特開 2021-134211 ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨおよび関連疾患の処置のための組合せ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2021-134211(P2021-134211A)

(43)【公開日】2021年9月13日

(54)【発明の名称】ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨおよび関連疾患の処置のための組合せ

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/444 20060101AFI20210816BHJP

   C07D 405/14 20060101ALI20210816BHJP

   C07D 471/10 20060101ALI20210816BHJP

   A61K 31/506 20060101ALI20210816BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20210816BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20210816BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20210816BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210816BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210816BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20210816BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20210816BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20210816BHJP

   A61P 9/04 20060101ALI20210816BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20210816BHJP

   A61P 9/06 20060101ALI20210816BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20210816BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20210816BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20210816BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/444

   C07D405/14CSP

   C07D471/10 102

   A61K31/506

   A61P1/16

   A61P3/00

   A61P29/00

   A61P43/00 105

   A61P35/00

   A61P9/10 101

   A61P9/00

   A61P25/00

   A61P9/10

   A61P9/04

   A61P13/12

   A61P9/06

   A61P3/04

   A61P3/10

   A61P3/06

   A61P43/00 121

【審査請求】未請求

【請求項の数】17

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

【全頁数】85

(21)【出願番号】特願2021-23812(P2021-23812)

(22)【出願日】2021年2月18日

(31)【優先権主張番号】62/980664

(32)【優先日】2020年2月24日

(33)【優先権主張国】US

(71)【出願人】

【識別番号】593141953

【氏名又は名称】ファイザー・インク

(74)【代理人】

【識別番号】100133927

【弁理士】

【氏名又は名称】四本 能尚

(74)【代理人】

【識別番号】100147186

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 眞紀

(74)【代理人】

【識別番号】100174447

【弁理士】

【氏名又は名称】龍田 美幸

(74)【代理人】

【識別番号】100185960

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 理愛

(72)【発明者】

【氏名】ニータ バークリシャン エーミン

(72)【発明者】

【氏名】アーサー ジェイムズ バーグマン

(72)【発明者】

【氏名】ロバート アーノルド カル

(72)【発明者】

【氏名】ウィリアム ポール エズラー

(72)【発明者】

【氏名】アルバート ミュン キム

(72)【発明者】

【氏名】ジェフリー アレン フェファーコーン

(72)【発明者】

【氏名】パトリック ロバート ヴァーホスト

【テーマコード（参考）】

4C063

4C065

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C063AA05

4C063BB09

4C063CC73

4C063DD29

4C063EE01

4C065AA16

4C065AA19

4C065BB05

4C065CC09

4C065DD03

4C065EE02

4C065HH09

4C065JJ01

4C065KK09

4C065LL04

4C065PP03

4C065PP12

4C065QQ10

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086BC42

4C086CB05

4C086GA02

4C086GA07

4C086GA08

4C086GA15

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZA02

4C086ZA36

4C086ZA45

4C086ZA70

4C086ZA75

4C086ZA81

4C086ZB11

4C086ZB21

4C086ZB26

4C086ZC21

4C086ZC33

4C086ZC35

4C086ZC75

(57)【要約】

【課題】医薬、例えば、経口医薬を提供すること。
【解決手段】脂肪肝疾患および関連疾患または障害を、治療有効量の、約２５ｍｇから約１２００ｍｇまでの（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩と、約５ｍｇから約４０ｍｇまでの４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩とを含む組成物で処置するための方法。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

脂肪肝、非アルコール性脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、肝線維症を伴う非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変を伴う非アルコール性脂肪性肝炎、ならびに肝硬変および肝細胞癌または代謝関連疾患を伴う非アルコール性脂肪性肝炎から選択される疾患または状態を処置するための方法であって、
それを必要とするヒトに、治療有効量の、約５ｍｇから約１２００ｍｇまでの（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩と、約５ｍｇから約６０ｍｇの４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩とを含む組成物を投与するステップを含む方法。

【請求項2】

脂肪肝、アルコール性脂肪肝疾患、アルコール性脂肪性肝炎、肝線維症を伴うアルコール性脂肪性肝炎、肝硬変を伴うアルコール性脂肪性肝炎、ならびに肝硬変および肝細胞癌または代謝関連疾患を伴うアルコール性脂肪性肝炎から選択される疾患または状態を処置するための方法であって、
それを必要とするヒトに、治療有効量の、約５ｍｇから約１２００ｍｇまでの（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩と、約５ｍｇから約６０ｍｇまでの４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩とを含む組成物を投与するステップとを含む方法。

【請求項3】

アテローム性動脈硬化、脳卒中、心筋梗塞、大動脈血管疾患、脳血管疾患、腎臓血管疾患、心不全、心房細動または冠状動脈性心疾患から選択される心血管疾患または状態を処置するための方法であって、
それを必要とするヒトに、治療有効量の、約５ｍｇから約１２００ｍｇまでの（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩と、約５ｍｇから約６０ｍｇまでの４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩とを含む組成物を投与するステップを含む方法。

【請求項4】

肥満、脂質異常症、２型真性糖尿病、２型真性糖尿病患者における血糖コントロール、耐糖能異常（ＩＧＴ）の状態、空腹時血漿グルコース異常の状態、代謝症候群、症候群Ｘ、高血糖症、高インスリン血症、インスリン抵抗性またはグルコース代謝異常から選択される代謝性疾患または状態を処置するための方法であって、
それを必要とするヒトに、治療有効量の、約５ｍｇから約１２００ｍｇまでの（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩と、約５ｍｇから約６０ｍｇまでの４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩とを含む組成物を投与するステップを含む方法。

【請求項5】

Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩の、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩に対する比が、約１：１、約５：１、約１０：１、約１５：１、約２０：１、または約３０：１である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩の前記治療有効量が、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約５０ｍｇ、約７５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２２５ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約６００ｍｇまたは約１２００ｍｇであり、前記４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩の前記治療有効量が、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約４０ｍｇ、約５０ｍｇまたは約６０ｍｇである、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩の前記治療有効量が、約３００ｍｇである、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩の前記治療有効量が、約１０ｍｇである、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩の前記治療有効量が、約１５ｍｇである、請求項７に記載の方法。

【請求項10】

前記４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩の前記治療有効量が、約２０ｍｇである、請求項７に記載の方法。

【請求項11】

前記組成物が１日に１回投与される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記組成物が１日に２回投与される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記（Ｓ）−２−（５（（３エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドが、構造：

【化1】

の結晶性固体または薬学的に許容できるその塩である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記結晶性固体が、（ＣｕＫα放射線、１．５４０５６Åの波長）５．３±０．２、７．７±０．２および１５．４±０．２の２シータ値を含む粉末ｘ線回折パターンを有する、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記結晶性固体が、（ＣｕＫα放射線、１．５４０５６Åの波長）６．５±０．２、９．３±０．２および１３．６±０．２の２シータ値を含む粉末ｘ線回折パターンを有する、請求項１３に記載の方法。

【請求項16】

前記４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸が、構造：

【化2】

の結晶性固体または薬学的に許容できるその塩である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記結晶性固体が、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸の２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール塩である、請求項１６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、脂肪肝疾患およびそれに関連する疾患の処置のための、（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩と、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩とを含む、新たな医薬組成物にも関する。

【背景技術】

【0002】

非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、全死因死亡率、肝硬変および末期肝疾患の増大、心血管死亡率の増大、ならびに肝臓関連および非肝臓関連がん両方の発生率の増大に関連する、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ、５％以上の肝臓脂肪症の存在として定義される）の臨床的および組織学的サブセットである（Ｓａｎｙａｌら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１５；６１（４）：１３９２〜１４０５）。ＮＡＦＬＤは、代謝症候群の肝臓の兆候であり、脂肪症、ＮＡＳＨ、線維症、肝硬変および最終的に肝細胞癌を包含する一連の肝臓の状態である。ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨは、肝臓の脂質の上昇がある個体の最も大きな割合を占めることから、原発性脂肪肝疾患とみなされる。ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの重症度は、脂質、炎症性細胞浸潤、肝細胞風船化の存在、および線維症の程度に基づく。現時点では、処置の選択肢は関連状態の管理に限定される（ＥＡＳＬ−ＥＡＳＤ−ＥＡＳＯ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２０１６；６４（６）：１３８８〜１４０２）。

【0003】

脂質代謝の変化が、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨの分子病因に寄与すると仮定されてきた。脂肪症は、ＮＡＳＨの病因の、必要だが十分ではない構成要素である（Ｄａｙ ＣおよびＪａｍｅｓ Ｏ．、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．１９９８；２７（６）：１４６３〜６）。これと一致して、複数の研究が、脂肪症の重症度により、併発する脂肪性肝炎のリスクおよび肝硬変への進行のリスクが予測されることを実証している（Ｓｏｒｅｎｓｅｎら、Ｌａｎｃｅｔ．１９８４；２（８３９７）：２４１〜４；Ｗａｎｌｅｓｓ ＩおよびＬｅｎｔｚ Ｊ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９０；１２（５）：１１０６〜１０；Ｒｅｅｖｅｓ Ｈら、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１９９６；２５（５）：６７７〜８３）。肝臓脂肪症は、トリグリセリド生成／肝臓への取り込みおよびクリアランス／除去における不均衡の結果である（Ｃｏｈｅｎ ＪＣら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１１；３３２（６０３７）：１５１９〜１５２３）。ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの発生を支持する代謝原動力である脂肪症を低減させることは、肝臓炎症および線維症におけるその後の改善をもたらすであろうという仮説が立てられている。

【0004】

アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）およびジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２（ＤＧＡＴ２）は、脂質代謝を調節する２つの主要な酵素である。ＡＣＣは、デノボ脂質生成（ＤＮＬ）のプロセスにおける必須かつ律速なステップを触媒する（Ｓａｇｇｅｒｓｏｎ Ｄ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．２００８；２８：２５３〜７２）。さらに、ＡＣＣは、酵素カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１（ＣＰＴ１）のアロステリック調節により、脂肪酸のミトコンドリアベータ酸化も調節する（Ｓａｇｇｅｒｓｏｎ、２００８；Ｗａｉｔｅ ＭおよびＷａｋｉｌ ＳＪ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９６２；２３７：２７５０〜２７５７）。新たに出現したデータは、ＡＣＣ阻害によるＤＮＬの抑制が、Ｔヘルパー１７系統の炎症性インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）分泌Ｔ細胞（Ｔｈ１７細胞）の形成を制限し、抗炎症ＦｏｘＰ３（＋）調節Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の発生を有利にすることによって、炎症を直接低減させ得ることも示唆する（Ｂｅｒｏｄ Ｌら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０１４；２０（１１）：１３２７〜３３）。

【0005】

ＡＣＣ活性の阻害は、少なくとも２つの独立した機序により、ＮＡＳＨ患者にとって有益であると仮定される。上記でまとめた通り、ＮＡＦＬＤを持つヒトは、肝臓のＤＮＬの著しい上昇を示し、薬理学的な肝臓ＡＣＣ阻害によるこのフラックス増大の正常化は、脂肪症を低減させると仮定される。加えて、脂肪酸酸化を増大させるＡＣＣ阻害剤の効果は、肝臓脂肪含有量を低減させることにも寄与し得る。これと一致して、ＡＣＣ阻害剤は、ＤＮＬを阻害することが示されている。Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ＤＡら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１４；５７（２４）：１０５１２〜１０５２６；Ｋｉｍ ＣＷら、Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．２０１７；２６、３９４〜４０６；Ｓｔｉｅｄｅ Ｋら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１７；６６（２）：３２４〜３３４；Ｌａｗｉｔｚ ＥＪら、Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．２０１８（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｇｈ．２０１８．０４．０４２）を参照されたい。加えて、ＩＬ−１７分泌Ｔ細胞におけるＤＮＬの阻害は、ＮＡＳＨ病因において重要となり得る経路である（Ｒａｕ Ｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６；１９６（１）：９７〜１０５）炎症性Ｔｈ１７細胞の形成を制限し（Ｂｅｒｏｄら、２０１４）、抗炎症Ｔｒｅｇ細胞の発生を有利にすることによって、肝臓炎症を抑制することが期待されている。さらに、ＡＣＣ阻害は、星状細胞活性化および線維症を低減させ得る（Ｒｏｓｓら、２０１９）。

【0006】

トリグリセリドまたはトリアシルグリセロール（ＴＧ）は、哺乳動物におけるエネルギー貯蔵の主要な形態を表す。ＴＧは、グリセロールと、様々な鎖長および飽和度の３つの脂肪酸との順次エステル化によって形成される（Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｒ．Ａ．およびＭａｓｈｅｋ，Ｄ．Ｇ．２０１１．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１１１：６３５９〜６３８６）。腸または肝臓において合成されたＴＧは、カイロミクロンまたは超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）にそれぞれ包まれ、末梢組織に移出され、そこで、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）によって、それらの構成要素である脂肪酸およびグリセロールに加水分解される。結果として生じた非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）は、さらに代謝されてエネルギーを生成するか、または再エステル化され、貯蔵されるかのいずれかであり得る。

【0007】

正常な生理的条件下では、エネルギー密度の高いＴＧは、それを放出する需要があるまで、種々の脂肪蓄積部内に隔離されたままであり、需要があるとすぐに、グリセロールおよび遊離脂肪酸に加水分解され、次いで、これが血流中に放出される。このプロセスは、種々の生理的条件下でＴＧ貯蔵の沈着および動員を促進する、インスリン、およびカテコールアミン等のホルモンの反対作用によって、厳密に調節される。食後の状況では、インスリンが脂肪分解を阻害する作用をし、それにより、ＮＥＦＡの形態でのエネルギーの放出を制限し、脂肪蓄積部における食事中の脂質の適切な貯蔵を確実にする。しかしながら、２型糖尿病患者では、脂肪分解を抑制するインスリンの能力が向上し、脂肪細胞からのＮＥＦＡフラックスが不適切に上昇する。これが今度は、筋肉および肝臓等の組織への脂質の送達の増大をもたらす。エネルギー需要の非存在下では、ＴＧおよびジアシルグリセロール（ＤＡＧ）等の他の脂質代謝物が蓄積し、インスリン感受性の喪失を引き起こし得る（Ｅｒｉｏｎ，Ｄ．Ｍ．およびＳｈｕｌｍａｎ，Ｇ．Ｉ．２０１０．Ｎａｔ Ｍｅｄ １６：４００〜４０２）。筋肉におけるインスリン抵抗性は、グルコース取り込みおよびグリコーゲン貯蔵の低減を特徴とするのに対し、肝臓では、インスリンシグナル伝達の喪失が、グルコース生産量の調節不全、および２型糖尿病の特質であるＴＧリッチＶＬＤＬの過剰生成を生み出す（Ｃｈｏｉ，Ｓ．Ｈ．およびＧｉｎｓｂｅｒｇ，Ｈ．Ｎ．２０１１．Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２２：３５３〜３６３）。ＴＧが豊富なＶＬＤＬ、いわゆるＶＬＤＬ１粒子の分泌の上昇は、冠状動脈性心疾患のリスク上昇に関連するＬＤＬのアテローム生成促進的な亜画分であるスモールデンス低比重リポタンパク質（ｓｄＬＤＬ）の生成を刺激すると考えられる（Ｓｔ−Ｐｉｅｒｒｅ，Ａ．Ｃ．ら、２００５．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２５：５５３〜５５９）。

【0008】

哺乳動物では、２つのジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）酵素（ＤＧＡＴ１およびＤＧＡＴ２）が特徴付けられている。これらの酵素は、同じ酵素反応を触媒するが、それらのそれぞれのアミノ酸配列は無関係であり、異なった遺伝子ファミリーを占有する。ＤＧＡＴ１をコードする遺伝子に破壊を抱えるマウスは、食事誘導性肥満に耐性があり、エネルギー消費および活性の上昇を有する（Ｓｍｉｔｈ，Ｓ．Ｊ．ら、２０００．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２５：８７〜９０）。Ｄｇａｔ１−／−マウスは、カイロミクロンの吸収後（ｐｏｓｔａｂｏｒｐａｔｉｖｅ）放出の調節不全を呈し、腸細胞内に脂質を蓄積する（Ｂｕｈｍａｎ，Ｋ．Ｋ．ら、２００２．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２５４７４〜２５４７９）。これらのマウスにおいて観察される代謝的に有利な表現型は、腸におけるＤＧＡＴ１発現の喪失によって駆動されることが示唆されている（Ｌｅｅ，Ｂ．ら、２０１０．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．５１：１７７０〜１７８０）。重要なことに、雌Ｄｇａｔ１−／−マウスの授乳における欠陥にもかかわらず、これらの動物は、ＴＧを合成する能力を保持し、さらなるＤＧＡＴ酵素の存在を示唆している。この観察および真菌モルティエレラ・ラマニアナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｒａｍａｎｎｉａｎａ）からの第２のＤＧＡＴの単離が、ＤＧＡＴ２の同定および特徴付けにつながった（Ｙｅｎ，Ｃ．Ｌ．ら、２００８．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４９：２２８３〜２３０１）。

【0009】

ＤＧＡＴ２は、肝臓および脂肪において高度に発現され、ＤＧＡＴ１とは異なり、ＤＡＧに対する申し分ない基質特異性を呈する（Ｙｅｎ，Ｃ．Ｌ．、２００８）。げっ歯類におけるＤＧＡＴ２遺伝子の欠失は、子宮内発育不良、重度の脂肪血症、皮膚バリア機能異常および出生後早期死亡をもたらす（Ｓｔｏｎｅ，Ｓ．Ｊ．ら、２００４．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１１７６７〜１１７７６）。ＤＧＡＴ２の喪失によって引き起こされる致死性により、ＤＧＡＴ２の生理的役割に関する我々の理解のほとんどは、代謝性疾患のげっ歯類モデルにおけるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を用いて実施される研究に由来する。この設定では、肝臓ＤＧＡＴ２の阻害は、血漿リポタンパク質プロファイルにおける改善（総コレステロールおよびＴＧにおける減少）および肝臓の脂質負荷の低減をもたらし、これには、インスリン感受性および全身グルコースコントロールの改善が付随していた（Ｌｉｕ，Ｙ．ら、２００８．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １７８１：９７〜１０４；Ｃｈｏｉ，Ｃ．Ｓ．ら、２００７．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：２２６７８〜２２６８８；Ｙｕ，Ｘ．Ｘ．ら、２００５．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４２：３６２〜３７１）。これらの観察の根底にある分子機序は完全には解明されていないが、ＤＧＡＴ２の抑制は、ステロール応答エレメント結合タンパク質１ｃ（ＳＲＥＢＰ１ｃ）およびステアロイルＣｏＡ−デサチュラーゼ１（ＳＣＤ１）を含む、脂質生成（ｌｉｐｏｇｅｎｓｉｓ）に関与するタンパク質をコードする複数の遺伝子の発現の下方調節をもたらすことが明らかである（Ｃｈｏｉ、２００７；Ｙｕ、２００５）。並行して、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１（ＣＰＴ１）等の遺伝子の発現増大から明らかなように、酸化的経路が誘導される（Ｃｈｏｉ、２００７）。これらの変化の最終結果は、肝臓ＤＡＧおよびＴＧ脂質のレベルを減少させることであり、これが今度は、肝臓におけるインスリン応答性の改善につながる。さらに、ＤＧＡＴ２阻害は、肝臓ＶＬＤＬ ＴＧ分泌、および循環コレステロールレベルの低減を抑制する。最後に、おそらく新たに合成されたＡＰＯＢタンパク質の脂質化のためのＴＧの供給の減少により、血漿アポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯＢ）レベルが抑制された（Ｌｉｕ、２００８；Ｙｕ、２００５）。血糖コントロールおよび血漿コレステロールプロファイルの両方に対するＤＧＡＴ２阻害の有益な効果は、この標的が代謝性疾患の処置において貴重であるかもしれないことを示唆している（Ｃｈｏｉ、２００７）。加えて、ＤＧＡＴ２活性の抑制が肝臓の脂質蓄積の低減をもたらすという観察は、この酵素の阻害剤がＮＡＳＨの処置において有用性を有するかもしれないことを示唆している。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】国際出願公開第ＰＣＴ／ＩＢ２０１１／０５４１１９号

【特許文献2】ＵＳ８，８５９，５７７

【特許文献3】ＷＯ２０１９／１０２３１１

【特許文献4】国際特許出願公開第ＰＣＴ／ＩＢ２０１８／０５８９６６号

【特許文献5】ＷＯ２０１６／１１２３０５

【特許文献6】欧州特許出願公開第０９０１７８６Ａ２号

【特許文献7】米国特許第５，４５６，９２３号

【特許文献8】米国特許第５，９３９，０９９号

【特許文献9】米国特許第５，３４０，５９１号

【特許文献10】米国特許第４，６７３，５６４号

【特許文献11】米国特許第５，７０７，６４６号

【特許文献12】米国特許第４，８９４，２３５号

【特許文献13】米国特許第９，８０９，５７９号

【特許文献14】米国公開特許出願第２０１８−００５１０１２Ａ１号

【特許文献15】米国特許第１０，２０８，０１９号

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Ｓａｎｙａｌら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１５；６１（４）：１３９２〜１４０５

【非特許文献2】ＥＡＳＬ−ＥＡＳＤ−ＥＡＳＯ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２０１６；６４（６）：１３８８〜１４０２

【非特許文献3】Ｄａｙ ＣおよびＪａｍｅｓ Ｏ．、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．１９９８；２７（６）：１４６３〜６

【非特許文献4】Ｓｏｒｅｎｓｅｎら、Ｌａｎｃｅｔ．１９８４；２（８３９７）：２４１〜４

【非特許文献5】Ｗａｎｌｅｓｓ ＩおよびＬｅｎｔｚ Ｊ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９０；１２（５）：１１０６〜１０

【非特許文献6】Ｒｅｅｖｅｓ Ｈら、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１９９６；２５（５）：６７７〜８３

【非特許文献7】Ｃｏｈｅｎ ＪＣら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１１；３３２（６０３７）：１５１９〜１５２３

【非特許文献8】Ｓａｇｇｅｒｓｏｎ Ｄ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．２００８；２８：２５３〜７２

【非特許文献9】Ｗａｉｔｅ ＭおよびＷａｋｉｌ ＳＪ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９６２；２３７：２７５０〜２７５７

【非特許文献10】Ｂｅｒｏｄ Ｌら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０１４；２０（１１）：１３２７〜３３

【非特許文献11】Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ＤＡら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１４；５７（２４）：１０５１２〜１０５２６

【非特許文献12】Ｋｉｍ ＣＷら、Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．２０１７；２６、３９４〜４０６

【非特許文献13】Ｓｔｉｅｄｅ Ｋら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１７；６６（２）：３２４〜３３４

【非特許文献14】Ｌａｗｉｔｚ ＥＪら、Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．２０１８（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｇｈ．２０１８．０４．０４２）

【非特許文献15】Ｒａｕ Ｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６；１９６（１）：９７〜１０５

【非特許文献16】Ｒｏｓｓら、２０１９

【非特許文献17】Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｒ．Ａ．およびＭａｓｈｅｋ，Ｄ．Ｇ．２０１１．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１１１：６３５９〜６３８６

【非特許文献18】Ｅｒｉｏｎ，Ｄ．Ｍ．およびＳｈｕｌｍａｎ，Ｇ．Ｉ．２０１０．Ｎａｔ Ｍｅｄ １６：４００〜４０２

【非特許文献19】Ｃｈｏｉ，Ｓ．Ｈ．およびＧｉｎｓｂｅｒｇ，Ｈ．Ｎ．２０１１．Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２２：３５３〜３６３

【非特許文献20】Ｓｔ−Ｐｉｅｒｒｅ，Ａ．Ｃ．ら、２００５．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２５：５５３〜５５９

【非特許文献21】Ｓｍｉｔｈ，Ｓ．Ｊ．ら、２０００．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２５：８７〜９０

【非特許文献22】Ｂｕｈｍａｎ，Ｋ．Ｋ．ら、２００２．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２５４７４〜２５４７９

【非特許文献23】Ｌｅｅ，Ｂ．ら、２０１０．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．５１：１７７０〜１７８０

【非特許文献24】Ｙｅｎ，Ｃ．Ｌ．ら、２００８．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４９：２２８３〜２３０１

【非特許文献25】Ｓｔｏｎｅ，Ｓ．Ｊ．ら、２００４．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１１７６７〜１１７７６

【非特許文献26】Ｌｉｕ，Ｙ．ら、２００８．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １７８１：９７〜１０４

【非特許文献27】Ｃｈｏｉ，Ｃ．Ｓ．ら、２００７．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：２２６７８〜２２６８８

【非特許文献28】Ｙｕ，Ｘ．Ｘ．ら、２００５．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４２：３６２〜３７１

【非特許文献29】Ｂｅｒｇｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６、１〜１９（１９７７）

【非特許文献30】Ｂｅｒｇｍａｎら、ＡＣＣＰ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｅｏｐｍｅｎｔ ２０２０、００（０）１〜１３

【非特許文献31】Ｌｏｕｉｓ Ｆ．ＦｉｅｓｅｒおよびＭａｒｙ Ｆｉｅｓｅｒ、Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第１〜１９巻、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６７〜１９９９年版）

【非特許文献32】Ｂｅｉｌｓｔｅｉｎｓ Ｈａｎｄｂｕｃｈ ｄｅｒ ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ、第４版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ

【非特許文献33】Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１

【非特許文献34】Ｂｅｒｇｍａｎら、（２０１８）Ｊ．ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、第６８巻、Ｓ５８２

【非特許文献35】Ｄｒｅｓｃｈｅｒ，Ｈ．ら（「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ｉｎ ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ（ＮＡＦＬＤ）ａｎｄ ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ （ＮＡＳＨ）、Ｃｅｌｌｓ ２０１９、８、８４５）

【非特許文献36】Ｒａｔｚｉｕ、Ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ ｆｏｒ ｎｏｎ−ｃｉｒｒｈｏｔｉｃ ＮＡＳＨ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｒｉａｌｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２０１８、６８．３５３〜３６１

【非特許文献37】Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ Ｍｄ、第２０版、２０００

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

上記を考慮すると、（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミド（ＤＧＡＴ２阻害剤）または薬学的に許容できるその塩と、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸（ＡＣＣＩ阻害剤）または薬学的に許容できるその塩との組合せを含有する医薬、例えば、経口医薬の必要性が存在する。本明細書において記述される具体的な組合せは、この既存のニーズを満たす。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明は、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、肝線維症を伴う非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変を伴う非アルコール性脂肪性肝炎、ならびに肝硬変および肝細胞癌または代謝関連疾患を伴う非アルコール性脂肪性肝炎から選択される疾患または状態を処置するための方法であって、それを必要とするヒトに、治療有効量の、約５ｍｇから約１２００ｍｇまでの（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩と、約５ｍｇから約６０ｍｇまでの４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩とを含む組成物を投与するステップを含む方法を対象とする。

