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特開2021-16385ＰＡＨｓ−重金属複合汚染分解／吸着細菌及び環境汚染修復におけるその応用

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2021-16385(P2021-16385A)

(43)【公開日】2021年2月15日

(54)【発明の名称】ＰＡＨｓ−重金属複合汚染分解／吸着細菌及び環境汚染修復におけるその応用

(51)【国際特許分類】

C12N 1/20 20060101AFI20210118BHJP

【ＦＩ】

C12N1/20 AZNA

C12N1/20 F

【審査請求】有

【請求項の数】3

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】9

(21)【出願番号】特願2019-223490(P2019-223490)

(22)【出願日】2019年12月11日

(11)【特許番号】特許第6782036号(P6782036)

(45)【特許公報発行日】2020年11月11日

(31)【優先権主張番号】201910658863.0

(32)【優先日】2019年7月22日

(33)【優先権主張国】CN

(71)【出願人】

【識別番号】519292730

【氏名又は名称】肇▲慶▼学院

(74)【代理人】

【識別番号】110000291

【氏名又は名称】特許業務法人コスモス国際特許商標事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100131406

【弁理士】

【氏名又は名称】福山正寿

(72)【発明者】

【氏名】▲劉▼沙沙

(72)【発明者】

【氏名】付建平

(72)【発明者】

【氏名】袁国▲棟▼

(72)【発明者】

【氏名】▲呉▼▲賢▼格

(72)【発明者】

【氏名】▲呉▼国▲トン▼

(72)【発明者】

【氏名】李▲暁▼峰

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065CA54

(57)【要約】（修正有）

【課題】PAHs-重金属複合汚染分解／吸着細菌及び環境汚染修復におけるその応用の提供。
【解決手段】当該菌株はスフィンゴビウム属細菌（Sphingobium sp.）PM1Bであり、2019年3月28日に中国典型培養物寄託センターに寄託され、寄託番号がCCTCC NO: M 2019212である。当該菌株は多環芳香族炭化水素に対して良い分解効果があり、一方、重金属に対して吸着作用がある。電子廃棄物解体エリア、下水灌漑地域、産業及び鉱業地域、汚染地域等の水体と土壌環境を含むPAHs-重金属複合汚染環境のカバナンスと修復に応用できる。幅広い応用見通しがある。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

スフィンゴビウム属細菌（Sphingobium sp.）PM1Bであって、
寄託番号がCCTCC NO: M 2019212であることを特徴とする。

【請求項2】

前記スフィンゴビウム属細菌（Sphingobium sp.）PM1Bの16S rDNAのヌクレオチド配列はSeq ID No:1に示す
ことを特徴とする請求項1に記載のスフィンゴビウム属細菌（Sphingobium sp.）PM1B。

【請求項3】

請求項1又は2に記載のスフィンゴビウム属細菌（Sphingobium sp.）PM1BがPAHsの分解及び/又は重金属の吸着転化における応用。

【請求項4】

前記PAHsはピレン及び/又はフェナントレンである
ことを特徴とする請求項３に記載のスフィンゴビウム属細菌（Sphingobium sp.）PM1BがPAHsの分解及び/又は重金属の吸着転化における応用。

【請求項5】

前記重金属は銅及び/又はカドミウムである
ことを特徴とする請求項３に記載のスフィンゴビウム属細菌（Sphingobium sp.）PM1BがPAHsの分解及び/又は重金属の吸着転化における応用。

【請求項6】

分解細菌剤であって、
請求項1又は2に記載のスフィンゴビウム属細菌（Sphingobium sp.）PM1B菌株を含む
ことを特徴とする。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生物による環境汚染物質の処理の分野に関し、更に詳細には、PAHs-重金属複合汚染分解/吸着細菌及び環境汚染修復におけるその応用に関する。

【背景技術】

【0002】

多環芳香族炭化水素(PAHs)は残留性有機汚染物質であり、主に石油流出事故、石炭、石油、木材、有機高分子化合物または化学燃料の不完全燃焼から発生するものである。経済の発展及び工業化のプロセスの加速に伴い、より多くのPAHsが環境中に入り、深刻な汚染を引き起こす。なお、マイニング、排気ガス、固形廃棄物の蓄積、下水灌漑、農薬の不当な使用などの原因で、大量の重金属が環境中に入り、蓄積し続ける。環境中の汚染物質は単一の形で存在しなく、調査と研究により、中国の多くの地域の大気、水及び土壌はさまざまな程度のPAHs重金属汚染の影響を受けていることが示されている。例えば、練江、大燕川及び珠江出海口の水、堆積物、水生生物体内及び電子廃棄物解体エリアの土壌と大気で同時に検出されている。

