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特開2021-171035幹細胞の培養用の足場、幹細胞の培養方法、及びＦＮＷ基材の製造方法。
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】特開2021-171035(P2021-171035A)
(43)【公開日】2021年11月1日
(54)【発明の名称】幹細胞の培養用の足場、幹細胞の培養方法、及びＦＮＷ基材の製造方法。
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20211004BHJP
C12N 5/0775 20100101ALI20211004BHJP
C01B 32/156 20170101ALI20211004BHJP
【ＦＩ】
C12M1/00 C
C12N5/0775ZNA
C01B32/156
【審査請求】未請求
【請求項の数】13
【出願形態】ＯＬ
【全頁数】25
(21)【出願番号】特願2020-80772(P2020-80772)
(22)【出願日】2020年4月30日
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】301023238
【氏名又は名称】国立研究開発法人物質・材料研究機構
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】特許業務法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】有賀 克彦
(72)【発明者】
【氏名】宋 静文
(72)【発明者】
【氏名】賈 小芳
(72)【発明者】
【氏名】南 皓輔
(72)【発明者】
【氏名】ヒル ジョナサン ピー
(72)【発明者】
【氏名】中西 淳
(72)【発明者】
【氏名】スレスタ ロック クマール
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
4G146
【Ｆターム（参考）】
4B029AA14
4B029BB11
4B029CC08
4B065AA93X
4B065AC12
4B065BC41
4B065CA44
4G146AA09
4G146AB06
4G146AC02B
4G146AC30B
4G146AD05
4G146AD40
4G146BA04
4G146BA43
4G146BA46
4G146CB10
4G146CB17
4G146CB26
4G146CB29
4G146CB32
4G146CB35
(57)【要約】
【課題】大面積でナノスケールの表面形状を連続的に調整できるＦＮＷ基材の作製方法を提供する。また、大面積で、幹細胞を、多能性及自己複製能を維持しながら培養可能とする足場を提供する。【解決手段】
針状のＦＮＷを水の表面に分散させ、該水の表面に分散したＦＮＷに一定方向から水圧をかけて配向させることを含む、ＦＮＷ基材の製造方法において、異なるアスペクト比のＦＮＷの混合物を、それらの混合比率を調整して水の表面に分散させ、該異なるアスペクト比のＦＮＷの混合物に一定方向から水圧をかけることによって、配向の程度を制御する。
配列された針状のフラーレンナノウィスカー（ＦＮＷ）を含む幹細胞培養用の足場において、配列された針状のＦＮＷによって、ナノスケールの尾根と谷の交互の繰り返しを含む表面形状が形成されている、足場とする。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
針状のフラーレンナノウィスカー（ＦＮＷ）を含む幹細胞培養用の足場であって、前記針状のＦＮＷが配向され、これにより、ナノスケールの尾根と谷の交互の繰り返しを含む表面形状が形成されている、足場。
【請求項2】
前記尾根は、マイクロスケールの長さを有する、請求項１に記載の足場。
【請求項3】
±３０°の範囲内の配向方向を有するＦＮＷが８５％（個数割合）以上含む、請求項１又は２に記載の足場。
【請求項4】
±３０°の範囲内の配向方向を有するＦＮＷが９０％（個数割合）以上含む、請求項３に記載する足場。
【請求項5】
前記ＦＮＷは、２００〜１２００のアスペクト比を有する、請求項１〜４の何れか１項に記載の足場。
【請求項6】
前記ＦＮＷは、１００〜３００μｍの長さを有する、請求項１〜５の何れか１項に記載の足場。
【請求項7】
前記ＦＮＷは、２００〜７００ｎｍの直径を有する、請求項１〜６の何れか１項に記載の足場。
【請求項8】
隣接するＦＮＷによって形成される溝の幅（隣接する尾根の距離）が、２００〜７００ｎｍである、請求項１〜７の何れか１項に記載の足場。
【請求項9】
前記幹細胞は、間葉系幹細胞である、請求項１〜８の何れか１項に記載の足場。
【請求項10】
請求項１〜９の何れか１項に記載の足場上に幹細胞を播種し、培地中で培養する、多能性及び自己複製能を維持しながら幹細胞を培養する方法。
【請求項11】
針状のＦＮＷを水の表面に分散させ、該水の表面に分散したＦＮＷに一定方向から水圧をかけて配向させることを含む、ＦＮＷ基材の製造方法であって、
異なるアスペクト比のＦＮＷの混合物を、それらの混合比率を調整して水の表面に分散させ、該異なるアスペクト比のＦＮＷの混合物に一定方向から水圧をかけることによって、配向の程度を制御することを特徴とする、方法。
異なるアスペクト比のＦＮＷの混合物を、それらの混合比率を調整して水の表面に分散させ、該異なるアスペクト比のＦＮＷの混合物に一定方向から水圧をかけることによって、配向の程度を制御することを特徴とする、方法。
【請求項12】
前記ＦＮＷ基材は、ＦＮＷからなる細胞培養用の足場である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記細胞培養用の足場は、間葉系幹細胞の培養用の足場である、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、一定方向に配列（配向）されたフラーレンナノウィスカー（ＦＮＷ）を含む幹細胞、特にヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の培養用の足場及びこれを用いる幹細胞の培養方法に関する。本発明はまた、ＦＮＷの配向の程度を調整可能なＦＮＷ基材の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）は、骨、脂肪、神経又は軟骨を形成する細胞を含むいくつかの細胞系列に分化する能力を有する多能性の体性幹細胞であり（非特許文献１及び２）、入手が容易であり強力な免疫抑制効果を奏することも明らかになったことから、変性疾患、骨格組織損傷、臓器不全を含む多様な疾患における再生医療への利用が期待されている（非特許文献３）。
【0003】
しかしながら、ｈＭＳＣの臨床上の利用は、ｈＭＳＣの多能性を長期間維持するための実用的な方法がないことから、依然として非常に制限的である。ｈＭＳＣは、in vitroでの増殖過程で、制御不能な分化により多能性と自己複製能を急速に失う（非特許文献４）。ｈＭＳＣの多能性を維持するための現在の戦略は、成長因子などの複雑で十分に理解されていない外因性の生理活性物質に主に依存している。このため、in vitroで多能性を維持しながらｈＭＳＣを増殖するための新しい戦略が強く求められている（非特許文献５）。
【0004】
この点、基材からの生物学的・力学的刺激が、接着、遊走および分化といった、細胞の短期的および長期的な活動を調節することが報告されている（非特許文献６及び７）。また、基質の剛性、生分解性および表面形状（凹凸）などの特徴が制御された材料を用いて、幹細胞を、未分化状態を維持しながら増殖することが報告されている（非特許文献８から１０）。しかしながら、幹細胞の増殖に適した剛性と生分解性を備えた生体材料の設計は複雑で高コストであり、臨床上の利用は事実上不可能である。一方、電子ビームを用いるリソグラフィにより高度に秩序化されたナノメートルサイズの凹凸を施した足場が、ｈＭＳＣの多能性を維持するのに役立つことが報告されている（非特許文献１１）。より具体的には、１２０ｎｍの直径、深さ１００ｎｍのピットを、隣接するピットの中心から当該ピットの中心までの距離を３００ｎｍとして配列した表面形状がｈＭＳＣの多能性を維持するのに有益であり、他方、ピット間の距離を±５０ｎｍずらしてピットを配列した表面形状では、骨形成性の分化に有益であったことが報告されている。しかし、このようなアプローチは、大面積で所望のナノ構造を形成することは難しく、幹細胞の増殖を実用レベルで行うには不向きである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Lindner, U. et al. Improved proliferation and differentiation capacity of human mesenchymal stromal cells cultured with basement-membrane extracellular matrix proteins. Cytotherapy 12, 992-1005, (2010).
【非特許文献2】Uccelli, A., Moretta, L. & Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat. Rev. Immunol. 8, 726-736, (2008).
【非特許文献3】Williams, A. R. & Hare, J. M. Mesenchymal stem cells: biology, pathophysiology, translational findings, and therapeutic implications for cardiac disease. Circ. Res. 109, 923-940, (2011).
【非特許文献4】Yeo, G. C. & Weiss, A. S. Soluble matrix protein is a potent modulator of mesenchymal stem cell performance. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 116, 2042-2051, (2019).
【非特許文献5】Nombela-Arrieta, C., Ritz, J. & Silberstein, L. E. The elusive nature and function of mesenchymal stem cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 126-131, (2011).
【非特許文献6】Murphy, W. L., McDevitt, T. C. & Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat. Mater. 13, 547-557, (2014).
【非特許文献7】Wen, J. H. et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nat. Mater. 13, 979-987, (2014).
【非特許文献8】Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L. & Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat. Mater. 13, 645-652, (2014).
【非特許文献9】Madl, C. M. et al. Maintenance of neural progenitor cell stemness in 3D hydrogels requires matrix remodelling. Nat. Mater. 16, 1233-1242, (2017).
【非特許文献10】McMurray, R. J. et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat. Mater. 10, 637-644, (2011).
【非特許文献11】Tsimbouri, P. M. et al. Using nanotopography and metabolomics to identify biochemical effectors of multipotency. ACS Nano 6, 10239-10249, (2012).
【非特許文献12】Acharya, S., Panda, A. B., Belman, N., Efrima, S. & Golan, Y. A Semiconductor-nanowire assembly of ultrahigh junction density by the Langmuir-Blodgett technique. Adv. Mat. 18, 210-213, (2006).
【非特許文献13】Minami, K. et al. Highly ordered 1D fullerene crystals for concurrent control of macroscopic cellular orientation and differentiation toward large-scale tissue engineering. Adv. Mater. 27, 4020-4026, (2015).
【非特許文献14】Yang, P. Wires on water. Nature 425, 243-244, (2003).
【非特許文献15】Heng, X. et al. Controllable preparation of submicrometer single-crystal C60 rods and tubes trough concentration depletion at the surfaces of seeds. J. Phys. Chem. C 111, 10498-10502, (2007).
【非特許文献16】Sathish, M., Miyazawa, K. & Sasaki, T. Nanoporous fullerene nanowhiskers. Chem. Mater. 19, 2398-2400, (2007).
