特開 2021-172636 線維化抑制剤及び医薬組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2021-172636(P2021-172636A)

(43)【公開日】2021年11月1日

(54)【発明の名称】線維化抑制剤及び医薬組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/50 20150101AFI20211004BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20211004BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20211004BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20211004BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20211004BHJP

【ＦＩ】

   A61K35/50

   A61P43/00 105

   A61P1/16

   A61K31/7105

   C12N5/071ZNA

【審査請求】未請求

【請求項の数】8

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】11

(21)【出願番号】特願2020-80283(P2020-80283)

(22)【出願日】2020年4月30日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 掲載ウェブサイトのアドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｋａｋｅｎ．ｎｉｉ．ａｃ．ｊｐ／ｊａ／ｇｒａｎｔ／ＫＡＫＥＮＨＩ−ＰＲＯＪＥＣＴ−１９Ｋ２３７３２／、掲載年月日：令和０１年０９月０３日

(71)【出願人】

【識別番号】899000057

【氏名又は名称】学校法人日本大学

(74)【代理人】

【識別番号】100161207

【弁理士】

【氏名又は名称】西澤 和純

(74)【代理人】

【識別番号】100175824

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100126882

【弁理士】

【氏名又は名称】五十嵐 光永

(72)【発明者】

【氏名】三木 敏生

【テーマコード（参考）】

4B065

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AC20

4B065BD15

4B065CA44

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

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4C087BB64

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4C087MA55

4C087MA56

4C087MA58

4C087MA59

4C087MA60

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA75

4C087ZB21

(57)【要約】

【課題】新規線維化抑制剤、及び線維性疾患を治療又は予防するための医薬組成物を提供する。
【解決手段】羊膜上皮細胞の分泌物を含有する、線維化抑制剤。また、羊膜上皮細胞の分泌物を含有する、線維性疾患を治療又は予防するための医薬組成物。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

羊膜上皮細胞の分泌物を含有する、線維化抑制剤。

【請求項2】

前記羊膜上皮細胞の分泌物が、前記羊膜上皮細胞が分泌するエクソソームである、請求項１に記載の線維化抑制剤。

【請求項3】

前記羊膜上皮細胞の分泌物が、ｍｉＲ−４８３−５ｐである、請求項１に記載の線維化抑制剤。

【請求項4】

羊膜上皮細胞の分泌物を含有する、線維性疾患を治療又は予防するための医薬組成物。

【請求項5】

前記羊膜上皮細胞の分泌物が、前記羊膜上皮細胞が分泌するエクソソームである、請求項４に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記羊膜上皮細胞の分泌物が、ｍｉＲ−４８３−５ｐである、請求項５に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記線維性疾患が、肝臓の線維性疾患である、請求項６に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記肝臓の線維性疾患が、肝硬変である、請求項７に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、線維化抑制剤、及び線維性疾患を治療又は予防するための医薬組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

線維化は、組織に線維性結合組織が過剰に蓄積する現象である。組織の線維化が起こると、組織が柔軟性を失って硬化し、機能障害を生じる。その結果生じる疾患が線維性疾患である。線維性疾患は、肺、肝臓、腎臓等の種々の器官で生じる。線維性疾患は、多くの場合非可逆的であり、進行すると死に至る場合もある。

【0003】

肝硬変では、その状態に合わせて、炎症抑制剤、肝機能回復剤などの種々の薬剤により症状を抑制するとともに、多くの肝硬変の原因となるウイルスへの対処が行われる。しかし、根本的な治療方法は開発されていない。

【0004】

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、タンパク質をコードしない約２０〜２５塩基長のＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、機能性のｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）に分類されており、遺伝子の発現を調節する機能を有している。ｍｉＲＮＡは、各種医薬品への応用が期待されている。例えば、特許文献１には、特定のｍｉＲＮＡを高発現する間葉系幹細胞を含む疾患医療剤が記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２０１９−１５６７３９号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

上記のように、線維性疾患の根本的な治療方法は開発されておらず、新規治療薬の開発が求められている。

【0007】

本発明は上記事情に鑑みて為されたものであり、新規線維化抑制剤、及び線維性疾患を治療又は予防するための医薬組成物を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は以下の態様を含む。
［１］羊膜上皮細胞の分泌物を含有する、線維化抑制剤。
［２］前記羊膜上皮細胞の分泌物が、前記羊膜上皮細胞が分泌するエクソソームである、［１］に記載の線維化抑制剤。
［３］前記羊膜上皮細胞の分泌物が、ｍｉＲ−４８３−５ｐである、［１］に記載の線維化抑制剤。
［４］羊膜上皮細胞の分泌物を含有する、線維性疾患を治療又は予防するための医薬組成物。
［５］前記羊膜上皮細胞の分泌物が、前記羊膜上皮細胞が分泌するエクソソームである、［４］に記載の医薬組成物。
［６］前記羊膜上皮細胞の分泌物が、ｍｉＲ−４８３−５ｐである、［５］に記載の医薬組成物。
［７］前記線維性疾患が、肝臓の線維性疾患である、［６］に記載の医薬組成物。
［８］前記肝臓の線維性疾患が、肝硬変である、［７］に記載の医薬組成物。

