特開 2021-167301 ＣＤＫ２阻害剤に対する腫瘍適応を抑制するためのＣＤＫ４／６およびＣＤＫ２阻害剤による同時処置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2021-167301(P2021-167301A)

(43)【公開日】2021年10月21日

(54)【発明の名称】ＣＤＫ２阻害剤に対する腫瘍適応を抑制するためのＣＤＫ４／６およびＣＤＫ２阻害剤による同時処置

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/06 20060101AFI20210924BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210924BHJP

   A61K 31/519 20060101ALI20210924BHJP

   A61K 31/506 20060101ALI20210924BHJP

   A61K 31/527 20060101ALI20210924BHJP

   A61K 31/4045 20060101ALI20210924BHJP

【ＦＩ】

   A61K45/06

   A61P35/00ZNA

   A61K31/519

   A61K31/506

   A61K31/527

   A61K31/4045

【審査請求】未請求

【請求項の数】16

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

【全頁数】77

(21)【出願番号】特願2021-64507(P2021-64507)

(22)【出願日】2021年4月6日

(31)【優先権主張番号】63/007329

(32)【優先日】2020年4月8日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】63/165049

(32)【優先日】2021年3月23日

(33)【優先権主張国】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】593141953

【氏名又は名称】ファイザー・インク

(71)【出願人】

【識別番号】308032460

【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド，ア ボディー コーポレイト

【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＯＬＯＲＡＤＯ，ａ ｂｏｄｙ ｃｏｒｐｏｒａｔｅ

(74)【代理人】

【識別番号】100133927

【弁理士】

【氏名又は名称】四本 能尚

(74)【代理人】

【識別番号】100147186

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 眞紀

(74)【代理人】

【識別番号】100174447

【弁理士】

【氏名又は名称】龍田 美幸

(74)【代理人】

【識別番号】100185960

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 理愛

(72)【発明者】

【氏名】マンシ アローラ

(72)【発明者】

【氏名】ステファン ジョージ ダン

(72)【発明者】

【氏名】ニコル リー グッドマン ミラー

(72)【発明者】

【氏名】サブリナ スペンサー

(72)【発明者】

【氏名】トッド リー ヴァナデル

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C084AA20

4C084NA05

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC201

4C084ZC202

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC13

4C086BC50

4C086CB05

4C086CB09

4C086GA07

4C086GA08

4C086GA12

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA05

4C086ZB26

(57)【要約】      （修正有）

【課題】ＣＤＫ２阻害剤に対する腫瘍適応を抑制するためのＣＤＫ４／６およびＣＤＫ２阻害剤による同時処置を提供する。
【解決手段】疾患または障害、好ましくは、がんを処置するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量のＣＤＫ２阻害剤および治療有効量のＣＤＫ４／６阻害剤を投与するステップを含み、ＣＤＫ４／６阻害剤が、ＣＤＫ２の阻害に応答した、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６によって媒介されるリバウンドリン酸化を防止する、方法を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

がんを処置するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量のＣＤＫ２阻害剤および治療有効量のＣＤＫ４／６阻害剤を投与するステップを含み、治療有効量が、一緒になって、がんの処置において有効である、方法。

【請求項2】

がんが、腫瘍細胞増殖に対するＣＤＫ２依存によって特徴付けられる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

治療有効量のＣＤＫ４／６阻害剤が、ＣＤＫ２の阻害に応答した、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６によって媒介されるリバウンドリン酸化を防止する、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

ＣＤＫ４／６阻害剤が、アベマシクリブ、リボシクリブ、パルボシクリブ、レロシクリブ、トリラシクリブ、ＳＨＲ−６３９０およびＢＰＩ−１６３５０、またはそれらの薬学的に許容できる塩からなる群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

ＣＤＫ２阻害剤が、６−（ジフルオロメチル）−８−［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−メチルシクロペンチル］−２−｛［１−（メチルスルホニル）ピペリジン−４−イル］アミノ｝ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン（ＰＦ−０６８７３６００）、ミルシクリブ、インジチニブおよびＦＮ−１５０１、またはそれらの薬学的に許容できる塩からなる群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

ＣＤＫ２阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤が、逐次に、同時発生的にまたは同時に投与される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

ＣＤＫ２阻害剤が、ＰＦ−０６８７３６００またはその薬学的に許容できる塩である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

ＣＤＫ４／６阻害剤が、パルボシクリブまたはその薬学的に許容できる塩である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

細胞におけるＣＤＫ２の阻害に応答した、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６によって媒介されるリバウンドリン酸化を阻害するための方法であって、細胞に、ある量のＣＤＫ２阻害剤およびある量のＣＤＫ４／６阻害剤を導入するステップを含み、ＣＤＫ４／６阻害剤の量が、ＣＤＫ２の阻害に応答した、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６によって媒介されるリバウンドリン酸化の阻害において有効である、方法。

【請求項10】

細胞が、がん細胞である、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

がん細胞が、腫瘍細胞増殖に対するＣＤＫ２依存によって特徴付けられる、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

ＣＤＫ４／６阻害剤が、アベマシクリブ、リボシクリブ、パルボシクリブ、レロシクリブ、トリラシクリブ、ＳＨＲ−６３９０およびＢＰＩ−１６３５０、またはそれらの薬学的に許容できる塩からなる群から選択される、請求項９から１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

ＣＤＫ２阻害剤が、ＰＦ−０６８７３６００、ミルシクリブ、インジチニブおよびＦＮ−１５０１、またはそれらの薬学的に許容できる塩からなる群から選択される、請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

ＣＤＫ２阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤が、それを必要とする対象へと逐次に、同時発生的にまたは同時に投与される、請求項９から１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

ＣＤＫ２阻害剤が、ＰＦ−０６８７３６００またはその薬学的に許容できる塩である、請求項９から１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

ＣＤＫ４／６阻害剤が、パルボシクリブまたはその薬学的に許容できる塩である、請求項９から１５のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

配列表の参照
本願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に出願されており、．ｔｘｔ形式で電子的に提出された配列表を含む。この．ｔｘｔファイルは、２０２１年３月２６日に作成され、１７ＫＢのサイズを有する、「ＰＣ０７２５８００２ＳＥＱＬＩＳＴＩＮＧ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という表題の配列表を含有する。この．ｔｘｔファイルに含有される配列表は、本明細書の一部であり、その全体を参照により本明細書に組み込む。

【0002】

発明の分野
本発明は、サイクリン依存性キナーゼ２（ＣＤＫ２）ならびにサイクリン依存性キナーゼ４および６（ＣＤＫ４／６）の同時阻害により、がん等の異常細胞増殖性障害を処置または改善するための組合せおよび方法に関する。一部の実施形態では、本組合せおよび方法は、ＣＤＫ２およびＣＤＫ４／６の相乗的同時阻害を提供する。

【背景技術】

【0003】

細胞周期の進行は、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）によって媒介される逐次リン酸化事象によって実行される。細胞周期を通したＣＤＫ活性のタイミングおよび特異性は、ヘテロ二量体複合体の形成を介してＣＤＫを活性化する、様々なサイクリンの上昇および下降によってもたらされる。休止または静止状態の細胞は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ経路を活性化するマイトジェンによって、細胞周期に進入するように刺激され、Ｄ型サイクリン（サイクリンＤ１、Ｄ２およびＤ３）の上方調節をもたらすことができる（Ａｋｔａｓら、１９９７；Ｓｈｅｒｒ、１９９３、１９９４）。次に、サイクリンＤは、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６に結合し、網膜芽細胞腫タンパク質、Ｒｂのリン酸化を惹起する。ＲｂのＣＤＫ４／６媒介性リン酸化の性質および効果については、活発な議論中であるが（Ｃｈｕｎｇら、２０１９；Ｎａｒａｓｉｍｈａら、２０１４；Ｓａｎｉｄａｓら、２０１９）、現在のモデルは、Ｒｂリン酸化が、その不活性化および結果的にＥ２Ｆ転写因子遊離をもたらし、Ｅ２Ｆ転写因子が、サイクリンＥおよびサイクリンＡを含むＳ期進入に必要とされる遺伝子の発現を駆動することを記述する（Ｃｈｅｌｌａｐｐａｎら、１９９１；Ｏｈｔａｎｉら、１９９５）。ＣＤＫ４およびＣＤＫ６は、構造的および機能的な相同性を示し、両者共に、Ｒｂをリン酸化することができる（Ｋａｔｏら、１９９３；ＭｅｙｅｒｓｏｎおよびＨａｒｌｏｗ、１９９４）。しかし、両者の特有の系列特異的発現プロファイルは、これらが完全に冗長であるとは限らないことを示唆する（Ｈｕら、２００９；Ｍａｌｕｍｂｒｅｓら、２００４；Ｒａｎｅら、１９９９）。

【0004】

マイトジェンの添加によって細胞周期に再進入するように刺激された静止細胞において、ＣＤＫ４／６活性は、サイクリンＥがＣＤＫ２を活性化するまで要求され、ＣＤＫ２は、Ｒｂをさらにリン酸化し、Ｅ２Ｆの完全遊離および制限点（細胞が以後マイトジェン非依存性になる時点として定義）の通過を確実にする正のフィードバックループを惹起する（Ｂａｌｄｉｎら、１９９３；ＬｕｎｄｂｅｒｇおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ、１９９８；Ｍａｔｓｕｓｈｉｍｅら、１９９４；Ｍｉｔｔｎａｃｈｔら、１９９４）。非同期的に周期を進める細胞において、ＣＤＫ４／６は、Ｇ１期の最初の３〜６時間においてのみ要求され、これは、パルボシクリブ（ＩＢＲＡＮＣＥ（登録商標）、参照により本明細書に組み込む米国特許第６，９３６，６１２号およびＲＥ４７，７３９も参照）等のＣＤＫ４／６阻害剤の添加がＣＤＫ２活性の上昇および細胞周期進行を以後妨害しなくなる時点によって決定される（Ｙａｎｇら、２０１７ｂ）。Ｓ期進入後に、サイクリンＥレベルは減退し、ＣＤＫ２−サイクリンＡが取って代わり、これは、いくつものプロセスの中でもとりわけ、ＤＮＡ複製（例えば、Ｃｄｃ６）、ＤＮＡ修復（例えば、Ｎｂｓ１）、ヒストン合成（例えば、ＮＰＡＴ）、中心体重複（例えば、ヌクレオフォスミン、Ｍｐｓ１）に必須なタンパク質のリン酸化を促進する（ＦｉｓｋおよびＷｉｎｅｙ、２００１；Ｏｋｕｄａら、２０００；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、１９９９；Ｗｏｈｌｂｏｌｄら、２０１２；Ｚｈａｏら、２０００）。最後に、ＣＤＫ１−サイクリンＡおよびＣＤＫ１−サイクリンＢ複合体が、Ｓ期後期およびＧ２期において活性化されて、それぞれ有糸分裂への移行およびその完了を駆動する（Ｋａｔｓｕｎｏら、２００９）（Ｌｉｎｄｑｖｉｓｔら、２００９；Ｌｏｈｋａら、１９８８）。ＣＤＫ−サイクリン複合体の生物学的重要性を考慮すると、これらの複合体およびこれらを調節するタンパク質が、がんにおいて突然変異されることが多いことは驚くには当たらない（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅら、２００５）。一般的な変更は、Ｒｂ機能の損失、またはサイクリンＤ、サイクリンＥ、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６の上方調節／増幅を含む（ＢｕｒｋｈａｒｔおよびＳａｇｅ、２００８；Ｋｅｙｏｍａｒｓｉら、２００２；Ｋｈａｔｉｂら、１９９３；Ｍａｓｓａｇｕｅ、２００４；Ｍｕｓｇｒｏｖｅら、２０１１；Ｐａｒｋら、２０１４）。

【0005】

ＣＤＫの決定的な機能にもかかわらず、ＣＤＫ１を例外として、その多くはｉｎ ｖｉｖｏで必須ではなく、ＣＤＫ間の機能的代償を示唆する。例えば、マウスにおけるＣＤＫ４の欠失は、膵ベータ細胞および下垂体乳腺刺激ホルモン分泌細胞の増殖に選択的に影響を与え、ＣＤＫ６の欠失は、造血細胞のサブセットのみに影響を与え、ＣＤＫ２損失は、生殖系列細胞における増殖に選択的に影響を与える（Ｍａｌｕｍｂｒｅｓら、２００４；Ｍｏｏｎｓら、２００２；Ｒａｎｅら、１９９９）。ＣＤＫ４／ＣＤＫ６ダブルノックアウトは、造血欠乏が原因でマウスにおいて胚性致死であるが、他の組織は、正常な増殖を示した（Ｍａｌｕｍｂｒｅｓら、２００４）。これと一致して、様々な細胞培養モデルにおけるＣＤＫ２のノックアウトまたはノックダウンは、ＣＤＫ２が、細胞増殖に必須ではないことを示した（ＴｅｔｓｕおよびＭｃＣｏｒｍｉｃｋ、２００３）。

【0006】

これらの研究は、ＣＤＫ２活性が、生存率および増殖に必須ではないという考えを支持するが、ＣＤＫ２が、細胞周期進行に必須ではないのか、または代償性キナーゼが、ＣＤＫ２ヌル設定において活性であるか否かは不明であった（Ｂｅｒｔｈｅｔら、２００３）。ＣＤＫ２／ＣＤＫ４ダブルノックアウトマウスも生存可能であったため、ＣＤＫ２またはＣＤＫ４の非存在下での増殖は、ＣＤＫ１による代償性リン酸化に起因した（Ｍａｌｕｍｂｒｅｓら、２００４）。実際に、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６を欠くマウス胚は、妊娠中期に至るまで発生することができる（Ｓａｎｔａｍａｒｉａら、２００７）。これらのマウスノックアウト研究から得た結論は、ＣＤＫ１が、哺乳類細胞における唯一の必須ＣＤＫであり、あらゆる必須ＣＤＫ２、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６基質の代償性リン酸化を駆動することができることであった。

【0007】

上述の研究によって実証されるＣＤＫ２の非必須性にもかかわらず、依然として、サイクリンＥを過剰発現し、これに依存するがんを処置するための、ＣＤＫ２を標的とする低分子阻害剤の開発には大きな関心がある。このようながんは、臨床ＣＤＫ４／６阻害剤に対し内在的な抵抗性を有し、生存のためにＣＤＫ２に「耽溺」していると考えられる（Ｃａｌｄｏｎら、２０１２）。その上、前臨床モデルにおいて、ＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、パルボシクリブ、アベマシクリブ、リボシクリブ）による延長された処置は、Ｒｂの損失、ＣＤＫ２／サイクリンＥ活性の上方調節をもたらすＣＣＮＥ１の増幅、または非正準ＣＤＫ２／サイクリンＤ１複合体の形成を介して、獲得抵抗性をもたらす（Ｆｒａｎｃｏら、２０１４；Ｈｅｒｒｅｒａ−Ａｂｒｅｕら、２０１６；Ｙａｎｇら、２０１７ａ）。この臨床仮説に取り組むために、新たなＡＴＰ競合性ＣＤＫ阻害剤ＰＦ−０６８７３６００（本明細書において、ＰＦ３６００と称される場合もあり、これは、米国特許第１０，２３３，１８８号にさらに開示されており、各化学構造およびその使用を特に参照により本明細書に組み込む）が、Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．により近年開発された。ＰＦ３６００は、抗標的ＣＤＫ１を上回る有意な効力ウィンドウを維持しつつ、ＣＤＫ２、４および６複合体の細胞シグナリング活性を捕捉するように設計された。このことから分かるように、特に、がん等の異常細胞増殖性障害の処置において、ＣＤＫ２、４および６の組み合わせた阻害の潜在的な治療効果をより良く理解することが、長年にわたって切実に必要とされている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】米国特許第６，９３６，６１２号

【特許文献2】ＲＥ４７，７３９

【特許文献3】米国特許第１０，２３３，１８８号

【特許文献4】米国特許第８，８２２，６８３号

【特許文献5】米国特許第８，５９８，１９７号

【特許文献6】米国特許第８，５９８，１８６号

【特許文献7】米国特許第８，６９１，８３０号

【特許文献8】米国特許第８，８２９，１０２号

【特許文献9】米国特許第８，８２２，６８３号

【特許文献10】米国特許第９，１０２，６８２号

【特許文献11】米国特許第９，４９９，５６４号

【特許文献12】米国特許第９，４８１，５９１号

【特許文献13】米国特許第９，２６０，４４２号

【特許文献14】米国特許第６，１０６，８６４号

【特許文献15】ＷＯ ００／３５２９８

【特許文献16】ＷＯ ９１／１１１７２

【特許文献17】ＷＯ ９４／０２５１８

【特許文献18】ＷＯ ９８／５５１４８

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ａｋｔａｓら、１９９７

【非特許文献2】Ｓｈｅｒｒ、１９９３、１９９４

【非特許文献3】Ｃｈｕｎｇら、２０１９

【非特許文献4】Ｎａｒａｓｉｍｈａら、２０１４

【非特許文献5】Ｓａｎｉｄａｓら、２０１９

【非特許文献6】Ｃｈｅｌｌａｐｐａｎら、１９９１

【非特許文献7】Ｏｈｔａｎｉら、１９９５

【非特許文献8】Ｋａｔｏら、１９９３

【非特許文献9】ＭｅｙｅｒｓｏｎおよびＨａｒｌｏｗ、１９９４

【非特許文献10】Ｈｕら、２００９

【非特許文献11】Ｍａｌｕｍｂｒｅｓら、２００４

【非特許文献12】Ｒａｎｅら、１９９９

【非特許文献13】Ｂａｌｄｉｎら、１９９３

【非特許文献14】ＬｕｎｄｂｅｒｇおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ、１９９８

【非特許文献15】Ｍａｔｓｕｓｈｉｍｅら、１９９４

【非特許文献16】Ｍｉｔｔｎａｃｈｔら、１９９４

【非特許文献17】Ｙａｎｇら、２０１７ｂ

【非特許文献18】ＦｉｓｋおよびＷｉｎｅｙ、２００１

【非特許文献19】Ｏｋｕｄａら、２０００

【非特許文献20】Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、１９９９

【非特許文献21】Ｗｏｈｌｂｏｌｄら、２０１２

【非特許文献22】Ｚｈａｏら、２０００

【非特許文献23】Ｋａｔｓｕｎｏら、２００９

【非特許文献24】Ｌｉｎｄｑｖｉｓｔら、２００９

【非特許文献25】Ｌｏｈｋａら、１９８８

【非特許文献26】Ｄｅｓｈｐａｎｄｅら、２００５

【非特許文献27】ＢｕｒｋｈａｒｔおよびＳａｇｅ、２００８

【非特許文献28】Ｋｅｙｏｍａｒｓｉら、２００２

【非特許文献29】Ｋｈａｔｉｂら、１９９３

【非特許文献30】Ｍａｓｓａｇｕｅ、２００４

【非特許文献31】Ｍｕｓｇｒｏｖｅら、２０１１

【非特許文献32】Ｐａｒｋら、２０１４

【非特許文献33】Ｍａｌｕｍｂｒｅｓら、２００４

【非特許文献34】Ｍｏｏｎｓら、２００２

【非特許文献35】Ｒａｎｅら、１９９９

【非特許文献36】Ｍａｌｕｍｂｒｅｓら、２００４

【非特許文献37】ＴｅｔｓｕおよびＭｃＣｏｒｍｉｃｋ、２００３

【非特許文献38】Ｂｅｒｔｈｅｔら、２００３

【非特許文献39】Ｍａｌｕｍｂｒｅｓら、２００４

【非特許文献40】Ｓａｎｔａｍａｒｉａら、２００７

【非特許文献41】Ｃａｌｄｏｎら、２０１２

【非特許文献42】Ｆｒａｎｃｏら、２０１４

【非特許文献43】Ｈｅｒｒｅｒａ−Ａｂｒｅｕら、２０１６

【非特許文献44】Ｙａｎｇら、２０１７ａ

【非特許文献45】「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１９版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５）

【非特許文献46】Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐａｔｅｎｔｓ、１１（６）、９８１〜９８６、ＬｉａｎｇおよびＣｈｅｎ著（２００１）

【非特許文献47】「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ、１巻」、Ｈ．ＬｉｅｂｅｒｍａｎおよびＬ．Ｌａｃｈｍａｎ著、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎ．Ｙ．、Ｎ．Ｙ．、１９８０（ＩＳＢＮ ０−８２４７−６９１８−Ｘ）

【非特許文献48】Ｖｅｒｍａら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｏｎ−ｌｉｎｅ、２５（２）、１〜１４（２００１）

【非特許文献49】Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ、８８（１０）、９５５〜９５８、ＦｉｎｎｉｎおよびＭｏｒｇａｎ著（１９９９年１０月）

【非特許文献50】「Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、１４巻、ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ（Ｔ ＨｉｇｕｃｈｉおよびＷ Ｓｔｅｌｌａ）

【非特許文献51】「Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ」、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、１９８７（Ｅ Ｂ Ｒｏｃｈｅ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）

【非特許文献52】「Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ」Ｈ Ｂｕｎｄｇａａｒｄ著（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８５）

【非特許文献53】Ｈａｔａら、２０１６

【非特許文献54】Ｒａｍｉｒｅｚら、２０１６

【非特許文献55】Ｓｈａｆｆｅｒら、２０１７

【非特許文献56】Ｓｈａｒｍａら、２０１０

【非特許文献57】Ｏｒｔｅｇａら、２００３

【非特許文献58】ＧｒｉｍおよびＣｌｕｒｍａｎ、２００３

【非特許文献59】Ｍａｔｓｕｓｈｉｍｅら、１９９２

【非特許文献60】Ｂｒｏｏｋｅｓら、２０１５

【非特許文献61】Ｇａｂｒｉｅｌｌｉら、１９９９

【非特許文献62】Ｇｏｏｋｉｎら、２０１７

【非特許文献63】Ｙａｎｇら、２００６

【非特許文献64】Ｚｅｒｊａｔｋｅら、２０１７

【非特許文献65】Ｓｃｈｗａｒｚら、２０１８

【非特許文献66】Ｓｐｅｎｃｅｒら、２０１３

【非特許文献67】Ｂａｒｒｉｅｒｅら、２００７

【非特許文献68】ＳｈｅｒｒおよびＲｏｂｅｒｔｓ、２００４

【非特許文献69】Ｓａｈａら、１９９８

【非特許文献70】Ｍｅｒｒｉｃｋら、２０１１

【非特許文献71】Ｓａｒｃｅｖｉｃら、１９９７

【非特許文献72】Ａｋｉｙａｍａら、１９９２

【非特許文献73】Ａｌｅｅｍら、２００５

【非特許文献74】Ｖａｓｓｉｌｅｖら、２００６

【非特許文献75】Ｅｖｒｏｎら、２００１

【非特許文献76】Ｃａｐｐｅｌｌら、２０１６

【非特許文献77】Ａｒｏｒａら、２０１７

【非特許文献78】ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｓｃａｐｐｅｌｌ／Ｃｅｌｌ＿ｔｒａｃｋｉｎｇ

【非特許文献79】Ｌａｐｅｋら、２０１７ｂ

【非特許文献80】ＥｄｗａｒｄｓおよびＨａａｓ、２０１６

【非特許文献81】Ｘｕら、２０１５

【非特許文献82】Ｈｕｔｔｌｉｎら、２０１０

【非特許文献83】Ｌａｐｅｋら、２０１７ａ

【非特許文献84】Ｇｕｅｒｒａら、２００３

【非特許文献85】Ｊｏｎｋｅｒｓら、２００１

【非特許文献86】Ｌｅｅら、２０１２

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

【課題を解決するための手段】

【0011】

そこで、本発明者らは、単細胞タイムラプスイメージングを他の伝統的技法と共に使用して、基質リン酸化および細胞周期進行におけるＣＤＫ２阻害の動的効果を特徴付けた。ＤＮＡヘリカーゼＢ（ＤＨＢ）のＣ末端に由来するＣＤＫ２活性に関する生細胞センサーを使用して、ＣＤＫ２阻害後にＣＤＫ２基質再リン酸化および細胞周期進行を駆動する急速代償性機構が実証された。ＣＤＫ２の阻害は、予想される通り、多種多様な異なるＣＤＫ２基質にわたるリン酸化の即時損失をもたらす。しかし、細胞適応の顕著な表出において、代償性基質リン酸化が、急速に、１〜２時間以内に始まる。驚いたことに、ＣＤＫ２およびＣＤＫ１の同時阻害は、代償性リン酸化を遮断しない一方で、ＣＤＫ２およびＣＤＫ４／６の同時阻害は、リバウンドリン酸化を排除し、細胞をＣＤＫ^ｌｏｗ非増殖性状態にさせる。これらの結果は、細胞が、ＣＤＫ４／６の代償性活性化により、ＣＤＫ２活性の損失に急速に適応し得ること、また、ＣＤＫ２阻害剤が、承認されたＣＤＫ４／６阻害剤を含むＣＤＫ４／６を標的とする治療薬と組み合わせて相乗的に作用する準備ができていることを指し示す。

【0012】

本発明は、一部には、疾患または障害、好ましくは、がんを処置するための方法であって、それを必要とする対象に、ＣＤＫ２およびＣＤＫ４およびＣＤＫ６の活性を阻害する、治療有効量の２種以上のＣＤＫ阻害剤、またはそれらの組合せを投与するステップを含む方法を提供する。

【0013】

本発明は、一部には、疾患または障害、好ましくは、がんを処置するための方法であって、それを必要とする対象に、ＣＤＫ２の阻害に応答した、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６によって媒介されるリバウンドリン酸化を阻害する、治療有効量の２種以上のＣＤＫ阻害剤を投与するステップを含む方法をさらに提供する。

【0014】

一態様では、本発明は、異常細胞増殖性疾患または障害、好ましくは、がんを処置するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量のＣＤＫ２阻害剤および治療有効量のＣＤＫ４／６阻害剤を投与するステップを含み、ＣＤＫ４／６阻害剤が、ＣＤＫ２の阻害に応答した、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６によって媒介されるリバウンドリン酸化を阻害する、方法を提供する。

【0015】

別の態様では、本発明は、細胞におけるＣＤＫ２の阻害に応答した、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６によって媒介されるリバウンドリン酸化を阻害するための方法であって、細胞に、ある量のＣＤＫ２阻害剤およびある量のＣＤＫ４／６阻害剤を導入するステップを含み、ＣＤＫ４／６阻害剤の量が、ＣＤＫ２の阻害に応答した、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６によって媒介されるリバウンドリン酸化の阻害において有効である、方法を提供する。一部の実施形態では、ＣＤＫ２阻害剤が導入され、続いてＣＤＫ４／６阻害剤が導入される。

