGFRに結合特異性を有することができる。一実施形態において、scFvドメインは、HER3に結合特異性を有することができる。一実施形態において、IgG部分は、EGFRに結合特異性を有することができ、scFvドメインは、HER3に結合特異性を有することができる。

【0014】

いくつかの実施形態において、IgG1重鎖の一方又は両方のC末端は、アミノ酸残基が欠如している。例えば、リジン残基は、コネクターがC末端に融合される前に、IgG1鎖のC末端から削除することができる。リジン残基の欠失は、IgG1-コネクター接続をプロテアーゼ活性耐性にする。

【0015】

いくつかの実施形態において、IgG1重鎖の一方又は両方は、CH3ドメインの2つの変異を含む。例えば、2つの変異は、ヒトCH3ドメインにおける共通残基への復帰変異であってもよい。

【0016】

ある実施形態において、IgG1重鎖は、配列番号7、15、23、31、39、47、及び127のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも95%、98%又は99%の類似性を有するアミノ酸配列を有することができる。いくつかの実施形態において、IgG1重鎖、コネクター及びscFvドメインは、配列番号56、66、76、86、98、108、118、及び136アミノ酸配列又はそれに対して少なくとも95%、98%又は99%の類似性を有するアミノ酸配列を有することができる。いくつかの実施形態において、カッパー軽鎖は、配列番号3、11、19、27、35、43、51、61、71、81、92、103、113、123、及び131のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも95%、98%又は99%の類似性を有するアミノ酸配列を有することができる。いくつかの実施形態において、可変軽鎖は、配列番号4、12、20、28、36、44、52、62、72、82、93、104、114、124、及び132のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも95%、98%又は99%の類似性を有するアミノ酸配列を有することができる。いくつかの実施形態において、可変重鎖は、配列番号8、16、24、32、40、48、57、67、77、87、99、109、119、128、及び137のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも95%、98%又は99%の類似性を有するアミノ酸配列を有することができる。

【0017】

いくつかの実施形態において、IgG部分は、HER3に結合特異性を有し、scFvドメインはEGFRに結合特異性を有する。一実施形態において、IgG1重鎖、コネクター及びscFvドメインは、配列番号56のアミノ酸配列を有し、カッパー軽鎖は、配列番号51のアミノ酸配列を有する。一実施形態において、IgG1重鎖、コネクター及びscFvドメインは、配列番号76のアミノ酸配列を有し、カッパー軽鎖は、配列番号71のアミノ酸配列を有する。一実施形態において、IgG1重鎖、コネクター及びscFvドメインは、配列番号108のアミノ酸配列を有し、カッパー軽鎖は、配列番号103のアミノ酸配列を有する。

【0018】

いくつかの実施形態において、IgG部分は、EGFRに結合特異性を有し、scFvドメインは、HER3に結合特異性を有する。一実施形態において、IgG1重鎖、コネクター及びscFvドメインは、配列番号66のアミノ酸配列を有し、カッパー軽鎖は、配列番号61のアミノ酸配列を有する。一実施形態において、IgG1重鎖、コネクター及びscFvドメインは、配列番号86のアミノ酸配列を有し、カッパー軽鎖は、配列番号81のアミノ酸配列を有する。一実施形態において、IgG1重鎖、コネクター及びscFvドメインは、配列番号98のアミノ酸配列を有し、カッパー軽鎖は、配列番号92のアミノ酸配列を有する。一実施形態において、IgG1重鎖、コネクター及びscFvドメインは、配列番号118のアミノ酸配列を有し、カッパー軽鎖は、配列番号113のアミノ酸配列を有する。一実施形態において、IgG1重鎖、コネクター及びscFvドメインは、配列番号136のアミノ酸配列を有し、カッパー軽鎖は、配列番号131のアミノ酸配列を有する。

【0019】

上記二重特異性四価抗体は、がん細胞の成長を阻害する活性を有する。ある種の実施形態では、本発明の抗体は、その標的EGRF又はHER3に関して≦80 nM、≦50 nM、≦30 nM、≦20nM、≦10nM又は≦0.1nMの解離定数(Kd)を有する。本抗体は、両方の標的に同時に結合することができる。いくつかの実施形態において、本抗体は、50nM未満のKdにてEGRF及びHER3に結合する。いくつかの実施形態において、本抗体は、40、30、25、20、19、18又は10nM未満のKdにてEGRF及び/又はHER3に結合する。一実施形態において、本抗体は、30nM未満のKdにてEGRFに結合し、30nM未満のKdにてHER3に結合する。一実施形態において、本抗体は、50nM未満のKdにてEGRFに結合し、同時に、50nM未満のKdにてHER3に結合する。

【0020】

別の態様においては、本開示は、本願明細書に開示される、二重特異性四価抗体をエンコードしている単離された核酸又はそのサブコンポーネントを提供する。本サブコンポーネントは、IgG1重鎖、カッパー軽鎖、可変軽鎖又は可変重鎖であってもよい。

【0021】

更なる態様において、本開示は、本願明細書に開示される、二重特異性四価抗体をエンコードしている単離された核酸又はそのサブコンポーネントを有する発現ベクターを提供する。本ベクターは、宿主細胞において発現可能である。本宿主細胞は、原核生物であってもよく、真核生物であってもよい。

【0022】

更なる態様において、本開示は、本願明細書に開示される二重特異性四価抗体をエンコードしている単離された核酸又はかかる塩基配列を含む発現ベクターを有する宿主細胞を提供する。

【0023】

更なる態様において、本開示は、二重特異性四価抗体を生産する方法を提供する。一実施形態において、本方法は、本抗体を生産するように上記宿主細胞を培養するステップを含むことができる。

【0024】

更なる態様において、本開示は、本願明細書に記載されている二重特異性四価抗体及び細胞毒性薬剤を含む免疫複合体を提供する。

【0025】

更なる態様において、本開示は、医薬組成物を提供する。本医薬組成物は、本願明細書に記載されている二重特異性四価抗体又は免疫複合体及び医薬的に許容可能なキャリアを含むことができる。いくつかの実施形態において、本組成物は、ラジオアイソトープ、放射性核種、毒素、治療薬剤、化学療法薬剤又はその組み合わせを更に含むことができる。

