特開 2021-129558 グルタチオンとアルデヒド脱水素酵素を生産するサッカロマイセス・セレビシエＫｗｏｎ Ｐ１、２、３

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2021-129558(P2021-129558A)

(43)【公開日】2021年9月9日

(54)【発明の名称】グルタチオンとアルデヒド脱水素酵素を生産するサッカロマイセス・セレビシエＫｗｏｎ Ｐ１、２、３

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/16 20060101AFI20210813BHJP

   C12N 9/02 20060101ALI20210813BHJP

   C12P 21/00 20060101ALI20210813BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/16 Z

   C12N9/02

   C12P21/00 G

【審査請求】未請求

【請求項の数】7

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2021-22552(P2021-22552)

(22)【出願日】2021年2月16日

(31)【優先権主張番号】10-2020-0019858

(32)【優先日】2020年2月18日

(33)【優先権主張国】KR

(71)【出願人】

【識別番号】521069652

【氏名又は名称】ピコエンテック シーオー．，エルティーディー．

【氏名又は名称原語表記】ＰＩＣＯＥＮＴＥＣＨ Ｃｏ．，ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】100188798

【弁理士】

【氏名又は名称】土田 幸広

(72)【発明者】

【氏名】權 興澤

【テーマコード（参考）】

4B050

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B050CC03

4B050DD04

4B050LL01

4B050LL02

4B050LL03

4B064AG01

4B064DA01

4B064DA10

4B064DA13

4B065AA80X

4B065AC14

4B065BA24

4B065CA24

4B065CA28

4B065CA41

4B065CA44

4B065CA46

(57)【要約】

【課題】野生のサッカロマイセス・セレビシエ酵母を突然変異させて、グルタチオンとアルデヒド脱水素酵素の同時生産能力を増加させる突然変異方法を提供する。
【解決手段】
本発明は、グルタチオン（ＧＳＨ）とアルデヒド脱水素酵素（Ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を生産する酵母菌株に関する。より具体的には、本発明は、グルタチオンとアルデヒド脱水素酵素を同時に生産するサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｋｗｏｎ Ｐ−１ ＫＣＴＣ１３９２５ＢＰ）とサッカロマイセスセレビシエＫｗｏｎ Ｐ−２ ＫＣＴＣ１４１２２ＢＰ、及びサッカロマイセスセレビシエＫｗｏｎ Ｐ−３ ＫＣＴＣ１４１２３ＢＰの酵母菌株に関する。
【選択図】図６

【特許請求の範囲】

【請求項1】

サッカロマイセス・セレビシエＫｗｏｎ Ｐ−１ ＫＣＴＣ１３９２５ＢＰ。

【請求項2】

サッカロマイセス・セレビシエＫｗｏｎ Ｐ−２ ＫＣＴＣ１４１２２ＢＰ。

【請求項3】

サッカロマイセス・セレビシエＫｗｏｎ Ｐ−3 ＫＣＴＣ１４１２3ＢＰ。

【請求項4】

サッカロマイセス・セレビシエ酵母にエチルメタンスルホネート（Ｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）又はニトロソグアニジン（ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）を処理して突然変異を誘導し、メチルグリオキサール適応酵母を選別し、グルタチオンの生産能力が向上した突然変異酵母を製造する方法。

【請求項5】

サッカロマイセス・セレビシエ酵母にエチルメタンスルホネート又はニトロソグアニジンを処理して突然変異を誘導し、リシン適応酵母を選別して、アルデヒド脱水素酵素の生産能力が向上した突然変異酵母を製造する方法。

【請求項6】

サッカロマイセス・セレビシエ酵母を培養し、グルタチオンとアルデヒド脱水素酵素を同時に生産する方法。

【請求項7】

前記サッカロマイセス・セレビシエ酵母がサッカロマイセス・セレビシエＫｗｏｎ Ｐ−１ ＫＣＴＣ１３９２５ＢＰとサッカロマイセス・セレビシエＫｗｏｎ Ｐ−２ ＫＣＴＣ１４１２２ＢＰ、及びサッカロマイセス・セレビシエＫｗｏｎ Ｐ−3 ＫＣＴＣ１４１２3ＢＰからなる群から選択されるいずれか、又はこれらの混合酵母である、請求項６に記載のグルタチオンとアルデヒド脱水素酵素の同時生産方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、グルタチオン（ＧＳＨ）とアルデヒド脱水素酵素（ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を生産する酵母菌株に関する。より具体的には、本発明は、グルタチオンとアルデヒド脱水素酵素を同時に生産するサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｋｗｏｎ Ｐ−１ ＫＣＴＣ１３９２５ＢＰ）とサッカロマイセス・セレビシエＫｗｏｎ Ｐ−２ ＫＣＴＣ１４１２２ＢＰ、及びサッカロマイセス・セレビシエＫｗｏｎ Ｐ−３ ＫＣＴＣ１４１２３ＢＰの酵母菌株に関する。

【背景技術】

【0002】

グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ，γ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅ，ＧＳＨ）は、細胞内に存在する生理活性物質としてグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎ）、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）の三つのアミノ酸で構成されたトリペプチドであって、動物、植物、及び微生物の細胞内で０．１〜１０ｍＭの濃度で存在し、細胞の総非タンパク質性活成分の９０％以上を占めている。

【0003】

生体内においてグルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）は白血球の生成を通じた免疫活性の増加を引き起こすことにより、重要な抗ウイルス剤の役割をするものと知られており、ＧＳＴ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の基質として作用し、生体に有害な非生体物質（ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃｓ）のような毒性物質をコンジュゲーション（Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）の形態で結合し、解毒作用に重要な役割をする。

【0004】

また、グルタチオンは、細胞内において酸化作用で細胞膜、核酸と細胞構造を損傷させて壊死させることを防ぎ、老化の原因である活性酸素種（Ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＯＳ）の毒性を緩和させてくれる役割をする。このときの活性酸素種は、様々な生体物質の代謝作用で形成され、 スーパーオキシド（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ）、過酸化物（ｐｅｒｏｘｉｄｅ）、ヒドロキシルラジカル（ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌ）等が含まれ、物質の生体代謝産物として生成される内因性活性酸素種や、タバコ、放射能等の外因性活性酸素種に区分できる。

【0005】

活性酸素種に起因した酸化的ストレスは、認知機能に損傷を与え得（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．２００２）、精子のＤＮＡを破壊して男性不妊の原因となり（Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．２０１４）、細胞タンパク質、脂質、及び核酸を損傷させて癌を誘発し得、生理的機能を低下させて各種疾病や老化の原因因子として作用する。従って、私たちの体は、疾病予防、免疫強化、老化防止などの役割をする抗酸化剤が非常に重要であり、細胞内で抗酸化の役割をするグルタチオンの機能は、酵素学、薬物学、治療、毒物学、内分泌学および微生物学を含む多くの医学分野で注目されている。

【0006】

このようなグルタチオンは、基本的に体内で合成されるが、疾病発生、免疫力弱化、老化など異常な状態が進行されるほど人体内の絶対的含量が少なくなり、健康を悪化させる。従って、外部から供給されるグルタチオンは、細胞内の活性酸素種を除去して健康を維持し、老化を遅らせることができる。