【0014】

本発明は、脂肪肝、アルコール性脂肪肝疾患、アルコール性脂肪性肝炎、肝線維症を伴うアルコール性脂肪性肝炎、肝硬変を伴うアルコール性脂肪性肝炎、ならびに肝硬変および肝細胞癌または代謝関連疾患を伴うアルコール性脂肪性肝炎から選択される疾患または状態を処置するための方法であって、それを必要とするヒトに、治療有効量の、約５ｍｇから約１２００ｍｇまでの（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩と、約５ｍｇから約６０ｍｇまでの４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩とを含む組成物を投与するステップを含む方法も対象とする。

【0015】

本発明は、アテローム性動脈硬化、脳卒中、心筋梗塞、大動脈血管疾患、脳血管疾患、腎臓血管疾患、心不全、心房細動または冠状動脈性心疾患から選択される心血管疾患または状態を処置するための方法であって、それを必要とするヒトに、治療有効量の、約５ｍｇから約１２００ｍｇまでの（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩と、約５ｍｇから約６０ｍｇまでの４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩とを含む組成物を投与するステップを含む方法も対象とする。

【0016】

本発明は、肥満、脂質異常症、２型真性糖尿病、２型真性糖尿病患者における血糖コントロール、耐糖能異常（ＩＧＴ）の状態、空腹時血漿グルコース異常の状態、代謝症候群、症候群Ｘ、高血糖症、高インスリン血症、インスリン抵抗性またはグルコース代謝異常から選択される代謝性疾患または状態を処置するための方法であって、それを必要とするヒトに、治療有効量の、約５ｍｇから約１２００ｍｇまでの（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩と、約５ｍｇから約６０ｍｇまでの４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩とを含む組成物を投与するステップを含む方法も対象とする。

【0017】

先述の概要および下記の詳細な記述はいずれも、例示的かつ説明的なものにすぎず、特許請求される通りの本発明の制限ではないことを理解されたい。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】ＤＧＡＴ２ｉ化合物（化合物Ｄ）の実施例１の結晶形態１を示す特徴的なｘ線粉末回折パターンを示す図である（縦軸：強度（ＣＰＳ）；横軸：２シータ（度））。

【図2】ＤＧＡＴ２ｉ化合物（化合物Ｄ）の実施例１の結晶形態２を示す特徴的なｘ線粉末回折パターンを示す図である（縦軸：強度（ＣＰＳ）；横軸：２シータ（度））。

【図3】Ｃｕ放射線源が装備されたＢｒｕｋｅｒ ＡＸＳ Ｄ４エンデバー回折計で行われた実施例２（化合物Ａ）の形態１の例証的なＰＸＲＤパターンを示す図である。

【図4】ＦＴ−ＩＲベンチに取り付けられたＮｉｃｏｌｅｔ ＮＸＲ ＦＴ−ラマンアクセサリーを使用して収集した実施例２（化合物Ａ）の形態１の例証的なラマンスペクトルを示す図である。

【図5】ＢｒｕｋｅｒバイオスピンアバンセＩＩＩ ５００ＭＨｚ（^１Ｈ周波数）ＮＭＲ分光計内に位置付けられたＢｒｕｋｅｒバイオスピンＣＰＭＡＳプローブで行われた実施例２（化合物Ａ）の形態１の例証的な^１３Ｃ ｓｓＮＭＲパターンを示す図である。

【図6】Ｃｕ放射線源が装備されたＢｒｕｋｅｒ ＡＸＳ Ｄ４エンデバー回折計で行われた実施例２（化合物Ａ）の形態２の例証的なＰＸＲＤパターンを示す図である。

【図7】ＦＴ−ＩＲベンチに取り付けられたＮｉｃｏｌｅｔ ＮＸＲＦＴ−ラマンアクセサリーを使用して収集した実施例２（化合物Ａ）の形態２の例証的なラマンスペクトルを示す図である。

【図8】ＢｒｕｋｅｒバイオスピンアバンセＩＩＩ ５００ＭＨｚ（^１Ｈ周波数）ＮＭＲ分光計内に位置付けられたＢｒｕｋｅｒバイオスピンＣＰＭＡＳプローブを使用して行われた実施例２（化合物Ａ）の形態２の例証的な^１３Ｃ ｓｓＮＭＲパターンを示す図である。

【図9】実施例２（化合物Ａ）の形態２の例証的な単結晶構造を示す図である。

【図10】給餌状態で測定された、西洋食給餌スプラーグドーリーラットにおける血漿トリグリセリドレベルに対する、化合物Ａおよび化合物Ｄの単剤療法としてのおよび組み合わせた経口投与の効果をまとめた図である。

【図11】絶食状態で測定された、西洋食給餌スプラーグドーリーラットにおける血漿トリグリセリドレベルに対する、化合物Ａおよび化合物Ｄの単剤療法としてのおよび組み合わせた経口投与の効果をまとめた図である。

【図12】西洋食給餌ラットにおけるＳＲＥＢＰ−１核局在化に対する、単剤療法としてのおよび組み合わせた化合物Ａおよび化合物Ｄの投与の効果をまとめた図である。

【図13】西洋食給餌ラットにおける肝臓の脂質生成遺伝子発現、具体的にはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ１）に対する、単剤療法としてのおよび組み合わせた化合物Ａおよび化合物Ｄの投与の効果をまとめた図である。

【図14】西洋食給餌ラットにおける肝臓の脂質生成遺伝子発現、具体的には脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳＮ）に対する、単剤療法としてのおよび組み合わせた化合物Ａおよび化合物Ｄの投与の効果をまとめた図である。

【図15】西洋食給餌ラットにおける肝臓の脂質生成遺伝子発現、具体的にはステロール−ＣｏＡデサチュラーゼ（ＳＣＤ１）に対する、単剤療法としてのおよび組み合わせた化合物Ａおよび化合物Ｄの投与の効果をまとめた図である。

【図16】西洋食給餌ラットにおける肝臓の脂質生成遺伝子発現、具体的にはステロール応答エレメント結合タンパク質１ｃ（ＳＲＥＢＰ−１ｃ）に対する、単剤療法としてのおよび組み合わせた化合物Ａおよび化合物Ｄの投与の効果をまとめた図である。

【図17】西洋食給餌ラットにおける肝臓の脂質生成遺伝子発現、具体的にはプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）に対する、単剤療法としてのおよび組み合わせた化合物Ａおよび化合物Ｄの投与の効果をまとめた図である。

【図18】西洋食給餌スプラーグ・ドーリーラットにおける肝臓トリグリセリドレベルに対する化合物Ａおよび化合物Ｄの単剤療法としてのおよび組み合わせた経口投与の効果をまとめた図である。

【図19】コリン欠乏および高脂肪食（ＣＤＡＨＦＤ）給餌雄ウィスターハンラットにおける肝臓炎症および線維症のマーカーである肝臓の弾性に対する、化合物Ａおよび化合物Ｄの単剤療法としてのおよび組み合わせた経口投与の効果をまとめた図である。

【図20】ＣＤＡＨＦＤ給餌雄ウィスターハンラットにおける筋線維芽細胞活性化および線維形成のマーカーである肝臓のアルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）免疫組織化学に対する、化合物Ａおよび化合物Ｄの単剤療法としてのおよび組み合わせた経口投与の効果をまとめた図である。

【図21】ＣＤＡＨＦＤ給餌雄ウィスターハンラットにおける肝臓のピクロシリウス（Ｐｉｃｏｓｉｒｉｕｓ）レッド染色に対する、化合物Ａおよび化合物Ｄの単剤療法としてのおよび組み合わせた経口投与の効果をまとめた図である。

【図22】ＣＤＡＨＦＤ給餌雄ウィスターハンラットにおける肝臓のアルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）遺伝子発現に対する、化合物Ａおよび化合物Ｄの単剤療法としてのおよび組み合わせた経口投与の効果をまとめた図である。

【図23】ＣＤＡＨＦＤ給餌雄ウィスターハンラットにおける肝臓のコラーゲン１Ａ１遺伝子発現に対する、化合物Ａおよび化合物Ｄの単剤療法としてのおよび組み合わせた経口投与の効果をまとめた図である。

【図24】ＣＤＡＨＦＤ給餌雄ウィスターハンラットにおけるイオン化カルシウム結合アダプター分子１染色に対する、化合物Ａおよび化合物Ｄの単剤療法としてのおよび組み合わせた経口投与の効果をまとめた図である。

【図25a】本明細書において記述される第２Ａ相研究のための処置アーム（ａｒｍ）によるＷＬＦデータの箱ひげ図を示す図である。

【図25b】３０％以上の肝臓脂肪の低減がある対象の％を示す図である。

【図25c】５０％以上の肝臓脂肪の低減がある対象の％を示す図である。

【図26】本明細書において記述される第２Ａ相研究のための血清トリグリセリドにおけるベースラインからのパーセント変化を表す最小二乗平均値および９０％ＣＩのプロットを示す図である。

【図27a】本明細書において記述される第２Ａ相研究のためのアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）におけるベースラインからのパーセント変化を表す最小二乗平均値および９０％ＣＩのプロットを示す図である。

【図27b】本明細書において記述される第２Ａ相研究のためのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）におけるベースラインからのパーセント変化を表す最小二乗平均値および９０％ＣＩのプロットを示す図である。

【図27c】本明細書において記述される第２Ａ相研究のためのアルカリフォスファターゼにおけるベースラインからのパーセント変化を表す最小二乗平均値および９０％ＣＩのプロットを示す図である。

【図27d】本明細書において記述される第２Ａ相研究のためのガンマグルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）におけるベースラインからのパーセント変化を表す最小二乗平均値および９０％ＣＩのプロットを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本発明は、本発明の例示的な実施形態の下記の詳細な記述およびその中に含まれる例を参照することにより、より容易に理解され得る。

【0020】

本発明は、作製のための具体的な合成方法に限定されず、それらは当然変動し得ることを理解されたい。本明細書において使用される術語は、特定の実施形態を記述することのみを目的とし、限定的であることを意図したものではないことも理解されたい。本明細書においておよびこの後の請求項において、若干数の用語を参照することになり、これらは下記の意味を有すると定義されるものとする。

【0021】

本明細書において使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは複数を意味し得る。請求項において使用される場合、語「を含む」と併せて使用される際は、語「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは１つ超を意味し得る。本明細書において使用される場合、「別の」は、少なくとも第２またはそれ以上を意味し得る。

【0022】

用語「約」は、それが表す公称値のプラスまたはマイナス１０％の近似を表示する相対的な用語を指す。本開示の分野では、このレベルの近似は、該値がより狭い範囲を必要とするように具体的に述べられているのでない限り、適切である。

【0023】

「化合物」は、本明細書において使用される場合、本明細書において記述される化合物、または、配座異性体（例えば、シスおよびトランス異性体）およびすべての光学異性体（例えば、鏡像異性体およびジアステレオマー）、そのような異性体のラセミ、ジアステレオマーおよび他の混合物、ならびに溶媒和物、水和物、同形体、多形体、互変異性体、エステル、塩形態およびプロドラッグを含む、任意の薬学的に許容できる誘導体もしくは変化物を含む。表現「プロドラッグ」は、投与後に何らかの化学的または生理的プロセスを介してインビボで薬物を放出する薬物前駆体である化合物を指す（例えば、プロドラッグが生理的ｐＨにされてまたは酵素作用を介して所望の薬物形態に変換される）。例示的なプロドラッグは、開裂時に対応する遊離酸を放出し、本発明の化合物のそのような加水分解性エステル形成残基は、カルボキシル部分を有するものを含むがこれらに限定されず、ここで、遊離水素は、（Ｃ_１〜Ｃ_４）アルキル、（Ｃ_２〜Ｃ_７）アルカノイルオキシメチル、４から９個までの炭素原子を有する１−（アルカノイルオキシ）エチル、５から１０個までの炭素原子を有する１−メチル−１−（アルカノイルオキシ）−エチル、３から６個までの炭素原子を有するアルコキシカルボニルオキシメチル、４から７個までの炭素原子を有する１−（アルコキシカルボニルオキシ）エチル、５から８個までの炭素原子を有する１−メチル−１−（アルコキシカルボニルオキシ）エチル、３から９個までの炭素原子を有するＮ−（アルコキシカルボニル）アミノメチル、４から１０個までの炭素原子を有する１−（Ｎ−（アルコキシカルボニル）アミノ）エチル、３−フタリジル、４−クロトノラクトニル、ガンマ−ブチロラクトン−４−イル、ジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ_１〜Ｃ_２）アルキルアミノ（Ｃ_２〜Ｃ_３）アルキル（β−ジメチルアミノエチル等）、カルバモイル−（Ｃ_１〜Ｃ_２）アルキル、Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ_１〜Ｃ_２）アルキルカルバモイル−（Ｃ_１〜Ｃ_２）アルキルおよびピペリジノ−、ピロリジノ−またはモルホリノ（Ｃ_２〜Ｃ_３）アルキルによって置きかえられている。

【0024】

「患者」は、例えば、モルモット、マウス、ラット、スナネズミ、ネコ、ウサギ、イヌ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、サル、チンパンジーおよびヒト等の温血動物を指す。「哺乳動物」は、患者である。

【0025】

「薬学的に許容できる」が意味するのは、物質または組成物が、製剤を構成する他の原料および／またはそれにより処置される哺乳動物と、化学的にかつ／または毒物学的に適合性でなくてはならないことである。

【0026】

本明細書において使用される場合、下記の用語は、医薬作用物質の投与のための一般的な意味を有する：ＱＤは１日１回を意味し、ＢＩＤは１日２回を意味する。

【0027】

本明細書において使用される場合、用語「選択性」または「選択的」は、第２のアッセイにおける同じ化合物の効果と比較した、第１のアッセイにおける化合物のより優れた効果を指す。例えば、「消化管選択的」化合物では、第１のアッセイは腸における化合物の半減期についてのものであり、第２のアッセイは肝臓における化合物の半減期についてのものである。

【0028】

「治療有効量」は、本明細書において記述される特定の疾患、状態または障害を処置する、本明細書において記述される化合物の量を意味する。「治療有効量」は、本明細書において記述される特定の疾患、状態または障害を処置する、ある量の（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドと組み合わせた、ある量の別の化合物と組み合わせていてもよい、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸の量も意味し得る。

【0029】

用語「処置すること」、「処置する」または「処置」は、本明細書において使用される場合、予防的、すなわち、防護的；緩和的処置、すなわち、患者の疾患（または状態）または疾患（または状態）に関連する任意の組織損傷の進行を、和らげる、緩和するまたは減速させる；処置が開始されたら患者の疾患（または状態）が緩和されるだけでなく疾患（または状態）に関連する任意の組織損傷がより良好な状態になる好転を内包する。この後者は、例えば、限定ではないが、下記のいずれか１つまたは複数から起こり得る：肝生検に基づくＮＡＳＨ消散のおよび／もしくは線維症スコアにおける改善からの実証；肝硬変、肝細胞癌および／もしくは他の肝臓関連の転帰への進行の発生率が低いこと；非アルコール性脂肪性肝炎活性の血清もしくは撮像ベースのマーカーのレベルの低減もしくは改善；非アルコール性脂肪性肝炎疾患活動性の低減もしくは改善；または非アルコール性脂肪性肝炎の医学的結果における低減。

【0030】

本発明の化合物は、不斉またはキラル中心を含有してよく、したがって、異なる立体異性形態で存在し得る。別段の定めがない限り、本発明の化合物のすべての立体異性形態およびラセミ混合物を含むそれらの混合物は、本発明の一部を形成することが意図されている。加えて、本発明は、すべての幾何および位置異性体を内包する。例えば、本発明の化合物が二重結合または縮合環を組み込む場合、シスおよびトランス形態の両方ならびに混合物は、本発明の範囲内に内包される。

【0031】

本発明のキラル化合物（およびそのキラル前駆体）は、不斉固定相を持つ、ならびに、０から５０％までのイソプロパノール、典型的には２から２０％まで、および０から５％までのアルキルアミン、典型的には０．１％のジエチルアミン（ＤＥＡ）またはイソプロピルアミンを含有する炭化水素、典型的にはヘプタンまたはヘキサンからなる移動相を持つ樹脂上で、クロマトグラフィー、典型的には高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）を使用して、鏡像異性的に富化された形態で取得され得る。溶離液の濃縮は、富化混合物をもたらす。

【0032】

ジアステレオマー混合物は、クロマトグラフィーおよび／または分別結晶によって等、当業者に周知の方法によって、それらの物理化学的差異に基づいてそれらの個々のジアステレオ異性体に分離され得る。鏡像異性体は、適切な光学活性化合物（例えば、キラルアルコールまたはモーシェル酸クロリド等のキラル補助基）との反応によって鏡像異性混合物をジアステレオマー混合物に変換し、ジアステレオ異性体を分離し、個々のジアステレオ異性体を対応する純粋な鏡像異性体に変換する（例えば、加水分解する）ことによって、分離することができる。鏡像異性体は、キラルＨＰＬＣカラムの使用によって分離することもできる。代替として、特異的な立体異性体は、光学活性出発材料を使用することによって、光学活性試薬、基質、触媒もしくは溶媒を使用する不斉合成によって、または１つの立体異性体を不斉転換によって他のものに変換することによって、合成されてよい。

【0033】

本発明の化合物が、２つ以上の立体中心を保有し絶対または相対立体化学が名称に記されている場合、呼称ＲおよびＳは、各分子について従来のＩＵＰＡＣ番号スキームに従う番号の昇順（１、２、３等）の各立体中心をそれぞれ指す。本発明の化合物が、１つまたは複数の立体中心を保有し、立体化学が名称にも構造にも記されていない場合、該名称または構造は、ラセミ形態を含む化合物のすべての形態を包含するように意図されていることが理解される。

【0034】

本発明の中間体および化合物は、異なる互変異性形態で存在し得ることも可能であり、すべてのそのような形態は本発明の範囲内に内包される。用語「互変異性体」または「互変異性形態」は、低エネルギー障壁を介して相互交換可能である異なるエネルギーの構造異性体を指す。例えば、プロトン互変異性体（プロトトロピック互変異性体としても公知）は、ケト−エノールおよびイミン−エナミン異性化等のプロトンの移動を介する相互変換を含む。

【0035】

原子価互変異性体は、結合性電子のいくつかの再編成による相互変換を含む。

【0036】

特許請求される本発明の化合物の範囲内に含まれるものは、複数種の異性を呈する化合物およびその１つまたは複数の混合物を含む、本発明の化合物のすべての立体異性体、幾何異性体および互変異性形態を含む。対イオンが光学活性である酸付加もしくは塩基塩、例えば、Ｄ−乳酸もしくはＬ−リジン、またはラセミである該塩、例えば、ＤＬ−酒石酸またはＤＬ−アルギニンも含まれる。

【0037】

本発明は、１個または複数の原子が、同じ原子数であるが自然界において通常見られる原子質量または質量数とは異なる原子質量または質量数を有する原子によって置きかえられている、本発明のすべての薬学的に許容できる同位体標識化合物を含む。

【0038】

本発明の化合物への包含に好適な同位体の例は、^２Ｈおよび^３Ｈ等の水素、^１１Ｃ、^１３Ｃおよび^１４Ｃ等の炭素、^３６Ｃｌ等の塩素、^１８Ｆ等のフッ素、^１２３Ｉ、^１２４Ｉおよび^１２５Ｉ等のヨウ素、^１３Ｎおよび^１５Ｎ等の窒素、^１５Ｏ、^１７Ｏおよび^１８Ｏ等の酸素、^３２Ｐ等のリン、ならびに^３５Ｓ等の硫黄の同位体を含む。

【0039】

本発明のある特定の同位体標識化合物、例えば、放射性同位体を組み込んだものは、薬物および／または基質組織分布研究において有用である。放射性同位体トリチウム、すなわち^３Ｈ、および炭素−１４、すなわち^１４Ｃは、それらの組み込みの容易性および即時の検出手段を考慮すると、この目的のために特に有用である。

【0040】

重水素、すなわち^２Ｈ等のより重い同位体による置換は、より優れた代謝安定性から生じるある特定の治療上の利点、例えば、インビボ半減期の増大または必要投薬量の低減をもたらし得、故にいくつかの状況において好ましい場合がある。

【0041】

^１１Ｃ、^１８Ｆ、^１５Ｏおよび^１３Ｎ等の陽電子放出同位体による置換は、基質受容体占有率を検査するための陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）研究において有用となり得る。

【0042】

本発明の同位体標識化合物は、概して、当業者に公知である従来の技術によって、または添付の実施例および調製において記述されているものに類似のプロセスによって、先に用いた非標識試薬の代わりに適切な同位体標識試薬を使用して調製することができる。

【0043】

本発明の化合物は、単離され、それ自体、または可能な場合その薬学的に許容できる塩の形態で使用され得る。用語「塩」は、本発明の化合物の無機および有機塩を指す。これらの塩は、化合物の最終単離および精製中にインサイチュで、または化合物を好適な有機もしくは無機酸もしくは塩基で別個に処理し、このように形成された塩を単離することによって、調製することができる。本発明の前述の塩基化合物の薬学的に許容できる酸付加塩を調製するために使用される酸は、非毒性酸付加塩を形成するもの（すなわち、薬理学的に許容できるアニオンを含有する塩、例を挙げると、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、過リン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、酒石酸水素塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、糖酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリルスルホン酸塩、六フッ化リン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トシル酸塩、ギ酸塩、トリフルオロ酢酸塩、シュウ酸塩、べシル酸塩、パルミチン酸塩（ｐａｌｍｉｔｉａｔｅ）、パモ酸塩、マロン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、ホウ酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩およびパモ酸塩（すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエート））である。

【0044】

本発明は、本発明の化合物の塩基付加塩にも関する。性質が酸性である本発明のそれらの化合物の薬学的に許容できる塩基塩を調製するための試薬として使用され得る化学塩基は、そのような化合物と非毒性塩基塩を形成するものである。そのような非毒性塩基塩は、そのような薬理学的に許容できるカチオンに由来するもの、例を挙げると、アルカリ金属カチオン（例えば、リチウム、カリウムおよびナトリウム）およびアルカリ土類金属カチオン（例えば、カルシウムおよびマグネシウム）、アンモニウムまたは水溶性アミン付加塩、例を挙げると、Ｎ−メチルグルカミン−（メグルミン）、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンおよび低級アルカノールアンモニウム、ならびに薬学的に許容できる有機アミンの他の塩基塩を含むがこれらに限定されない。例えば、Ｂｅｒｇｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６、１〜１９（１９７７）を参照されたい。

【0045】

本発明のある特定の化合物は、複数の結晶形態（概して「多形体」と称する）で存在し得る。多形体は、種々の条件下、例えば、再結晶のための異なる溶媒もしくは異なる溶媒混合物を使用する結晶化；異なる温度での結晶化；ならびに／または結晶化中の非常に速いから非常に遅い冷却に及ぶ種々の冷却モードによって調製され得る。多形体は、本発明の化合物を加熱または融解すること、続いて、徐または急速冷却によって取得してもよい。多形体の存在は、固体プローブＮＭＲスペクトル法、ＩＲスペクトル法、示差走査熱量測定、粉末Ｘ線回折またはそのような他の技術によって決定され得る。

【0046】

４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸（「化合物Ａ」とも称される）は、選択的ＡＣＣ阻害剤であり、国際出願公開第ＰＣＴ／ＩＢ２０１１／０５４１１９号の米国国内移行であるＵＳ８，８５９，５７７の実施例９において遊離酸として調製され、これらの両方は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。化合物の結晶形態は、２０１９年５月３１日にＷＯ２０１９／１０２３１１として公開された、国際特許出願公開第ＰＣＴ／ＩＢ２０１８／０５８９６６号において記述されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0047】

ＡＣＣ阻害剤の投与は、肝臓のトリグリセリドを低下させるプラス効果およびＮＡＳＨの処置に対する潜在的に他の有益な効果を有し得るように思われる。循環トリグリセリドレベルの増大は、肝臓ＡＣＣ阻害の機械的な結果であると報告されているが（Ｋｉｍら、２０１７）、ＤＮＬを部分的にしか阻害しないＡＣＣ阻害剤の用量は、循環トリグリセリドの上昇を生成しないことがある（Ｂｅｒｇｍａｎら、ＡＣＣＰ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｅｏｐｍｅｎｔ ２０２０、００（０）１〜１３）。ＷＯ２０１６／１１２３０５は、ＡＣＣ阻害剤を単独でまたは１つもしくは複数の追加の治療剤と組み合わせて使用して、非アルコール性脂肪肝疾患を処置する、安定させるまたはその重症度もしくは進行を減らす方法を提供する。薬学的に許容できる塩として投与されていてもよい４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸の投与は、ヒト対象で観察されたように、西洋食給餌スプラーグドーリーラットにおいて循環トリグリセリドの上昇（概して血漿または血清から測定される）をもたらす潜在性を有することが発見された。加えて、血小板の減少が４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸の投与で報告されている（Ｂｅｒｇｍａｎ，Ａ．ら、「Ｓａｆｅｔｙ， ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ， ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ａ ｌｉｖｅｒ−ｔａｒｇｅｒｔｉｎｇ ＡＣＣ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｏｒａｌ ｄｏｓｅｓ」、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２０１８年４月、第６８巻、付録１、Ｓ５８２頁。

【0048】

（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミド（「化合物Ｄとも称される）は、ＤＧＡＴ２阻害剤であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国公開特許出願第２０１８−００５１０１２Ａ１号の実施例１である。ＤＧＡＴ２阻害剤のＡＣＣ阻害剤との共投与は、ＡＣＣ阻害剤誘導性トリグリセリド上昇を反転させ、単剤療法よりも大きい効能を生成するであろうことが発見された。予想外にも、ＤＧＡＴ２阻害剤のＡＣＣ阻害剤との共投与は、ＡＣＣ阻害剤単剤療法に関連する血小板数における減少を軽減することも発見された。