【0026】

更なる態様において、本開示は、がんを患っている対象を治療する方法を提供する。一実施形態において、本方法は、本願明細書に記載されている二重特異性四価抗体を有効量で対象に投与するステップを含む。上記がんは、例えば、EGFR、HER2、HER3、その断片又は誘導体を含むEGFRファミリーの少なくとも2つのメンバーを発現している細胞を含むことができる。上記がんは、乳がん、大腸がん、膵臓がん、頭頸部がん、メラノーマ、卵巣がん、前立腺がん及び非小細胞肺がん、膠腫、食道がん、鼻咽頭がん、肛門がん、直腸がん、胃がん、膀胱がん、子宮頸がん及び脳がんであってもよい。

【0027】

一実施形態において、本方法は、治療薬剤を有効量で共投与するステップを更に含むことができる。上記治療薬剤は、例えば、抗体、化学療法薬剤、細胞毒性薬剤、酵素又はその組み合わせであってもよい。いくつかの実施形態において、上記治療薬剤は、抗エストロゲン薬剤、受容体チロシン阻害剤又はその組み合わせであってもよい。いくつかの実施形態において、上記治療薬剤は、生物製剤であってもよい。一実施形態において、上記治療薬剤は、チェックポイント阻害剤であってもよい。いくつかの実施形態において、上記治療薬剤は、PD1、PDL1、CTLA4、4-1BB、OX40、GITR、TIM3、LAG3、TIGIT、CD40、CD27、HVEM、BTLA、VISTA、B7H4、その誘導体、複合体又は断片を含むことができる。いくつかの実施形態において、上記治療薬剤は、カペシタビン、シスプラチン、トラスツズマブ、フルベストラント、タモキシフェン、レトロゾール、エクセメスタン、アナストロゾール、アミノグルテチミド、テストラクトン、ボロゾール、ホルメスタン、ファドロゾール、レトロゾール、エルロチニブ、ラパチニブ(lafatinib)、ダサチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、パゾパニブ(pazopinib)、ラパチニブ、スニチニブ、ニロチニブ、ソラフェニブ、ナブパクリタキセル又はその誘導体であってもよい。いくつかの実施形態において、かかる治療を必要とする対象は、ヒトである。

【0028】

一実施形態において、本開示は、HER受容体の生物活性を阻害するために二重特異性四価抗体を有効量で対象に投与することによって対象を治療する方法を提供する。

【0029】

一実施形態において、本開示は、二重特異性四価抗体を有効濃度で有する溶液を提供する。一実施形態において、上記溶液は、対象の血漿である。

【0030】

IgGの一般的な構造の図を図1に示している。

【0031】

いくつかの実施形態による二重特異性四価抗体の代表的な構造の図を図2に示している。この例では、二重特異性四価抗体は、2つのヒトIgG1重鎖、2つのヒトカッパー軽鎖及び2つの単鎖Fv(scFv)ドメインを含む。2つのヒトIgG1重鎖及びヒトカッパー軽鎖は、EGFRファミリーの1つのメンバーに結合特異性を有するIgG部分を形成し、2つのscFvドメインの各々は、gly-gly-gly-gly-ser-gly-gly-gly-gly-ser((G4S)2)のアミノ酸配列を有するコネクターによってヒトIgG1重鎖のどちらかのC末端残基に結合する。各scFvドメインは、N末端-可変重鎖-リンカー-可変軽鎖C末端の順番である。リンカーは、gly-gly-gly-gly-ser-gly-gly-gly-gly-ser-gly-gly-gly-gly-ser(また、(G4S)3とも知られている)のアミノ酸配列を含む。二重特異性四価抗体のある実施形態に関して、CH1、CH2、CH3、CL、コネクター及びリンカーアミノ酸配列は、同一である。各二重特異性四価抗体は、本抗体の一端に二価抗HER3結合特異性と、他端に特異的に二価抗EGFR結合特異性を有する。抗HER3可変重鎖及び可変軽鎖の1対は、1C1として示され、抗EGFR可変重鎖及び可変軽鎖の4対は、それぞれ、1C3、1C5、1C5.2、1C6及び1C6.4として示されている。二重特異性四価抗体は、1X1、1X2、1X3、1X4、1X4.2、1X5、1X5.2、1X6及び1X6.4として示されている。

【0032】

加えて、コントロール分子1C4(SI-1C4としても示される)をいくつかの調査の中で用いた。1C4は、シェファー達(Schaefer et al., Cancer Cell. 2011 Oct 18; 20(4):472-86)が開示したツー-イン-ワンプラットフォーム(two-in-one platform)に構築したHER3及びEGFRに対する二重特異性抗体である。IC4は、モノクローナル抗体に類似した構造を有する。上記分子は、各FabアームにおいてEGFR又はHER3に結合することができるが、各Fabアームにおいて両方の標的に同時に係合することができない。

【0033】

可変軽鎖、可変重鎖及び単鎖Fv(scFv)DNA断片は、外部ベンダーを通じた遺伝子合成によって作成した。ヒトガンマ-1重鎖及びヒトカッパー軽鎖DNA断片は、外部ベンダーを通じた遺伝子合成によって作成した。上記断片は、制限酵素サイトを使用してDNAライゲーションによって共にアセンブルして、哺乳動物細胞での一時的発現のために設計されたベクターにクローンした。上記ベクターは、強力なCMV由来プロモーター、及び一時的発現のために必要な他の上流及び下流の因子を含む。得られたIgG発現プラスミドは、DNA塩基配列決定によって予定されたDNA配列を含むものと確認した。

【0034】

抗体構築物の一時的発現は、他で記載(CSH Protocols; 2008; doi:10.1101/pdb.prot4977を参照)されている線形PEIと浮遊培養適合HEK293F細胞とのトランスフェクションをして成し遂げた。抗体は、得られたトランスフェクション上清から必要に応じてタンパク質親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。タンパク価は、Superdex 200カラムによって分析する。全てのアッセイに使用するタンパク質は、90%を超える純度を有する。

