特開 2021-136979 ウイルス分析用プライマーセット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2021-136979(P2021-136979A)

(43)【公開日】2021年9月16日

(54)【発明の名称】ウイルス分析用プライマーセット

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6888 20180101AFI20210820BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20210820BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/6888 ZZNA

   C12N15/09 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】3

【出願形態】書面

【全頁数】11

(21)【出願番号】特願2020-53396(P2020-53396)

(22)【出願日】2020年3月6日

(71)【出願人】

【識別番号】520101683

【氏名又は名称】鈴木 彦有

(71)【出願人】

【識別番号】516279260

【氏名又は名称】株式会社日本バイオデータ

(72)【発明者】

【氏名】鈴木 彦有

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA13

4B063QA18

4B063QA19

4B063QQ10

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR79

4B063QS16

4B063QS25

4B063QS32

4B063QS34

4B063QX01

4B063QX04

(57)【要約】      （修正有）

【課題】体の状態を悪化させるウイルスが存在しているか否か分析するためのプライマーセットを提供する。
【解決手段】特定の配列のプライマーから選択される２種のプライマーセットを含むウイルス分析用のプライマーセット。例えば、２種のプライマーセットのうち一方は、ある特定の配列塩基配列を有するプライマーであり、残りは、別の特定の配列で示される塩基配列を有するプライマーであることが好ましい。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号９〜２３のプライマーから選択される２種のプライマーセットを含むウイルス分析用のプライマーセット

【請求項2】

請求項１に記載のウイルス分析用のプライマーセットと配列類似性が７０％以上であるプライマーセット。

【請求項2】

請求項１に記載のウイルス分析用のプライマーセットであって，
前記２種のプライマーセットは，
配列番号９及び配列番号１０で示される塩基配列を有するプライマーセット，
配列番号１１及び配列番号１２で示される塩基配列を有するプライマーセット，
配列番号１３及び配列番号１４で示される塩基配列を有するプライマーセット，
配列番号１５及び配列番号１６で示される塩基配列を有するプライマーセット，
配列番号１５及び配列番号１７で示される塩基配列を有するプライマーセット，
配列番号１８及び配列番号１９で示される塩基配列を有するプライマーセット，
配列番号２０及び配列番号２１で示される塩基配列を有するプライマーセット，及び
配列番号２２及び配列番号２３で示される塩基配列を有するプライマーセットから選択される
いずれかのプライマーセットであるウイルス分析用のプライマーセット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は，ウイルス分析用プライマーセットに関する。より詳しく説明すると，本発明は，特定のウイルスを効果的に検出・分類するためのウイルス分析用プライマーセットに関する。

【背景技術】

【0002】

特許５５９５６１２号公報には，肌分析用用プライマーセットが開示されている。このプライマーセットは，ＰＣＲを用いて，動物検体に由来する微生物種のＤＮＡを増幅し，これを測定することで，特定の微生物種が混合しているか否かを検出するためのものである。このようにＰＣＲに用いられるプライマーを見出すことができれば特定の生物又はウイルスが存在するか否かを判別できる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特許５５９５６１２号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

動物の体には，体の状態を悪化させるウイルスが存在する場合がある。このため，特定のウイルスが体に存在していることがわかれば，動物の状態を分析できる。このため，体の状態を悪化させるウイルスが体に存在しているか否かを解析するためのプライマーセットが望まれる。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明は，所定のウイルスが体に悪影響を及ぼすことを突き止め，そしてそのウイルスを特異的に検出するための特定のプライマーセットを見出したことに基づくものである。

【0006】

本発明は，ウイルス分析用のプライマーセットに関する。このプライマーセットは，配列番号９〜２０のプライマーから選択される２種のプライマーセットを含む。２種のプライマーセットのうち一方は，配列番号９，１１，１３，１５，１８，２０又は２２で示される塩基配列を有するプライマーであり，残りは，配列番号１０，１２，１４，１６，１７，１９，２１又は２３で示される塩基配列を有するプライマーであることが好ましい。

【0007】

本発明の好ましい態様は，
前記２種のプライマーセットが，
配列番号９及び配列番号１０で示される塩基配列を有するプライマーセット，
配列番号１１及び配列番号１２で示される塩基配列を有するプライマーセット，
配列番号１３及び配列番号１４で示される塩基配列を有するプライマーセット，
配列番号１５及び配列番号１６で示される塩基配列を有するプライマーセット，
配列番号１５及び配列番号１７で示される塩基配列を有するプライマーセット，
配列番号１８及び配列番号１９で示される塩基配列を有するプライマーセット，
配列番号２０及び配列番号２１で示される塩基配列を有するプライマーセット，及び
配列番号２２及び配列番号２３で示される塩基配列を有するプライマーセットから選択されるいずれかのプライマーセットのものである。

