特開 2021-169444 インフルエンザウイルス阻害剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2021-169444(P2021-169444A)

(43)【公開日】2021年10月28日

(54)【発明の名称】インフルエンザウイルス阻害剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/70 20060101AFI20211001BHJP

   A61P 31/16 20060101ALI20211001BHJP

   A61K 31/519 20060101ALI20211001BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20211001BHJP

   A61K 47/06 20060101ALI20211001BHJP

   A61K 127/00 20060101ALN20211001BHJP

【ＦＩ】

   A61K36/70

   A61P31/16

   A61K31/519

   A61K9/08

   A61K47/06

   A61K127:00

【審査請求】未請求

【請求項の数】2

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2020-197693(P2020-197693)

(22)【出願日】2020年11月29日

(31)【優先権主張番号】特願2019-216910(P2019-216910)

(32)【優先日】2019年11月29日

(33)【優先権主張国】JP

(71)【出願人】

【識別番号】504229284

【氏名又は名称】国立大学法人弘前大学

(71)【出願人】

【識別番号】516294610

【氏名又は名称】吉田 久幸

(71)【出願人】

【識別番号】516294643

【氏名又は名称】佐々木 健郎

(74)【代理人】

【識別番号】100110560

【弁理士】

【氏名又は名称】松下 恵三

(72)【発明者】

【氏名】中根 明夫

(72)【発明者】

【氏名】浅野 クリスナ

(72)【発明者】

【氏名】櫻庭 裕丈

(72)【発明者】

【氏名】菊池 英純

(72)【発明者】

【氏名】佐々木 健郎

(72)【発明者】

【氏名】吉田 久幸

【テーマコード（参考）】

4C076

4C086

4C088

【Ｆターム（参考）】

4C076AA14

4C076CC35

4C076DD34

4C076DD34E

4C076FF12

4C076FF15

4C086AA01

4C086AA02

4C086CB05

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA16

4C086NA14

4C086ZB33

4C088AB43

4C088AC05

4C088BA08

4C088BA31

4C088CA09

4C088MA17

4C088NA14

4C088ZB33

(57)【要約】

【課題】 エタノールに代わるインフルエンザウイルスに効果のある薬剤が求められていること。
【解決手段】 トリプタンスリン含有藍エキスを用いてインフルエンザウイルス阻害剤とする。当該トリプタンスリン含有藍エキスは溶媒に対して５ｎｇ／ｍｌ以上の割合とする。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

藍草からリモネンを用いて抽出した藍エキス抽出液を用いたインフルエンザウイルス阻害剤。

【請求項2】

前記藍エキス抽出液は溶媒に対して５ｎｇ／ｍｌ以上、５０ｎｇ／ｍｌ以下の割合で含まれている請求項１に記載のインフルエンザウイルス阻害剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、藍葉に含まれるトリプタンスリンによる抗ウイルス作用を用いたインフルエンザウイルス阻害剤に関するものである。

【背景技術】

【0002】

従来から特許文献１に開示されたトリプタンスリン含有藍葉エキス製造方法が知られている。当該製造方法では、タデ藍の天日乾燥葉にエタノールを加えてこれを２時間還流し、室温まで自然冷却した後、メッシュ状のフィルタにより葉を濾過する。このようにして得た濾液（藍葉エタノール抽出液）をロータリーエバポレーターにより減圧蒸留し、所定総量まで濃縮する。そして、当該濃縮濾液にブチレングリコールを加えて当該エキスを溶解させトリプタンスリン含有藍葉エキスを得る。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】再表２０１２／１２４７４３

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

現在、インフルエンザの流行が問題となっていることから、エタノールを用いた消毒が活用されている。しかしながら、エタノールは、手荒れや肌荒れの原因にもなることから使用には注意が必要であった。このため、エタノールに代わるインフルエンザウイルスに効果のある薬剤が求められている。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明に係るインフルエンザウイルス阻害剤は、藍草からリモネンを用いて抽出した藍エキス抽出液を用いたことを特徴とする。当該藍エキスは溶媒に対して５ｎｇ／ｍｌ以上の割合で含めるのが好ましい。