【0049】

肝生検は、依然としてＮＡＳＨ患者の同定のための標準であるが、炎症性肝疾患患者を同定するための非侵襲的方法が、Ｄｒｅｓｃｈｅｒ，Ｈ．ら（「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ｉｎ ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ（ＮＡＦＬＤ）ａｎｄ ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ （ＮＡＳＨ）、Ｃｅｌｌｓ ２０１９、８、８４５）によって記述されている。これらの非侵襲的代理マーカーは、炎症性肝疾患（肝臓脂肪症、脂肪性肝炎および線維症）を同定するための手段および特異的療法の効能の尺度として信頼を得ることに成功している、血液検査、肝機能検査および撮像を含む。

【0050】

肝臓脂肪症（脂肪症）は、ＮＡＦＬＤにおける主要な要因である。現在存在する特異的な血清マーカーはないが、脂肪症を評価するために利用され得るいくつかの血液バイオマーカーパネルがある。これらの血液バイオマーカーは、ｉ）ＮＡＦＬＤリッジスコア（パラメーターは、ＡＬＴ、ＨＤＬ、コレステロール、トリグリセリド、ＨｂＡ１ｃ、白血球数高血圧症を含む）；ｉｉ）ＮＡＦＬＤ肝臓脂肪スコア（ＮＬＦＳ）（パラメーターは、肝臓脂肪含有量、代謝症候群、２型糖尿病、ＡＳＴ、ＡＳＴ：ＡＬＴ、空腹時インスリンを含む）；ｉｉｉ）肝臓脂肪症指数（ＨＩＳ）（パラメーターは、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＢＭＩ、糖尿病、性別を含む）；ｉｖ）脂肪肝指数（ＦＬＩ）（パラメーターは、ＢＭＩ、胴囲、トリグリセリド、γ−グルタミルトランスフェラーゼを含む）；ｖ）脂肪蓄積量指数（ＬＡＰ）（パラメーターは、性別、トリグリセリド、重量周囲を含む）；ｖｉ）脂肪肝の進行阻害（ＦＬＩＰ）アルゴリズム（パラメーターは、組織学的脂肪症、疾患活動性、線維症スコアを含む）；ｖｉｉ）ＣＨｅｋスコア（パラメーターは、年齢、ＨｂＡ１ｃ、γ−グルタミルトランスフェラーゼ、アディポネクチン、Ｍ３０を含む）；ｖｉｉｉ）ＮＡＦＬＤ線維症スコア（ＮＦＳ）（パラメーターは、ＡＳＴ：ＡＬＴ、アルブミン、血小板数、年齢、ＢＭＩ、高血糖症を含む）；ｉｘ）線維症−４−スコア（ＦＩＢ−４）（パラメーターは、ＡＳＴ、ＡＬＴ、血小板数、年齢を含む）；ｘ）ＡＳＴ対血小板比指数（ＡＰＲＩ）（パラメーターは、ＡＳＴ、血小板数を含む）；ｘｉ）ＢＡＲＤスコア（パラメーターは、ＢＭＩ、ＡＳＴ：ＡＬＴ、糖尿病を含む）；ｘｉｉ）強化された肝線維症パネル（ＥＬＦ）（パラメーターは、年齢、ＴＩＭＰ−１、ＰＩＩＩＮＰ、ヒアルロン酸を含む）；ｘｉｉｉ）Ｈｅｐａスコア（パラメーターは、ビリルビン、γ−グルタミルトランスフェラーゼ、ヒアルロン酸、α_２マクログロブリン（ｍａｃｒｏｇｌｏｂｉｌｉｎ）、年齢、ジェンダーを含む）；ｘｉｖ）フィブロテスト−フィブロＳＵＲＥ／アクチテスト（パラメーターは、α_２マクログロブリン、ハプトグロビン、γ−グルタミルトランスフェラーゼ、総ビリルビン、アポリポタンパク質Ａ１、ＡＬＴ、年齢、ジェンダーを含む）；ならびに、ｘｖ）フィブロメーターＮＡＦＬＤ指数（パラメーターは、血小板数、プロトロンビン指数、フェリチン、ＡＳＴ、ＡＬＴ、体重、年齢、バイブレーションコントロールドトランジエントエラストグラフィによって決定される肝臓剛性を含む）を含み得るがこれらに限定されない。各バイオマーカーについて同定されたパラメーターは、肝臓損傷／機能不全（例えば、ＡＳＴ、ＡＬＴ、γ−ＧＴ、血小板数、ハプトグロビン）、脂質代謝障害（例えば、コレステロール、トリグリセリド）、糖尿病（例えば、ＨｂＡ１ｃ、空腹時（ｆａｓｔｉｎ）インスリンレベル）、炎症（例えば、α_２マクログロブリン、フェリチン）の評価を援助する。

【0051】

撮像技術は、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ患者を同定するために生検および血液バイオマーカーと併せて使用することもできる。撮像技術は、超音波（例えば、造影超音波（ＣＥＵＳ））；超音波ベースのエラストグラフィ（例えば、バイブレーションコントロールドトランジエントエラストグラフィ（ＶＣＴＥ；フィブロスキャン）、リアルタイムせん断波エラストグラフィ（ＳＷＥ）、音響放射力インパルスエラストグラフィ（ＡＲＦＩ）、超音速せん断撮像（ＳＳＩ））；制御減衰パラメーター；ＭＲＩプロトン密度脂肪率（ＭＲＩ−ＰＤＦＦ）等の磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）；ならびに磁気共鳴エラストグラフィ（ＭＲＥ）を含むがこれらに限定されない。

【0052】

先に開示した実施形態のそれぞれでは、（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩と、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩とが、１日に１回投与されることが好ましい。

【0053】

先に開示した実施形態のそれぞれでは、（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩と、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩とが、１日に２回投与されることが好ましい。

【0054】

ある特定の他の実施形態では、Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩の、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩に対する比が、約１：１、約５：１、約１０：１、約１５：１、約２０：１、または約３０：１である。ある特定の実施形態では、該比が、約２０：１である。

【0055】

ある特定の実施形態では、（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩の治療有効量が、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約５０ｍｇ、約７５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２２５ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約６００ｍｇまたは約１２００ｍｇであり、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩の治療有効量が、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約４０ｍｇ、約５０ｍｇまたは約６０ｍｇである、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【0056】

ある特定の実施形態では、（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約６００ｍｇであり、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約２０ｍｇである。

【0057】

ある特定の他の実施形態では、（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約４５０ｍｇであり、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約１５ｍｇである。

【0058】

ある特定の実施形態では、（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約４００ｍｇであり、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約２０ｍｇである。

【0059】

ある特定の他の実施形態では、（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約３００ｍｇである。（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩の治療有効量が約３００ｍｇである場合、ある特定の実施形態では、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約１０ｍｇである。他の実施形態では、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約１５ｍｇである。さらに別の実施形態では、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約２０ｍｇである。

【0060】

ある特定の他の実施形態では、（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約２２５ｍｇであり、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約１５ｍｇである。

【0061】

ある特定の他の実施形態では、（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約２００ｍｇである。（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩の治療有効量が約２００ｍｇである場合、ある特定の実施形態では、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約１０ｍｇである。ある特定の他の実施形態では、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約２０ｍｇである。

【0062】

さらに別の実施形態では、（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約１５０ｍｇである。（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩の治療有効量が約１５０ｍｇである場合、ある特定の実施形態では、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約５ｍｇである。他の実施形態では、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約１０ｍｇである。別の実施形態では、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約１５ｍｇである。

【0063】

さらに別の実施形態では、（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約１００ｍｇである。（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩の治療有効量が約１００ｍｇである場合、ある特定の実施形態では、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約５ｍｇである。別の実施形態では、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約１０ｍｇである。さらに別の実施形態では、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約２０ｍｇである。

【0064】

他の実施形態では、（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約７５ｍｇである。（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩の治療有効量が約７５ｍｇである場合、ある特定の実施形態では、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約５ｍｇである。別の実施形態では、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約１５ｍｇである。

【0065】

別の実施形態では、（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約５０ｍｇである。（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩の治療有効量が約５０ｍｇである場合、ある特定の実施形態では、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約５ｍｇである。別の実施形態では、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約１０ｍｇである。

【0066】

ある特定の他の実施形態では、（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約２５ｍｇであり、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約５ｍｇである。

【0067】

別の実施形態では、（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約２０ｍｇであり、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約２０ｍｇである。

【0068】

さらに別の実施形態では、（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約１５ｍｇであり、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約１５ｍｇである。

【0069】

別の実施形態では、（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約１０ｍｇであり、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約１０ｍｇである。

【0070】

別の実施形態では、（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約５ｍｇであり、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩の治療有効量は、約５ｍｇである。

【0071】

上記の実施形態のいずれかでは、上記で言及した治療有効量のいずれかでの組合せの投与は、１日に１回または２回投与され得る。

【0072】

上記で言及した実施形態のいずれかでは、組合せの投与は、全肝臓脂肪においてベースラインから約３０％以上の変化を実現する。他の事例では、組合せの投与は、全肝臓脂肪におけるベースラインから約５０％以上の変化を実現する。

【0073】

上記で言及した実施形態のいずれかでは、患者の同定は、１つまたは複数の血液マーカーパネルの使用によるものであってよい。好適な血液マーカーパネルは、ＮＡＦＬＤリッジスコア、ＮＡＦＬＤ肝臓脂肪スコア（ＮＬＦＳ）、肝臓脂肪症指数（ＨＩＳ）、脂肪肝指数（ＦＬＩ）、脂肪蓄積量指数（ＬＡＰ）、脂肪肝の進行阻害（ＦＬＩＰ）アルゴリズム、ＣＨｅＫスコア、ＮＡＬＦＤ線維症スコア（ＮＦＳ）、線維症−４スコア（Ｆｉｂ−４）、ＡＳＴ対血小板比指数（ＡＰＲＩ）、ＢＡＲＤスコア、強化された肝線維症パネル（ＥＬＦ）、Ｈｅｐａスコア、フィブロテスト−フィブロＳＵＲＥ／アクチテスト、フィブロメーターＮＡＦＬＤ指数、および先述の任意の組合せからなる群を含むがこれらに限定されない。

【0074】

ある特定の実施形態では、患者が肝臓脂肪症を有すると同定される場合、利用される血液マーカーパネルは、ＮＡＦＬＤリッジスコアである。別の実施形態では、血液マーカーパネルは、ＮＡＦＬＤ肝臓脂肪スコア（ＮＬＦＳ）である。別の実施形態では、血液マーカーパネルは、脂肪肝指数（ＦＬＩ）である。

【0075】

ある特定の実施形態では、患者が脂肪性肝炎を有すると同定される場合、利用される血液マーカーパネルは、脂肪肝の進行阻害（ＦＬＩＰ）アルゴリズムである。別の実施形態では、血液マーカーパネルは、ＣＨｅＫスコアである。

【0076】

ある特定の実施形態では、患者が線維症を有すると同定される場合、利用される血液マーカーパネルは、ＮＡＦＬＤ線維症スコア（ＮＦＳ）である。別の実施形態では、血液マーカーパネルは、線維症−４スコア（Ｆｉｂ−４）である。別の実施形態では、血液マーカーパネルは、ＡＳＴ対血小板比指数（ＡＰＲＩ）である。別の実施形態では、血液マーカーパネルは、ＢＡＲＤスコアである。

【0077】

上述した方法におけるある特定の他の実施形態では、肝臓脂肪症、脂肪性肝炎または両方を持つ患者を同定するステップは、撮像の使用をさらに含む。撮像は、超音波、超音波ベースのエラストグラフィ、制御減衰パラメーター（ＣＡＰ）、磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）、磁気共鳴エラストグラフィ、または先述の組合せを含み得るがこれらに限定されない。一実施形態では、撮像は、造影超音波（ＣＥＵＳ）である。別の実施形態では、撮像は、超音波ベースのエラストグラフィであり、バイブレーションコントロールドトランジエントエラストグラフィ（ＶＣＴＥ）、音響放射力インパルスエラストグラフィ（ＡＲＦＩ）、超音速せん断撮像（ＳＳＩ）、または先述の組合せから選択される。別の実施形態では、撮像は、磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）であり、ＭＲＩプロトン密度脂肪率（ＭＲＩ−ＰＤＦＦ）である。別の実施形態では、撮像は、磁気共鳴エラストグラフィである。

【0078】

患者において炎症性肝疾患を同定するための上記で言及した方法および手段に加えて、ＮＡＳＨにおける第ＩＩＩ相研究のための規制当局に認められた条件付承認は、肝生検によって取得される組織学的代理マーカーに基づく。これらの一般に許容されている代理は、ｉ）線維症の悪化（すなわち、線維症段階における数値的増大）のないＮＡＳＨの消散；ｉｉ）ＮＡＳＨの悪化のない線維症における１つまたは複数の段階低減である。詳細は、Ｒａｔｚｉｕ、Ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ ｆｏｒ ｎｏｎ−ｃｉｒｒｈｏｔｉｃ ＮＡＳＨ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｒｉａｌｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２０１８、６８．３５３〜３６１およびその中の参考文献において見られ得る。

【0079】

加えて、規制当局は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）活性スコア（ＮＡＳ）におけるベースラインからの変化に目を向けている。ＮＡＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳ）は、肝生検の一元化された病理学者スコアリングからの、脂肪症グレード（０〜３）、小葉炎症グレード（０〜３）および肝細胞風船化グレード（０〜２）の和に等しい複合スコアである。ＮＡＳの全体的な規模は０〜８であり、より高いスコアはより重度の疾患を指し示す。転帰尺度、ＮＡＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳ）におけるベースラインからの変化は、−８から＋８までの可能な範囲を有し、負の値はより良好な転帰（改善）を指し示し、正の値はより悪い転帰を指し示す。ＮＡＳの構成要素は、次の通りにスコア付けされる：脂肪症グレード０＝５％未満脂肪症、１＝５〜３３％脂肪症、２＝３４〜６６％脂肪症、３＝６６％超脂肪症。小葉炎症グレード＝小葉炎症の量（単核、脂肪肉芽腫および多形核（ｐｍｎ）病巣を合わせたもの）：０＝０、１＝２０倍の倍率で２未満、２＝２０倍の倍率で２〜４、３＝２０倍の倍率で４超。肝細胞風船化０＝なし、１＝軽度、２＝軽度を超える。

【0080】

上記で言及した方法に加えて、ＮＡＳＨを処置するための薬物への規制当局に認められた全面的な承認は、（１）病理組織学における肝硬変への進行、（２）肝臓の代償不全事象（肝性脳症、静脈瘤出血、腹水を含む）における低減、（３）１２以下から１５超までのＭＥＬＤスコアにおける変化、（４）肝臓移植、または（５）全死因死亡率を含む１つまたは複数の臨床的尺度に対する効能の実証に基づく。

【0081】

さらなる実施形態では、医薬組成物は、構造：

【0082】

【化1】

の結晶性固体としての（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドまたは薬学的に許容できるその塩を含有する。

【0083】

さらなる実施形態では、結晶性固体は、（ＣｕＫα放射線、１．５４０５６Åの波長）５．３±０．２、７．７±０．２および１５．４±０．２の２シータ値を含む粉末ｘ線回折パターンを有する。

【0084】

さらなる実施形態では、結晶性固体は、（ＣｕＫα放射線、１．５４０５６Åの波長）６．５±０．２、９．３±０．２および１３．６±０．２の２シータ値を含む粉末ｘ線回折パターンを有する。

【0085】

さらなる実施形態では、医薬組成物は、構造：

【0086】

【化2】

の結晶性固体または薬学的に許容できるその塩としての４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸または薬学的に許容できるその塩を含有する。

【0087】

さらなる実施形態では、結晶性固体は、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸の２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール塩である。

【0088】

さらなる実施形態では、疾患または状態は、脂肪肝である。別の実施形態では、疾患または状態は、非アルコール性脂肪肝疾患である。別の実施形態では、疾患または状態は、非アルコール性脂肪性肝炎である。別の実施形態では、疾患または状態は、肝線維症を伴う非アルコール性脂肪性肝炎である。別の実施形態では、疾患または状態は、肝硬変を伴う非アルコール性脂肪性肝炎である。別の実施形態では、疾患または状態は、肝硬変および肝細胞癌を伴う非アルコール性脂肪性肝炎である。別の実施形態では、疾患または状態は、肝硬変および代謝関連疾患を伴う非アルコール性脂肪性肝炎である。

【0089】

さらなる実施形態では、疾患または状態は、脂肪肝である。別の実施形態では、疾患または状態は、アルコール性脂肪肝疾患である。別の実施形態では、疾患または状態は、アルコール性脂肪性肝炎である。別の実施形態では、疾患または状態は、肝線維症を伴うアルコール性脂肪性肝炎である。別の実施形態では、疾患または状態は、肝硬変を伴うアルコール性脂肪性肝炎である。別の実施形態では、疾患または状態は、肝硬変および肝細胞癌を伴うアルコール性脂肪性肝炎である。別の実施形態では、疾患または状態は、肝硬変および代謝関連疾患を伴うアルコール性脂肪性肝炎である。

【0090】

さらなる実施形態では、方法または組成物は、少なくとも１つの他の医薬作用物質を含み、ここで、該作用物質は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ−（ＡＣＣ）阻害剤、ファルネソイドＸ受容体アゴニスト（例えば、トロピフェクサー（ｔｒｏｐｉｆｅｘｏｒ）、オベチコール酸）、ジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ１（ＤＧＡＴ−１）阻害剤、モノアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ阻害剤、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）−１０阻害剤、ＡＭＰＫ活性化因子、スルホニル尿素、メグリチニド、α−アミラーゼ阻害剤、α−グルコシドヒドロラーゼ阻害剤、α−グルコシダーゼ阻害剤、ＰＰＡＲγアゴニスト、ＰＰＡＲα／γアゴニスト（例えば、エラフィブラノール）、ビグアニド、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）モジュレーター、リラグルチド、アルビグルチド、エキセナチド、アルビグルチド、リキシセナチド、デュラグルチド、セマグルチド、タンパク質チロシンホスファターゼ−１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ）阻害剤、ＳＩＲＴ−１活性化因子、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）阻害剤、インスリン分泌促進剤（ｓｅｃｒｅａｔａｇｏｇｕｅ）、脂肪酸酸化阻害剤、Ａ２アンタゴニスト、ｃ−ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）阻害剤、グルコキナーゼ活性化因子（ＧＫａ）、インスリン、インスリン模倣物質、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤、ＶＰＡＣ２受容体アゴニスト、ＳＧＬＴ２阻害剤、グルカゴン受容体モジュレーター、ＧＰＲ１１９モジュレーター、ＦＧＦ２１誘導体または類似体、ＴＧＲ５受容体モジュレーター、ＧＰＢＡＲ１受容体モジュレーター、ＧＰＲ４０アゴニスト、ＧＰＲ１２０モジュレーター、高親和性ニコチン酸受容体（ＨＭ７４Ａ）活性化因子、ＳＧＬＴ１阻害剤、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ酵素の阻害剤またはモジュレーター、フルクトース１，６−ジホスファターゼの阻害剤、アルドースレダクターゼの阻害剤、ミネラルコルチコイド受容体阻害剤、ＴＯＲＣ２の阻害剤、ＣＣＲ２および／またはＣＣＲ５の阻害剤、ＰＫＣアイソフォーム（例えば、ＰＫＣα、ＰＫＣβ、ＰＫＣ^γ）の阻害剤、脂肪酸シンターゼの阻害剤、セリンパルミトイルトランスフェラーゼの阻害剤、ＧＰＲ８１、ＧＰＲ３９、ＧＰＲ４３、ＧＰＲ４１、ＧＰＲ１０５、Ｋｖ１．３、レチノール結合タンパク質４、グルココルチコイド受容体、ソマトスタチン受容体のモジュレーター、ＰＤＨＫ２またはＰＤＨＫ４の阻害剤またはモジュレーター、ＭＡＰ４Ｋ４の阻害剤、ＩＬ１ベータを含むＩＬ１ファミリーのモジュレーター、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、スクアレンシンターゼ阻害剤、フィブレート、胆汁酸捕捉剤、ＡＣＡＴ阻害剤、ＭＴＰ阻害剤、リポオキシゲナーゼ阻害剤、コレステロール吸収阻害剤、ＰＣＳＫ９モジュレーター、コレステリルエステル輸送タンパク質阻害剤、ならびにＲＸＲアルファのモジュレーターからなる群から選択される。

【0091】

さらなる実施形態では、方法または組成物は、少なくとも１つの他の医薬作用物質を含み、ここで、該作用物質は、システアミンもしくは薬学的に許容できるその塩、シスタミンもしくは薬学的に許容できるその塩、抗酸化化合物、レシチン、ビタミンＢ複合体、胆汁塩調製物、カンナビノイド−１（ＣＢ１）受容体のアンタゴニスト、カンナビノイド−１（ＣＢ１）受容体の逆アゴニスト、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体）活性調節因子、ベンゾチアゼピンもしくはベンゾチエピン化合物、タンパク質チロシンホスファターゼＰＴＰＲＵを阻害するためのＲＮＡアンチセンスコンストラクト、ヘテロ原子結合置換ピペリジンおよびその誘導体、ステアロイル−補酵素アルファデルタ−９デサチュラーゼを阻害することができるアザシクロペンタン誘導体、アディポネクチンの分泌促進物質もしくは誘導物質活性を有するアシルアミド化合物、第四級アンモニウム化合物、酢酸グラチラマー、ペントラキシンタンパク質、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、ｎ−アセチルシステイン、イソフラボン化合物、マクロライド抗生物質、ガレクチン阻害剤、抗体、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

【0092】

特に、単一の投薬量単位として提供される場合、組み合わさった活性原料間に化学的相互作用の潜在性が存在する。この理由から、第１の治療剤および第２の治療剤を単一の投薬量単位中で組み合わせる場合、それらは、活性原料を単一の投薬量単位中で組み合わせても、活性原料間の物理的接触が最小化される（すなわち、低減される）ように製剤化される。例えば、１つの活性原料は、腸溶コーティングされてよい。活性原料の１つを腸溶コーティングすることにより、組み合わさった活性原料間の接触を最小化することが可能なだけでなく、これらの成分が胃では放出されず腸で放出されるように、胃腸管内のこれらの成分のうちの１つの放出を制御することも可能である。活性原料のうちの１つを、胃腸管全体を通して持続放出を達成し、組み合わさった活性原料間の物理的接触を最小化する働きもする材料でコーティングしてもよい。さらに、この成分の放出が腸でのみ起こるように、持続放出成分を追加で腸溶コーティングすることもできる。また別のアプローチは、活性成分をさらに分離するために、１つの成分が、持続および／または腸溶放出ポリマーでコーティングされ、他の成分も、低粘度グレードのヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）等のポリマーまたは当技術分野で公知の通りの他の適切な材料でコーティングされている、組合せ製品の製剤化を伴うであろう。ポリマーコーティングは、他の成分との相互作用に対する追加の障壁を形成する働きをする。

【0093】

本発明の組合せ製品の成分間の接触を最小化するこれらおよび他の手法は、単一剤形で投与されるか、別個の形態であるが同じ方式によって同時に投与されるかにかかわらず、本開示を理解すれば、当業者には容易に明らかとなるであろう。

【0094】

併用療法処置では、本発明の化合物および他の薬物療法の両方が、従来の方法によって哺乳動物（例えば、ヒト、男性または女性）に投与される。

【0095】

各治療剤、例えば、化合物Ａ、化合物Ｄ、および任意の追加の治療剤の投薬量は、概して、処置されている対象の健康、所望される処置の程度、もしあれば、併用療法の性質および種類、ならびに所望される処置の頻度および効果の性質を含む若干数の要因に依存する。概して、各治療剤の投薬量範囲は、１日当たり個体の体重１キログラムにつき約０．００１ｍｇから約１００ｍｇまで、好ましくは１日当たり個体の体重１キログラムにつき約０．１ｍｇから約１０ｍｇまでの範囲内である。しかしながら、処置されている対象の年齢および体重、意図されている投与ルート、投与されている特定の抗肥満剤等に応じて、一般的な投薬量範囲におけるいくらかの可変性が必要とされることもある。特定の患者のための投薬量範囲および最適投薬量の決定も、十分に本開示の利益を有する当業者の能力の範囲内である。

【0096】

本発明の処置方法によれば、本発明の化合物または本発明の化合物と少なくとも１つの追加の医薬作用物質との組合せ（本明細書では「組合せ」と称される）は、そのような処置を必要とする対象に、好ましくは医薬組成物の形態で投与される。本発明の組合せ態様では、本発明の化合物および少なくとも１つの他の医薬作用物質（例えば、別の抗肥満剤）は、別個にまたは両方を含む医薬組成物でのいずれかで投与されてよい。そのような投与は経口であることが概して好ましい。

【0097】

本発明の化合物と少なくとも１つの他の医薬作用物質との組合せが一緒に投与される場合、そのような投与は、時間的に順次であっても同時であってもよい。薬物組合せの同時投与が概して好ましい。順次投与では、本発明の化合物および追加の医薬作用物質は、任意の順序で投与されてよい。そのような投与は経口であることが概して好ましい。そのような投与は経口かつ同時であることがとりわけ好ましい。本発明の化合物および追加の医薬作用物質が順次に投与される場合、それぞれの投与は、同じまたは異なる方法によるものであってよい。

【0098】

本発明の方法によれば、本発明の化合物または組合せは、好ましくは、医薬組成物の形態で投与される。したがって、本発明の化合物または組合せは、任意の従来の経口、直腸、経皮、非経口（例えば、静脈内、筋肉内または皮下）、大槽内、膣内、腹腔内、局所（例えば、散剤、軟膏剤、クリーム剤、スプレー剤またはローション剤）、口腔または鼻腔内剤形（例えば、スプレー剤、液滴剤または吸入剤）で、別個にまたは一緒に、患者に投与され得る。

【0099】

本発明の化合物または組合せは、単独で投与され得るが、概して、当技術分野において公知である１つまたは複数の好適な医薬添加剤、アジュバント、賦形剤または担体との混和物で投与され、意図されている投与ルートおよび標準的な医薬実務に関して選択されることになる。本発明の化合物または組合せは、治療必要性に見合った、所望の投与ルートおよび放出プロファイルの特異性に応じて、即時、遅延、調節、持続、パルスまたは制御放出剤形を提供するように製剤化されてよい。

【0100】

医薬組成物は、本発明の化合物または組合せを、概して組成物の約１％から約７５％、８０％、８５％、９０％またはさらには９５％（重量で）の範囲内、通常は約１％、２％または３％から約５０％、６０％または７０％の範囲内、より頻繁には約１％、２％または３％から５０％未満、例を挙げると約２５％、３０％または３５％の範囲内の量で含む。