【0016】

別の態様では、本発明は、疾患または障害、好ましくは、がんを処置するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量のＣＤＫ２阻害剤および治療有効量のＣＤＫ４／６阻害剤を投与するステップを含み、治療有効量が、一緒になって、疾患または障害の処置において有効である、方法を提供する。

【0017】

別の態様では、本発明は、疾患または障害、好ましくは、がんを処置するための方法であって、ＣＤＫ２の阻害に応答した、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６によって媒介されるリバウンドリン酸化が、対象において観察される場合、それを必要とする対象に、治療有効量のＣＤＫ２阻害剤および治療有効量のＣＤＫ４／６阻害剤を投与するステップを含む方法を提供する。

【0018】

本発明は、また、疾患または障害、好ましくは、がんを処置する治療上の方法および使用であって、それを必要とする対象に、治療有効量のＣＤＫ２阻害剤および治療有効量のＣＤＫ４／６阻害剤を、治療有効量の１種または複数の追加的な抗がん剤または緩和剤とさらに組み合わせて投与するステップを含み、治療有効量が、一緒になって、疾患または障害、例えば、がんの処置において有効である、方法および使用を提供する。

【0019】

別の態様では、本発明は、対象におけるＣＤＫ２、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６によって媒介される疾患または障害、好ましくは、対象におけるＣＤＫ２の阻害に応答した、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６によって媒介されるリバウンドリン酸化によって特徴付けられる疾患または障害の処置のための方法を提供する。

【0020】

本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、疾患または障害は、サイクリンＥ１（ＣＣＮＥ１）および／またはサイクリンＥ２（ＣＣＮＥ２）の増幅または過剰発現によって特徴付けられるがんである。本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、がんは、例えば、増加したサイクリンＥ発現が原因の、１種または複数のＣＤＫ４／６阻害剤に対する抵抗性によって特徴付けられる。本明細書に提供される方法の他の頻出する実施形態では、がんは、腫瘍細胞増殖に対するＣＤＫ２依存によって特徴付けられる。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】図１Ａ〜図１Ｇ：ＣＤＫ２活性は、ＰＦ３６００によって急性的に阻害されるが、リン酸化は急速にリバウンドする。（Ａ）ＣＤＫ２活性センサーの模式図。ＤＨＢ（ＤＮＡヘリカーゼＢ断片）は、非リン酸化の場合は核に局在化する；漸進的リン酸化は、細胞質へのセンサーの移行をもたらす。ＮＬＳ、核局在化シグナル；ＮＥＳ、核外輸送シグナル；Ｓ、セリンにおけるＣＤＫコンセンサスリン酸化部位。（Ｂ）ＭＣＦ１０ＡにおけるＤＨＢセンサーリン酸化。活発に増殖中の細胞（ＣＤＫ２^ｉｎｃ、方法を参照）は、ハッシュ化（hashed）陰影でマークされた時間ウィンドウにおいて薬物を受けた場合、プロットに選択される。細胞は、薬物添加のｔ時間前に分裂後期を完了した場合、プロットに選択され、この場合、ｔは、有糸分裂間時間の２５％〜７５％の間の細胞周期の試料採取に選択された。単細胞トレースの数：ＤＭＳＯ（１２１、９２、９９、７１）、２５ｎＭ ＰＦ３６００（１３３、９２、１０４、７６）、１００ｎＭ ＰＦ３６００（８０、９５、１０７、８０）、５００ｎＭ（１９、５１、１５９、１１９）。（Ｃ）ＣＤＣ６−ＹＦＰ Ｃ／Ｎ比による読み取り値としてのＭＣＦ１０Ａ細胞におけるＣＤＣ６リン酸化。細胞は、図１Ｂと同様にイメージング、処置およびプロットした。単細胞トレースの数：ＤＭＳＯ（８３）、１００ｎＭ ＰＦ３６００（８６）、５００ｎＭ ＰＦ３６００（９５）。（Ｄ）、（Ｆ）および（Ｇ）図１Ｂと同様のＤＨＢセンサーリン酸化。次の細胞についての単細胞トレースの数：（Ｄ）ＲＰＥ−ｈＴＥＲＴ：ＤＭＳＯ（６９、７４、１００、９７）、２５ｎＭ ＰＦ３６００（６６、９７、９２、１０６）、１００ｎＭ ＰＦ３６００（４３、１１１、１２１、８７）、５００ｎＭ ＰＦ３６００（２５、１５１、２３１、１８２）；（Ｆ）ＭＣＦ７：ＤＭＳＯ（１４８、１２６、１２４、１０７）、２５ｎＭ ＰＦ３６００（１９６、１７９、１６７、１４５）、１００ｎＭ ＰＦ３６００（１７２、１９８、１８８、１６１）、５００ｎＭ ＰＦ３６００（２４６、２３０、１９１、１９０）；（Ｇ）ＯＶＣＡＲ３：ＤＭＳＯ（１００、１００、１００、８６）、２５ｎＭ ＰＦ３６００（１００、１００、１００、９５）、１００ｎＭ ＰＦ３６００（６２、１００、１００、１００）、５００ｎＭ ＰＦ３６００（２２、１００、８８、９４）。（Ｅ）指し示されている時間におけるＤＭＳＯまたは１０μＭ ３ＭＢ−ＰＰ１で処置されたＣＤＫ２アナログ感受性ＲＰＥ−ｈＴＥＲＴにおけるＤＨＢセンサーリン酸化。単細胞トレースの数：ＤＭＳＯ（１３３）、１０μＭ ３ＭＢ−ＰＰ１（１０４）。

【図2】図２Ａ〜図２Ｃ：ＣＤＫ４／６およびＣＤＫ２の同時阻害は、増殖およびＣＤＫ２基質の代償性リン酸化を遮断する。（Ａ）図１Ｂと同様に、指し示されている時間におけるＤＭＳＯ、１０μＭ ３ＭＢ−ＰＰ１、１μＭパルボシクリブまたは１０μＭ ３ＭＢ−ＰＰ１＋１μＭパルボシクリブで処置したＣＤＫ２アナログ感受性ＲＰＥ−ｈＴＥＲＴ細胞におけるＤＨＢセンサーリン酸化。３ＭＢ−ＰＰ１は、ＣＤＫ２アナログ感受性細胞におけるＣＤＫ２活性の阻害に使用される。単細胞トレースの数：ＤＭＳＯ（１３３）、１０μＭ ３ＭＢ−ＰＰ１（１０４）、１μＭパルボシクリブ（１４６）、１０μＭ ３ＭＢ−ＰＰ１＋１μＭパルボシクリブ（１６０）。図１Ｅから再現されたＤＭＳＯおよび１０μＭ ３ＭＢ−ＰＰ１メジアントレース。（Ｂ）図１Ｂと同様にＤＭＳＯ、１００ｎＭ ＰＦ３６００、５μＭリボシクリブ、１００ｎＭ ＰＦ３６００＋５μＭリボシクリブで処置したＭＣＦ１０Ａ細胞におけるＤＨＢセンサーリン酸化；（Ｃ）図１Ｂと同様にＤＭＳＯ、１００ｎＭ ＰＦ３６００、１μＭアベマシクリブまたは１００ｎＭ ＰＦ３６００＋１μＭアベマシクリブで処置したＭＣＦ１０Ａ細胞におけるＤＨＢセンサーリン酸化。（Ｂ）単細胞トレースの数、左：ＤＭＳＯ（５５）、１００ｎＭ ＰＦ３６００（５３）、５μＭリボシクリブ（２３）、１００ｎＭ ＰＦ３６００＋５μＭリボシクリブ（２６）。（Ｃ）単細胞トレースの数、右：ＤＭＳＯ（１９７）、１００ｎＭ ＰＦ３６００（２４２）、１μＭアベマシクリブ（３９０）、１００ｎＭ ＰＦ３６００＋１μＭアベマシクリブ（２７０）。

【図3】図３。指し示されている濃度において１μＭパルボシクリブまたは９μＭ ＲＯ３３０６で処置したＭＣＦ１０Ａ細胞におけるＤＨＢセンサーリン酸化。単細胞トレースの数：ＤＭＳＯ（３９）、パルボシクリブ（７２）およびＲＯ３３０６（４３）。細胞は、分裂後期の５〜６時間後に薬物を受けた。

【図4】図４Ａ〜図４Ｄ：ＣＤＫ２阻害後のＣＤＫ２基質リン酸化における一過性損失およびリバウンド。（Ａ）および（Ｂ）ＭＣＦ１０Ａ細胞は、指し示されている時間にわたり１００ｎＭ ＰＦ３６００で処置し、固定し、（Ａ）ホスホ−Ｒｂまたは（Ｂ）ホスホ−ヌクレオリンに関して染色した。ヘキストを使用して、個々の細胞におけるＤＮＡ含量を定量化した。平均核シグナルを、３〜４Ｎ ＤＮＡ含量を有する細胞に関して定量化し、右に確率密度ヒストグラムとしてプロットした。（Ｃ）指し示されている時間にわたるＰＦ３６００による処置後のＭＣＦ１０Ａ細胞における選択ＣＤＫ２基質のリン酸化レベルを示すウエスタンブロット。β−チューブリンおよびＧＡＰＤＨをローディング対照とした。バンド強度を定量化し、棒グラフとしてプロットした。データは、２回の生物学的反復の代表である。（Ｄ）ＰＦ３６００による処置後のリン酸化ペプチドの不偏網羅的解析。ＭＣＦ７細胞を２５ｎＭ ＰＦ３６００で処置し、その結果生じるリン酸化ペプチドモジュレーションをプロテオミクスにより評価した。１時間処置後の最小ＣＤＫコンセンサスモチーフ（ＳＰまたはＴＰ）を含有する有意にモジュレートされたリン酸化ペプチド（ｐ＜０．０５）、および２４時間目の同じペプチドの運命が示されている。データは、ＤＭＳＯ対照と比べてプロットされている。

【図5】図５Ａ〜図５Ｄ：パルボシクリブは、ＣＤＫ２基質の代償性リン酸化を消失させる。（Ａ）および（Ｂ）ＤＭＳＯ、ＰＦ３６００、ＰＦ３６００＋９μＭ ＲＯ３３０６またはＰＦ３６００＋１μＭパルボシクリブで処置したＭＣＦ１０Ａ、ＲＰＥ−ｈＴＥＲＴおよびＭＣＦ７細胞におけるＤＨＢセンサーリン酸化。ＭＣＦ１０ＡおよびＲＰＥ−ｈＴＥＲＴについて、１００ｎＭ ＰＦ３６００を使用した；ＭＣＦ７について、２５ｎＭ ＰＦ３６００を使用した。図１Ｂと同様に細胞をイメージングし、プロットした。垂直ハッシュ化バーは、薬物添加時点を表す。（Ｃ）指し示されている時間にわたる１００ｎＭ ＰＦ３６００および１μＭパルボシクリブによる同時処置後のＭＣＦ１０Ａ細胞における選択ＣＤＫ２基質のリン酸化レベルを示すウエスタンブロット。β−チューブリンおよびＧＡＰＤＨをローディング対照とした。白色のバーは、図４Ｃから再現されている。データは、２回の生物学的反復の代表である。（Ｄ）ＭＣＦ１０Ａ細胞は、指し示されている時間にわたり１００ｎＭ ＰＦ３６００＋１μＭパルボシクリブで処置し、固定し、ホスホ−Ｒｂまたはホスホ−ヌクレオリンに関して染色した。平均核シグナルを、３〜４Ｎ ＤＮＡ含量を有する細胞に関して定量化し、確率密度ヒストグラムとしてプロットした。陰影付きのヒストグラムは、図４Ａおよび図４Ｂから再現された、対応する時点におけるＰＦ３６００単独処置後のホスホ−Ｒｂまたはホスホ−ＮＣＬ分布を表す。

【図6】図６Ａ〜図６Ｆ：ＣＤＫ４／６／サイクリンＤのノックダウンは、ＣＤＫ２基質の代償性リン酸化を低下させる。（Ａ）次のｓｉＲＮＡによるトランスフェクションの２０時間後にＤＭＳＯまたはＰＦ３６００で処置したＭＣＦ１０ＡおよびＭＣＦ７におけるＤＨＢセンサーリン酸化：非標的化、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、またはＣＤＫ４およびＣＤＫ６。垂直の黒い線は、ＰＦ３６００添加の時間をマークする（ＭＣＦ１０Ａは１００ｎＭ ＰＦ３６００；ＭＣＦ７は２５ｎＭ ＰＦ３６００）。（Ｂ）（Ａ）においてプロットされた個々のＭＣＦ１０Ａ（上）およびＭＣＦ７（下）細胞に関するＤＨＢ Ｃ／Ｎ単細胞トレース。薬物処置後の任意のさらなる有糸分裂は、Ｃ／Ｎ比の急激な下落によって認められる。ＤＨＢ Ｃ／Ｎ比の漸進的な下落は、有糸分裂によらないＤＨＢの脱リン酸化を表示する。（Ｃ）次のｓｉＲＮＡによるトランスフェクションの６時間後にＤＭＳＯまたはＰＦ３６００で処置したＭＣＦ１０ＡおよびＭＣＦ７におけるＤＨＢセンサーリン酸化：非標的化、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、またはＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２およびＣＣＮＤ３（ＭＣＦ１０Ａ）もしくはＣＣＮＤ１およびＣＣＮＤ３（ＭＣＦ７）の組み合わせたノックダウン。ＭＣＦ７細胞は、サイクリンＤ２を発現しないため、ＭＣＦ７実験からＣＣＮＤ２ノックダウンを省略した。（Ｄ）指し示されている時間における、ＰＦ３６００処置（ＭＣＦ１０Ａは１００ｎＭ、ＭＣＦ７は２５ｎＭ）に応答した指し示されているＣＤＫおよびＤ型サイクリンのウエスタンブロット解析。ホールセル抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。対照試料は、０時間と標識されている。ローディング対照としてヒストンＨ３が使用されている。（Ｅ）指し示されている時間における、ＰＦ３６００処置に応答したＭＣＦ１０ＡまたはＭＣＦ７細胞におけるＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６ ｍＲＮＡの発現を示す代表的ｍＲＮＡ ＦＩＳＨ画像。核は、ヘキスト色素で染色されており、シアンで示されている；ｍＲＮＡはマゼンタで示されている。（Ｆ）（Ｅ）におけるｍＲＮＡ ＦＩＳＨデータの定量化。エラーバーは、複数の画像の標準偏差を指し示す。

【図7】図７Ａ〜図７Ｃ：Ｃｄｋ２アブレーションは、Ｋｒａｓ^Ｇ１２Ｖ／Ｔｒｐ５３^−／−駆動肺腫瘍においてパルボシクリブに対する感受性を増加させる。（Ａ）Ｋｒａｓ^{＋／ＬＳＬＧ１２Ｖ}；Ｔｒｐ５３^Ｌ／Ｌマウス由来の平均腫瘍体積倍率変化（ＣＴスキャンにより測定）の定量化。測定は、パルボシクリブ（７０ｍｇ／ｋｇ）による処置後２８日目に実行した。各コホートにおいて解析した腫瘍の数は、「ｎ」として指定されている。平均腫瘍体積倍率変化は、初期腫瘍体積で割った最終腫瘍体積として計算した。エラーバーは、ＳＥＭを指し示す。（Ｂ）図７Ａに描写されているパルボシクリブで処置したＫｒａｓ^{＋／ＬＳＬＧ１２Ｖ}；Ｔｒｐ５３^Ｌ／Ｌマウス由来の腫瘍のウエスタンブロットは、指し示されているバイオマーカーに関して調べ、定量化した。ｐ値は、２標本ｔ検定から得た。（Ｃ）Ｋｒａｓ^{＋／ＬＳＬＧ１２Ｖ}；Ｔｒｐ５３^Ｌ／Ｌマウスの各コホート由来の指し示されている数の腫瘍（ｎ）由来の平均腫瘍体積倍率変化の定量化。Ｃｄｋ２状態は、野生型（Ｃｄｋ２^＋／＋）またはヌル（Ｃｄｋ２^−／−）として指し示されている。腫瘍体積は、ＣＴスキャンにより測定される。平均腫瘍体積倍率変化は、Ａと同様に計算された。エラーバーは、ＳＥＭを指し示す。

【図8】図８Ａ〜図８Ｃ：（Ａ）ＭＣＦ１０ＡおよびＭＣＦ７細胞を、増加する用量のＰＦ３６００で１時間処置し、ＥＬＩＳＡによってホスホ−Ｒｂ（Ｓ８０７／８１１）を測定した。データは、薬物濃度当たり重複した測定から得られる平均および標準偏差を表す。（Ｂ）ＤＭＳＯまたは１μＭパルボシクリブで１時間処置した個々のＭＣＦ１０ＡまたはＭＣＦ７細胞における、総Ｒｂに対して正規化された平均核ホスホ−Ｒｂ Ｓ８０７／Ｓ８１１シグナル強度の密度散布図。ＤＮＡ含量は、ヘキスト色素の総核強度を使用して定量化した。（Ｃ）個々のＭＣＦ１０Ａ、ＲＰＥ−ｈＴＥＲＴ、ＭＣＦ７およびＯＶＣＡＲ３細胞に関するＤＨＢ Ｃ／Ｎ単細胞トレース。細胞は、薬物添加のｔ時間前に分裂後期を完了した場合、プロットに選択され、この場合、ｔは、薬物添加時点における細胞周期中途（有糸分裂間時間に基づく）の細胞の捕捉に選択された。単細胞トレースの数：ＭＣＦ１０Ａ：ＤＭＳＯ（５３）、２５ｎＭ ＰＦ３６００（７２）、１００ｎＭ ＰＦ３６００（６６）。ＭＣＦ７：ＤＭＳＯ（１００）、２５ｎＭ ＰＦ３６００（１００）、１００ｎＭ ＰＦ３６００（１００）。ＲＰＥ−ｈＴＥＲＴ：ＤＭＳＯ（７１）、２５ｎＭ ＰＦ３６００（６８）、１００ｎＭ ＰＦ３６００（６２）。ＯＶＣＡＲ３：ＤＭＳＯ（１９）、２５ｎＭ ＰＦ３６００（２９）、１００ｎＭ ＰＦ３６００（２３）。薬物処置後の任意の追加的な有糸分裂が標識されている。

【図9】図９Ａ〜図９Ｆ：（Ａ）および（Ｂ）野生型ＲＰＥ−ｈＴＥＲＴ（Ｂ）または両方のＣｄｋ２アレルにおいてＣＤＫ２のゲートキーパー残基（ＲＰＥ−ｈＴＥＲＴ ＣＤＫ２^{Ｆ８０Ｇ／Ｆ８０Ｇ}）にゲノム突然変異を有するＲＰＥ−ｈＴＥＲＴ細胞（Ａ）におけるＤＨＢセンサーリン酸化。細胞は、分裂後期の後の指し示されている時間ウィンドウにおいてＤＭＳＯまたは１０μＭのＡＴＰアナログ３ＭＢ−ＰＰ１で処置し、図１Ｂと同様にイメージングおよびプロットした。（Ｃ）ＲＰＥ−ｈＴＥＲＴ ＣＤＫ２^{Ｆ８０Ｇ／Ｆ８０Ｇ}は、１０μＭ ３ＭＢ−ＰＰ１で１時間処置し、固定し、ホスホ−ＮＢＳ１抗体で染色した。核ホスホ−ＮＢＳ１シグナルのヒストグラムを示す。２回の技術的複製からデータをプールする。（Ｄ）野生型ＲＰＥ−ｈＴＥＲＴ細胞におけるＤＨＢセンサーリン酸化。細胞は、分裂後期の後の指し示されている時間ウィンドウにおいて１００ｎＭ ＰＦ３６００で処置し、図１Ｂと同様にイメージングおよびプロットした。（Ｅ）野生型ＲＰＥ−ｈＴＥＲＴ ｖｓ． ＲＰＥ−ｈＴＥＲＴ ＣＤＫ２^{Ｆ８０Ｇ／Ｆ８０Ｇ}細胞におけるＤＨＢセンサーリン酸化。細胞は、分裂後期の後の指し示されている時間ウィンドウにおいて９μＭ ＲＯ３３０６で処置し、図１Ｂと同様にイメージングおよびプロットした。（Ｆ）ＤＭＳＯ対照と比べた、２５ｎＭ ＰＦ３６００で１時間または２４時間処置したＭＣＦ７細胞におけるタンパク質で正規化されたホスホ−プロテオミクス変化。各ホスホペプチドは、同様の条件下で決定されたその総細胞レベルに対して正規化された。黒色の球は、１時間時点で有意に減少したホスホペプチドを強調し、これは一般に、２４時間時点でベースラインレベルに戻る。

【図10】図１０Ａ〜図１０Ｃ：（Ａ）ＭＣＦ１０Ａ細胞は、１００ｎＭ ＰＦ３６００＋９μＭ ＲＯ３３０６で指し示されている時間処置し、固定し、ホスホ−Ｒｂまたはホスホ−ヌクレオリンに関して染色した。平均核シグナルは、３〜４Ｎ ＤＮＡ含量を有する細胞に関して定量化し、確率密度ヒストグラムとしてプロットした。陰影付きのヒストグラムは、図４Ａおよび図４Ｂから再現された、対応する時点におけるＰＦ３６００単独処置後のホスホ−Ｒｂまたはホスホ−ＮＣＬ分布を表す。（Ｂ）ＰＦ３６００、プラス、パルボシクリブで処置した個々のＭＣＦ１０Ａ、ＲＰＥ−ｈＴＥＲＴおよびＭＣＦ７細胞に関する図５Ｂから得たＤＨＢ Ｃ／Ｎ単細胞トレース。（Ｃ）指し示される通りに処置したＭＣＦ１０Ａ、ＲＰＥ−ｈＴＥＲＴおよびＭＣＦ７に関する図５Ｂに対応する増殖データ。細胞計数は、イメージングの最初のフレームにおける細胞の数に対して正規化した。３回の技術的複製からデータをプールした。垂直な黒い線は、薬物添加時点をマークする。細胞計数における湾曲（jog）は、培地交換による有糸分裂細胞の損失が原因で、媒体または薬物添加により起こり得ることに留意されたい。

【図11】図１１Ａ〜図１１Ｆ：（Ａ）指し示されているｓｉＲＮＡ処置後のＭＣＦ１０ＡおよびＭＣＦ７におけるＣＤＫ４およびＣＤＫ６の損失を検証するウエスタンブロット。ライセートは、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションの２４時間後に収集した。ローディング対照としてβ−チューブリンまたはヒストンＨ３を使用する。（Ｂ）次のｓｉＲＮＡによる処置後のＭＣＦ１０ＡまたはＭＣＦ７細胞におけるＤＨＢセンサーリン酸化：非標的化、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、またはＣＤＫ４およびＣＤＫ６。細胞を、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの直後に開始して５０時間連続的にイメージングした。（Ｃ）指し示されているｓｉＲＮＡ処置後のＭＣＦ１０ＡおよびＭＣＦ７におけるサイクリンＤ１、Ｄ２、Ｄ３の損失を検証するウエスタンブロット。ライセートは、トランスフェクションの２４時間後に収集した。ローディング対照としてβ−チューブリン、ＧＡＰＤＨまたはヒストンＨ３を使用する。（Ｄ）次のｓｉＲＮＡによる処置後のＭＣＦ１０ＡまたはＭＣＦ７細胞におけるＤＨＢセンサーリン酸化：非標的化、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、同時ＣＣＮＤ１、Ｄ２およびＤ３（ＭＣＦ１０Ａ）、または同時ＣＣＮＤ１およびＤ３（ＭＣＦ７）ノックダウン。（Ｅ）図６Ｃにおいてプロットされた個々のＭＣＦ１０Ａ（上）およびＭＣＦ７（下）細胞に関するＤＨＢ Ｃ／Ｎトレース。薬物処置後の任意のさらなる有糸分裂は、Ｃ／Ｎ比の急激な下落によって認められる。ＤＨＢ Ｃ／Ｎ比の漸進的な下落は、有糸分裂によらないＤＨＢの脱リン酸化を表示する。（Ｆ）１００ｎＭ ＰＦ３６００による２４時間処置後のＭＣＦ１０Ａ細胞における増加したサイクリンＤ３−ＣＤＫ４およびサイクリンＤ３−ＣＤＫ６タンパク質相互作用。ＣＤＫ−サイクリン複合体は、ＣＤＫ４またはＣＤＫ６のいずれかに対する抗体を使用して免疫沈降した。偽免疫沈降のためにウサギＩｇＧを使用した（ＩｇＧ）。免疫沈降物およびインプット（Ｉｎｐ）におけるサイクリンＤ３およびＣＤＫレベルは、ウエスタンブロットによって決定した。

【発明を実施するための形態】

【0022】

本発明は、本発明の好まれる実施形態の次の詳細な説明および本明細書に含まれる実施例を参照することにより、より容易に理解することができる。本明細書で使用されている用語法は、単に特異的な実施形態の記載を目的としており、限定を意図しないことを理解されたい。本明細書に特に定義されていない限り、本明細書で使用されている用語法が、関連する技術分野で知られたその伝統的な意義を与えられるべきであることをさらに理解されたい。

【0023】

本明細書において、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、文脈がそれ以外を明らかに指示しない限り、複数形指示対象を含む。よって、例えば、「１つの細胞（a cell）」の参照は、１つまたは複数の細胞および当業者に知られたその均等物、等々を含む。同様に、単語「または（or）」は、文脈がそれ以外を明らかに指し示さない限り、「および（and）」を含むことを意図する。したがって、「ＡまたはＢを含む」は、Ａ、またはＢ、またはＡおよびＢを含むことを意味する。さらに、用語「含んでいる（including）」、ならびに「含む（includes）」および「含まれる（included）」等の他の関連形態の使用は、限定的ではない。

【0024】

用語「約」は、本明細書において、「およそ」または「ほぼ」と同様の意義を有する柔軟な単語である。用語「約」は、厳密さが要求されないが、むしろ企図された変動があることを指し示す。よって、本明細書において、用語「約」は、特に列挙されている値から１もしくは２標準偏差以内、または特に列挙されている値と比較して±で最大２０％、最大１５％、最大１０％、最大５％または最大４％、３％、２％もしくは１％の範囲を意味する。

【0025】

本明細書に記載されている本発明は、適宜、本明細書で特に開示されていないいずれかの要素（複数可）の非存在下で実施することができる。よって、例えば、本明細書における各例において、用語「を含む（comprising）」、「から本質的になる（consisting essentially of）」および「からなる（consisting of）」のいずれかは、残る２つの用語のどちらかに置き換えることができる。