【図面の簡単な説明】

【0006】

【図1】実験結果を示した図面代用写真である。

【図2】実験結果を示した図面代用写真である。

【図3】実験結果を示した図面代用写真である。

【図4】実験結果を示した図面代用写真である。

【図5】実験結果を示した図面代用写真である。

【図6】実験結果を示した図面代用写真である。

【図7】実験結果を示した図面代用写真である。

【実施例】

【0007】

［ネコカリシウイルス（ＦＣＶ Ｆ４）と培養条件］
試験に用いるＣｒａｎｄｅｌｌ Ｆｅｌｉｎｅ Ｋｉｄｎｅｙ（ＣＲＦＫ）細胞は、１０％胎児子牛血清（ＦＣＳ； ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）、１％Ｌ-グルタミン（和光純薬工業株式会社、大阪、日本）、および１×非必須アミノ酸（サーモフィッシャーサイエンティフィック、マサチューセッツ州ウォルサム）を添加したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ； Ｎｉｓｓｕｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ.、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）で３７度、５％ＣＯ_２で増殖させた。

【0008】

ＦＣＶを前記ＣＲＦＫ細胞に1時間吸収させ、３７度、５％ＣＯ_２で１８〜２４時間インキュベートした。細胞変性効果（ＣＰＥ）が見つかった後、上清を収集し、１回だけ凍結融解した。 続いて、８，０００×ｇ、４℃で２０分間の遠心分離により細胞破片を除去した。得られた上清を−８０℃に保ち、ウイルスストックとして使用した。９６ウェルプレートで増殖させたＣＲＦＫ細胞に感染させた後、５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ50）を計算することにより、ストックウイルスを滴定した。このストックウイルス溶液には、１．８×１０^７ＴＣＩＤ50／ｍＬが含まれる。

【0009】

［インフルエンザウイルスと培養条件］
試験には、インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１／ｐｄｍ０９／Ａ／ミシガン／４５／２０１５、Ｈ３Ｎ２／Ａ／香港／４８０１／２０１４、及び、Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１４（山形）を使用した。
これらのインフルエンザウイルスは、ＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ（大阪、日本）より入手したＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞で増殖させた。ＭＤＣＫ細胞の単層は、１０％ＦＣＳおよび１％Ｌ−グルタミンを添加したイーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ；Ｎｉｓｓｕｉ）で細胞を培養することにより調製した。

【0010】

このインフルエンザウイルスをＭＤＣＫ単層細胞に1時間吸収させ、３４度、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；和光）、１％抗生物質−抗真菌剤（Ａｂｘ；×１００ストック、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および０．６μｇ/ｍＬのＴＰＣＫ処理トリプシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加したＤＭＥＭにおいて、５％ＣＯ_２環境下でインキュベートした。次に、ＣＰＥを４〜６日間監視し、その後、培養上清を回収し、８，０００×ｇで２０分間遠心分離した。上澄みは使用するまでウイルスストックとして−８０℃で保存した。ストックウイルスの力価はＴＣＩＤ50によって評価した。ストックウイルス溶液は、Ｈ１Ｎ１/ｐｄｍ０９/Ａ/ミシガン/４５/２０１５の場合は１．０×１０^５ＴＣＩＤ50／ｍＬ、Ｈ３Ｎ２/Ａ/香港/４８０１/２０１４の場合は１．０×１０^４ＴＣＩＤ50／ｍＬ、Ｂ/プーケット/３０７３/２０１４（山形）の場合は１．０×１０^５ＴＣＩＤ50／ｍＬを含むものである。

【0011】

［ＦＣＶの細胞変性効果（ＣＰＥ）およびプラークアッセイ］
エタノールで希釈した２５マイクロリットルのあおもり藍エキス抽出液と２５μＬのエタノールのみを、それぞれ７５μＬのＦＣＶと共に室温で１０分間インキュベートした後、無血清ＥＭＥＭで１０倍段階希釈を行った。この希釈液を９６ウェルマイクロプレートで３７度、５％ＣＯ_２で１時間の条件でＣＲＦＫ単層に感染させた後、ウェル内の希釈液を５％ＦＣＳ、１％Ｌ-グルタミン、および１％非必須アミノ酸を添加したＥＭＥＭ倍地に置換した。更に、当該プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で４８時間インキュベートし、Ｇｅｎｔｉａｎバイオレットで染色してＣＰＥを評価した。

【0012】

ＦＣＶ力価はプラークアッセイによって計算した。具体的には、あおもり藍エキス抽出液とＦＣＶの段階希釈混合物を、１２ウェルマイクロプレートで３７℃、５％ＣＯ_２で1時間ＣＲＦＫ細胞に吸収させた。次に、１０％ＦＣＳおよび１％カルボキシメチルセルロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を含むＥＭＥＭ培地を重ね合わせ、３７℃、５％ＣＯ_２で３０時間インキュベートした。このウェルを３．７％ホルムアルデヒドで固定し、Ｇｅｎｔｉａｎバイオレットで染色した。そして、プラークを数えてプラーク形成単位（ＰＦＵ）として表した。