【0007】

このようなグルタチオンの人体内の生理活性要因により、現在グルタチオンは、食品、化粧品、飼料、及び医薬品の用途として使用されており、ますます使用量が増加している傾向にある。

【0008】

一方、グルタチオンの生産は、現在食用可能な微生物を用いて生産するが、微生物が生産し得るグルタチオン固有の含量は非常に低いため、突然変異及び組換え技術で微生物のグルタチオンの含量を増大させて、これを利用した発酵技法により高含量グルタチオンの生産菌株として大量に生産する研究が活発に進められている。

【0009】

従って、グルタチオン高含量菌株の開発は、経済的価値を高める根本的な素材を開発するものであって、グルタチオンを健康食品、医薬品、飼料など広範囲に使用できるようにする市場競合力を持たせるようにする。しかしながら、遺伝子組換え技術による菌株の開発は、現在イシューになっているＧＭＯ議論から自由になれないため、その使用範囲が制限されるが、突然変異技術による菌株の育種は、使用に制限がなく、様々な用途として広範囲に使用できる。従って、突然変異技術を利用した高含量のグルタチオン生産菌株の育種は、非常に必要な技術である。

【0010】

一方、韓国は経済成長と共に、飲酒に使用するアルコールの消費が急増しており、これによる国民健康の管理は重要なイシューであり、過度なアルコール摂取が国民の健康及び社会経済的な側面で大きな社会問題となっている。韓国の保健福祉部と疾病管理本部の調査結果によると、２０１６年基準の韓国内２０歳以上の成人の場合、月１回以上飲酒した割合が約７５％と報告されており、毎年その割合が増加している。のみならず、ＷＨＯの国別アルコール消費量の調査結果、２０１６年基準満１５歳以上の韓国国民のアルコールの消費量は、１人当たり平均１１．９Ｌで、世界のアルコールの平均消費量よりも４．８Ｌ高いレベルであって、飲酒量の消費は世界１７位に該当し、西太平洋地域の国では１位を記録した。

【0011】

特に、韓国国民のうち、アルコール摂取により生成される体内のアルデヒド（Ａｌｄｅｈｙｄｅ）の過量残存は、 心血管系疾患、糖尿、神経退行性疾患、上部消化及び呼吸器がん、放射線皮膚炎、ファンコーニ貧血、末梢神経損傷、炎症、骨粗しょう症や老化のような酸化作用に起因した疾病をもたらすと報告されている（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１４）。

【0012】

また、飲酒による社会経済的な損失規模が大半の国でＧＤＰ比約０．５−２．７％に至ることが報告されており、韓国の場合、２０００年一年飲酒による社会経済コストが１４条９，３５２億ウォンと推定されており、その中で、疾病、事故、二日酔いによる生産性の減少や損失額が６兆２，８４５億ウォンと推定されるという報告がある（チョン・ウジンｅｔ ａｌ．２００６）。

【0013】

このような社会的問題を解決するために、エタノールの毒性を軽減させたり、毒性の発現を阻害することができる多くの物質に対する研究や実験が進められており、その結果物は様々な健康補助食品に関する製品として開発されている。体内に流入したアルコールは、胃腸又は小腸で吸収され、血管内に入って肝臓へ移されて、分解されて解毒される。

【0014】

肝細胞に存在するアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ、Ａｌｃｏｈｏｌ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）がアルコールを先にアセトアルデヒド（Ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ）に酸化させると、アルデヒドは再度肝細胞にあるアルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ、ＡＬｄｅｈｙｄｅ ＤｅＨｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）により酢酸塩（Ａｃｅｔａｔｅ）に分解されて、全身の筋肉や脂肪組織に移されて、最終的には炭酸ガスと水に分解される。エタノールの最初の代謝産物であるアセトアルデヒドは、エタノールに比べて反応性が非常に高く、毒性が強いため、二日酔い及びアルコール性肝障害の主要原因になる。

【0015】

人が持っているアルデヒド脱水素酵素は、１９種類が報告されており（Ｍａｒｃｈｉｔｔｉ ｅｔ ａｌ．２００７、２００８）、この中で、ミトコンドリアに主に存在するアセトアルデヒド脱水素酵素（Ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２）は、酵素工学的に分析した結果、アセトアルデヒドを酵素の基質として分析したとき、他の種類のアルデヒドを基質として使用したときよりも、最も低いＫｍ値（〜０．２μＭ）をもって、アルコールに由来するアセトアルデヒドを最もよく酸化させて除去することが示された。

【0016】

生体内エタノールの代謝で生成された二日酔いの原因物質であるアセトアルデヒドを酢酸塩に最も効果的に切り換えることにより、アルデヒドを除去することは人体健康に非常に重要である（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９７７，Ｋｌｙｏｓｏｖ ｅｔ ａｌ．１９９６−１）。また、アセトアルデヒド脱水素酵素は、アセトアルデヒドだけでなく、脂肪族アルデヒド、芳香族アルデヒド、多環式アルデヒドのようなアルデヒドの代謝過程にも用いられて、体内の毒性物質を除去する（Ｋｌｙｏｓｏｖ ｅｔ ａｌ．１９９６−２）。

【0017】

代表的な例として、酸化的ストレス過程で発生する酸化アルデヒド物質である４−ヒドロキシ−２−ノネナール（４−ＨＮＥ）とマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）を除去し、タバコの煙や自動車のばい煙で発生するアクロレイン（ａｃｒｏｌｅｉｎ）を除去する役割をする（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１０，Ｙｏｖａｌ−Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ ａｌ．２０１２）。人体内のアセトアルデヒド脱水素酵素の酵素の発現が少ないか、この酵素の４８７番目のアミノ酸残基がグルタミン酸からリシンに変異された人は、顔が赤くなる紅潮現象を見せるなど、少ない量のアルコールにも敏感な反応を示すだけでなく、転換をすることができないため、飲酒時に血中アセトアルデヒドの濃度が高い（Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． １９８４）。

【0018】

特に、アセトアルデヒド脱水素酵素の同型接合体であるＡＬＤＨ２−２を有している場合、飲酒に弱いということが多くの研究を通じて知られており、このような遺伝的変異は、西洋人にはほぼ示されないが、韓国人、中国人、日本人には全人口の５０％で見つかっている（Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．２００９）。

【0019】

アルデヒド脱水素酵素に対する研究開発は、医療用の目的で体内のアルデヒド脱水素酵素の促進剤及び抑制剤に対する研究が活発に研究されることにより、アルデヒド脱水素酵素の重要性が強調されているが（Ｂｕｄａｓ ｅｔ ａｌ．２００９、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１４、Ｍ．ｚｅｌ ｅｔ ａｌ．２０１８）、アルデヒド脱水素酵素２の高含量微生物の育種や大量生産技術の開発に対する研究は、まだ足りないのが実情である。