【非特許文献17】Hsieh, F. Y., Shrestha, L. K., Ariga, K. & Hsu, S. H. Neural differentiation on aligned fullerene C60 nanowhiskers. Chem. Commun. 53, 11024-11027, (2017).
【非特許文献18】Hashizume, H., Hirata, C., Fujii, K. & Miyazawa, K. Adsorption of amino acids by fullerenes and fullerene nanowhiskers. Sci. Technol. Adv. Mater. 16, 065005, (2015).
【非特許文献19】Schellenberger, F., Encinas, N., Vollmer, D. & Butt, H. J. How water advances on superhydrophobic surfaces. Phys. Rev. Lett. 116, 096101, (2016).
【非特許文献20】Hammachi, F. et al. Transcriptional activation by Oct4 is sufficient for the maintenance and induction of pluripotency. Cell Rep. 1, 99-109, (2012).
【非特許文献21】Tsai, C. C., Su, P. F., Huang, Y. F., Yew, T. L. & Hung, S. C. Oct4 and Nanog directly regulate Dnmt1 to maintain self-renewal and undifferentiated state in mesenchymal stem cells. Mol. Cell 47, 169-182, (2012).
【非特許文献22】30. Wang, Z., Oron, E., Nelson, B., Razis, S. & Ivanova, N. Distinct lineage specification roles for NANOG, OCT4, and SOX2 in human embryonic stem cells. Cell Stem Cell 10, 440-454, (2012).
【非特許文献23】Boyer, L. A. et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell 122, 947-956, (2005).
【非特許文献24】Kim, J. et al. Designing nanotopographical density of extracellular matrix for controlled morphology and function of human mesenchymal stem cells. Sci. Rep. 3, 3552, (2013).
【非特許文献25】Yao, H. B., Fang, H. Y., Wang, X. H. & Yu, S. H. Hierarchical assembly of micro-/nano-building blocks: bio-inspired rigid structural functional materials. Chem Soc Rev 40, 3764-3785, (2011).
【非特許文献26】Jia, X. et al. Adaptive liquid interfacially assembled protein nanosheets for guiding mesenchymal stem cell fate. Adv. Mater. 32, 1905942, (2019).
【非特許文献27】Teo, B. et al. Nanotopography modulates mechanotransduction of stem cells and induces differentiation through focal adhesion kinase. ACS Nano 7, 4785-4798 (2013).
【非特許文献28】Chaudhuri, O. et al. Hydrogels with tunable stress relaxation regulate stem cell fate and activity. Nat. Mater. 15, 326-334, (2016).
【非特許文献29】Curtis, A. S. & Varde, M. Control of cell behavior: topological factor. J. Natl. Cancer Res. Inst. 33, 15-26, (1964).
【非特許文献30】Weiss, P. & Garber, B. Shape and movement of mesenchyme cells as functions of the physical structure of the medium. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 38, 264-280, (1952).
【非特許文献31】Ventre, M., Coppola, V., Natale, C. F. & Netti, P. A. Aligned fibrous decellularized cell derived matrices for mesenchymal stem cell amplification. J Biomed Mater. Res. A 107, 2536-2546, (2019).
【非特許文献32】Iskratsch, T., Wolfenson, H. & Sheetz, M. P. Appreciating force and shape - the rise of mechanotransduction in cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 825-833, (2014).
【非特許文献33】Vogel, V. & Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 265-275, (2006).
【非特許文献34】Dupont, S. et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature 474, 179-183, (2011).
【非特許文献35】Lian, I. et al. The role of YAP transcription coactivator in regulating stem cell self-renewal and differentiation. Genes Dev. 24, 1106-1118, (2010).
【非特許文献36】Ohgushi, M., Minaguchi, M. & Sasai, Y. Rho-signaling-directed YAP/TAZ activity underlies the long-term survival and expansion of human embryonic stem cells. Cell Stem Cell 17, 448-461, (2015).
【非特許文献37】Vining, K. H. & Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 728-742, (2017).
【非特許文献38】Song, W., Veiga, D. D., Custodio, C. A. & Mano, J. F. Bioinspired degradable substrates with extreme wettability properties. Adv. Mat. 21, 1830-1834, (2009).
【非特許文献39】Chen, W. et al. Nanotopography influences adhesion, spreading, and self-renewal of human embryonic stem cells. ACS Nano 6, 4094-4103, (2012).
【非特許文献40】Downing, T. L. et al. Biophysical regulation of epigenetic state and cell reprogramming. Nat. Mater. 12, 1154-1162, (2013).
【非特許文献41】Elosegui-Artola, A. et al. Force triggers YAP nuclear entry by regulating transport across nuclear pores. Cell 171, 1397-1410, (2017).
【非特許文献42】Dominici, M. et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. the international society for cellular therapy position statement. Cytotherapy 8, 315-317, (2006).
【非特許文献43】Horzum, U., Ozdil, B. & Pesen-Okvur, D. Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions. MethodsX 1, 56-59, (2014).
【非特許文献44】Miyazawa, K.; Kuwasaki, Y.; Obayashi, A.; Kuwabara, M., C60 Nanowhiskers Formed by the Liquid-Liquid Interfacial Precipitation Method. J. Mater. Res. 2001, 17, 83-88.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