【0013】

［インフルエンザウイルスの細胞変性効果（ＣＰＥ）およびプラークアッセイ］
エタノールで希釈した９０μＬのあおもり藍エキス抽出液及びまたは９０μＬのエタノールのみを、それぞれ１０μＬのインフルエンザウイルスと共に３７℃、５％ＣＯ_２で１時間インキュベートした後、０．１％ＢＳＡ、０．６μｇ/ｍＬのＴＰＣＫ処理したトリプシンを含むＤＭＥＭにおいて１０倍段階希釈を行った。この希釈液を９６ウェルマイクロプレートで３４℃、５％ＣＯ_２の環境で１時間ＭＤＣＫ単層に感染させた後、ウェル内の希釈液を０．１％ＢＳＡ、１％Ａｂｘ、０．６μｇ/ｍＬのトリプシン処理のＴＰＣＫを添加したＤＭＥＭに置換した。このプレートを３４℃、５％ＣＯ_２で４８〜７２時間インキュベートし、Ｇｅｎｔｉａｎバイオレットで染色してＣＰＥを評価した。

【0014】

インフルエンザウイルス力価は、プラーク形成アッセイによって計算した。具体的には、あおもり藍エキス抽出液とインフルエンザウイルスの段階希釈混合物を、１２ウェルマイクロプレートで３４℃、５％ＣＯ_２で1時間ＭＤＣＫ細胞に吸収させた。次に、０．１％ＢＳＡ、１％Ａｂｘ、０．６μｇ/ｍＬのＴＰＣＫ処理したトリプシンおよび１％カルボキシメチルセルロースを添加したＤＭＥＭ培地を重ね、３４℃、５％ＣＯ_２で３０時間インキュベートした。当該ウェルを３．７％ホルムアルデヒドで固定し、Ｇｅｎｔｉａｎバイオレットで染色した。そして、プラークを数えることでＰＦＵとして表した。

【0015】

［実験結果］
（１）あおもり藍エキス抽出液のＦＣＶへの影響
実験結果を図１に示す。エタノールで希釈したあおもり藍エキス抽出液（５ｎｇ/ｍＬ）と、あおもり藍エキス抽出液を含まないエタノールと、のそれぞれにおいてＦＣＶ（１．８×１０^７ ＴＣＩＤ５０/ｍＬ）を３７℃で３：１の比率で１０分間インキュベートした後、感染性ウイルスの力価を測定した。

【0016】

あおもり藍エキス抽出液を用いた処理試料のウイルス力価は、あおもり藍エキス抽出液を含まないエタノール処理サンプルのウイルス力価の１０分の１となり、あおもり藍エキス抽出液がＦＣＶを不活性化する可能性があることを示した。あおもり藍エキス抽出液のＦＣＶへの影響をＣＰＥアッセイとプラークアッセイで数回調べたが、あおもり藍エキス抽出液の安定した効果を得ることができた。

【0017】

（２）あおもり藍エキス抽出液のインフルエンザウイルスへの影響
実験結果を図２に示す。インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１/ｐｄｍ０９/Ａ/ミシガン/４５/２０１５を、１０％エタノールに溶解したあおもり藍エキス抽出液（５ｎｇ/ｍＬ）、あおもり藍エキス抽出液を含まない１０％エタノール、または培地のみとの３種の条件で、３７℃で１時間、１：９比率でインキュベートした。そして感染性ウイルスの力価が測定した。

【0018】

この結果、ウイルス力価は１０％エタノールで１０分の１に減少したが、あおもり藍エキス抽出液ではウイルス力価はあおもり藍エキス抽出液を含まないエタノール処理サンプルに比べてさらに１０分の1に減少した。

【0019】

具体的には、ウイルス液希釈倍数が１：１００の場合、１０％エタノール溶液ではインフルエンザＡウイルスの複製を阻害できなかった。一方、あおもり藍エキスを５ｎｇ／ｍｌの割合で配合したあおもり藍エキス抽出液ではインフルエンザＡウイルスの複製を阻害できた。

【0020】

また、ウイルス液希釈倍数が１：１０００の場合、１０％エタノール溶液ではインフルエンザＡウイルスの複製を阻害できたが、その効果は僅かである。一方、５ｎｇ／ｍｌのあおもり藍エキス抽出液では当該希釈倍数においてもインフルエンザＡウイルスの複製を阻害できた。