【発明の効果】

【0009】

本発明によれば、新規線維化抑制剤、及び線維性疾患を治療又は予防するための医薬組成物が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】羊膜上皮細胞培養上清に含まれるエクソソームの線維化抑制効果を示す。肝星細胞の活性化マーカーであるα―ＳＭＡの発現量を、内在性コントロールであるＰＰＩＡに対する相対発現量として示した。

【図2】羊膜上皮細胞由来エクソソームのｍｉＲＮＡの網羅的解析結果を示す。

【図3】羊膜上皮細胞由来エクソソームのｍｉＲＮＡの網羅的解析結果を示す。

【図4】ｍｉＲ−４８３−５ｐの線維化抑制効果を示す。肝星細胞の活性化マーカーであるα―ＳＭＡの発現量を、内在性コントロールであるＰＰＩＡに対する相対発現量として示した。

【発明を実施するための形態】

【0011】

[線維化抑制剤]
一実施形態において、本発明は、羊膜上皮細胞の分泌物を含む、線維化抑制剤、を提供する。

【0012】

「羊膜上皮細胞」は、羊膜の上皮から分離された細胞、及び前記細胞に由来する細胞を意味する。羊膜上皮細胞の分泌物は、星細胞の活性化を抑制し、組織の線維化を抑制する作用を有する。羊上皮膜細胞が由来する生物種は、本実施形態の線維化抑制剤の投与対象となる生物種と同一であることが好ましい。羊膜上皮細胞が由来する生物種としては、例えば、ヒト、又はヒト以外の哺乳動物が挙げられる。ヒト以外の哺乳動物は、特に限定されないが、例えば、霊長類（サル、チンパンジー、ゴリラなど）、げっ歯類（マウス、ハムスター、ラットなど）、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等が挙げられる。羊膜細胞は、好ましくは、ヒトの羊膜上皮細胞である。

【0013】

羊膜上皮細胞の分泌物は、例えば、羊膜上皮細胞を培養した培養上清から得ることができる。羊膜上皮細胞の培養方法は、特に限定されず、公知の方法で培養することができる。培地は、公知の細胞培養用培地を特に限定なく用いることができる。培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培養液（ＤＭＥＭ）、ＭＥＭ培養液（α−ＭＥＭ、ＭＥＭ［Ｈａｎｋ’ｓ Ｂｓｓ］等）、ＲＰＭＩ培養液（ＲＰＭＩ １６４０等）、Ｆ１２培養液、ＳｔｅｍＰｒｏ３４、ｍＴｅＳＲ１等が挙げられる。培養温度は、２５〜４０℃が挙げられ、３０〜４０℃が好ましく、３５〜３７℃がより好ましい。

【0014】

羊膜上皮細胞の分泌物は、羊膜上皮細胞の培養上清をそのまま用いてもよいし、前記培養上清から特定の成分を分離して用いてもよい。培養上清は、羊膜上皮細胞を培養し、培養液から羊膜上皮細胞を分離することにより、得ることができる。培養上清と羊膜上皮細胞とを分離する方法は、特に限定されないが、例えば、遠心分離法、フィルターろ過等が挙げられる。

【0015】

羊膜上皮細胞の分泌物としては、例えば、エクソソームが挙げられる。本実施形態の線維化抑制剤は、羊膜上皮細胞由来のエクソソームを含有するものであってもよい。エクソソームは、羊膜上皮細胞の培養上清から取得することができる。例えば、羊膜上皮細胞の培養上清からエクソソームを分離する方法は、特に限定されないが、例えば、超遠心分離、限外ろ過、連続フロー電気泳動、クロマトグラフィー等の方法が挙げられる。

【0016】

エクソソームは、ｍｉＲ−４８３−５ｐを含有することが好ましい。ｍｉＲ−４８３−５ｐは、羊膜上皮細胞由来のエクソソームに特異的に含まれるｍｉＲＮＡである。後述する実施例で示すように、ｍｉＲ−４８３−５ｐは、星細胞の脱活性化を誘導し、線維化を抑制する作用を有する。そのため、ｍｉＲ−４８３−５ｐを含むエクソソームを用いることにより、線維化抑制効果を奏することができる。羊膜上皮細胞由来のエクソソームは、通常、ｍｉＲ−４８３−５ｐを含有する。ヒトのｍｉＲ−４８３−５ｐ（ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３−５ｐ）の塩基配列を配列番号１に示す。
ａａｇａｃｇｇｇａｇｇａａａｇａａｇｇｇａｇ（配列番号１）