【0026】

本明細書において、「阻害する」、「阻害」は、正常野生型レベルと比べた、標的タンパク質産物の活性の減少を指す。阻害は、標的酵素、好ましくは、ＣＤＫの活性の減少、より好ましくは、ＣＤＫ２の阻害に応答した、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６によって媒介されるリバウンドリン酸化の減少をもたらすことができる。一部の実施形態では、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６によって媒介されるリバウンドリン酸化は、１０％未満、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％減少する。

【0027】

ＣＤＫおよび関連セリン／スレオニンキナーゼは、細胞分裂および増殖の調節における必須機能を果たす重要な細胞酵素である。「ＣＤＫ阻害剤」は、１種または複数のＣＤＫタンパク質またはＣＤＫ／サイクリンキナーゼ複合体の活性を阻害するいずれかの化合物または薬剤を意味する。化合物または薬剤は、ＣＤＫタンパク質との直接的もしくは間接的相互作用により、リン酸化等のＣＤＫ活性を阻害することができる、または１種もしくは複数のＣＤＫ遺伝子の発現を防止するように作用することができる。好まれる実施形態では、ＣＤＫ阻害剤は、低分子ＣＤＫ阻害剤またはその薬学的に許容できる塩である。

【0028】

ＣＤＫ阻害剤は、幅広いＣＤＫを標的とする汎ＣＤＫ阻害剤、または特異的なＣＤＫ（複数可）を標的とする選択的ＣＤＫ阻害剤を含む。ＣＤＫ阻害剤は、オーロラＡ、オーロラＢ、Ｃｈｋ１、Ｃｈｋ２、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＧＳＴ−ＥＲＫ１、ＧＳＫ−３α、ＧＳＫ−３β、ＰＤＧＦＲ、ＴｒｋＡおよびＶＥＧＦＲ等、ＣＤＫに加えた標的に対する活性を有することができる。

【0029】

ＣＤＫ阻害剤は、アベマシクリブ（ＣＡＳ番号１２３１９２９−９７−７）、アルボシジブ（alvocidib）（すなわち、フラボピリドール；ＣＡＳ番号１４６４２６−４０−６）、ディナシクリブ（ＣＡＳ番号７７９３５３−０１−４）、インジチニブ（inditinib）（ＡＧＭ−１３０；ＣＡＳ番号１４５９２１６−１０−４）、ミルシクリブ（milciclib）（ＰＨＡ−８４８１２５；ＣＡＳ番号８０２５３９−８１−７）、パルボシクリブ（ＣＡＳ番号５７１１９０−３０−２）、リボシクリブ（ＣＡＳ番号１２１１４４１−９８−３）、ロスコビチン（セリシクリブ（seliciclib）；ＣＡＳ番号１８６６９２−４６−６）、ＡＴ７５１９（ＣＡＳ番号８４４４４２−３８−２）、ＡＺＤ５４３８（ＣＡＳ番号６０２３０６−２９−６）、ＢＭＳ−２６５２４６（ＣＡＳ番号５８２３１５−７２−８）、ＢＭＳ−３８７０３２（ＳＮＳ−０３２；ＣＡＳ番号３４５６２７−８０−７）、ＢＳ−１８１（ＣＡＳ番号１３９７２１９−８１−６）、ＦＮ−１５０１（ＣＡＳ番号１４２９５１５−５９−２）、ＪＮＪ−７７０６６２１（ＣＡＳ番号４４３７９７−９６−４）、Ｋ０３８６１（ＣＡＳ番号８５３２９９−０７−７）、ＭＫ−８７７６（ＣＡＳ番号８９１４９４−６３−６）、Ｐ２７６−００（ＣＡＳ番号９２０１１３−０３−７）、ＰＦ−０６８７３６００（ＣＡＳ番号２１８５８５７−９７−８）、ＰＨＡ−７９３８８７（ＣＡＳ番号７１８６３０−５９−２）、Ｒ５４７（ＣＡＳ番号７４１７１３−４０−６）、ＲＯ３３０６（ＣＡＳ番号８７２５７３−９３−８）およびＳＵ ９５１６（ＣＡＳ番号３７７０９０−８４−１）を含むがこれらに限定されない。

【0030】

汎ＣＤＫ阻害剤の例は、アルボシジブ、ディナシクリブ、ロスコビチン、ＡＴ７５１９、ＡＺＤ５４３８、ＢＭＳ−３８７０３２、Ｐ２７６−００、ＰＨＡ−７９３８８７、Ｒ５４７およびＳＵ ９５１６を含むがこれらに限定されない。選択的ＣＤＫ１阻害剤の非限定的な例は、ＲＯ３３０６である。ＣＤＫ１／２阻害剤の例は、ＢＭＳ−２６５２４６およびＪＮＪ−７７０６６２１を含むがこれらに限定されない。

【0031】

ＣＤＫ２阻害剤は、ＣＤＫ２の選択的または非選択的阻害剤であり得る。ＣＤＫ２阻害剤の例は、Ｋ０３８６１、ＰＦ−０６８７３６００、インジチニブ、ミルシクリブおよびＦＮ−１５０１を含むがこれらに限定されない。ＰＦ−０６８７３６００等の一部の化合物が、ＣＤＫ２阻害剤として同定され得るが、この命名は、他のＣＤＫに対する化合物の活性を限定するものではない。したがって、ＰＦ−０６８７３６００は、ＣＤＫ２を、例えば用量依存性様式で、有効に阻害することができ、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６を、一部の例ではこの場合も同様に用量依存性様式で、阻害することもできる（すなわち、ＣＤＫ２／４／６阻害剤として作用することができる）。本明細書における方法および組合せのそれぞれの一部の実施形態では、ＣＤＫ２阻害剤は、６−（ジフルオロメチル）−８−［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−メチルシクロペンチル］−２−｛［１−（メチルスルホニル）ピペリジン−４−イル］アミノ｝ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン（ＰＦ−０６８７３６００）、ミルシクリブ、インジチニブおよびＦＮ−１５０１、またはそれらの薬学的に許容できる塩からなる群から選択される。本明細書における方法および組合せのそれぞれの一部の実施形態では、ＣＤＫ２阻害剤は、６−（ジフルオロメチル）−８−［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−メチルシクロペンチル］−２−｛［１−（メチルスルホニル）ピペリジン−４−イル］アミノ｝ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン（ＰＦ−０６８７３６００）、インジチニブおよびＦＮ−１５０１、またはそれらの薬学的に許容できる塩からなる群から選択される。本明細書における方法および組合せのそれぞれの一部の実施形態では、ＣＤＫ２阻害剤は、ＰＦ−０６８７３６００またはその薬学的に許容できる塩である。

【0032】

選択的ＣＤＫ４／６阻害剤の例は、アベマシクリブ、リボシクリブ、パルボシクリブ、レロシクリブ（lerociclib）（ＣＡＳ番号１６２８２５６−２３−４）、トリラシクリブ（trilaciclib）（ＣＡＳ番号１３７４７４３−００−６）、ＳＨＲ−６３９０（ＣＡＳ番号２２７８６９２−３９−８）およびＢＰＩ−１６３５０（ＣＡＳ番号２４１２５５９−１９−２）、またはそれらの薬学的に許容できる塩を含むがこれらに限定されない。本明細書における方法および組合せのそれぞれの一部の実施形態では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、アベマシクリブ、リボシクリブ、パルボシクリブ、レロシクリブ、トリラシクリブ、ＳＨＲ−６３９０およびＢＰＩ−１６３５０、またはそれらの薬学的に許容できる塩からなる群から選択される。本明細書における方法および組合せのそれぞれの一部の実施形態では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、アベマシクリブ、リボシクリブおよびパルボシクリブ、またはそれらの薬学的に許容できる塩からなる群から選択される。

【0033】

本明細書における方法および組合せのそれぞれの一部の実施形態では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、パルボシクリブまたはその薬学的に許容できる塩である。

【0034】

ＣＤＫ４／６阻害剤の好まれる例およびそれらの構造を下に提示する：

【0035】

パルボシクリブ（ＰＤ−０３３２９９１；ＩＢＲＡＮＣＥ（登録商標））は、内分泌療法と組み合わせたホルモン受容体陽性、ＨＥＲ２陰性転移性乳がんの処置のための、Ｐｆｉｚｅｒによって販売される選択的ＣＤＫ４／６阻害剤である。パルボシクリブの構造を次に示す：

【0036】

【化1】

【0037】

アベマシクリブ（ＬＹ２８３５２１９；ＶＥＲＺＥＮＩＯ（登録商標））は、内分泌療法と組み合わせたホルモン受容体陽性、ＨＥＲ２陰性転移性乳がんの処置のための、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙによって販売される選択的ＣＤＫ４／６阻害剤である。アベマシクリブの構造を次に示す：

【0038】

【化2】

【0039】

リボシクリブ（Ｌｅｅ０１１；ＫＩＳＱＡＬＩ（登録商標））は、内分泌療法と組み合わせたホルモン受容体陽性、ＨＥＲ２陰性転移性乳がんの処置のための、Ｎｏｖａｒｔｉｓによって販売される選択的ＣＤＫ４／６阻害剤である。リボシクリブの構造を次に示す：

【0040】

【化3】

【0041】

レロシクリブは、複数の腫瘍学徴候における他の標的化療法と組み合わせた使用のための、Ｇ１ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって臨床開発中の経口の選択的ＣＤＫ４／６阻害剤である。レロシクリブは、次の構造を有する：

【0042】

【化4】

【0043】

トリラシクリブは、化学療法を受ける患者のための骨髄保存（myelopreservation）療法における使用のための、Ｇ１ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって臨床開発中の選択的ＣＤＫ４／６阻害剤である。トリラシクリブは、化学療法に先立ち投与される短時間作用型静脈内ＣＤＫ４／６阻害剤であり、現在、臨床的に評価されている。トリラシクリブは、次の構造を有する：

【0044】

【化5】

【0045】

ＳＨＲ−６３９０は、Ｊｉａｎｇｓｕ ＨｅｎｇＲｕｉ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｏ．、Ｌｔｄ．によって開発されている選択的ＣＤＫ４／６阻害剤である。ＳＨＲ−６３９０は現在、ＨＲ陽性およびＨＥＲ２陰性進行型乳がんを有する患者において、レトロゾールまたはアナストロゾールまたはフルベストラントと組み合わせて調査されている。様々な他のピリミジンに基づく薬剤が、過剰増殖性疾患の処置のために開発された。ＴａｖａｒｅｓおよびＳｔｒｕｍによって出願され、Ｇ１ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓに譲渡された、米国特許第８，８２２，６８３号；同第８，５９８，１９７号；同第８，５９８，１８６号；同第８，６９１，８３０号；同第８，８２９，１０２号；同第８，８２２，６８３号；同第９，１０２，６８２号；同第９，４９９，５６４号；同第９，４８１，５９１号；および同第９，２６０，４４２号は、次式（文献中で定義された変数による）のものを含むＮ−（ヘテロアリール）−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−アミンサイクリン依存性キナーゼ阻害剤のクラスについて記載する：

【0046】

【化6】

【0047】

ＢＰＩ−１６３５０は、Ｂｅｔｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発されている選択的ＣＤＫ４／６阻害剤である。ＢＰＩ−１６３５０は現在、局所的進行型または転移性固形腫瘍のための第Ｉ相用量漸増研究において調査されている。ＢＰＩ−１６３５０は、次の構造を有する：

【0048】

【化7】

【0049】

ＣＤＫ２阻害剤の好まれる例およびそれらの構造を下に提示する：
本明細書においてＰＦ−０６８７３６００またはＰＦ３６００とも称される、化合物６−（ジフルオロメチル）−８−［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−メチルシクロペンチル］−２−｛［１−（メチルスルホニル）−ピペリジン−４−イル］アミノ｝ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オンは、Ｐｆｉｚｅｒによって開発中のＣＤＫ２阻害剤であり、これは、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６も阻害する。ＰＦ３６００の化学構造は、下に同定されており、参照により本明細書に組み込む米国特許第１０，２３３，１８８号においてより十分に記載されている：

【0050】

【化8】

【0051】

他のＣＤＫ、例えば、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６をさらに阻害することができる追加的なＣＤＫ２阻害剤は、ミルシクリブ、ＦＮ−１５０１およびインジチニブ（ＡＧＭ−１３０）を含むがこれらに限定されない。化学構造を下に提示する：

【0052】

【化9】

【0053】

他に指示がなければ、低分子ＣＤＫ阻害剤、特に、低分子ＣＤＫ２阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤についての本明細書におけるあらゆる参照は、その薬学的に許容できる塩、溶媒和化合物、水和物および複合体、ならびにその薬学的に許容できる塩の溶媒和化合物、水和物および複合体の参照を含み、そのアモルファスおよび多形性形態、立体異性体ならびに同位体標識バージョンを含む。

【0054】

本明細書に記載されている方法は、それを必要とする対象に、選択的または非選択的ＣＤＫ２阻害剤であり得るＣＤＫ２阻害剤と、典型的に選択的ＣＤＫ４／６阻害剤であるＣＤＫ４／６阻害剤とを投与するステップを含む併用療法に関する。明確にするために、本明細書に記載されている方法および組合せにおいて、ＣＤＫ２阻害剤（すなわち、第１のＣＤＫ阻害剤）およびＣＤＫ４／６阻害剤（すなわち、第２のＣＤＫ阻害剤）が、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６を阻害する、２個の別々のおよび別個の化合物であって、単一の化合物ではないことが理解されるであろう。

【0055】

一実施形態では、本発明は、疾患または障害、好ましくは、がんを処置するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量のＣＤＫ２阻害剤および治療有効量のＣＤＫ４／６阻害剤を投与するステップを含む方法を提供する。

【0056】

別の実施形態では、本発明は、疾患または障害、好ましくは、がんを処置するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量のＣＤＫ２阻害剤および治療有効量のＣＤＫ４／６阻害剤を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、ＣＤＫ２阻害剤が投与され、続いて、ＣＤＫ４／６阻害剤が投与される。

【0057】

別の実施形態では、本発明は、疾患または障害、好ましくは、がんを処置するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量のＣＤＫ２／４／６阻害剤および治療有効量のＣＤＫ４／６阻害剤を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、ＣＤＫ２／４／６阻害剤が投与され、続いて、ＣＤＫ４／６阻害剤が投与される。

【0058】

本明細書における方法および組合せのそれぞれの一部の実施形態では、治療有効量のＣＤＫ２阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤は、一緒になって、がん等の疾患または障害の処置において有効である。

【0059】

本明細書における方法および組合せのそれぞれの一部の実施形態では、他に指示がなければ、ＣＤＫ２阻害剤は、ＣＤＫ４／６をさらに阻害することができる（すなわち、ＣＤＫ２／４／６阻害剤）。

【0060】

別の実施形態では、本発明は、疾患または障害、好ましくは、がんを処置するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量のＣＤＫ２阻害剤および治療有効量のＣＤＫ４／６阻害剤を投与するステップを含み、ＣＤＫ４／６阻害剤が、ＣＤＫ２の阻害に応答した、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６によって媒介されるリバウンドリン酸化を防止する、方法を提供する。

【0061】

別の実施形態では、本発明は、疾患または障害、好ましくは、がんを処置するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量のＣＤＫ２阻害剤および治療有効量のＣＤＫ４／６阻害剤を投与するステップを含み、ＣＤＫ４／６阻害剤の量が、ＣＤＫ２の阻害に応答した、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６によって媒介されるリバウンドリン酸化の防止、改善または低下に有効である、方法を提供する。

【0062】

別の実施形態では、本発明は、疾患または障害、好ましくは、がんを処置するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量のＣＤＫ２阻害剤および治療有効量のＣＤＫ４／６阻害剤を投与するステップを含み、ＣＤＫ４／６阻害剤が、ＣＤＫ２の阻害に応答した、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６によって媒介されるリバウンドリン酸化を防止する、方法を提供する。一部の実施形態では、ＣＤＫ２阻害剤が投与され、続いて、ＣＤＫ４／６阻害剤が投与される。

【0063】

別の実施形態では、本発明は、疾患または障害、好ましくは、がんを処置するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量のＣＤＫ２阻害剤および治療有効量のＣＤＫ４／６阻害剤を投与するステップを含み、ＣＤＫ４／６阻害剤の量が、ＣＤＫ２の阻害に応答した、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６によって媒介されるリバウンドリン酸化の改善または低下に有効である、方法を提供する。一部の実施形態では、ＣＤＫ２阻害剤が投与され、続いて、ＣＤＫ４／６阻害剤が投与される。

【0064】

別の実施形態では、本発明は、疾患または障害、好ましくは、がんを処置するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量のＣＤＫ２／４／６阻害剤および治療有効量のＣＤＫ４／６阻害剤を投与するステップを含み、ＣＤＫ４／６阻害剤が、ＣＤＫ２の阻害に応答した、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６によって媒介されるリバウンドリン酸化を防止する、方法を提供する。一部の実施形態では、ＣＤＫ２／４／６阻害剤が投与され、続いて、ＣＤＫ４／６阻害剤が投与される。

【0065】

別の実施形態では、本発明は、疾患または障害、好ましくは、がんを処置するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量のＣＤＫ２／４／６阻害剤および治療有効量のＣＤＫ４／６阻害剤を投与するステップを含み、ＣＤＫ４／６阻害剤の量が、ＣＤＫ２／４／６阻害剤による、ＣＤＫ２の阻害に応答した、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６によって媒介されるリバウンドリン酸化の改善または低下に有効である、方法を提供する。一部の実施形態では、ＣＤＫ２／４／６阻害剤が投与され、続いて、ＣＤＫ４／６阻害剤が投与される。

【0066】

一実施形態では、本発明は、疾患または障害、好ましくは、がんを処置するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量のＣＤＫ２阻害剤、ならびにパルボシクリブ、リボシクリブおよびアベマシクリブ、またはそれらの薬学的に許容できる塩からなる群から選択される治療有効量のＣＤＫ４／６阻害剤を投与するステップを含む方法を提供する。好まれる実施形態では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、パルボシクリブまたはその薬学的に許容できる塩である。

【0067】

一実施形態では、本発明は、疾患または障害、好ましくは、がんを処置するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量のＣＤＫ２阻害剤であって、ＰＦ−０６８７３６００またはその薬学的に許容できる塩であるＣＤＫ２阻害剤と、パルボシクリブ、リボシクリブおよびアベマシクリブ、またはそれらの薬学的に許容できる塩からなる群から選択される治療有効量のＣＤＫ４／６阻害剤とを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、ＰＦ−０６８７３６００またはその薬学的に許容できる塩が投与され、続いて、ＣＤＫ４／６阻害剤が投与される。

【0068】

別の実施形態では、本発明は、疾患または障害、好ましくは、がんを処置するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量のＣＤＫ２阻害剤であって、ＰＦ−０６８７３６００またはその薬学的に許容できる塩であるＣＤＫ２阻害剤と、治療有効量のＣＤＫ４／６阻害剤であって、パルボシクリブまたはその薬学的に許容できる塩であるＣＤＫ４／６阻害剤とを投与するステップを含む方法を提供する。

【0069】

本発明は、ＣＤＫ２阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤、またはそれらの薬学的に許容できる塩を、単独で、または１種もしくは複数の他の治療剤もしくは緩和剤と組み合わせて投与するステップを含む、治療上の方法および使用をさらに提供する。

【0070】

本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、疾患または障害は、異常な細胞成長、特に、がんである。一態様では、本発明は、対象における異常な細胞成長の処置のための方法であって、対象に、治療有効量のＣＤＫ２阻害剤および治療有効量のＣＤＫ４／６阻害剤を投与するステップを含む方法を提供する。頻出する実施形態では、異常な細胞成長は、がんである。別の態様では、本発明は、対象におけるがんの処置のための方法であって、対象に、ある量のＣＤＫ２阻害剤およびある量のＣＤＫ４／６阻害剤を、ある量の追加的な抗がん剤とさらに組み合わせて投与するステップを含み、これらの量が、一緒になって、前記がんの処置において有効である、方法を提供する。

【0071】

さらに別の態様では、本発明は、対象におけるがん細胞増殖を阻害するための方法であって、対象に、ＣＤＫ２阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤を、がん細胞増殖の阻害に有効な量で投与するステップを含む方法を提供する。

【0072】

別の態様では、本発明は、対象におけるがん細胞侵襲性を阻害するための方法であって、対象に、ＣＤＫ２阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤を、がん細胞侵襲性の阻害に有効な量で投与するステップを含む方法を提供する。

【0073】

別の態様では、本発明は、対象におけるがん細胞においてアポトーシスを誘導するための方法であって、対象に、ＣＤＫ２阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤を、アポトーシスの誘導に有効な量で投与するステップを含む方法を提供する。

【0074】

別の態様では、本発明は、それを必要とする対象におけるがんの処置における使用のための、ＣＤＫ２阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤を含む組合せを提供する。一部の斯かる実施形態では、ＣＤＫ２阻害剤は、ＣＤＫ４／６をさらに阻害する（すなわち、ＣＤＫ２／４／６阻害剤）。

【0075】

別の態様では、本発明は、それを必要とする対象におけるがんの処置における、ＣＤＫ２阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤を含む組合せの使用を提供する。

【0076】

別の態様では、本発明は、それを必要とする対象におけるがんの処置のための医薬の製造における、ＣＤＫ２阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤を含む組合せの使用を提供する。

【0077】

本明細書に提供される方法、組合せおよび使用のそれぞれの好まれる実施形態では、ＣＤＫ２阻害剤は、ＰＦ−０６８７３６００またはその薬学的に許容できる塩である。本明細書に提供される方法、組合せおよび使用のそれぞれの好まれる実施形態では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、パルボシクリブまたはその薬学的に許容できる塩である。本明細書に提供される方法、組合せおよび使用の特に好まれる組合せにおいて、ＣＤＫ２阻害剤は、ＰＦ−０６８７３６００またはその薬学的に許容できる塩であり、ＣＤＫ４／６阻害剤は、パルボシクリブまたはその薬学的に許容できる塩である。

【0078】

本明細書に提供される方法、組合せおよび使用のそれぞれの一部の実施形態では、がんは、例えば、増加したサイクリンＥ発現が原因の、ＣＤＫ４／６阻害剤に対する抵抗性によって特徴付けられる。本明細書に提供される方法、組合せおよび使用のそれぞれの他の実施形態では、がんは、腫瘍細胞増殖に対するＣＤＫ２依存によって特徴付けられる。

【0079】

本明細書に提供される方法、組合せおよび使用のそれぞれの頻出する実施形態では、がんは、乳がん、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、前立腺がん、肺がん（ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、扁平上皮癌または腺癌を含む）、食道がん、頭頸部がん、結腸直腸がん、腎臓がん（ＲＣＣを含む）、肝臓がん（ＨＣＣを含む）、膵がん、胃（stomach）（すなわち、胃（gastric））がんおよび甲状腺がんからなる群から選択される。

【0080】

本明細書に提供される方法、組合せおよび使用のそれぞれのさらなる実施形態では、がんは、乳がん、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、前立腺がん、肺がん、食道がん、肝臓がん、膵がんおよび胃（stomach）がんからなる群から選択される。一部の斯かる実施形態では、がんは、腫瘍細胞増殖に対するＣＤＫ２依存によって特徴付けられる。本明細書に提供される方法の他の実施形態では、異常な細胞成長は、サイクリンＥ１（ＣＣＮＥ１）および／または（ＣＣＮＥ２）の増幅または過剰発現によって特徴付けられるがんである。本明細書に提供される方法、組合せおよび使用のそれぞれの一部の実施形態では、対象は、ＣＣＮＥ１および／またはＣＣＮＥ２の増幅または過剰発現によって特徴付けられるがんを有すると同定される。

【0081】

一部の実施形態では、がんは、乳がんおよび卵巣がんからなる群から選択される。一部の斯かる実施形態では、がんは、ＣＣＮＥ１および／またはＣＣＮＥ２の増幅または過剰発現によって特徴付けられる乳がんまたは卵巣がんである。一部の斯かる実施形態では、がんは、（ａ）乳がんもしくは卵巣がんである；（ｂ）ＣＣＮＥ１もしくはＣＣＮＥ２の増幅もしくは過剰発現によって特徴付けられる；または（ｃ）（ａ）および（ｂ）の両方である。

【0082】

一部の実施形態では、がんは、卵巣がんである。一部の斯かる実施形態では、卵巣がんは、ＣＣＮＥ１および／またはＣＣＮＥ２の増幅または過剰発現によって特徴付けられる。

【0083】

一部の実施形態では、がんは、乳がんである。一部の斯かる実施形態では、乳がんは、エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）および／またはプロゲステロン受容体陽性（ＰＲ＋）であり得るホルモン受容体陽性（ＨＲ＋）である。一部の実施形態では、乳がんは、ホルモン受容体陰性（ＨＲ−）である。一部の実施形態では、乳がんは、ヒト上皮成長因子受容体２陽性（ＨＥＲ２＋）である。一部の実施形態では、乳がんは、ヒト上皮成長因子受容体２陰性（ＨＥＲ２−）である。他の斯かる実施形態では、乳がんは、ＨＲ陽性、ＨＥＲ２陰性乳がん；ＨＲ陽性、ＨＥＲ２陽性乳がん；ＨＲ陰性、ＨＥＲ２陽性乳がん；三種陰性乳がん（ＴＮＢＣ）；または炎症性乳がんである。一部の実施形態では、乳がんは、内分泌抵抗性乳がん、トラスツズマブ抵抗性乳がん、またはＣＤＫ４／６阻害に対する一次（primary）もしくは獲得抵抗性を実証する乳がんである。一部の実施形態では、乳がんは、進行型または転移性乳がんである。前述のそれぞれの一部の実施形態では、乳がんは、ＣＣＮＥ１および／またはＣＣＮＥ２の増幅または過剰発現によって特徴付けられる。

【0084】

一部の実施形態では、ＣＤＫ２阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤は、第一選択療法として投与することができる。他の実施形態では、ＣＤＫ２阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤は、第二（またはそれ以降の）選択療法として投与される。一部の実施形態では、ＣＤＫ２阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤は、内分泌療法剤による処置後に、第二（またはそれ以降の）選択療法として投与される。一部の実施形態では、ＣＤＫ２阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤は、内分泌療法剤による処置後に、第二（またはそれ以降の）選択療法として投与される。一部の実施形態では、ＣＤＫ２阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤は、逐次に投与され、それによると、ＣＤＫ２阻害剤は、０の時点で投与され、続いて、１の時点でＣＤＫ４／６阻害剤が投与される。一部の実施形態では、ＣＤＫ阻害剤は、例えば、タキサンまたは白金剤を含む１種または複数の化学療法レジメンによる処置後に、第二（またはそれ以降の）選択療法として投与される。一部の実施形態では、ＣＤＫ阻害剤は、例えばＨＥＲ２標的化剤、例えば、トラスツズマブによる処置後に、第二（またはそれ以降の）選択療法として投与される。