【発明の効果】

【0008】

本発明のプライマーセットは，ＰＣＲにより，体を悪化させるウイルス由来のＤＮＡを特異的に増幅させることができる。このため，本発明は，体の状態を悪化させるウイルスが体に生息しているか否か分析するためのプライマーセットを提供できる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】 図１は，体の状態を悪化させるウイルスが存在していると考えられる体由来のサンプルについて配列番号９及び配列番号１０からなるプライマーセットを用いて分析を行った結果を示す図面に替わるゲル電気泳動写真である。

【発明を実施するための形態】

【0010】

以下，図面を用いて本発明を実施するための形態について説明する。本発明は，以下に説明する形態に限定されるものではなく，以下の形態から当業者が自明な範囲で適宜修正したものも含む。

【0011】

本発明は，ウイルス分析用のプライマーセットに関する。このプライマーセットは，ＰＣＲにより以下の表１に示される塩基配列を有するＤＮＡ（配列番号１〜８で示される塩基配列を有するＤＮＡ）を増幅できる。

【0012】

【表1】

【0013】

本発明のプライマーセットは，配列番号９〜２３のプライマーから選択される２種のプライマーセットを含む。２種のプライマーセットのうち一方は，配列番号９，１１，１３，１５，１８，２０又は２２で示される塩基配列を有するプライマーであり，残りは，配列番号１０，１２，１４，１６，１７，１９，２１又は２３で示される塩基配列を有するプライマーであることが好ましい。

【0014】

本発明の好ましい態様は，
２種のプライマーセットが，配列番号９及び配列番号１０で示される塩基配列を有するプライマーセット（配列番号９で示される塩基配列を有するプライマーと，配列番号１０で示される塩基配列を有するプライマーのセット，以下同様），配列番号１１及び配列番号１２で示される塩基配列を有するプライマーセット，配列番号１３及び配列番号１４で示される塩基配列を有するプライマーセット，配列番号１５及び配列番号１６で示される塩基配列を有するプライマーセット，配列番号１５及び配列番号１７で示される塩基配列を有するプライマーセット，配列番号１８及び配列番号１９で示される塩基配列を有するプライマーセット，配列番号２０及び配列番号２１で示される塩基配列を有するプライマーセット，及び配列番号２２及び配列番号２３で示される塩基配列を有するプライマーセットから選択されるいずれかのプライマーセットのものである。これらプライマーの塩基配列は，以下の表２に示されるとおりである。

【0015】

【表2】

【0016】

プライマーを用いて特定のＤＮＡ（ＤＮＡ断片）を増幅し，対象となる生物が検体に含まれるか否かまた対象となる生物の存在量を評価することは，公知である。本発明においても，公知の方法を適宜採用できる。

【0017】

上記のプライマーは，ＤＮＡ自動合成器を用いて支持体上でヌクレオチドを伸長し，適宜脱保護や支持体からの切断を行い，カラムクロマトグラフィー等公知の方法を用いて分離生成することで得ることができる。

【0018】

次に，上記したいずれかのウイルス分析用のプライマーセットを用いたウイルス分析方法について説明する。

【0019】

まず，検査対象に存在するウイルスを採取する。本発明の対象は，哺乳動物（例えばヒト）の体である。体の例は，喉の粘膜や痰である。そして，例えば，湿らせた綿棒で対象部位である痰をこする。

【0020】

次に綿棒に含まれるウイルスのゲノムに含まれるＤＮＡ断片を公知のキットを用いて取得する。この方法は，公知のキットを用いて，公知のキットの説明書に基づいて行えばよい。

【0021】

ＰＣＲは，公知のＰＣＲ装置を用いてＰＣＲ装置の解説書に基づいて行えばよい。ＰＣＲを行う際に，プライマーセットは，例えば，最終濃度が０．１μＭ以上１μＭとなるように設定すればよく，０．２μＭ以上２μＭ以下でもよい。ＰＣＲにより，対象物に含まれるＤＮＡ断片が特異的に増幅する。ＰＣＲ反応の条件の例は，以下のとおりである。

【0022】

二本鎖ＤＮＡの一本鎖への熱変性（ステップ１）二本鎖ＤＮＡの一本鎖への熱変性は，例えば，摂氏９０度以上摂氏１００度以下（又は摂氏９４度以上摂氏９８度以下）で３秒以上１０秒以下（又は４秒以上７秒以下）により行う。