上記従来技術に対して、本発明は、大面積でナノスケールの表面形状を連続的に調整できるＦＮＷ基材の作製方法を提供することを第一の目的とする。本発明はまた、大面積で、幹細胞を、多能性及自己複製能を維持しながら培養可能とするナノスケールの表面形状を有する足場を提供することを第二の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
上記第一の目的に関し、本発明者らは、ラングミュア-ブロジェット（ＬＢ）法（非特許文献１２、１４及び１６）によりＦＮＷで足場を製作するアプローチをとり、異なるアスペクト比のＦＮＷを用い、その混合比（質量比）を調整することで、連続的にＦＮＷの配向レベルを制御でき、これによりＦＮＷ基材のナノスケールの表面形状を適宜調整できることを見出した。
【0008】
本発明者らはまた、上記第二の目的に関し、高いアスペクト比のＦＮＷを用いてＬＢ法を実施して、高度にＦＮＷが配列し、尾根と谷が交互に繰り返される均一なナノスケールの表面形状を広範囲で有する足場を製作し、この足場上で、幹細胞を培養したところ、尾根の部分に幹細胞が接着し尾根に沿って伸長する現象が見られ、この制限的な接着状態の幹細胞が長期間多能性及び自己複製能を維持できることを見出した。従来、細長い形態のｈＭＳＣが、神経性または筋原性分化に至るとの知見が示されており（非特許文献２６及び２７）、今回の知見は、これとは異なる知見である。本発明は、以上の知見に基づき、以下の足場等を提供するものである。
【0009】
［１］針状のフラーレンナノウィスカー（ＦＮＷ）を含む幹細胞培養用の足場であって、前記針状のＦＮＷが配向され、これにより、ナノスケールの尾根と谷の交互の繰り返しを含む表面形状が形成されている、足場。［２］前記尾根は、マイクロスケールの長さを有する、［１］に記載の足場。
［３］±３０°の範囲内の配向方向を有するＦＮＷが８５％（個数割合）以上含む、［１］又は［２］に記載の足場。
［４］±３０°の範囲内の配向方向を有するＦＮＷが９０％（個数割合）以上含む、［３］に記載する足場。
［５］前記ＦＮＷは、２００〜１２００のアスペクト比を有する、［１］〜［４］の何れか１項に記載の足場。
［６］前記ＦＮＷは、１００〜３００μｍの長さを有する、［１］〜［５］の何れか１項に記載の足場。
［７］前記ＦＮＷは、２００〜７００ｎｍの直径を有する、［１］〜［６］の何れか１項に記載の足場。
［８］隣接するＦＮＷによって形成される溝の幅（隣接する尾根の距離）が、２００〜７００ｎｍである、［１］〜［７］の何れか１項に記載の足場。
［９］１ｍｍ以上の長さを有する、［１］〜［８］の何れか１項に記載の足場。
［１０］前記幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である、［１］〜［９］の何れか１項に記載の足場。
［１１］［１］〜［１０］の何れか１項に記載の足場上に幹細胞を播種し、培地中で培養する、多能性及び自己複製能を維持しながら幹細胞を培養する方法。
［１２］針状のＦＮＷを水の表面に分散させ、該水の表面に分散したＦＮＷに一定方向から水圧をかけて配向させることを含む、ＦＮＷ基材の製造方法であって、
異なるアスペクト比のＦＮＷの混合物を、それらの混合比率を調整して水の表面に分散させ、該異なるアスペクト比のＦＮＷの混合物に一定方向から水圧をかけることによって、配向の程度を制御することを特徴とする、方法。
［１３］前記ＦＮＷ基材は、ＦＮＷからなる細胞培養用の足場である、［１２］に記載の方法。
［１４］前記細胞培養用の足場は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の培養用足場である、［１３］に記載の方法。
［１５］［１］〜［７］の何れか１項に記載の足場を含む、幹細胞を培養するためのキット。
［１６］更に、幹細胞を増殖する培地を含む、［１５］に記載のキット。
【0010】
ここで本発明で用いる幾つかの用語の定義付けをする。本願明細書において、「配向された」とは、足場を構成するＦＮＷが、限定的な範囲内の方向、典型的には、実質的に同じ方向を向いて配列されていることを意味する。
ＦＮＷの配向方向とは、配向されたＦＮＷの長軸方向を意味し、本願明細書では、走査型電子顕微鏡で得られた画像の各ピクセルデータを、Ｉｍａｇｅ Ｊで分析して決定しているが、他の方法（例えば、肉眼）で決定することもできるし、Ｉｍａｇｅ Ｊと同様の処理を行うソフトを用いて決定することもできる。
本願明細書において、「±Ｘ°の範囲」は、上記のように決定された配向方向に基づき、ＦＮＷが最も多く含まれるように特定される。「±Ｘ°の範囲内の配向方向を有するＦＮＷ」の割合（％）は、このように確定された範囲内のＦＮＷの個数の、足場全体の全ＦＮＷの個数に対する割合を意味する。ただし、足場の端付近では、ＦＮＷの配列が乱れ易い傾向がある。また、大面積の足場を構成する全ＦＮＷの個数を計測するのは非現実的である。そこで、本願明細書では、「±Ｘ°の範囲内の配向方向を有するＦＮＷ」の割合（％）は、１００μｍ間隔で５か所以上の１００μｍ×１００μｍの領域（ただし、長さ１ｃｍ未満の足場の場合、足場の端から５００μｍ以内の領域は除き、長さ１ｃｍ以上の足場の場合、足場の端から１ｍｍ以内の領域は除く）を選択してＦＮＷの個数を計測し、各領域における「±Ｘ°の範囲内の配向方向を有するＦＮＷ」の割合（％）を求め、それらを平均化した値をいうものとする。本願明細書では、これも、走査型電子顕微鏡で得られた画像の各ピクセルデータをＩｍａｇｅ Ｊで分析して決定しているが、他の方法（例えば、肉眼）で決定することもできるし、Ｉｍａｇｅ Ｊと同様の処理を行うソフトを用いて決定することもできる。
本願明細書において、「ナノスケール」とは、１μｍ未満１０ｎｍ以上、通常は１００ｎｍ以上の範囲を意味する。
本願明細書において、「パターン化された」とは、ある特定の形状の繰り返しを意味する。典型的な例は、尾根と谷の繰り返し形状である。「ナノスケールのパターン化された表面形状」とは、ナノスケールで繰り返される形状単位によって表面形状が形成されていることを意味する。例えば、「ナノスケールの尾根と谷が交互に繰り返される表面形状」は、尾根及び谷の形状単位がナノスケールで交互に繰り返されている表面形状を意味する。なお、繰り返しがナノスケールで生じていれば該当し、尾根の長軸の長さは、ナノスケールである必要はない。
本願明細書において、「ＦＮＷの長さ」は、ＦＮＷの長軸の長さを意味し、「ＦＮＷの直径」とは、ＦＮＷの最も大きな径を意味する。「隣接する尾根の距離」は、「溝の幅」と同義であり、隣接するＦＮＷ間で一方のＦＮＭの尾根の最も高いある位置から他方のＦＮＭの尾根の最も高く且つ最短で結べる位置までの距離をいうものとする。本願明細書では、「長さ」、「直径」及び「隣接する尾根の距離」は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で得られた画像から、Ｉｍａｇｅ Ｊによって算出しているが、他の方法（例えば、肉眼）で決定することもできるし、Ｉｍａｇｅ Ｊと同様の処理を行うソフトを用いて決定することもできる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】図１は、液−液界面析出法でアスペクト比の異なるＦＮＷを調製するプロセスの概要を表す模式図、並びにキシレン中のフラーレン濃度を変動させることで、ＦＮＷの直径及び長さ（従って、アスペクト比）を調整するプロセスの概要を表す模式図である。
【図2】図２は、実施例において、液−液界面析出法でアスペクト比の異なるＦＮＷを調製したプロセスの概要を表す模式図、並びに得られた低アスペクト比及び高アスペクト比のＦＮＷのそれぞれの位相差顕微鏡画像、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像、長さの分布を示すグラフ及び直径の分布を示すグラフである。ａは、低アスペクト比のＦＮＷのＳＥＭ画像であり、スケールバーは、２μｍである。ｂの左側のグラフは、低アスペクト比のＦＮＷの長さの分布を示し、右側のグラフは、直径の分布を示す。ｃは、高アスペクト比のＦＮＷの位相差顕微鏡画像であり、スケールバーは、５０μｍである。ｄの左側のグラフは、高アスペクト比のＦＮＷの長さの分布を示し、右側のグラフは、直径の分布を示す。
【図3】図３は、Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ（ＬＢ）アプローチによってＦＮＷ足場を作製するプロセスの概要を示す。ａは、各工程を示す。ｂは最後の工程でガラス板にＦＮＷ膜を移す際のガラス板の傾斜状態を示す。ｃは、高アスペクト比のＦＮＷが圧力で配列される状態を模式的に示す。ｄは、低アスペクト比のＦＮＷに圧力をかけた状態を模式的に示す。
【図4】図４は、実施例１、２及び３のＦＮＷ足場の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像、ＳＥＭ画像中のＦＮＷの長軸方向をカラーコード化し異なる長軸方向のＦＮＷを色分けして表示した画像、及びＦＮＷの長軸方向の分布を示すグラフである。上段は、各ＦＮＷ足場のＳＥＭ画像であり、左から順に実施例３の足場（低アスペクト比のＦＮＷでＬＢ法で作製）、実施例２の足場（低アスペクト比のＦＮＷと高アスペクト比のＦＮＷの混合物でＬＢ法で作製）及び実施例１の足場（高アスペクト比のＦＮＷでＬＢ法で作製）のＳＥＭ画像である。中段は、各ＦＮＷ足場のＳＥＭ画像中のＦＮＷを長軸方向毎に色分けして表示した画像であり、左から順に実施例３の足場（低アスペクト比のＦＮＷでＬＢ法で作製）、実施例２の足場（低アスペクト比のＦＮＷと高アスペクト比のＦＮＷでＬＢ法で作製）及び実施例１の足場（高アスペクト比のＦＮＷでＬＢ法で作製）の画像である。下段は、各ＦＮＷ足場におけるＦＮＷの長軸方向の分布を示すグラフであり、左から順に実施例３の足場（低アスペクト比のＦＮＷでＬＢ法で作製）、実施例２の足場（低アスペクト比のＦＮＷと高アスペクト比のＦＮＷの混合物でＬＢ法で作製）及び実施例１の足場（高アスペクト比のＦＮＷでＬＢ法で作製）におけるＦＮＷの配向方向の分布を示す。以下では、実施例１、２、及び３のＦＮＷ足場を、それぞれ、高配向性ＦＮＷ足場、中程度の配向性ＦＮＷ足場（中配向性ＦＮＷ足場）、及び低配向性ＦＮＷ足場ということがある。