【0021】

なお、ウイルス液希釈倍数が１：１００００、１：１０００００、１：１００００００の場合、１０％エタノール溶液及び５ｎｇ／ｍｌのあおもり藍エキス抽出液のいずれもインフルエンザＡウイルスの複製を阻害できた。

【0022】

次に、Ａ型インフルエンザウイルスの感染力に対するあおもり藍エキス抽出液の影響もプラークアッセイによって評価したところ、あおもり藍エキス抽出液（５ｎｇ/ｍＬ）は、ウイルスのプラーク形成を完全に抑制した（図３参照）。

【0023】

なお、図３に示した実験条件は、次の通りである。エタノールで希釈した９０μＬのあおもり藍エキス抽出液及びまたは９０μＬのエタノールのみを、それぞれ１０μＬのインフルエンザウイルスと共に３７℃、５％ＣＯ_２で１時間インキュベートした後、０．１％ＢＳＡ、０．６μｇ/ｍＬのＴＰＣＫ処理したトリプシンを含むＤＭＥＭにおいて３倍段階希釈を行った。この希釈液を９６ウェルマイクロプレートで３４℃、５％ＣＯ_２の環境で１時間ＭＤＣＫに感染させた後、ウェル内の希釈液を０．１％ＢＳＡ、１％Ａｂｘ、０．６μｇ/ｍＬのトリプシン処理のＴＰＣＫを添加したＳｅｍｉＳｏｌｉｄのＤＭＥＭに置換した。このプレートを３４℃、５％ＣＯ_２で４８〜７２時間インキュベートし、Ｇｅｎｔｉａｎバイオレットで染色してＣＰＥを評価した。

【0024】

この実験結果から、５ｎｇ／ｍｌのあおもり藍エキス抽出液は、ウイルス液希釈倍数が１：３０〜２４３０（３０，９０，２７０，８１０，２４３０）の範囲の全てにおいて複製の阻害が確認できた。これに対し、１０％エタノール溶液ではウイルス液希釈倍数が１：３０〜２７０においてプラークが確認された。ウイルス液希釈倍数が１：８１０，２４３０ではインフルエンザＡウイルスの複製の阻害が確認できた。比較例として、インフルエンザＡウイルスのみの場合を測定したところ、ウイルス液希釈倍数が１：３０〜２４３０（３０，９０，２７０，８１０，２４３０）の範囲の全てにおいてプラークの発生が確認できた。

【0025】

この実験結果から、５ｎｇ／ｍｌのあおもり藍エキス抽出液は、ウイルス液希釈倍数が１：３０の高濃度の場合でもインフルエンザＡウイルスの複製の阻害が確認できた。

【0026】

次に、図４に示すように、あおもり藍エキス抽出液（０．０５〜５ｎｇ /ｍＬ）の用量依存性をプラークアッセイで確認した。０．０５ｎｇ/ｍＬのあおもり藍エキス抽出液は０．１％エタノールと同様の抗ウイルス効果を示した。あおもり藍エキス抽出液の０．５ｎｇ/ｍＬのＰＦＵは、１％エタノール処理サンプルと比較してわずかに減少したが、大きな差は観察されなかった。５ｎｇ/ｍＬのあおもり藍エキス抽出液は、１０％エタノールと比較してウイルスのＰＦＵを大幅に減少させた。

【0027】

用量が０．５ｎｇ／ｍｌ，０．０５ｎｇ／ｍｌのあおもり藍エキス抽出液では、１％エタノール溶液，０．１％エタノール溶液と略同等のＰＦＵ／ｍｌとなったが、５ｎｇ／ｍｌのあおもり藍エキス抽出液は、感染性をもつインフルエンザＡウイルスの量が略測定できない程度まで減少した。これに対し、１０％エタノール溶液では１％エタノール溶液，０．１％エタノール溶液に比べて大きなウイルス量の減少は確認できなかった。あおもり藍エキス抽出液は、上記実験結果から５０ｎｇ／ｍｌの用量でも感染性をもつインフルエンザＡウイルスの量が略測定できない程度まで減少させ得ることが理解できる。

【0028】

更に、あおもり藍エキス抽出液がインフルエンザＡサブタイプＨ３Ｎ２（香港）（図５）およびインフルエンザＢ系統山形（図６）に及ぼす影響をＣＰＥアッセイで評価した。あおもり藍エキス抽出液により両ウイルスの感染力が低下した。これらの結果は、あおもり藍エキス抽出液がインフルエンザＡ型およびＢ型ウイルスの感染性を阻害することを示している。