【0023】

アニーリング（ステップ２）アニーリングは，例えば，摂氏５０度以上摂氏７０度以下（又は摂氏５５度以上摂氏６５度以下）で３秒以上１０秒以下（又は４秒以上７秒以下）により行う。

【0024】

ＤＮＡ伸長反応（ステップ３）ＤＮＡ伸長反応は，通常，通常アニーリング工程より高温にて行う。ＤＮＡ伸長反応は，例えば，摂氏６０度以上摂氏８０度以下（又は摂氏６３度以上摂氏７３度以下）で５秒以上２０秒以下（又は６秒以上１２秒以下）により行う。

【0025】

ＰＣＲは，上記のステップ１〜ステップ３を複数サイクル行う。サイクル数の例は，１０回以上１００回以下である。サイクル数は，対象となるウイルス由来の増幅物が検出できる程度に増幅するまで行えばよい。

【0026】

次に，ＤＮＡ断片の増幅産物を検出する。ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片の検出方法は公知である。本発明においても公知の検出方法を適宜採用できる。ＤＮＡ断片の増幅産物を検出する方法の例は，増幅産物をアがロースゲル電気泳動により分離し，核酸染色を行って可視化するものである。後述の実施例により示されたとおり，プライマーセットにより増幅される対象の菌に含まれるＤＮＡ断片の長さが実施例により見出された。よって，検出対象に，所定の長さのＤＮＡ断片が含まれるか（所定の長さ領域の部位にバンドが見えるか）を判断することで，対象となるウイルスが検体に存在するか否かを判断することができる。

【実施例】

【0027】

体に悪影響を与えるウイルスの調査
動物の体の状態が悪化する原因となる菌叢についての知見を得るため，被験者の協力のもと体に悪影響を及ぼすウイルス及びそのウイルスのＤＮＡを調査した。具体的には，被験者は，その痰を綿棒でこすり，体に存在するウイルスを増幅させた。さらに，各被験者について，体の状況と体の変化とを記録した。各サンプルについて，大規模配列解析を行った。配列解析には，イルミナ社のＨｉＳｅｑ２０００を用いた。

【0028】

その結果，体の状態が悪かったサンプルは，他のサンプルに比べて配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８で示される塩基配列を有するＤＮＡが多く含まれることがわかった。このため，配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８で示される塩基配列を有するＤＮＡを有するウイルスの有無や量を測定することで，体の状態を分析できることがわかった。

【実施例1】

【0029】

配列番号９，１０の塩基配列を基に，遊離のヌクレオチドをＦｍｏｃ固相法によって結合し，次いでＯＰＣカラムにより精製することによって，２種類のプライマーを作製した。合成されたプライマーは，使用直前まで−８０℃にて保管し，融解後直ちに使用するようにし，凍結融解を３回以上繰り返さないようにした。

【0030】

上記２種類のプライマーを，使用前に蒸留水にて溶解し，被験ＤＮＡ液を含む反応液に対し，それぞれの最終濃度が０．２５μＭとなるようにした。

【0031】

被験者の痰から， ＤＮＡを精製するキットであるＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてサンプルのＤＮＡを精製した。上記精製したサンプルのＤＮＡの濃度を測定し，滅菌水を加えて希釈し，被験ＤＮＡ液（１ｎｇ／μｌ）に希釈した。それぞれの被験ＤＮＡ液１μｌに滅菌水及びＰＣＲ酵素バッファー混合液およびプライマーを，ＱＩＡＧＥＮ Ｆａｓｔ Ｃｙｃｌｉｎｇ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）のプロトコルに従って加え，総液量を２０μｌに調整してＰＣＲ反応を行った。

【0032】

ＰＣＲ反応は，反応液が入った状態のチューブを９５℃で５分保持した後，熱変性反応を９６℃で５秒，アニーリング反応を６０℃で５秒，ＤＮＡ伸長反応を６８℃で９秒行い，以上の反応を４５サイクル繰り返し，最後に７２℃で１分ＤＮＡ伸長反応を行った。

【0033】

ＰＣＲ反応終了後，得られたＰＣＲ産物を，４．０％アがロースゲル（インビトロジェン社製）を用いＭｕｐｉｄ―２（アドバンス社製）により，１００Ｖ４５分間電気泳動し，エチジウムブロマイド（１．０μｇ／ｍｌ）で５分間染色後，ＵＶランプ下でバンドを撮影した。その結果を図１に示す。図１は，体を悪化させるウイルスが生息していると考えられるサンプルについて配列番号２及び配列番号３からなるプライマーセットを用いて分析を行った結果を示すゲル電気泳動写真である。図１に示されるように，体の状態が良くないサンプルのみで，１１０ｂｐのバンドが確認できた。