【図5】図５は、比較例１、２、及び３のＦＮＷ足場の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像、ＳＥＭ画像中のＦＮＷの長軸方向をカラーコード化し異なる長軸方向のＦＮＷを色分けして表示した画像、及びＦＮＷの長軸方向の分布を示すグラフである。上段は、各ＦＮＷ足場のＳＥＭ画像であり、左から順に比較例３の足場（低アスペクト比のＦＮＷでＤＣ法で作製）、比較例２の足場（低アスペクト比のＦＮＷと高アスペクト比のＦＮＷの混合物でＤＣ法で作製）及び比較例１の足場（高アスペクト比のＦＮＷでＤＣ法で作製）のＳＥＭ画像である。スケールバーは、１０μｍである。中段は、各ＦＮＷ足場のＳＥＭ画像中のＦＮＷを長軸方向毎に色分けして表示した画像であり、左から順に比較例３の足場（低アスペクト比のＦＮＷでＤＣ法で作製）、比較例２の足場（低アスペクト比のＦＮＷと高アスペクト比のＦＮＷでＤＣ法で作製）及び比較例１の足場（高アスペクト比のＦＮＷでＤＣ法で作製）の画像である。下段は、各ＦＮＷ足場におけるＦＮＷの長軸方向の分布を示すグラフであり、左から順に比較例３の足場（低アスペクト比のＦＮＷでＤＣ法で作製）、比較例２の足場（低アスペクト比のＦＮＷと高アスペクト比のＦＮＷでＤＣ法で作製）及び比較例１の足場（高アスペクト比のＦＮＷでＤＣ法で作製）におけるＦＮＷの長軸方向の分布を示す。
【図8】図８は、実施例３の足場（低配向性ＦＮＷ足場）、実施例２の足場（中配向性ＦＮＷ足場）及び実施例１の足場（高配向性ＦＮＷ足場）に水滴を滴下した際の各ＦＮＷ足場上の水滴の状態を示す画像と、接触角を示すグラフである。ｎ＝4、エラーバーは、平均値±標準偏差を示す。
【図11】図１１は、実施例１乃至３のＦＮＷ足場上及びコントロールとしてガラス板上で１日又は７日間培養したｈＭＳＣを、Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭ及びＥｔｈＤ−１で標識化して、蛍光顕微鏡で得られた画像を示す。スケールバーは、２００μｍである。上段は、１日培養したｈＭＳＣの画像であり、下段は、７日間培養したｈＭＳＣの画像である。左から、コントロール（ガラス板）、実施例３のＦＮＷ足場（低配向性ＦＮＷ足場）、実施例２のＦＮＷ足場（中配向性ＦＮＷ足場）、及び実施例１のＦＮＷ足場（高配向性ＦＮＷ足場）の画像である。
【図12】図１２は、ガラス板（コントロール）、実施例３のＦＮＷ足場（低配向性ＦＮＷ足場）、実施例２のＦＮＷ足場（中配向性ＦＮＷ足場）及び実施例１のＦＮＷ足場（高配向性ＦＮＷ足場）上で培養したｈＭＳＣ細胞の倍加時間を示すグラフである。ｎ＝３、エラーバーは、平均値±標準偏差を示す。
【図13】図１３は、ｈＭＳＣを、ガラス板（コントロール）、実施例３のＦＮＷ足場（低配向性ＦＮＷ足場）、実施例２のＦＮＷ足場（中配向性ＦＮＷ足場）及び実施例１のＦＮＷ足場（高配向性ＦＮＷ足場）上で２週間培養し、幹細胞性マーカーのＯＣＴ４、ＳＯＸ２およびＮＡＮＯＧの遺伝子発現レベルを、定量リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって測定した結果を示すグラフである。ＯＣＴ４およびＮＡＮＯＧ遺伝子発現レベルは、ガラス上で培養された細胞に対して正規化して示す。ＳＯＸ２の遺伝子発現レベルは、ＧＡＰＤＨの遺伝子発現と比較した相対値として示した。ｎ＝３。エラーバーは平均値±標準偏差を示す。＊はコントロールに対してＰ＜０．０５、＃はＰ＜０．０５、＃＃はＰ＜０．０１である。両側スチューデントのｔ検定。
【図14】図１４は、ｈＭＳＣを、ガラス板（コントロール）、実施例３のＦＮＷ足場（低配向性ＦＮＷ足場）、実施例２のＦＮＷ足場（中配向性ＦＮＷ足場）及び実施例１のＦＮＷ足場（高配向性ＦＮＷ足場）上で１週間培養し、幹細胞性マーカーのＯＣＴ４、ＳＯＸ２およびＮＡＮＯＧの遺伝子発現レベルを、定量リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって測定した結果を示すグラフである。ＯＣＴ４、ＳＯＸ２およびＮＡＮＯＧ遺伝子発現は、ガラス上で培養された細胞に対して正規化された。ｎ＝３、エラーバーは平均値±標準偏差を示す。
【図15】図１５は、ガラス板（コントロール）、実施例３のＦＮＷ足場（低配向性ＦＮＷ足場）、実施例２のＦＮＷ足場（中配向性ＦＮＷ足場）及び実施例１のＦＮＷ足場（高配向性ＦＮＷ足場）上で２週間培養したｈＭＳＣについて、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２およびＮＡＮＯＧのタンパク質発現レベルを示す。aは、免疫蛍光染色により、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２およびＮＡＮＯＧを、それぞれ緑色、黄色、およびマゼンタに標識して、共焦点レーザー走査顕微鏡または蛍光顕微鏡で得られた画像を示す。ｂでは、上段は、ＯＣＴ４陽性細胞の比率を示し、中段は、核内のＳＯＸ２蛍光強度を示し、下段は、ＯＣＴ４陽性細胞の比率を示す。ｎ＝６００−１７００。エラーバーは、平均値±標準偏差を示す。＊＊＊は、コントロールに対するＰ＜０．００１、＃＃＃は、Ｐ＜０．００１を示す。一元配置分散分析。
【図16】図１６は、実施例３（低配向性ＦＮＷ）、実施例２（中配向性ＦＮＷ）および実施例１（高配向性ＦＮＷ）の足場上で１日培養したｈＭＳＣの形態及びそれに関連する幾つかのパラメータを示す。ａは、実施例３（低配向性ＦＮＷ）、実施例２（中配向性ＦＮＷ）および実施例１（高配向性ＦＮＷ）の足場の表面でｈＭＳＣを１日培養し、核内Ｆアクチン（緑）、及び核（青）を標識化して得た代表的な免疫蛍光画像である。スケールバーは２００μｍを示す。画像中の白い矢印は、ｄ及びｅの細胞の伸長方向を決める基準（０°）を示す。ｂは、実施例３（低配向性ＦＮＷ）、実施例２（中配向性ＦＮＷ）および実施例１（高配向性ＦＮＷ）の足場の表面で培養された個々のｈＭＳＣ１細胞の細胞面積を示すグラフである。ｃは、実施例３（低配向性ＦＮＷ）、実施例２（中配向性ＦＮＷ）および実施例１（高配向性ＦＮＷ）の足場の表面で培養されたｈＭＳＣのアスペクト比を示すグラフである。ｄは、実施例３（低配向性ＦＮＷ）、実施例２（中配向性ＦＮＷ）および実施例１（高配向性ＦＮＷ）の足場の表面で培養されたｈＭＳＣ伸長方向を示す。伸長方向は、ａの画像中の白い矢印を基準として角度で示した。ｅは、実施例３（低配向性ＦＮＷ）、実施例２（中配向性ＦＮＷ）および実施例１（高配向性ＦＮＷ）の足場の表面で培養されたｈＭＳＣのアスペクト比（横軸）と伸長方向（縦軸）との関係を示す。θ（°）は、白い矢印の方向と細胞の長軸との間の角度を示す。ｎ＝３６−４５、＊＊＊はＰ＜０．００１を示す。
【図17】図１７は、ガラス板（コントロール）、実施例３（低配向性ＦＮＷ）、実施例２（中配向性ＦＮＷ）および実施例１（高配向性ＦＮＷ）の足場上でｈＭＳＣを２週間培養し、核内Ｆアクチン（赤）及び核（青）を標識化して得た代表的な蛍光染色画像である。スケールバーは２００μｍを示す。
【図18】図１８は、ガラス板（コントロール）、実施例３（低配向性ＦＮＷ）、実施例２（中配向性ＦＮＷ）および実施例１（高配向性ＦＮＷ）の足場の表面でｈＭＳＣを２４時間培養し、ビンキュリン（緑）、Ｆ−アクチン（赤）、および核（青）を標識化して得た代表的な免疫蛍光画像及びそれから得られた幾つかのパラメータを示す。ａは、上段にＦ−アクチン（赤）を標識化して得た蛍光染色画像、ビンキュリン（緑）を標識化して得た免疫蛍光画像、及び核（青）を標識化して得た蛍光染色画像をオーバーレイした画像を示し、中段に、上段の画像の白枠部分のビンキュリン（緑）を標識化して得た蛍光染色画像を示し、下段に、上段の画像の白枠部分のＦ−アクチン（赤）を標識化して得た蛍光染色画像を示す。左から順に、ガラス板（コントロール）、実施例３（低配向性ＦＮＷ）、実施例２（中配向性ＦＮＷ）および実施例１（高配向性ＦＮＷ）の足場の表面で培養したｈＭＳＣの画像を示す。スケールバーは、２５μｍを示す。ｂは、ガラス板（コントロール）、実施例３（低配向性ＦＮＷ）、実施例２（中配向性ＦＮＷ）および実施例１（高配向性ＦＮＷ）の足場の表面で培養された１つのｈＭＳＣの単一の接着斑（ＦＡ）の面積を示す箱ひげ図である。ｃは、ガラス板（コントロール）、実施例３（低配向性ＦＮＷ）、実施例２（中配向性ＦＮＷ）および実施例１（高配向性ＦＮＷ）の足場の表面で培養されたｈＭＳＣの１細胞当たりの接着斑の数を示す箱ひげ図である。ｎ＝１０−１３細胞。＊＊＊は、コントロールに対してＰ＜０．００１、＃＃は、Ｐ＜０．０１。
【図19】図１９は、実施例３（低配向性ＦＮＷ）、実施例２（中配向性ＦＮＷ）および実施例１（高配向性ＦＮＷ）の足場の表面で培養されたｈＭＳＣでビンキュリン接着斑を有する細胞の割合を示すグラフである。ｎ＝１０−１３細胞。
【図20】図２０は、実施例３（低配向性ＦＮＷ）、実施例２（中配向性ＦＮＷ）および実施例１（高配向性ＦＮＷ）の足場の表面でｈＭＳＣを２４時間培養し、ＹＡＰ（緑）、Ｆ−アクチン（赤）、および核（青）を標識化して得た代表的な蛍光染色画像及び核局在ＹＡＰ：細胞質局在ＹＡＰ比を示す箱ひげ図である。ａは、上段にＦ−アクチン（赤）及び核（青）を標識化して得た蛍光染色画像を示し、下段に、ＹＡＰ（緑）を標識化して得た蛍光染色画像を示す。左から順に、実施例３（低配向性ＦＮＷ）、実施例２（中配向性ＦＮＷ）および実施例１（高配向性ＦＮＷ）の足場の表面で培養したｈＭＳＣの画像を示す。スケールバーは、２５μｍを示す。ｂは、実施例３（低配向性ＦＮＷ）、実施例２（中配向性ＦＮＷ）および実施例１（高配向性ＦＮＷ）の足場の表面で培養されたｈＭＳＣの核局在ＹＡＰと細胞質局在ＹＡＰの濃度比を示す箱ひげ図である。ｎ＝１４−２２。箱の下端と上端はそれぞれ２５％と７５％を表す。箱内の線は中央値を表す。箱内の四角いマーカーは平均値を表す。＊＊は、Ｐ＜０．０１、＊＊＊は、Ｐ＜０．００１を示す。一元配置分散分析。