【0020】

アルデヒド脱水素酵素２の高効率生産菌株の開発は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を宿主としたタンパク質発現システムを用いて、ヒト型アルデヒド脱水素酵素１と２のタンパク質を発現させて、このうち３０％のみが活性のある可溶性形態の酵素として発現し、単に２−４ｍｇ／Ｌのタンパク質を生産したと報告されており（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９３）、ラット（Ｒａｔ）のアルデヒド脱水素酵素２の場合、９５％が活性のある可溶性タンパク質として発現されたが、１−２ｍｇ／Ｌの非常に少ないタンパク質を生産したと報告されている（Ｊｅｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９１）。

【0021】

しかし、法的制限が小さく、活用が容易な突然変異方法を用いたアルデヒド脱水素酵素２の生産量を増加させた事例は報告されていない。従って、アルデヒド脱水素酵素２の使用範囲の拡大のために、突然変異方法による高活性のアルデヒド脱水素酵素２を有する微生物の開発が早急に要求される。

【0022】

一般に、微生物菌株から目的産物の生産性を増加させるための菌株の育種方法は、遺伝子組換え技術や突然変異技術等が多く使用されているが、遺伝子組換え技術による菌株改良の場合、法的制限要素が多く、適用範囲にも限界があり、突然変異の誘発方法は非常に有利である。

【0023】

菌株の改良のための突然変異誘発方法は、一般にＥｔｈｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＥＭＳ）又はＭｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ（ＮＴＧ）のような化学物質や紫外線（ＵＶ）等を用いて、菌株の遺伝子に突然変異を誘発させて特性を変化させた後、目的産物の生産に適した選択要素（Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）を加えて、所望の形質を適応（Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ）し、所望の突然変異体を誘導して選別できる。

【0024】

生体遺伝子は、グアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）とシトシン（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ）の遺伝子結合対は３重水素結合で、アデニン（Ａｄｅｎｉｎｅ）とチミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ）は２重水素結合で対をなしており、遺伝情報を保存している遺伝子の塩基配列は、３重、２重水素結合のため、必ずグアニンはシトシンと、アデニンとチミンと対になって構成されている。

【0025】

化学物質を突然変異の誘発源として使用する際には主に、化学的誘発剤であるＥＭＳやＮＴＧを使用する際にはグアニンをアルキル化してＯ−６−ｅｔｈｙｌ Ｇｕａｎｉｎｅを形成し、結果として３重結合を妨害し、最終のチミンと２重結合を形成することになり、この部分の遺伝子塩基対が変わり得るようになる。

【0026】

このように遺伝子塩基が変わった状態でＤＮＡ複製が生じると、チミン部分はアデニンと対をなして、グアニン、シトシン部分がアデニンチミンに置換（Ｎａｈａｆｉ ｅｔ ａｌ．２０１３）され、このようになると突然変異が生じる。

【0027】

また、適応による突然変異体の選抜は、メチルグリオキサール（Ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｏｘａｌ）は該当過程及びアミノアセトンの循環で合成された毒性物質としてグリオキサール還元酵素（Ｇｌｙｏｘａｌ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）により乳酸に転換されるが、このシステムにグルタチオンが助酵素として関与する性質を用いてグリオキサールを添加した培地を使用し、グルタチオンの生産性が高い菌株に誘導することになる。

【0028】

即ち、グルタチオンが足りないと、このシステムが作動されないため、敏感性が増加し、グルタチオンが過剰生産されると、抵抗性が増加し得る。結果として、グルタチオンの過剰生産菌株の選別のための選別要素として、メチルグリオキサールが使用できるようになる（Ｏｈｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．１９９０）（Ｈａｍａｄ ｅｔ ａｌ．２０１８）。

【0029】

アルデヒド脱水素酵素を多く生産する突然変異誘導体は、リシン（Ｌｙｃｉｎｅ）を培地に添加して選別できる。リシンは陰電荷の細菌膜と作用した後、細胞膜の構造を崩して菌体の成長を抑制させるだけでなく、また、細胞内部に透過後、核酸と作用してタンパク質合成を阻害機能することで、微生物の成長を抑制させる。

【0030】

従って、高濃度のリシンが含有された条件で育てる耐性菌株は、菌株のタンパク質の合成能力を増加させることができ、結果、アルデヒド脱水素酵素を過量に生産する菌株選別方法として使用できる。

【0031】

しかしながら、以上で見たように、人体内に溜まる様々な有害物質のうち、特に活性酸素種や様々なアルデヒド類のような化学物質を除去するためには、グルタチオンとアルデヒド脱水素酵素を同時に使用すると効率性が高いが、これまでの調査では、グルタチオンとアルデヒド脱水素酵素を同時に生産する菌株の開発は報告されていない。

【0032】

本発明では、アルデヒド脱水素酵素とグルタチオンを同時に高効率で生産できる菌株を１次化学突然変異方法を使用し、突然変異株を作り、２次選択要素（Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）適応（Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ）変異株を選抜して開発した。

【0033】

Ｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＥＭＳ）又はＭｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ（ＮＴＧ）を使用した化学的方法を１次使用し、２次選抜の際には、これまで試みられていないメチルグリオキサールとリシンの２つの適応試験でグルタチオンとアルデヒド脱水素酵素を同時に過量に生産株を最終選別した。

【0034】

グルタチオンとアルデヒド脱水素酵素を同時に過量生産する突然変異菌株は、食品、健康食品、飼料、化粧品、及び医薬用の使用に問題がないＧＲＡＳ（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ Ａｓ Ｓａｆｅ）と報告されており、既に生産効率は低いが、グルタチオンとアルデヒド脱水素酵素を全て生産する菌株として知られている野生のサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を選抜して使用した。

【0035】

このように突然変異を通じてグルタチオンの生産能力が増加し、同時にアルデヒド脱水素酵素の生産能力も増加した新しい改良菌株であるサッカロマイセス・セレビシエ属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｐ．）を確保することにより、本発明を完成するに至った。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0036】

【非特許文献1】Ｂｕｄａｓ，Ｇ．Ｒ．，Ｄｉｓａｔｎｉｋ， Ｍ． Ｈ．， ＆ Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．（２００９）．Ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２ ｉｎ ｃａｒｄｉａｃ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ：ａ ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ？．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９（５），１５８−１６４．

【0037】

【非特許文献2】Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｈ．，Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｊ．Ｃ．Ｂ．，Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．Ｒ．，＆ Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．（２０１４）．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２：ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ，９４（１），１−３４．

【0038】

【非特許文献3】Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，Ｃ．Ｊ．（１９７７）．Ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｖｉｖｏ ｄｕｒｉｎｇ ｅｔｈａｎｏｌ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｙ，８５，３１９−３４１．

【0039】

【非特許文献4】Ｈａｍａｄ，Ｇ．Ｍ．，Ｔａｈａ，Ｔ．Ｈ．，Ａｌｓｈｅｈｒｉ，Ａ．Ｍ．＆ Ｈａｆｅｚ，Ｅ．Ｅ．，（２０１８）．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｍｕｔａｔｅｄ Ｙｅａｓｔ Ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｉｔｓ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｓ Ｆｏｏｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ．Ｒｅｓ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３：２８−３６．

【0040】

【非特許文献5】Ｊｅｎｇ，Ｊ．，＆Ｗｅｉｎｅｒ，Ｈ．（１９９１）．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｏｆ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，２８９（１），２１４−２２２．