【0101】

具体的な量の活性化合物を用いて種々の医薬組成物を調製する方法は、当業者に公知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ Ｍｄ、第２０版、２０００を参照されたい。

【0102】

非経口注射に好適な組成物は、概して、薬学的に許容できる滅菌水溶液もしくは非水溶液、分散体、懸濁液、または乳剤、および滅菌注射用溶液または分散体への復元のための滅菌粉末を含む。好適な水性および非水性担体または賦形剤（溶媒およびビヒクルを含む）の例は、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール等）、それらの好適な混合物、オリーブ油等の植物油を含むトリグリセリド、およびオレイン酸エチル等の注射用有機エステルを含む。好ましい担体は、Ｃｏｎｄｅａ Ｖｉｓｔａ Ｃｏ．、Ｃｒａｎｆｏｒｄ、Ｎ．Ｊ．から入手可能な、グリセリンまたはプロピレングリコールを加えたＭｉｇｌｙｏｌ（登録商標）ブランドカプリル／カプリン酸エステル（例えば、Ｍｉｇｌｙｏｌ（登録商標）８１２、Ｍｉｇｌｙｏｌ（登録商標）８２９、Ｍｉｇｌｙｏｌ（登録商標）８４０）である。妥当な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散体の場合には必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。

【0103】

非経口注射のためのこれらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤等の添加剤も含有してよい。組成物の微生物汚染の予防は、種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等を用いて遂行することができる。等張剤、例えば、砂糖、塩化ナトリウム等を含むことも望ましい場合がある。吸収を遅延させることができる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によって、注射用医薬組成物の持続的吸収を起こすことができる。

【0104】

経口投与のための固体剤形は、カプセル剤、錠剤、チュアブル錠、キャンディー剤、丸剤、散剤およびマルチ微粒子調製物（顆粒剤）を含む。そのような固体剤形では、本発明の化合物または組合せは、少なくとも１つの不活性添加剤、賦形剤または担体と混和される。好適な添加剤、賦形剤または担体は、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム等の材料、ならびに／または（ａ）１つもしくは複数の充填剤もしくは増量剤（例えば、微結晶性セルロース（ＦＭＣ Ｃｏｒｐ．からＡｖｉｃｅｌ（商標）として入手可能）デンプン、ラクトース、スクロース、マンニトール、ケイ酸、キシリトール、ソルビトール、デキストロース、リン酸水素カルシウム、デキストリン、アルファ−シクロデキストリン、ベータ−シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、中鎖脂肪酸、酸化チタン、酸化マグネシウム、酸化アルミニウム等）；（ｂ）１つもしくは複数の結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、エチルセルロース、ポリビニルアルコール、プルラン、アルファ化デンプン、寒天、トラガカント、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、アカシア等）；（ｃ）１つもしくは複数の保湿剤（例えば、グリセロール等）；（ｄ）１つもしくは複数の崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、バレイショもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定の複合ケイ酸塩、炭酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム（Ｅｄｗａｒｄ Ｍｅｎｄｅｌｌ Ｃｏ．からＥｘｐｌｏｔａｂ（商標）として入手可能）、架橋ポリビニルピロリドン、クロスカルメロースナトリウムＡ型（Ａｃ−ｄｉ−ｓｏｌ（商標）として入手可能）、ポリアクリリンカリウム（ｐｏｌｙａｃｒｉｌｉｎ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ）（イオン交換樹脂）等）；（ｅ）１つもしくは複数の溶液緩染剤（例えば、パラフィン等）；（ｆ）１つもしくは複数の吸収加速剤（例えば、第四級アンモニウム化合物等）；（ｇ）１つもしくは複数の湿潤剤（例えば、セチルアルコール、モノステアリン酸グリセロール等）；（ｈ）１つもしくは複数の吸着剤（例えば、カオリン、ベントナイト等）；ならびに／または（ｉ）１つもしくは複数の滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ステアリン酸ポリオキシル、セタノール、タルク、水素化ヒマシ油、ショ糖脂肪酸エステル、ジメチルポリシロキサン、微結晶性ワックス、黄蝋、白蝋、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム等）を含む。カプセル剤および錠剤の場合には、剤形は緩衝剤も含み得る。

【0105】

同様の種類の固体組成物は、ラクトースまたは乳糖等の添加剤および高分子量ポリエチレングリコール等を使用して、軟質または硬質充填ゼラチンカプセル剤における充填剤としても使用され得る。

【0106】

錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤および顆粒剤等の固体剤形は、腸溶コーティングおよび当技術分野において周知である他のもの等のコーティングおよび外殻を用いて調製され得る。それらは、乳白剤を含有してもよく、本発明の化合物および／または追加の医薬作用物質を遅延方式で放出するような組成のものであってもよい。使用され得る包埋組成物の例は、ポリマー性物質およびワックスである。薬物は、適切な場合、上記で言及した添加剤の１つまたは複数を加えた、マイクロカプセル形態であってもよい。

【0107】

錠剤では、活性剤は、典型的には、製剤の５０％未満（重量で）、例えば、重量で５％または２．５％等の約１０％未満を構成することになる。製剤の主部は、充填剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤を含み、香味剤を含んでいてもよい。これらの添加剤の組成は、当技術分野において周知である。高頻度で、充填剤／賦形剤は、下記の成分：微結晶性セルロース、マンニトール、ラクトース（全種類）、デンプンおよびリン酸二カルシウムのうちの２つ以上の混合物を含むことになる。充填剤／賦形剤混合物は、典型的には、製剤の９８％未満、好ましくは９５％未満、例えば９３．５％を構成する。好ましい崩壊剤は、Ａｃ−ｄｉ−ｓｏｌ（商標）、Ｅｘｐｌｏｔａｂ（商標）、デンプンおよびラウリル硫酸ナトリウムを含む。存在する場合、崩壊剤は、通常、製剤の１０％未満または５％未満、例えば約３％を構成することになる。好ましい滑沢剤は、ステアリン酸マグネシウムである。存在する場合、滑沢剤は、通常、製剤の５％未満または３％未満、例えば約１％を構成することになる。

【0108】

錠剤は、標準的な錠剤化プロセス、例えば、直接圧縮または湿式、乾式もしくは融解造粒、融解凝固プロセスおよび押出によって製造され得る。錠剤核は、単または多層であってよく、当技術分野において公知の適切な保護膜でコーティングされ得る。

【0109】

経口投与のための液体剤形は、薬学的に許容できる乳剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤を含む。本発明の化合物または組合せに加えて、液体剤形は、当技術分野において一般的に使用される不活性賦形剤、例を挙げると、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（例えば、綿実油、落花生油、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ種子油等）、Ｍｉｇｌｙｏｌｅ（登録商標）（ＣＯＮＤＥＡ Ｖｉｓｔａ Ｃｏ．、Ｃｒａｎｆｏｒｄ、Ｎ．Ｊ．から入手可能）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタン脂肪酸エステル、またはこれらの物質の混合物等を含有してよい。

【0110】

そのような不活性賦形剤のほかに、組成物は、湿潤剤、乳化および懸濁化剤、甘味、香味および着香剤等の添加剤も含み得る。

【0111】

本発明の化合物または組合せの経口液体形態は、活性化合物が完全に溶解する溶液を含む。溶媒の例は、経口投与に好適なすべての薬学的に先例のある溶媒、特に、本発明の化合物が良好な溶解度を示すもの、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、食用油ならびにグリセリルおよびグリセリドベースの系を含む。グリセリルおよびグリセリドベースの系は、例えば、下記のブランド製品（および対応するジェネリック製品）：Ｃａｐｔｅｘ（商標）３５５ＥＰ（トリカプリル酸／カプリン酸グリセリル、Ａｂｉｔｅｃ製、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｏｈｉｏ）、Ｃｒｏｄａｍｏｌ（商標）ＧＴＣ／Ｃ（中鎖トリグリセリド、Ｃｒｏｄａ製、Ｃｏｗｉｃｋ Ｈａｌｌ、ＵＫ）またはＬａｂｒａｆａｃ（商標）ＣＣ（中鎖トリグリセリド（、Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅ製）、Ｃａｐｔｅｘ（商標）５００Ｐ（三酢酸グリセリル、すなわちトリアセチン、Ａｂｉｔｅｃ製）、Ｃａｐｍｕｌ（商標）ＭＣＭ（中鎖モノおよびジグリセリド、Ａｂｉｔｅｃ製）、Ｍｉｇｙｏｌ（商標）８１２（カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、Ｃｏｎｄｅａ製、Ｃｒａｎｆｏｒｄ Ｎ．Ｊ．）、Ｍｉｇｙｏｌ（商標）８２９（カプリル酸／カプリン酸／コハク酸トリグリセリド、Ｃｏｎｄｅａ製）、Ｍｉｇｙｏｌ（商標）８４０（ジカプリル酸／ジカプリン酸プロピレングリコール、Ｃｏｎｄｅａ製）、Ｌａｂｒａｆｉｌ（商標）Ｍ１９４４ＣＳ（オレオイルマクロゴール−６グリセリド、Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅ製）、Ｐｅｃｅｏｌ（商標）（モノオレイン酸グリセリル、Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅ製）およびＭａｉｓｉｎｅ（商標）３５−１（モノオレイン酸グリセリル、Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅ製）を含み得る。特に興味深いのは、中鎖（約Ｃ．ｓｕｂ．８からＣ．ｓｕｂ．１０）トリグリセリド油である。これらの溶媒は、高頻度で、組成物の主部、すなわち、約５０％超、通常は、約８０％、例えば約９５％または９９％超を構成する。アジュバントおよび添加物が、溶媒とともに、主に矯味剤、嗜好性および香味剤、酸化防止剤、安定剤、質感および粘度調整剤ならびに可溶化剤として含まれていてもよい。

【0112】

懸濁剤は、本発明の化合物または組合せに加えて、懸濁化剤、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタ水酸化物、ベントナイト、寒天、ならびにトラガカント、またはこれらの物質の混合物等の担体をさらに含んでよい。

【0113】

直腸または膣内投与のための組成物は、好ましくは、坐剤を含み、これは、本発明の化合物または組合せを、通常の室温では固体であるが体温では液体であり、したがって、直腸または膣腔内で融解し、それにより、活性成分を放出する、ココアバター、ポリエチレングリコールまたは坐剤ワックス等の好適な非刺激性添加剤または担体と混合することによって調製され得る。

【0114】

本発明の化合物または組合せの局所投与のための剤形は、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、散剤およびスプレー剤を含む。薬物は、薬学的に許容できる添加剤、賦形剤または担体、および、必要とされ得る任意の保存剤、緩衝液または噴射剤と混和される。

【0115】

化合物が水への溶解度に乏しい、例えば約１μｇ／ｍＬ未満である場合、上記で論じた中鎖トリグリセリド油等の可溶化非水性溶媒中の液体組成物は、これらの化合物のための好ましい剤形である。

【0116】

スプレー乾燥プロセスによって形成された分散体を含む固体非晶質分散体も、本発明の溶解度が乏しい化合物のための好ましい剤形である。「固体非晶質分散体」が意味するのは、溶解度が乏しい化合物の少なくとも一部が非晶質形態であり、水溶性ポリマー中に分散されている、固体材料である。「非晶質」が意味するのは、溶解度が乏しい化合物が結晶性ではないことである。「結晶性」が意味するのは、化合物が各次元において少なくとも１００の繰り返し単位の三次元の長距離秩序を呈することである。故に、非晶質という用語は、本質的に秩序を有さない材料だけでなく、わずかな程度の秩序を有し得るがその秩序が三次元未満であるおよび／または短距離しかない材料も含むように意図されている。非晶質材料は、当技術分野において公知の技術、例を挙げると、粉末ｘ線回折（ＰＸＲＤ）結晶学、固体状態ＮＭＲ、または示差走査熱量測定（ＤＳＣ）等の熱的技術によって特徴付けられ得る。

【0117】

好ましくは、固体非晶質分散体中の溶解度が乏しい化合物の少なくとも大部分（すなわち、少なくとも約６０ｗｔ％）が非晶質である。化合物は、比較的純粋な非晶質ドメインまたは領域中の固体非晶質分散体内に、ポリマー全体に均質に分布している化合物の固溶体またはこれらの状態もしくはそれらの間の中間にある状態の任意の組合せとして、存在することができる。好ましくは、固体非晶質分散体は実質的に均質であり、そのため、非晶質化合物はポリマー全体に可能な限り均質に分散されている。本明細書において使用される場合、「実質的に均質」は、固体非晶質分散体内の比較的純粋な非晶質ドメインまたは領域中に存在する化合物の割合が比較的小さく、薬物の総量のおよそ２０ｗｔ％未満、好ましくは１０ｗｔ％未満であることを意味する。

【0118】

固体非晶質分散体における使用に好適な水溶性ポリマーは、溶解度が乏しい化合物と有害な方式で化学的に反応せず、薬学的に許容できるものであり、生理的に関連するｐＨ（例えば、１〜８）で水溶液への少なくともいくらかの溶解度を有するという意味で、不活性であるべきである。ポリマーは、中性またはイオン化可能であることができ、１〜８のｐＨ範囲の少なくとも一部を上回る、少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬの水溶解度を有するべきである。

【0119】

本発明での使用に好適な水溶性ポリマーは、セルロースであっても非セルロースであってもよい。ポリマーは、水溶液中で中性またはイオン化可能であってよい。これらのうち、イオン化可能およびセルロースポリマーが好ましく、イオン化可能セルロースポリマーがより好ましい。

【0120】

例示的な水溶性ポリマーは、酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＡＳ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＰ）、カルボキシメチルエチルセルロース（ＣＭＥＣ）、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、トリメリト酸酢酸セルロース（ＣＡＴ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、メチルセルロース（ＭＣ）、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのブロックコポリマー（ＰＥＯ／ＰＰＯ、ポロキサマーとしても公知である）、ならびにそれらの混合物を含む。とりわけ好ましいポリマーは、ＨＰＭＣＡＳ、ＨＰＭＣ、ＨＰＭＣＰ、ＣＭＥＣ、ＣＡＰ、ＣＡＴ、ＰＶＰ、ポロキサマー、およびそれらの混合物を含む。最も好ましいのは、ＨＰＭＣＡＳである。欧州特許出願公開第０９０１７８６Ａ２号を参照されたく、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0121】

固体非晶質分散体は、溶解度が乏しい化合物の少なくとも大部分（少なくとも６０％）が非晶質状態であるという結果をもたらす固体非晶質分散体を形成するための任意のプロセスに従って調製され得る。そのようなプロセスは、機械的、熱的および溶媒プロセスを含む。例示的な機械的プロセスは、製粉および押出；高温溶融、溶媒修飾溶融（ｓｏｌｖｅｎｔ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｆｕｓｉｏｎ）および融解凝固プロセスを含む融解プロセス；ならびに非溶媒沈殿、スプレーコーティングおよびスプレー乾燥を含む溶媒プロセスを含む。例えば、下記の米国特許を参照されたく、その関連する開示は、参照により本明細書に組み込まれる：押出プロセスにより分散体を形成することを記述する第５，４５６，９２３号および第５，９３９，０９９号；製粉プロセスにより分散体を形成することを記述する第５，３４０，５９１号および第４，６７３，５６４号；ならびに融解凝固プロセスにより分散体を形成することを記述する第５，７０７，６４６号および第４，８９４，２３５号。好ましいプロセスでは、固体非晶質分散体は、欧州特許出願公開第０９０１７８６Ａ２号で開示される通り、スプレー乾燥によって形成される。このプロセスでは、化合物およびポリマーが、アセトンまたはメタノール等の溶媒に溶解され、次いで、スプレー乾燥によって溶媒が溶液から迅速に除去されて、固体非晶質分散体を形成する。固体非晶質分散体は、化合物の最大約９９ｗｔ％、例えば、所望される通りに１ｗｔ％、５ｗｔ％、１０ｗｔ％、２５ｗｔ％、５０ｗｔ％、７５ｗｔ％、９５ｗｔ％、または９８ｗｔ％を含有するように調製され得る。

【0122】

固体分散体は、それ自体が剤形として使用されてもよいし、またはカプセル剤、錠剤、液剤もしくは懸濁剤等の他の剤形の調製において製造使用製品（ＭＵＰ）としての働きをしてもよい。水性懸濁剤の例は、２％ポリソルベート−８０中に２．５ｍｇ／ｍＬの化合物を含有する１：１（ｗ／ｗ）化合物／ＨＰＭＣＡＳ−ＨＦスプレー乾燥分散体の水性懸濁剤である。錠剤またはカプセル剤において使用するための固体分散体は、概して、典型的にはそのような剤形において見られる他の添加剤またはアジュバントと混合されることになる。例えば、カプセル剤のための例示的な充填剤は、２：１（ｗ／ｗ）化合物／ＨＰＭＣＡＳ−ＭＦスプレー乾燥分散体（６０％）、ラクトース（高速流）（１５％）、微結晶性セルロース（例えば、アビセル^{（Ｒ０−１０２）}（１５．８％）、ナトリウムデンプン（７％）、ラウリル硫酸ナトリウム（２％）およびステアリン酸マグネシウム（１％）を含有する。

【0123】

ＨＰＭＣＡＳポリマーは、日本、東京の信越化学工業株式会社からそれぞれＡｑｏａ（登録商標）−ＬＦ、Ａｑｏａｔ（登録商標）−ＭＦおよびＡｑｏａｔ（登録商標）−ＨＦとして、低、中および高グレードで入手可能である。より高いＭＦおよびＨＦグレードが概して好ましい。

【0124】

下記の段落は、非ヒト動物に有用な、例示的な製剤、投薬量等について記述するものである。化合物Ａまたは薬学的に許容できるその塩の、化合物Ｄまたは薬学的に許容できるその塩と組み合わせた、２つの作用物質としてのまたは別の作用物質と組み合わせた投与は、経口的にまたは非経口的に達成され得る。

【0125】

有効用量が受けられるような量の、化合物Ａまたは薬学的に許容できるその塩が、化合物Ｄまたは薬学的に許容できるその塩とともに、一緒にまたは別の作用物質と組み合わせて投与される。概して、動物に経口的に投与される１日用量は、体重１ｋｇ当たり約０．０１から約１，０００ｍｇの間、例えば、約０．０１から約３００ｍｇ／ｋｇの間、または約０．０１から約１００ｍｇ／ｋｇの間、または体重１ｋｇ当たり約０．０１から約５０ｍｇの間、または約０．０１から約２５ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１から約１０ｍｇ／ｋｇまたは約０．０１から約５ｍｇ／ｋｇの間である。投与される化合物Ａの１日用量は、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、または６０ｍｇであってよい。１日用量は、１日に２回（例えば、「ＢＩＤ」または「ｑ１２」時間投薬間隔）等の複数回用量に分割されてよい。例えば、ある特定の事例では、化合物Ａの１日用量は、１５ｍｇを１日に２回（例えば、ｑ１２時間）として投与されてよい。投与される化合物Ｄの１日用量は、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２２５ｍｇ、３００ｍｇ、４５０ｍｇ、または６００ｍｇであってよい。１日用量は、１日に２回（例えば、「ＢＩＤ」または「ｑ１２時間投薬間隔」等の複数回用量に分割されてよい。例えば、ある特定の事例では、化合物Ｄの１日用量は、３００ｍｇを１日に２回（例えば、ｑ１２時間）として投与されてよい。

【0126】

好都合なことに、本発明の化合物（または組合せ）は、治療投薬量の化合物が日常の給水とともに摂取されるように、飲用水中に担持され得る。化合物は、好ましくは液体の水溶性濃縮物（水溶性塩の水溶液等）の形態で、飲用水に直接計り入れることができる。

【0127】

好都合なことに、本発明の化合物（または組合せ）を、そのままで、またはプレミックスもしくは濃縮物とも称される動物飼料サプリメントの形態で、飼料に直接添加することもできる。添加剤、賦形剤または担体中の化合物のプレミックスまたは濃縮物は、飼料への作用物質の包含のためにより一般的に用いられる。好適な添加剤、賦形剤または担体は、所望される通りに、水、種々のミール、例を挙げると、アルファルファミール、大豆ミール、綿実油ミール、アマニ油ミール、トウモロコシ穂軸ミールおよびコーンミール、糖蜜、尿素、骨ミール、ならびに養鶏飼料において一般的に用いられるような鉱物ミックス等の、液体または固体である。特に有効な添加剤、賦形剤または担体は、それ自体がそれぞれ動物飼料、すなわち、そのような飼料のごく一部である。担体は、プレミックスがブレンドされる完成飼料中における化合物の一様分布を容易にする。好ましくは、化合物は、プレミックス、その後、飼料に徹底的にブレンドされる。この点において、化合物は、大豆油、コーン油、綿実油等の好適な油性ビヒクルに、または揮発性有機溶媒に分散または溶解され、次いで、担体とブレンドされてよい。完成飼料中における化合物の量が、所望のレベルの化合物を取得するために適切な割合のプレミックスを飼料とブレンドすることによって調整され得ることから、濃縮物中における化合物の割合は、幅広い変動が可能であることが分かるであろう。

【0128】

高効力濃縮物は、飼料製造業者によって、上述した通りに大豆油ミールおよび他のミール等のタンパク質性担体とブレンドされて、動物に直接給餌するために好適な濃縮サプリメントを生成し得る。そのような事例では、動物は、通常食を消費することが許可される。代替として、そのような濃縮サプリメントを飼料に直接添加して、治療有効レベルの本発明の化合物を含有する栄養的にバランスの取れた完成飼料を生成してよい。混合物をツインシェルブレンダー内等の標準的な手順によって徹底的にブレンドして、均質性を確実にする。

【0129】

サプリメントが飼料の最上層として使用される場合、これは同様に、仕上げ加工された飼料の頂部全体にわたる化合物の分布の均一性を確実にするのに役立つ。

【0130】

赤身肉の沈着を増大させるためおよび赤身肉対脂肪の比を改善するために有効な飲用水および飼料は、概して、本発明の化合物を、飼料または水中約１０^−３から約５００ｐｐｍまでの化合物を提供するために十分な量の動物飼料と混合することによって調製される。

【0131】

好ましい薬用のブタ、ウシ、ヒツジおよびヤギ飼料は、概して、飼料１トン当たり約１から約４００グラムまでの本発明の化合物（または組合せ）を含有し、これらの動物のための最適量は、通常、飼料１トン当たり約５０から約３００グラムである。

【0132】

好ましい養鶏および家庭内ペット飼料は、通常、飼料１トン当たり、約１から約４００グラムおよび好ましくは約１０から約４００グラムの本発明の化合物（または組合せ）を含有する。

【0133】

動物における非経口投与では、本発明の化合物（または組合せ）は、ペーストまたはペレットの形態で調製され、通常、赤身肉の沈着における増大および赤身肉対脂肪の比における改善が求められる動物の頭部または耳の皮膚の下に、移植片として投与されてよい。

【0134】

ペースト製剤は、ピーナッツ油、ゴマ油、コーン油等の薬学的に許容できる油中に薬物を分散させることによって調製され得る。

【0135】

治療有効量の化合物Ａまたは薬学的に許容できるその塩を、化合物Ｄもしくは薬学的に許容できるその塩、医薬組成物または組合せと組み合わせて含有するペレットは、化合物Ａまたは薬学的に許容できるその塩を、化合物Ｄまたは薬学的に許容できるその塩と、カーボワックス、カルナウバ（ｃａｒｎｕｂａ）ロウ等の賦形剤とともに混和することによって調製され得、ペレット化プロセスを改善するために、ステアリン酸マグネシウムまたはカルシウム等の滑沢剤を添加してよい。

【0136】

当然ながら、所望される赤身肉の沈着における増大および赤身肉対脂肪の比における改善を提供するであろう所望の用量レベルを実現するために、複数のペレットが動物に投与され得ることが認識される。その上、移植片は、動物の体内における妥当な薬物レベルを維持するために、動物の処置期間中、周期的に作製されてもよい。

【0137】

本発明は、いくつかの有利な獣医学的特色を有する。ペット動物の赤身の多さを増大させおよび／または不要な脂肪を取り除きたいペットの飼い主または獣医に、本発明は、これを遂行し得る手段を提供する。養鶏、肉牛およびブタ飼育者のために、本発明の方法の利用は、食肉産業からより高い売買価格が付けられる、より赤身の多い動物を産出する。

【実施例】

【0138】

別段の定めがない限り、出発材料は、概して、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．（Ｗｉｎｄｈａｍ、ＮＨ）、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｆａｉｒｌａｗｎ、ＮＪ）、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｌｔｄ．（Ｃｏｒｎｗａｌｌ、Ｅｎｇｌａｎｄ）およびＴｙｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）等の商業的供給源から入手可能である。ある特定の一般的な略語および頭字語が用いられており、それらは、ＡｃＯＨ（酢酸）、ＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン）、ＣＤＩ（１，１’−カルボニルジイミダゾール）、ＤＣＭ（ジクロロメタン）、ＤＥＡ（ジエチルアミン）、ＤＩＰＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）、ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン）、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ＥＤＣＩ（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド）、Ｅｔ_２Ｏ（ジエチルエーテル）、ＥｔＯＡｃ（酢酸エチル）、ＥｔＯＨ（エタノール）、Ｇまたはｇ（グラム）、ＨＡＴＵ（２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートメタンアミニウム）、ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＨＯＢＴ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）、Ｈまたはｈ（時間）、ＩＰＡ（イソプロピルアルコール）、ＫＨＭＤＳ（カリウムヘキサメチルジシラジド）、ＭｅＯＨ（メタノール）、Ｌまたはｌ（リットル）、ｍＬ（ミリリットル）、ＭＴＢＥ（ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル）、ｍｇ（ミリグラム）、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）_３（トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム）、ＮａＨＭＤＳ（ナトリウムヘキサメチルジシラザン）、ＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）、ＲＨ（相対湿度）、ＲＴまたはｒｔ（周囲温度（約２０から２５℃）と同じである室温）、ＳＥＭ（［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチル）、ＴＥＡ（トリエチルアミン）、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）、およびＴ_３Ｐ（プロパンホスホン酸無水物）を含み得る。

【0139】

^１Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、いずれの場合も、推定構造と一致していた。特徴的な化学シフト（δ）は、重水素化溶媒中の残留プロトンシグナル（７．２７ｐｐｍのＣＨＣｌ_３、３．３１ｐｐｍのＣＤ_２ＨＯＤ）に対するパーツパーミリオン（ｐｐｍ）で記され、主要ピークの呼称を表す従来の略語：例えば、ｓ、一重線；ｄ、二重線；ｔ、三重線；ｑ、四重線；ｍ、多重線；ｂｒ、広域を使用して報告される。