【0035】

上記二重特異性抗体は、EGFR及びHER3共発現を有するタイプのがんを治療のために用いることができる。上記がんは、限定するものではないが、結腸がん、頭頸部扁平上皮癌腫、肺がん、膠腫、膵臓がん、鼻咽頭がん及び他のがんタイプを含む。

【0036】

上記二重特異性抗体は、四価の二重特異性である。例示的な抗体は、IgG及び2つのscFvとすることができ、一重特異性抗体IgGと比較して2つの異なる結合特異性をもたらす。IgGコンポーネントは、scFvだけを使用した他の二重特異性抗体(例えばBiTE技術)(Lutterbuese et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107.28 (2010): 12605=12610. PMC. Web. 2 Dec. 2014)及び他のもの(例えば、US7332585B2)を超える安定性及び向上した血清半減期をもたらす。これは、ADCCを媒介できるが、Fcコンポーネントのないものは、それができない(例えば、US7332585B2)。四価の二重特異性の性質は、二重特異性抗体に、一度に1つの抗原にしか結合することができないいくつかの他の二重特異性抗体の結合能力を同時に提供するものである(Schanzer et al６, Antimicrob. Agents Chemother. 2011, 55(5):2369; EP272942A1)。

【0037】

記述を簡便にするために、上記二重特異性抗体の、又はそれに関連した配列を本願明細書の以下の表1にまとめた。

【表1】

【実施例】

【0038】

以下の実施例は、実例としての提供しており、それに限定するものではない。当業者は、様々な重要でないパラメーターを変更又は改変することによって本質的に同じ又は類似の結果を得ることができることを容易に認識している。

【0039】

実施例1:SI-1X4とSI-1X4.2との配列相違
SI-1X4.2は、SI-1X4分子の改変型であり、カバット番号付けシステムで表すV71A、T75S、N76S、A93T及びS107Tの5つのアミノ酸変更を含む。これらの変更のいくつかは、これらがCDRループになく且つ結合及び活性にとって重要な場合であっても、抗原と潜在的に相互作用する75、76及び93に特に位置する。図4は、SI-1X4.2とSI-1X4との間の5つのアミノ酸相違を示している。

【0040】

実施例2:BLIを用いた上皮成長因子受容体に対する抗体の特性評価
モノマーEGFR細胞外ドメイン結合は、BLItz機器(ForteBio社)でのバイオレイヤー干渉(BLI)結合アッセイにおいて測定した。25μg/mLのSI-1C3、SI-1C4、SI-1C6、SI-1X1、SI-1X2、SI-1X5及びSI-1X6をPBSにて希釈し、抗huIgG Fc BLItzバイオセンサーチップ上で120秒間捕獲した。チップをPBSで30秒間洗浄して、588nMで結合のためのEGFR(ProSpec Bio、PKA-344)サンプルに移した。チップに対するEGFR ECDの結合は、120秒の会合時間にわたるバイオレイヤー干渉信号(Δnm)として記録した。チップをPBSに移し、解離を240秒間(*SI-1C6の解離時間のみ120秒間)観察した。図5及び6は、抗体をロードしたバイオセンサーに対するEGFRの会合ステップで始まっているデータを報告している。各図は、ベンチマーク抗体としてのSI-1C4に対する比較を示している。

【0041】

SI-1C3及びSI-1X2が、Fabとして示しているEGFR結合ドメインを共有しているため、それらの結合プロファイルは、類似しており、SI-1X1と表示するscFv形態よりも強い(図6)。各々は、SI-1C4と比較してEGFRに非常に遅いオフレートを有しており、それらのオンレートによって影響を受けない。SI-1X1は、EGFRに対する結合がより弱いオンレートを示し得るが、非常に強く結合したままである。同じ傾向は、図5にも観察され、SI-1C6及びSI-1X6として表示されているEGFR結合ドメインのFabバージョンは、SI-1X5として表示されているそれらの代表的なscFvよりも速いレートで結合する。二重特異性抗体のFabサイド上にEGFR結合ドメインを有することは、scFvバージョンよりも速いオンレートで結合するが、同程度のオフレートを示すように見える。SI-1X3及びSI-1X4は、このアッセイにおいてモノマーEGFR結合を示さず(データ不図示)、二量体EGFR結合は、下記ELISAにおいて調査する。

【0042】

実施例3:BL1を使用したEGFR及びHer3に対する抗体の特性評価
EGFR及びHer3細胞外ドメインに対する二重特異性結合は、BLItz機器(ForteBio社)でのバイオレイヤー干渉(BLI)結合アッセイにおいて測定した。200nMのSI-1C1、SI-1C3、SI-1C4、SI-1C6、SI-1X1、SI-1X2、SI-1X3、SI-1X4、SI-1X5及びSI-1X6を、1Xカイネティクス緩衝液(ForteBio社)にて希釈して、抗huIgG Fc BLItzバイオセンサーチップ上で120秒間捕獲した。チップをKBで30秒間洗浄して、200nMで結合のためのEGFRサンプル(ProSpec Bio、PKA-344)に移した。チップに対するEGFR ECDの結合は、120秒の会合時間にわたるバイオレイヤー干渉信号(Δnm)として記録した。チップをKBに移し、解離を60秒間観察した。本プロセスは、200nMで120秒間、及びKBにおける60秒の類似の解離ステップでHer3 ECDサンプル(Sino Biological、10201-H08H-10)と共に繰り返した。図7-10は、抗体をロードしたバイオセンサーに対するEGFRの会合ステップで始まっているデータを報告している。抗体は、Fcによってセンサーに結合されている間、EGFR及びHer3に関する二重特異性結合を同時に示すことが可能である。図7及び図8において観察されているように、Fab(SI-1X2、SI-1X6)であるEGFR結合ドメインの表示は、それらのscFv形態(それぞれSI-1X1、SI-1X5)よりも結合が強いオンレートを有する。ここで、EGFR及びHer3は、同じFab>>scFvオンレート傾向を示す。SI-1X3及びSI-1X4は、モノマーEGFRに対する結合を示さないが、各分子は、SI-1X1、SI-1X2、SI-1X5及びSI-1X6と同じαHer3結合ドメインを使用しているため、予想通り、各々は、Her3を結合する能力を有する。SI-1X3及びSI-1X4は、下記ELISAにおいて二量体EGFR結合に関して調査する。