【0029】

なお、図５に示す実験結果の条件は次の通りである。
インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２/Ａ/香港/４８０１/２０１４を、５％エタノールに溶解したあおもり藍エキス抽出液（２．５ｎｇ/ｍＬ）、あおもり藍エキス抽出液を含まない５％エタノール、または培地のみとの３種の条件で、３７℃で１時間、インキュベートした後、０．１％ＢＳＡ、０．６μｇ/ｍＬのＴＰＣＫ処理したトリプシンを含むＤＭＥＭにおいて４倍段階希釈を行った。この希釈液をウェルマイクロプレートで３４℃、５％ＣＯ_２の環境で１時間ＭＤＣＫ細胞に感染させた後、ウェル内の希釈液を０．１％ＢＳＡ、１％Ａｂｘ、０．６μｇ/ｍＬのトリプシン処理のＴＰＣＫを添加したＤＭＥＭに置換した。このプレートを３４℃、５％ＣＯ_２で４８〜７２時間インキュベートし、Ｇｅｎｔｉａｎバイオレットで染色してＣＰＥを評価した。

【0030】

また、図６に示す実験結果の条件は次の通りである。
インフルエンザウイルスＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１４（山形）を、１０％エタノールに溶解したあおもり藍エキス抽出液（５ｎｇ/ｍＬ）、あおもり藍エキス抽出液を含まない１０％エタノール、または培地のみとの３種の条件で、３７℃で１時間、インキュベートした後、０．１％ＢＳＡ、０．６μｇ/ｍＬのＴＰＣＫ処理したトリプシンを含むＤＭＥＭにおいて５倍段階希釈を行った。この希釈液をウェルマイクロプレートで３４℃、５％ＣＯ_２の環境で１時間ＭＤＣＫ細胞に感染させた後、ウェル内の希釈液を０．１％ＢＳＡ、１％Ａｂｘ、０．６μｇ/ｍＬのトリプシン処理のＴＰＣＫを添加したＤＭＥＭに置換した。このプレートを３４℃、５％ＣＯ_２で４８〜７２時間インキュベートし、Ｇｅｎｔｉａｎバイオレットで染色してＣＰＥを評価した。

【0031】

［あおもり藍エキス抽出方法］
本発明において使用するあおもり藍エキス抽出液は、例えば、以下のようにして抽出する。

【0032】

藍草は、例えば、蓼藍（タデ科）、琉球藍（キツネノマゴ科）、蝦夷藍（ウォード；アブラナ科）、山藍（トウダイグサ科）、インド藍（マメ科）等の含藍植物である。特に、タデ科に属する一年生植物である蓼藍は、入手しやすく且つ特有の成分であるトリプタンスリンを豊富に含んでいることから、使用するに当たり好ましいものとなる。

【0033】

また、使用する藍草は、その起源や栽培方法に特に制限はなく、天然に自生する藍草でも、栽培されているものでもよく、これらを常法により育種して得られる変異株などでもよい。また、本発明で使用する藍草は、組織培養、カルス培養、細胞培養等により得ることのできる培養物であってもよい。植物体を抽出の原料として用いる場合、その植物体の一部又は全部を用いることができる。また、植物体は、水分を含む状態、凍結状態、乾燥状態のいずれであってもよいし、これらの混合物であってもよい。取り扱いの容易さからは、乾燥状態のものを用いるのが望ましい。

【0034】

加熱乾燥工程では、上記のように収穫した藍草から藍葉のみを採取し、加熱乾燥させる。加熱乾燥は、乾燥装置の乾燥室内に藍葉を入れる。そして、バーナーで加熱した高温の風を送り込みながら、藍葉を撹拌する。風量は、藍葉が乾燥室内で飛ぶ程度に設定し、藍葉全体に均一に風が当たるようにする。

【0035】

次に、上記加熱乾燥させた藍葉を容器内に所定量投入し、この容器内にｄ−リモネンの溶液を入れる。ｄ−リモネンの溶液は、藍葉が完全に浸漬される程度に当該容器に入れるのが好ましい。そして、容器内をゆっくりと撹拌した後、一定時間、常温で保持する。温度が高いとｄ−リモネンが揮発するため、常温以下に保持するのが好ましい。