【0140】

ｓｓＮＭＲは、固体状態ＮＭＲを意味する。

【0141】

ＰＸＲＤは、粉末Ｘ線回折を意味する。

【0142】

用語「実質的に同じ」は、Ｘ線粉末回折パターンについて記述するために使用される場合、そのピークが＋／−０．２°２θの標準偏差内であるパターンを含むことを意味する。

【0143】

本明細書において使用される場合、特定の結晶形態に対する用語「実質的に純粋な」は、該結晶形態が、重量で１０％未満、好ましくは５％未満、好ましくは３％未満、好ましくは１％未満の、化合物Ａまたは化合物Ｄの任意の他の物理的形態を含むことを意味する。

【0144】

反応は、空気中で、または、酸素もしくは水分に感受性の試薬もしくは中間体を用いる場合には、不活性雰囲気（窒素またはアルゴン）下で、実施した。適切な場合、反応装置は、ヒートガンを使用して動的真空下で乾燥させ、無水溶媒（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷｉｓｃｏｎｓｉｎのＳｕｒｅ−Ｓｅａｌ（商標）製品、またはＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪのＤｒｉＳｏｌｖ（商標）製品）を用いた。市販の溶媒および試薬は、さらに精製することなく使用した。指示されている場合、ＢｉｏｔａｇｅイニシエーターまたはＰｅｒｓｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙエムリーズオプティマイザーマイクロ波を使用するマイクロ波照射によって、反応物を加熱した。反応進行は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣＭＳ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および／またはガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣＭＳ）分析を使用してモニターした。ＴＬＣは、蛍光指示薬（２５４ｎｍ励起波長）を用いるプレコートシリカゲルプレートで実施し、ＵＶ光下でならびに／またはＩ_２、ＫＭｎＯ_４、ＣｏＣｌ_２、リンモリブデン酸および／もしくはモリブデン酸セリウムアンモニウム染色を用いて可視化した。ＬＣＭＳデータは、Ｌｅａｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓオートサンプラー、ジェミニＣ１８カラム、ＭｅＣＮ／水勾配、および、ＴＦＡ、ギ酸または水酸化アンモニウム調整剤のいずれかを用いて、アジレント１１００シリーズ機器で獲得した。カラム溶離液は、Ｗａｔｅｒｓ ＺＱ質量分析計走査を、１００から１２００Ｄａまでの正および負イオンモード両方で使用して分析した。他の同様の機器も使用した。ＨＰＬＣデータは、ジェミニまたはクロスブリッジＣ１８カラム、ＭｅＣＮ／水勾配、およびＴＦＡまたは水酸化アンモニウム調整剤のいずれかを使用して、アジレント１１００シリーズ機器で獲得した。ＧＣＭＳデータは、ＨＰ６８９０インジェクター、ＨＰ−１カラム（１２ｍ×０．２ｍｍ×０．３３μｍ）およびヘリウム担体ガスを用いるＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０オーブンを使用して獲得した。試料は、電子イオン化を使用して、５０から５５０ＤａまでＨＰ５９７３質量選択検出器走査で分析した。精製は、Ｉｓｃｏコンビフラッシュコンパニオン、ＡｎａＬｏｇｉｘインテリフラッシュ２８０、Ｂｉｏｔａｇｅ ＳＰ１、またはＢｉｏｔａｇｅアイソレラワン機器およびプレパックＩｓｃｏレディセップもしくはＢｉｏｔａｇｅスナップシリカカートリッジを使用する中速液体クロマトグラフィー（ＭＰＬＣ）によって実施した。キラル精製は、ＢｅｒｇｅｒまたはＴｈａｒ機器；キラルパック−ＡＤ、−ＡＳ、−ＩＣ、キラルセル−ＯＤまたは−ＯＪカラム；および、単独のまたはＴＦＡもしくはｉＰｒＮＨ_２を使用して修飾された、ＭｅＯＨ、ＥｔＯＨ、ｉＰｒＯＨまたはＭｅＣＮを加えたＣＯ_２混合物を使用する、キラル超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）によって実施した。ＵＶ検出を使用して、分別捕集を誘引した。

【0145】

質量分析データは、ＬＣＭＳ分析により報告される。質量分析（ＭＳ）は、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、電子衝撃イオン化（ＥＩ）または電子散乱（ＥＳ）イオン化源を介して実施した。プロトン磁気共鳴スペクトル法（^１Ｈ ＮＭＲ）化学シフトは、テトラメチルシランから低磁場のパーツパーミリオンで記され、３００、４００、５００または６００ＭＨｚのＶａｒｉａｎ分析計で記録した。化学シフトは、重水素化溶媒残留ピークを参照して、パーツパーミリオン（ｐｐｍ、δ）で表現される。ピーク形状は、次の通りに記述される：ｓ、一重線；ｄ、二重線；ｔ、三重線；ｑ、四重線；ｑｕｉｎ、五重線；ｍ、多重線；ｂｒｓ、広域一重線；ａｐｐ、見掛け。分析的ＳＦＣデータは、上述した通りにＢｅｒｇｅｒ分析機器で獲得した。旋光度データは、１ｄｍセルを使用してＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒモデル３４３偏光計で獲得した。シリカゲルクロマトグラフィーは、ＢｉｏｔａｇｅおよびＩＳＣＯを含む種々の商業的供給業者によって予め包装されたカラムを使用して、中圧ＢｉｏｔａｇｅまたはＩＳＣＯシステムを主として使用し実施した。微量分析は、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．によって実施され、算出された値の０．４％以内であった。

【0146】

別段の注記がない限り、化学反応は、室温（摂氏約２３度）で実施した。

【0147】

後述する化合物および中間体は、ケムバイオドローウルトラ、バージョン１２．０（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＳｏｆｔ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）が提供する命名規則を使用して命名した。ケムバイオドローウルトラ、バージョン１２．０が提供する命名規則は、当業者に周知であり、ケムバイオドローウルトラ、バージョン１２．０が提供する命名規則は、概して、有機化合物の命名法におけるＩＵＰＡＣ（国際純正応用化学連合）勧告およびＣＡＳインデックスルールに適合すると考えられる。別段の注記がない限り、すべての反応物質は、さらに精製することなく商業的に入手した、または文献において公知の方法を使用して調製した。

【0148】

用語「濃縮した」、「蒸発させた」および「真空で濃縮した」は、６０℃未満の浴温度を持つロータリーエバポレーターにおける、減圧での溶媒の除去を指す。略語「ｍｉｎ」および「ｈ」は、それぞれ「分」および「時間」を表す。用語「ＴＬＣ」は、薄層クロマトグラフィーを指し、「室温または周囲温度」は、１８から２５℃の間の温度を意味し、「ＧＣＭＳ」は、ガスクロマトグラフィー−質量分析を指し、「ＬＣＭＳ」は、液体クロマトグラフィー−質量分析を指し、「ＵＰＬＣ」は、超高速液体クロマトグラフィーを指し、「ＨＰＬＣ」は、高圧液体クロマトグラフィーを指し、「ＳＦＣ」は、超臨界流体クロマトグラフィーを指す。

【0149】

水素化は、加圧水素ガス下、Ｐａｒｒシェーカー内で、または、完全水素および１〜２ｍＬ／分の間の流速で、指定された温度にて、Ｔｈａｌｅｓ−ｎａｎｏ Ｈキューブフロー式水素化装置内で、実施され得る。

【0150】

ＨＰＬＣ、ＵＰＬＣ、ＬＣＭＳ、ＧＣＭＳおよびＳＦＣ保持時間は、手順に注記された方法を使用して測定した。

【0151】

本発明の化合物は、化学分野で周知のものに類似のプロセスを含む合成ルートによって、特に本明細書に含有される記述を踏まえて、合成され得る。出発材料は、概して、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）等の商業的供給源から入手可能であるか、または当業者に周知の方法を使用して容易に調製される（例えば、Ｌｏｕｉｓ Ｆ．ＦｉｅｓｅｒおよびＭａｒｙ Ｆｉｅｓｅｒ、Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第１〜１９巻、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６７〜１９９９年版）、またはＢｅｉｌｓｔｅｉｎｓ Ｈａｎｄｂｕｃｈ ｄｅｒ ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ、第４版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、付録を含む（Ｂｅｉｌｓｔｅｉｎオンラインデータベースを介しても利用可能）に概して記述されている方法によって調製される）。（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドの調製は、あらゆる目的のための参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１８−００５１０１２Ａ１の実施例１において提示されている。４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸の調製は、あらゆる目的のための参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＵＳ８，８５９，５７７の実施例９にある。［（１Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−３−｛２−［（２Ｓ）−２−メチルアゼチジン−１−イル］−６−（トリフルオロメチル）ピリミジン−４−イル｝−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサ−６−イル］酢酸（その結晶性遊離酸形態を含む）の調製は、米国特許第９，８０９，５７９号の実施例４において記述されている。ＧＬＰ−１Ｒアゴニストの調製は、米国特許第１０，２０８，０１９号において記述されている。

【0152】

中間体および実施例の調製
（実施例１）
（ＤＧＡＴ２ｉ化合物／化合物Ｄ）：（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミド

【0153】

【化3】

ステップ１：３−エトキシピリジン
炭酸セシウム（１２ｍｏｌ、１．５当量）およびヨウ化エチル（９．７ｍｏｌ、１．２当量）を、１５℃のアセトン（１２Ｌ）中の３−ヒドロキシピリジン（ｈｙｄｒｏｘｙｐｙｒｄｉｎｅ）（８．１０ｍｏｌ、１．０当量）の溶液に添加した。反応混合物を室温で２４時間にわたって撹拌した。反応混合物を濾過し、有機層を濃縮して、粗生成物を得た。酢酸エチル（２０Ｌ）を添加し、水（３×５Ｌ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して、３−エトキシピリジン（６２０ｇ、６２％）を油として得た。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 1.44 (t, 3H), 4.07 (q, 2H), 7.15-7.23 (m,
2H), 8.20 (dd, 1H), 8.30 (d, 1H).

【0154】

ステップ２：３−エトキシピリジン−１−オキシド
ｍ−クロロ過安息香酸（６．５ｍｏｌ、１．３当量）を、１０℃のジクロロメタン（１２Ｌ）中の３−エトキシピリジン（５．０ｍｏｌ、１．０当量）の溶液に添加した。反応混合物を室温で２４時間にわたって撹拌した。チオ硫酸ナトリウム（５Ｌの水中４ｋｇ）を添加した。反応混合物を１５℃で２時間にわたって撹拌した。別の部のチオ硫酸ナトリウム（５Ｌの水中１．５ｋｇ）を添加した。反応混合物を１５℃で１時間にわたって撹拌した。混合物をジクロロメタン（１６×１０Ｌ）で抽出した。合わせた有機層を濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール；１００：１〜１０：１）によって精製して、表題化合物（６８０ｇ、９７％）を褐色油として得た。これを、室温で２４時間にわたる石油エーテル（４Ｌ）での粉砕によってさらに精製して、３−エトキシピリジン−１−オキシド（５８０ｇ、８３％）を黄色固体として得た。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 1.41 (t, 3H), 4.02 (q, 2H), 6.84 (dd, 1H),
7.12 (dd, 1H), 7.85 (d, 1H), 7.91-7.95 (m, 1H).

【0155】

ステップ３：２−（（５−ブロモピリジン−３−イル）オキシ）−３−エトキシピリジン
この反応は、５つの並列バッチで行った。

【0156】

ジイソプロピルエチルアミン（２．６９ｍｏｌ、３．７当量）およびブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（０．９３ｍｏｌ、１．３当量）を、室温のテトラヒドロフラン（２５００ｍＬ）中の３−エトキシピリジン−１−オキシド（０．７２ｍｏｌ、１．０当量）および３−ブロモ−５−ヒドロキシピリジン（０．７２ｍｏｌ、１．０当量）の撹拌溶液に添加した。反応混合物を室温で２日間にわたって撹拌し、次いで、別個のバッチを合わせて、単一のバッチとした。得られた懸濁液を濃縮乾固し、ジクロロメタン（２５Ｌ）に溶解した。有機層を、１Ｎ水酸化ナトリウム（１５Ｌ）、水（３×２０Ｌ）およびブライン（２０Ｌ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して、油を得た。粗製油をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル；１０：１〜１：１）によって精製して、粗生成物を褐色固体として得た。この固体をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル：石油エーテル（１：１０；１１Ｌ）で粉砕して、２−（（５−ブロモピリジン−３−イル）オキシ）−３−エトキシピリジン（７３０ｇ、６９％）をオフイエロー固体として得た。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 1.49 (t, 3H), 4.16 (q, 2H), 7.04 (dd, 1H),
7.25 (dd, 1H), 7.68-7.73 (m, 2H), 8.44 (d, 1H), 8.49 (d, 1H). MS (ES+)
297.1 (M+H).

【0157】

ステップ４：エチル２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキシレート
テトラヒドロフラン（１．３Ｌ）中の２−（（５−ブロモピリジン−３−イル）オキシ）−３−エトキシピリジン（３００ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液を、窒素で３０分間にわたって脱気した。ターボグリニャール（３９０ｍｍｏｌ、１．３当量、テトラヒドロフラン中１．３Ｍ）を、室温にて、内部温度を３０℃未満に維持する速度で添加した。反応混合物を室温に冷却させ、３時間にわたって撹拌した。反応物を１０℃に冷却し、塩化亜鉛（３９０ｍｍｏｌ、１．３当量、２−メチルテトラヒドロフラン中１．９Ｍ）を、温度を１５℃未満に維持する速度で添加した。得られた懸濁液を、すべての沈殿物が溶解するまで室温に加温し、次いで、冷却して１０℃に戻した。エチル２−クロロピリミジン−５−カルボキシレート（３６０ｍｍｏｌ、１．２当量）およびジクロロ［ビス（２−（ジフェニルホスフィノ）フェニル）エーテル］パラジウム（ＩＩ）（６．００ｍｍｏｌ、０．０２当量）を固体として添加した。得られた懸濁液を、窒素で３０分間にわたって脱気し、次いで、５０℃に１６時間にわたって加熱した。反応物を水性条件下でワークアップし、次いで、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩、チオシリカ（ｔｈｉｏｓｉｌｉｃａ）および炭で順次に処理して、金属不純物を除去した。粗化合物をメタノール（４５０ｍＬ）から再結晶させて、エチル２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキシレート（７７ｇ、７０％）を淡黄色固体として産出した。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 1.44 (t, 3H), 1.50 (t, 3H), 4.19 (q, 2H),
4.46 (q, 2H), 7.00-7.04 (m, 1H), 7.25 (s, 1H), 7.71 (d, 1H), 8.59 (s, 1H), 8.66
(d, 1H), 9.32 (s, 2H), 9.55 (s, 1H).

【0158】

ステップ５：２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）ピリミジン−５−カルボン酸（中間体１）
水酸化ナトリウム（３０７ｍｍｏｌ、１．５当量、４Ｍ水溶液）およびメタノール（５０ｍＬ）を、テトラヒドロフラン（３００ｍＬ）中の２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキシレート（２０５ｍｍｏｌ、１．０当量）の懸濁液に添加した。得られた溶液を室温で３時間にわたって撹拌した。反応混合物を水（４００ｍＬ）で希釈し、２：１ ジエチルエーテル：ヘプタン（２×３００ｍＬ）で抽出した。水性層を４Ｍ塩酸で４のｐＨに酸性化した。得られた懸濁液を室温で１時間にわたって撹拌した。固体を濾過し、水で洗浄し、乾燥させて、２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）ピリミジン−５−カルボン酸（６９ｇ、１００％）を淡黄色固体として産出した。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ1.37 (t, 3H), 4.18 (q, 2H), 7.19 (dd, 1H),
7.58 (dd, 1H), 7.70 (dd, 1H), 8.35-8.40 (m, 1H), 8.66 (d, 1H), 9.33 (s, 2H),
9.41 (d, 1H), 13.9 (br. s, 1H).

【0159】

ステップ６：（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミド（実施例１（ＤＧＡＴ２ｉ化合物））
塩化オキサリル（１３．８ｍＬ、１６０ｍｍｏｌ、１．２当量）およびジメチルホルムアミド（０．５１０ｍＬ、６．６５ｍｍｏｌ、０．０５当量）を、ジクロロメタン（５００ｍＬ）中の２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）ピリミジン−５−カルボン酸（４５．０ｇ、１３３ｍｍｏｌ、１．０当量）の懸濁液に添加した。溶液が実現されたら、懸濁液を２時間にわたって撹拌した。反応混合物を濃縮して、粗酸塩化物を赤色固体として産出した。テトラヒドロフラン（１００ｍＬ）中の（Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−アミン（１２．２ｇ、１４０ｍｍｏｌ、１．０５当量）およびジイソプロピルエチルアミン（５１．０ｍＬ、２９３ｍｍｏｌ、２．２当量）の溶液を、０℃のジクロロメタン中粗酸塩化物の溶液（２００ｍＬ）に滴下添加した。反応物を室温に加温させ、１６時間にわたって撹拌した。水（１．０Ｌ）および酢酸エチル（６００ｍＬ）を添加し、有機層を分離し、飽和重炭酸ナトリウムで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した。濾液を活性炭（２０ｇ）で処理し、６５℃で２０分間にわたって撹拌した。懸濁液を温かいうちに濾過し、濾液を濃縮して淡黄色固体とし、これを、酢酸エチル中メタノール（４：１、１Ｌ）から再結晶させて、（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミド（４３．５ｇ、８１％）を無色固体として産出した。表題化合物を、同じ方式で調製した前のバッチ（１０８．７ｇ、２６６．８ｍｍｏｌ）と合わせ、８０℃で４時間にわたって酢酸エチル（１．０Ｌ）によりスラリー化した。懸濁液を室温に冷却させ、４日間にわたって撹拌した。固体を濾過し、酢酸エチル（３×２００ｍＬ）で洗浄し、高真空下、５０℃で２４時間にわたって乾燥させて、（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミド（１００．５ｇ、９２％）を無色固体として産出した。¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 1.38 (t, 3H), 1.89-1.98 (m, 1H), 2.15-2.26
(m, 1H), 3.65 (dd, 1H), 3.70-3.78 (m, 1H), 3.85-3.92 (m, 2H), 4.18 (q, 2H),
4.46-4.55 (m, 1H), 7.18 (dd, 1H), 7.58 (dd, 1H), 7.69 (dd, 1H), 8.37 (dd, 1H),
8.64 (d, 1H), 8.95 (d, 1H), 9.28 (s, 2H), 9.39 (d, 1H). MS (ES+) 408.4 (M+H).
融点１７７．５℃。C₂₁H₂₁N₅O₄の元素分析: 計算値C, 61.91; H, 5.20; N, 17.19; 実測値C, 61.86; H, 5.18; N, 17.30.

【0160】

この手順からの固体形態を、粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）分析によって特徴付け、化合物Ｄの形態１として割り当てた。

【0161】

（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミド（実施例１（化合物Ｄ））の調製のための代替ステップ６
１００ｍＬの反応器に、アセトニトリル（３５ｍＬ）、２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）ピリミジン−５−カルボン酸（５．０ｇ、１５ｍｍｏｌ）および（Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−アミン塩酸塩（２．２ｇ、１８ｍｍｏｌ、１．２当量）を投入した。温度を２０℃から３０℃に維持しながら、ジイソプロピルエチルアミン（１８ｍＬ、１０３ｍｍｏｌ、７．０当量）を投入した。アセトニトリル中プロパンホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ）の溶液（２１ｍＬ、３０ｍｍｏｌ、２．０当量）を、温度を４５℃未満に維持する速度で投入した。反応器を４０±５℃に１時間にわたって加熱し、次いで、反応完了のために試料採取した。反応物を２０℃から２５℃に冷却し、テトラヒドロフラン（２５ｍＬ）を添加した。重炭酸ナトリウムの溶液（０．５Ｍ、４０ｍＬ）を投入し、混合物を１時間にわたって撹拌した。ｐＨを確認し、８．５で測定した。酢酸エチル（４０ｍＬ）を添加し、混合物を１５分間にわたって撹拌した。混合物を静置し、相を分離させた。水性層を分液漏斗に移し、酢酸エチル（１００ｍＬ）で逆抽出した。有機相を合わせ、水（４０ｍＬ）で洗浄した。有機層を１００ｍＬの反応器に小分けにして移し、真空下で濃縮して、低体積とした。メチルエチルケトン（１００ｍＬ）を添加し、混合物を濃縮して、およそ６０ｍＬの最終体積とした。真空を除去し、スラリーを還流まで加熱し、固体が反応器壁から洗い流されるまで保持した。スラリーを１５℃に２時間かけて冷却し、終夜顆粒化した。固体を濾過によって単離し、反応器およびケーキをメチルエチルケトン（１０ｍＬずつ）で２回洗浄した。固体を、５０℃の真空オーブン内で乾燥させて、４．８６ｇ（８１％）の所望生成物を産出した。この手順からの固体形態を、ＰＸＲＤ分析によって特徴付けし、化合物Ｄの形態２として割り当てた。

【0162】

化合物Ｄの形態２から形態１への変換
１００ｍＬの反応器に、（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドの形態２（実施例１）（１０．０ｇ、２４．６ｍｍｏｌ、１．００当量）、メチルエチルケトン（８．８ｍＬ／ｇ）、８８．０ｍＬ）および水（１．２ｍＬ／ｇ、１２．０ｍＬ）を投入した。反応器を５０℃に３０分間かけて加熱した。完全溶液はおよそ４４℃で出現した。反応器を４０℃に３０分間かけて冷却し、次いで、（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミドの種形態１（化合物Ｄの実施例１）（０．０５０ｇ、０．１２３ｍｍｏｌ、０．００５０当量）を投入した。播種後、濁ったスラリーを１時間にわたって撹拌した後、５℃に２時間かけて冷却し、次いで、５℃で１２時間にわたって撹拌した。プロセス中の対照試料（ｉｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓａｍｐｌｅ）を取り出し、ＰＸＲＤ分析によって特徴付けて、固体が化合物Ｄの形態１であることを確認した。スラリーを濾過し、反応器およびケーキを０℃のメチルエチルケトン（２．５ｍＬ／ｇ、２５ｍＬ）で洗浄した。固体を、５０℃の真空オーブン内で乾燥させて、８．１５ｇ（８１．５％）の所望生成物を産出した。所望生成物のＰＸＲＤパターンは、化合物Ｄの形態１と一致していた。

【0163】

粉末Ｘ線回折：
粉末Ｘ線回折分析を、Ｃｕ放射線源（１．５４０５６ÅのＫα−平均波長）が装備され、ｇｏｂｅｌミラーを利用する双一次（ｔｗｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ）が装備されたＢｒｕｋｅｒ ＡＸＳ Ｄ８アドバンス回折計を使用して行った。回折される放射線をＰＳＤ−リンクスアイ検出器によって検出した。一次および二次いずれも２．５ソーラースリットを装備していた。Ｘ線管電圧およびアンペア数は、それぞれ４０ｋＶおよび４０ｍＡに設定した。データは、３．０から４０．０度２シータまでのロックドカップル走査（ｌｏｃｋｅｄ ｃｏｕｐｌｅ ｓｃａｎ）で、１ステップ当たり６秒の走査スピードを使用し１０００ステップで、シータ・シータゴニオメーターに収集した。試料は、シリコン低バックグラウンド試料ホルダー（Ｃ７９２９８Ａ３２４４Ｂ２６１）に入れることによって調製した。データはＢｒｕｋｅｒ ＤＩＦＦＲＡＣプラスソフトウェアを使用して収集した。分析はＥＶＡディフラクトプラスソフトウェアによって実施した。

【0164】

ＰＸＲＤデータファイルは、ピーク検索前には加工しなかった。ＥＶＡソフトウェアにおけるピーク検索アルゴリズムを使用して、５の閾値および０．２の幅値を持つピークを選択した。妥当性を確実にするために自動割り当ての出力を視覚的に確認し、必要ならば調整を手動で行った。３％以上の相対強度を持つピークを概して選択した。分離されなかった、またはノイズと一致するピークも廃棄した。ＵＳＰにおいて述べられているＰＸＲＤからのピーク位置に関連する典型的な誤差は、＋／−０．２°以内である（ＵＳＰ−９４１）。

【0165】

【表1】

【0166】

図１は、実施例１（化合物Ｄ）の結晶形態１を示す特徴的なｘ線粉末回折パターンである（縦軸：強度（ＣＰＳ）；横軸：２シータ（度））。

【0167】

図２は、実施例１（化合物Ｄ）の結晶形態２を示す特徴的なｘ線粉末回折パターンである（縦軸：強度（ＣＰＳ）；横軸：２シータ（度））。

【0168】

（実施例２）
４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸、化合物Ａ（ＡＣＣｉ化合物）の調製：
化合物Ａの調製では、本明細書において記述される調製方法のいくつかは、遠隔官能基（例えば、式Ｉ前駆体中の第一級アミン、第二級アミン、カルボキシル）の保護を必要とし得ることに留意されたい。そのような保護の必要性は、遠隔官能基の性質および調製方法の条件に応じて変動することになる。そのような保護の必要性は、当業者によって容易に決定される。そのような保護／脱保護方法の使用も、当業者が備える技能の範囲内である。保護基の概要およびそれらの使用については、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１を参照されたい。さらに、本発明は、本明細書で提供される具体的な合成方法に限定されず、それらは変動し得る。

【0169】

中間体Ａ１：１−イソプロピル−４，６−ジヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン（ｐｉｐｅｒｌｄｉｎ）］−７（１Ｈ）−オン、塩酸塩。

【0170】

【化4】

ステップ１． ｔｅｒｔ−ブチル９−オキソ−３−アザスピロ［５．５］ウンデカ−７−エン−３−カルボキシレート。

【0171】

【化5】

乾燥した反応器に、ｔｅｒｔ−ブチル４−ホルミルピペリジン−１−カルボキシレート（１０８Ｋｇ）、シクロヘキサン（１０８０Ｌ）およびピロリジン（６４．８Ｋｇ）を２５〜３０℃で投入した。混合物を５〜１０分間撹拌し、次いで、ディーン・スタークトラップを使用して水を収集しながら、１２〜１６時間にわたって還流まで加熱した。次いで、反応混合物を５０〜６０℃に冷却し、この温度で真空を印加して過剰なピロリジンおよびシクロヘキサンを蒸留した。次いで、反応混合物を２５〜３０℃に冷却し、シクロヘキサン（６４８Ｌ）、続いて、メチルビニルケトン（４９．６３Ｋｇ）を投入した。混合物を１２〜１６時間にわたって撹拌し、次いで濾過し、濾液を清潔で乾燥した反応器に投入した。溶液を１０〜１５℃に冷却し、次いで、温度を１５℃未満に維持しながら、水（５４Ｌ）中の酢酸（５４．７５Ｋｇ）の溶液をゆっくりと添加した。添加の終わりに、混合物を２５〜３０℃まで加温し、１２〜１６時間にわたって撹拌した。層を分離し、水性物を酢酸エチル（３２４Ｌ）で抽出した。合わせた有機層を、水（３２４Ｌ）中の重炭酸ナトリウム（３２．３４Ｋｇ）の溶液で洗浄し、次いで、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体を酢酸エチル（５４Ｌ）で洗浄し、合わせた濾液を、減圧下、４０℃未満で濃縮した。ｎ−ヘプタン（２１６Ｌ）を反応器に投入し、減圧下、４０℃未満で、乾固するまで蒸留を続行した。混合物を２５〜３０℃に冷却し、ｎ−ヘプタン（２１６Ｌ）を反応器に投入した。固体の形成後、混合物を１〜２時間にわたって撹拌した。次いで、固体を濾過し、ｎ−ヘプタン（５４Ｌ）で洗浄し、４０〜５０℃で１０〜１２時間にわたって乾燥させて、所望の材料（９０．１Ｋｇ、６７％収率）を産生した。

【0172】

ステップ２． （Ｅ）−ｔｅｒｔ−ブチル１０−（（ジメチルアミノ）メチレン）−９−オキソ−３−アザスピロ［５．５］ウンデカ−７−エン−３−カルボキシレート。

【0173】

【化6】

清潔で乾燥した反応器に、ｔｅｒｔ−ブチル９−オキソ−３−アザスピロ［５．５］ウンデカ−７−エン−３−カルボキシレート（５０Ｋｇ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５００Ｌ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジメチルアセタール（１３５Ｋｇ）を、窒素雰囲気下、２５〜３０℃で投入した。反応混合物を５〜１０分間撹拌し、次いで、１２０〜１３０℃に２０時間にわたって加熱した。次いで、混合物を５０〜６０℃に冷却し、溶媒を、高真空下、６０℃未満で蒸留した。混合キシレン（２００Ｌ）を４５℃未満で投入し、溶媒を、高真空下、６０℃未満で蒸留した。この操作を、別ロットの混合キシレン（２００Ｌ）を用いて繰り返した。次いで、トルエン（２００Ｌ）を反応器に投入し、溶媒を、高真空下、６０℃未満で蒸留した。この操作を、第２のロットのトルエン（２００Ｌ）を用いて繰り返した。次いで、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１００Ｌ）を３０℃未満で投入し、溶媒を、高真空下、４０℃未満で蒸留した。混合物を１５〜２０℃まで冷却し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１００Ｌ）を２０℃未満で投入した。混合物を２０〜３０分間にわたって撹拌し、固体を濾過し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（５０Ｌ）で洗浄し、真空なし、５０〜５５℃で１０時間にわたって乾燥させて、所望の化合物（５２．１Ｋｇ、８７％収率）を提供した。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ ppm 7.48 (s, 1H), 6.57 (d, J=9.97 Hz, 1H),
5.99 (d, J=10.16 Hz, 1H), 3.32-3.51 (m, 4H), 3.06 (s, 6H), 2.72 (s, 2H),
1.57-1.66 (m, 2H), 1.41-1.53 (m, 11H).