【0041】

【非特許文献6】Ｋｌｙｏｓｏｖ，Ａ．Ａ．，Ｒａｓｈｋｏｖｅｔｓｋｙ，Ｌ．Ｇ．，Ｔａｈｉｒ，Ｍ．Ｋ．，＆ Ｋｅｕｎｇ，Ｗ．Ｍ．（１９９６−１）．Ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ ｉｎ ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５（１４），４４４５−４４５６．

【0042】

【非特許文献7】Ｋｌｙｏｓｏｖ，Ａ．Ａ．（１９９６−２）．Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ ｔｏｗａｒｄ ａｌｉｐｈａｔｉｃ，ａｒｏｍａｔｉｃ，ａｎｄ ｆｕｓｅｄ ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ ａｌｄｅｈｙｄｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５（１４），４４５７−４４６７．

【0043】

【非特許文献8】Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｈｅａｄ，Ｅ．，Ｇｈａｒｉｂ，Ａ．Ｍ．，Ｙｕａｎ，Ｗ．，Ｉｎｇｅｒｓｏｌｌ，Ｒ．Ｔ．，Ｈａｇｅｎ，Ｔ．Ｍ．， ＆ Ａｍｅｓ，Ｂ． Ｎ．（２００２）．Ｍｅｍｏｒｙ ｌｏｓｓ ｉｎ ｏｌｄ ｒａｔｓ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｂｒａｉｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｅｃａｙ ａｎｄ ＲＮＡ／ＤＮＡ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ： Ｐａｒｔｉａｌ ｒｅｖｅｒｓａｌ ｂｙ ｆｅｅｄｉｎｇ ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ｃａｒｎｉｔｉｎｅ ａｎｄ／ｏｒ Ｒ−α−ｌｉｐｏｉｃ ａｃｉｄ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９９（４），２３５６−２３６１．

【0044】

【非特許文献9】Ｍａｒｃｈｉｔｔｉ，Ｓ．Ａ．，Ｄｅｉｔｒｉｃｈ，Ｒ．Ａ．， ＆ Ｖａｓｉｌｉｏｕ，Ｖ．（２００７）．Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ３，４ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａ ｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ ａｎｄ ３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｇｌｙｃｏｌａｌｄｅｈｙｄｅ：ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ，５９（２），１２５−１５０．

【0045】

【非特許文献10】Ｍａｒｃｈｉｔｔｉ，Ｓ．Ａ．，Ｂｒｏｃｋｅｒ，Ｃ．，Ｓｔａｇｏｓ，Ｄ．， ＆ Ｖａｓｉｌｉｏｕ，Ｖ．（２００８）．Ｎｏｎ−Ｐ４５０ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ：ｔｈｅ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．Ｅｘｐｅｒｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ ｄｒｕｇ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ＆ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，４（６），６９７−７２０．

【0046】

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【0047】

【非特許文献12】Ｏｈｔａｋｅ，Ｙ．，Ｓａｔｏｕ，Ａ．，＆ Ｙａｂｕｕｃｈｉ，Ｓ．（１９９０）．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｍｕｔａｎｔｓ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４（１２），３１４５−３１５０．

【0048】

【非特許文献13】Ｗｒｉｇｈｔ，Ｃ．，Ｍｉｌｎｅ，Ｓ．， ＆ Ｌｅｅｓｏｎ，Ｈ．（２０１４）．Ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ：ｍｏｄｉｆｉａｂｌｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ，ｌｉｆｅｓｔｙｌｅ ａｎｄ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｍａｌｅ ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ．Ｒｅｐｒｏｄ． ＢｉｏＭｅｄ．Ｏｎｌｉｎｅ，２８（６），６８４−７０３．

【0049】

【非特許文献14】Ｙｏｓｈｉｄａ，Ａ．，Ｈｕａｎｇ，Ｉ．Ｙ．， ＆ Ｉｋａｗａ，Ｍ．（１９８４）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙ ｏｆ ａｎ ｉｎａｃｔｉｖｅ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｖａｒｉａｎｔ ｃｏｍｍｏｎｌｙ ｆｏｕｎｄ ｉｎ Ｏｒｉｅｎｔａｌｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，８１（１），２５８−２６１．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0050】

本発明の目的は、野生のサッカロマイセス・セレビシエ酵母を突然変異させて、グルタチオンとアルデヒド脱水素酵素の同時生産能力を増加させる突然変異方法を提供することである。

【0051】

本発明のまた別の目的は、グルタチオンとアルデヒド脱水素酵素を同時に高効率の生産能力を示すサッカロマイセス・セレビシエＫｗｏｎＰ−１（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＫｗｏｎＰ−１：ＫＣＴＣ１３９２５ＢＰ）の突然変異酵母菌株を提供することである。

【0052】

本発明のまた別の目的は、野生のサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を突然変異させて培養した、グルタチオンとアルデヒド脱水素酵素の同時生産能力に優れるとともに、メチルグリオキサール（Ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｏｘａｌ）耐性が強い、新規な酵母である寄託番号ＫＣＴＣ１４１２２ＢＰのサッカロマイセス・セレビシエＫｗｏｎＰ−２を提供することである。

【0053】

本発明のまた別の目的は、野生のサッカロマイセス・セレビシエ酵母を突然変異させて製造した、リシン（Ｌｙｓｉｎｅ）耐性が強い新規な菌株ＫＣＴＣ１４１２３ＢＰのサッカロマイセス・セレビシエＫｗｏｎＰ−３を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0054】

以上のような本発明の目的を達成するために、本発明は、グルタチオン及びアルデヒド脱水素酵素の同時生産能力を増加させた変異微生物を作るために、野生のサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中、微量であるものの、グルタチオン及びアルデヒド脱水素酵素を生産することができる菌株を選抜使用した。

【0055】

このような基準に選抜した野生酵母を人為的に化学突然変異させた後、再度グルタチオンを過量生産する菌株は、メチルグリオキサール適応変異株、アルデヒド脱水素酵素の過量生産菌株の選抜は、リシン適応変異株の選抜方法として、最終的にグルタチオンとアルデヒド脱水素酵素を同時に過量生産するサッカロマイセス・セレビシエを選抜した。

【0056】

以下、本発明の突然変異誘導方法と、選抜された突然変異酵母をより具体的に説明する。

【0057】

サッカロマイセス・セレビシエＫｗｏｎＰ−１の突然変異菌株（ＫＣＴＣ１３９２５ＢＰ）は、韓国産マッコリ、麹等から選抜された野生のサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株の２５０種のうち、微量であるものの、グルタチオン及びアルデヒド脱水素酵素を同時に生産する菌株を２０種選抜した後、同時生産性が最も高い菌株を１種最終選抜した。

【0058】

その後、選抜された２０種の菌株にＮＴＧ（Ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）又はＥＭＳ（Ｅｔｈｙｌ−ｍｅｔｈａｎｅ−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）処理し、化学突然変異を誘発した突然変異の微生物のグルタチオンの生産性を高めるために、メチルグリオキサールの濃度、これに制限されないが、５乃至１５ｍＭ、好ましくは１０ｍＭの濃度に対する適応性が高い耐性酵母微生物を１次選抜した。