【0036】

浸漬時間は、２０時間以上３０時間以下とするのが好ましい。２０時間、２４時間、３０時間で十分にトリプタンスリンを抽出可能であり、これらの時間による抽出量は４８時間、７２時間の場合に比較して大きな差がないことが判った。換言すれば、ｄ−リモネンによれば、短時間でトリプタンスリンを十分な量まで抽出可能である。そして、２０時間以上３０時間以下の短時間での抽出であれば、クロロフィルが溶出することは殆どなく、抽出液の着色は肉眼では認められず、無色透明と評価できるものであった。

【0037】

これに対し、エタノールによる抽出の場合、２４時間の抽出ではｄ−リモネンよりもトリプタンスリンの抽出量が少なかった。また、エタノールによる抽出の場合、クロロフィルによる着色の度合いが強く、抽出液が黒緑色になった。

【0038】

[抽出効率と着色]
新藍の藍葉に対してｄ−リモネンとエタノールとによる抽出実験を行った。実験条件として、乾燥させた新藍葉１００ｇにｄ−リモネン溶液（和光純薬工業，試薬特級）を１．２Ｌ加えてすべての藍葉をｄ−リモネン溶液に浸漬させ、これを撹拌しつつ、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間で常温保持し、各抽出時間におけるトリプタンスリンの抽出量を測定した。

【0039】

比較例として、乾燥させた新藍葉１００ｇにエタノール溶液（和光純薬工業，試薬特級）１．２Ｌを加えてすべての藍葉を浸漬させ、撹拌しつつ常温保持し、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間でのトリプタンスリンの抽出量を測定した。

【0040】

この結果、ｄ−リモネンによる抽出において、その抽出時間が２４時間の場合、抽出液のトリプタンスリンの含有量は８１μｇ/ｇであった。抽出時間が４８時間、７２時間の場合では、抽出液のトリプタンスリンの含有量は、９８μｇ/ｇ前後である。この実験結果から、４８時間、７２時間と抽出時間を倍増しても、トリプタンスリンの抽出量は比例して増大することはなく、２４時間の抽出時間の場合と大差がないことが判った。この実験結果より、２４時間程度でトリプタンスリンを所定量まで急速に抽出できることが判った。また、抽出時間が２４時間の抽出液は無色透明であり、クロロフィルの出現は目視では確認できなかった。

【0041】

一方、エタノールによる抽出では、抽出時間が２４時間でトリプタンスリンの含有量が７３μｇ/ｇであり、ｄ−リモネンの場合よりも若干少ない抽出量となった。また、４８時間では１３７μｇ/ｇ、７２時間では２３２μｇ/ｇと時間に比例してトリプタンスリンの抽出量が増えたが、２４時間〜７２時間の抽出時間のすべての場合において、クロロフィルの出現が極めて強く、抽出液が黒緑色になった。

【0042】

以上の実験結果から、ｄ−リモネンにより藍葉の２４時間の抽出を行うことで、クロロフィルの出現を抑えて効率的にトリプタンスリンを抽出できることが判った。

【0043】

次の実験では、１，５，１０，１５，２０，２５，３０時間の短時間でトリプタンスリンの抽出量の変化を測定した。この実験では、抽出溶媒としてｎ−ヘキサン（和光純薬工業，試薬特級），上記エタノール，上記ｄ−リモネンの３種の溶媒を用いトリプタンスリンの抽出量を比較した。具体的には、藍葉０．５ｇに抽出溶媒を５ｍＬ加え，日本薬局方通則１５の冷浸法に従い，室温暗所にて冷浸した。その後、継時的に１，５，１０，１５，２０，２５，３０時間で抽出液を採取し，メンブレンフィルターでろ過し，ＨＰＬＣ用の試料とした。

【0044】

ＨＰＬＣ装置および分析条件
検出器：ＳＰＤ−２０A （ＳＨＩＭＡＤＺＵ）
送液ポンプ：ＬＣ−２０ＡＤ （ＳＨＩＭＡＤＺＵ）
脱気ユニット：ＤＧＵ−２０Ａ３Ｒ(ＳＨＩＭＡＤＺＵ)
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５ＰＥ−ＭＳ ４．６×２５０ｍｍ (nacalai tesque)
移動相：４０％アセトニトリル(Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ)
流速：０．７ ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長：２５０ｎｍ

【0045】

冷浸開始５時間後ではｎ−ヘキサン抽出液、ｄ−リモネン抽出液およびエタノール抽出液中のトリプタンスリン含量は、それぞれ１８．０１８８μｇ／ｍｌ，３６．２２６６μｇ／ｍｌ及び３８．６００７μｇ／ｍｌであった。ｄ−リモネンおよびエタノールによる抽出量はｎ−ヘキサンによる抽出量の約２倍となった。