【0043】

実施例4:二量体EGFR ELISAアッセイ
以前観察したように、SI-1X3及びSI-1X4は、BLIアッセイにおいてEGFRのモノマー形態を結合することができなかった(図9)。このことは、SI-1C5、SI-1X3及びSI-1X4において使用するαEGFR結合ドメインがインビトロでEGFRに結合するために、二価結合が必要であることを示唆している(Perez et al, Chin Clin Oncol 2014;3(1):5)。このことを観察するために、我々は、EGFRの二量体形態を使用して、他のEGFR結合抗体に対する抗体結合に関してELISAを用いた。

【0044】

ELISAは、組織内で作成したラビットFcに融合した、二量体EGFR ECD試薬であるSI-2C1を使用して実行した。EGFRを、Maxisorp免疫プレート(Nunc)上に3μg/mL(PBS)でコートし4℃で一晩置いた。プレートを、3%BSA及び0.05%Tween20含有PBSにて室温で2時間ブロックした。抗体は、SI-1C5、SI-1X3及びSI-1X4を除いて10ug/mLで捕獲し、SI-1C5、SI-1X3及びSI-1X4は、50μg/mLで捕獲した(nMで報告している)。全ては、室温で1時間、PBST(1%BSA)で3倍希釈している。ヤギαヒトIgG-HRP抗体(Jackson ImmunoResearch, 109-035-098)を使用して、PBST(1%BSA)での1:2000希釈にて抗体のFc部分を検出し、TMB(Thermo Scientific)にて5分間進めて、停止液として2MのH2S04を用いた。PBST(1%BSA)用いた3回の洗浄を、各ステップの間に実行した。全データポイントは、同じものを３つ用いて実行し、450nmで回収した(図10)。SI-1C5、SI-1X3及びSI-1X4の全ては、他の分子と比較して、このELISAフォーマットにおいて高濃度で二量体EGFR ECDに結合した。

【0045】

実施例5:Octetを用いた1C5.2及び1X4.2の結合カイネティクス
カイネティクスは、抗ヒトFcセンサー(ForteBio、AHC #18-5060)を用いたForteBio Octet Red96機器を使用して決定した。結合実験は、1000RPMでの混合にて30℃で実行した。EGFRタンパク質は、C末端ポリヒスチジンタグを有するヒトEGFRの細胞外ドメイン(Met1-Ser645)である。全てのサンプルは、10Xカイネティクス緩衝液(ForteBio #18-5032)にて希釈した。1C5.2、1X6及び1X4.2をそれぞれ8つのセンサー上に300秒間10μg/mlでロードして、次に、10Xカイネティクス緩衝液での60秒間をベースラインとした。EGFRタンパク質との会合を、単一濃度(300、100、33.33、11.11、3.705、1.235、0.4116及び0nM)のEGFRタンパク質にて各センサーを用いて300秒間実行した。次に、解離を、10Xカイネティクス緩衝液において900秒間実行した。1C5.2及び1X4.2に関する典型的な会合及び解離トレースを図11に示している。

【0046】

ForteBio Data Analysis Software v9.0を使用してデータ分析を実行した。ソフトウェア曲線のあてはめを実行して、1C5.2(表2)、1X4.2(表3)及び1X6(表4)の4つの最適曲線あてはめを用いて平均値を出し、KD、k(on)及びk(dis)を決定した。SI-1C5.2及びSI-1X4.2の平均KDは、それぞれ19.2nM及び18.4nMであった。SI-1C6に関する平均KDは、3.04nMであった。1C5.2及び1X4.2は、実施例1にて説明したように、1C5及び1X4と比較して、5つのアミノ酸変化を含んでいた。これらの変化は、図10の1C5及び1X4で得られたデータと比較すると、EGFR ECDに対する改良された結合性を占めた。

【表2】

【表3】

【表4】

【0047】

実施例6:腫瘍細胞株に対する例示的な二重特異性抗体の結合試験
二重特異性抗体SI-1X1、SI-1X2、SI-1X3、SI-1X4、SI-1X5及びSI-1X6並びアイソタイプコントロールは、フローサイトメトリーによって、腫瘍細胞株であるA431(扁平上皮がん、ATCC CRL-1555)及びBxPC3(膵臓腺がん、ATCC CRL-1687)に対する結合について試験した。細胞を、10%ウシ胎児血清含有RPMI-1640において生育させ、指数増殖期にある間に分析のために回収した。5×106個の細胞のアリコートをPBSで一回洗浄して、次に、250μlのPBS+1%ウシ血清アルブミン(BSA)で再懸濁し、非特異的結合から膜をブロックするために4℃で15分間インキュベートした。PBS/1%BSAにて10μg/mlに希釈した250μlの抗体を5μg/mlの最終的な抗体濃度となるように各サンプルに加えた。細胞を一次抗体と混合しながら4℃で1時間インキュベートした。次に細胞を1mlのPBS/1%BSAにて二回洗浄して、500μlのPE共役マウス-抗ヒトIgG-Fcに再懸濁し、混合しながら4℃で45分間インキュベートした。サンプルを再び1mlのPBS/1%BSAにて二回洗浄して、300mlのPBSに再懸濁し、FACScaliburフローサイトメーターを使用して分析した。サンプルごとに、10000イベントをFL-2チャネルにて回収した。ヒストグラムを、FCSExpressソフトウェアを使用して作成し、SI-1Xヒストグラムは、アイソタイプコントロール染色由来のヒストグラムと重ねた。全6つの二重特異性抗体は、コントロール染色に対するヒストグラムシフトを示し、細胞結合を示した。このデータは、図12(A431細胞結合)及び図13(BxPC3細胞結合)に示している。