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、本発明の実施形態について説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。
【0013】
本発明の一の実施形態は、上述の通り、配向された針状のフラーレンナノウィスカー（ＦＮＷ）を含み、当該配向された針状のＦＮＷによって、ナノスケールの尾根と谷の繰り返しを含む表面形状が形成されている、幹細胞培養用の足場に関する。足場を構成するＦＮＷは疎水性且つ生体適合性である。これに加え、上記ナノスケールの表面形状により、この足場では尾根の部分に細胞外たんぱく質が局所的に吸着し易い。そして、この局所的に吸着した細胞外たんぱく質は、尾根の部分に幹細胞を誘引し、幹細胞を尾根に沿って局所的に接着させる。興味深いことに、このように幹細胞を足場に局所的に整列させて接着させると、当該幹細胞は、多能性を維持しながら増殖する。
【0014】
本発明の好ましい実施形態では、尾根の部分は、マイクロスケールの長さを有する。このスケールは、幹細胞に伸長を促し、尾根の短軸方向への幹細胞の伸長を制限しながら、尾根に沿って幹細胞と足場の接着が拡張される。この局所的な接着の制限的な拡張は、幹細胞の多能性及び自己複製能を促進する。より具体的には、尾根の部分は、５０μｍ以上の長さを有することが好ましく、１００μｍ以上の長さを有することがより好ましく、１２０μｍ以上の長さを有することが特に好ましい。また、９００μｍ以下の長さを有することが好ましく、６００μｍ以下の長さを有することがより好ましく、５００μｍ以下の長さを有すること更に好ましく、４００μｍ以下の長さを有することが特に好ましい。
【0015】
多能性を維持しながら効率的に幹細胞を増殖するのには、上述したナノスケールのパターン化された表面形状を広範囲で有することが好ましい。この点で、足場は、±３０°の範囲内に長軸方向が配向しているＦＮＷを全体の８５％（個数割合）以上含むことが好ましく、９０％（個数割合）以上含むことがより好ましく、９５％（個数割合）以上含むことが特に好ましい。後述する実施例で実証している通り、足場に局所的に接着されている細胞の配向の程度が高いほど、多能性及び自己複製能が促進される。
【0016】
隣接するＦＮＷによって形成される溝の大きさ（隣接するＦＮＷの尾根間の距離）は、幹細胞に局所的な接着（ＦＮＷの短軸方向への幹細胞の伸長を抑制する）をもたらし得るものであればよいが、効率的に多くの幹細胞を培養するには、尾根と谷の繰り返し形状が密な方が有利である。この点で、９００ｎｍ以下が好ましく、２００〜７００ｎｍがより好ましく、２５０〜６５０ｎｍがさらに好ましく、３００〜６００ｎｍが特に好ましい。一の好ましい実施形態による足場では、４００〜５００ｎｍの溝を有する。
【0017】
足場を構成する針状のＦＮＷは、足場の表面に、上述したナノスケールのパターン化された表面形状を形成し得るサイズを有する必要がある。この点で、ＦＮＷの直径は、ナノスケールであることが好ましい。より具体的には、９００ｎｍ以下の直径を有するＦＮＷが好ましく、２００〜７００ｎｍの直径を有するＦＮＷがより好ましく、２５０〜６５０ｎｍの直径を有するＦＮＷが特に好ましい。
【0018】
また、ＦＮＷの長さは、マイクロスケールであることが好ましく、幹細胞が伸長可能な長さより長いことがより好ましい。より具体的には、５０μｍ以上の長さを有するＦＮＷが好ましく、１００μｍ以上の長さを有するＦＮＷがより好ましく、１２０μｍ以上の長さを有するＦＮＷが特に好ましい。また、９００μｍ以下の長さを有するＦＮＷが好ましく、６００μｍ以下の長さを有するＦＮＷがより好ましく、５００μｍ以下の長さを有するＦＮＷが更に好ましく、４００μｍ以下の長さを有するＦＮＷが特に好ましい。
【0019】
後述する実施例で実証している通り、ＦＮＷのアスペクト比が大きい程、幹細胞の伸長がＦＮＷの短軸方向では制限されながら、ＦＮＷの長軸方向へは促進され、この制限的な幹細胞の伸長によって幹細胞の多能性及び自己複製能が強化される。この点から、アスペクト比が５０以上のＦＮＷが好ましく、１００以上のＦＮＷがより好ましく、２００以上のＦＮＷがさらに好ましく、３００以上のＦＮＷが特に好ましい。ＦＮＷのアスペクト比の上限は特にないが、上記の通り、足場を構成するＦＮＷの直径は、通常ナノレベルであり、長さはマイクロレベルであるため、アスペクト比の上限は、通常、２０００以下となり、多くの場合、１０００以下となり、好ましくは８００以下であり、より好ましくは７００以下である。一の実施形態では、ＦＮＷは、２００〜１２００のアスペクト比を有し、好ましくは４００〜６００のアスペクト比を有する。
【0020】
隣接するＦＮＷによって形成される溝の大きさは、隣接するＦＮＷが密着して配列している場合には、その直径によって決まり、通常、９００ｎｍ以下であり、２００〜７００ｎｍが好ましく、２５０〜６５０ｎｍがより好ましく、３００〜６００ｎｍが特に好ましい。一の実施形態では、４００〜５００ｎｍの溝を有する。
【0021】
ＦＮＷは、足場表面に疎水性、及び上記表面形状を付与し得ること以外に特に制限はなく、ＦＮＷは様々なフラーレンから得ることができる。例えば、Ｃ６０、Ｃ７０、Ｃ７４、Ｃ７６、Ｃ７８などのフラーレンからＦＮＷを調製することができる。
【0022】
ＦＮＷは、種々の方法で調製可能であるが、好ましい方法として、液-液界面析出法（非特許文献１５及び４４）が挙げられる。図１（ａ）に示すように、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）５ｍＬを、フラーレンのキシレン（通常、ｍ−キシレン）溶液に種々の速度で添加することで、液-液界面でのフラーレンナノウィスカー（ＦＮＷ）の析出を制御する方法である。例えば、ＩＰＡとキシレンの２つの液相が明確に維持されるように、ゆっくり（例えば２．５ｍｌ／分以下）ＩＰＡを容器の壁伝いに加えると、高いアスペクト比のＦＮＷが得られ、ＩＰＡとキシレンの２つの液相が完全に混在した状態になるように、迅速に（例えば１〜２ｍｌ／秒）、場合によっては撹拌しながら、ＩＰＡを滴下すると、低いアスペクト比のＦＮＷが得られる。このようにＩＰＡを加える速度や加え方を調整するだけで、得られるＦＮＷのアスペクト比を変えることができるため、便利である。
【0023】
この液-液界面析出法では、キシレン溶液中のフラーレン濃度によっても、ＦＮＷの直径及び長さ（よって、アスペクト比）を制御することができる。図１（ｂ）に示すように、キシレン溶液中のフラーレン濃度を低くすると、太く短い（したがってアスペクト比が小さい）ＦＮＷが得られ、濃度を上げていくにつれ、細く長く（したがってアスペクト比が大きくなる）なるが、更に濃度を挙げると細くなるがむしろ短くなる。従って、この特性も考慮して、ＦＮＷを調製することが好ましく、例えば、０．２ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌのフラーレンを含むキシレン溶液で調製することが好ましく、０．５ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌのフラーレンを含むキシレン溶液で調製することがより好ましく、１ｍｇ／ｍｌ〜３ｍｇ／ｍｌのフラーレンを含むキシレン溶液で調製することが更に好ましく、２ｍｇ／ｍｌのフラーレンを含むキシレン溶液で調製することが特に好ましい。
【0024】
足場の製造方法についても、特に制限はないが、我々が開発したＬＢアプローチ（非特許文献１３）に従って作製するのが好ましい。このＬＢアプローチによる方法は、図３に示す通り、針状のＦＮＷを、水の表面に浮遊させ、該ＦＮＷに対して一定方向から圧力をかけることにより、針状のＦＮＷを配列させ、この配列構造を維持したままＦＮＷ基材を作製するプロセスである。
【0025】
このアプローチによると、パターン化されたナノスケールの表面形状を大きな面積、例えば、図６に示すようにｃｍ２スケールで有する足場を容易に得ることができ、幹細胞の培養を実用化する上で極めて有益である。また、ＦＮＷ基材の表面形状が各ＦＮＷの形状及びＦＮＷの配列状態に依存するが、このＬＢアプローチによれば、ＦＮＷに対して一定方向から圧力をかけた際、ＦＮＷのアスペクト比が高いほどＦＮＷの配向の程度が高くなる。従って、このアプローチに付されるＦＮＷのアスペクト比を調整することで、ＦＮＷの配向の程度、引いては、表面形状、特に表面形状の峰及び谷の繰り返し形状の形成及びその均一性を容易に制御することができる。
【0026】
この点から、本発明の一の実施形態においては、ＦＮＷを、水の表面に分散させ、該水の表面に分散したＦＮＷに一定方向から水圧をかけて配向させることを含む、ＦＮＷ基材の製造方法において、異なるアスペクト比のＦＮＷの混合物を、それらの混合比率を調整して水の表面に分散させ、該異なるアスペクト比のＦＮＷの混合物に一定方向から水圧をかけることによって、ＦＮＷの配向の程度を制御する、方法が提供される。この方法によれば、異なるアスペクト比のＦＮＷの混合比を変えていくことで、ＦＮＷの配向の程度、換言するとＦＮＷ基材表面の形状を、連続的に調整することができる。従って、この方法は、細胞培養用の足場を作製する際に、培養する細胞の種類に応じて微妙な足場表面形状の調整が可能となるばかりでなく、細胞培養以外の用途に向けたＦＮＷ基材の作製に利用することも期待される。
【0027】
他方、幹細胞の培養用の足場の表面形状は、上述の通り、できるだけ均一な尾根及び谷の繰り返し形状が望まれるため、このような足場を作製する場合には、高いアスペクト比の針状のＦＮＷを上記ＬＢアプローチによる方法に供することが好ましい。具体的には、例えば、５０以上のアスペクト比のＦＮＷが好ましく、１００以上のアスペクト比のＦＮＷがより好ましく、２００以上のアスペクト比のＦＮＷがさらに好ましく、３００以上のアスペクト比のＦＮＷがよりさらに好ましく、４００以上のアスペクト比のＦＮＷが特に好ましい。このような高いアスペクト比のＦＮＷは、同様のアスペクト比のＦＮＷを上記ＬＢアプローチによる方法に供してもよく、異なるアスペクト比のＦＮＷを上記ＬＢアプローチによる方法に供してもよい。後者の場合は、異なるアスペクト比のＦＮＷの混合比を調整して尾根間の距離を微調整することもできる。もっとも、幹細胞の培養では、尾根ができるだけ等間隔で配列していることが好ましく、この点で、できるだけ近似するアスペクト比のＦＮＷを用いることが好ましい。