【0085】

用語「治療有効量」は、本明細書において、処置されている障害の症状のうち１種または複数をある程度軽減するであろう、投与されている化合物の当該量を指す。がんの処置の参照において、治療有効量は、（１）腫瘍のサイズを低下させる、（２）腫瘍転移を阻害する（すなわち、ある程度遅くする、好ましくは、停止する）、（３）腫瘍成長もしくは腫瘍侵襲性をある程度阻害する（すなわち、ある程度遅くする、好ましくは、停止する）、および／または（４）がんに関連する１種もしくは複数の徴候もしくは症状をある程度軽減する（または好ましくは、排除する）効果を有する当該量を指す。

【0086】

本明細書において、「対象」は、ヒトまたは動物対象を指す。ある特定の好まれる実施形態では、対象は、ヒトである。

【0087】

用語「処置すること」は、本明細書において、他に指示がなければ、斯かる用語が適用される障害もしくは状態または斯かる障害もしくは状態の１種もしくは複数の症状を反転すること、それを緩和すること、その進行を阻害することまたはそれを防止することを意味する。用語「処置」は、本明細書において、他に指示がなければ、直ぐ上で「処置すること」が定義されている通りの、処置する行為を指す。用語「処置すること」は、対象のアジュバントおよびネオアジュバント処置も含む。

【0088】

用語「異常な細胞成長」および「過剰増殖性障害」は、本願で互換的に使用されている。

【0089】

「異常な細胞成長」は、本明細書において、他に指示がなければ、正常な調節機構に依存しない細胞成長を指す（例えば、接触阻害の損失）。異常な細胞成長は、良性（非がん性）または悪性（がん性）であり得る。

【0090】

用語「追加的な抗がん剤」は、本明細書において、次のクラスに由来する薬剤等、がんの処置において使用されるまたは使用され得る、本発明のＣＤＫ２およびＣＤＫ４／６阻害剤の組合せ以外のいずれか１種または複数の治療剤を意味する：有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗薬、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼＩおよびＩＩ阻害剤、植物アルカロイド、ホルモン剤およびアンタゴニスト、成長因子阻害剤、放射線照射、タンパク質チロシンキナーゼおよび／またはセリン／スレオニンキナーゼの阻害剤、細胞周期阻害剤、生物学的応答修飾因子、酵素阻害剤、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体、細胞傷害性薬剤、ならびに免疫腫瘍学的（immuno-oncology）薬剤。

【0091】

本明細書において、「がん」は、いずれかの悪性および／もしくは侵襲性成長、または異常な細胞成長に起因する腫瘍を指す。がんは、自身を形成する細胞の型にちなんで命名された固形腫瘍、血液、骨髄またはリンパ系のがんを含む。固形腫瘍の例は、肉腫および癌腫を含む。血液のがんは、白血病、リンパ腫および骨髄腫を含むがこれらに限定されない。がんは、身体の特異的な部位に起源をもつ原発性がん、それが開始した場所から身体の他の部分へと拡散した転移性がん、寛解後の本来の原発性がんからの再発、および後のがんとは異なる型の以前のがんの病歴を有する人物における新たな原発性がんである第２の原発性がんも含む。

【0092】

ＣＤＫ阻害剤の投与、好ましくは、ＣＤＫ２阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤の投与は、作用部位への阻害剤の送達を可能にするいずれかの方法によって投与することができる。これらの方法は、経口経路、十二指腸内経路、非経口的注射（静脈内、皮下、筋肉内、血管内または注入を含む）、外用および直腸投与を含む。ＣＤＫ２阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤は、逐次に、同時発生的にまたは同時に投与することができる。用語「逐次」または「逐次に」は、単独または医薬中のいずれかでの、次々に為される、併用療法の各治療剤の投与を指し、各治療剤は、いずれかの順序で投与することができる。併用療法における治療剤が、異なる剤形である場合、例えば、ある１種の薬剤が錠剤であり、別の薬剤が滅菌された液体である場合、および／または薬剤が、異なる投薬スケジュールに従って投与される場合、例えば、ある１種の薬剤が毎日投与され、第２の薬剤が毎週等、より低い頻度で投与される場合、逐次投与は、特に有用となることができる。用語「同時発生的に」は、単独または別々の医薬中のいずれかでの、本発明の併用療法における各治療剤の投与を指し、第２の治療剤は、第１の治療剤の直後に投与されるが、治療剤は、いずれかの順序で投与することができる。用語「同時」は、同じ医薬における本発明の併用療法の各治療剤の投与を指す。

【0093】

投薬量レジメンは、最適な所望の応答をもたらすように調整することができる。例えば、単一ボーラスを投与することができる、いくつかの分割用量を経時的に投与することができる、または治療状況の危急によって指し示される通りに、用量を比例的に低下もしくは増加させることができる。投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬量単位形態で非経口的組成物を製剤化することは特に有利である。投薬量単位形態は、本明細書において、処置されるべき哺乳類対象のための単位投薬量として適する物理的に別々の単位を指す；各単位は、要求される薬学的担体と共同して所望の治療効果を生じるように計算された所定の含量の活性化合物、例えば、ＣＤＫ２阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤を含有する。投薬量単位形態の詳細は、（ａ）化学療法剤の特有の特徴および達成されるべき特定の治療または予防効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の処置のための斯かる活性化合物の配合の技術分野における固有の限界によって決定され、これらに直接依存する。

【0094】

よって、当業者であれば、本明細書に提供される開示に基づき、用量および投薬レジメンが、治療技術分野でよく知られた方法に従って調整されることを認めるであろう。すなわち、最大耐量を容易に確立することができ、患者に検出可能な治療利益をもたらすための各薬剤の投与に関する時間的要求と同様に、患者に検出可能な治療利益をもたらす有効量を決定することもできる。したがって、ある特定の用量および投与レジメンが本明細書で例証されているが、これらの例は、本発明の実施において対象にもたらされ得る用量および投与レジメンを決して限定しない。

【0095】

投薬量の値が、緩和されるべき状態の種類および重症度に伴い変動することがあり、単一または複数用量を含むことができることに留意されたい。いずれか特定の対象のために、特異的な投薬量レジメンが、個々の必要および組成物を投与するまたはその投与を監督する人物の専門家判断に従って経時的に調整されるべきであること、また、本明細書に示す投薬量範囲が、単なる例示であり、請求されている組成物の範囲または実施の限定を意図しないことをさらに理解されたい。例えば、用量は、毒性効果および／または研究室検査値等の臨床効果を含むことができる薬物動態または薬力学パラメータに基づき調整することができる。よって、本発明は、当業者によって決定される通りの患者内用量漸増を包含する。化学療法剤の投与に適切な投薬量およびレジメンの決定は、関連する技術分野でよく知られており、本明細書に開示されている教示が提供されれば、当業者によって包含されることが理解されるであろう。

【0096】

投与されるＣＤＫ２阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤の量は、処置されている対象、障害または状態の重症度、投与率、化合物の体内動態（disposition）、および処方医の裁量に依存するであろう。しかし、有効投薬量は典型的に、単一または分割用量において、１日当たり体重１ｋｇ当たり約０．００１〜約１００ｍｇ、好ましくは、約０．０１〜約３５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内である。７０ｋｇのヒトに関して、これは、約０．０７〜約７０００ｍｇ／日、好ましくは、約０．７〜約２５００ｍｇ／日に達するであろう。一部の例では、前述の範囲の下限を下回る投薬量レベルは、十分過ぎるものであり得るが、他の場合では、いかなる有害副作用を引き起こすこともなく、さらにより多い用量を使用することができ、斯かるより多い用量は典型的に、１日を通した投与のために、いくつかのより少ない用量へと分割される。好まれる一実施形態では、有効投薬量は、単一または分割用量において、１日当たり体重１ｋｇ当たり約０．００１〜約１００ｍｇ、好ましくは、約１〜約３５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内である。７０ｋｇのヒトに関して、これは、約０．０５〜約７ｇ／日、好ましくは、約０．１〜約２．５ｇ／日に達するであろう。一部の例では、前述の範囲の下限を下回る投薬量レベルは、十分過ぎるものであり得るが、他の場合では、いかなる有害副作用を引き起こすこともなく、さらにより多い用量を用いることができ、ただし、斯かるより多い用量は先ず、１日を通した投与のためにいくつかの少ない用量へと分割されるものとする。一部の場合では、前述の投薬量の例は、ＣＤＫ２阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤の組合せのための投薬量範囲を記載することができる。代替実施形態では、前述の投薬量の例は、個々にＣＤＫ２阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤のための投薬量範囲を記載することができる。

【0097】

好まれる一実施形態では、ＣＤＫ４／６阻害剤の治療有効量または投薬量は、ＣＤＫ２阻害剤によるＣＤＫ２の阻害に応答した、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６によって媒介されるリバウンドリン酸化の防止に十分な投薬量であり得る。

【0098】

本明細書において、「薬学的に許容できる担体」は、生物に有意な刺激作用を引き起こさず、投与されるＣＤＫ２阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤の生物学的活性および特性を抑止しない担体または希釈剤を指す。

【0099】

薬学的に許容できる担体は、いずれかの従来の薬学的担体または賦形剤を含むことができる。担体および／または賦形剤の選択は、大いに、投与機序、溶解性および安定性における担体または賦形剤の効果、ならびに剤形の性質等の因子に依存するであろう。

【0100】

適した薬学的担体は、不活性希釈剤またはフィラー、水および様々な有機溶媒（水和物および溶媒和化合物等）を含む。医薬組成物は、所望に応じて、調味料、結合剤、賦形剤等の追加的な成分を含有することができる。よって、経口投与のため、デンプン、アルギン酸およびある特定の複合ケイ酸塩等の様々な崩壊剤ならびにスクロース、ゼラチンおよびアカシア等の結合薬剤と共に、クエン酸等の様々な賦形剤を含有する錠剤を用いることができる。賦形剤の限定しない例は、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプンの種類、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油ならびにポリエチレングリコールを含む。その上、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルク等の潤滑剤は多くの場合、打錠目的に有用である。同様の種類の固体組成物は、軟および硬充填ゼラチンカプセルにおいて用いることもできる。したがって、材料の非限定的な例は、ラクトースまたは乳糖および高分子量ポリエチレングリコールを含む。水性懸濁液またはエリキシル剤が、経口投与に所望される場合、その中にある活性化合物は、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリンまたはこれらの組合せ等の希釈剤と共に、様々な甘味料または調味剤、着色物質または色素および所望に応じて、乳化剤または懸濁剤と組み合わせることができる。

【0101】

医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセル、丸剤、粉末、徐放製剤、溶液、懸濁液として経口投与に、滅菌溶液、懸濁液もしくはエマルションとして非経口的注射に、軟膏もしくはクリームとして外用投与に、または坐剤として直腸投与に適した形態であり得る。医薬組成物は、正確な投薬量の単一投与に適した単位剤形であり得る。

【0102】

例示的な非経口的投与形態は、滅菌水性溶液、例えば、水性プロピレングリコールまたはデキストロース溶液における活性化合物の溶液または懸濁液を含む。斯かる剤形は、所望に応じて適宜緩衝することができる。

【0103】

本発明の化合物、すなわち、本明細書に記載されているＣＤＫ２およびＣＫＤ４／６阻害剤の送達に適した医薬組成物、ならびにそれらの調製のための方法は、当業者には容易に明らかとなるであろう。斯かる組成物およびそれらの調製のための方法は、例えば、その開示全体を参照により本明細書に組み込む、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１９版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５）に見出すことができる。

【0104】

ＣＤＫ２およびＣＫＤ４／６阻害剤は、経口投与することができる。経口投与は、化合物が胃腸管に進入できるような嚥下が関与し得る、または化合物が口から直接的に血流に進入する頬側もしくは舌下投与を用いることができる。経口投与に適した製剤は、錠剤、微粒子、液体または粉末を含有するカプセル、薬用キャンディー（液体充填型を含む）、チューズ、多微粒子およびナノ微粒子、ゲル、固溶体、リポソーム、フィルム（粘膜付着性を含む）、オビュール（ovule）等の固体製剤、スプレー、ならびに液体製剤を含む。

【0105】

液体製剤は、懸濁液、溶液、シロップおよびエリキシル剤を含む。斯かる製剤は、軟または硬カプセル中のフィラーとして使用することができ、典型的に、担体、例えば、水、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、メチルセルロースまたは適した油、ならびに１種または複数の乳化剤および／または懸濁剤を含む。液体製剤は、例えば、小袋から得た固体の復元によって調製することもできる。

【0106】

ＣＤＫ２およびＣＫＤ４／６阻害剤は、その開示全体を参照により本明細書に組み込む、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐａｔｅｎｔｓ、１１（６）、９８１〜９８６、ＬｉａｎｇおよびＣｈｅｎ著（２００１）に記載されている剤形等、急速溶解、急速崩壊剤形において使用することもできる。

【0107】

錠剤剤形に関して、用量に依存して、薬物は、剤形の１ｗｔ％〜８０ｗｔ％、より典型的には、剤形の５ｗｔ％〜６０ｗｔ％を構成することができる。薬物に加えて、錠剤は一般に、崩壊剤を含有する。崩壊剤の例は、デンプングリコール酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、微結晶性セルロース、低級アルキル置換ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、アルファ化デンプンおよびアルギン酸ナトリウムを含む。一般に、崩壊剤は、剤形の１ｗｔ％〜２５ｗｔ％、好ましくは、５ｗｔ％〜２０ｗｔ％を占めるであろう。

【0108】

結合剤は一般に、錠剤製剤への粘着性品質の付与に使用される。適した結合剤は、微結晶性セルロース、ゼラチン、糖、ポリエチレングリコール、天然および合成ゴム、ポリビニルピロリドン、アルファ化デンプン、ヒドロキシプロピルセルロースならびにヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む。錠剤は、ラクトース（一水和物、噴霧乾燥一水和物、無水物その他）、マンニトール、キシリトール、デキストロース、スクロース、ソルビトール、微結晶性セルロース、デンプンおよび二塩基性リン酸カルシウム二水和物等の希釈剤を含有することもできる。

【0109】

錠剤は、また、ラウリル硫酸ナトリウムおよびポリソルベート８０等の表面活性剤、ならびに二酸化ケイ素およびタルク等の流動促進剤を含んでいてもよい。存在する場合、表面活性剤は典型的に、錠剤の０．２ｗｔ％〜５ｗｔ％の量であり、流動促進剤は典型的に、錠剤の０．２ｗｔ％〜１ｗｔ％である。錠剤は、また、一般に、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリルフマル酸ナトリウム（sodium stearyl fumarate）、およびステアリン酸マグネシウムとラウリル硫酸ナトリウムの混合物等の潤滑剤を含有する。潤滑剤は一般に、錠剤の０．２５ｗｔ％〜１０ｗｔ％、好ましくは、０．５ｗｔ％〜３ｗｔ％の量で存在する。他の従来成分は、抗酸化剤、着色剤、調味剤、保存料および味覚遮蔽（taste-masking）剤を含む。例示的な錠剤は、最大約８０ｗｔ％の薬物、約１０ｗｔ％〜約９０ｗｔ％の結合剤、約０ｗｔ％〜約８５ｗｔ％の希釈剤、約２ｗｔ％〜約１０ｗｔ％の崩壊剤および約０．２５ｗｔ％〜約１０ｗｔ％の潤滑剤を含有する。

【0110】

錠剤ブレンドを、直接的にまたはローラーによって圧縮して、錠剤を形成することができる。錠剤ブレンドまたはブレンドの部分を、その代わりに、打錠前に湿式、乾式もしくは溶融造粒する、溶融凝結するまたは押し出すことができる。最終製剤は、１または複数の層を含むことができ、コーティングされていてもコーティングされていなくてもよい；またはカプセル封入されていてよい。錠剤の製剤は、その開示全体を参照により本明細書に組み込む、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ、１巻」、Ｈ．ＬｉｅｂｅｒｍａｎおよびＬ．Ｌａｃｈｍａｎ著、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎ．Ｙ．、Ｎ．Ｙ．、１９８０（ＩＳＢＮ ０−８２４７−６９１８−Ｘ）に詳細に記述されている。経口投与のための固体製剤は、即時および／または修飾放出となるように製剤化することができる。修飾放出製剤は、遅延、持続、パルス（pulsed）、制御、標的化およびプログラムされた放出を含む。適した修飾放出製剤は、米国特許第６，１０６，８６４号に記載されている。高エネルギー分散および浸透圧およびコーティング粒子等、他の適した放出技術の詳細は、Ｖｅｒｍａら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｏｎ−ｌｉｎｅ、２５（２）、１〜１４（２００１）に見出すことができる。制御された放出を達成するためのチューインガムの使用は、ＷＯ ００／３５２９８に記載されている。これらの参考文献の開示全体を参照により本明細書に組み込む。

【0111】

本発明のＣＤＫ２およびＣＤＫ４／６阻害剤は、血流中、筋肉中または内臓中に直接的に投与することもできる。非経口的投与に適した手段は、静脈内、動脈内、腹腔内、くも膜下腔内、脳室内（intraventricular）、尿道内（intraurethral）、胸骨内（intrasternal）、頭蓋内、筋肉内および皮下を含む。非経口的投与に適したデバイスは、有針（マイクロニードルを含む）注射器、無針注射器および注入技法を含む。

【0112】

非経口的製剤は典型的に、塩、炭水化物および緩衝剤（好ましくは、３〜９のｐＨにするための）等の賦形剤を含有することができる水性溶液であるが、一部の適用のため、滅菌非水性溶液として、または滅菌パイロジェンフリーの水等の適した媒体と併せて使用されるべき乾燥形態として、より適切に製剤化することができる。

【0113】

滅菌条件下での、例えば、凍結乾燥による非経口的製剤の調製は、当業者によく知られた標準薬学的技法を使用して容易に達成することができる。非経口的溶液の調製において使用される本発明の化合物の溶解性は、溶解性増強剤の取り込み等、適切な製剤技法を使用して増加させることができる。非経口的投与のための製剤は、即時および／または修飾放出となるように製剤化することができる。修飾放出製剤は、遅延、持続、パルス、制御、標的化およびプログラムされた放出を含む。よって、本発明の化合物は、活性化合物の修飾放出をもたらす植え込まれたデポーとしての投与のために固体、半固体またはチキソトロピー液体として製剤化することができる。斯かる製剤の例は、薬物コーティングされたステントおよびＰＧＬＡマイクロスフェアを含む。

【0114】

本発明のＣＤＫ阻害剤は、皮膚または粘膜へと外用に、すなわち、真皮的または経皮的に投与することもできる。この目的のための典型的な製剤は、ゲル、ハイドロゲル、ローション、溶液、クリーム、軟膏、散布剤（dusting powder）、ドレッシング材、泡、フィルム、皮膚パッチ、オブラート（wafer）、インプラント、スポンジ、繊維、包帯およびマイクロエマルションを含む。リポソームを使用することもできる。典型的な担体は、アルコール、水、鉱物油、流動ワセリン、白色ワセリン、グリセリン、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールを含む。浸透増強薬が取り込まれてもよい；例えば、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ、８８（１０）、９５５〜９５８、ＦｉｎｎｉｎおよびＭｏｒｇａｎ著（１９９９年１０月）を参照されたい。外用投与の他の手段は、電気穿孔、イオン泳動、フォノフォレーシス、ソノフォレーシスおよびマイクロニードルまたは無針（例えば、Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ（商標）、Ｂｉｏｊｅｃｔ（商標）等）注射による送達を含む。これらの参考文献の開示全体を参照により本明細書に組み込む。外用投与のための製剤は、即時および／または修飾放出となるように製剤化することができる。修飾放出製剤は、遅延、持続、パルス、制御、標的化およびプログラムされた放出を含む。

【0115】

本発明のＣＤＫ阻害剤は、典型的には、乾燥粉末インヘラーからの乾燥粉末（単独で、または例えば、ラクトースとの乾燥ブレンドにおける混合物として、または混合構成成分粒子として、例えば、ホスファチジルコリン等のリン脂質と混合して）の形態で、または加圧された容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー（好ましくは、細かいミストを産生するための電気流体力学を使用したアトマイザー）もしくはネブライザーからのエアロゾルスプレーとして、当技術分野内で知られた適した推進剤を使用してまたは使用せず、鼻腔内にまたは吸入によって投与することもできる。鼻腔内使用のため、粉末は、生体接着剤、例えば、キトサンまたはシクロデキストリンを含むことができる。

【0116】

加圧された容器、ポンプ、スプレー、アトマイザーまたはネブライザーは、例えば、エタノール、水性エタノール、または活性の分散、可溶化もしくは放出延長に適した代替薬剤、溶媒としての推進剤（複数可）、およびソルビタントリオレエート、オレイン酸またはオリゴ乳酸（oligolactic acid）等の場合による界面活性物質を含む、本発明の化合物（複数可）の溶液または懸濁液を含有する。乾燥粉末または懸濁液製剤における使用に先立ち、薬物製品は、吸入による送達に適したサイズ（典型的には、５ミクロン未満）へと微粒子化される。これは、スパイラルジェット（spiral jet）製粉、流動床ジェット製粉、ナノ粒子を形成するための超臨界流体加工、高圧ホモジナイゼーションまたは噴霧乾燥等、いずれか適切な粉砕方法によって達成することができる。

【0117】

インヘラーまたは吸入器における使用のためのカプセル（例えば、ゼラチンまたはＨＰＭＣから作られた）、ブリスターおよびカートリッジは、ＣＤＫ阻害剤、ラクトースまたはデンプン等の適した粉末基剤、およびＩ−ロイシン、マンニトールまたはステアリン酸マグネシウム等の性能修飾因子の粉末ミックスを含有するように製剤化することができる。ラクトースは、無水、または一水和物の形態であり得、好ましくは後者である。他の適した賦形剤は、デキストラン、グルコース、マルトース、ソルビトール、キシリトール、フルクトース、スクロースおよびトレハロースを含む。

【0118】

細かいミストを産生するために電気流体力学を使用したアトマイザーにおける使用に適した溶液製剤は、発動当たり１μｇ〜２０ｍｇの本発明のＣＤＫ阻害剤を含有することができ、発動体積は、１μＬから１００μＬに変動し得る。典型的な製剤は、本発明の１種または複数のＣＤＫ阻害剤、プロピレングリコール、滅菌水、エタノールおよび塩化ナトリウムを含む。プロピレングリコールの代わりに使用することができる代替溶媒は、グリセロールおよびポリエチレングリコールを含む。メントールおよびレボメントール（levomenthol）等の適した香料、またはサッカリンもしくはサッカリンナトリウム等の甘味料を、吸入／鼻腔内投与に意図される本発明のこのような製剤に添加することができる。

【0119】

吸入／鼻腔内投与のための製剤は、例えば、ポリ（ＤＬ−乳酸−ｃｏ グリコール酸（ＰＧＬＡ）を使用して、即時および／または修飾放出となるように製剤化することができる。修飾放出製剤は、遅延、持続、パルス、制御、標的化およびプログラムされた放出を含む。

【0120】

乾燥粉末インヘラーおよびエアロゾルの場合、投薬量単位は、計量された量を送達するバルブを用いて決定される。本発明に従った単位は典型的に、好ましくは、所望の量の本発明のＣＤＫ２およびＣＤＫ４／６阻害剤を含有する、計量された用量または「パフ（puff）」を投与するように準備される。全体的な１日用量は、単一用量において、またはより通常では、１日を通した分割用量として投与することができる。

【0121】

本発明のＣＤＫ２およびＣＤＫ４／６阻害剤は、例えば、坐剤、ペッサリーまたは注腸の形態で、直腸または腟に投与することができる。カカオバターは、伝統的な坐剤の基剤であるが、必要に応じて様々な代替を使用することができる。直腸／腟投与のための製剤は、即時および／または修飾放出となるように製剤化することができる。修飾放出製剤は、遅延、持続、パルス、制御、標的化およびプログラムされた放出を含む。

【0122】

本発明のＣＤＫ２およびＣＤＫ４／６阻害剤は、典型的には、等張性のｐＨ調整された滅菌生理食塩水における微粒子化された懸濁液または溶液の液滴の形態で、眼または耳に直接的に投与することもできる。眼性および耳性投与に適した他の製剤は、軟膏、生分解性（例えば、吸収性ゲルスポンジ、コラーゲン）および非生分解性（例えば、シリコーン）インプラント、オブラート、レンズおよび微粒子、またはニオソーム（niosome）もしくはリポソーム等の小胞系を含む。架橋（crossed-linked）ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ヒアルロン酸、セルロース性ポリマー、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースもしくはメチルセルロース、またはヘテロ多糖ポリマー、例えば、ゲランガム（gelan gum）等のポリマーを、塩化ベンザルコニウム等の保存料と共に取り込むことができる。斯かる製剤は、イオン泳動によって送達することもできる。眼性／耳性投与のための製剤は、即時および／または修飾放出となるように製剤化することができる。修飾放出製剤は、遅延、持続、パルス、制御、標的化またはプログラムされた放出を含む。

【0123】

投与機序のいずれかにおける使用のための、それらの溶解性、溶解速度、味覚遮蔽、バイオアベイラビリティおよび／または安定性を改善するための、本発明のＣＤＫ２およびＣＤＫ４／６阻害剤ならびにそれらの適した誘導体またはポリエチレングリコール含有ポリマー。薬物−シクロデキストリン複合体は、例えば、大部分の剤形および投与経路に一般に有用であることが見出される。封入および非封入複合体の両方を使用することができる。薬物との直接的な複合体形成の代替として、シクロデキストリンは、補助的添加物、すなわち、担体、希釈剤または可溶化剤として使用することができる。アルファ−、ベータ−およびガンマ−シクロデキストリンが、これらの目的のために最も一般的に使用されており、これらの例は、それらの開示全体を参照により本明細書に組み込む、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９１／１１１７２、ＷＯ ９４／０２５１８およびＷＯ ９８／５５１４８に見出すことができる。