【0048】

実施例7:細胞結合アッセイによるSI-1C5.2及びSI-1X4.2の特性評価
二重特異性抗体であるSI-1X4.2、一重特異性抗体であるSI-1C5.2及びSI-1C1並びにアイソタイプコントロールは、フローサイトメトリーによって、腫瘍細胞株であるA431(扁平上皮がん、ATCC CRL-1555)(図14)及びFaDu(低咽頭扁平上皮癌腫、ATCC HTB-43)(図15)に対する結合について試験した。細胞を10%ウシ胎児血清含有RPMI-1640培地において生育させ、指数増殖期にある間に分析のために回収した。細胞を、PBSで一回洗浄して、次に、5x106個/mlの細胞の濃度でPBS+5%ウシ胎児血清アルブミン(FBS)に再懸濁し、4℃で15分間インキュベートして非特異的結合から膜をブロックした。100μlの細胞アリコートを96ウェルプレートにある100μlの抗体アリコート(また、PBS+5%FBSで希釈したもの)に加えた。サンプルを一次抗体と共に氷上で45分間インキュベートした。次に、細胞を200μlのPBS+5%FBSにて二回洗浄し、そして、100μlのPE共役マウス-抗ヒトIgG-Fcに再懸濁し、30分間氷上でインキュベートした。サンプルを再び200μlのPBS+5%FBSにて二回洗浄し、200μlのPBSに再懸濁し、FACScaliburフローサイトメーターを使用して分析した。サンプルごとに、10000イベントをFL-2チャネルにて回収した。ヒストグラムを、FCSExpressソフトウェアを使用して分析し、幾何平均蛍光強度(GMFI)をデータセットごとに決定した。EC50結合値は、Graphpad Prismソフトウェアを用いて、GMFI対抗体濃度をプロットすることによって決定した。二重特異性抗体であるSI-1X4.2は、一重特異性抗EGFR抗体であるSI-1C5.2と類似の結合プロファイルを、両細胞株において類似のEC50として示した。他の一重特異性抗Her3抗体であるSI-1C1は、細胞表面上のHer3の低発現レベルに起因して、おそらく2つの細胞株に弱く結合する。1C5.2及び1X4.2は、実施例1にて説明したように、1C5及び1X4と比較して、5つのアミノ酸変化を含んでいた。これらの変化は、親分子である1X4と比較すると、標的細胞に対する結合が向上していることを示している。

【0049】

実施例8:腫瘍細胞株に対しうるSI-1X抗体の抗増殖効果
抗Her3/EGFR二重特異性抗体の潜在的な増殖阻害性を評価するために、扁平上皮がん腫瘍系統であるA431細胞(ATCC CRL-1555, Manassas, Va.)の増殖に対する効果を試験した。膵臓腺がん腫瘍系統であるBxPC3の増殖に対する効果(ATCC CRL-1687, Manassas, Va.)も試験した。株ごとに、細胞を、100μlの1%ウシ胎児血清含有RPMI-1640培地にて6000細胞/ウェルの密度で96ウェル組織培養プレートに播種した。4時間後、試験抗体を0.0015nMから100nMにわたる様々な濃度で加えた。細胞を試験抗体の存在下で72時間培養した。各ウェルに、20μlのMTS試薬(Promega, Madison, WI)を加えて、細胞を37℃で2時間インキュベートした。MTSは、活発に増殖している細胞によって容易に取り込まれて、(490nmで容易に光を吸収する)ホルマザンへと還元され、培地に分泌される。インキュベーション後、OD490値は、BioTek(Winooski、VT)ELx800吸光度計を使用して測定した。(培地だけで処理された)コントロール細胞のOD490値も、代謝活性のベースラインを定めるために抗体追加時にこの方法で取得した。増殖は、72時間のOD490からコントロールベースラインのOD490を減算することによって算出することができる。抗体力価測定からのデータは、以下の式によってコントロール集団%で表した:コントロール増殖%=(試験増殖/コントロール増殖)*100。

【0050】

A431細胞増殖に対する様々な二重特異性抗Her3/抗EGFR抗体の効果を図16及び図17に示している。SI-1X2は、コントロール抗体であるSI-1C1(抗Her3)、SI-1C3(抗EGFR)又は共にアプライしたSI-1C1及びSI-1C3よりも効果的な抗増殖効果を示した。SI-1X1は、抗増殖効果を示した。但し、その程度は、SI-1C3及びSI-1C1とSI-1C3との組み合わせでみられるほどではない。図17は、阻害プロットとIC50値を示している。同様の結果が、SI-1X5及びSI-1X6において観察された。SI-1X6は、SI-1X5及びコントロール抗体SI-1C1(抗Her3)よりも強力であるが、それは、コントロール抗体SI-1C6(抗EGFR)及びSI-1C1とSI-1C6との組み合わせに類似する潜在的な抗増殖効果を示した。これは、図17のIC50値と共に見ることができる。

【0051】

これらの分子は、BxPC3細胞株の抗増殖効果についても試験した(図18及び図19)。また、SI-1X2は、コントロール抗体であるSI-1C1(抗Her3)、SI-1C3(抗EGFR)又は共にアプライしたSI-1C1及びSI-1C3よりも効果的な抗増殖効果を示した。SI-1X1は、SI-1C1よりも効果的であったが、SI-1C3及びSI-1C1とSI-1C3との組み合わせよりも弱かった。阻害曲線及びIC50値を図19に示している。SI-1X5とSI-1X6の両方とも、コントロール抗体SI-1C1(抗Her3)、SI-1C6(抗EGFR)又はSI-1C1とSI-1C6との組み合わせよりもBxPC3増殖を強く阻害した。このデータは、IC50値と共に図19に示している。