【0003】

重金属は、分解されにくい毒性汚染物質であり、生体内で蓄積し、毒性が高い特性を持っている。PAHsには発がん性、催奇性及び変異原性などの影響がある。重金属とPAHsは、生態環境を損なうだけでなく、直接接触または食物連鎖を通じて人体に入り、人間の健康に深刻な脅威をもたらす。当該二種類の汚染物は環境で長続きに存在し、結果として生じた複合汚染は、環境と人間にとってより有害である。従って、PAHs‐重金属複合汚染環境のカバナンスと修復を実施することが急務である。環境での重金属とPAHsは長期的に共存し、両者の間に物理化学的特性の差異が大きく、複雑な相互作用が発生するために、複合汚染の修復が困難になる。

【0004】

現在、PAHs‐重金属複合汚染の修復技術として主に物理化学的手法及び生物的手法がある。物理化学的な修復技術は、吸着法、酸化還元、ゲスト土壌法、土壌洗浄法及び改良法などを含む。操作が簡単で、修復速度が速いが、コストが高い、PAHsと重金属との両方を含む廃水または土壌に対する処理効果が明らかではない、生態環境を損傷し、二次汚染などの問題を招致しやすい。微生物による修復は環境から汚染物質を除去する有効な方法の1つであり、経済的で、便利で、新しい汚染を引き起こしにくい利点を有する。微生物は、自分自身の代謝活動を通じて、毒性が高く構造が複雑な汚染物質を低毒性または無毒の化合物に分解することができ、環境からPAHsを除去する主な方法である。近年、国内外の学者は、PAHsを分解する微生物に関して鋭意研究を行い、細菌、真菌、放線菌及び藻類等を含むPAHsを分解できる、70個を超える属、200個を超える種類の微生物を分離された。一方、微生物の細胞表面に多数の官能基（例えば、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基及びアミド基）とアクティブサイトとが存在するので、重金属に対して良好な吸着作用がある。環境メディア（environmental media）における重金属を除去するために有効な吸着材料として微生物を使用するのは広く注目された。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】中国特許出願公開第105013815号明細書

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

前記の課題に対して、本発明は、PAHs-重金属複合汚染分解/吸着細菌及びその応用を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明の上記目的は開示された以下の技術案によって達成される。

【0008】

本発明に係るスフィンゴビウム属細菌（Sphingobium sp.）PM1Bは、2019年3月28日に中国典型培養物寄託センターに寄託され、寄託番号がCCTCC NO: M 2019212であり、場所が中国．武漢．武漢大学であり、住所が湖北省武漢市武昌珞珈山である。

【0009】

前記スフィンゴビウム属細菌（Sphingobium sp.）PM1Bは、広東省清遠龍塘鎮電子廃棄物解体エリアの焼却現場で家畜化し、スクリーニングし、分離してから獲得されたものである。前記スフィンゴビウム属細菌PM1Bの平板での形態として、コロニーは明るい黄色で、球形、縁が規則、表面が隆起、表面が滑らかで湿り、不透明であり、電子顕微鏡で観察された当該細菌の形状は棒状である。

【0010】

16SrDNA配列解析によって菌株の分類鑑定を行い、生工生物工程（上海）有限会社に委託して完成し、長さが1428bpの配列を得る。菌株に対して配列の相同性の比較を行うことによって、PM1Bの16SrDNA配列とスフィンゴビウム属細菌（Sphingobium sp.）との相同性が99％に達したので、当該菌種をスフィンゴビウム属細菌に帰属する。

【0011】

前記スフィンゴビウム属細菌（Sphingobium sp.）PM1Bの16SrDNAのヌクレオチド配列はSeq ID No:1に示す。

【0012】

本発明の二番目の目的として、前記スフィンゴビウム属細菌（Sphingobium sp.）はPAHsの分解及び/又は重金属の吸着転化における応用を提供する。

【0013】

前記PAHsがピレン及び/又はフェナントレンであることは好ましい。

【0014】

前記重金属が銅及び/又はカドミウムであることは好ましい。

【0015】

本発明の三番目の目的として、前記スフィンゴビウム属細菌（Sphingobium sp.）PM1Bの菌株を含む、PAHsの分解及び/又は重金属の吸着転化できる分解菌を提供する。