【0124】

例えば、がん等の特定の疾患または状態を処置する目的のため、ＣＤＫ２阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤の組合せを投与することが望ましい場合があるため、ＣＤＫ２阻害剤を含有する第１の医薬組成物およびＣＤＫ４／６阻害剤を含有する第２の医薬組成物を、組成物の同時投与に適したキットの形態で簡便に組み合わせることができることは本発明の範囲内である。よって、本発明のキットは、２種以上の別々の医薬組成物を含み、そのうち１種はＣＤＫ２阻害剤を含有し、そのうち別の１種はＣＤＫ４／６阻害剤を含有し、容器、分割ボトルまたは分割ホイルパケット等、前記組成物を別々に保持するための手段を含む。斯かるキットの例は、錠剤、カプセルその他の包装に使用される馴染み深いブリスターパックである。本発明のキットは、異なる剤形、例えば、経口および非経口の投与に、異なる投薬量間隔での別々の組成物の投与に、または互いに対する別々の組成物の用量設定に特に適する。服薬遵守を支援するために、キットは典型的に、投与のための指示を含み、記憶補助装置と共に提供され得る。

【0125】

一部の態様では、ＣＤＫ２阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤は、併用療法の一部である。本明細書において、用語「併用療法」は、１種または複数の追加的な薬学的なまたは薬用の薬剤（例えば、抗がん剤）と一緒であってもよい、ＣＤＫ２阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤の、逐次、同時発生的または同時のいずれかでの投与を指す。ある特定の腫瘍における本発明の組合せの治療有効性は、他の承認されたまたは実験的ながん治療法、例えば、放射線照射、外科手術、化学療法剤、標的化療法、腫瘍において調節不全される他のシグナリング経路を阻害する薬剤、およびＰＤ−１アンタゴニスト等の他の免疫増強剤との組合せによって増強され得る。

【0126】

本明細書に提供される方法のそれぞれの一部の実施形態では、方法は、第１のＣＤＫ阻害剤および第２のＣＤＫ阻害剤を投与するステップを含み、第１のＣＤＫ阻害剤は、ＣＤＫ２阻害剤（ＣＤＫ２の選択的または非選択的阻害剤であり得る）であり、第２のＣＤＫ阻害剤は、好まれる実施形態では選択的ＣＤＫ４／６阻害剤である、ＣＤＫ４／６阻害剤である。選択的ＣＤＫ阻害剤は典型的に、標準生化学的アッセイにおいて、目的の特異的ＣＤＫ（複数可）を阻害し、ＩＣ_５０は、他のＣＤＫの少なくとも５倍の選択性、好ましくは、斯かる他のＣＤＫの１０倍以上の選択性を実証する。例えば、選択的ＣＤＫ４／６阻害剤は典型的に、他のＣＤＫの少なくとも５、好ましくは、１０倍の選択性で、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６を阻害するであろう。

【0127】

追加的な抗がん剤を含む併用療法が使用される場合、１種または複数の追加的な抗がん剤は、ＣＤＫ２阻害剤および／またはＣＤＫ４／６阻害剤と逐次に、同時発生的にまたは同時に投与することができる。一実施形態では、追加的な抗がん剤は、本発明のＣＤＫ２および／またはＣＤＫ４／６阻害剤の投与に先立ち、哺乳類（例えば、ヒト）に投与される。別の実施形態では、追加的な抗がん剤は、本発明のＣＤＫ２および／またはＣＤＫ４／６阻害剤の投与の後に、哺乳類に投与される。別の実施形態では、追加的な抗がん剤は、本発明のＣＤＫ２および／またはＣＤＫ４／６阻害剤の投与と同時に、哺乳類（例えば、ヒト）に投与される。

【0128】

本発明は、また、ヒトを含む哺乳類における異常な細胞成長の処置のための医薬組成物であって、１種または複数の（好ましくは１〜３種の）追加的な抗がん剤と組み合わせた、上に定義されている、ある量のＣＤＫ２阻害剤およびある量のＣＤＫ４／６阻害剤（前記化合物またはその薬学的に許容できる塩の水和物、溶媒和化合物および多形を含む）を含む医薬組成物に関する。

【0129】

特定の実施形態では、１種または複数の追加的な抗がん剤は、Ｐｌ３キナーゼ、ｍＴＯＲ、ＰＡＲＰ、ＩＤＯ、ＴＯＯ、ＡＬＫ、ＲＯＳ、ＭＥＫ、ＶＥＧＦ、ＦＬ Ｔ３、ＡＸＬ、ＲＯＲ２、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、Ｓｒｃ／Ａｂｌ、ＲＴＫ／Ｒａｓ、Ｍｙｃ、Ｒａｆ、ＰＤＧＦ、ＡＫＴ、ｃ−Ｋｉｔ、ｅｒｂＢ、ＣＤＫ２、ＣＤＫ２／４／６、ＣＤＫ４／６、ＣＤＫ５、ＣＤＫ７、ＣＤＫ９、ＳＭＯ、ＣＸＣＲ４、ＨＥＲ２、ＧＬＳ１、ＥＺＨ２もしくはＨｓｐ９０の阻害剤等の標的化された薬剤、またはＰＤ−１もしくはＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＯＸ４０アゴニストまたは４−１ＢＢアゴニスト等の免疫調節剤である。

【0130】

他の実施形態では、１種または複数の追加的な抗がん剤は、タモキシフェン、ドセタキセル、パクリタキセル、シスプラチン、カペシタビン、ゲムシタビン、ビノレルビン、エキセメスタン、レトロゾール、フルベストラント、アナストロゾールまたはトラスツズマブ等の標準治療剤である。

【0131】

別の実施形態では、本発明は、ＣＤＫ２阻害剤またはその薬学的に許容できる塩および薬学的に許容できる担体または賦形剤を含む医薬組成物、ならびにＣＤＫ４／６阻害剤またはその薬学的に許容できる塩および薬学的に許容できる担体または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、医薬組成物は、２種以上の薬学的に許容できる担体および／または賦形剤を含む。他の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１種の追加的な抗がん剤をさらに含む。

【0132】

一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、少なくとも１種の追加的な抗がん剤または緩和剤をさらに含む。一部の斯かる実施形態では、少なくとも１種の追加的な薬剤は、後述する抗がん剤である。一部の斯かる実施形態では、組合せは、相加的な、相加的よりも大きい、または相乗的な抗がん効果をもたらす。

【0133】

一実施形態では、本発明は、それを必要とする対象における異常な細胞成長の処置のための方法であって、治療有効量の本発明の医薬組成物またはその薬学的に許容できる塩を対象に投与するステップを含む方法を提供する。

【0134】

別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における異常な細胞成長の処置のための方法であって、ある量の本発明の医薬組成物またはその薬学的に許容できる塩を、ある量の追加的な治療剤（例えば、抗がん治療剤）と組み合わせて対象に投与するステップを含み、これらの量が一緒になって、前記異常な細胞成長の処置において有効である、方法を提供する。

【0135】

本明細書に提供される方法の頻出する実施形態では、異常な細胞成長は、がんである。本発明の医薬組成物は、単一の薬剤として、例えば、ＣＤＫ２阻害剤の医薬組成物、ＣＤＫ４／６阻害剤の医薬組成物もしくはＣＤＫ２／４／６阻害剤の医薬組成物としてまたは単一の医薬組成物として投与することができる、または他の抗がん剤、特に、特定のがんに適切な標準治療剤と組み合わせて投与することができる。一部の実施形態では、提供される方法は、次の効果のうち１種または複数をもたらす：（１）がん細胞増殖の阻害；（２）がん細胞侵襲性の阻害；（３）がん細胞のアポトーシスの誘導；（４）がん細胞転移の阻害；または（５）血管新生の阻害。

【0136】

別の態様では、本発明は、ある特定のがん等、対象におけるＣＤＫ２、ＣＤＫ４および／またはＣＤＫ６によって媒介される障害の処置のための方法であって、ＣＤＫ２阻害剤またはその薬学的に許容できる塩および本発明のＣＤＫ４／６阻害剤またはその薬学的に許容できる塩を、前記障害の処置に有効な量で、対象に投与するステップを含む方法を提供する。

【0137】

他に指示がなければ、本明細書におけるＣＤＫ阻害剤の参照は全て、その塩、溶媒和化合物、水和物、アナログおよび複合体、ならびにその塩の溶媒和化合物、水和物および複合体の参照を含み、これは、その多形、立体異性体および同位体標識バージョンを含む。

【0138】

本発明のＣＤＫ阻害剤のうち１種または複数は、例えば、本明細書で同定されているＣＤＫ阻害剤のうち１種の化合物の酸付加塩および塩基付加塩等、薬学的に許容できる塩の形態で存在することができる。本明細書において、用語「薬学的に許容できる塩」は、親化合物の生物学的有効性および特性を保持する塩を指す。語句「薬学的に許容できる塩（複数可）」は、本明細書において、他に指示がなければ、本明細書で同定されているＣＤＫ阻害剤中に存在し得る酸性または塩基性の基の塩を含む。

【0139】

本発明は、また、本明細書に提供される式の化合物のプロドラッグに関する。よって、それ自体に薬理学的活性が殆どないまたは全くなくてよい本発明の化合物のある特定の誘導体は、患者に投与されると、例えば加水分解性の切断によって、発明に係る化合物へと変換され得る。斯かる誘導体は、「プロドラッグ」と称される。プロドラッグの使用に関するさらなる情報は、それらの開示全体を参照により本明細書に組み込む、「Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、１４巻、ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ（Ｔ ＨｉｇｕｃｈｉおよびＷ Ｓｔｅｌｌａ）および「Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ」、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、１９８７（Ｅ Ｂ Ｒｏｃｈｅ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）に見出すことができる。

【0140】

本発明に従ったプロドラッグは、例えば、その開示全体を参照により本明細書に組み込む、「Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ」Ｈ Ｂｕｎｄｇａａｒｄ著（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８５）に記載されている通りに、例えば、発明に係る化合物中に存在する適切な官能性を、「プロモイエティ（pro-moiety）」として当業者に知られたある特定の部分に置き換えることにより産生することができる。

【0141】

本明細書に引用されているあらゆる刊行物および特許出願は、それらの全体を参照により本明細書に組み込む。当業者であれば、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、それに対してある一定の変化および修飾を為すことができることが明らかであろう。

【実施例】

【0142】

（実施例１）
ＣＤＫ４／６媒介性リバウンドリン酸化による、ＣＤＫ２阻害に対する急速適応の概要
本発明は、ＣＤＫ２阻害が、基質リン酸化の急速かつ劇的な損失をもたらし、これはその後、数時間以内に回復されることを実証した。この代償性リン酸化現象は、複数の細胞株において、細胞周期の全ての期で観察された。本発明は、細胞株が、Ｇ１初期におけるそれらの典型的役割を越えて活性となるＣＤＫ４およびＣＤＫ６の活性化により、ＣＤＫ２活性の損失に急速に適応することをさらに実証した。本発明は、ＣＤＫ２／４／６阻害剤ＰＦ３６００ならびにＣＤＫ２基質の固定細胞および生細胞イメージングを使用して、細胞型依存性様式で、ＣＤＫ４／６−サイクリンＤ複合体が、例えば、ＰＦ３６００等の低分子ＣＤＫ２阻害剤に応答したＣＤＫ２の阻害後に、細胞周期を駆動することができる再配線（rewiring）事象を生じたことをさらに実証した。このＣＤＫ４／６依存性活性は、ＣＤＫ２阻害１０時間後までに最大強度となることが示され、一部には、ＣＤＫ４／６／サイクリンＤの上方調節によって駆動され得る。これらの知見の著しい特色は、細胞が、ＣＤＫ２活性低下に応答してバイパス機構を活性化したスピードであった。

【0143】

注目すべきことに、標的化されたがん治療法の出現以降、このような治療法に対する抵抗性を駆動する分子機構の理解に、顕著な研究努力が費やされてきた。一部のがん薬物抵抗性は、薬物に対する既存の（内在的な）遺伝的抵抗性によって駆動されるが、新たに得られつつある証拠は、バイパス経路のエピジェネティック変化および活性化を含む非遺伝的代償性機構が、細胞に標的化療法を相殺させることを実証した（Ｈａｔａら、２０１６；Ｒａｍｉｒｅｚら、２０１６；Ｓｈａｆｆｅｒら、２０１７；Ｓｈａｒｍａら、２０１０）。このような適応応答は、細胞が真正な遺伝的薬物抵抗性突然変異を獲得することができるリザーバーとして機能する薬物耐性状態を、細胞が通過することを可能にする。バイパス機構の存在は、種々のがん型において実証されたが、薬物に対する適応の報告されたタイムスケールは、数週間から数カ月間に及ぶ（Ｈａｔａら、２０１６；Ｒａｍｉｒｅｚら、２０１６；Ｓｈａｒｍａら、２０１０）。本明細書で実証される分子事象の精細な時間分解能のため、数時間のタイムスケールでのＣＤＫ２阻害に対する適応が観察された。細胞の１００％が、ＰＦ３６００に初期に応答したという事実は、薬物に対する内在的な抵抗性と相反し、適応の急速なタイムスケールは、ＣＤＫ２阻害剤に対する観察された耐性のためのドライバーとしての獲得された遺伝的突然変異と相反する。むしろ、実証される通り、本明細書に提供されるデータは、まとめると、例えばＣＤＫ２阻害薬による処置後のＣＤＫ２阻害に対する適応のための機構として、急速な上方調節および可能なＣＤＫ／サイクリン再複合体形成を支持する。

【0144】

ＣＤＫ２／サイクリン複合体は、決定的な細胞プロセスに関与する多数の基質をリン酸化する。したがって、ＣＤＫ２は、細胞周期の決定的な調節因子であると考えられる。しかし、この考えに対しては、ＣＤＫ２が、発生および増殖に必須ではないことを示すマウスおよび細胞株ノックアウト研究によって、１５年前に異議が唱えられた（Ｂｅｒｔｈｅｔら、２００３；Ｏｒｔｅｇａら、２００３；Ｓａｎｔａｍａｒｉａら、２００７；ＴｅｔｓｕおよびＭｃＣｏｒｍｉｃｋ、２００３）。これらの研究は、２種の可能な解釈を示唆した：ＣＤＫ２基質リン酸化が、検査した環境において細胞周期進行に決定的でなかった、または冗長なキナーゼ活性が、ＣＤＫ２の非存在下でＣＤＫ２基質をリン酸化することができた、のいずれかである（Ｂｅｒｔｈｅｔら、２００３；ＧｒｉｍおよびＣｌｕｒｍａｎ、２００３）。本明細書に提示されるデータは、ＣＤＫ２基質の少なくともサブセットが、細胞周期進行に必須であり、ＣＤＫ２の非存在下で、ＣＤＫ４／６が、ある特定の細胞環境においてこれらの決定的な機能を実現可能であるという考えを支持する。実際に、本明細書に提供されるデータは、代償性リン酸化を媒介するＣＤＫ４／６／サイクリンＤ複合体が、細胞型特異的であり得ることをさらに指し示す。様々なＤ型サイクリン、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６が、組織特異的発現および機能を有することが知られていることを考慮すると、このことは驚くには当たらない。しかし、ＰＦ３６００に対する適応に関与するキナーゼ／サイクリンは、所与の細胞型において正常な細胞周期進行に要求されるものと必ずしも同じでなくてもよい。

【0145】

細胞周期の広く受け入れられているモデルにおいて、ＣＤＫ４／６／サイクリンＤ複合体は、Ｇ１初期において機能し、その後、サイクリンＤは分解され、ＣＤＫ４／６は不活性にされる（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍｅら、１９９２）。しかし、数例の研究が、より後の細胞周期ステージにおけるＣＤＫ４／６活性の役割を報告した（Ｂｒｏｏｋｅｓら、２０１５；Ｇａｂｒｉｅｌｌｉら、１９９９）。その上、いくつかの研究が、サイクリンＤ１タンパク質が、ＭＣＦ１０Ａ、ＲＰＥ−ｈＴＥＲＴおよびＭＲＣ５ヒト線維芽細胞において、細胞周期のＧ２期で上昇することを報告したが、いかなるキナーゼ活性が関連するかについては不明である（Ｇｏｏｋｉｎら、２０１７；Ｙａｎｇら、２００６；Ｚｅｒｊａｔｋｅら、２０１７）。本明細書で、ＣＤＫ４／６活性は、Ｇ１期の後に必須ではないようであるが、ＣＤＫ４／６は、ＣＤＫ２阻害後に全ての細胞周期の期で基質リン酸化を媒介することが実証される。一実施形態では、ＰＦ３６００およびパルボシクリブの同時処置が、ベースラインへのＤＨＢシグナルの即時下落を引き起こさないという事実において、ＣＤＫ４／６再活性化における見かけ上の遅延を見ることができる。代わりに、ＤＨＢシグナルは先ず、およそ５時間上昇し（ＰＦ３６００単独で処置された細胞のＤＨＢシグナルと並行して）、その後、減退が始まり、これは、ベースラインへと下降するのにさらに５時間を要求する。ＣＤＫ４／６再活性化における見かけ上の遅延は、代償性キナーゼ活性に関与するタンパク質を上方調節するのに要する時間に起因し得る。

【0146】

ＣＤＫ２基質のＣＤＫ４／６媒介性代償性リン酸化は、直接的または間接的なプロセスにより為され得る。例えば、精製されたＣＤＫ／サイクリン複合体および精製されたＤＨＢセンサーを利用したｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイは、ＣＤＫ２／サイクリンＥ１、ＣＤＫ２／サイクリンＡ２、ＣＤＫ１／サイクリンＡ２およびＣＤＫ１／サイクリンＥ１によるＤＨＢのリン酸化を示したが、ＣＤＫ１／サイクリンＢ１、ＣＤＫ４／サイクリンＤ１またはＣＤＫ６／サイクリンＤ１によるＤＨＢのリン酸化を示さなかった（Ｓｃｈｗａｒｚら、２０１８；Ｓｐｅｎｃｅｒら、２０１３）。しかし、これらのアッセイは、正常なＣＤＫ２に能力がある（proficient）条件下で発現された、タグ付けおよび精製されたＣＤＫ／サイクリン複合体を使用した。したがって、ＣＤＫ／サイクリン複合体は、ＣＤＫ２阻害によって誘導され得、ＣＤＫ４／６／サイクリンＤの活性化に必要となり得る、翻訳後修飾または新たなタンパク質−タンパク質相互作用を含有しないであろう。ＣＤＫ４／６が、他のキナーゼを活性化するもしくはホスファターゼを阻害することによる間接的な効果によりＣＤＫ２基質再リン酸化を可能にすること、またはＣＤＫ２それ自体が再活性化されるようになることも確実に可能である。

【0147】

ＣＤＫ１は、細胞周期において非冗長機能を果たし、これにより、必須であると考慮される。これと一致して、ＣＤＫ１ノックアウト胚は、発生することができず（Ｓａｎｔａｍａｒｉａら、２００７）、細胞培養物におけるＣＤＫ１の低分子阻害は、Ｇ２停止および有糸分裂遮断をもたらす。ＣＤＫ１は、マウスが、妊娠中期に至るまでＣＤＫ２およびＣＤＫ４の非存在下で生存するのに十分であったが、その後、胚は重篤な造血欠損のために死亡した（Ｓａｎｔａｍａｒｉａら、２００７）。よって、ＣＤＫ１が、大部分の組織型において、ＣＤＫ２およびＣＤＫ４の非存在下で全ての代償性キナーゼ活性を実行することができることが暗示された。対照的に、本明細書において、本出願人らは、ＣＤＫ１は依然として、有糸分裂への進入に必須であるが（図３、右）、ＣＤＫ２機能的バックグラウンドにおける急性ＣＤＫ２阻害後に、本明細書で検査される細胞の環境において、ＣＤＫ２基質のリン酸化において小さな代償性役割しか果たさないことを示す。

【0148】

本明細書に示されている酵素阻害とは対照的に、代償性リン酸化をＣＤＫ１が駆動する直接的な証拠は、他の間期ＣＤＫが全て完全にアブレーションされた（ＣＤＫ２／３／４／６四重ノックアウト）マウスにおいてのみ示された。興味深いことに、ＣＤＫ４／ＣＤＫ２ダブルノックアウトマウスにおいて、ＣＤＫ６およびサイクリンＤ２の間の相互作用の増加が観察され、ＣＤＫ６／サイクリンＤが、ＣＤＫ４およびＣＤＫ２の非存在下で代償性リン酸化を駆動することができることが推測された（Ｂａｒｒｉｅｒｅら、２００７）。さらに、ＣＤＫ２またはＣＤＫ２とＣＤＫ４を欠くＭＥＦは、その野生型対応物と比較して、より低い効率で増殖した（Ｂａｒｒｉｅｒｅら、２００７；Ｂｅｒｔｈｅｔら、２００３；Ｏｒｔｅｇａら、２００３）。これと一致して、本発明において、ＣＤＫ２活性が、ＭＣＦ１０Ａ、ＭＣＦ７およびＲＰＥ−ｈＴＥＲＴ細胞においてＰＦ３６００を使用して急性的に阻害された場合、より長い有糸分裂間時間が観察された（図８Ｃ）。

【0149】

本明細書に提供されるデータは、増加したサイクリンＥ発現が原因で臨床ＣＤＫ４／６阻害剤に対して抵抗性になったがんにおいて、腫瘍細胞増殖のためにＣＤＫ２に依存するがんにおいて、または代償性キナーゼの上方調節によって代償することができないがんにおいて、選択的ＣＤＫ２阻害が、標的化療法として有望な戦略となり得ることを示唆する。この考えに一致して、ＯＶＣＡＲ３細胞は、サイクリンＥ増幅が原因で、パルボシクリブに対して抵抗性であるが、ＣＤＫ２阻害に対して特に感受性であり、基質の代償性リン酸化を示すことも、またはＰＦ３６００に応答して任意のさらなる有糸分裂を起すこともない。さらに、遺伝的に操作された、パルボシクリブ抵抗性マウス肺腫瘍は、ＰＦ３６００によるＣＤＫ２／４／６の阻害と同様に、ＣＤＫ２損失およびＣＤＫ４／６阻害のコンビナトリアル活性を実証した。ＣＤＫ４／６によりＣＤＫ２阻害に適応したこのような腫瘍は、ＣＤＫ２およびＣＤＫ４／６阻害剤による併用処置の候補となることができる。

【0150】

（実施例２）
ＣＤＫ２活性の阻害は、基質リン酸化の急速損失を引き起こした
ＰＦ３６００処置によるＣＤＫ２阻害のリアルタイム効果は先ず、ＤＨＢに基づくＣＤＫ２活性センサーを使用して試験した（Ｓｐｅｎｃｅｒら、２０１３）（図１Ａ）。ＤＨＢセンサーは、リン酸化されていない場合、核に局在化する。リン酸化後に、核局在化シグナルが遮蔽され、核外輸送シグナルが遮蔽を外され、センサーは、増加するＣＤＫ２活性に応答して細胞質へと着実に移行する（図１Ａ）。よって、キナーゼ活性は、ＤＨＢセンサーの細胞質蛍光強度の核蛍光強度に対する比（Ｃ／Ｎ比）によって定量化することができる。本発明において、細胞ＩＣ_５０値（図８Ａ）を使用して、ＰＦ３６００の関連する用量として２５ｎＭおよび１００ｎＭを選択し、２種の非形質転換上皮細胞株（ＭＣＦ１０ＡおよびＲＰＥ−ｈＴＥＲＴ）、乳がん細胞株（ＭＣＦ７）および卵巣がん系統（ＯＶＣＡＲ３）においてＤＨＢセンサーのタイムラプスイメージングを行った。非同期的に周期を進める細胞を先ず、薬物の非存在下でおよそ２０時間イメージングを行って、各細胞の細胞周期の期を確立した；次に、動画を休止して、薬物を添加し、次いでイメージングをさらに１〜２日間続けた。細胞は、非同期的に周期を進めていたため、１種の薬物処置による全ての細胞周期の期が試料採取された。これにより、本発明者らは、分裂後期の完了から任意の時点で薬物を受けた細胞のトレースを計算的に単離することができた。

【0151】

より高い濃度では、ＰＦ３６００は、ＣＤＫ２に加えてＣＤＫ４／６を阻害する。ＰＦ３６００の効果が主にＣＤＫ４／６阻害からの干渉を伴わないＣＤＫ２の阻害によるものであったことを確実にするために、ＣＤＫ４／６が不活性であると考えられる細胞周期ステージに解析を制限した。ＣＤＫ４／６が主に細胞周期のＧ１期において作用する（Ｃｈｕｎｇら、２０１９；ＳｈｅｒｒおよびＲｏｂｅｒｔｓ、２００４）という概念と一致して、分裂後期５時間後またはそれより後のパルボシクリブの添加は、ＤＨＢセンサーリン酸化、細胞周期進行または有糸分裂のタイミングに効果がなかった（図３、左）。本発明者らは、したがって、分裂後期５時間後に始まるＰＦ３６００に応答したＤＨＢリン酸化のいかなる変化も、ＣＤＫ２活性の阻害が原因であろうと判断した。同様に、１時間のパルボシクリブ処置は、２Ｎ ＤＮＡ含量を有する細胞におけるＲｂの脱リン酸化をもたらしたが、３〜４Ｎ ＤＮＡ含量を有する細胞においてはＲｂリン酸化に効果がなく（図８Ｂ）、この場合もやはり、Ｃｈｕｎｇら、２０１９と一致した。したがって、ＰＦ３６００による処置後のＣＤＫ２基質リン酸化を評価する全ての実験に関して、解析を、３〜４Ｎ ＤＮＡ含量を有する細胞または分裂後期≧５時間後に処置した細胞に制限した。

【0152】

予想通り、細胞周期半ば（mid-cell
cycle）のＰＦ３６００の添加は、検査した全４種の細胞株においてＤＨＢセンサーのＣ／Ｎ比の急激かつ急速な下落をもたらした（図１Ｂ、図１Ｄ、図１Ｆおよび図１Ｇ）。ＣＤＫ２リン酸化に応答して核から細胞質へと同様に移行する（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、１９９９；Ｓａｈａら、１９９８）複製前複合体の構成成分である、別のＣＤＫ２基質ＣＤＣ６のリン酸化におけるＰＦ３６００のリアルタイム効果も試験した。ＰＦ３６００の添加は、ＣＤＣ６リン酸化の下落をもたらし、核へと戻るその移行を引き起こした（図１Ｃ）。まとめると、ＤＨＢおよびＣＤＣ６の両方のＣ／Ｎ比の下落は、ＰＦ３６００による処置後の急速な（１時間以内）ＣＤＫ２活性の阻害を示唆する。