【0052】

実施例9:腫瘍細胞株に対するSI-1C5.2及びSI-1X4.2の抗増殖効果
抗Her3/EGFR二重特異性抗体の潜在的な増殖阻害性を評価するために、FaDu(鼻咽頭扁平上皮癌腫株、ATCC HTB-43)、及びA431(扁平上皮癌腫、ATCC CRL-1555)細胞の増殖に対する効果を試験した。細胞を、100μlの1%ウシ胎児血清含有RPMI-1640培地にて6000細胞/ウェルの密度で96ウェル組織培養プレートに播種した。4時間後、試験抗体を0.0015nMから100nMにわたる様々な濃度で加えた。細胞を試験抗体の存在下で72時間培養した。各ウェルに、11μlのアラマーブルー試薬(Thermo Scientific)を加えて、細胞を37℃で2時間インキュベートした。アラマーブルーは、活発に増殖している細胞に容易に取り込まれて、還元され、培地に分泌される。アラマーブルーの還元型は、強い蛍光性がある。インキュベーションの後、蛍光は、Molecular Devices(Sunnyvale, CA) FilterMax F5マルチモードプレートリーダーを使用し、535nmの励起波長及び595nmの放出波長で測定した。(培地だけで処理された)コントロール細胞の蛍光も、代謝活性のベースラインを定めるために抗体追加時にこの方法で取得した。増殖は、72時間の蛍光からコントロールベースラインの蛍光を減算することによって算出することができる。抗体力価測定からのデータは、以下の式によってコントロール集団%で表した: コントロール増殖%=(試験増殖/コントロール増殖)*100。

【0053】

Fadu及びA431細胞増殖に対するSI-1C5.2及びSI-1X4.2の効果は、それぞれ、図20及び図21に示している。両細胞株において、SI-1X4.2は、コントロール抗体、SI-1C5.2(抗EGFRマブ)、SI-1C1(抗Her3マブ)又は共にアプライしたSI-1C1及びSI-1C7よりも改良された効果的な抗増殖効果を示した。

【0054】

実施例10:SI-1X二重特異性抗体のADCC活性
いくつかの腫瘍細胞株に対する細胞傷害活性を媒介するSI-1X抗体の能力を試験した。通常の健常なボランティアから全血を取得した。血液を等量のリン酸緩衝食塩水(PBS)で希釈した。希釈した血液の20mlアリコートを、15mlのFicol Pacque PLUSの上に慎重に重層した(GE Life Sciences cat# 17-1440-02; Pittsburgh, PA)。チューブを、40分間、300gでブレーキをかけることなく遠心した。遠心後、ほとんどのプラズマ層を慎重に吸引し、(PBMCを含む)バフィーコートをピペットにて慎重に可能な限り取り除いた。PBMCを50mlのチューブに貯めて、50mlまでPBSを各チューブに加えた。チューブを1300RPMで10分間遠心して、上清を慎重に吸引した。細胞を40mlのPBSに再懸濁して、再び遠心した。このプロセスは、合計2回の洗浄液のために繰り返した。最終的な洗浄後、細胞を30mlのRPMI-1630+10%FBSに再懸濁して、37℃、5%CO2で一晩インキュベートした。

【0055】

試験標的細胞は、頭頸部扁平上皮癌腫株、FaDu(ATCC HTB-43、Manassus、VA)及び非小細胞肺腺がん細胞株(NCI-H1975)(ATCC CRL-5908, Manassus, VA)とした。標的細胞は、以下の通り、カルセインでラベル化した。細胞を、単層として生育して、アクターゼを用いてのインキュベーションによって分離した。細胞を、血清なしのRPMIにて二回洗浄した。4x106細胞/mlである1mlの細胞を、1mlのRPMI(血清なし)+20μMカルセインAM(Sigma cat# C1359; St. Louis, MO)と混合した。細胞を、10分ごとに穏やかに混合しながら、37℃で30分間インキュベートした。ラベル化後、細胞を14mlRPMI+10%FBS+2.5mMプロベネシド(アッセイ培地)を用いて二回洗浄した。プロベネシド(Sigma cat# P8761; St. Louis, MO)は、アニオン性輸送体阻害剤であり、細胞内カルセインの自然放出を減らすことが知られている。細胞を20mlのアッセイ培地にて再懸濁し、37℃、5%CO2で2時間回復させた。次に、細胞をアッセイ培地にて一回洗浄して、200,000細胞/mlまで希釈した。カルセインラベル化細胞の50μlアリコート(10,000個の細胞)を96ウェル丸底プレートに等分した。(3X終濃度での)50μlの抗体を細胞に加えて、氷上で40分間結合させた。前の日のPBMCを300gで5分間遠心して、20mlの新しいアッセイ培地に再懸濁し、計数した後、6x106細胞/mlとなるように希釈した。50μlのPBMC(300,000)を各ウェルに加えて、プレートを37℃、5%CO2で4時間インキュベートした。各抗体を、50nMから0.00005nMまでの10倍の段階希釈を介して、同じものを３つ用いて滴定した。カルセインの最大及び自然放出を測定するために、コントロールウェルは、抗体非存在下のラベル化標的細胞及びエフェクター細胞を含むようにセットアップした。

【0056】

4時間のインキュベーション後、8%IGEPAL CA-630(Sigma cat# I8896; St. Louis, MO)を含む50μlのアッセイ培地を(最大カルセイン放出を測定するために)ラベル化標的細胞のみを含むコントロールウェルに加えた。50μlのアッセイ培地を、全量が200μl/ウェルになるように全ての他のウェルに加えた。プレートを2000RPMで10分間遠心して、150μlの上清をV型底部の９６ウェルプレートに慎重に移した。これらのプレートを更に10分間、2000RPMで遠心して、100mlの上清を黒色クリア底部９６ウェルプレートに慎重に移した。上清のカルセインを、485nMの励起波長及び535nMの放出波長を使用して、各サンプルの蛍光を測定することによって数量化した。特異的溶解のパーセントは、以下の通りに算出した:
特異的溶解%=[(試験サンプル値=自然放出)/(最大放出=自然放出)*100

【0057】

データを図22及び図23に示している。両細胞株に関して、SI-1X6.4は、細胞傷害活性を媒介したが、コントロール抗体、SI-1C6.2、SI-1C7又はSI-1C6.2+SI-1C7の組み合わせよりも特に効果的であるというわけではなかった。SI-1X6.4は、我々のベンチマーク抗体であるSI-1C4よりもEC50が低い細胞傷害活性を媒介した。両細胞株に関して、SI-1X4.2は、コントロール抗体とほぼ同じ程度で細胞傷害活性を媒介した。しかしながら、ベンチマークであるSI-1C4ほど、細胞傷害活性の媒介が効果的ではなかった。これは、SI-1X4.2よりも低い親和性に起因するものと思われる。