【0028】
上記ＬＢアプローチでは、非常に大きな面積でＦＮＷが配向され、パターン化されたナノスケールの表面形状を有するＦＮＷ基材の作製が可能であり、効率的な幹細胞の培養を行う上で極めて有利な足場を提供できる。具体的には、広範囲で、このようなナノスケールの表面形状を有する、長さ１ｍｍ以上、例えばｃｍスケール（例えば、１ｃｍ〜９９ｃｍ）、及びｍスケール（例えば、１ｍ〜１０ｍ）の長さを有する、幹細胞培養用の足場を作製できる。
【0029】
後述する実施例で実証する通り、ナノスケールの尾根と谷の繰り返しを含む表面形状が形成されている足場上で幹細胞を培養すると、幹細胞が尾根に沿って伸長する一方、尾根の短軸方向への伸長は制限され、この局所的な接触状態を長期間維持できる。この様な接着状態を通じて、適切な細胞収縮性とＹＡＰの核局在化がもたらされ、幹細胞性（多能性及び自己複製能）の中核制御因子である、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２およびＮＡＮＯＧがアップレギュレートされ、幹細胞性が長期間維持される。従って、例えば、幹細胞（例えば、間葉系幹細胞）を入手した後、この足場を利用して培養することで、臨床上使用する前に長期間幹細胞性（多能性及び自己複製能）を維持して幹細胞を保持することができ、臨床上極めて重要な意義を有する。
【0030】
この足場は、その表面形状により、幹細胞性を維持することを可能とするため、幹細胞を培養する培地には、成長因子などの複雑で十分に理解されていない外因性の生理活性物質を含める必要はなく、通常の増殖用培地で構わない。また、培養条件についても特に制限はなく、足場上に幹細胞を播種し、通常の培養条件で培養することができる。
【実施例】
【0031】
以下、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。特に、以下では、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を用いた各試験で本発明の足場を評価しているが、本発明は他の幹細胞にも適用できるものである。なお、以下に記載する試験のすべての定量データは、一元配置分散分析またはスチューデントのt検定を使用して分析し、有意差を評価した。値は平均±標準偏差であり、各エラーバーは少なくとも3回の独立した実験からの標準偏差を示す。
【0032】
フラーレンナノウィスカー（ＦＮＷ）の調製と精製Materials Technologies Research （ＭＴＲ）,Ltd.（米国オハイオ州クリーブランド）から購入した純粋なフラーレンＣ６０粉末（純度＞９９．５％の）を用いて、液−液界面析出法によってフラーレンナノウィスカー（ＦＮＷ）を調製した。図２に示すように、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ、和光化学株式会社）５ｍＬを、ｍ−キシレン（和光化学株式会社）にＣ６０フラーレンを溶解したＣ６０フラーレン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬに、ＩＰＡとキシレンの２つの液相が明確に維持されるように、ゆっくり（２．５mL/分）又はＩＰＡとキシレンの２つの液相が完全に混在した状態になるように、素早く（１ｍＬ／秒）添加した。溶液を室温で３０分間インキュベートして、高アスペクト比ＦＮＷ（アスペクト比＝４９８、直径４０５±９６ｎｍ、長さ２０２±５５μｍ）、並びに低アスペクト比ＦＮＷ（アスペクト比＝５、直径３４０±１７０ｎｍ、長さ１．７±０．５μｍ）を形成した。形成したＦＮＷを含むｍ−キシレン・ＩＰＡ混合溶液を４０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清のｍ−キシレン・ＩＰＡ混合溶液を取り除いた。沈殿したＦＮＷにＩＰＡを２ｍＬ加え４０００ｒｐｍで２分間遠心分離して洗浄した。この洗浄操作を少なくとも２度以上繰り返し洗浄した。洗浄したＦＮＷは、室温で２ｍＬのＩＰＡに分散して使用した。
【0033】
Ｌａｎｇｍｕｉｒ-Ｂｌｏｄｇｅｔｔ（ＬＢ）アプローチによるＦＮＷ足場の調製［実施例１］
ＦＮＷの足場を、以前に我々が報告したＬＢアプローチに従って調製した（非特許文献１３）。簡単に述べると、図３a及び図３ｂに示すように、高アスペクト比ＦＮＷ（アスペクト比＝４９８、直径４０５±９６ｎｍ、長さ２０２±５５μｍ）のＩＰＡ懸濁液０．２ｍＬを、シリンジで石英トラフ（４５ｍｍ×５２．５ｍｍ×１２．５ｍｍ）中の水の表面に静かに分散させた。３分後、空気と水の界面にＦＮＷ膜が形成された。未処理のガラス板（２６．０ｍｍ×１０．０ｍｍ）を、アセトン、メタノール、及び水で洗浄した後、ＦＮＷ膜の端でトラフの壁に沿って水相に挿入し、一部は水面から突出したままとして障壁を形成した。ガラス板をトラフの反対側に向けゆっくり（３０秒間で３ｃｍ）移動させ、水の表面に浮遊するＦＮＷを圧縮し、ガラス板の水面から突出した端部を進行方向と逆の方向に少し倒してガラス板を傾斜させそのまま上方にゆっくり引き上げてガラス板上にＦＮＷ膜を移して水相から取り出した。形成したＦＮＷ膜を、真空オーブン中で、１５時間減圧下６０℃で乾燥して、ＦＮＷの足場を作製し、各特性評価試験に供した。得られた足場は、約２．５ｃｍ×２．５ｃｍの板状であり、その外観を図６に示す。
［実施例２］
低アスペクト比ＦＮＷ（アスペクト比＝５、直径３４０±１７０ｎｍ、長さ１．７±０．５μｍ）と、高アスペクト比ＦＮＷ（アスペクト比＝４９８、直径４０５±９６ｎｍ、長さ２０２±５５μｍ）とを、１：３（Ｌ：Ｈ、質量比）で含むＩＰＡ懸濁液を用いた以外は、［実施例１］と同様にＬＢアプローチに従ってＦＮＷの足場を作製した。
［実施例３］
低アスペクト比ＦＮＷ（アスペクト比＝５、直径３４０±１７０ｎｍ、長さ１．７±０．５μｍ）のＩＰＡ懸濁液を用いた以外は、［実施例１］と同様にＬＢアプローチに従ってＦＮＷの足場を作製した。
【0034】
［比較例１］ＦＮＷの足場を、非特許文献１７に記載するドロップキャスト（ＤＣ）法に従って調製した。簡単に述べると、高アスペクト比ＦＮＷ（アスペクト比＝４９８、直径４０５±９６ｎｍ、長さ２０２±５５μｍ）のＩＰＡ懸濁液０．２ｍＬを、ガラス板上に滴下し、そのまま５分間放置し、ＩＰＡを揮発させた。形成したＦＮＷのキャスト膜を、真空オーブン中で、１５時間減圧下６０℃で乾燥して、ＦＮＷの足場を作製し、各特性評価試験に供した。
【0035】
［比較例２］低アスペクト比ＦＮＷ（アスペクト比＝５、直径３４０±１７０ｎｍ、長さ１．７±０．５μｍ）と、高アスペクト比ＦＮＷ（アスペクト比＝４９８、直径４０５±９６ｎｍ、長さ２０２±５５μｍ）とを、１：３（Ｌ：Ｈ、質量比）で含むＩＰＡ懸濁液を用いた以外は、［比較例１］と同様にドロップキャスト（ＤＣ）法に従ってＦＮＷの足場を形成した。
【0036】
［比較例３］低アスペクト比ＦＮＷ（アスペクト比＝５、直径３４０±１７０ｎｍ、長さ１．７±０．５μｍ）のＩＰＡ懸濁液を用いた以外は、［比較例１］と同様にドロップキャスト（ＤＣ）法に従ってＦＮＷの足場を形成した。
【0037】
ＦＮＷ足場におけるＦＮＷの長軸方向のマップ及び分布実施例１乃至３及び比較例１乃至３で得られたＦＮＷ足場を、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（Ｓ−４８００、日立、電界放出銃を１０ｋＶ、１０μＡで操作）によって観察し（図４の上段、図５の上段）、得られた走査型電子顕微鏡画像をＩｍａｇｅ Ｊで解析して、足場を構成するＦＮＷの長軸方向を、Ｉｍａｇｅ Ｊ用に開発されたＯｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ Ｊソフトウェア（ＮＩＨ）で処理し、カラーコードマップを取得した。画像の各ピクセルデータからＦＮＷの長軸方向を決定し、個々の方向に異なる色を付与した。同じ色は同じ方向を示し、異なる色は異なる方向を示す。このようにして、実施例１乃至３及び比較例１乃至３のＦＮＷ足場について、ＦＮＷの長軸方向のマップ（図４の中段、図５の中段）とＦＮＷの長軸方向の分布（図４の下段、図５の下段）を得た。
ＦＮＷの長軸方向の分布は、各ＦＮＷ足場の走査型電子顕微鏡画像において、１００μｍ間隔で５か所の１００μｍ×１００μｍの領域（ただし、足場の端から１ｍｍ以内の領域は除く）を選択してＦＮＷの個数を計測し、各領域における特定の長軸方向を有するＦＮＷの割合（％）を求め、その平均値により示した。
図４に示す通り、低アスペクト比のＦＮＷのみで構成される実施例３のＦＮＷ足場では、ＦＮＷの長軸方向はほぼランダムであり、すべての方向を向いてＦＮＷがガラス上に広がっていた。低アスペクト比のＦＮＷと、高アスペクト比のＦＮＷで構成される実施例２のＦＮＷ足場では、ＦＮＷの約８０％が±３０°の角度内で配向していた。これに対して、高アスペクト比のＦＮＷのみで構成される実施例１のＦＮＷ足場では、０°（ガラス板の短軸方向と一致した。）付近で非常に高いピークを示し、ＦＮＷの９６％以上が±３０°の角度内に配向していた。このように、本発明の方法によれば、足場を構成させる異なるアスペクト比のＦＮＷの割合を調整することで、ＦＮＷの配向方向の分布を制御することができる。
他方、ドロップキャスト法によって得られた、比較例１乃至３で得られたＦＮＷ足場は、ＦＮＷの表面被覆率が低く不均一に被覆され、いずれのＦＮＷ足場でも、ＦＮＷの長軸方向はほぼランダムであり、ＦＮＷが様々な方向を向いていた。したがって、異なるアスペクト比のＦＮＷの割合を調整することで、ＦＮＷの配向の分布を制御することはできなかった。
【0038】
ＦＮＷ足場の溝パターン原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）（ＳＰＡ−４００、セイコーインスツル株式会社）を用いて、実施例１で得られたＦＮＷ足場のナノ構造を観察した。図７に示す通り、隣接するＦＮＷによって約５００ｎｍ程度の溝が形成され、ＦＮＷが同じ方向に配列していた。
【0039】