【0059】

その後、再度２次選別は、アルデヒド脱水素酵素の生産性が高い微生物の選抜のために、リシンに対する適応耐性を有する新規な酵母突然変異菌株を選別するために、これに制限されないが、３乃至５％、好ましくは３％濃度のリシンで耐性を有する酵母微生物を選抜した。最終的に、グルタチオンとアルデヒド脱水素酵素の同時生産性が高いサッカロマイセス・セレビシエＫｗｏｎＰ−１（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＫｗｏｎＰ−１）を選抜した。

【0060】

前記サッカロマイセス・セレビシエＫｗｏｎＰ−１は、国際寄託機関に受託番号ＫＣＴＣ１３９２５ＢＰとして寄託されており、優れたグルタチオンの生産及びアルデヒド脱水素酵素の生産能力を有することを特徴とする。

【0061】

本発明の実施例において、前記サッカロマイセス・セレビシエＫｗｏｎＰ−１の突然変異菌株（ＫＣＴＣ１３９２５ＢＰ）は、サッカロマイセス・セレビシエの野生型菌株のうち、微量であるものの、グルタチオンの生産及びアルデヒド脱水素酵素の同時生産能力がある選抜菌株にＮＴＧ（ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）又はＥＭＳ（Ｅｔｈｙｌ−ｍｅｔｈａｎｅ−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）を処理して突然変異を誘発し、前記菌株からメチルグリオキサールに対する耐性を有し、リシンに対する耐性を有する菌株を選別したものであって、グルタチオンとアルデヒド脱水素酵素の生成能が最初選抜されたや野生菌株に比べて、２つ物質の生産性に優れることを確認した。

【図面の簡単な説明】

【0062】

【図1】本発明の実施例にかかり、メチルグリオキサールの処理濃度によるサッカロマイセス・セレビシエの野生型菌株の生存率曲線（ｃｕｒｖｅ）を示すグラフである。

【図2】本発明の実施例にかかり、ＮＴＧの処理濃度によるサッカロマイセス・セレビシエの野生型菌株の生存率曲線（ｃｕｒｖｅ）を示すグラフであり、青色は２４時間培養した野生のサッカロマイセス・セレビシエの生存率であり、オレンジ色は野生のサッカロマイセス・セレビシエを培養してＯＤ値が０．５になった後に使用した。

【図3】本発明の実施例にかかり、ＥＭＳの処理濃度によるサッカロマイセス・セレビシエ野生型菌株の生存率曲線（ｃｕｒｖｅ）を示すグラフであり、青色は２４時間培養した野生のサッカロマイセス・セレビシエの生存率であり、オレンジ色は野生のサッカロマイセス・セレビシエを培養してＯＤ値が０．５になった後に使用した。

【図4】本発明の実施例にかかり、サッカロマイセス・セレビシエの突然変異菌株から生成されたグルタチオンの濃度分布結果を示すグラフである。この際、横軸は菌体当たりのグルタチオンの含量を示し、縦軸はコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）の数を示す。

【図5】本発明の実施例にかかり、リシンの処理濃度によるサッカロマイセス・セレビシエの野生型菌株の生存率曲線（ｃｕｒｖｅ）を示すグラフである。

【図6】本発明の実施例にかかり、サッカロマイセス・セレビシエの突然変異菌株から生成されたアルデヒド脱水素酵素の濃度分析結果を示すグラフである。このとき、横軸の数字はサッカロマイセス・セレビシエそれぞれの突然変異菌株を意味するものであり、縦軸はサッカロマイセス・セレビシエの突然変異菌株のアルデヒド脱水素酵素の活性をサッカロマイセス・セレビシエの野生菌株のアルデヒド脱水素酵素の活性と比較し、相対的なアルデヒド脱水素酵素の活性を示すものである。

【図7】本発明の１つの実施例にかかるサッカロマイセス・セレビシエの突然変異菌株ＫｗｏｎＰ−１の細胞形態を光学顕微鏡で観察した図である。

【図8】本発明の１つの実施例にかかるサッカロマイセス・セレビシエの野生型菌株の細胞形態を光学顕微鏡で観察した図である。

【発明を実施するための形態】

【0063】

以下、次の実施例を通じて、本発明の構成及び効果をさらに詳細に説明しようとする。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであるだけで、本発明の範囲がこれらの実施例により限定されるわけではない。

【0064】

［実施例１］
グルタチオンの生産能力が向上した菌株の選別

【0065】

グルタチオンの生産能力が向上した新規な突然変異菌株を選別するために、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の野生菌株に突然変異を誘導するためのＥＭＳ（Ｅｔｈｙｌ−ｍｅｔｈａｎｅ−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）又はＮＴＧ（ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）を処理し、メチルグリオキサール（ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｏｘａｌ）に対する耐性を評価し、最終的にグルタチオンの生成能が向上した菌株を選別した。具体的には、下記のように実験を行った。

【0066】

実施例１−１：メチルグリオキサール（ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｏｘａｌ）におけるサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の野生型菌株の生存率分析

【0067】

グルタチオンの生成能が向上した新規な酵母突然変異菌株を選別するための実験条件を確立するために、メチルグリオキサールに対する耐性菌株を選別する前に生存率を測定し、処理濃度の範囲を決定した後に処理濃度を選定しようとした。このとき、野生で選別されたサッカロマイセス・セレビシエを母菌株として使用した。

【0068】

具体的に、まず、突然変異株の耐性菌株を選別するために、前記準備した酵母菌株のメチルグリオキサールの処理濃度を異にして生存率を調査した。このため、前記菌株をＹＰＤ培地（２％ペプトン、１％酵母抽出物、２％グルコース）に接種し、３０℃でＯＤ_{６００ｎｍ}（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ ａｔ ６００ｎｍ）値が０．５になるまで成長させた後、菌体を回収した。前記回収した菌体をそれぞれ０ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、及び１５ｍＭの濃度のメチルグリオキサールが添加されたＹＰＤ寒天培地（寒天１．５％添加）に塗抹して接種した後に培養した。このとき、回収した菌体は、０．１Ｍクエン酸バッファー（Ｃｉｔｉｒｉｃ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ５．５）で洗浄した後、ＯＤ_{６００ｎｍ}値を１．０に調節してメチルグリオキサールが添加されたＹＰＤ寒天培地に塗抹した。塗抹後、３０℃で４８時間培養し、前記菌株の生存率グラフで作成した。

【0069】

その結果、下記の図１に示すように、メチルグリオキサールを１０ｍＭの濃度で処理時、９９．９９５％の死滅率が確認され、メチルグリオキサールを１５ｍＭの濃度で処理時、試験微生物１００％が死滅した。

【0070】

ここに、グルタチオンの生成能が向上した新規な突然変異菌株を選別するために、前記結果に基づいて、野生型菌株のメチルグリオキサール耐性菌株を選別するためには、メチルグリオキサールが１０ｍＭの濃度で添加されたＹＰＤ寒天培地を使用した。