【0153】

ＤＨＢセンサーの特異性の評価において、有糸分裂５時間後またはそれより後の高用量の１μＭパルボシクリブによる処置は、ＤＨＢセンサーリン酸化、細胞周期進行または有糸分裂のタイミングに即時効果がなかった（図３、左）。しかし、次の回の有糸分裂の完了後に、このようなパルボシクリブ処置細胞は、ＣＤＫ２^ｌｏｗ Ｇ０停止に進入し、ＣＤＫ４／６の阻害およびその後の細胞周期へのコミットメントの遮断におけるパルボシクリブの有効性を指し示す。９μＭ ＲＯ３３０６によるＣＤＫ１阻害もまた、ＤＨＢセンサーリン酸化における即時効果が最小であった（図３、右）。細胞周期の終わりに向かって、このようなＲＯ３３０６処置細胞は、Ｇ２停止を示し、ＤＨＢリン酸化がプラトーに達し、ＣＤＫ１の阻害および有糸分裂進入の遮断におけるＲＯ３３０６の有効性を指し示す。これらの観察は、以前に公開されたｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼデータ（Ｓｃｈｗａｒｚら、２０１８；Ｓｐｅｎｃｅｒら、２０１３）およびサイクリンＥ１^−／−Ｅ２^−／−Ａ１^−／−Ａ２^−／−ＭＥＦが、核ＤＨＢセンサーを維持するという事実（Ｃｈｕｎｇら、２０１９）と共に、ＤＨＢセンサーが、正常な成長条件下において、主にＣＤＫ２によってリン酸化され、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６またはＣＤＫ１によるリン酸化が最小であることを実証する。

【0154】

（実施例３）
ＣＤＫ２阻害後のＣＤＫ２基質リン酸化における急速リバウンド
ＰＦ３６００による処置後のＤＨＢセンサーリン酸化の即時下落に加えて、１〜２時間以内に始まるリン酸化の急速リバウンドが、ＭＣＦ１０Ａ、ＭＣＦ７およびＲＰＥ−ｈＴＥＲＴ細胞において認められた（それぞれ図１Ｂ、図１Ｆおよび図１Ｄ）。５時間目までに、ＤＨＢセンサーリン酸化は、処置前レベルに戻り、その後上昇し続けた。これと一致して、細胞周期進行は続き、細胞は、有糸分裂を最終的に完了した（図８Ｃ）。ＭＣＦ７乳がん細胞は、ＭＣＦ１０ＡおよびＲＰＥ−ｈＴＥＲＴ細胞よりも、ＰＦ３６００に対して感受性が高かった（図１Ｆ、図８Ａおよび図８Ｃ）。２５ｎＭ ＰＦ３６００は、ＭＣＦ７において下落−リバウンド挙動を示したが、１００ｎＭ ＰＦ３６００は、ＤＨＢリン酸化の短いリバウンドとそれに続く長続きした抑制および有糸分裂遮断を引き起こした（図１Ｆおよび図８Ｃ）。下落−リバウンドは、ＰＦ３６００で処置したＭＣＦ１０Ａ細胞におけるＣＤＣ６リン酸化によっても観察された（図１Ｃ）。細胞におけるＰＦ３６００のほぼ３０時間の半減期ならびに薬物動態および薬力学研究は、ＰＦ３６００処置後のＣＤＫ２基質の観察された再リン酸化が、化合物の不安定性または阻害剤結合の損失が原因ではないことを指し示した。

【0155】

センサーリン酸化のリバウンドが観察された３種の細胞株（ＭＣＦ１０Ａ、ＭＣＦ７およびＲＰＥ−ｈＴＥＲＴ）は全て、細胞周期進入のためにＣＤＫ４／６／サイクリンＤに依存し、予想通り、パルボシクリブ感受性であった。対照的に、ＯＶＣＡＲ３細胞は、サイクリンＥの増幅を有し、パルボシクリブに対して抵抗性である。本発明者らは、ＯＶＣＡＲ３細胞が、その生存および増殖のためにＣＤＫ２活性にさらに依存する場合、この細胞は、ＤＨＢセンサーにより可視化される通り、ＰＦ３６００によるＣＤＫ２阻害に対してさらに大きい感受性を示すであろうと仮定した。この考えと一致して、低い方の２５ｎＭ用量のＰＦ３６００によるＯＶＣＡＲ３細胞の処置は、イメージング期間の残りにおいて、細胞増殖を阻害し、さらなる有糸分裂を全て防止した（図１Ｇおよび図８Ｃ）。興味深いことに、ＭＣＦ１０Ａ、ＭＣＦ７またはＲＰＥ−ｈＴＥＲＴ細胞とは異なり、ＤＨＢセンサーリン酸化は、ＰＦ３６００処置後にＯＶＣＡＲ３細胞においてリバウンドしなかったが、その代わりに、下落し、次いで中間レベルにおいてプラトーに達した（図１Ｇ）。

【0156】

直交性様式で下落−リバウンド効果を検査するために、両方のＣＤＫ２アレルにＦ８０Ｇ突然変異を含有するＣＤＫ２アナログ感受性ＲＰＥ−ｈＴＥＲＴ細胞（ＣＤＫ２^{Ｆ８０Ｇ／Ｆ８０Ｇ}；（Ｍｅｒｒｉｃｋら、２０１１））へとＤＨＢセンサーを形質導入した。この突然変異は、巨大なＡＴＰ競合性アナログ、３ＭＢ−ＰＰ１、１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（３−メチルベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン（ＣＡＳ番号９５６０２５−８３−５）によって特異的に阻害される、修飾されたＡＴＰ結合ポケットを生じる。ＰＦ３６００処置と一致して、３ＭＢ−ＰＰ１によるＣＤＫ２活性の阻害は、迅速にリバウンドするＤＨＢセンサーリン酸化の低下を引き起こした一方で、野生型ＲＰＥ−ｈＴＥＲＴ細胞は、３ＭＢ−ＰＰ１による影響を受けなかった（図１Ｅ、図９Ａおよび図９Ｂ）。３ＭＢ−ＰＰ１によるＣＤＫ２^{Ｆ８０Ｇ／Ｆ８０Ｇ}細胞におけるＤＨＢリン酸化の下落は、ＰＦ３６００による野生型ＲＰＥ−ｈＴＥＲＴ細胞よりも顕著に劇的でなかったが、ＣＤＫ２^{Ｆ８０Ｇ／Ｆ８０Ｇ}は、Ｎｂｓ１リン酸化の損失によって実証される通り、実際に阻害された（図９Ｃ）。ゲートキーパー残基の突然変異が、ＣＤＫ２機能を低下させることが知られている（Ｍｅｒｒｉｃｋら、２０１１）ことを考慮すると、３ＭＢ−ＰＰ１によるＤＨＢリン酸化における小さい効果は、ＣＤＫ２^{Ｆ８０Ｇ／Ｆ８０Ｇ}細胞が、野生型ＲＰＥ−ｈＴＥＲＴ細胞と比較して、よりＣＤＫ１活性に頼るという事実が原因の可能性がある。ＣＤＫ１阻害剤ＲＯ３３０６の添加は、野生型ＲＰＥ−ｈＴＥＲＴ細胞と比較して、ＲＰＥ−ｈＴＥＲＴ ＣＤＫ２^{Ｆ８０Ｇ／Ｆ８０Ｇ}細胞においてＤＨＢリン酸化のはるかにより大幅な下落をもたらした（図９Ｅ）。よって、ＲＰＥ−ｈＴＥＲＴ ＣＤＫ２^{Ｆ８０Ｇ／Ｆ８０Ｇ}細胞において、ＣＤＫ１は、細胞周期初期に異常に活性であり、ＣＤＫ２基質のリン酸化に寄与し、これにより、３ＭＢ−ＰＰ１により達成可能なＤＨＢリン酸化の阻害を弱める。

【0157】

次に、免疫蛍光およびウエスタンブロッティングを使用して、ＣＤＫ２阻害が、内因性ＣＤＫ２基質：Ｃｄｃ６（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、１９９９；Ｓａｈａら、１９９８）、ヌクレオリン（Ｓａｒｃｅｖｉｃら、１９９７）およびＲｂ（Ａｋｉｙａｍａら、１９９２）のリン酸化動態に同様の効果を有したかについて調査した。３〜４Ｎ ＤＮＡ含量を有する細胞におけるＰＦ３６００の効果を免疫蛍光によって定量化したところ、ＰＦ３６００処置は、Ｒｂおよびヌクレオリンのリン酸化の一過性低下と、それに続くリバウンドをもたらした（図４Ａおよび図４Ｂ）。Ｃｄｃ６、Ｒｂおよびヌクレオリンに関して、ウエスタンブロッティングによって同様の結果が得られた（図４Ｃ）。

【0158】

ＣＤＫ２基質動力学をホスホ−プロテオミクスにより網羅的に評価した。ＭＣＦ７細胞を２５ｎＭ ＰＦ３６００で１時間または２４時間処置し、ＣＤＫ基質リン酸化における効果を質量分析による解析によって評価した（図９Ｆ）。最小ＣＤＫコンセンサスリン酸化部位（ＳＰまたはＴＰ）を有するペプチドのみを考慮して、１時間のＰＦ３６００処置後にそのリン酸化が有意に低下した（ｐ＜０．０５）４０種のペプチドを同定したところ、これらの大部分が、２４時間目までに対照レベルにリバウンドした（図４Ｄ、図９Ｆおよび表１）。まとめると、生細胞イメージング、免疫蛍光、ウエスタンブロッティングおよびホスホ−プロテオミクスから得られた観察は、ＣＤＫ２活性が急性的に阻害された場合、ＭＣＦ１０Ａ、ＭＣＦ７およびＲＰＥ−ｈＴＥＲＴ細胞等のがん細胞は、代償性キナーゼ（複数可）の活性化によって急速に適応したことを示唆し、その際に、代償性キナーゼはＣＤＫ２基質をリン酸化して、細胞周期の最終的完了を容易にする。

【0159】

（実施例４）
代償性キナーゼ活性の調査：ＣＤＫ１の寄与は小さかった
ＣＤＫ１は、非正準ＣＤＫ１−サイクリン複合体の形成により、ＣＤＫ２／４／６マウスノックアウトにおいて完全な細胞周期を駆動することが示された（Ａｌｅｅｍら、２００５；Ｓａｎｔａｍａｒｉａら、２００７）。ＣＤＫ１が、急性ＣＤＫ２阻害後にＣＤＫ２基質のリン酸化を駆動することができるかについて、ＣＤＫ１阻害剤であるＲＯ３３０６で同時処置することにより、ＭＣＦ１０Ａ、ＲＰＥ−ｈＴＥＲＴおよびＭＣＦ７細胞におけるタイムラプスイメージングによって調査した（Ｖａｓｓｉｌｅｖら、２００６）。予想に反して、ＣＤＫ２（１００ｎＭまたは２５ｎＭ ＰＦ３６００）およびＣＤＫ１（９μＭ ＲＯ３３０６）の同時阻害は、それにもかかわらず、ＤＨＢセンサーのリン酸化のリバウンドをもたらした（図５Ａ）が、このような同時処置条件下で達成されたＤＨＢリン酸化のレベルは、若干低かった。同様に、ＣＤＫ２（１００ｎＭ ＰＦ３６００）およびＣＤＫ１（９μＭ ＲＯ３３０６）の同時阻害は、ＣＤＫ２のみの阻害（１００ｎＭ ＰＦ３６００）と比較して、Ｒｂまたはヌクレオリンのリン酸化に追加的な効果がなかった（図１０Ａ）。まとめると、これらのデータは、ＣＤＫ２の阻害後に、ＤＨＢおよび他のＣＤＫ２基質は、十分に機能的なＣＤＫ２を有する細胞において、ＣＤＫ１によってごく弱くリン酸化されることを示唆する。ＣＤＫ２およびＣＤＫ１の同時阻害は、基質リン酸化のリバウンドを消失させなかったため、本発明者らは、ＣＤＫ２活性の非存在下でのＣＤＫ２基質リン酸化を可能にし得る代替キナーゼ（複数可）の存在を仮定した。

【0160】

（実施例５）
代償性キナーゼ活性の調査：活性はＣＤＫ４／６阻害により消失した
ＨＣＴ１１６結腸がん細胞における以前の研究は、ＣＤＫ２が、遺伝的アプローチにより（though）アブレーションされた場合、Ｒｂはやはり、細胞においてリン酸化されたことを示した。増大されたＣＤＫ４活性は、このリン酸化の原因であると推測された（ＴｅｔｓｕおよびＭｃＣｏｒｍｉｃｋ、２００３）が、このことは、ＲｂがＣＤＫ４／６基質でもあるという事実によって説明することができる。同様に、ＨＣＴ１１６細胞は一般に、パルボシクリブに対して非感受性であるが、ＣＤＫ２の遺伝的アブレーションは、この細胞をＣＤＫ４／６阻害に対して脆弱性にする。これらの観察は、ＣＤＫ４のせいで、このような細胞においてＣＤＫ２活性が冗長になっている可能性を暗示するが、ＣＤＫ２特異的基質のリン酸化は試験されなかった。ＤＨＢセンサーは、正常ではＣＤＫ４／６基質ではないため（図３および（Ｓｐｅｎｃｅｒら、２０１３））、本発明者らは、ＤＨＢセンサーを使用して、ＣＤＫ４／６／サイクリンＤによる代償を経たＰＦ３６００に対する可能な適応を調査した。

【0161】

パルボシクリブ（１μＭ）およびＰＦ３６００による、ＭＣＦ１０Ａ（１００ｎＭ ＰＦ３６００）、ＲＰＥ−ｈＴＥＲＴ（１００ｎＭ ＰＦ３６００）およびＭＣＦ７（２５ｎＭ ＰＦ３６００）細胞におけるＣＤＫ４／６およびＣＤＫ２の同時阻害は、リン酸化の持続性よりはむしろ一過性のリバウンドを明らかにし、これはその後、イメージング期間の残りにおいてベースラインレベルに降下した（図５Ｂ）。これらの細胞は、任意のさらなる有糸分裂を起こさず、細胞周期完了に決定的な基質リン酸化が遮断されたことを示唆する（図１０Ｂおよび図１０Ｃ）。Ｒｂ、Ｃｄｃ６およびヌクレオリンのリン酸化は、ＣＤＫ４／６およびＣＤＫ２の同時阻害後に急速に失われ、処置２４時間後になっても回復は観察されなかったため、この現象は、ＤＨＢセンサーに制限されなかった（図５Ｃおよび図５Ｄ）。直交性システムにおいてこの効果を検査するために、ＲＰＥ−ｈＴＥＲＴ ＣＤＫ２^{Ｆ８０Ｇ／Ｆ８０Ｇ}細胞において、１０μＭ ３ＭＢ−ＰＰ１、１μＭパルボシクリブまたは１０μＭ ３ＭＢ−ＰＰ１＋１μＭパルボシクリブにより、指し示されている時間でＣＤＫ２およびＣＤＫ４／６を同時阻害した。３ＭＢ−ＰＰ１単独により以前に見られた持続したリバウンドリン酸化（図９Ａ）は、３ＭＢ−ＰＰ１およびパルボシクリブによる同時処置後に消失した（図２Ａ）。単細胞トレースの数：ＤＭＳＯ（１３３）、１０μＭ ３ＭＢ−ＰＰ１（１０４）、１μＭパルボシクリブ（１４６）、１０μＭ ３ＭＢ−ＰＰ１＋１μＭパルボシクリブ（１６０）。ＤＭＳＯおよび１０μＭ ３ＭＢ−ＰＰ１メジアントレースは、図１Ｄから再現された。これらの結果は、複数のＣＤＫ２基質が、ＣＤＫ２活性の急性阻害後に、ＣＤＫ４／６依存性様式でリン酸化されるという概念を支持する。ＣＤＫ２およびＣＤＫ４／６は、ＭＣＦ１０Ａ細胞において、１００ｎＭ ＰＦ３６００、５μＭリボシクリブ、１００ｎＭ ＰＦ３６００＋５μＭリボシクリブにより同時阻害された（図２Ｂ）。単細胞トレースの数：ＤＭＳＯ（５５）、１００ｎＭ ＰＦ３６００（５３）、５μＭリボシクリブ（２３）、１００ｎＭ ＰＦ３６００＋５μＭリボシクリブ（２６）（図２Ｂ）。ＣＤＫ２およびＣＤＫ４／６は、ＭＣＦ１０Ａ細胞において、１００ｎＭ ＰＦ３６００、１μＭアベマシクリブまたは１００ｎＭ ＰＦ３６００＋１μＭアベマシクリブにより同時阻害された（図２Ｃ）。単細胞トレースの数、右：ＤＭＳＯ（１９７）、１００ｎＭ ＰＦ３６００（２４２）、１μＭアベマシクリブ（３９０）、１００ｎＭ ＰＦ３６００＋１μＭアベマシクリブ（２７０）（図２Ｃ）。

【0162】

（実施例６）
ＣＤＫ４／６−サイクリンＤ複合体は、ＣＤＫ２基質のリバウンドリン酸化において重大な役割を果たす
ＣＤＫ４およびＣＤＫ６は、重複する細胞機能および特有の細胞機能の両方を有するため、ＣＤＫ２の阻害後に見られる基質リン酸化のリバウンドに対するそれらの個々の寄与の決定に興味を持った。周期を進めるＭＣＦ１０ＡおよびＭＣＦ７細胞におけるＣＤＫ４またはＣＤＫ６のｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウン（図１１Ａ）は、ＭＣＦ７細胞が、正常な細胞周期進行のためにＣＤＫ４に主に頼ることを明らかにした一方で、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６の同時ノックダウンが、ＭＣＦ１０Ａにおける増殖の遮断に必要とされた（図１１Ｂ）。

【0163】

ＰＦ３６００処置ＭＣＦ１０Ａ細胞において、ＣＤＫ４ノックダウンは、ＤＨＢのリバウンドリン酸化の遮断において非常に有効であり（図６Ａ、左）、単細胞トレースの大部分は、有糸分裂の阻害と共にＤＨＢセンサーの核局在化を示した（図６Ｂ、上）。対照的に、ＭＣＦ７細胞において、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６の両方の同時ノックダウンが、ＤＨＢのリバウンドリン酸化の有効な遮断に必要とされた（図６Ａ、右および図６Ｂ、下）。よって、ＣＤＫ４／６ノックダウンは、ＰＦ３６００およびパルボシクリブ同時処置により為された観察を表現型コピーする（図５Ｂ）。

【0164】

ＣＤＫ４およびＣＤＫ６は一般的には、Ｄ型サイクリンと対になるため、ｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウン（図１１Ｃ）を使用して、いずれのＤ型サイクリンが、代償性キナーゼ活性に寄与するか調査した。周期を進めるＭＣＦ１０Ａ細胞において、トリプルノックダウンのみが細胞周期進行に強い効果を有したため、全３種のサイクリンＤ１、Ｄ２およびＤ３が、細胞周期進入に寄与した（図１１Ｄ、上）。ＭＣＦ７細胞は、サイクリンＤ２を発現しないため（Ｅｖｒｏｎら、２００１）、本発明者らは、サイクリンＤ１およびＤ３に焦点を合わせた。ＭＣＦ７細胞において、サイクリンＤ１のノックダウンは、細胞周期進行を有効に遮断したが、サイクリンＤ３は必須ではなかった（図１１Ｄ、下）。

【0165】

ＰＦ３６００で処置したＭＣＦ１０Ａ細胞において、ＤＨＢリン酸化のリバウンドは、サイクリンＤ１、Ｄ２またはＤ３単独をノックダウンすることにより部分的に遮断された一方で、Ｄ型サイクリンのトリプルノックダウンは、持続したリバウンドを抑止した（図６Ｃ、左および図１１Ｅ、上）。ＰＦ３６００で処置したＭＣＦ７細胞において、サイクリンＤ３のノックダウンは、最小の効果を有した一方で、サイクリンＤ１の標的化は、ＤＨＢリン酸化のリバウンドを大部分は遮断し、サイクリンＤ１およびＤ３の同時ノックダウンは、このリバウンドの防止においてさらにより有効であった（図６Ｃ、右および図１１Ｅ、下）。よって、サイクリンＤ１、Ｄ２およびＤ３（ＭＣＦ１０Ａ）またはサイクリンＤ１（ＭＣＦ７）のノックダウンは、図５Ｂに示すＰＦ３６００およびパルボシクリブ同時処置により為される観察を表現型コピーする。要約すると、ＭＣＦ１０Ａ細胞は、正常な細胞周期進入のためにＣＤＫ４、ＣＤＫ６、サイクリンＤ１、サイクリンＤ２およびサイクリンＤ３を使用することができるが、急性ＣＤＫ２阻害後のリバウンドリン酸化のためにＣＤＫ４／サイクリンＤ２およびＤ３に僅かにより大きく頼る。対照的に、ＭＣＦ７細胞は、正常な細胞周期進行のためにＣＤＫ４／サイクリンＤ１を使用するが、急性ＣＤＫ２阻害後のリバウンドリン酸化のためにサイクリンＤ１と共にＣＤＫ４およびＣＤＫ６の両方に頼る。

【0166】

（実施例７）
サイクリンＤ１およびＤ３レベルは、ＣＤＫ２阻害後に上方調節された
ＣＤＫ２阻害後にリバウンドキナーゼ活性を駆動する機構を調査した。ＭＣＦ１０Ａ細胞において、ＰＦ３６００（１００ｎＭ）処置２４時間以内にサイクリンＤ１およびＤ３タンパク質レベルの増加が観察されたが、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６タンパク質レベルは安定を維持した（図６Ｄ）。対照的に、ＭＣＦ７細胞において、サイクリンＤ１、サイクリンＤ３、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６タンパク質レベルは全て、ＰＦ３６００（２５ｎＭ）処置２４時間以内に様々な程度増加した。上方調節が転写レベルで起こったか決定するために、ｍＲＮＡ ＦＩＳＨを行って、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６ならびにサイクリンＤ１、Ｄ２およびＤ３の発現を測定した。ウエスタンブロット結果に一致して、ＰＦ３６００処置に応答して、サイクリンＤ１およびＤ３のｍＲＮＡ発現の増加が、ＭＣＦ１０Ａにおいて観察され、サイクリンＤ１の特に強い増加が、ＭＣＦ７細胞において観察された（図６Ｅ〜図６Ｆ）。これらの知見は、増加したタンパク質レベルを少なくとも部分的に説明する。

【0167】

上方調節されたサイクリンＤタンパク質レベルが、ＭＣＦ１０Ａ細胞における増加したＣＤＫ−サイクリンＤ３複合体に繋がったか決定するために、ＤＭＳＯまたはＰＦ３６００のいずれかで２４時間処置したＭＣＦ１０Ａ細胞においてＣＤＫ４およびＣＤＫ６の免疫沈降を行って、サイクリンＤ３について調べた。実際に、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６の両方に結合した、より多い量のサイクリンＤ３が、ＣＤＫ２阻害後に観察された（図１１Ｆ）。まとめると、これらのデータは、ＣＤＫ２の急性阻害が、細胞型特異的ＣＤＫ４／６／サイクリンＤ複合体の上方調節を誘発し、この複合体のサブセットが、ＣＤＫ２基質のリバウンドリン酸化を促進し得ることを実証する。

【0168】

（実施例８）
ＣＤＫ４／６およびＣＤＫ２は、ｉｎ ｖｉｖｏで互いを代償する
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＣＤＫ２およびＣＤＫ４／６の間の潜在的な代償性の関係性を検査するために、ＫＲＡＳ^Ｇ１２ＶおよびＴＲＰ５３突然変異によって駆動される確立されたマウス肺腫瘍モデルを使用した。Ｃｒｅリコンビナーゼをコードするアデノウイルス粒子を鼻腔内感染させたＫｒａｓ^{＋／ＬＳＬＧ１２Ｖ}、Ｔｒｐ５３^Ｌ／Ｌマウスは、５カ月間の潜伏期により肺腫瘍を発生した。ＣＴスキャンによって腫瘍発生が検出されたら、媒体またはパルボシクリブ（７０ｍｇ／ｋｇ ＱＤ）のいずれかで動物を２８日間処置し、その後、処置期間の終わりにＣＴスキャンによって腫瘍体積を測定した。媒体およびパルボシクリブ処置マウスの間の腫瘍体積倍率変化の比較は、パルボシクリブ処置後に腫瘍負荷の有意な低下を示さなかった（図７Ａ）。しかし、ＣＤＫ２ Ｔ−ループリン酸化およびサイクリンＥ１の上方調節が、パルボシクリブ処置肺腫瘍において、ウエスタンブロットにより検出された。ＣＤＫ阻害剤ｐ２１の有意な下方調節（図７Ｂ）と共に、これらのデータは、ＣＤＫ２活性の上方調節が、パルボシクリブに対する非感受性を説明することができることを指し示す。

【0169】

ＣＤＫ２が、パルボシクリブ抵抗性腫瘍における役割を果たすか検査するために、Ｋｒａｓ^{＋／ＬＳＬＧ１２Ｖ}；Ｔｒｐ５３^Ｌ／Ｌ；Ｃｄｋ２^−／−マウスを作製した。このようなマウスは、Ｋｒａｓ^{＋／ＬＳＬＧ１２Ｖ}；Ｔｒｐ５３^Ｌ／Ｌ；Ｃｄｋ２^＋／＋対照動物と同様のサイズの肺腫瘍を発生した（図７Ｃ）。注目すべきことに、Ｃｄｋ２ヌル肺腺癌を有するマウスのパルボシクリブ処置は、有意に低下した腫瘍サイズをもたらした（ｐ＝０．０３７）（図７Ｃ）。よって、この腫瘍設定において、ＣＤＫ４／６阻害は、ＣＤＫ２の非存在下での腫瘍成長の抑制に十分であった。

【0170】

ＣＤＫ２およびＣＤＫ４／６の両方が、腫瘍成長に寄与するという考えをさらに支持するために、５０ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ（ＣＤＫ２、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６を網羅する、現在までに発表された細胞研究において使用されるよりも高い用量）のＰＦ３６００で処置することにより、Ｋｒａｓ^{＋／ＬＳＬＧ１２Ｖ}；Ｔｒｐ５３^Ｌ／Ｌ肺腫瘍を有するマウスにおけるＣＤＫ２、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６活性を阻害した。Ｃｄｋ２ヌル腫瘍のパルボシクリブ感受性と一致して、ＰＦ３６００によるＣＤＫ２／４／６の阻害は、有意に低下した腫瘍体積をもたらした（図７Ｃ）。まとめると、ｉｎ ｖｉｖｏデータは、ＣＤＫ２およびＣＤＫ４／６キナーゼが、重複する機能を果たし、互いを代償することができるという仮説を支持する。