ＦＮＷ足場の疎水性実施例１乃至３及び比較例１乃至３で得られたＦＮＷ足場表面の疎水性を、水を足場表面に滴下した際の水滴と足場表面の角度を接線法によって算出される水接触角により評価した。具体的には、各足場に、超純水１μｌを滴下し、水滴の側面から液滴の形状を写真撮影し、撮影された液滴の形状から接線法により接触角を求めた。
図８に示す通り、実施例１で得られたＦＮＷ足場の接触角は１３０°より大きくなり、疎水性を示した。また、実施例２及び３で得られたＦＮＷ足場の接触角もほぼ同じ値となった。
【0040】
ＦＮＷ足場のタンパク質吸着分布フルオレセインイソチオシアネート標識ウシ血清アルブミン（ＦＩＴＣ−ＢＳＡ）を使用して、実施例１で得られたＦＮＷ足場へのタンパク質吸着分布を調べた。
簡単に述べると、ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌＦＩＴＣ−ＢＳＡ溶液中に、１時間、実施例１で得られたＦＮＷ足場及びコントロールとして未処理ガラス板を浸し、次いで、ライカＴＣＳ−ＳＰ５共焦点レーザー走査顕微鏡で画像を得た。
フラーレンは、疎水性とπ電子が豊富な性質を持ち、タンパク質と安定な複合体を形成できるが（非特許文献１８）、実施例１で得られたＦＮＷでは、図９に示す通り、ウシ血清アルブミンがＦＮＷ足場の峰（隆起部）表面に選択的に吸着され、ＦＮＷ足場上に峰に沿って配列したタンパク質のナノパターンが形成された。これに対して、未処理のガラス板では、図１０に示す通り、ガラス板全体にウシ血清アルブミンが吸着していた。
この試験結果から、ＦＮＷ足場におけるＦＮＷの配列を制御することで、ＦＮＷ足場上にタンパク質が吸着される位置及びそのパターンを制御できることが理解できる。上述の通り、本発明の方法では、ＦＮＷ足場表面のナノ形状を連続的に微調整することができるため、ＦＮＷ足場上にタンパク質が吸着される位置及びそのパターンも調整し得る。これを利用することにより、適切な細胞−ＥＣＭ相互作用を達成するための表面ナノ形状を提供できることが理解される。
【0041】
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の培養ｈＭＳＣ（商品名：Human Mesenchymal Stem Cell、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社）を、Ｄｏｍｉｎｉｃｉ，Ｍ等の報告（非特許文献４２）に記載するプロトコルに従って、ペトリ皿で、標準培養条件下（３７℃、５％ＣＯ２）、標準増殖培地（商品名：Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社）で培養し、使用前に継代５回目まで細胞を増殖させたものを使用した。各足場の表面での細胞培養のために、細胞をペトリ皿から０．２５％（ｖ／ｖ）トリプシン−エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液（Invitrogen）によって収集し、次いで、各足場に、５，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。
【0042】
細胞生死アッセイLIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit（Invitrogen社）を使用して、実施例１乃至３のＦＮＷ足場上及びコントロールとしてガラス板上で培養したｈＭＳＣの生死アッセイを実施した。すべてのグループで３回試験を実施した。ＰＢＳ中のＣａｌｃｅｉｎ ＡＭ（１：２０００で希釈）及びＥｔｈＤ−１（１：５００で希釈）を、１日又は７日間、各足場上で培養したｈＭＳＣに加えた。室温で３０分間インキュベートした後、蛍光顕微鏡（ＢＸ５１、オリンパス）で標識細胞を観察した。
図１１に示す通り、いずれのＦＮＷ足場も良好な生体適合性を示し、ｈＭＳＣが増殖した。
【0043】
細胞倍加時間アッセイｈＭＳＣを、３日間、実施例１乃至３のＦＮＷ足場上及びコントロールとしてガラス板上で培養した。次いで、０．２５％（ｖ／ｖ）トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Invitrogen）で細胞をトリプシン処理し、細胞数を計測した。細胞倍加時間は、以下の式により算定した。
【数1】
式中、t2は細胞採取の時間、t1は細胞播種の時間、q2は採取した細胞の数、q1は播種した細胞の数である。この試験では、細胞播種から細胞採取までの時間は3日間であり、播種した細胞の数は５，０００細胞／ｃｍ２である。すべてのグループで３回試験を実施した。
図１２に示す通り、実施例１の高配向性ＦＮＷ足場上で培養したｈＭＳＣの増殖速度は、実施例３の低配向性ＦＮＷ足場上で培養したｈＭＳＣおよびガラス上で培養したｈＭＳＣの増殖速度と同等であったが、実施例３の中程度の配向性ＦＮＷ足場（中配向性ＦＮＷ）上で培養したｈＭＳＣの増殖速度よりも速かった。
【0044】
ＦＮＷ足場の多能性及び自己複製能の維持に関する効果ｈＭＳＣを、ガラス板上又は実施例１乃至３で得られたＦＮＷ足場上で２週間培養し、各足場の多能性及び自己複製能の維持に関する効果を、幹細胞性マーカーを用いて調査した。ＯＣＴ４、ＳＯＸ２およびＮＡＮＯＧは、幹細胞の自己複製能及び多能性の中核調節因子であり（非特許文献２０〜２２）、本試験では、これらのマーカーの遺伝子発現レベルを、定量リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって測定し、タンパク質発現を免疫染色により測定した。
【0045】
１）全ＲＮＡ抽出およびｑＲＴ−ＰＣＲ簡単に述べると、ガラス板上又は実施例１乃至３で得られたＦＮＷ足場上で培養したｈＭＳＣを、２４ウェルプレートの新しいチャンバーに移し、製造業者のプロトコルに従って、全ＲＮＡ抽出を実施した。具体的には、Ethachinmateキット（Nippon Gene）およびAgencourt RNAclean XPキット（Beckman coulter）を使用して、タンパク質およびその他の不純物を除去し、DNaseキット（TaKaRa）を利用して、すべての残留ゲノムＤＮＡを除去して、全ＲＮＡを抽出した。
次いで、PrimeScript RT試薬キット（TaKaRa）を用いて、５００ｎｇの全ＲＮＡの逆転写反応により、相補ＤＮＡを得た。
各マーカー遺伝子の定量は、それぞれ、ＧＡＰＤＨ（フォワード、5'-TCA ACG GAT TTG GTC GTA TTG GG-3'（配列番号１）;リバース、5'-TGA TTT TGG AGG GAT CTC GC-3'（配列番号２））；ＯＣＴ３／４（フォワード、5'-GCC CGA AAG AGA AAG CGA AC-3'（配列番号３）;リバース、5'-ACA TCC TTC AGC CCA AG-3'（配列番号４））；ＮＡＮＯＧ（フォワード、5'-GAC AAG GTC CCG GTC AAG AA-3'（配列番号５）; リバース、5'-CTT CAC CTG TTT GTA GCT GAG G-3'（配列番号６））；ＳＯＸ２（フォワード、5'-CAG GAG TTG TCA AGG CAG AGA-3'（配列番号７）、リバース、5'-GG GGC TCA AAC TTC TCT CCC-3'（配列番号８））のプライマーセットを使用し、LightCycler 480 II（Roche）でLightCycler 480 SYBR Green I Master（Roche）を使用して実施した。ハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤＨを用い、標的遺伝子の定量的発現を、２−△△Ｃｔ法で分析した。未処理のガラス板上で培養されたｈＭＳＣの遺伝子発現を１に正規化した。
【0046】
図１３に示すように、実施例１（高配向性ＦＮＷ）および実施例２（中配向性ＦＮＷ）の足場上で培養したｈＭＳＣは、実施例３（低配向性ＦＮＷ）およびガラス板（コントロール）と比較して、ＯＣＴ４の遺伝子発現が、顕著にアップレギュレーションされた。また、ＳＯＸ２遺伝子の発現は、実施例１の足場（高配向性ＦＮＷ）で培養したｈＭＳＣのみで検出された。ＮＡＮＯＧ遺伝子の発現については、実施例１の足場（高配向性ＦＮＷ）で培養したｈＭＳＣで、顕著にアップレギュレーションされ、実施例３（低配向性ＦＮＷ）および実施例２（中配向性ＦＮＷ）の足場上で培養したｈＭＳＣは、アップレギュレートされなかった。
【0047】
さらに、ｈＭＳＣを、ガラス板上又は実施例１乃至３で得られたＦＮＷ足場上で１週間培養し、同様の試験を行った。図１４に示すように、マーカー遺伝子の発現の傾向は、２週間培養したｈＭＳＣと類似していたが、実施例１（高配向性ＦＮＷ）の足場上で培養したｈＭＳＣは、マーカー遺伝子の発現レベルが、２週間培養した場合に比べて顕著に高くなっておらず、同レベルで推移していることが認められた。両試験の結果を比較すると、ガラス板上で培養したｈＭＳＣは、多能性が時間の経過に従って徐々に減少するが、実施例１（高配向性ＦＮＷ）の足場上で培養したｈＭＳＣは、長期間の培養で多能性及び自己複製能を維持していることが確認された。
【0048】
２）免疫蛍光染色ガラス板上又は実施例１乃至３で得られたＦＮＷ足場上で２週間培養したｈＭＳＣについて、免疫染色により、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２およびＮＡＮＯＧのタンパク質発現も調査した。