【0071】

実施例１−２：グルタチオンの生成能に優れた突然変異候補菌株の選別のための突然変異条件の確立

【0072】

前記実施例１−１でグルタチオンの生成能が向上した新規な突然変異菌株を選別するための実験条件を確立した。具体的に、野生型菌株のメチルグリオキサール耐性菌株の選別のために、ＹＰＤ寒天培地にメチルグリオキサールを１０ｍＭの濃度で添加した。

【0073】

よって、野生型菌株からグルタチオンの生産に優れた突然変異菌株を選別するために、ＥＭＳ（Ｅｔｈｙｌ−ｍｅｔｈａｎｅ−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ；エチル−メタン−スルホネート）又はＮＴＧ（Ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）の処理濃度別の生存率曲線を作成した。

【0074】

具体的に、野生型菌株をＹＰＤ培地に接種し、ＯＤ_{６００ｎｍ}値が０．５になるまでに、また２４時間培養した後、２つの培養液を対象として４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して沈殿した菌体を回収した。回収した菌体を０．１Ｍクエン酸バッファー（Ｃｉｔｉｒｉｃ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ５．５）を使用して２回洗浄し、遠心分離した後、最終的にＯＤ_{６００ｎｍ}値が１．０になるように、０．１Ｍクエン酸バッファー（Ｃｉｔｉｒｉｃ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ５．５）で希釈して使用した。その後、突然変異を誘導するために、遠心分離後に回収された菌体に１％、２％、３％、及び４％濃度のＮＴＧが含まれた０．１Ｍクエン酸バッファー（Ｃｉｔｉｒｉｃ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ５．５）を添加し、３０℃の温度条件で３０分間ＮＴＧを処理した。前記ＮＴＧが処理された突然変異株を４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体を回収した後、０．１Ｍクエン酸バッファー（ｃｉｔｉｒｉｃ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ５．５）を使用して２回洗浄した。前記洗浄された菌体に１ｍｌの０．１Ｍクエン酸バッファー（Ｃｉｔｉｒｉｃ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ５．５）を添加して混合した後、ＹＰＤ寒天培地に塗抹した。

【0075】

一方、突然変異を誘導するための物質であるＥＭＳ処理によるメチルグリオキサール耐性突然変異菌株の選別のために、前記ＮＴＧ処理条件と同じ条件で成長した酵母野生型菌株を１ｍＬ取って遠心分離した。前記遠心分離後に回収された菌体に１％、２％、３％、及び４％濃度のＥＭＳが含まれた０．１Ｍクエン酸バッファー（Ｃｉｔｉｒｉｃ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ５．５）を添加し、３０℃の温度条件で６０分間ＥＭＳを微生物に処理した。前記ＥＭＳが処理された突然変異株を４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体を回収した後、０．１Ｍクエン酸バッファー（ｃｉｔｉｒｉｃ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ５．５）を使用して２回洗浄した。前記洗浄された菌体に１ｍｌの０．１Ｍクエン酸バッファー（Ｃｉｔｉｒｉｃ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ５．５）を添加して混合した後、ＹＰＤ寒天培地に塗抹した。

【0076】

その結果、下記の図３に示すように、ＥＭＳは２４時間培養後、３％の濃度で処理時、９９．４％の死滅が確認された。また、図２に示すように、ＮＴＧは２４時間培養後、１％の濃度で処理時、９９．７％の死滅を示した。

【0077】

ここに、グルタチオンの生成能が向上した新規な酵母突然変異菌株を選別するために、前記結果に基づいて、野生型菌株のグルタチオン耐性菌株の選別のための最適のＮＴＧ、ＥＭＳ処理濃度をそれぞれ１％、３％と選定した。

【0078】

実施例１−３：グルタチオンの生成能に優れた突然変異酵母菌株の選別

【0079】

前記実施例１−２、１−３でグルタチオンの生成能が向上した新規な酵母突然変異菌株を選別するための実験条件を確立した。具体的に、酵母野生型菌株のメチルグリオキサール耐性菌株の選別のために、ＹＮＢ寒天培地にメチルグリオキサールを１０ｍＭの濃度で添加することとし、突然変異のためにＮＴＧ１％、ＥＭＳ３％の条件を確立した。

【0080】

ここに、野生型菌株からグルタチオンの生産に優れた突然変異菌株を選別するために、メチルグリオキサール耐性突然変異菌株を選別し、これをＹＰＤ培地で菌体を成長させてグルタチオンの濃度を測定して、菌体内グルタチオンの含量（％、ｇ／ｇ−ｃｅｌｌ）で表記した。

【0081】

具体的に、野生型菌株をＹＰＤ培地に接種して２４時間培養した後、培養液を収得して４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体を回収した。その後、前記回収した菌体を０．１Ｍクエン酸バッファー（Ｃｉｔｉｒｉｃ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ５．５）を使用して２回洗浄し、最終的にＯＤ_{６００ｎｍ}値が１．０になるように０．１Ｍクエン酸バッファー（Ｃｉｔｉｒｉｃ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ５．５）で希釈して使用した。突然変異を誘導するために、それぞれＥＭＳ３％を含む０．１Ｍクエン酸バッファー（Ｃｉｔｉｒｉｃ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ５．５）に１０分間、ＮＴＧ１％を含む０．１Ｍクエン酸バッファー（Ｃｉｔｉｒｉｃ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ５．５）に３０分間処理した後、突然変異された微生物を４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体を回収した後、０．１Ｍクエン酸バッファー（Ｃｉｔｉｒｉｃ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ５．５）を添加して混合した後、１０ｍＭ濃度のメチルグリオキサールが添加されたＹＰＤ寒天培地に塗抹した。塗抹して培養した後、生存された菌株を回収し、これをＹＰＤ培地で４８時間培養した。このときの培養条件として、培養温度は３０℃であり、攪拌速度は１６０ｒｐｍであった。４８時間培養した後、グルタチオンの濃度を測定し、菌体内グルタチオンの含量（％、ｇ／ｇ−ｃｅｌｌ）と表記した。

【0082】

このとき、グルタチオンの濃度分析のために培養された菌体を遠心分離し、沈殿した菌体に１ｍＬの水を添加して２時間の間に８５℃で１，０００ｒｐｍで攪拌して抽出した。抽出した後、遠心分離機を利用して菌体を除去し、上澄液を０．２２μｍフィルタでろ過して回収した。ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｚｕ ＬＣ−２０ＡＤ）分析を通じて、前記回収したろ過液に含まれているグルタチオンの濃度を測定した。一方、グルタチオンの濃度は、グルタチオンの標準曲線を用いて分析し、ＨＰＬＣ分析の条件は、Ｃ１８カラムを使用して分析した。移動相溶媒（２．０２ｇ／Ｌ Ｓｏｄｉｕｍ １−ｈｅｐｔａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ，６．８ｇ／Ｌ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ３．０，メタノール混合）を１ｍｌ／ｍｉｎの流速で流して、紫外線検出器２１０ｎｍ波長で検出されたグルタチオンの濃度を測定した。