【0046】

ｎ−ヘキサン抽出液中のトリプタンスリン含量は、開始３０時間後には開始１時間後の含量（１６．２８３６μｇ／ｍｌ）に比較し、３１．１３３８μｇ／ｍｌと約２倍に上昇したが、その時点ではエタノール抽出液およびリモネン抽出液では顕著な含量の上昇が認められ、ヘキサン抽出液（３１．１３３８μｇ／ｍｌ）に比較し、エタノール抽出液では７３．０４４４μｇ／ｍｌ、リモネン抽出液では９６．９９７６μｇ／ｍｌとそれぞれ２．３５倍および３．１２倍の抽出効率が得られることが判った。

【0047】

一方、エタノール抽出液とｄ−リモネン抽出液との比較では、冷浸開始１０時間後からその抽出効率に変化が認められ、冷浸開始２０時間後にはエタノール抽出液で５８．３８２６μｇ／ｍｌ、ｄ−リモネン抽出液で７２．２４２２μｇ／ｍｌであり、約１．３倍の抽出効率の差異が認められた。

【0048】

更に、上記各抽出液には、色調に大きな差異が認められた。３０時間後の抽出液の色調は、ｎ−ヘキサン抽出液で黄緑褐色、エタノール抽出液で淡緑黒色の強い着色が見られた。ｄ−リモネン抽出液では無色に近い淡黄色であった。また、短時間抽出においては、ｎ−ヘキサン抽出液及びエタノール抽出液に比較して、ｄ−リモネン抽出液のトリプタンスリン含量が多くなることが判った。すなわち、ｄ−リモネンによれば、短時間でトリプタンスリンを効率的に抽出し且つ無色の抽出液が得られることが判った。

【0049】

[静菌活性]
藍葉トリプタンスリンのｄ−リモネン抽出液によれば、高い静菌活性が得られる。本来、トリプタンスリンもｄ−リモネンも単独で同作用を有することが知られている。また、トリプタンスリンとｄ−リモネンを混合して用いることも考えられる。しかしながら、ｄ−リモネンにより藍葉からトリプタンスリンを抽出した抽出液は、これらの単独使用又は混合使用に比べて、顕著なる静菌作用を発揮することが実験の結果、判った。

【0050】

静菌活性の測定は以下のように行った。
パールコア（登録商標）ミューラーヒントンＳ寒天培地（栄研化学）３８ｇを精製水１０００ｍｌに溶解し、１１５℃で３０分オートクレーブ（ＥＳ−２４５、ＴＯＭＹ）処理し、1シャーレ（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｄｉｓｈ １００ｍｍ×２０ｍｍ Ｓｔｙｌｅ、ＮＥＳＴ者）に２０ｍＬ〜２５ｍＬ分注しこれを培地とした。試験菌として酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いた。菌数は血球計算盤（Ｃ−Ｃｈｉｐ ＤＨＣ−Ｎ０１ ＮａｎｏＥｎＴｅｋ ｉｎｃ.）を用いてカウントし１０７ＣＦＵとした。

【0051】

被験液として、（１）トリプタンスリンのＤＭＳＯ溶液、（２）ｄ−リモネン単独液 、（３）トリプタンスリンのＤＭＳＯ溶液＋ｄ−リモネン単独液、 （４）藍葉トリプタンスリンのｄ−リモネン抽出液（あおもり藍産業協同組合乾燥藍葉８．３３ ｗ／ｖ ％）の４種を（１）〜（３）は１０μＭ〜０．００１μＭまでの濃度に、（４）は抽出液原液から１０−６希釈液までＤＭＳＯにて希釈して調製した。９６穴マイクロプレート１ｗｅｌｌにつき液体培地１８０μＬ（ブランク１８５μＬ）、菌液５μＬ、サンプル５μＬを分注し３８℃で３ｈインキュベートした。各被験液の静菌活性は微生物比色検出キット (ＭｉｃｒｏｂｉａｌＶｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴ 同人化学)を用い測定した。すなわち、上記培養液に発色試薬ＷＳＴ−８を１０μＬ ／ｗｅｌｌ添加し、さらに１時間インキュベート後の４５０ｎｍの吸光度を測定し静菌活性値とし、その濃度依存性からＭＩＣ５０値を算出した。試験菌としてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを用いるため、発色試薬はＤＭＳＯで８倍希釈したものを用事調製とし用いた。