免疫蛍光染色のために、未処理のガラス板（１ｃｍ×１ｃｍ）と実施例１乃至３で得られたＦＮＷ足場（１ｃｍ×１ｃｍ）を、２４ウェルプレートのチャンバーに入れ、ｈＭＳＣを播種した。２週間、各足場上でｈＭＳＣを培養した後、標準的な免疫染色プロトコルを実施した。細胞をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、次いで、遊離アルデヒドをＰＢＳ中の５％グリシンで５分間で消滅させた。細胞を０．２％Triton X-100ＰＢＳ溶液で５分間透過処理した。５％ＢＳＡで、室温で１時間ブロッキングした後、免疫染色を、ＯＣＴ４マウスモノクローナル抗体（Santa Cruz、sc-5279、1：100で希釈）、ＮＡＮＯＧマウスモノクローナル抗体（Santa Cruz、sc-293121、1：100で希釈）、ＳＯＸ２マウスモノクローナル抗体（Santa Cruz、sc-365823、1：100で希釈）、抗ビンキュリンマウスモノクローナル抗体（サンタクルーズ、sc-73614、1：200で希釈）およびＹＡＰマウスモノクローナル抗体（サンタクルーズ、sc-101199、1：100で希釈）で４℃で一晩実施し、次いで、２次抗体として、Alex Fluor 488ニワトリ抗マウス抗体（Life Technologies、A21200、1：100で希釈）と共に、暗所中室温で、１時間インキュベーションした。次に、Ｆ-アクチンを、ファロイジンAlexa Fluor 568（Life Technologies、A12380、1：200で希釈）で１時間染色した。さらに、核をヘキスト33342（Life Technologies、2584w、1：3000の希釈）で３０分間染色した。最後に、Slowfade（登録商標）antifadeキット（Life Technologies、1597356）を使用して、ガラス板をガラス底皿に固定した。ＯＣＴ４およびＮＡＮＯＧの画像は、蛍光顕微鏡（ＢＸ５１、オリンパス）を用い、６３倍オイル対物レンズで取得し、ＯＣＴ４およびＮＡＮＯＧの細胞発現の割合は、ＭｅｔａＶｕｅソフトウェアで算出した。ＳＯＸ２の画像は、ライカＴＣＳ−ＳＰ５共焦点レーザー走査顕微鏡で取得し、核領域におけるＳＯＸ２の平均蛍光強度は、ＬＡＳ−ＡＦ−Ｌｉｔｅソフトウェアで決定した。
【0049】
図１５aに示すように、幹細胞性マーカーのＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＮＡＮＯＧは、それぞれｈＭＳＣの核に偏在していた（非特許文献２１も参照）。実施例１（高配向性ＦＮＷ）および実施例２（中配向性ＦＮＷ）の足場上で培養したｈＭＳＣは、ＯＣＴ４マーカーの発現が顕著にアップレギュレートした。また、図１５ｂに示すように、実施例１（高配向性ＦＮＷ）の足場上で培養したｈＭＳＣは、実施例３（低配向性ＦＮＷ）および実施例２（中配向性ＦＮＷ）の足場上で培養したｈＭＳＣに比べ、ＳＯＸ２およびＮＡＮＯＧマーカーの発現が有意にアップレギュレートした。これらの結果は、遺伝子発現を調査した試験と同様に、実施例１（高配向性ＦＮＷ）の足場上で培養したｈＭＳＣが、２週間に亘って多能性及び自己複製能を維持したことを示す。
【0050】
ＦＮＷ足場によるｈＭＳＣの伸縮、及び伸長方向に対する効果本試験では、ＦＮＷ足場におけるナノスケール及びマイクロスケールの構造又は形状がｈＭＳＣの伸縮性及び局所接着範囲に及ぼす影響を、以前に報告された方法（非特許文献４３）に基づいて行った。
【0051】
ｈＭＳＣを、実施例１（高配向性ＦＮＷ）、実施例２（中配向性ＦＮＷ）および実施例３（低配向性ＦＮＷ）の足場上で１日培養した後、F-アクチンを、ファロイジンAlexa Fluor 680（Life Technologies、A22286、1：200で希釈）で１時間染色した後、核をヘキスト33342（Life Technologies、2584w、1：3000の希釈）で３０分間染色した。染色後、Slowfade（登録商標）antifadeキット（Life Technologies、1597356）を使用して、ガラス板をガラス底皿に固定し、蛍光顕微鏡（ＢＸ５１、オリンパス）で６３倍オイル対物レンズを使用して画像を取得した。得られた画像を、Ｉｍａｇｅ Ｊで処理して、個々の細胞の面積、細胞のアスペクト比、細胞の伸長方向の分布を算出し、細胞の伸長方向のマップを作成した。
【0052】
実施例１の足場（高配向性ＦＮＷ）上で培養したｈＭＳＣは、実施例２の足場（中配向性ＦＮＷ）および実施例３の足場（低配向性ＦＮＷ）上で培養したｈＭＳＣに比べ、細胞面積が有意に大きかった（図１６ａ、図１６ｂ）。また、実施例３の足場（低配向性ＦＮＷ）上で培養したｈＭＳＣ、実施例２の足場（中配向性ＦＮＷ）上で培養したｈＭＳＣ、及び実施例１の足場（高配向性ＦＮＷ）上で培養したｈＭＳＣのアスペクト比は、それぞれ、２．５±０．９、４．３±１．８、及び５．８±２．１であり（図１６ｃ）、足場のＦＮＷのアスペクト比及び配向の程度が大きくなるにつれ大きくなった。また、実施例１の足場（高配向性ＦＮＷ）上で培養した細胞は、きれいに一方向を向いて整列してしたが、実施例３の足場（低配向性ＦＮＷ）上で培養したｈＭＳＣは、様々な方向に伸長していた（図１６ｄ）。また、細胞の伸びが大きくなると（すなわち、アスペクト比が大きくなると）、細胞の伸長方向は隣接するＦＮＷの長軸方向（核を染色した際の、核の真下にあるＦＮＷの長軸方向）に対して０°に収束していった（図１６e）。
【0053】
ｈＭＳＣを、実施例１（高配向性ＦＮＷ）、実施例２（中配向性ＦＮＷ）および実施例３（低配向性ＦＮＷ）の足場上で２週間培養した後、同様の試験を行ったが、図１７に示す通り、各足場上の細胞の形態は、１日培養した場合と同様の傾向が認められた。これらの結果から、ＦＮＷ足場のパターン化されたナノスケールの表面形状により、細胞の伸縮、及びその伸長方向を長期間制御できることが理解される。興味深いことに、細長い形態のｈＭＳＣは、神経性または筋原性分化に至ることが報告されており（非特許文献２６及び２７）、今回の知見は、これとは異なり、ｈＭＳＣの一定方向への伸長が、多能性及び自己複製を維持することを示し（図１４参照）、ｈＭＳＣの運命が細胞の形状から切り離されていると理解できる（非特許文献２８参照）。
【0054】
ＦＮＷ足場によるｈＭＳＣの細胞伸縮及び局所接着に対する効果ｈＭＳＣを、実施例１（高配向性ＦＮＷ）、実施例２（中配向性ＦＮＷ）および実施例３（低配向性ＦＮＷ）の足場上で１日培養した後、Ｆ−アクチン（赤）を、ファロイジンAlexa Fluor 568（Life Technologies、A12380、1：200で希釈）で、ビンキュリン（緑）を、抗ビンキュリン抗体（サンタクルーズ、sc-73614、1：200で希釈）で、１時間染色した後、核（青）を、ヘキスト33342（Life Technologies、2584w、1：3000の希釈）で、３０分間染色した。染色後、Slowfade（登録商標）antifadeキット（Life Technologies、1597356）を使用して、ガラス板をガラス底皿に固定し、共焦点レーザー走査顕微鏡（ＴＣＳ−ＳＰ５、ライカ）で６３倍オイル対物レンズを使用して画像を取得した。得られた画像を、Ｉｍａｇｅ Ｊで処理して、１細胞当たりの接着斑の面積を決定した。
【0055】
図１８ａに示すように、実施例１（高配向性ＦＮＷ）、実施例２（中配向性ＦＮＷ）の足場上で培養したｈＭＳＣは、実施例３（低配向性ＦＮＷ）の足場上で培養したｈＭＳＣに比べ、ＦＮＷの長軸に沿ってよく組織化されたＦ−アクチン標識細胞群が認められた（下段）。また、実施例１（高配向性ＦＮＷ）、及び実施例２（中配向性ＦＮＷ）の足場上で培養したｈＭＳＣでは、ビンキュリンに富む接着斑が明確に観察され、それは、ＦＮＷの長軸方向に沿って伸長していた（中段）。図１９に示す通り、実施例１（高配向性ＦＮＷ）及び実施例２（中配向性ＦＮＷ）の足場上で培養したｈＭＳＣは、それぞれ約８５％及び約７０％のｈＭＳＣで、成熟した接着斑が観察された。他方、実施例３（低配向性ＦＮＷ）の足場上で培養したｈＭＳＣでは、約３０％のｈＭＳＣで成熟した接着斑が観察された。
【0056】
図１８ｂ及び図１８ｃに示す通り、接着斑の面積は、実施例３（低配向性ＦＮＷ）の足場上及び実施例２（中配向性ＦＮＷ）の足場上で培養したｈＭＳＣよりも、実施例１（高配向性ＦＮＷ）の足場上で培養したｈＭＳＣで有意に大きくなり、これは、ｈＭＳＣの伸長に関連した。対照的に、ガラス板（コントロール）上で培養したｈＭＳＣでは、実施例１（高配向性ＦＮＷ）の足場上で培養したｈＭＳＣよりも接着斑の面積が著しく大きく、多数のＦ−アクチン標識細胞が観察された（図１８ａの左列）。
【0057】
適切な接着／引っ張り状態が、ｈＭＳＣの自己複製に必要であり、分化に必要なメタボロームの活性化を防ぐために細胞接着を低下させながらも、細胞の自己複製を可能にするのに十分に機械的に活性であることが重要であると理解される（非特許文献１０参照）。
【0058】
ＦＮＷ足場によるＹＡＰの核内移行に対する効果ｈＭＳＣを、実施例１（高配向性ＦＮＷ）、実施例２（中配向性ＦＮＷ）および実施例３（低配向性ＦＮＷ）の足場上で１日培養した後、Ｆ−アクチン（赤）を、ファロイジンAlexa Fluor 568（Life Technologies、A12380、1：200で希釈）で、ＹＡＰ（緑）をＹＡＰ抗体（サンタクルーズ、sc-101199、1：100で希釈）で、１時間染色した後、核（青）をHochest 33342で、３０分間染色した。染色後、Slowfade（登録商標）antifadeキット（Life Technologies、1597356）を使用して、ガラス板をガラス底皿に固定し、Leica TCS-SP5共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して画像を取得した。得られた画像の核領域および核外の細胞骨格領域の平均蛍光強度を、ＬＡＳ−ＡＦ−Ｌｉｔｅソフトウェアによって決定した。
【0059】
図２０ａに示すように、実施例１（高配向性ＦＮＷ）の足場上で培養したｈＭＳＣでは、ＹＡＰは主に核に存在していた。他方、実施例２（中配向性ＦＮＷ）の足場及び実施例３（低配向性ＦＮＷ）の足場上で培養したｈＭＳＣでは、細胞質に存在するＹＡＰがより多くなった。従って、核局在ＹＡＰ／細胞質局在ＹＡＰの比は、実施例２（中配向性ＦＮＷ）の足場及び実施例３（低配向性ＦＮＷ）の足場上で培養したｈＭＳＣに比べ、実施例１（高配向性ＦＮＷ）の足場上で培養したｈＭＳＣで有意に高かった（図２０ｂ）。ｈＭＳＣにおけるＹＡＰ核局在化は、転写コアクチベーターとして上述した幹細胞性（多能性及び自己複製能）の中核制御因子の発現を促すものと理解される（非特許文献３５−３７）。
【図1】
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【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]