【0058】

実施例11:SI-1X二重特異性抗体の温度安定性
Protein Thermal Shift Studyをタンパク質熱安定性分析のために実行した。タンパク質溶融反応は、Protein Thermal Shift BufferTM及びProtein Thermal Shift DyeTM(Applied Biosystems)を用いてセットアップした。簡潔に言えば、20ulの反応混合物が5ugのタンパク質、5ulのProtein Thermal Shift BufferTM及び8Xになるよう希釈した2.5μのProtein Thermal ShiftTM Dyeを含むようにする。ネガティブコントロールについては、PBSを代わりに用いた。反応混合物をMicroAmp Optical Reaction Plateに加えて、MicroAmp Optical Adhesive Filmによって封止した。各サンプルは、同じものが4つ一組になるようにした。タンパク質溶融反応は、25-90℃を1%増加するApplied Biosystem Real-Time PCR Systemにて実行し、Protein Thermal Shift SoftwareTMによって分析した。図24は、SI-1X2、SI-1X4.2、SI-1X6.4、SI-1C3、SI-1C3、SI-1C6.2、SI-1C5.2及びSI-1C7の温度曲線を示している。表5は、これらの分子のTmを示している。Tmは、タンパク質の50%がアンフォールドするのに必要な温度と定義している。二重特異性分子である1X2、1X4.2及び1X6の全ては、MAb(1C3、1C6.2、1C5.2)及びFc-scFv(1C7)分子の全てと同様に66℃付近にTmを有する。

【表5】

【0059】

実施例12:SI-1X二重特異性抗体の血清安定性分子
SI-1C5.2、SI-1C6.2、SI-1X4.2及びSI-1X6.4の血清安定性は、37℃での0、3及び7日目の時点と、分解が生じることが既知の条件である55℃での7日目の追加の時点において、95%ヒト血清(Atlanta Biologics, S40110)における100μg/mLでのインキュベーション後、ELISAによるモノマーEGFR ECD対する結合比較によって決定した。4℃で一晩、ELISAプレートを、PBS中で3μg/mLのモノマーEGFR ECD(SI-2R4)でコートした。コートしたELISAプレートを、25℃で2時間、3%BSA PBSTによってブロックし、PBSTを用いて3回洗浄した。SI-1C6.2及びSI-1X6.4を、1%BSA PBSTにて1:10となるように希釈して、プレート全体が4xとなるように希釈した。SI-1C5.2及びSI-1X4.2を、1%BSA PBSTにて1:2となるように希釈して、プレート全体が4xとなるように希釈し、25℃で1時間インキュベートした。25℃で1時間、1%BSA PBST中で1μg/mLのHer3 ECDラビットIgG1(SI-1R1)を用いた抗原捕獲の前に、PBST用いた3回以上の洗浄を実行した。ヤギ抗ラビットIgG-HRP(Bio-Rad 172-1019)二次抗体を25℃で1時間1%BSA PBSTでの1:5000希釈で加える前に、PBSTを用いた3回以上の洗浄を実行した。100μlのPierce1-ステップUltra TMB ELISA(Pierce, 34028)で、10分間、100μlの2M H2S04で最終的にクエンチする前に、最後にPBSTを用いた3回の洗浄を行なう。プレートを450nmで読み取った。ELISAデータをプロットして、GraphPad Prism 6を使用して曲線を作成した。

【0060】

ELISAの結果は、図25にEC50として報告しており、37℃で保持した際の小さい分解の好ましいプロファイルを示している。55℃の場合、分子が分解条件に当てはまるとEC50はほぼ対数シフトする。SI-1C5.2のEC50値は、37℃で0日目の589.7pMから7日目の755.2pMにシフト(Δ165.5pM)し、55℃で7日目の6.522nMにシフト(Δ5932.3pM)する。SI-1C6のEC50値は、37℃で0日目の218.2pMから7日目の226.6pMにシフト(Δ8.4pM)し、55℃で7日目の1.322nMにシフト(Δ1103pM)する。SI-1X4.2のEC50値は、37℃で0日目の429.3pMから7日目の466.7pMにシフト(Δ37.4pM)し、55℃で7日目の4.248nMにシフト(Δ3818.7pM)する。SI-1X6のEC50値は、37℃で0日目の209.3pMから7日目の237.3pMにシフト(Δ28pM)し、55℃で7日目の4.112nMにシフト(Δ3902.7pM)する。

【0061】

実施例13:SI-1X分子のPK半減期
それらの半減期をインビボで試験するために、薬物動態実験をSDラットにおいて実行した。二重特異性抗体(1C6 10mg/kg、1X6 10mg/kg、1X2 10mg/kg、1X4 32mg/kg)の単一尾静脈注入を、体重(190-212gの範囲)によってランダムに分けた4匹の雌ラットのグループに行った。血液(〜150μL)を各時点で眼窩叢から採血し、血清を処理して、分析まで-80℃で保存した。調査期間は、28日とした。

【0062】

抗体濃度は、3つのELISAアッセイを使用して決定した。アッセイ1(EGFR ECDコートELISA)において、組換え型EGFR-ラビットFcをプレートにコートして、ウェルをPBST(0.05%Tween含有リン酸緩衝食塩水)にて洗浄し、1%BSA含有PBSTでブロックした。次に、血清又は血清希釈スタンダードを加えて、PBST洗浄を行い、HRPラベル化ラビット-抗-ヒトIgG(BOSTER)を追加して、PBST洗浄を更に行った。次にTMBを加えて、プレートを暗室で2.5分インキュベートした。呈色反応を2Mの硫酸の添加によって止めた。プレートを450nm波長で読み取った。アッセイ2(Her3コートELISA)において、血清を同様のELISAを用いて検出したが、組換え型HER3-Hisは、捕捉試薬として用いた。アッセイ3(サンドイッチELISA)において、組換えHER3-Hisをコートして、血清又は血清希釈スタンダードを追加し、PBST洗浄を行って、EGFR-ラビットFcを含むPBSTを追加し、PBST洗浄を更に行った。次に、HRPラベル化ヤギ-抗-ラビットIgG(BOSTER)を加えた。PKパラメーターを非コンパートメントモデルで決定した。