【0174】

ステップ３． ｔｅｒｔ−ブチル１−イソプロピル−１，４−ジヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボキシレート。

【0175】

【化7】

清潔で乾燥した反応器に、（Ｅ）−ｔｅｒｔ−ブチル１０−（（ジメチルアミノ）メチレン）−９−オキソ−３−アザスピロ［５．５］ウンデカ−７−エン−３−カルボキシレート（８０Ｋｇ）、トルエン（７０４Ｌ）およびトリメチルアミン（１６Ｌ）を２５〜３０℃で投入した。反応混合物を７０〜８０℃まで加温し、メタノール中イソプロピルヒドラジン塩酸塩の溶液（１．２５当量、合計１４１Ｋｇ）を４〜５時間かけて添加した。次いで、反応混合物を７０〜８０℃で８〜１０時間にわたって撹拌した後、１５〜２５℃に冷却した。次いで、内部温度を２５℃未満に維持しながら、水（４８０Ｌ）中のクエン酸（４８Ｋｇ）の溶液をゆっくりと添加した。酢酸エチル（２０８Ｌ）を添加し、混合物を１０分間にわたって撹拌した。層を分離し、有機層を、水（４８０Ｌ）中のクエン酸（４８Ｋｇ）の溶液、次いで、水のみ（３２０Ｌ）で連続的に洗浄した。合わせた水性層を酢酸エチル（３２０Ｌ）で抽出した。次いで、合わせた有機層を硫酸ナトリウム（８Ｋｇ）で乾燥させ、溶媒を、減圧下、４０℃未満で蒸発乾固させた。ジクロロメタン（２４０Ｌ）を反応器に投入し、混合物を２５〜３０℃で透明になるまで撹拌した。活性炭（１．８４Ｋｇ）、ケイ酸マグネシウム（１．８４Ｋｇ）およびシリカゲル（３２Ｋｇ、１００〜２００メッシュ）を２５〜３０℃で連続的に投入し、不均質混合物を１時間にわたって撹拌した。次いで、スラリーを、ハイフロスーパーセル（８Ｋｇ）およびジクロロメタン（４０Ｌ）を混合することによって調製されたハイフロベッド上で濾過した。ケーキをジクロロメタン（３回１２０Ｌ）で洗浄した。合わせた濾液を反応器に戻し入れ、溶媒を、減圧下、４０℃未満で蒸発させた。次いで、ｎ−ヘプタン（１６０Ｌ）を投入し、減圧下、４０℃未満で蒸留した。ｎ−ヘプタン（２００Ｌ）を反応器に投入し、混合物を０〜５℃まで冷却した。１２〜１５時間にわたって撹拌した後、固体を０℃で濾過し、冷やした（０〜５℃）ｎ−ヘプタン（１６０Ｌ）で洗浄し、真空下、４０〜５０℃で乾燥させて、表題化合物（８２．４Ｋｇ、７５％）を提供した。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ ppm 7.25 (s, 1H), 6.42 (dd, J=10.05, 0.49
Hz, 1H) 5.84 (d, J=9.95 Hz, 1H), 4.42-4.52 (m, 1H), 3.36-3.53 (m, 4H), 2.62 (s,
2H) 1.56-1.68 (m, 2H) 1.45-1.55 (m, 17H).

【0176】

ステップ４． １−イソプロピル−４，６−ジヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−７（１Ｈ）−オン、塩酸塩。

【0177】

【化8】

清潔で乾燥した反応器に、ｔｅｒｔ−ブチル１−イソプロピル−１，４−ジヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボキシレート（６０Ｋｇ）およびメタノール（６００Ｌ）を２５〜３０℃で投入した。Ｎ−ブロモコハク酸イミド（３２．４Ｋｇ）を５回に分けて２５〜３０℃で３０〜４０分間かけて添加し、撹拌を３０〜６０分間にわたって続けた。内部温度を３０℃未満に維持しながら、水（１０２Ｌ）中のチオ硫酸ナトリウム五水和物（５．４Ｋｇ）の溶液をゆっくりと添加した。混合物を２０〜３０分間にわたって撹拌し、次いで、溶媒を、減圧下、４５℃未満で蒸発させた。残留物を２５〜３０℃まで冷却し、２−メチルテトラヒドロフラン（ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕａｎ）（４２０Ｌ）を水（９０Ｌ）とともに反応器に投入した。混合物を１５〜２０分間にわたって撹拌し、次いで、層を分離し、水性層を２−メチルテトラヒドロフラン（１２０Ｌ）でさらに抽出した。合わせた有機抽出物を、水（１２０Ｌ）中の水酸化ナトリウム（４．８Ｋｇ）の溶液により、２５〜３０℃で１５〜２０分間にわたって処理した。層を分離し、有機層を、水（１２０Ｌ）、続いて、水（１２０Ｌ）中の塩化ナトリウム（１２Ｋｇ）の溶液で洗浄し、次いで、硫酸ナトリウム（６Ｋｇ）で乾燥させた。濾過後、ケーキを２−メチルテトラヒドロフラン（３０Ｌ）で洗浄し、合わせた濾液を反応器に戻し入れた。溶媒を、減圧下、４５℃未満で完全に蒸留し、残留物を、テトラヒドロフラン（２０１Ｌ）中で可溶化した。別の清潔で乾燥した反応器に、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（６０．６Ｋｇ）およびテトラヒドロフラン（３６０Ｌ）を２５〜３０℃で投入した。その混合物に、温度を３０℃未満に維持しながら、テトラヒドロフラン中の残留物の溶液をゆっくりと添加した。次いで、反応混合物を６０〜６５℃まで加温し、１〜２時間にわたってこの温度に保った。完了したら、混合物を０〜１０℃に冷却し、内部温度を１０℃未満に維持しながら、塩酸の溶液（１Ｎ、１９６Ｌ）でゆっくりとクエンチした。反応混合物を２５〜３０℃まで加温させ、酢酸エチル（７９８Ｌ）を投入した。１５〜２０分間にわたって撹拌した後、層を分離し、水性層を酢酸エチル（１６０Ｌ）でさらに抽出した。合わせた有機層を水（１６０Ｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウム（８Ｋｇ）で乾燥させ、濾過し、ケーキを酢酸エチル（３００Ｌ）で洗浄した。溶媒を、減圧下、４５℃未満で全面的に蒸留し、酢酸エチル（５４０Ｌ）を反応器に２５〜３０℃で、続いて、メタノール（１５６Ｌ）を投入した。混合物を０〜５℃に冷却し、この時点で、温度を指定された範囲内に維持しながら、塩化アセチル（７９．８Ｋｇ）をゆっくりと添加した。次いで、混合物を２０〜２５℃まで加温させ、撹拌しながら４〜５時間にわたってこの温度に保った。得られたスラリーを濾過し、固体を酢酸エチル（１２０Ｌ）で洗浄し、次いで、４０〜４５℃で８〜１０時間にわたって乾燥させて、所望の粗生成物（３３．５Ｋｇ、６５％）を得た。

【0178】

最終精製ステップは、この粗固体（５６．８Ｋｇ）を、２５〜３０℃の清潔で乾燥させた反応器内のメタノール（４５４．４Ｌ）中で可溶化することによって実施した。溶液を３０〜４５分間にわたって撹拌し、次いで、０．２ミクロンのカートリッジフィルターに通過させて、２５〜３０℃の清潔で乾燥した反応器に入れた。メタノールを、約１体積の溶媒が残るまで、減圧下、５０℃未満で蒸留した。反応混合物を２５〜３０℃に冷却し、０．２ミクロンのカートリッジフィルターを経由して新しいアセトニトリル（１１３．６Ｌ）を投入した。溶媒を、約１体積の溶媒が残るまで、減圧下、５０℃未満で蒸留した。反応混合物を２５〜３０℃に冷却し、０．２ミクロンのカートリッジフィルターを経由して、新しいアセトニトリル（１９０Ｌ）を反応器に投入した。混合物を６５〜７０℃まで加温し、４５分間にわたって撹拌し、次いで、２５〜３０℃まで冷却し、１時間にわたって撹拌し、得られたスラリーを濾過し、ケーキを、冷やした（１５℃）アセトニトリル（５６．８Ｌ）で洗浄した。固体を、減圧下、４０〜５０℃で８時間にわたって乾燥させて、中間体Ａ１（３６．４Ｋｇ、６４％）を得た。¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ ppm 7.43 (s, 1H), 5.32-5.42 (m, 1H),
3.15-3.25 (m, 4H), 2.89 (s, 2H), 2.64 (s, 2H), 1.69-1.90 (m, 4H), 1.37-1.45 (m,
6H); ESI [M+H]⁺ =248.

【0179】

中間体Ａ２：２−（４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）フェニル）−６−メトキシイソニコチン酸。

【0180】

【化9】

清潔で乾燥させた反応器に、２，６−ジクロロイソニコチン酸（３０Ｋｇ）およびメタノール（１２０Ｌ）を２０〜２５℃で投入した。スラリーを５分間にわたって撹拌し、次いで、６５℃（還流）まで加熱した。次いで、メタノール中ナトリウムメトキシドの溶液（３０％、８７．２Ｋｇ）を、添加漏斗を介して、少なくとも４時間かけてゆっくりと投入した。漏斗をメタノール（１５Ｌ）ですすぎ、撹拌を６５℃で少なくとも１５時間にわたって続行した。次いで、混合物を４５℃まで冷却し、約９０Ｌの残留体積になるまで減圧下で蒸留した。次いで、水（１８０Ｌ）中の重炭酸カリウム（２８．２Ｋｇ）および炭酸カリウム（２１．６Ｋｇ）の溶液を、反応器に４０〜４５℃で投入した。水溶液を含有する反応器を、水（２１Ｌ）ですすぎ、洗浄液を反応混合物に投入した。混合物を、約２４０Ｌの残留体積になるまで、減圧下、８０℃未満で蒸留し、次いで、２０〜２５℃まで冷却した。

【0181】

別の清潔で乾燥した反応器に、ｔｅｒｔ−ブチル４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキソボロラン（ｄｉｏｘｏｂｏｒｏｌａｎ）−２−イル）ベンゾエート（５２．３Ｋｇ）およびジオキサン（３４０Ｋｇ）を投入し、完全に溶解するまで２〜２５℃で撹拌した。次いで、前者の反応器の内容物を４０℃で加熱して、完全溶解度を確実にし、この新たな反応器に移した。反応混合物を２０〜２５℃まで冷却し、真空／窒素サイクルを介して脱酸素ステップを実施した。混合物を０〜１０℃までさらに冷却し、反応器に、酢酸パラジウム（０．６５Ｋｇ）、続いて、トリフェニルホスフィン（２．４６Ｋｇ）を窒素流下で投入した。混合物を２０〜２５℃まで加温し、真空／窒素サイクルを介して別の脱酸素ステップを実施した。次いで、混合物を８０℃に加熱し、少なくとも１８時間にわたってこの温度に維持した。混合物を２０〜２５℃まで冷却し、次いで、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１３３．２Ｋｇ）および水（３０Ｌ）を反応器に連続的に投入した。層を分離し、水性物を水（１１０Ｌ）で希釈し、次いで、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１１０Ｌ）で抽出した。合わせた有機抽出物を水（８４Ｌ）中のクエン酸（５２Ｋｇ）の溶液で洗浄し、層を分離した。水性層をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（８８．８Ｋｇ）でさらに抽出し、有機層を合わせ、次いで、水（８０Ｌ）中の塩化ナトリウム（４３Ｋｇ）の溶液の３分の１で３回洗浄した。最終層分離後、有機層を、チャコールカートリッジを含有するポールフィルターに通して濾過し、ケーキをメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１１．２Ｋｇ）で洗浄した。濾液を、減圧下、５０℃未満で約９０Ｌまで蒸留し、次いで、５０℃未満で約１２０Ｌまで、ヘプタン（１２０Ｌ）と連続的に共蒸留した。次いで、混合物を２０〜２５℃まで１時間かけて冷却し、次いで、この温度でもう１時間にわたって撹拌した。スラリーを濾過し、ケーキを、ヘプタン（３×１８Ｌ）で３回、次いで、アセトニトリル（３×１８Ｌ）で３回洗浄した。得られた湿った固体を、真空および窒素流下、４５℃未満で少なくとも１５時間にわたって乾燥させて、中間体Ａ２（４４．６Ｋｇ、８７％収率）を得た。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ ppm 8.13 (s, 2H), 8.09 (s, 2H), 7.97 (d,
J=1.17 Hz, 1H), 7.34 (d, J=0.98 Hz, 1H), 4.08 (s, 3H), 1.61 (s, 9H); ESI [M+H]⁺
=330.

【0182】

中間体Ａ３：ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）ベンゾエート。

【0183】

【化10】

丸底フラスコに、２−（４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）フェニル）−６−メトキシイソニコチン酸（中間体Ａ２、１５．２ｇ、４６．２ｍｍｏｌ）および酢酸エチル（１４０ｍＬ）を投入した。１，１’−カルボニルジイミダゾール（８．９８ｇ、５５．４ｍｍｏｌ）を一度に添加し、室温で１時間にわたって撹拌した。１−イソプロピル−４，６−ジヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−７（１Ｈ）−オン塩酸塩（中間体Ａ１、１４．８ｇ、５２．２ｍｍｏｌ）、続いて、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（９．１ｍＬ、５２．２ｍＬ）を添加し、反応物を室温で１８時間にわたって撹拌した。２Ｍ ＨＣｌ水溶液（４０ｍＬ）、続いて、１Ｍ硫酸水素カリウム（４０ｍＬ）および５０ｍＬのヘプタンを添加した。取得した混合物を室温で１時間にわたって撹拌した。混合物を分液漏斗に移した。有機相を分離し、水（２０ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム（３０ｍＬ）、水（２０ｍＬ）、ブライン（２０ｍＬ）で連続的に洗浄し、２０ｇの硫酸マグネシウムおよび１０ｇのシリカゲルで乾燥させ、濾過し、真空で濃縮した。濃縮の終わり頃に、固体が形成し始めた。残留物を、４０ｍＬの酢酸エチル中、８０℃で撹拌し、ヘプタン（１２０ｍＬ）をゆっくりと滴下添加した。混合物を８０℃で１時間にわたって撹拌し、次いで、１時間にわたって撹拌しながら室温にゆっくりと冷却し、室温で１８時間にわたって撹拌した。濾過を介して固体を収集し、水および酢酸エチル−ヘプタン（１：３）で洗浄し、真空下、５０℃で１８時間にわたって乾燥させて、中間体Ａ３（１９．６４ｇ、７６％収率）を取得した。

【0184】

中間体Ａ３の代替調製：
清潔で乾燥した反応器に、アセトニトリル（２１９Ｋｇ）および２−（４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）フェニル）−６−メトキシイソニコチン酸（中間体Ａ２、３４．８Ｋｇ）を２０〜２５℃で投入した。混合物を５分間にわたって撹拌し、次いで、１，１−カルボジイミダゾール（１８．９Ｋｇ）を３回に分けて連続で投入した。スラリーを２０〜２５℃で少なくとも１時間にわたってさらに撹拌し、次いで、１−イソプロピル−４，６−ジヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−７（１Ｈ）−オン塩酸塩（中間体Ａ１、３３．０Ｋｇ）を反応器に、続いて、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２０．５Ｋｇ）をポンプを介して投入した。試薬ポンプおよび反応器の壁をアセトニトリル（１３．７Ｋｇ）で洗浄し、撹拌を２０〜２５℃で少なくとも２時間にわたって続行した。完了したら、混合物にｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）ベンゾエート（中間体Ａ３、２０９ｇ）を播種し、少なくとも３０分間にわたって撹拌した。結晶化開始の確認後、水（２５７Ｌ）中のクエン酸一水和物（５８．５Ｋｇ）の溶液を１時間かけて投入した。得られたスラリーを２０〜２５℃で少なくとも２時間にわたってさらに撹拌し、次いで濾過し、ケーキをアセトニトリル（６８．４Ｋｇ）および水（８７Ｌ）の混合物で洗浄した。この洗浄液を使用して、反応器もすすいだ。固体を、減圧下、５５℃未満で乾燥させて、中間体Ａ３（４３．４４Ｋｇ、７３％収率）を得た。

【0185】

化合物Ａ（遊離酸として）：４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸。

【0186】

【化11】

丸底フラスコに、ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）ベンゾエート（３．７ｇ、６．６ｍｍｏｌ）およびトルエン（２５ｍＬ）を投入した。撹拌しながら８５％リン酸（３．０ｍＬ）を滴下添加し、反応物を６０℃に４時間にわたって加熱した。無色濃厚ガム状物が形成された。反応物を室温に冷却し、水を添加した。白色固体が観察された。トルエン有機層を廃棄し、水性層および固体を保存した。酢酸エチルを添加し（６０ｍＬ）、４Ｎ ＮａＯＨ溶液を添加してｐＨを約７に調整した。層を分離し、水性物を酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出した。合わせた酢酸エチル有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空で濃縮して、白色固体を提供した。これらを酢酸エチル（８０ｍＬ）に５０℃で溶解し、ヘプタン（９０ｍＬ）をゆっくりと添加した。熱を除去し、混合物を室温に冷却し、１６時間にわたって撹拌した。結果として生じた固体を濾過を介して収集し、母液ですすぎ、乾燥させて、表題化合物（化合物Ａ遊離形態、２．１５ｇ、６５％収率）を白色固体として提供した。

【0187】

化合物Ａ（遊離酸として）の代替調製：
清潔で乾燥した反応器に、アセトニトリル（１３０．４Ｋｇ）およびｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）ベンゾエート（中間体Ａ３、２０．７２Ｋｇ）を２０〜２５℃で投入した。混合物を５分間にわたって撹拌し、次いで、ｐ−トルエンスルホン酸（８．５Ｋｇ）を、穏やかな窒素掃引下で投入した。反応混合物を７０℃まで加温し、少なくとも６．５時間にわたってこの温度に維持した。完了したら、混合物を４０℃まで冷却し、化合物Ａ（１０４ｇ）を播種し、水（８３Ｌ）を少なくとも１時間かけてゆっくりと投入した。混合物を４０℃で最低４時間にわたってさらに撹拌し、次いで、２０〜２５℃まで２時間かけて冷却した。少なくとも２時間にわたるさらなる撹拌、続いて、濾過を行い、ケーキをアセトニトリル（３３Ｋｇ）および水（４１Ｌ）の溶液ですすいだ。この洗浄液を使用して、反応器もすすいだ。得られた固体を、減圧下、５５℃未満で乾燥させて、化合物Ａ（１６．５Ｋｇ、８９％収率）を得た。

【0188】

化合物Ａの形態１の調製 − 化合物Ａの無水モノ−トリス：

【0189】

【化12】

バイアルに、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸（１５１ｍｇ、０．３００ｍｍｏｌ）および３ｍＬのエタノールを投入した。混合物を８０℃に５分間にわたって加熱して、固体を溶解し、次いで、室温に冷却した。トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（３９ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で終夜撹拌した。ヘプタン（２．２５ｍＬ）を滴下添加してスラリーを生成し、これを５０℃に加熱して、透明溶液を生成した。混合物を撹拌しながら室温に終夜冷却した。白色固体が観察され、混合物を追加で３日間にわたって撹拌した。材料を濾過し、５０℃の真空オーブン内で終夜乾燥させて、形態１（１５１ｍｇ、０．２４２ｍｍｏｌ、８１％収率）を生成した。

【0190】

化合物Ａの形態１の代替調製：化合物Ａの無水モノ−トリス：
清潔で乾燥した反応器に、エタノール（８３Ｌ）を投入し、続いて、混合物を２０〜２５℃の温度に維持しながら、化合物Ａ（９．４３Ｋｇ）およびトリス（２．５５ｋｇ）を添加した。タンク壁をエタノール（２Ｌ）ですすぎ、得られた混合物を６５〜７０℃で加熱し、すべての固体が溶解するまで少なくとも３０分間にわたってこの温度に維持し、次いで、４５〜５０℃まで冷却した。１０μｍのインラインポリプロピレンフィルターに通す温濾過を実施し、反応器およびフィルターをエタノール（９Ｌ）で洗浄した。ｎ−ヘプタン（２４Ｌ）を同じインラインフィルターに通して温溶液に投入し、混合物に、４５〜５０℃のエタノール（０．５Ｌ）中、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸無水トリス塩（１００ｇ）を播種した。温度を少なくとも２時間にわたって保持した後、少なくとも２時間かけて２０〜２５℃まで冷却した。撹拌を少なくとも５日間にわたって続行した。次いで、スラリーを濾過し、ケーキをエタノール（１３Ｌ）およびｎ−ヘプタン（６Ｌ）の混合物で洗浄した。固体を、減圧下、４５℃未満で少なくとも１２時間にわたって乾燥させて、例１（１１．７Ｋｇ、７７％）を得た。

【0191】

化合物Ａの形態２の調製 − 化合物Ａのモノ−トリス塩の三水和物：

【0192】

【化13】

化合物Ａの形態２は、化合物Ａの形態１からの変換により取得した。５０ｍＬのイージーマックス反応器に、形態１（１．７２１４ｇ、２．７６０ｍｍｏｌ）、イソプロパノール（１６．５０ｍＬ、２１５．８ｍｍｏｌ）および水（６８８μＬ、３８．１９０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を、２５℃の反応器ジャケット温度で、約７２時間にわたって撹拌（３００ｒｐｍ）した。次いで、反応混合物を４０℃に１５分間かけて加温し、４０℃で約２４時間にわたって保持し、２０℃に一度冷却して、試験のために試料を除去した。ＰＸＲＤにより形態の混合物が見られ、したがって、追加の水（６８８μＬ、３８．１９０ｍｍｏｌ）を添加した。撹拌速度を４００ｒｐｍまで増大させ、スラリーを６時間にわたって撹拌させ、次いで、１５℃に冷却した。固体を６０ｍＬ／４０Ｍフィルターで単離し、９６／４ イソプロパノール／水で洗浄した。得られた材料は、ＰＸＲＤにより、化合物Ａの形態２と一致していた。

【0193】

化合物Ａの形態２の代替調製 − 化合物Ａのモノ−トリス塩の三水和物：
清潔で乾燥した反応器に、イソプロパノール（６０．４Ｋｇ）を投入し、混合物を２０〜２５℃の温度に維持しながら、化合物Ａ（１６．６８Ｋｇ）およびトリス（４．４２ｋｇ）を添加した。混合物を５分間にわたって撹拌し、次いで、水（６．７Ｋｇ）を投入し、スラリーを５５℃まで加温した。ここで、透明溶液を、事前に加温した清潔で乾燥した反応器（５０〜５５℃）中に、インライン１０μｍポリプロピレンフィルターに通して濾過した。次いで、溶液に、化合物Ａのモノ−トリス塩を三水和物（１６７ｇ）として播種した。播種が持続したことを確認後、混合物を少なくとも２時間かけて１５℃まで冷却し、次いで、１５℃で最低１６時間にわたって維持した。スラリーを濾過し、ケーキを、冷やしたイソプロパノール（１３．１Ｋｇ）で洗浄した。次いで、固体を、減圧下、２５℃未満で乾燥させて、化合物Ａの形態２（２２．１Ｋｇ、９８％収率）のみを得た。