【0083】

総１３０の突然変異菌株が生成され、それぞれの突然変異菌株のグルタチオンの濃度を分析した結果、図４のように、菌体内グルタチオンの含量が０．３％から０．５％未満の突然変異菌株は７０種であり、０．５％から０．７％未満の突然変異菌株は３０種であり、０．７％から０．８５％未満の突然変異菌株は２３種であり、０．８５％から１．１％未満の突然変異菌株は７種であった。即ち、ＥＭＳ又はＮＴＧ処理によるメチルグリオキサール耐性菌株のグルタチオンの生成能力は、４８．６％が野生型菌株の菌体内グルタチオンの含量である０．４２％に比べて優れて示され、このうち、下記の表１に示すように、７種の突然変異菌株が母菌株に比べて２倍以上向上したグルタチオンの生成能力を示した。

【0084】

これを根拠として、ＥＭＳ処理によるメチルグリオキサール耐性突然変異菌株のうち、最もグルタチオンの生成能が良いサッカロマイセス・セレビシエｅｍｓ ｃ７をグルタチオンの生成能に優れた突然変異の最終候補菌株として選別した。

【0085】

以下、実施例２では、ＮＴＧ処理を用いた突然変異を使用し、前記選別した候補菌株のアルデヒド脱水素酵素の生成能を向上させた。

【0086】

ＥＭＳ又はＮＴＧ処理による酵母のメチルグリオキサール耐性突然変異菌株の培養結果

【表1】

【0087】

［実施例２］
アルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ）の生成能が向上した菌株の選別

【0088】

アルデヒド脱水素酵素の生成能が向上した新規な突然変異菌株を選別するために、実施例１で選ばれたグルタチオンの生産量が最も高いサッカロマイセス・セレビシエｅｍｓ ｃ７をリシン（Ｌｙｓｉｎｅ）に対する耐性を評価し、最終的にアルデヒド脱水素酵素の生成能が向上した菌株を選別した。具体的に下記のように実験を行った。

【0089】

実施例２−１：リシン（Ｌｙｓｉｎｅ）でサッカロマイセス・セレビシエｅｍｓ ｃ７菌株の生存率分析

【0090】

アルデヒド脱水素酵素の生成能が向上した新規な突然変異菌株を選別するための実験条件を確立するために、グルタチオン突然変異株サッカロマイセス・セレビシエｅｍｓ ｃ７のリシンに対する耐性菌株を選別するための最適のリシン処理の濃度を選定しようとした。このとき、グルタチオンの生成能が向上したサッカロマイセス・セレビシエｅｍｓ ｃ７を準備し、この菌株を母菌株として使用した。

【0091】

具体的に、サッカロマイセス・セレビシエ突然変異菌株のリシン耐性菌株を選別するために、前記準備したサッカロマイセス・セレビシエｅｍｓ ｃ７菌株のリシン処理の濃度による生存率を調査した。このため、前記菌株をＹＰＤ培地（２％ペプトン、１％酵母抽出物、２％グルコース）に接種して、３０℃でＯＤ_{６００ｎｍ}値が０．５になるまで成長させた後、菌体を回収した。前記回収した菌体をそれぞれ０％、３％、４％、５％、６％、及び７％濃度のリシンが添加されたＹＰＤ寒天培地（寒天１．５％添加）に塗抹した。このとき、回収した菌体は、０．１Ｍクエン酸バッファー（Ｃｉｔｉｒｉｃ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ５．５）で洗浄した後、ＯＤ_{６００ｎｍ}値を１．０に調節し、リシンが添加されたＹＰＤ寒天培地に塗抹した。塗抹後、３０℃で４８時間培養して前記菌株の生存率曲線（ｃｕｒｖｅ）を作成した。

【0092】

その結果、下記図５に示すように、リシンを３％濃度で処理時、８７．５％の死滅が確認した。

【0093】

ここに、アルデヒド脱水素酵素の生成能が向上した新規な突然変異菌株を選別するために、前記結果に基づいて、サッカロマイセス・セレビシエｅｍｓ ｃ７菌株のリシン耐性菌株の選別のための最適のリシン処理の濃度を３％と選定し、リシンが３％濃度で添加されたＹＰＤ寒天培地を使用して選別した。

【0094】

実施例２−２：アルデヒド脱水素酵素の生成能に優れた突然変異候補菌株の選別

【0095】

前記実施例１−２、２−１でアルデヒド脱水素酵素の活性が向上した新規な酵母突然変異菌株を選別するための実験条件を確立した。具体的に、突然変異サッカロマイセス・セレビシエｅｍｓ ｃ７菌株のリシン耐性菌株の選別のために、ＹＰＤ寒天培地にリシンを３％の濃度で添加することとし、突然変異のためにＮＴＧ１％の条件を確認した。

【0096】

ここに、サッカロマイセス・セレビシエｅｍｓ ｃ７菌株からグルタチオンの生産が優れた突然変異菌株を選別するために、リシン３％が含まれたＹＰＤ培地で菌体を成長させて、アルデヒド脱水素酵素の濃度を測定した。

【0097】

具体的に、酵母野生型菌株をＹＰＤ培地に接種して２４時間培養した後、培養液を４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体を回収した。回収した菌体を０．１Ｍクエン酸バッファー（Ｃｉｔｉｒｉｃ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ５．５）を使用して２回洗浄し、最終的にＯＤ_{６００ｎｍ}値が１．０になるように０．１Ｍクエン酸バッファー（Ｃｉｔｉｒｉｃ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ５．５）を追加して希釈した。突然変異を誘導するために、それぞれＮＴＧ１％を含む０．１Ｍクエン酸バッファー（Ｃｉｔｉｒｉｃ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ５．５）に１０分間処理した後、突然変異株を４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体を回収した後、０．１Ｍクエン酸バッファー（Ｃｉｔｉｒｉｃ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ５．５）を添加して混合した後、３％濃度のリシンが添加されたＹＰＤ寒天培地に塗抹した。塗抹して培養した後、生存された菌株を回収し、これをＹＰＤ培地で４８時間培養した。このときの培養条件として、培養温度は３０℃であり、攪拌速度は１６０ｒｐｍであった。４８時間培養した後、アルデヒド脱水素酵素の活性を測定した。

【0098】

しかしながら、アルデヒドが揮発性であり、生産される量が微量であるため、既存の方法で測定は試料に対するばらつきが多く、安定したアルデヒドの測定方法の定立が必要であり、これに基づく正確な新しい酵素力価の測定方法の開発は、作られたアルデヒド脱水素酵素のＱＣ（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ）に絶対的に必要であり、実施例３で新しい方法を開発した。

【0099】

［実施例３］
新しいアルデヒド脱水素酵素力価の測定方法の確立と、突然変異菌株の酵素力価の測定

【0100】

既存のアルデヒド脱水素酵素の活性を測定する方法として、波長３４０ｎｍでのＮＡＤ（Ｐ）＋吸光度を測定する方法が広く使用されるが、これは、助酵素の変化量を見てみるため、間接的な結果といえ、使用できなかった。従って、酵素の基質に対する直接的な酵素のＫｍ値を測定するために、本発明者らは、アルデヒドの定量のためにＨＰＬＣ分析方法を利用した。但し、酵素ＡＬＤＨにより消耗されるアルデヒドは非常に少ない量であり、アセトアルデヒドは常温でも揮発性が強いため、反応産物で直接定量することは技術的に困難があるという問題点がある。