【0171】

（実施例９）
材料と方法
実験モデル詳細：
Ｉｃａｈｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＲｏｂｅｒｔ Ｆｉｓｈｅｒ研究室の厚意により得られたＲＰＥ−ｈＴＥＲＴ野生型およびＣＤＫ２アナログ感受性細胞を例外として、本研究で使用した細胞株は、ＡＴＣＣから得た。ＭＣＦ１０Ａ（ヒト乳房上皮）細胞は、５％ウマ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０ｎｇ／ｍＬ上皮成長因子（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．５ｍｇ／ｍＬヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００ｎｇ／ｍＬコレラ毒素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および１０μｇ／ｍＬインスリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２において培養した。ＲＰＥ−ｈＴＥＲＴ細胞は、１０％ＦＢＳを有するＤＭＥＭにおいて育成した。ＭＣＦ７およびＯＶＣＡＲ３細胞は、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０を使用して育成した。ｓｉＲＮＡトランスフェクション中を除いて、全ての完全成長培地に、ペニシリン／ストレプトマイシンを補充した。全ての細胞は、３７℃で５％ＣＯ_２により培養した。

【0172】

レンチウイルスベクターを使用した安定した細胞株作製：
ＣＤＫ２センサー（ＤＨＢ−ｍＶｅｎｕｓまたはＤＨＢ−ｍＣｈｅｒｒｙ）、およびｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅをタグ付けしたＨ２Ｂを安定して発現する細胞を、レンチウイルス形質導入によって作製した。ウイルス作製のため、Ｆｕｇｅｎｅ−ＨＤ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ２３１１）を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＣＳＩＩ−ＥＦプラスミド（ＣＳＩＩ−ＥＦ ＤＨＢ−ｍＶｅｎｕｓ、ＣＳＩＩ−ＥＦ ＤＨＢ−ｍＣｈｅｒｒｙ、ＣＳＩＩ−ＥＦ ＣＤＣ６−ＹＦＰまたはＣＳＩＩ−ＥＦ Ｈ２Ｂ−ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ）を、ヘルパーパッケージングおよびエンベローププラスミド（ｐＭＤＬｇ、ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ、ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ）と共にトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後にレンチウイルスを収集し、０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過し、５μｇ／ｍｌポリブレン（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃ＴＲ−１００３）の存在下で標的細胞と共に６〜１０時間インキュベートした。安定した組込みを有する細胞をＡｒｉａ Ｆｕｓｉｏｎフローサイトメーターにおいて選別して、全ての細胞が所望のセンサーを発現する集団を確立した。

【0173】

ｓｉＲＮＡトランスフェクション
Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ１試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）により、製造業者のプロトコールを使用して、ｓｉＲＮＡトランスフェクションを実行した。標的毎に、遺伝子の３種の異なる領域を標的とするｓｉＲＮＡのプールを使用した。細胞を、抗生物質を欠く完全成長培地においてトランスフェクション複合体と共に６〜７時間インキュベートした。本研究に使用したｓｉＲＮＡ配列は次の通りであった：ＣＣＮＤ１（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ＃ＭＵ−００３２１０−０５−０００２）、ＣＣＮＤ２（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ＃ＭＵ−００３２１０−０５−０００２）、ＣＣＮＤ３（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ＃Ｊ−００３２１２−１０−０００２、Ｊ−００３２１２−１１−０００２、Ｊ−００３２１２−１２−０００２）、ＣＤＫ４（ＩＤＴ製品＃１９８５６９３２６、１９８５６９３２９、１９８５６９３３２）、ＣＤＫ６（ＩＤＴ製品＃２００９２５８７０、２００９２５８７３、２００９２５８７６）。

【0174】

タイムラプスイメージング：
イメージングの少なくとも２４時間前に、播種前にコラーゲンでコーティングしたガラス底９６ウェルプレート（ＣｅｌｌＶｉｓ Ｐ９６−１．５Ｈ−Ｎ）におけるフェノールレッドを含まない完全成長培地に、細胞を播種した。細胞が、イメージング期間の終わりまでサブコンフルエントを維持するように、播種密度を選んだ。細胞は先ず、薬物なしで完全成長培地において１６〜２０時間イメージングした。次に、動画を短時間休止し、完全成長培地を、所望の濃度で薬物を含有する完全成長培地に置き換えた。次に、プレートを顕微鏡に再度挿入し、その以前の位置へと整列し、さらに２４〜４８時間イメージングを続けた。５％ＣＯ２で加湿した３７℃チャンバーにおいて、１０×０．４５ＮＡ対物レンズを備えるＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴｉまたはＴｉ２顕微鏡において１２分毎（ＭＣＦ１０ＡまたはＲＰＥ−ｈＴＥＲＴについて）または２０分毎に（ＭＣＦ７またはＯＶＣＡＲ３について）画像を獲得した。全チャネルの全動画の露光時間は、１時点当たり５００ミリ秒未満に維持して、光毒性を最小化した。公開されたＭＡＴＬＡＢスクリプト（Ｃａｐｐｅｌｌら、２０１６）を使用して、以前に記載された通りに（Ａｒｏｒａら、２０１７）、細胞トラッキングを行った。ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｓｃａｐｐｅｌｌ／Ｃｅｌｌ＿ｔｒａｃｋｉｎｇにおけるダウンロードからトラッキングコードを利用できる。動画の各フレームにおける分割された核の数を計数することにより、経時的な細胞計数を得た。

【0175】

免疫蛍光：
細胞は、新鮮に調製した４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ中３％ＢＳＡ）と共に１時間室温でインキュベートした。０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００を使用して、１５分間４℃で透過処理を実行した。一次抗体をブロッキングバッファーに希釈し、細胞と共に一晩４℃でインキュベートし、続いて１×ＰＢＳで３回洗浄した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７にコンジュゲートした二次抗体を細胞と共に１時間インキュベートし、続いて１×ＰＢＳで３回洗浄した。１：１００００でヘキスト３３３４２色素を使用してＤＮＡを１０分間染色した（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｈ３５７０）。１０×０．４５ＮＡ対物レンズを備えるＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴｉまたはＴｉ２顕微鏡において画像を獲得した。各細胞のヘキストシグナルの積分強度を得ることにより、ＤＮＡ含量を決定した。ＤＮＡ含量のヒストグラムをプロットし、閾値および２Ｎピークの終わりを導くことにより、細胞を３〜４Ｎ ＤＮＡ含量として描写した。

【0176】

抗体および試薬：
本研究で使用した抗体は、ホスホ−Ｒｂ（Ｓｅｒ８０７／８１１）（ＣＳＴ ８５１６）、ホスホ−ヌクレオリン（Ｔｈｒ８４）（Ａｂｃａｍ ａｂ１９６３３８）、ホスホ−ＮＢＳ１（Ｓｅｒ４３２）（Ａｂｃａｍ ａｂ１２２９７）、ホスホ−ＣＤＣ６（Ｓｅｒ５４）（Ａｂｃａｍ ａｂ７５８０９）、ＧＡＰＤＨ（図４ではＣＳＴ ５１７４、図５ではＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＺＧ００３）、β−チューブリン（ＣＳＴ ８６２９８）、ヒストンＨ３（ＣＳＴ）、ＣＤＫ２（Ａｂｃａｍ ａｂ３２１４７）、ＣＤＫ４（Ａｂｃａｍ ａｂ１０８３５７）、ＣＤＫ６（Ａｂｃａｍ ａｂ１５１２４７およびａｂ１２４８２１）、サイクリンＤ１（サイクリンＤ１クローンＳＰ４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＲＭ−９１４０−Ｓ０）、サイクリンＤ２（ＣＳＴ ３７４１）、サイクリンＤ３（ＣＳＴ ２９３６）、ホスホ−ＣＤＫ２ Ｔ１６０（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ２５６１）、ＣＤＫ２（Ａｂｃａｍ ３２１４７）、ｐ２１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ６２４６）、サイクリンＥ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ４８１）、ビンキュリン（Ｓｉｇｍａ Ｖ９１３１）、Ａｌｅｘａ ４８８ヤギ抗マウス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ−１１００１）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６ヤギ抗ウサギ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ−１１０３５）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ヤギ抗ウサギ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ−２１２４５）であった。

【0177】

パルボシクリブおよびＰＦ３６００は、無水ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号：２７６８５５）に溶解した；パルボシクリブは、１μＭの最終濃度となるように添加し、Ｐ３６００は、指し示される通り、２５ｎＭ、１００ｎＭまたは５００ｎＭの最終濃度となるように添加した。アベマシクリブ（カタログ番号：ＨＹ−１６２９７Ａ）およびリボシクリブ（カタログ番号：ＨＹ−１５７７７）は、ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓから購入し、無水ＤＭＳＯに溶解した。アベマシクリブは、１μＭの最終濃度となるように添加し、リボシクリブは、５μＭの最終濃度となるように添加した。３ＭＢ−ＰＰ１（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌカタログ番号：１７８６０）は、無水ＤＭＳＯに溶解し、１０μＭの最終濃度となるように添加した。ＲＯ３３０６（＃ＳＭＬ０５６９）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。

【0178】

共免疫沈降：
ＤＭＳＯまたは１００ｎＭ ＰＦ３６００で２４時間処置したＭＣＦ１０Ａ細胞は、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ホスファターゼ阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｐ８３４０の１：１０００希釈）を補充した１×細胞溶解バッファー（ＣＳＴ ９８０３）を使用して溶解した。ライセートにおける総タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用して測定し、等しい含量のタンパク質を５μｇの抗体と共に一晩４℃でインキュベートした。プロテインＧ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ １０００３Ｄ）とインキュベートすることにより、抗原−抗体複合体をプルダウンし、１×溶解バッファーで３回洗浄した。ビーズに結合したタンパク質は、１×ＬＤＳ試料バッファー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＮＰ０００７）を使用して溶出し、ウエスタンブロッティングによって解析した。

【0179】

ホスホ−セリン８０７／８１１ Ｒｂ ＥＬＩＳＡ：
ＭＣＦ１０ＡまたはＭＣＦ７細胞を、９６ウェル細胞培養プレート内の成長培地に２５，０００細胞／ウェルで播種し、３７℃で５％ＣＯ_２により一晩接着させた。翌日、１０ｍＭストックから１１ポイント３倍希釈曲線のためにＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）において化合物を系列希釈した。細胞における０．１％ＤＭＳＯにおける最終濃度１０μＭトップ用量のための細胞における１：５希釈に先立ち、化合物を成長培地へ中間的に１：２００希釈した。細胞を１時間３７℃で５％ＣＯ_２において処置した。プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、５８７２）、ＳＤＳおよびＰＭＳＦを含有する溶解バッファー（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、９８０３）に細胞を氷上で溶解し、４℃での一晩インキュベーションのために、予めコーティングされブロッキングされた抗ホスホ−Ｓｅｒ８０７／８１１ Ｒｂ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、８５１６）ＥＬＩＳＡプレートに移した。プレートをリン酸緩衝溶液で洗浄して、残渣非結合細胞タンパク質を除去し、総Ｒｂ検出抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、９３０９）を９０分間３７℃で添加した。非結合総Ｒｂ抗体を除去するための洗浄後に、ＨＲＰをタグ付けされた抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、７０７６）を３０分間３７℃で結合させた。非結合ＨＲＰ抗体を除去するための洗浄後に、Ｇｌｏ基質試薬（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＹ９９３）を添加し、光から保護しつつ５〜１０分間インキュベートした。Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）において発光モードでプレートを読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン８．０．２を使用してＩＣ５０値を計算した。

【0180】

ウエスタンブロッティング：
等しい数の細胞を使用した、１×ＬＤＳ試料バッファー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＮＰ００７）を使用して、ライセートを調製した。ＮｕＰＡＧＥプレキャストポリアクリルアミドゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＮＰ０３０１）を使用して、タンパク質を分離した。総タンパク質は、Ａｚｕｒｅ Ｒｅｄ色素（Ａｚｕｒｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＣ２１２４）を使用して定量化し、目的の抗体のシグナルの正規化に使用した。使用した一次抗体は、「抗体」セクションにて指定されている。ＨＲＰコンジュゲートまたはＩＲ７００およびＩＲ８００標識蛍光二次抗体を可視化のために使用した（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７０７４および７０７６）。

【0181】

図７Ｂにおけるウエスタンブロットのため、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤のカクテル（ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ、Ｒｏｃｈｅ、１１８３６１５３００１；ホスファターゼ阻害剤カクテル２および３、Ｓｉｇｍａ、Ｐ５７２６およびＰ００４４）を補充したタンパク質溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ−４０）においてタンパク質抽出を行った。Ｂｒａｄｆｏｒｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）法を使用してタンパク質濃度を測定した。腫瘍組織から得た２５ｇのタンパク質抽出物を、ＮＵＰＡＧＥ ＴＭ ４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｍｉｄｉゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において分離し、ニトロセルロース膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に転写し、一次抗体によりブロットした。マウスまたはウサギＩｇＧに対するヤギ二次抗体（ＨＲＰ、ＤａｋｏおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により一次抗体を検出し、ＥＣＬウエスタンブロット検出溶液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により可視化した。

【0182】

ｍＲＮＡ ＦＩＳＨ：
ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから標的特異的ｍＲＮＡプローブを得て、ＶｉｅｗＲＮＡ ＩＳＨキット（ＱＶＣ００１）を製造業者のプロトコールと共に使用して、単細胞における標的ｍＲＮＡ発現を検出した。本研究で使用したプローブは、ＣＣＮＤ１（ＶＡ６−１６９４３−ＶＣ）、ＣＣＮＤ２（ＶＡ４−３０８３６１５−ＶＣ）、ＣＣＮＤ３（ＶＡ６−１７６９６−ＶＣ）、ＣＤＫ４（ＶＡ６−１８８８０）およびＣＤＫ６（ＶＡ６−３１６９２５３）である。ｍＲＮＡ ＦＩＳＨシグナルの定量化のため、ヘキストを使用して核マスクを得て、これは、細胞当たりのメジアン細胞質シグナル強度を得るために１ピクセルにより拡張された。

【0183】

単細胞ＣＤＫ２活性解析：
イメージング期間中に分裂して薬物処置を受けた、非同期的に周期を進める細胞は、薬物添加時点に対する相対的な細胞の分裂後期の時間に基づきカテゴリーへと最初に分割した。次に、このような細胞はその上、有糸分裂事象後のそのＤＨＢ細胞質／核（Ｃ／Ｎ）比に基づきサブカテゴリー化した。Ｃ／Ｎ比は、細胞質の核に対する平均ＤＨＢ蛍光の比を定量化することにより計算し、細胞質構成成分は、核マスクの外側のピクセルのリングの上位５０パーセンタイルの平均として計算した。

【0184】

分裂後期３時間後にＤＨＢ Ｃ／Ｎ比が、０．５単位を上回る場合、細胞は、ＣＤＫ２^ｉｎｃとして分類し、それ以外の場合は、ＣＤＫ２^ｌｏｗとして分類した。図の説明文は、ＣＤＫ２^ｉｎｃ細胞のみがプロットされたか、または全ての細胞がプロットされたかを指し示す。次に、サブカテゴリーにおける単細胞トレースのメジアンを使用して、特定のサブカテゴリーを代表する９５％信頼区間によるメジアントレースを作成した。カスタムＭＡＴＬＡＢスクリプトを使用して、全ての細胞トレース解析を行った。要求に応じてコードを利用できる。

【0185】

ホスホ−プロテオミクス：
以前に記載された通りに（Ｌａｐｅｋら、２０１７ｂ）、ホスホ−ペプチド濃縮を行った。次に、以前に記載された通りに（ＥｄｗａｒｄｓおよびＨａａｓ、２０１６）、凍結乾燥したホスホ−ペプチドをＴＭＴ標識し、逆相塩基性ｐＨ分画によって分画し、画分を組み合わせた。画分を凍結乾燥し、ＭＳ解析まで８０℃で貯蔵した。ＬＣ−ＭＳ２／ＭＳ３解析のため、１０μＬの５％ギ酸中５％アセトニトリルにおいて試料を復元し、各画分のうち８μＬを解析のためにＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓに注射した。

【0186】

６０℃に加熱したＰｅｐＭａｐ ＲＳＬＣ Ｃ１８カラム（２μｍ、１００Å、７５μｍ×５０ｃｍ）において、３００ｎＬ／分で７〜３２％溶媒Ｂ（０．１％ギ酸中８０％アセトニトリル）の１６５分間勾配においてペプチドを溶出した。５秒間サイクルによるトップスピードモードでスペクトルを獲得した。５００〜１５００ｍ／ｚの範囲にわたる６００００分解能でＯｒｂｉｔｒａｐにおいて、ＭＳ１データを収集した。２×１０^５の自動利得制御（ＡＧＣ）標的を、１００ミリ秒の最大注射時間により使用した。急速スキャン速度、７０ミリ秒の最大注射時間および２×１０^４のＡＧＣ標的によるイオントラップにおいて、ＭＳ２データを獲得した。０．５ｍ／ｚの単離ウィンドウにより、四重極を単離のために使用した。１０ミリ秒の活性化時間および０．２５の活性化Ｑにより、３０％正規化衝突エネルギーにおけるＣＩＤによりペプチドを断片化した。ＭＳ３スペクトルのため、最大１０イオンが同期的前駆物質選択のために選択され、Ｏｒｂｉｔｒａｐにおける６００００分解能でデータを収集した。５５％のエネルギーにおけるＨＣＤによりイオンを断片化した。２５０ミリ秒の最大注射時間および１１０ｍ／ｚの第１の質量により、ＭＳ３ ＡＧＣを１×１０^５に設定した。全ステージにおけるデータは、質量中心（centroided）であった。

【0187】

その結果得られる未加工のファイルをＩＰ２ＧＰＵサーバー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｃ．）で処理した。現在の夾雑物（contaminant）データベースおよびリバース（reverse）データベースに連結されたＵｎｉｐｒｏｔヒトデータベース（２０１８年１月２９日にダウンロード）に対して、ＰｒｏＬｕＣＩＤアルゴリズム（Ｘｕら、２０１５）によりデータを検索した。システイン残基のカルバミドメチル化（Carbamidomethylation）（＋５７．０２１４６）ならびにペプチドｎ末端およびリジン残基のＴＭＴ−１１修飾（＋２２９．１６２９３２）が、静的修飾として含まれた。メチオニンの酸化（＋１５．９９４９）ならびにセリン、スレオニンおよびチロシンのリン酸化（＋７９．９６６３３１）が、可変的修飾として含まれた。最大４個の可変的修飾および２個の見逃された切断が許される。ペプチドは、考慮されるために最小で６アミノ酸の長さを有する必要があった。５０ｐｐｍ ＭＳ１許容値（Ｈｕｔｔｌｉｎら、２０１０）および８００ｐｐｍ ＭＳ２許容値によりデータを検索した。１％タンパク質レベル偽発見率へと最終データにフィルターをかけた。

【0188】

以前に記載された通りに（Ｌａｐｅｋら、２０１７ａ）、多段階プロセスでデータを正規化した。手短に説明すると、最初のデータは、プールされたブリッジチャネルに対して正規化して、ラン間の（run-to-run）機器性能差を補償し、次いで、メジアンを磨いて（scrub）、任意の混合エラーを補償した。全ホスホデータを処理し、ペプチドレベルで解析した。

【0189】

実験モデル詳細：
Ｉｃａｈｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＲｏｂｅｒｔ Ｆｉｓｈｅｒ研究室の厚意により得られたＲＰＥ−ｈＴＥＲＴ野生型およびＣＤＫ２アナログ感受性細胞を例外として、本研究で使用した細胞株は、ＡＴＣＣから得た。ＭＣＦ１０Ａ（ヒト乳房上皮）細胞は、５％ウマ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０ｎｇ／ｍＬ上皮成長因子（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．５ｍｇ／ｍＬヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００ｎｇ／ｍＬコレラ毒素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および１０μｇ／ｍＬインスリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２において培養した。ＲＰＥ−ｈＴＥＲＴ細胞は、１０％ＦＢＳを有するＤＭＥＭにおいて育成した。ＭＣＦ７およびＯＶＣＡＲ３細胞は、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０を使用して育成した。ｓｉＲＮＡトランスフェクション中を除いて、全ての完全成長培地に、ペニシリン／ストレプトマイシンを補充した。全ての細胞は、３７℃で５％ＣＯ２により培養した。

【0190】

マウス研究：
マウス：Ｋｒａｓ^{＋／ＬＳＬＧ１２Ｖ}Ｔｒｐ５３^Ｌ／ＬおよびＣｄｋ２^−／−マウスは、以前に記載された（Ｇｕｅｒｒａら、２００３；Ｊｏｎｋｅｒｓら、２００１；Ｏｒｔｅｇａら、２００３）。次の導入遺伝子：Ｋｒａｓ^{＋／ＬＳＬＧ１２Ｖ}（Ｇｕｅｒｒａら、２００３）；Ｔｒｐ５３^Ｌ／Ｌ（Ｌｅｅら、２０１２）およびＣｄｋ２^−／−（Ｏｒｔｅｇａら、２００３）を使用した複合マウスを本研究のために作製した。全動物実験は、Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｐａｎｉｓｈ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ（ＣＮＩＯ）、Ｃａｒｌｏｓ ＩＩＩ Ｈｅａｌｔｈ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅおよびＡｕｔｏｎｏｍｏｕｓ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｏｆ Ｍａｄｒｉｄ（ＰＲＯＥＸ ２７０／１４）によって承認され、Ｃｏｕｎｃｉｌ ｆｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＩＯＭＳ）によって開発されたＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｕｉｄｉｎｇ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ Ａｎｉｍａｌｓに記されたガイドラインに従って実施された。マウスは、ＣＮＩＯのＡｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＡＡＡＬＡＣ、ＪＲＳ：ｄｐＲ ００１６５９）において特定病原体を含まない条件下で収容した。雌および雄マウスを実験に使用した。全マウスは、ＣＮＩＯのＧｅｎｏｍｉｃ Ｕｎｉｔにおいて遺伝子型決定した。

【0191】

肺腫瘍誘導：麻酔した（ケタミン７５ｍｇ／ｋｇ、キシラジン１２ｍｇ／ｋｇ）８週齢マウスにおいて、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードするアデノウイルス（Ａｄ−Ｃｒｅ）の１０^６ｐｆｕ／マウスの単一用量の鼻腔内滴下注入によって、肺腺癌の誘導を実行した。全アデノウイルス調製物は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ（Ｉｏｗａ Ｃｉｔｙ、ＵＳＡ）から購入した。

【0192】

マイクロＣＴイメージング：画像研究は、ＣＮＩＯのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｕｎｉｔによって行われた。１％〜３％イソフルラン／酸素混合物の連続流（０．５Ｌ／分）によりマウスを麻酔し、ＣｏｍｐａＣＴスキャナー（ＳＥＤＥＣＡＬ Ｍａｄｒｉｄ ＳｐａｉｎＧＥ）により行われる三次元マイクロコンピュータ処理断層撮影によって胸部区域をイメージングした。３６０度スキャンによる７２０投射、３フレームによる１００ミリ秒の積分時間、５０ＫｅＶの光子エネルギーおよび１００ｕＡの電流により、データを獲得した。ＧＥ ＭｉｃｒｏＶｉｅｗソフトウェアｖ２．２により腫瘍測定値を得た。次の通りに腫瘍体積を計算した：（短軸×短軸×長軸／２）。

【0193】

マウスにおける薬理学的処置：Ｋｒａｓ^{＋／ＬＳＬＧ１２Ｖ}；Ｔｒｐ５３^Ｌ／Ｌ；Ｃｄｋ２^−／−およびＫｒａｓ^{＋／ＬＳＬＧ１２Ｖ}；Ｔｒｐ５３^Ｌ／Ｌ；Ｃｄｋ２^＋／＋マウスを、１０^６ｐｆｕのＡｄ−Ｃｒｅに感染させた。ＣＴによって腫瘍が検出されたら、３ｍｍ^３よりも大きい少なくとも１個の腫瘍を有するマウスを異なる処置群に登録した。パルボシクリブは、７０ｍｇ／ｋｇ ＱＤで４週間投薬し、ＰＦ３６００は、５０ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤで４週間投薬した。薬物有効性は、ＣＴ測定によってモニターした。