【0194】

化合物Ａの形態１は無水物であり、周囲温度にて、約０．２（２０％ＲＨ）の水分活性未満で熱力学的に安定である。化合物Ａの形態１は、化合物Ａの図３に示されているものと実質的に同じＰＸＲＤパターンを有する。２θ±０．２°２θとして表現される化合物Ａの形態１の特徴的なＰＸＲＤピークは、９．６、１０．７および１１．３である。図３におけるＰＸＲＤパターンについてのピーク場所および強度を、表２で提供する。

【0195】

【表2】

【0196】

化合物Ａの形態１は、図４に示されているものと実質的に同じラマンスペクトルを有する。化合物Ａの形態１は、５６８、６９８、９８９、１２１８、１５１１、１５６１および１６１５、±２ｃｍ^−１で、ｃｍ^−１として表現される特徴的なラマンピークシフトを有する。図４における化合物Ａの形態１のピーク位置（±２ｃｍ^−１）および正規化された強度（Ｗ＝弱、Ｍ＝中、Ｓ＝強）を表３に収載する。

【0197】

【表3】

【0198】

化合物Ａの形態１は、図５に示されているものと実質的に同じ^１３Ｃ ｓｓＮＭＲスペクトルを有する。化合物Ａの形態１は、２２．９、１４６．２、１５７．９、１６１．９および１７２．９、±０．２ｐｐｍで、ｐｐｍとして表現される特徴的な^１３Ｃ ｓｓＮＭＲ化学シフトを有する。図５に示す通りの化合物Ａの形態１の^１３Ｃ化学シフト（±０．２ｐｐｍ）を、表４に収載する。

【0199】

【表4】

【0200】

化合物Ａの形態２は、三水和物であり、周囲温度および２０％ＲＨにて、約０．２の水分活性超で熱力学的に安定である。化合物Ａの形態２は、図６に示されているものと実質的に同じＰＸＲＤパターンを有する。２θ±０．２°２θとして表現される化合物Ａの形態２の特徴的なＰＸＲＤピークは、８．４、９．０、１０．５、１５．０および２４．７である。図６におけるＰＸＲＤパターンについてのピーク場所および強度を、表５で提供する。

【0201】

【表5】

【0202】

化合物Ａの形態２は、図７に示されているものと実質的に同じラマンスペクトルを有する。化合物Ａの形態２は、５６２、６９２、９８４、１２２５、１５０７、１５５７および１６１０±２ｃｍ^−１で、ｃｍ^−１として表現される特徴的なラマンピークシフトを有する。図７における化合物Ａの形態２のピーク位置（±２ｃｍ^−１）および正規化された強度（Ｗ＝弱、Ｍ＝中、Ｓ＝強）を、表６に収載する。

【0203】

【表6】

【0204】

化合物Ａの形態２は、図８に示されているものと実質的に同じ^１３Ｃ ｓｓＮＭＲスペクトルを有する。化合物Ａの形態２は、１９．２、１４９．５、１５５．６、１６３．８および１８８．３、±０．２ｐｐｍで、ｐｐｍとして表現される特徴的な^１３Ｃ ｓｓＮＭＲ化学シフトを有する。図８に示されている通りの化合物Ａの形態２の^１３Ｃ化学シフト（±０．２ｐｐｍ）を、表７に収載する。

【0205】

【表7】

【0206】

本明細書で提供される開示に基づき、当業者は、化合物Ａの各形態１および形態２が、様々な組合せにおけるいくつかの異なるスペクトルピークまたはパターンによって一意的に同定され得ることが分かるであろう。化合物Ａの形態１および形態２を別個に同定するために使用され得る特徴的なピーク値の例示的な組合せについて後述するが、これらの例示的な組合せを、決して本明細書において開示される他のピーク値組合せを限定するものとみなすべきではない。

【0207】

化合物Ａの形態２における３個の水分子の存在を確認するために、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄ８ベンチャー回折計を使用し、室温でデータを収集した。図９を参照されたい。単斜晶系クラスの空間群Ｐ２_１／ｃにおいてＳＨＥＬＸソフトウェアスイートを使用する固有位相決定法によって、構造を解明した（バージョン５．１、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＸＳ、１９９７）。その後、全行列最小二乗法によって構造を精緻化した。異方性変位パラメーターを使用して、すべての非水素原子を発見し、精緻化した。

【0208】

窒素および酸素に位置する水素原子を、フーリエ差分マップから発見し、距離を制限して精緻化した。残りの水素原子を算出された位置に置き、それらの担体原子に乗せた。

【0209】

最終Ｒ指数は、７．２％であった。最終差分フーリエは、欠損も誤入電子密度（ｍｉｓｐｌａｃｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｄｅｎｓｉｔｙ）もないことを明らかにした。

【0210】

表８は、化合物Ａの形態２に関して収集されたデータを提供する：

【0211】

【表8】

【0212】

４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸の結晶性２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール塩。この結晶性塩は、概して、化合物Ａのトリス塩と称される。

【0213】

４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸対塩の比が、１：１である、化合物Ａの結晶性トリス塩。

【0214】

結晶性塩が、無水結晶性塩である、化合物Ａの結晶性トリス塩。

【0215】

前記無水結晶性塩が、９．６、１０．７および１１．３ ２θ、±０．２°２θの回折角にピークを含むＰＸＲＤパターンを有する、化合物Ａの無水結晶性トリス塩。

【0216】

前記無水結晶性塩が、１５１１、１５６１および１６１５ｃｍ^−１、±２ｃｍ^−１にピークシフトを含むラマンスペクトルを有する、化合物Ａの無水結晶性トリス塩。

【0217】

前記無水結晶性塩が、２２．９、１４６．２および１６１．９ｐｐｍ、±０．２ｐｐｍの化学シフトを含む^１３Ｃ ｓｓＮＭＲスペクトルを有する、化合物Ａの無水結晶性トリス塩。

【0218】

前記無水結晶性塩が、１５１１および１６１５ｃｍ^−１、±２ｃｍ^−１にピークシフトを含むラマンスペクトル、ならびに２２．９、１４６．２または１６１．９ｐｐｍ、±０．２ｐｐｍの少なくとも１つの化学シフトを含む^１３Ｃ ｓｓＮＭＲスペクトルからなる群から選択される分析パラメーターを有する、化合物Ａの無水結晶性トリス塩。

【0219】

前記無水結晶性塩が、実質的に純粋である、化合物Ａの無水結晶性トリス塩。

【0220】

結晶性塩が、三水和物結晶性塩である、化合物Ａの結晶性トリス塩。

【0221】

前記三水和物結晶性塩が、８．４、９．０および１０．５ ２θ、±０．２°２θの回折角にピークを含むＰＸＲＤパターンを有する、化合物Ａの三水和物結晶性トリス塩。

【0222】

前記三水和物結晶性塩が、１５０７、１５５７および１６１０ｃｍ^−１、±２ｃｍ^−１にピークシフトを含むラマンスペクトルを有する、化合物Ａの三水和物結晶性トリス塩。

【0223】

前記三水和物結晶性塩が、１９．２、１４９．５および１６３．８ｐｐｍ、±０．２ｐｐｍの化学シフトを含む^１３Ｃ ｓｓＮＭＲスペクトルを有する、化合物Ａの三水和物結晶性トリス塩。

【0224】

前記三水和物結晶性塩が、
８．４および９．０ ２θ、±０．２°２θの回折角にピークを含むＰＸＲＤパターン、
１５５７および１６１０ｃｍ^−１、±２ｃｍ^−１にピークシフトを含むラマンスペクトル、ならびに
１９．２、１４９．５または１６３．８ｐｐｍ、±０．２ｐｐｍの少なくとも１つの化学シフトを含む^１３Ｃ ｓｓＮＭＲスペクトル
からなる群から選択される分析パラメーターを有する、化合物Ａの三水和物結晶性トリス塩。

【0225】

前記三水和物結晶性塩が、８．４および９．０ ２θ、±０．２°２θの回折角にピークを含むＰＸＲＤパターン、ならびに１５０７、１５５７または１６１０ｃｍ^−１、±２ｃｍ^−１に少なくとも１つのピークシフトを含むラマンスペクトルからなる群から選択される分析パラメーターを有する、化合物Ａの三水和物結晶性トリス塩。

【0226】

前記三水和物結晶性塩が、８．４および９．０ ２θ、±０．２°２θの回折角にピークを含むＰＸＲＤパターン、ならびに１９．２、１４９．５または１６３．８ｐｐｍ、±０．２ｐｐｍの少なくとも１つの化学シフトを含む^１３Ｃ ｓｓＮＭＲスペクトルからなる群から選択される分析パラメーターを有する、化合物Ａの三水和物結晶性トリス塩。

【0227】

薬理学的データ
下記のプロトコールは、当然ながら、当業者によって変動し得る。

【0228】

無作為化、ビヒクル対照、並行８アーム間比較研究を、雄スプラーグドーリーラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ））において行って、循環および肝臓ＴＧレベルを取得した。標準的な実験室条件を使用して９６匹のラット（約２００ｇ）を収容し、それらを二重収容し、１２：１２時間反転明暗スケジュール（８：００ＡＭに消灯）下に保った。ラットを、到着次第、チャウまたは西洋食群および用量群に無作為化し、研究の開始前に、標準的なラットチャウまたは西洋食のいずれかで１４日間の導入期間を与えた。標準的な実験室げっ歯類チャウ食５０５３は、ＬａｂＤｉｅｔ（ＰＭＩ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）製であった。西洋食Ｄ１２０７９Ｂｉは、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）製であった。

【0229】

これらの研究のために、ビヒクルを調製して、脱イオン水中０．５％（ｗｔ／体積）のメチルセルロース（ＭＣ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；２７４４２９）を作製した。化合物Ａ（トリス塩から調製したもの）または化合物Ｄのいずれかを加えたストック溶液を、それぞれの化合物で調製して、１０ｍｌの溶液が所望のｍｇ／ｋｇ投薬量を送達するような濃度を提供し、ここで、使用したラットの平均重量は約２００ｇであった。

【0230】

研究の１日目に開始して、ラットに、ビヒクル対照（脱イオン（ｄｉｏｎｉｚｅｄ）水中０．５％ＭＣ（ｗｔ／体積％））、低もしくは高用量の化合物Ａ（それぞれ１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ ＱＤ）、低もしくは高用量の化合物Ｄ（それぞれ５ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ）、または低用量の共投与（１ｍｇ／ｋｇ ＱＤの化合物Ａおよび５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤの化合物Ｄ）、または高用量の共投与（１０ｍｇ／ｋｇ ＱＤの化合物Ａおよび３０ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤの化合物Ｄ）のいずれかを、経口的に投薬した（１０ｍＬ／ｋｇ）。

【0231】

給餌血漿分析物：給餌血漿ＴＧ濃度を決定するための血液を、投薬２時間後に（暗サイクルが始まって２時間）側面尾静脈を介して収集し、エチレンジアミン四酢酸二カリウム（Ｋ_２ＥＤＴＡ）（ＰＮ３６５９７４）でコーティングされたＢＤマイクロティナチューブに移し、４℃で遠心分離した。次いで、得られた血漿試料を、Ｓｉｅｍｅｎｓトリグリセリド＿２アッセイ試薬（参照１０３３５８９２）を使用してＳｉｅｍｅｎｓ化学ＸＰＴ臨床分析装置（Ｍａｌｖｅｎ、ＰＡ）で分析した。

【0232】

絶食血漿分析物：絶食血漿ＴＧを決定するための血液を、４時間の絶食後、投薬２時間後に（暗サイクルが始まって２時間）側面尾静脈を介して収集し、Ｋ_２ＥＤＴＡ（ＰＮ３６５９７４）でコーティングされたＢＤマイクロティナチューブに移し、４℃で遠心分離した。次いで、得られた血漿試料を、Ｓｉｅｍｅｎｓトリグリセリド２アッセイ試薬（参照１０３３５８９２）を使用してＳｉｅｍｅｎｓ化学ＸＰＴ臨床分析装置（Ｍａｌｖｅｎ、ＰＡ）で分析した。

【0233】

研究の最後の日（２８日目）、４時間絶食後、投薬２時間後に、組織収集のためにラットを屠殺した：投薬２時間後、血漿分析物を決定するための血液を、側面尾静脈を介して収集し、次いで、動物をＣＯ_２窒息によって屠殺した。血液を、Ｋ_２ＥＤＴＡ（ＰＮ３６５９７４）でコーティングされたＢＤマイクロティナチューブに移し、４℃で遠心分離し、血漿を９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、−２０℃で貯蔵した。肝臓を迅速に除去し、アルミホイルで個々に包んだ液体Ｎ_２中で予冷したウォーレンベルグクランプ内でフリーズクランプし、その後、−８０℃で貯蔵した。

【0234】

組織細砕：冷凍された肝臓を、液体Ｎ_２中で冷却したアルミブロック上で迅速に細砕して、細砕全体を通して組織が冷凍されたままであることを確実にした。細砕された組織を、７ｍＬのポリプロピレン円錐管に移し、分析まで−８０℃で貯蔵した。

【0235】

肝臓トリグリセリドの抽出：およそ５０から１００ｍｇの細砕された組織を、８００μＬの氷冷１：１ ＣＨＣｌ_３：ＭＥＯＨを含有する２ｍＬのライシングマトリックスＤチューブ（ＭＰ Ｂｉｏ）に添加した。試料を、ＱｉａｇｅｎティシューライザーＩＩ（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号８５３００）を３０Ｈｚで４分間にわたって使用して、４℃で直ちに抽出した。次いで、ホモジネートを１３×１００ｍｍのガラス管に移し、氷の上に置いた。次いで、溶解管を８００μＬの１：１ ＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨですすぎ、３０秒間にわたってボルテックスし、１３×１００ｍｍのガラス管に添加した。氷の上にある間に、２．４ｍｌの１００％ＣＨＣｌ_３をすべてのガラスバイアルに添加して、ＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨの比を４：２にした。次いで、試料を−２０℃の冷凍庫に終夜入れた。翌日、１．７５ｍＬの１Ｍ ＫＣｌ Ｈ_２Ｏを添加して、比を４：２：１．７５比のＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏにした。次いで、試料を３０秒間にわたってボルテックスし、１５００ｒｐｍ×１５分にて４℃で遠心分離した。遠心分離後、有機相を新しい１３×１００ｍｍの抽出管に移し、Ｎ_２下、３７℃で乾燥させ、７５０μＬのＣＨＣｌ_３に再懸濁した。アミノプロピル固相抽出（ＳＰＥ）カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓカタログ番号０５４５６０、６ｍＬ、５００ｍｇ）を湿らせ、５ｍＬのヘキサンで洗浄した。洗浄後、ＣＨＣｌ_３中２００μＬの試料抽出物をカートリッジに塗布し、カラムを乾燥させることなく真空によって除去した。次いで、中性脂質を、５ｍｌの２：１ ＣＨＣｌ_３：イソプロパノール／５０μＭのブチル化ヒドロキシトルエンで溶離した。次いで、試料を、Ｎ_２下、３７℃で乾燥させ、１．７５ｍｌの９８：２ イソオクタン：イソプロパノールに再懸濁した。試料を０．２μＭのシリンジフィルターに通して濾過した後、ＨＰＬＣシアノプロピル（Ｃｙａｎｏｐｒｏｐｙ）カラム（３．５μＭの粒径−４．６×１５０ｍｍカラムＡｇｉｌｅｎｔゾルバックスエクリプスＸＢＤ−ＣＮ）に注入した。実行方法は、溶媒Ａ（１０００：１：２、イソオクタン：イソプロパノール：酢酸）および溶媒Ｂ（５０：５０ イソプロパノール：メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル）を使用する２７分の実行時間での４μＬ注入であった。０〜３分まで、溶媒組成を１００％溶媒Ａに保持した。３〜８分まで、溶媒組成を１００％溶媒Ａから９５％溶媒Ａおよび５％溶媒Ｂに変化させた。８〜１８分まで、溶媒組成を５０：５０比に変化させた。１８〜１９分まで、溶媒組成を１００％溶媒Ａに戻し、その組成を１９〜２７分まで保持した。

【0236】

核および膜画分は、処置群ごとにプールされた細砕された肝臓試料の一部から、標準的な方法を使用する超遠心分離によって調製した。核抽出物および膜画分由来の試料を、ウエスタンブロッティングによってＳＲＥＢＰ１について分析した。カルネキシンについてのウエスタンブロットを膜画分についてのマーカーとして、アクチンを全試料ローディングについてのマーカーとして、およびヒストン２Ｂを核画分についてのマーカーとして使用した。核ＳＲＥＢＰ１レベルは相対単位を使用して定量化し、ヒストン２Ｂに対して正規化して、核分別およびゲルローディング中の試料喪失を制御した。

【0237】

細砕された肝臓の別の一部を加工し、脂質生成遺伝子発現について分析した。ＡＣＣ１、ＦＡＳＮ、ＳＣＤ１、ＰＣＳＫ９およびＳＲＥＢＰ−１ｃに対するラットタックマンプローブはすべて、Ａｃｔｂをハウスキーピング遺伝子として使用して、ｑＰＣＲで評価した。

【0238】

（Ｓ）−２−（５−（（３−エトキシピリジン−２−イル）オキシ）ピリジン−３−イル）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ピリミジン−５−カルボキサミド（化合物Ｄ）または薬学的に許容できるその塩の、４−（４−（１−イソプロピル−７−オキソ−１，４，６，７−テトラヒドロスピロ［インダゾール−５，４’−ピペリジン］−１’−カルボニル）−６−メトキシピリジン−２−イル）安息香酸（化合物Ａ）または薬学的に許容できるその塩と組み合わせた投与は、化合物Ａを単剤療法として投与した場合の血漿および肝臓ＴＧレベルと比較して、有意に減少した血漿（図１０、１１）および肝臓ＴＧ（図１８）レベルをもたらした。

【0239】

西洋食給餌は、チャウ給餌ラットと比べて、給餌状態血漿ＴＧにおける２．２倍の増大をもたらした（図１０）。低用量（１ｍｇ／ｋｇ ＱＤ）または高用量（１０ｍｇ／ｋｇ ＱＤ）いずれかの化合物Ａのみ（単剤療法）の経口投与は、ビヒクル投与された西洋食給餌ラットと比べて、給餌状態での血漿ＴＧにおけるそれぞれ１．７倍および１．３倍の増大をもたらした。逆に、低用量（５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ）または高用量（３０ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ）いずれかの化合物Ｄのみ（単剤療法）の経口投与は、ビヒクル投与された西洋食給餌ラットと比べて、給餌状態における血漿ＴＧをそれぞれ５５％および６３％低減させた。化合物Ａおよび化合物Ｄの共投与は、給餌状態での血漿ＴＧにおける化合物Ａ媒介性増大の完全遮断をもたらした。両方低用量または両方高用量のいずれかの、化合物Ａおよび化合物Ｄの経口共投与は、ビヒクル投与された西洋食給餌ラットと比べて、給餌状態血漿ＴＧレベルを３７％および６４％低減させた。

【0240】

西洋食給餌は、チャウ給餌ラットと比べて、絶食血漿ＴＧにおける１．６倍の増大をもたらした（図１１）。単剤療法としての低および高用量の化合物Ａの経口投与は、ビヒクル投与された西洋食給餌ラットと比べて、絶食血漿ＴＧにおけるそれぞれ２．４倍および１．７倍の増大をもたらした。逆に、単剤療法としての低および高用量の化合物Ｄの経口投与は、ビヒクル投与された西洋食給餌ラットに比べて、絶食血漿ＴＧをそれぞれ２０％および３５％低減させた。両方低用量のそれぞれまたは高用量のそれぞれの、化合物Ａおよび化合物Ｄの経口共投与は、化合物Ａのみを投与した場合に観察される絶食血漿ＴＧにおける化合物Ａ媒介性増大を、完全に軽減した。共投与された化合物Ａおよび化合物Ｄの低用量群（１０９ｍｇ／ｄｌ）および高用量群（８１ｍｇ／ｄｌ）両方についての絶食血漿ＴＧレベルは、ビヒクル投与された西洋食給餌ラット（９６ｍｇ／ｄｌ）と同様であった。

【0241】

ビヒクル、高用量化合物Ａ単剤療法、高用量化合物Ｄ単剤療法、または共投与された高用量化合物Ａおよび高用量化合物Ｄを投与した西洋食給餌ラット由来の試料において、核ＳＲＥＢＰ−１局在化を比較した（図１２）。ビヒクル処置西洋食給餌ラットと比べて、化合物Ａの投与は、ＳＲＥＢＰ−１活性化の増大を指し示すＳＲＥＢＰ−１の核局在化の増大を生成した。逆に、化合物Ｄの投与は、ＳＲＥＢＰ−１核局在化およびＳＲＥＢＰ−１活性化を低減させた。化合物Ａおよび化合物Ｄの共投与は核ＳＲＥＢＰ−１局在化における化合物Ａ媒介性増大を遮断し、化合物Ａのみの単剤療法と比較して５０％減少を生成した。

【0242】

チャウ給餌ビヒクル処置ラットと比べて、西洋食を給餌およびビヒクルで処置した動物は、脂質生成遺伝子：ＡＣＣ１（図１３）、ＦＡＳＮ（図１４）、ＳＣＤ１（図１５）およびＳＲＥＢＰ１（図１６）の発現の増大を示す傾向があったが、ＰＣＳＫ９（図１７）はなく、これは西洋食給餌ラットよりも低かった。化合物Ａの投与は、西洋食給餌およびビヒクル処置動物と比べて、ＡＣＣ１、ＦＡＳＮ（化合物Ａ高用量のみ）、ＳＣＤの発現をさらに増大させる傾向があったが、ＰＣＳＫ９およびＳＲＥＢＰ１はなかった。逆に、化合物Ｄの投与は、脂質生成遺伝子のすべての発現を減少させた。化合物Ａおよび化合物Ｄの共投与は、ビヒクル処置西洋食給餌ラットにおいて観察されたものと同等のまたはそれよりも低い発現レベルをもたらした。

【0243】

チャウ給餌ラットと比べて、ビヒクル投与された西洋食給餌ラットは、肝臓トリグリセリド蓄積における約２．７倍の増大を示した（図１８）。低用量および高用量の化合物Ａの経口投与は、ビヒクル投与された西洋食給餌ラットと比べて、脂肪症におけるそれぞれ３６％および５３％の低減を生成した。同様に、低用量および高用量の化合物Ｄの経口投与は、ビヒクル投与された西洋食給餌ラットと比べて、脂肪症をそれぞれ２５％および３０％低減させた。低または高用量いずれかの化合物Ａおよび化合物Ｄ両方の経口共投与は、ビヒクル投与された西洋食給餌ラットと比べて、脂肪症をそれぞれ５０％および７３％低減させた。低用量または高用量いずれかの化合物Ａおよび化合物Ｄの組合せの経口投与は、同じ用量レベルの単剤療法としての化合物Ａまたは化合物Ｄいずれかの投与で観察されるものよりも、脂肪症におけるより大きい低減を生成した。

【0244】

無作為化、ビヒクル対照、並行５アーム間比較研究を、コリン欠乏および高脂肪食（ＣＤＡＨＦＤ）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｄｉｅｔｓ；Ａ１６０９２００３）を給餌した雄ウィスターハンラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ））において行って、化合物Ａまたは化合物Ｄのいずれかを、単剤療法として単独でまたは組み合わせて投与した場合の、肝臓炎症および線維症のマーカーの改善における差異を同定した。標準的な実験室条件を使用して６０匹のラット（約２００ｇ）を収容し、それらを二重収容し、１２：１２時間反転明暗スケジュール（８：００ＡＭに消灯）下に保った。ラットに、研究開始の６週間前から始めて、コリン欠乏および高脂肪食（ＣＤＡＨＦＤ）を給餌した。ラットを、４つの投薬群（ｎ＝１２／群）に無作為化し、ビヒクル、化合物Ａ（５ｍｇ／ｋｇ）単剤療法、化合物Ｄ（３０ｍｇ／ｋｇ）単剤療法、または共投与化合物Ａ（５ｍｇ／ｋｇ）および化合物Ｄ（３０ｍｇ／ｋｇ）の１日２回投与を、６週間の期間にわたって受けさせた。研究全体を通して正常なチャウを続け、１日２回ビヒクルを投与した動物（ｎ＝１２）を、対照群として使用した。循環マーカーの評価のために、化合物投与開始前ならびに化合物投与３および６週間後に、血液試料を収集した。せん断波エラストグラフィ（エクスプローラーアルティメット撮像装置、Ｓｕｐｅｒｓｏｎｉｃ ｉｍａｇｉｎｅ）測定を、−３週目、０週目（第１回用量の前）、３週目および６週目に行って、炎症および線維症進行を経時的に評価した。ＣＤＡＨＦＤでの１２週間に対応する薬物投与の６週間後、組織学を評価した。結果は、各投薬群ごとの動物の平均として提供される。

【0245】

ＣＤＡＨＦＤでの１２週間後、動物をＣＯ_２窒息によって屠殺した。肝臓の、右外側、内側および左外側葉を収穫した。切片を、左外側、内側右および右外側葉から採取し、ホルマリン中で固定し、動物ごとにパラフィンブロックに加工した。動物１匹当たり左外側葉の１切片を、最適切削温度（ＯＣＴ）化合物中で凍結保存した。各動物からの肝臓の残りを冷凍し、液体Ｎ_２中で冷却したアルミブロック上で迅速に細砕して、細砕全体を通して組織が冷凍されたままであることを確実にした。細砕された組織を移し、分析まで−８０℃で貯蔵した。各動物由来の細砕された肝臓試料の一部を加工し、線維形成の遺伝子発現マーカーについて分析した。αＳＭＡおよびＣＯＬ１Ａ１に対するラットタックマンプローブはすべて、Ａｃｔｂをハウスキーピング遺伝子として使用して、ｑＰＣＲで評価した。