【0101】

よって、問題点を解決するために、発明者らは、アセトアルデヒドに一定量の割合でＤｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ（ＤＮＰＨ）を添加して一定の濃度で反応させると、アセトアルデヒド−ヒドラゾン（ＡｃＨ−ＤＮＰＨ）化合物が形成され、これは、ＨＰＬＣ用Ｃ１８カラムに移動相アセトニトリル（Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）と水（ｗａｔｅｒ）を溶媒で展開し、３６０ｎｍで検出されて定量できるという参考文献（Ｇｕａｎ．ｅｔ．ａｌ，２０１２）に基づいて、アルデヒド脱水素酵素の反応により減少したアルデヒドの量を分析した。酵素反応液としては、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ８．０）、１ｍＭアセトアルデヒド、測定微生物ライセート（ｌｙｓａｔｅ）１０μＬに酵素の補因子（Ｃｏｆａｃｔｏｒ）１ｍＭ ＮＡＤＰ＋をそれぞれ添加してから３０℃で反応後、ここに１０ｍＭ ＤＮＰＨ５０μｌを添加した後、２２℃で１時間アセトアルデヒド−ヒドラゾン（ＡｃＨ−ＤＮＰＨ）のラベリングを進行した。ラベリングは、３Ｍ酢酸ナトリウム（３ Ｍ Ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）（ｐＨ９）を添加することで反応を終了させて、２倍体積のアセトニトリル（Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）を添加することで、アセトアルデヒド−ＤＮＰＨ化合物が溶けている層を分離した後、ＨＰＬＣに注入して分析した。ラベリングされたアルデヒドの濃度は、Ａｌｄｅｈｙｄｅ−ＤＮＰＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の物質標準曲線を用いて分析し、ＨＰＬＣ分析の条件は、Ｃ１８カラムを使用して溶媒（アセトニトリル、水）を１ｍｌ／ｍｉｎの流速で流して、紫外線検出器３６０ｎｍ波長で得て分析した。このとき、アルデヒド脱水素酵素の１ｕｎｉｔは、分当たり減少したアセトアルデヒド−ＤＮＰＨの濃度１ｍＭを１ｕｎｉｔとし、アルデヒド脱水素酵素の活性は、タンパク質ｍｇ当たりｕｎｉｔと示した。

【0102】

アルデヒド脱水素酵素の濃度を分析した結果、下記図６で示すように、サッカロマイセス・セレビシエｅｍｓ ｃ７菌株のＮＴＧ処理によるリシン耐性菌株のアルデヒド脱水素酵素の生成能力は、リシン耐性突然変異株の約４２％が初期の母菌株とサッカロマイセス・セレビシエｅｍｓ ｃ７（母菌株より１１０％優れる）より優れて示され、４種（＃４、＃８、＃１６、＃２１）は、１４０％以上生産能の向上が示された。このとき、アルデヒド脱水素酵素の生成能力に優れた４種のグルタチオンの含量は、＃４番の突然変異菌株は０．９％、＃８番の突然変異菌株は０．９６％、＃１６番の突然変異菌株は０．９３％、＃２１番の突然変異菌株は０．９２％であり、ライセン処理によってもグルタチオンの生成能力の変化はなかった。

【0103】

前記アルデヒド脱水素酵素の活性が母菌株に比べて１．４倍以上向上した突然変異株４種に対する結果を表２に示した。これに基づいて、ＮＴＧ処理によるリシン耐性突然変異サッカロマイセス・セレビシエ＃８をアルデヒド脱水素酵素の生成能に優れた突然変異菌株として選別し、サッカロマイセス・セレビシエＫｗｏｎ Ｐ−１と名付けた。

【0104】

ＮＴＧ処理による酵母のリシン耐性突然変異菌株のアルデヒド脱水素酵素の活性

【表2】

【0105】

［実施例４］
グルタチオンとアルデヒド脱水素酵素の生成能に優れた突然変異の形態変化

【0106】

前記実施例２−２でグルタチオンとアルデヒド脱水素酵素の生成能が向上した新規な酵母突然変異菌株を選別し、形態変化を観察するために光学顕微鏡を使用して突然変異菌株を観察した。突然変異菌株サッカロマイセス・セレビシエＫｏｗｎＰ−１の細胞形態を図７に示し、野生型菌株酵母の野生型の形態を図８に示した。光学顕微鏡の観察結果、突然変異菌株サッカロマイセス・セレビシエＫｗｏｎＰ−１の細胞直径が６０％以上増加した結果を確認し、細胞内小器官である液胞の大きさが肥大した特徴を確認した。以上の実施例で本特許のサッカロマイセス・セレビシエＫｗｏｎ Ｐ−１は、細胞の大きさが６０％増加し、液胞が大きい独特な形態的特徴は、特許件を侵害した盗用を防止することができる重要な手段として使用できる特定化された形態である。

【0107】

［実施例５］
サッカロマイセス・セレビシエＫｗｏｎ Ｐ−１を用いたグルタチオンとアルデヒド脱水素酵素の同時生産

【0108】

サッカロマイセス・セレビシエＫｗｏｎ Ｐ−１を滅菌されたＹＰＤ液体培地（２％ペプトン、１％酵母抽出物、２％グルコース）に接種し、培養温度は３０℃であり、攪拌速度は１６０ｒｐｍであり、１６時間培養した種子培養（Ｓｅｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ）を行った。本培養は、滅菌したＹＰＤ滅菌液体培地に１％レベルで接種し、種子培養と同じ条件で４８時間培養後、培養液のグルタチオンの濃度とアルデヒド脱水素酵素の活性を測定した。同じ条件で２０個のフラスコを使用し、２０回の繰り返し培養実験をした結果、表３のような菌体内グルタチオンの含量とアルデヒド脱水素酵素の活性結果を得た。特許菌株であるサッカロマイセス・セレビシエＫｗｏｎ Ｐ−１は、グルタチオンとアルデヒド脱水素酵素を同時に生産することができ、２０回の繰り返し実験の平均生産値は、菌体内グルタチオンの含量は０．９７％であり、アルデヒド脱水素酵素の活性は０．１７３Ｕｎｉｔ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎであることを確認した。これは、特許菌株であるサッカロマイセス・セレビシエＫｗｏｎ Ｐ−１の突然変異菌株が、母菌に比べて、グルタチオンの含量は２．３倍、アルデヒド脱水素酵素は１．７倍の生産能力が増加することを示した結果である。

【0109】

フラスコ液体培養でサッカロマイセス・セレビシエＫｗｏｎ Ｐ−１のグルタチオンとアルデヒド脱水素酵素の同時生産を確認

【表3】

【受託番号】

【0110】

寄託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ１３９２５ＢＰ
受託日：２０１９０８２２

寄託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ１４１２２ＢＰ
受託日：２０２００１３０

寄託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ１４１２３ＢＰ
受託日：２０２００１３０

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】