【0194】

【表1-1】

【0195】

【表1-2】

【0196】

【表1-3】

【0197】

【表1-4】

【0198】

【表1-5】

【0199】

【表1-6】

【0200】

【表1-7】

【0201】

【表1-8】

【0202】

参考文献
次の参考文献は、それらの全体を参照により本明細書に組み込む：
［１］Akiyama, T.,
Ohuchi, T., Sumida, S., Matsumoto, K.およびToyoshima, K. (1992)「ｃｄｋ２による網膜芽細胞腫タンパク質のリン酸化（Phosphorylation of the retinoblastoma protein by cdk2）」Proc Natl Acad Sci U S A 89, 7900-7904.
［２］Aktas, H., Cai,
H.およびCooper, G.M. (1997)「Ｒａｓは、サイクリンＤ１およびＣｄｋ阻害剤ｐ２７ＫＩＰ１の調節により、成長因子シグナリングを細胞周期機構に関連付ける（Ras links growth factor signaling to the cell cycle machinery via
regulation of cyclin D1 and the Cdk inhibitor p27KIP1）」Mol Cell Biol 17, 3850-3857.
［３］Aleem, E.,
Kiyokawa, H.およびKaldis, P.
(2005)「Ｃｄｃ２−サイクリンＥ複合体は、Ｇ１／Ｓ期移行を調節する（Cdc2-cyclin E complexes regulate the G1/S phase transition）」Nat Cell Biol 7, 831-836.
［４］Arora, M.,
Moser, J., Phadke, H., Basha, A.A.およびSpencer, S.L. (2017)「母細胞における内因性複製ストレスは、娘細胞の静止状態をもたらす（Endogenous Replication Stress in Mother Cells Leads to Quiescence of
Daughter Cells）」Cell reports
19, 1351-1364.
［５］Baldin, V.,
Lukas, J., Marcote, M.J., Pagano, M.およびDraetta, G. (1993)「サイクリンＤ１は、Ｇ１期の細胞周期進行に要求される核タンパク質である（Cyclin D1 is a nuclear protein required for cell cycle progression
in G1）」Genes Dev 7, 812-821.
［６］Barriere, C.,
Santamaria, D., Cerqueira, A., Galan, J., Martin, A., Ortega, S., Malumbres,
M., Dubus, P.およびBarbacid, M.
(2007)「マウスは、Ｃｄｋ４およびＣｄｋ２なしで発育する（Mice
thrive without Cdk4 and Cdk2）」Mol
Oncol 1, 72-83.
Berthet, C., Aleem, E., Coppola, V.,
Tessarollo, L.およびKaldis, P.
(2003)「Ｃｄｋ２ノックアウトマウスは生存可能である（Cdk2
knockout mice are viable）」Curr
Biol 13, 1775-1785.
［７］Brookes, S.,
Gagrica, S., Sanij, E., Rowe, J., Gregory, F.J., Hara, E.およびPeters, G. (2015)「細胞老化のコンディショナルモデルにおけるＣＤＫ４依存性チェックポイントの証拠（Evidence for a CDK4-dependent checkpoint in a conditional model of
cellular senescence）」Cell Cycle
14, 1164-1173.
［８］Burkhart, D.L.およびSage, J. (2008)「網膜芽細胞腫遺伝子による腫瘍抑制の細胞機構（Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene）」Nat Rev Cancer 8, 671-682.
［９］Caldon, C.E.,
Sergio, C.M., Kang, J., Muthukaruppan, A., Boersma, M.N., Stone, A.,
Barraclough, J., Lee, C.S., Black, M.A., Miller, L.D.ら、(2012)「サイクリンＥ２過剰発現は、内分泌抵抗性に関連するが、ヒト乳がん細胞におけるＣＤＫ２阻害に対する非感受性には関連しない（Cyclin E2 overexpression is associated with endocrine resistance but
not insensitivity to CDK2 inhibition in human breast cancer cells）」Mol Cancer Ther 11, 1488-1499.
［１０］Cappell, S.D.,
Chung, M., Jaimovich, A., Spencer, S.L.およびMeyer, T. (2016)「不可逆的ＡＰＣ（Ｃｄｈ１）不活性化は、細胞周期進入のポイントオブノーリターンの根底にある（Irreversible APC(Cdh1) Inactivation Underlies the Point of No Return
for Cell-Cycle Entry）」Cell 166,
167-180.
［１１］Chellappan,
S.P., Hiebert, S., Mudryj, M., Horowitz, J.M.およびNevins, J.R. (1991)「Ｅ２Ｆ転写因子は、ＲＢタンパク質の細胞標的である（The E2F transcription factor is a cellular target for the RB protein）」Cell 65, 1053-1061.
［１２］Chung, M., Liu,
C., Yang, H.W., Koberlin, M.S., Cappell, S.D.およびMeyer, T. (2019)「ＣＤＫ４／６活性における一過性ヒステリシスは、Ｇ１期における制限点の通過の根底にある（Transient Hysteresis in CDK4/6 Activity Underlies Passage of the
Restriction Point in G1）」Mol
Cell.
［１３］Deshpande, A.,
Sicinski, P.およびHinds, P.W.
(2005)「発生およびがんにおけるサイクリンおよびｃｄｋ：展望（Cyclins and cdks in development and cancer: a perspective）」Oncogene 24, 2909-2915.
［１４］Edwards, A.およびHaas, W. (2016)「ヒト細胞株のハイスループット包括的プロテオーム比較のためのマルチプレックス化定量的プロテオミクス（Multiplexed Quantitative Proteomics for High-Throughput
Comprehensive Proteome Comparisons of Human Cell Lines）」Methods in molecular biology 1394, 1-13.
［１５］Evron, E.,
Umbricht, C.B., Korz, D., Raman, V., Loeb, D.M., Niranjan, B., Buluwela, L.,
Weitzman, S.A., Marks, J.およびSukumar,
S. (2001)「乳がんの大部分におけるサイクリンＤ２発現の損失は、プロモーター過剰メチル化に関連する（Loss of cyclin D2 expression in the majority of breast cancers is
associated with promoter hypermethylation）」Cancer Res 61, 2782-2787.
［１６］Fisk, H.A.およびWiney, M. (2001)「マウスＭｐｓ１ｐ様キナーゼは、中心体重複を調節する（The mouse Mps1p-like kinase regulates centrosome duplication）」Cell 106, 95-104.
［１７］Franco, J.,
Witkiewicz, A.K.およびKnudsen,
E.S. (2014)「ＣＤＫ４／６阻害剤は、膵がんのモデルにおいて経路選択的治療剤と組み合わせて強力な活性を有する（CDK4/6 inhibitors have potent activity in combination with pathway
selective therapeutic agents in models of pancreatic cancer）」Oncotarget 5, 6512-6525.
［１８］Gabrielli,
B.G., Sarcevic, B., Sinnamon, J., Walker, G., Castellano, M., Wang, X.Q.およびEllem, K.A. (1999)「Ｇ２期細胞周期進行に要求されるサイクリンＤ−Ｃｄｋ４活性は、紫外線照射に誘導されたＧ２期遅延において阻害される（A cyclin D-Cdk4 activity required for G2 phase cell cycle
progression is inhibited in ultraviolet radiation-induced G2 phase delay）」J Biol Chem 274, 13961-13969.
［１９］Gookin, S.,
Min, M.W., Phadke, H., Chung, M.Y., Moser, J., Miller, I., Carter, D.およびSpencer, S.L. (2017)「細胞周期進行および細胞周期脱出におけるタンパク質動力学のマップ（A map of
protein dynamics during cell-cycle progression and cell-cycle exit）」Plos Biology 15.
［２０］Grim, J.E.およびClurman, B.E. (2003)「ＣＤＫ２なしで周期を進める？（Cycling without CDK2?）」Trends Cell Biol 13, 396-399.
［２１］Guerra, C.,
Mijimolle, N., Dhawahir, A., Dubus, P., Barradas, M., Serrano, M., Campuzano,
V.およびBarbacid, M. (2003)「内因性Ｋ−ｒａｓ癌遺伝子による腫瘍誘導は、細胞の状況に高度に依存する（Tumor
induction by an endogenous K-ras oncogene is highly dependent on cellular
context）」Cancer Cell 4,
111-120.
［２２］Hata, A.N.,
Niederst, M.J., Archibald, H.L., Gomez-Caraballo, M., Siddiqui, F.M., Mulvey,
H.E., Maruvka, Y.E., Ji, F., Bhang, H.E., Krishnamurthy Radhakrishna, V.ら、(2016)「腫瘍細胞は、別個の進化経路に従って、上皮成長因子受容体阻害に対して抵抗性になることができる（Tumor cells can follow distinct evolutionary paths to become
resistant to epidermal growth factor receptor inhibition）」Nature medicine 22, 262-269.
［２３］Herrera-Abreu,
M.T., Palafox, M., Asghar, U., Rivas, M.A., Cutts, R.J., Garcia-Murillas, I.,
Pearson, A., Guzman, M., Rodriguez, O., Grueso, J.ら、(2016)「エストロゲン受容体陽性乳がんにおけるＣＤＫ４／６阻害に対する初期適応および獲得抵抗性（Early Adaptation and Acquired Resistance to CDK4/6 Inhibition in
Estrogen Receptor-Positive Breast Cancer）」Cancer Res 76, 2301-2313.
［２４］Hu, M.G.,
Deshpande, A., Enos, M., Mao, D., Hinds, E.A., Hu, G.F., Chang, R., Guo, Z.,
Dose, M., Mao, C.ら、(2009)「胸腺細胞発生および腫瘍発生におけるサイクリン依存性キナーゼ６の要求（A
requirement for cyclin-dependent kinase 6 in thymocyte development and
tumorigenesis）」Cancer Res 69,
810-818.
［２５］Huttlin, E.L.,
Jedrychowski, M.P., Elias, J.E., Goswami, T., Rad, R., Beausoleil, S.A.,
Villen, J., Haas, W., Sowa, M.E.およびGygi, S.P. (2010)「マウスタンパク質リン酸化および発現の組織特異的アトラス（A tissue-specific atlas of mouse protein phosphorylation and
expression）」Cell 143,
1174-1189.
［２６］Jonkers, J.,
Meuwissen, R., van der Gulden, H., Peterse, H., van der Valk, M.およびBerns, A. (2001)「乳がんのコンディショナルマウスモデルにおけるＢＲＣＡ２およびｐ５３の相乗的腫瘍サプレッサー活性（Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a
conditional mouse model for breast cancer）」Nat Genet 29, 418-425.
［２７］Kato, J.,
Matsushime, H., Hiebert, S.W., Ewen, M.E.およびSherr, C.J. (1993)「網膜芽細胞腫遺伝子産物（ｐＲｂ）へのサイクリンＤの直接的結合およびサイクリンＤ依存性キナーゼＣＤＫ４によるｐＲｂリン酸化（Direct binding of cyclin D to the retinoblastoma gene product (pRb)
and pRb phosphorylation by the cyclin D-dependent kinase CDK4）」Genes Dev 7, 331-342.
［２８］Katsuno, Y.,
Suzuki, A., Sugimura, K., Okumura, K., Zineldeen, D.H., Shimada, M., Niida, H.,
Mizuno, T., Hanaoka, F.およびNakanishi,
M. (2009)「サイクリンＡ−Ｃｄｋ１は、哺乳類細胞における複製起点点火（origin firing）プログラムを調節する（Cyclin A-Cdk1 regulates the origin firing program in mammalian cells）」Proc Natl Acad Sci U S A 106, 3184-3189.
［２９］Keyomarsi, K.,
Tucker, S.L., Buchholz, T.A., Callister, M., Ding, Y., Hortobagyi, G.N.,
Bedrosian, I., Knickerbocker, C., Toyofuku, W., Lowe, M.ら、(2002)「乳がん患者におけるサイクリンＥおよび生存（Cyclin E and survival in patients with breast cancer）」N Engl J Med 347, 1566-1575.
［３０］Khatib, Z.A.,
Matsushime, H., Valentine, M., Shapiro, D.N., Sherr, C.J.およびLook, A.T. (1993)「ヒト肉腫におけるＭＤＭ２およびＧＬＩとＣＤＫ４遺伝子との共増幅（Coamplification of the CDK4 gene with MDM2 and GLI in human sarcomas）」Cancer Res 53, 5535-5541.
［３１］Lapek, J.D.,
Jr., Greninger, P., Morris, R., Amzallag, A., Pruteanu-Malinici, I., Benes,
C.H.およびHaas, W. (2017a)「ハイスループットプロテオミクスによるタンパク質関連ネットワークの調節不全の検出は、がん脆弱性を予測する（Detection of dysregulated protein-association networks by
high-throughput proteomics predicts cancer vulnerabilities）」Nature biotechnology 35, 983-989.
［３２］Lapek, J.D.,
Jr., Lewinski, M.K., Wozniak, J.M., Guatelli, J.およびGonzalez, D.J. (2017b)「誘導性ＨＩＶ−１モデルの定量的時間的ビロミクス（Viromics）は、タンパク質Ｖｐｒに関連する網羅的宿主標的およびホスホ動力学に関する洞察をもたらす（Quantitative Temporal Viromics of an Inducible HIV-1 Model Yields
Insight to Global Host Targets and Phospho-Dynamics Associated with Protein Vpr）」Molecular & cellular proteomics : MCP
16, 1447-1461.
［３３］Lee, C.L.,
Moding, E.J., Huang, X., Li, Y., Woodlief, L.Z., Rodrigues, R.C., Ma, Y.およびKirsch, D.G. (2012)「ＦＲＴフランキングｐ５３マウスにおけるＦｌｐリコンビナーゼによる原発性腫瘍の作製（Generation
of primary tumors with Flp recombinase in FRT-flanked p53 mice）」Dis Model Mech 5, 397-402.
［３４］Lindqvist, A.,
Rodriguez-Bravo, V.およびMedema,
R.H. (2009)「有糸分裂に進む決断：有糸分裂進入ネットワークにおけるフィードバックおよび冗長性（The decision to enter mitosis: feedback and redundancy in the
mitotic entry network）」Journal
of Cell Biology 185, 193-202.
［３５］Lohka, M.J., Hayes,
M.K.およびMaller, J.L. (1988)「初期有糸分裂事象の細胞内調節因子である卵成熟促進因子の精製（Purification
of maturation-promoting factor, an intracellular regulator of early mitotic
events）」Proc Natl Acad Sci U S
A 85, 3009-3013.
［３６］Lundberg, A.S.およびWeinberg, R.A. (1998)「網膜芽細胞腫タンパク質の機能的不活性化は、少なくとも２種の別個のサイクリン−ｃｄｋ複合体による逐次修飾を要求する（Functional inactivation of the retinoblastoma protein requires
sequential modification by at least two distinct cyclin-cdk complexes）」Molecular and cellular biology 18,
753-761.
［３７］Malumbres, M.,
Sotillo, R., Santamaria, D., Galan, J., Cerezo, A., Ortega, S., Dubus, P.およびBarbacid, M. (2004)「哺乳類細胞は、Ｄ型サイクリン依存性キナーゼＣｄｋ４およびＣｄｋ６なしで周期を進める（Mammalian
cells cycle without the D-type cyclin-dependent kinases Cdk4 and Cdk6）」Cell 118, 493-504.
［３８］Massague, J.
(2004)「Ｇ１細胞周期制御およびがん（G1
cell-cycle control and cancer）」Nature
432, 298-306.
［３９］Matsushime, H.,
Ewen, M.E., Strom, D.K., Kato, J.Y., Hanks, S.K., Roussel, M.F.およびSherr, C.J. (1992)「哺乳類Ｄ型Ｇ１サイクリンの非定型触媒サブユニット（ｐ３４ＰＳＫ−Ｊ３／ｃｄｋ４）の同定および特性（Identification and properties of an atypical catalytic subunit
(p34PSK-J3/cdk4) for mammalian D type G1 cyclins）」Cell 71, 323-334.
［４０］Matsushime, H.,
Quelle, D.E., Shurtleff, S.A., Shibuya, M., Sherr, C.J.およびKato, J.Y. (1994)「哺乳類細胞におけるＤ型サイクリン依存性キナーゼ活性（D-type cyclin-dependent kinase activity in mammalian cells）」Mol Cell Biol 14, 2066-2076.
［４１］Merrick, K.A.,
Wohlbold, L., Zhang, C., Allen, J.J., Horiuchi, D., Huskey, N.E., Goga, A.,
Shokat, K.M.およびFisher, R.P.
(2011)「ヒト細胞増殖における要件を明らかにするために、低分子によりＣｄｋ２のスイッチをオンまたはオフにする（Switching Cdk2 On or Off with Small Molecules to Reveal Requirements
in Human Cell Proliferation）」Molecular
Cell 42, 624-636.
［４２］Meyerson, M.およびHarlow, E. (1994)「新規サイクリンＤパートナーであるｃｄｋ６のＧ１キナーゼ活性の同定（Identification of G1 kinase activity for cdk6, a novel cyclin D
partner）」Mol Cell Biol 14, 2077-2086.
［４３］Mittnacht, S.,
Lees, J.A., Desai, D., Harlow, E., Morgan, D.O.およびWeinberg, R.A. (1994)「網膜芽細胞腫タンパク質の別個の亜集団は、リン酸化の別個のパターンを示す（Distinct sub-populations of the retinoblastoma protein show a
distinct pattern of phosphorylation）」EMBO J 13, 118-127.
［４４］Moons, D.S.,
Jirawatnotai, S., Parlow, A.F., Gibori, G., Kineman, R.D.およびKiyokawa, H. (2002)「サイクリン依存性キナーゼ４を欠乏するマウスにおける下垂体形成不全および乳腺刺激ホルモン分泌細胞機能不全（Pituitary hypoplasia and lactotroph dysfunction in mice deficient
for cyclin-dependent kinase-4）」Endocrinology
143, 3001-3008.
［４５］Musgrove, E.A.,
Caldon, C.E., Barraclough, J., Stone, A.およびSutherland, R.L. (2011)「がんにおける治療標的としてのサイクリンＤ（Cyclin D as a therapeutic target in cancer）」Nat Rev Cancer 11, 558-572.
［４６］Narasimha,
A.M., Kaulich, M., Shapiro, G.S., Choi, Y.J., Sicinski, P.およびDowdy, S.F. (2014)「サイクリンＤは、モノリン酸化によりＲｂ腫瘍サプレッサーを活性化する（Cyclin D
activates the Rb tumor suppressor by mono-phosphorylation）」Elife 3.
Ohtani, K., DeGregori, J.およびNevins, J.R. (1995)「転写因子Ｅ２Ｆ１によるサイクリンＥ遺伝子の調節（Regulation of the
cyclin E gene by transcription factor E2F1）」Proc Natl Acad Sci U S A 92, 12146-12150.
［４７］Okuda, M.,
Horn, H.F., Tarapore, P., Tokuyama, Y., Smulian, A.G., Chan, P.K., Knudsen,
E.S., Hofmann, I.A., Snyder, J.D., Bove, K.E.ら、(2000)「ヌクレオフォスミン／Ｂ２３は、中心体重複におけるＣＤＫ２／サイクリンＥの標的である（Nucleophosmin/B23 is a target of CDK2/cyclin E in centrosome
duplication）」Cell 103, 127-140.
［４８］Ortega, S.,
Prieto, I., Odajima, J., Martin, A., Dubus, P., Sotillo, R., Barbero, J.L.,
Malumbres, M.およびBarbacid, M.
(2003)「サイクリン依存性キナーゼ２は、マウスにおいて減数分裂に必須であるが、有糸分裂の細胞分裂に必須ではない（Cyclin-dependent kinase 2 is essential for meiosis but not for
mitotic cell division in mice）」Nat
Genet 35, 25-31.
［４９］Park, S., Lee,
J., Do, I.G., Jang, J., Rho, K., Ahn, S., Maruja, L., Kim, S.J., Kim, K.M.,
Mao, M.ら、(2014)「ゲノムプロファイリングによって同定された難治性横紋筋肉腫における異常ＣＤＫ４増幅（Aberrant
CDK4 amplification in refractory rhabdomyosarcoma as identified by genomic
profiling）」Sci Rep 4, 3623.
［５０］Petersen, B.O.,
Lukas, J., Sorensen, C.S., Bartek, J.およびHelin, K. (1999)「サイクリンＡ／ＣＤＫ２による哺乳類ＣＤＣ６のリン酸化は、その細胞下局在を調節する（Phosphorylation of mammalian CDC6 by cyclin A/CDK2 regulates its
subcellular localization）」EMBO
J 18, 396-410.
［５１］Ramirez, M.,
Rajaram, S., Steininger, R.J., Osipchuk, D., Roth, M.A., Morinishi, L.S.,
Evans, L., Ji, W., Hsu, C.H., Thurley, K.ら、(2016)「多様な薬物抵抗性機構が、薬物耐性がん存続（persister）細胞から出現し得る（Diverse
drug-resistance mechanisms can emerge from drug-tolerant cancer persister cells）」Nature communications 7, 10690.
［５２］Rane, S.G.,
Dubus, P., Mettus, R.V., Galbreath, E.J., Boden, G., Reddy, E.P.およびBarbacid, M. (1999)「Ｃｄｋ４発現の損失は、インスリン欠乏性糖尿病を引き起こし、Ｃｄｋ４活性化は、ベータ島細胞肥厚をもたらす（Loss of Cdk4 expression causes insulin-deficient diabetes and Cdk4
activation results in beta-islet cell hyperplasia）」Nat Genet 22, 44-52.
［５３］Saha, P., Chen,
J., Thome, K.C., Lawlis, S.J., Hou, Z.H., Hendricks, M., Parvin, J.D.およびDutta, A. (1998)「ヒトＣＤＣ６／Ｃｄｃ１８は、Ｏｒｃ１およびサイクリン−ｃｄｋに会合し、Ｓ期開始時に核から選択的に排除される（Human CDC6/Cdc18 associates with Orc1 and cyclin-cdk and is
selectively eliminated from the nucleus at the onset of S phase）」Mol Cell Biol 18, 2758-2767.
［５４］Sanidas, I.,
Morris, R., Fella, K.A., Rumde, P.H., Boukhali, M., Tai, E.C., Ting, D.T.,
Lawrence, M.S., Haas, W.およびDyson,
N.J. (2019)「モノリン酸化のコードは、ＲＢの機能をモジュレートする（A Code of Mono-phosphorylation Modulates the Function of RB）」Mol Cell 73, 985-1000 e1006.
［５５］Santamaria, D.,
Barriere, C., Cerqueira, A., Hunt, S., Tardy, C., Newton, K., Caceres, J.F.,
Dubus, P., Malumbres, M.およびBarbacid,
M. (2007)「Ｃｄｋ１は、哺乳類細胞周期の駆動に十分である（Cdk1 is sufficient to drive the mammalian cell cycle）」Nature 448, 811-815.
［５６］Sarcevic, B.,
Lilischkis, R.およびSutherland,
R.L. (1997)「Ｄ１型、Ｄ３型、Ｅ型およびＡ型サイクリン−ＣＤＫ複合体によるＴ−４７Ｄヒト乳がん細胞基質の差次的リン酸化（Differential phosphorylation of T-47D human breast cancer cell
substrates by D1-, D3-, E-, and A-type cyclin-CDK complexes）」J Biol Chem 272, 33327-33337.
［５７］Schwarz, C.,
Johnson, A., Koivomagi, M., Zatulovskiy, E., Kravitz, C.J., Doncic, A.およびSkotheim, J.M. (2018)「正確なＣｄｋ活性閾値は、制限点の通過を決定する（A Precise Cdk
Activity Threshold Determines Passage through the Restriction Point）」Mol Cell 69, 253-264 e255.
［５８］Shaffer, S.M.,
Dunagin, M.C., Torborg, S.R., Torre, E.A., Emert, B., Krepler, C., Beqiri, M.,
Sproesser, K., Brafford, P.A., Xiao, M.ら、(2017)「がん薬物抵抗性の機序としての希少細胞可変性および薬物誘導性リプログラミング（Rare cell variability and drug-induced reprogramming as a mode of
cancer drug resistance）」Nature
546, 431-435.
［５９］Sharma, S.V.,
Lee, D.Y., Li, B., Quinlan, M.P., Takahashi, F., Maheswaran, S., McDermott, U.,
Azizian, N., Zou, L., Fischbach, M.A.ら、(2010)「がん細胞亜集団におけるクロマチン媒介性可逆的薬物耐性状態（A chromatin-mediated reversible drug-tolerant state in cancer cell
subpopulations）」Cell 141,
69-80.
［６０］Sherr, C.J.
(1993)「哺乳類Ｇ１サイクリン（Mammalian G1
cyclins）」Cell 73, 1059-1065.
［６１］Sherr, C.J.
(1994)「Ｇ１期進行：タイミング良く周期を進める（G1
phase progression: cycling on cue）」Cell 79, 551-555.
［６２］Sherr, C.J.およびRoberts, J.M. (2004)「サイクリンおよびサイクリン依存性キナーゼありまたはなしで生きる（Living with
or without cyclins and cyclin-dependent kinases）」Genes Dev 18, 2699-2711.
［６３］Spencer, S.L.,
Cappell, S.D., Tsai, F.C., Overton, K.W., Wang, C.L.およびMeyer, T. (2013)「増殖−静止状態の決断は、有糸分裂脱出におけるＣＤＫ２活性の分岐によって制御される（The proliferation-quiescence decision is controlled by a bifurcation
in CDK2 activity at mitotic exit）」Cell 155, 369-383.
［６４］Tetsu, O.およびMcCormick, F. (2003)「ＣＤＫ２阻害にもかかわらず起こるがん細胞の増殖（Proliferation of
cancer cells despite CDK2 inhibition）」Cancer Cell 3, 233-245.
［６５］Wohlbold, L.,
Merrick, K.A., De, S., Amat, R., Kim, J.H., Larochelle, S., Allen, J.J., Zhang,
C., Shokat, K.M., Petrini, J.H.ら、(2012)「化学遺伝学は、ＤＮＡ損傷応答におけるＣｄｋ２活性のための特異的な要件を明らかにし、ヒト細胞におけるＣｄｋ２基質としてＮｂｓ１を同定する（Chemical genetics reveals a specific requirement for Cdk2 activity
in the DNA damage response and identifies Nbs1 as a Cdk2 substrate in human
cells）」PLoS Genet 8, e1002935.
［６６］Xu, T., Park,
S.K., Venable, J.D., Wohlschlegel, J.A., Diedrich, J.K., Cociorva, D., Lu, B.,
Liao, L., Hewel, J., Han, X.ら、(2015)「ＰｒｏＬｕＣＩＤ：増強された感度および特異度を有する改善されたＳＥＱＵＥＳＴ様アルゴリズム（ProLuCID: An improved SEQUEST-like algorithm with enhanced
sensitivity and specificity）」Journal
of proteomics 129, 16-24.
［６７］Yang, C., Li,
Z., Bhatt, T., Dickler, M., Giri, D., Scaltriti, M., Baselga, J., Rosen, N.およびChandarlapaty, S. (2017a)「獲得されたＣＤＫ６増幅は、ＣＤＫ４／６阻害剤に対する乳がん抵抗性ならびにＥＲシグナリングおよび依存性の損失を促進する（Acquired CDK6 amplification promotes breast cancer resistance to
CDK4/6 inhibitors and loss of ER signaling and dependence）」Oncogene 36, 2255-2264.
［６８］Yang, H.W.,
Chung, M., Kudo, T.およびMeyer, T.
(2017b)「マイトジェンおよびｐ５３シグナリングの競合記憶は、細胞周期進入を制御する（Competing memories of mitogen and p53 signalling control cell-cycle
entry）」Nature 549, 404-408.
［６９］Yang, K.,
Hitomi, M.およびStacey, D.W.
(2006)「細胞周期を通したサイクリンＤ１レベルの変動は、細胞の増殖性運命を決定する（Variations in cyclin D1 levels through the cell cycle determine the
proliferative fate of a cell）」Cell
Div 1.
［７０］Zerjatke, T.,
Gak, I.A., Kirova, D., Fuhrmann, M., Daniel, K., Gonciarz, M., Muller, D.,
Glauche, I.およびMansfeld, J.
(2017)「細胞トラッキングおよび分類のための内因性オールインワンレポーターに基づく定量的細胞周期解析（Quantitative Cell Cycle Analysis Based on an Endogenous All-in-One
Reporter for Cell Tracking and Classification）」Cell Reports 19, 1953-1966.
［７１］Zhao, J.,
Kennedy, B.K., Lawrence, B.D., Barbie, D.A., Matera, A.G., Fletcher, J.A.およびHarlow, E. (2000)「ＮＰＡＴは、サイクリンＥ−Ｃｄｋ２を複製依存性ヒストン遺伝子転写の調節に関連付ける（NPAT links cyclin E-Cdk2 to the regulation of replication-dependent
histone gene transcription）」Genes
Dev 14, 2283-2297.

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図1-5】

【図1-6】

【図1-7】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図4-4】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図5-4】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】

【図6-5】

【図6-6】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図8-1】

【図8-2】

【図8-3】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【図9-4】

【図9-5】

【図9-6】

【図10-1】

【図10-2】

【図10-3】

【図11-1】

【図11-2】

【図11-3】

【図11-4】

【図11-5】

【図11-6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]

【外国語明細書】

2021167301000001.pdf