【0063】

図26-28は、それぞれ、3つの異なるアッセイを用いた4つの抗体の血清中濃度データを示している。インビボPK調査からの適したPKパラメーターを表6に挙げている。PKデータは、半減期、Cmax及びAUCを含む。半減期は、血清からの抗体の除去を特徴づけるベータフェーズを表す。Cmaxは、観察された最大血清中濃度を表す。AUCは、濃度時間曲線下の領域を表す。

【表6】

【0064】

実施例14:マウス異種移植調査
本実施例では、Faduの前臨床モデル(頭頸部扁平上皮癌腫異種移植片モデル)におけるHER3、EGFRの同時遮断に関するSI-1X2、SI-1X4.2及びSI-1X6の活性を試験し、それらの力価を抗HER3抗体と組み合わせたセツキシマブ及びセツキシマブと比較した。

【0065】

全マウス調査は、組織ガイドラインに従う、動物実験委員会が認可した動物プロトコールによって行った。6週齢の雌Balb/cヌードマウスは、ペキンバイタルリバーラボラトリーズから購入し、12時間の光サイクルで飲食自由なエアフィルター層流キャビネットに収容した。動物グループのサイズを計算して、検出力80%及びP値0.01にて25%の治療グループとプラセボグループとの間の平均差を測定した。異種移植片を有する宿主マウスをコントロールか治療グループにランダム且つ等しく分けた。動物実験は、制御された非盲検法にて実行した。細胞株由来異物移植調査について、マウス毎に150μｌの培地に懸濁された2X106個のFaduをマウスの皮下に注入した。

【0066】

腫瘍が100-250mm3の平均体積に達すると、マウスを9つのグループ(グループ当たり6匹のマウス)にランダムに分けた。ビヒクルコントロール、1C6(25mg/kg)、1C4(25mg/kg)、1C6+1C1(25mg/kg+50mg/kg)、SI-1X2(25mg/kg)、SI-1X6(10mg/kg)、SI-1X6(25mg/kg)及びSI-1X4.2(10mg/kg)、SI-1X4(25mg/kg)。全ての試験物質を、静脈内注入を介して週に一回投与した。腫瘍を全治療期間にわたり3日毎にデジタルノギスで測定し、体積を以下の式を用いて決定した:1/2×縦×横2。マウスの体重を、最初の投与前と、治療期間及び回復期間の間毎週記録を付けた。

【0067】

SI-1X2、SI-1X6及びSI-1X4.2とSI-1X6との組み合わせの全ての試験グループは、低用量SI-1X4.2 10mg/kgのグループを除いて、SI-1C6のポジティブコントロールと比較して著しく腫瘍成長を阻害した(図29-30)。さらに、低用量SI-1X4.2 10mg/kgのグループを除いて、治療停止の2週後に再発が観察されなかった。

【0068】

医薬組成物
「有効量」という用語は、例えば、対象における疾患を改善するために所望の効果を成し遂げる効果的な薬量を指す。疾患ががんである場合、有効量の薬は、限定するものではないが、がん細胞の成長、がん細胞の増殖、がん細胞の運動性、末梢器官へのがん細胞の浸潤、腫瘍転移及び腫瘍成長を含む一又は複数の特徴を阻害する(例えば、ある程度遅延させる、阻害するか又は止める)ことができる。あるいは、疾患ががんの場合、有効量の薬は、対象に投与されると、腫瘍成長を遅延又は止めること、腫瘍サイズ(例えば、体積又は質量)を低下させること、がんと関連した1又は複数の症状をある程度緩和すること、無増悪生存期間を延長すること、(例えば、部分的反応又は完全反応を含む)客観的反応が得られること、全生存期間を長くすることの1又は複数を成し遂げることができる。薬は、存在しているがん細胞の成長を防止する及び/又は殺すことができる適度に、細胞増殖抑制性で及び/又は細胞毒性である。

【0069】

対象(例えば治療を必要とするヒト患者)への投与のための適切な組成物の製剤に関して、本願明細書に開示される抗体は、選択した投与ルートに従って、従来技術で知られている医薬的に許容可能なキャリアと共に混合又は組み合わせてもよい。本願明細書に開示される抗体の応用形態については特段の制限が存在しない。そして、適切な投与ルート及び適切な組成物の選択は、過度の実験を行なうことなく、従来技術において知られている。

【0070】

多くの投与形態が可能であるが、例示的な投与形態は、特に静脈内又は動脈内注入に関する溶液注入である。通常、注入のための適切な医薬組成物としては、医薬的に適切なキャリア又は賦形剤(例えば、限定するものではないが、緩衝液、界面活性剤又は安定剤)を挙げることができる。例示的な緩衝液としては、限定するものではないが、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液又はクエン酸緩衝液を挙げることができる。例示的な界面活性剤としては、限定するものではないが、ポリソルベートを挙げることができる。例示的な安定剤は、限定するものではないが、ヒトアルブミンを挙げることができる。

【0071】

同様に、当業者は、状態(例えばがん)を効果的に治療する本願に開示の抗体の有効量又は濃度を決定する能力を有する。当業者は、過度に実験することなく、他のパラメーター(例えば医薬組成物の様々な成分の割合、投与量及び頻度)を得ることができる。例えば、注入に適切な溶液としては、限定するものではないが、約1から約20、約1〜約10mg抗体/mlを挙げることができる。例示的な用量としては、限定するものではないが、約0.1から約20、約1から約5mg/Kg体重を挙げることができる。例示的な投与頻度としては、限定するものではないが、1日1回又は週3回を挙げることができる。

【0072】

本開示は、特定の実施形態又は実施例に関して記載しているが、実施形態は、解説のためであり、本開示の範囲を制限するものではないことを理解できるだろう。本開示の別の実施形態は、本開示に関係する当業者にとって明白であろう。かかる別の実施形態は、本開示の範囲内に含まれると考える。従って、本開示の範囲は、添付された特許請求の範囲によって規定され、上述の記述によってサポートされる。

【図1】