【発明の効果】

【0016】

ほとんどの菌株はPAHsを分解するのみ、重金属に耐性と吸着機能がなく、または重金属を吸着するのみ、PAHsを分解できないため、目下の研究は、微生物による単一の重金属またはPAHsの除去に注目している。本発明はスクリーニングによってスフィンゴビウム属細菌を獲得し、色んなPAHsを分解でき、且つ重金属も吸着でき、PAHs-重金属複合汚染の水土環境のカバナンスと修復に応用できる。応用対象として、電子廃棄物解体エリア、下水灌漑地域、産業及び鉱業地域、汚染地域等、及びその周辺環境を挙げられる、生態環境及び人間の健康に対する重金属及びPAHsの損傷を有効に減らすことができる。

【0017】

本発明に提供されたスフィンゴビウム属細菌を利用してPAHsと重金属汚染を処理することは、物理吸着、化学改良及び酸化還元法に比べて、効果が良く、コストが低く、環境保護等の利点を持っている。

【図面の簡単な説明】

【0018】

図面に基づいて、本発明を更に説明する。ただし、図面の実施例は本発明を限定するものではなく、当業者が創造的な労力を付与することなく、これらの図面によって他の図面を得ることも可能である。

【図1】スフィンゴビウム属細菌PM1Bの平板での形態。

【図2】スフィンゴビウム属細菌PM1Bの電子顕微鏡での形態。

【図3】ピレン、フェナントレン、銅及びカドミウムの複合システムの中で、細菌PM1Bがフェナントレン及びピレンに対する分解効果と時間との関係を示す図である。

【図4】ピレン、フェナントレン、銅及びカドミウムの複合システムの中で、細菌PM1Bが銅及びカドミウムに対する吸着効果と時間との関係を示す図である。

【図5】菌液が土壌サンプルのおけるピレン、フェナントレン、銅及びカドミウムを除去する効果である。

【発明を実施するための形態】

【0019】

具体的な実施例に合わせて本発明をさらに説明する。

【0020】

実施例1：
スフィンゴビウム属細菌PM1Bの菌株の分離鑑定。

【0021】

１、土壌サンプル
試験用土壌サンプルは広東省清遠龍塘鎮電子廃棄物解体エリアの焼却現場から採取され、表土を除去された後、5-20cmの深さの範囲の土壌を取って密封袋に入れ、実験室に持ち帰り、-20℃の冷蔵庫に保管される。

【0022】

２、培地と溶液の調製
無機塩培地（MSM）の組成：5mlリン酸緩衝食塩液(KH₂PO₄ 8.5 g/L、K₂HPO₄・3H₂O
21.75 g/L、Na₂HPO₄・12H₂O 33.4g/L、NH₄Cl 5.0 g/L)； 3mL MgSO₄の溶液(22.5 g/L)； 1mL FeCl₃水溶液(0.25 g/L)；1mL CaCl₂溶液(36.4 g/L)；1mL微量元素溶液(MnSO₄・H₂O 39.9 mg/L、ZnSO₄・H₂O 42.8 mg/L、(NH₄)₆Mo₇O₂₄・4H₂O 34.7 mg/L)，1Lまで定容し、pH値が7.2~7.4である。
PAHsストック溶液：アセトンを溶媒として、ピレン（1 g/L）とフェナントレン（1 g/L）との母液をそれぞれ調整し、バックアップのために冷蔵庫で4℃に保管する。
重金属ストック溶液：一定量のCd(NO₃)₂、Cu(NO₃)₂を量ってそれぞれに脱イオン水に溶解し、濃度が1g/であるCd²⁺、Cu²⁺ストック溶液に調製する。

【0023】

３、PAHs-重金属を分解吸着する菌の家畜化、スクリーニング及び分離
10g土壌を量って250 mLの三角フラスコに入れ、100 mL滅菌された酸性ピロリン酸ナトリウム（Na₂P₂O₇・7H₂O，2. 8 g/L）を入れ、超音波で均一に振動する（3 min）、シェーカーで一晩振ってスタンバイバクテリア溶液を得て、ストックする。

【0024】

先ず、10mL前記スタンバイバクテリア溶液をピレンとフェナントレンを有するMSM培地に接種し、150rpm、30℃で7dに培養した後、その中から10mL上澄み液を取って、フェナントレン（50mg/L）、ピレン（10mg/L）、Cd²⁺（5mg/L）、Cu²⁺（20 mg/L）を含むMSM培地に移動する。培養システムの総容量は100mLであり、上記ステップを繰り返し、家畜化を5回行う。

【0025】

最後のサイクルの家畜化された培養菌液5mLを取って、10倍希釈方法で、細菌溶液を10^-1~10^-7勾配の懸濁液に希釈した後、0.1mLを取って肉汁固体培地に塗りて、平板を反転して30℃の生化学インキュベーターに置き、3-4日を経て、コロニーがよく成長した後、コロニーの形態を観察する。