【0052】

実験結果１
被験液（１）〜（４）のそれぞれの阻害率から求めたＭＩＣ５０値（ｎｇ /μＬ）を以下に示す。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに対する静菌作用
（１）トリプタンスリンＤＭＳＯ溶液 ４６０
（２）ｄ−リモネン ３００
（３）トリプタンスリンＤＭＳＯ溶液＋ｄ−リモネン ５６０
（４）藍葉トリプタンスリンのｄ−リモネン抽出液 ３

【0053】

被験液（１）と（２）の単独溶液においては、（１）のトリプタンスリン単独溶液のＭＩＣ５０値は４６０ ｎｇ／μＬであり，ｄ−リモネン単独溶液のＭＩＣ５０値は３００ ｎｇ／μＬであった。この（１）と（２）の等量混合溶液を使用した（３）においては、それぞれを単独で用いたＭＩＣ５０値よりもその値は高く５６０ ｎｇ／μＬであった。この実験結果から、トリプタンスリン溶液とｄ−リモネン溶液を混合して用いても、その静菌効果の増強は認められなかった。

【0054】

一方、ｄ−リモネンで藍葉からトリプタンスリンを抽出した（４）を用いた場合、そのＭＩＣ５０値は３ｎｇ／μＬであり単独使用の（１）または（２）に比較し，その効果は約１００倍近く強く、著しくその効果が増強したことから、藍葉トリプタンスリンのｄ−リモネン抽出液の静菌作用はそれぞれの単独使用時よりもその作用が大きく増加することが判った。

【0055】

上記ＨＰＬＣ装置により測定したチャートによれば、ｄ−リモネンの抽出液では、トリプタンスリンの付近に複数の化合物が測定されており、これらの化合物が静菌作用に好影響を及ぼしているものと推測される。これに対し、エタノールにより抽出では、ｄ−リモネンの場合とは異なる分で多数の化合物が測定された。これらの化合物は、静菌作用に貢献しないうえに、着色の原因物質になると推定される。この結果より、静菌作用については、エタノール抽出よりもリモネン抽出によるトリプタンスリン抽出液が優れていることが判る。

【0056】

また、上記リモネンの抽出時に、アスコルビン酸を加えても良い。アスコルビン酸の添加量は、ｄ−リモネンに対する溶解度が０．０１％以下であるため、アスコルビン酸の結晶が沈殿する０．０１％以上とし、飽和状態を保つものとする。また、アスコルビン酸の添加は、藍葉の添加と同時に行うのが好ましい。なお、実験の結果、上記２４時間の抽出では、トリプタンスリンの抽出量には影響を及ぼさないことが判った。

【0057】

本発明において、ｄ−リモネンに殆ど溶けないアスコルビン酸を添加したのは、次の理由による。リモネンには光反応・酸化変性や自動酸化が生じるところ、アスコルビン酸は、空気中では酸化型のデヒドロアスコルビン酸として存在する量が多く、共存するリモネンや藍葉の成分等よりもヒドロキシラジカルとの反応性が高いため、共存する化合物の酸化変性を抑制する抗酸化剤として機能する。

【0058】

また、トリプタンスリン抽出液を布の染に用いる場合において当該染の後に日光下で風乾するとき、アスコルビン酸の光反応によるラジカルの産生が染における「染むら」の原因となる色素に対して分解作用を示し、退色を誘発する。即ち、アスコルビン酸が漂白剤として機能する。

【0059】

更に、上記日光下での風乾において、前記リモネンも酸化・光反応により揮発性の生成物やジカルボニル等の不安定な反応性の高い生成物を生じさせるが、これらのリモネン酸化物は、アスコルビン酸により分解され得る。

【0060】

なお、トリプタンスリン等の有効成分であるアルカロイド類よりも、リモネンからの生成物の方がラジカルとの反応性が極めて高いため、アスコルビン酸の光反応によるトリプタンスリンの分解については殆ど考慮しなくても良い。すなわち、アスコルビン酸の添加による藍葉の抗菌有効成分への影響は低い。

【0061】

このように、トリプタンスリン抽出時にアスコルビン酸を添加することで、トリプタンスリン抽出液に対して極めて有用な作用効果をもたらすことが判った。

【0062】

なお、上記実施の形態では、藍葉をリモネン溶液に浸漬することでトリプタンスリンを抽出したが、藍葉に対してリモネン容器を点滴又は噴霧することで、当該藍葉に対してリモネン溶液を接触させ、この滴を循環させながらトリプタンスリンの抽出を行うようにしても良い。即ち、リモネン溶液が藍葉に接触することで抽出が行われることから、このような状態を形成する接触方法であれば、これらに限定されるものではない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】