【0246】

下記のエンドポイントを、専門医師会認定の獣医病理学者による定性的組織学的評価および定量的組織形態計測（ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ）によって評価した：αＳＭＡ免疫組織化学（ＩＨＣ）による肝星細胞活性化および筋線維芽細胞への分化；ピクロシリウスレッド染色による線維症の相関としてのコラーゲン。画像は、Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍソフトウェアを使用して分析した。閾値パラメーター付きのＶｉｓｉｏｐｈａｒｍアプリケーションを一様に適用して、組織切片を同定し、各ＩＨＣ（ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）陽性）または組織化学的に染色されたスライド上の標的をパーセント面積として定量化した：目的の染色面積／全組織ＲＯＩ−空白部分）×１００％。ノンパラメトリック統計を使用して、この研究からのデータを分析した。群の値を、平均＋／−平均の標準誤差として報告した。

【0247】

チャウ食を給餌しビヒクルを投与した対照動物と比べて、ＣＤＡＨＦＤを受けビヒクルを投与した動物は、研究期間中にわたり、肝臓剛性における著しい増大（せん断波エラストグラフィ（ＳＷＥ）を使用して評価、キロパスカル（ｋＰａ）で測定）を示し、進行性肝臓炎症および線維症を指し示した（図１９）。化合物Ａまたは化合物Ｄの単剤療法としての投与はそれぞれ、肝臓剛性を低減させ、肝臓炎症および／または線維症の低減を示唆した。化合物Ａおよび化合物Ｄの共投与は、単剤療法としてのいずれの作用物質よりも、肝臓剛性において大きい低減を生成した（図１９）。

【0248】

チャウ食を給餌しビヒクルを投与した対照動物と比べて、ＣＤＡＨＦＤを受けビヒクルを投与した動物は、肝臓アルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）染色における著しい増大を示し、筋線維芽細胞活性化および線維形成を指し示した（図２０）。化合物Ａまたは化合物Ｄの単剤療法としての投与はそれぞれ、αＳＭＡ染色をそれぞれ４１％および２３％低減させ、肝臓の筋線維芽細胞活性化および線維形成の低減を示唆した。化合物Ａおよび化合物Ｄの共投与は、単剤療法としてのいずれの作用物質よりも、αＳＭＡ染色において大きい低減を生成し、染色を７２％低減させた（図２０）。

【0249】

チャウ食を給餌しビヒクルを投与した対照動物と比べて、ＣＤＡＨＦＤを受けビヒクルを投与した動物は、ピクロシリウスレッド（ＰＳＲ）染色における著しい増大を示し、コラーゲン沈着および線維症を指し示した（図２１）。化合物Ａまたは化合物Ｄの単剤療法としての投与はそれぞれ、ＰＳＲ染色をそれぞれ２６％および２０％低減させ、コラーゲン沈着および線維症の低減を示唆した。化合物Ａおよび化合物Ｄの共投与は、単剤療法としてのいずれの作用物質よりも、ＰＳＲ染色において大きい低減を生成し、染色を５６％低減させた（図２１）。

【0250】

チャウ食を給餌しビヒクルを投与した対照動物と比べて、ＣＤＡＨＦＤを受けビヒクルを投与した動物は、イオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａ１）染色における著しい増大を示し、肝マクロファージ活性化を指し示した（図２４）。化合物Ａの単剤療法としての投与は、Ｉｂａ１染色を１５％低減させ、肝臓の炎症トーンの低減を示唆した。一方、Ｄの単剤療法としての投与は、Ｉｂａ１染色を変化させず、ＡおよびＤの共投与は、単剤療法として投与された化合物Ａよりも、Ｉｂａ１染色において大きい低減を生成し、染色を３３％減少させた（図２４）。

【0251】

チャウ食を給餌しビヒクルを投与した対照動物と比べて、ＣＤＡＨＦＤを受けビヒクルを投与した動物は、肝臓アルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）（図２２）およびコラーゲンＡ１Ａ（ＣＯＬ１Ａ１）（図２３）遺伝子発現における著しい増大を示し、筋線維芽細胞活性化および線維形成を指し示した。化合物Ａまたは化合物Ｄの単剤療法としての投与はそれぞれ、肝臓のαＳＭＡおよびＣＯＬ１Ａ１遺伝子発現を低減させ、肝臓の筋線維芽細胞活性化および線維形成の低減を示唆した。化合物Ａおよび化合物Ｄの共投与は、単剤療法としてのいずれの作用物質よりも、肝臓のαＳＭＡ（図２２）およびＣＯＬ１Ａ１（図２３）遺伝子発現において大きい低減を生成した。

【0252】

第ＩＩ相薬力学、安全性および忍容性研究
第２Ａ相、無作為化、二重盲検、プラセボ対照、並行群間比較研究を行って、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を持つ成人において６週間にわたって共投与された実施例２の化合物（化合物Ａ）および実施例１の化合物（化合物Ｄ）の、薬力学、安全性および忍容性を評価した。化合物の共投与は、１２時間ごとに３００ｍｇ用量（１００ｍｇずつ３個の錠剤）としての化合物Ｄの経口投与および１２時間ごとに１５ｍｇ用量（５ｍｇずつ３個の錠剤）として投与される化合物Ａの経口投与を含んだ。

【0253】

化合物Ａによるアセチル−ＣｏＡ（補酵素Ａ）カルボキシラーゼ１および２の阻害ならびに化合物Ｄによるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の阻害は、脂質代謝を異なった補完的な手法でモジュレートするであろうと仮定され、２つの化合物の共投与が、単独で投与されたいずれかの作用物質と比較して改善されたベネフィット・リスクプロファイルにつながり得ることを示唆していた。全肝臓脂肪（ＷＬＦ）の一次ＰＤエンドポイント、安全性（血小板）および忍容性に関する主要な二次エンドポイント、ならびに脂質（例えば、トリグリセリド、ＴＧ）および肝機能検査（ＬＦＴ）を含む主要な三次／診査ＰＤおよびバイオマーカーエンドポイントについての結果を、以下の表９にまとめる：
表９：全肝臓脂肪、トリグリセリドおよび血小板の処置効果のまとめ（ベースラインから４２日目までの変化、プラセボ調整）。

【0254】

【表9】

【0255】

４２日目における全肝臓脂肪（ＷＬＦ）およびトリグリセリドについての主要な所見は、ｉ）すべての処置アームが、ＷＬＦについての予め指定された決定基準（すなわち、処置アームがプラセボよりも良好であり；観察されたプラセボ調整低減が３０％の目標値よりも大きいという９５％以上の信頼）を満たしたこと；ｉｉ）化合物Ａによる単剤療法が著しいトリグリセリド上昇を誘導し、化合物Ｄによる単剤療法がトリグリセリドにおける適度の減少につながったこと；ならびに、ｉｉｉ）化合物Ａおよび化合物（Ｃｏｍｏｕｎｄ）Ｄの共投与が、プラセボと比較して最小限変化したトリグリセリド値につながり、化合物Ａ単剤療法で見られるトリグリセリド上昇の強力な軽減をもたらしたことを示す。

【0256】

主要な安全性および忍容性所見は、ｉ）すべての処置アームが概して安全であり、研究過程にわたって忍容性良好であったこと；およびｉｉ）いかなる処置アームにおいても血小板における臨床的に意味のある変化が観察されなかったことを示す。プラセボと比較して、化合物Ａ単剤療法アームでは血小板における減少が観察された。これは、化合物Ｄでは明らかではなかった。驚くべきことに、血小板における減少が、化合物Ａ／化合物Ｄ共投与アームにおいて向上した。

【0257】

まとめると、化合物Ａ／化合物Ｄの共投与は、概して安全であり、忍容性良好であり、化合物Ｄ単独の投与よりも大きいＷＬＦ低減を提供し、化合物Ａによる単剤療法に関連して誘導されるトリグリセリド上昇を実質的に軽減した。

【0258】

ベースライン特徴
以下の表１０は、研究個体群の主要な人口統計学およびベースライン特徴についての情報を提供する。

【0259】

【表10】

【0260】

ＭＲＩ−ＰＤＦＦによる一次全肝臓脂肪
ＭＲＩ−ＰＤＦＦによるＷＬＦにおけるベースラインから４２日目までの対数変換された相対変化は、共分散分析法（ＡＮＣＯＶＡ）を使用して分析した。モデルは、ＭＲＩ−ＰＤＦＦによる対数変換されたベースラインＷＬＦを共変量として含んでいた。モデルから導出された推定を対数スケールから逆変換し、パーセント変化に変換した。図２５ａは、処置アームによるＷＬＦデータの箱ひげ図を示し、表１１は、ＡＮＣＯＶＡモデルからの結果を提供する。

【0261】

【表11】

【0262】

すべての処置アームは、数値的増大を示したプラセボと比較して、４２日目におけるベースラインからのＷＬＦにおける低減につながる。各処置アームは、プラセボに対するＷＬＦについての予め指定された決定基準（すなわち、処置アームがプラセボよりも良好であり；観察されたプラセボ調整低減が３０％の目標値よりも大きいという９５％以上の信頼）を満たした。さらに、アーム間でのＷＬＦにおける低減の規模の比較は、化合物Ａおよび化合物Ｄ共投与が、化合物Ｄによる単剤療法よりも数値的に大きい低減および化合物Ａによる単剤療法と同等の低減につながるという証拠を示した［−０．２１％（５０％ＣＩ−６．８２、６．８７）］（表１１を参照）。

【0263】

図２５ｂおよび２５ｃは、肝臓脂肪における３０％以上または５０％以上相対的低減の肝臓脂肪の低減閾値を満たす参加者の割合を実証する。

【0264】

血清トリグリセリド
血清トリグリセリドにおけるベースラインからの対数変換された相対変化は、反復測定の混合モデル（ＭＭＲＭ）を使用して分析した。モデルは、対数変換されたベースラインＴＧおよびベースライン全肝臓脂肪を共変量として含んでいた。モデルから導出された推定を対数スケールから逆変換し、パーセント変化に変換した。表１２ａは、血清トリグリセリドにおけるベースラインからのパーセント変化 − ＦＡＳの統計的分析を提供する。図２６は、血清トリグリセリドにおけるベースラインからのパーセント変化 − ＦＡＳを表す最小二乗平均値および９０％ＣＩのプロットである。

【0265】

【表12】

【0266】

表１２ａは、各時点におけるＭＭＲＭモデルからの結果を示す。データは、ＡＣＣｉ誘導トリグリセリド上昇が化合物Ａによる単剤療法投与で観察されたことを示す。しかしながら、研究仮説と一致して、化合物Ａ／化合物Ｄの共投与は、トリグリセリド上昇の軽減につながった。４２日目のトリグリセリドにおけるプラセボ調整増大は、化合物Ａ処置アームにおいては４７．３０％（２１．７７％、７８．１９％）であったが、化合物Ａ／化合物Ｄ組合せアームにおいてはわずか６．００％（−１２．２１％、２７．９９％）であった。これは、化合物Ａ単剤療法アームと比べて、組合せアームのトリグリセリドレベルにおける２８．０３％（２３．４０％、３２．３９％）の統計学的に有意な低減に等しい。組合せアームにおける５日目および１４日目のトリグリセリド上昇は、化合物Ａ単剤療法アームにおいて見られたものよりも小さい規模であり、２８日目および４２日目の値はプラセボと同様であった（図２６を参照）。

【0267】

加えて、表２２ｂは、ＮＡＦＬＤ患者におけるトリグリセリド異常のまとめを提供する。データは、トリグリセリド閾値を超える対象の総数（％）として提示される。データセットは、４００ｍｇ／ｄｌ超、６００ｍｇ／ｄｌ超および８００ｍｇ／ｄｌ超の化合物Ａ媒介性トリグリセリド異常の軽減を示す。具体的には、データは、化合物Ａおよび化合物Ｄの共投与による、化合物Ａ媒介性トリグリセリド異常（６００ｍｇ／ｄｌ超および８００ｍｇ／ｄｌ超）の完全遮断を示す。

【0268】

【表13】

【0269】

他の脂質およびアポリポタンパク質
４２日目における他の空腹時血清脂質パラメーターにおけるベースラインからのパーセント変化 − ＦＡＳの統計的分析のまとめを、表１３で提供する。

【0270】

【表14】

【0271】

３つの処置アーム（化合物Ａ単剤療法、化合物Ｄ単剤療法および化合物Ａ／化合物Ｄ共投与）の、主要な脂質パラメーター（総コレステロール、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール、非ＨＤＬコレステロール）に対する影響を、４２日目について上記表１３に示し、各アームをプラセボと、および化合物Ａ／化合物Ｄ共投与アームを各単剤療法アームと比較する。総コレステロールについて、すべての処置アームは、プラセボよりも低い傾向があり、化合物Ａ／化合物Ｄ共投与アームにおいて統計学的に有意な減少が見られた［−９．５８％（−１６．２６、−２．３８）］。各単剤療法アームを各組合せアームと比較した場合、統計学的に有意な差異は観察されなかった。ＨＤＬコレステロールは、すべての処置アームにおいて、プラセボと比較して同様の規模で減少した。化合物Ａ／化合物Ｄの共投与は、ＨＤＬコレステロールを有意に各単剤療法よりも低く減少させなかった。ＬＤＬコレステロールは、化合物Ａ単剤療法アームにおいて統計学的に有意に減少し、化合物Ｄ単剤療法および化合物Ａ／化合物Ｄ共投与アームにおいて、統計学的に有意ではない、数値的に低下する傾向があった。非ＨＤＬコレステロールは、いずれの処置アームにおいてもプラセボと有意に異なっていなかった。

【0272】

３つの処置アーム（化合物Ａ、化合物Ｄおよび化合物Ａ／化合物Ｄ共投与）の、ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＢおよびＡｐｏＣ３に対する影響を測定した。４２日目のアポリポタンパク質Ｃ３（ＡｐｏＣ３）におけるベースラインからのパーセント変化 − ＦＡＳの統計的分析の結果を、表１４に示し、各アームをプラセボと、および化合物Ａ／化合物Ｄ共投与アームを各単剤療法アームと比較する。４２日目におけるプラセボからのＬＳ平均（および９０％ＣＩ）パーセント変化が記される。

【0273】

【表15】

【0274】

ＡｐｏＣ３は、化合物Ａ単剤療法アームにおいて統計学的に有意な方式で増大した［４２．７１％（２２．８６、６５．７７）］。驚くべきことに、ＡｐｏＣ３は、化合物Ｄ単剤療法アームでは増大せず［−８．１９％（−２０．７５、６．３６）］、ここではプラセボと同様のままであった。また驚くべきこと（Ｓｕｒｐｓｉｎｇｌｙ）に、化合物Ａ／化合物Ｄ共投与アームにおいては、ＡｐｏＣ３レベルもプラセボと同様であり［７．５２％（−６．９６、２４．２６）］、故に、ＡｐｏＣ３における化合物Ａ誘導上昇は、化合物Ｄとの共投与によって軽減された。

【0275】

他の目的のエンドポイント − 肝機能検査
他の目的のエンドポイントのまとめを、表１５で提供する。４２日目におけるプラセボからのＬＳ平均（および９０％ＣＩ）パーセント変化が記される。表１５は、４２日目の肝機能検査におけるベースラインからのパーセント変化 − ＦＡＳの統計的分析を提供する。図２７ａ〜２７ｄは、肝機能検査におけるベースラインからのパーセント変化 − ＦＡＳについての最小二乗平均値および９０％ＣＩのプロットを提供する。図２７ａは、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）についてのプロットを提供し、図２７ｂは、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）についてのプロットを提供し、図２７ｃは、アルカリホスファターゼについてのプロットを提供し、図２７ｄは、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）についてのプロットを提供する。

【0276】

【表16】

【0277】

すべての処置アームで、最初の４週間にわたって、プラセボと比較してＡＬＴおよびＡＳＴにおける一過性増大が観察された。４２日目までに、いずれもベースライン値未満になった。アルカリホスファターゼについては、プラセボアームにおいて適度の増大が認められ、化合物Ａ単剤療法アームにおいて明確で統計学的に有意な上昇があった。驚くべきことに、アルカリホスファターゼにおける明確で統計学的に有意な減少が、化合物Ｄ処置アームにおいて認められた。化合物Ａ／化合物Ｄ共投与アームでは、アルカリホスファターゼ値はベースライン値前後で推移し、研究全体を通して統計学的に有意な変化はなかった。ＧＧＴは、プラセボにおいても化合物Ｄ単剤療法アームにおいてもベースラインからの有意な変化を示さず、一方、驚くべきことに、化合物Ａ単剤療法アームおよび化合物Ａ／化合物Ｄ共投与アームにおいては増大が観察された。共投与アームにおいて観察されたＧＧＴの増大は、４２日目のみ化合物Ａ単剤療法アームよりも有意に低かった。

【0278】

安全性および忍容性
表１６は、安全性解析対象集団における対象について、有害事象（すべての因果関係）の数を示す。具体的には、表１６は、処置中に発生した有害事象（ＡＥ）（すべての因果関係） − 安全性解析対象集団を示す。

【0279】

【表17】

【0280】

ＡＥの発生率は、化合物Ａ／化合物Ｄ共投与アームと両方の単剤療法処置アームとの間で同様であった。「下顎膿瘍（Ａｂｃｅｓｓ）」の１つのＳＡＥは、化合物Ａ／化合物Ｄ共投与アームにおいて報告された（処置に関連するとはみなされなかった）。２人の対象がＡＥにより治験薬を中断した。化合物Ａ単剤療法アームにおける１人の対象が、ＴＧ上昇の重度のＡＥにより中断し（処置に関連するとみなされた）、該対象は無症候性のままであった。化合物Ｄ単剤療法アームにおける別の対象は、クレアチンキナーゼおよびＡＳＴ上昇の軽度のＡＥにより治験薬を中断した（処置に関連するとはみなされなかった）。上記したＴＧ、ＣＫおよびＡＳＴ上昇を除いて、主要な検査所見の異常は認められなかった。全体として、すべての処置は安全であり、忍容性良好であった。

【0281】

他の目的の安全性エンドポイント
表１７は、４２日目の血小板におけるベースラインからのパーセント変化 − ＦＡＳの統計的分析を提供する。

【0282】

【表18】

【0283】

プラセボと比較して、血小板における経時的な減少の数値的な傾向が、化合物Ａ単剤療法処置アームにおいて観察された。化合物Ｄ単剤療法アームでは、血小板における減少は認められなかった。驚くべきことに、化合物Ａ／化合物Ｄ共投与アームでも、プラセボと比べて、血小板における減少は観察されないことが発見された。

【0284】

本出願全体を通して、種々の刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、あらゆる目的のための参照によりその全体が本出願に組み込まれる。

【0285】

本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、本発明において種々の修正および変形が為され得ることが、当業者には明らかであろう。本発明の他の実施形態は、本明細書の考察および本明細書において開示される発明の実践から、当業者に明らかであろう。本明細書および例は、例示的なものにすぎないとみなされ、本発明の真の範囲および趣旨は、下記の特許請求の範囲によって指し示されることが意図されている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27-1】

【図27-2】

【図27-3】

【図27-4】

【手続補正書】

【提出日】2021年6月15日

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0018】

【図1】ＤＧＡＴ２ｉ化合物（化合物Ｄ）の実施例１の結晶形態１を示す特徴的なｘ線粉末回折パターンを示す図である（縦軸：強度（ＣＰＳ）；横軸：２シータ（度））。

【図2】ＤＧＡＴ２ｉ化合物（化合物Ｄ）の実施例１の結晶形態２を示す特徴的なｘ線粉末回折パターンを示す図である（縦軸：強度（ＣＰＳ）；横軸：２シータ（度））。

【図3】Ｃｕ放射線源が装備されたＢｒｕｋｅｒ ＡＸＳ Ｄ４エンデバー回折計で行われた実施例２（化合物Ａ）の形態１の例証的なＰＸＲＤパターンを示す図である。

【図4】ＦＴ−ＩＲベンチに取り付けられたＮｉｃｏｌｅｔ ＮＸＲ ＦＴ−ラマンアクセサリーを使用して収集した実施例２（化合物Ａ）の形態１の例証的なラマンスペクトルを示す図である。

【図5】ＢｒｕｋｅｒバイオスピンアバンセＩＩＩ ５００ＭＨｚ（^１Ｈ周波数）ＮＭＲ分光計内に位置付けられたＢｒｕｋｅｒバイオスピンＣＰＭＡＳプローブで行われた実施例２（化合物Ａ）の形態１の例証的な^１３Ｃ ｓｓＮＭＲパターンを示す図である。

【図6】Ｃｕ放射線源が装備されたＢｒｕｋｅｒ ＡＸＳ Ｄ４エンデバー回折計で行われた実施例２（化合物Ａ）の形態２の例証的なＰＸＲＤパターンを示す図である。

【図7】ＦＴ−ＩＲベンチに取り付けられたＮｉｃｏｌｅｔ ＮＸＲＦＴ−ラマンアクセサリーを使用して収集した実施例２（化合物Ａ）の形態２の例証的なラマンスペクトルを示す図である。

【図8】ＢｒｕｋｅｒバイオスピンアバンセＩＩＩ ５００ＭＨｚ（^１Ｈ周波数）ＮＭＲ分光計内に位置付けられたＢｒｕｋｅｒバイオスピンＣＰＭＡＳプローブを使用して行われた実施例２（化合物Ａ）の形態２の例証的な^１３Ｃ ｓｓＮＭＲパターンを示す図である。

【図9】実施例２（化合物Ａ）の形態２の例証的な単結晶構造を示す図である。

【図10】給餌状態で測定された、西洋食給餌スプラーグドーリーラットにおける血漿トリグリセリドレベルに対する、化合物Ａおよび化合物Ｄの単剤療法としてのおよび組み合わせた経口投与の効果をまとめた図である。

【図11】絶食状態で測定された、西洋食給餌スプラーグドーリーラットにおける血漿トリグリセリドレベルに対する、化合物Ａおよび化合物Ｄの単剤療法としてのおよび組み合わせた経口投与の効果をまとめた図である。

【図12】西洋食給餌ラットにおけるＳＲＥＢＰ−１核局在化に対する、単剤療法としてのおよび組み合わせた化合物Ａおよび化合物Ｄの投与の効果をまとめた図である。

【図13】西洋食給餌ラットにおける肝臓の脂質生成遺伝子発現、具体的にはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ１）に対する、単剤療法としてのおよび組み合わせた化合物Ａおよび化合物Ｄの投与の効果をまとめた図である。

【図14】西洋食給餌ラットにおける肝臓の脂質生成遺伝子発現、具体的には脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳＮ）に対する、単剤療法としてのおよび組み合わせた化合物Ａおよび化合物Ｄの投与の効果をまとめた図である。

【図15】西洋食給餌ラットにおける肝臓の脂質生成遺伝子発現、具体的にはステロール−ＣｏＡデサチュラーゼ（ＳＣＤ１）に対する、単剤療法としてのおよび組み合わせた化合物Ａおよび化合物Ｄの投与の効果をまとめた図である。

【図16】西洋食給餌ラットにおける肝臓の脂質生成遺伝子発現、具体的にはステロール応答エレメント結合タンパク質１ｃ（ＳＲＥＢＰ−１ｃ）に対する、単剤療法としてのおよび組み合わせた化合物Ａおよび化合物Ｄの投与の効果をまとめた図である。

【図17】西洋食給餌ラットにおける肝臓の脂質生成遺伝子発現、具体的にはプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）に対する、単剤療法としてのおよび組み合わせた化合物Ａおよび化合物Ｄの投与の効果をまとめた図である。

【図18】西洋食給餌スプラーグ・ドーリーラットにおける肝臓トリグリセリドレベルに対する化合物Ａおよび化合物Ｄの単剤療法としてのおよび組み合わせた経口投与の効果をまとめた図である。

【図19】コリン欠乏および高脂肪食（ＣＤＡＨＦＤ）給餌雄ウィスターハンラットにおける肝臓炎症および線維症のマーカーである肝臓の弾性に対する、化合物Ａおよび化合物Ｄの単剤療法としてのおよび組み合わせた経口投与の効果をまとめた図である。

【図20】ＣＤＡＨＦＤ給餌雄ウィスターハンラットにおける筋線維芽細胞活性化および線維形成のマーカーである肝臓のアルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）免疫組織化学に対する、化合物Ａおよび化合物Ｄの単剤療法としてのおよび組み合わせた経口投与の効果をまとめた図である。

【図21】ＣＤＡＨＦＤ給餌雄ウィスターハンラットにおける肝臓のピクロシリウス（Ｐｉｃｏｓｉｒｉｕｓ）レッド染色に対する、化合物Ａおよび化合物Ｄの単剤療法としてのおよび組み合わせた経口投与の効果をまとめた図である。

【図22】ＣＤＡＨＦＤ給餌雄ウィスターハンラットにおける肝臓のアルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）遺伝子発現に対する、化合物Ａおよび化合物Ｄの単剤療法としてのおよび組み合わせた経口投与の効果をまとめた図である。

【図23】ＣＤＡＨＦＤ給餌雄ウィスターハンラットにおける肝臓のコラーゲン１Ａ１遺伝子発現に対する、化合物Ａおよび化合物Ｄの単剤療法としてのおよび組み合わせた経口投与の効果をまとめた図である。

【図24】ＣＤＡＨＦＤ給餌雄ウィスターハンラットにおけるイオン化カルシウム結合アダプター分子１染色に対する、化合物Ａおよび化合物Ｄの単剤療法としてのおよび組み合わせた経口投与の効果をまとめた図である。

【図25a】本明細書において記述される第２Ａ相研究のための処置アーム（ａｒｍ）によるＷＬＦデータの箱ひげ図を示す図である。

【図25b】３０％以上の肝臓脂肪の低減がある対象の％を示す図である。

【図25c】５０％以上の肝臓脂肪の低減がある対象の％を示す図である。

【図26】本明細書において記述される第２Ａ相研究のための血清トリグリセリドにおけるベースラインからのパーセント変化を表す最小二乗平均値および９０％ＣＩのプロットを示す図である。

【図27-1】本明細書において記述される第２Ａ相研究のためのアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）におけるベースラインからのパーセント変化を表す最小二乗平均値および９０％ＣＩのプロットを示す図である。

【図27-2】本明細書において記述される第２Ａ相研究のためのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）におけるベースラインからのパーセント変化を表す最小二乗平均値および９０％ＣＩのプロットを示す図である。

【図27-3】本明細書において記述される第２Ａ相研究のためのアルカリフォスファターゼにおけるベースラインからのパーセント変化を表す最小二乗平均値および９０％ＣＩのプロットを示す図である。

【図27-4】本明細書において記述される第２Ａ相研究のためのガンマグルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）におけるベースラインからのパーセント変化を表す最小二乗平均値および９０％ＣＩのプロットを示す図である。

【外国語明細書】

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