【0026】

平板での異なる形態特徴なコロニーを選択し、改めて100 mLの50mg/Lフェナントレン、10mg/Lピレン及び5mg/L Cd²⁺、20 mg/L Cu²⁺を含むMSM培地に移動し、振動培養でPAHsを分解する能力と重金属を吸着する能力があるかどうかを検証する。培地の色が濁りであるフラスコを選択し、上記のステップを繰り返し、精製を3回に行って、菌株の純度及び分解/吸着性能の安定性を確保する。最後、ピレン/フェナントレン‐銅/びカドミウム複合汚染の分解吸着能力が最高、成長性能が穏やかな菌株を標的菌株として、PM1Bという番号を付く。

【0027】

実施例2
スフィンゴビウム属細菌（Sphingobium sp.）PM1Bの菌株の分解吸着性能。

【0028】

MSM溶液で菌株を菌懸濁液に作成し、OD₆₀₀を0.6に調整し、10%の比例で50 mg/Lフェナントレン、10 mg/Lピレン、5 mg/L Cd²⁺と20 mg/L Cu²+を含む18mL MSMの培養システムに加入し、いずれの処理に三つの重複を設置し、30℃，150 rpmの条件で振動培養を行い、定期的にPM1Bの成長量及び溶液に残るピレン、フェナントレン、銅、びカドミウムの濃度を測定する。実験中の汚染物質の非生物学的な損失を分析するために、菌がないブランクコントロールを設定する。

【0029】

フェナントレンとピレンの濃度は高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で測定する。フラスコに適量なクロマトグラフィーグレードのメタノールクロマトグラフィーを入れ、フェナントレンとピレンを完全に溶解させるために一定期間の超音波処理を行い、50 mLのメスフラスコに移動してメタノールで定容する。0.22 μmの有機相フィルターを使ってHPLCに入ってフェナントレンの濃度を測定する。フェナントレンとピレンとの測定波長はそれぞれ234と250 nmであり、移動相はメタノール/超純水(v/v，90/10)であり、各反応系溶液に対して遠心分離を行い、定量な上澄み液を取って、0.22 μmのフィルターで濾過し、原子吸光分析装置でカドミウム及び銅の濃度を測定する。

【0030】

実験の結果は図3に示すように、ピレン、フェナントレン、銅及びカドミウムの複合システムの中で、時間の経つにつれて、菌PM1Bがピレン、フェナントレンに対する分解効果が徐々に増加した。120hの時、フェナントレンとピレンとの除去率は89.58%と38.81%に達した。なお、PM1Bは銅及びカドミウムに対して、ある程度の吸着作用（図4を参照）があり、吸着率も、時間の経つにつれて増加し、36hの時、銅及びカドミウムに対する吸着率が一番高い、それぞれ63.03%と48.04%であった。その後、菌PM1Bは銅に対して僅かな脱着効果があるが、ほとんど40%くらいに維持していた。

【0031】

本発明に係るスフィンゴビウム属細菌は、多種のPAHsを有効に分解できるし、重金属も吸着できる。PAHs-重金属複合汚染の水土環境のカバナンスと修復に応用できる。

【0032】

実施例3
スフィンゴビウム属細菌PM1Bは電子廃棄物解体エリアの土壌に対する修復。

【0033】

土壌サンプルは広東省清遠龍塘鎮電子廃棄物解体エリアの周辺の農地から取られたのである。中に様々な重金属とPAHs汚染物を含んでいる。一定量の汚染土壌を量ってガラス培養装置に入れ、菌液を土壌に接種し、土壌の湿度をフィールドの最大保水力の60%に維持され、バクテリアがないコントロールグループを設置する。30℃の条件で、自然光で60dに培養した後、土壌でのピレン、フェナントレン、銅及びカドミウムの残留濃度を測定する。実験の結果は図5に示すように、 2ヶ月の微生物の分解/吸着を通して、土壌でのピレン、フェナントレン、銅及びカドミウムの除去率はそれぞれ79.47%、34.92%、59.12%及び37.98%であり、スフィンゴビウム属細菌PM1Bは実際にPAHs-重金属複合汚染土壌に対して良い修復効果がある。

【0034】

最後に説明するはずのは、以上の実施例が本発明の技術構想を容易に理解するための技術案であり、本発明の保護範囲を限定するものではない。実施例によって本発明に対して詳しく説明しましたが、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、創造的労働を付与しない前提下で得られる別のすべての実施例は本発明の範囲内に含まれると当業者が理解すべきである。

【図1】