【0034】

このことから，配列番号９及び配列番号１０で示される塩基配列を有するプライマーセットを用いたＰＣＲ法に基づいて体の状態を指弾する場合，１１０ｂｐ前後（例えば１０５ｂｐ以上１１５ｂｐ以下，又は１０８ｂｐ以上１１２ｂｐ以下）のバンドの有無を用いればよいことがわかる。すなわち，１１０ｂｐ前後のバンドが観測される対象は，体に悪影響を及ぼすウイルスが存在しているといえる。

【実施例2】

【0035】

配列番号９及び配列番号１０で示される塩基配列を有するプライマーセットに代えて，配列番号１１及び配列番号１２で示される塩基配列を有するプライマーセットを用いた以外は実施例１と同様にしてＰＣＲに基づく体の状況解析を行った。その結果，体の状態が悪いサンプルのみで，１０３ｂｐのバンドが確認できた。

【0036】

このことから，配列番号４及び配列番号５で示される塩基配列を有するプライマーセットを用いたＰＣＲ法に基づいて体の状態を分析する場合，１０３ｂｐ前後（例えば９８ｂｐ以上１０８ｂｐ以下，又は１０１ｂｐ以上１０５ｂｐ以下）のバンドの有無を用いればよいことがわかる。

【実施例3】

【0037】

配列番号９及び配列番号１０で示される塩基配列を有するプライマーセットに代えて，配列番号１３及び配列番号１４で示される塩基配列を有するプライマーセットを用いた以外は実施例１と同様にしてＰＣＲに基づく体の状況解析を行った。その結果，体の状態が悪いサンプルのみで，１０６ｂｐのバンドが確認できた。

【0038】

このことから，配列番号１３及び配列番号１４で示される塩基配列を有するプライマーセットを用いたＰＣＲ法に基づいて体の状態を分析する場合，１０６ｂｐ前後（例えば１０１ｂｐ以上１１１ｂｐ以下，又は１０４ｂｐ以上１０８ｂｐ以下）のバンドの有無を用いればよいことがわかる。

【実施例4】

【0039】

配列番号９及び配列番号１０で示される塩基配列を有するプライマーセットに代えて，配列番号１５及び配列番号１６で示される塩基配列を有するプライマーセットを用いた以外は実施例１と同様にしてＰＣＲに基づく体の状況解析を行った。その結果，体の状態が悪いサンプルのみで，４２５ｂｐのバンドが確認できた。

【0040】

このことから，配列番号１５及び配列番号１６で示される塩基配列を有するプライマーセットを用いたＰＣＲ法に基づいて体の状態を分析する場合，４２５ｂｐ前後（例えば４２０ｂｐ以上４３０ｂｐ以下，又は４２３ｂｐ以上４２７ｂｐ以下）のバンドの有無を用いればよいことがわかる。

【実施例5】

【0041】

配列番号９及び配列番号１０で示される塩基配列を有するプライマーセットに代えて，配列番号１８及び配列番号１９で示される塩基配列を有するプライマーセットを用いた以外は実施例１と同様にしてＰＣＲに基づく体の状況解析を行った。その結果，体の状態が悪いサンプルのみで，３１８ｂｐのバンドが確認できた。

【0042】

このことから，配列番号１８及び配列番号１９で示される塩基配列を有するプライマーセットを用いたＰＣＲ法に基づいて体の状態を分析する場合，３１８ｂｐ前後（例えば３１３ｂｐ以上３２３ｂｐ以下，又は３１６ｂｐ以上３２０ｂｐ以下）のバンドの有無を用いればよいことがわかる。

【産業上の利用可能性】

【0043】

本発明は，医療のための機器を製造販売する製造業の分野で利用されうる。

【配列表フリーテキスト】

【0045】

配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
配列番号９：プライマー
配列番号１０：プライマー
配列番号１１：プライマー
配列番号１２：プライマー
配列番号１３：プライマー
配列番号１４：プライマー
配列番号１５：プライマー
配列番号１６：プライマー
配列番号１７：プライマー
配列番号１８：プライマー
配列番号１９：プライマー
配列番号２０：プライマー
配列番号２１：プライマー
配列番号２２：プライマー
配列番号２３：プライマー

【図1】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]