【0017】

羊膜上皮細胞の分泌物は、ｍｉＲ−４８３−５ｐであってもよい。ｍｉＲ−４８３−５ｐは、配列番号１に示す塩基配列に基づき、公知の核酸合成法で合成することにより、取得することができる。核酸合成法としては、例えば、ホスホロアミダイト法等が挙げられる。

【0018】

ｍｉＲ−４８３−５ｐは、ヌクレオチド残基の一部又は全部が、人工ヌクレオチドから誘導されるヌクレオチド残基で構成されていてもよい。「人工ヌクレオチド」は、リボヌクレオチドの糖部分、塩基部分及びリン酸基部分のいずれか１つ以上が修飾されたヌクレオチドである。人工ヌクレオチドとしては、例えば、ＢＮＡ、ＥＮＡ等が挙げられるが、これらに限定されない。また、ｍｉＲ−４８３−５ｐは、ヌクレオチド残基の一部が、デオキシリボヌクレオチドから誘導されるヌクレオチド残基で構成されていてもよい。一般的に、人工ヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドから誘導されるヌクレオチド残基の存在は、核酸分子の安定性を向上させる。本明細書において、「ｍｉＲ−４８３−５ｐ」という用語は、ＲＮＡのみからなるものに加えて、人工ヌクレオチド残基及びデオキシリボヌクレオチド残基からなる群より選択される少なくとも１種を含むものも包含する。

【0019】

本実施形態の線維化抑制剤は、羊膜上皮細胞の分泌物に加えて、任意成分を含んでいてもよい。前記任意成分は、特に限定されず、医薬品分野において常用されるものを特に制限なく使用することができる。任意成分としては、例えば、後述する薬学的に許容される担体等が挙げられる。

【0020】

本実施形態の線維化抑制剤は、組織又は器官の線維化を抑制するために、対象に投与して使用することができる。あるいは、後述する医薬組成物として、対象に投与することができる。線維化の抑制対象となる組織又は器官は、線維化が生じる組織又は器官であれば、特に限定されない。線維化が生じる組織又は器官としては、例えば、肝臓、肺、腎臓、皮膚、骨髄、心内膜、皮膚、後腹膜、腸間膜、乳腺、消化管、脂肪組織等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0021】

［医薬組成物］
一実施形態において、本発明は、羊膜上皮細胞の分泌物を含有する、線維性疾患を治療又は予防するための医薬組成物を提供する。

【0022】

羊膜上皮細胞の分泌物は、線維化抑制効果があるため、医薬組成物に含有させることにより、線維性疾患を治療又は予防するための医薬組成物として用いることができる。本実施形態の医薬組成物は、羊膜上皮細胞の分泌物を有効成分として含有する。羊膜上皮細胞の分泌物は、エクソソームであることが好ましく、ｍｉＲ−４８３−５ｐであることがより好ましい。

【0023】

線維性疾患は、組織又は器官の線維化に伴って発生する疾患である。線維性疾患は、特に限定されないが、例えば、肝硬変、肺線維症、腎線維症、膵線維症、心筋線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、腸間膜線維症、乳腺線維症、嚢胞性線維症、消化管線維症、脂肪組織線維症、全身性強皮症、限局性強皮症、ケロイド、肥厚性瘢痕、皮膚創傷後または皮膚潰瘍後の瘢痕、皮膚線維症等が挙げられるが、これらに限定されない。線維性疾患は、肝臓の線維性疾患であることが好ましく、肝硬変がより好ましい。

【0024】

本実施形態の医薬組成物の適用対象の生物種は、線維性疾患を発症する生物であれば、特に限定されない。適用対象の生物種としては、例えば、ヒト、又はヒト以外の哺乳動物が挙げられる。ヒト以外の哺乳動物としては、例えば、霊長類（サル、チンパンジー、ゴリラなど）、げっ歯類（マウス、ハムスター、ラットなど）、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0025】

本実施形態の医薬組成物は、羊膜上皮細胞の分泌物に加えて、少なくとも１種の薬学的に許容される担体を含み得る。「薬学的に許容される担体」とは、有効成分の生理活性を阻害せず、且つ、その投与対象に対して実質的な毒性を示さない担体を意味する。「実質的な毒性を示さない」とは、その成分が通常使用される投与量において、投与対象に対して毒性を示さないことを意味する。本実施形態の医薬組成物においては、薬学的に許容される担体は、羊膜上皮細胞の分泌物の線維化抑制能を阻害せず、且つその投与対象に対して実質的な毒性を示さない担体である。薬学的に許容される担体は、典型的には非活性成分とみなされる、公知のあらゆる薬学的に許容され得る成分を包含する。薬学的に許容される担体は、特に限定されないが、例えば、溶媒、希釈剤、ビヒクル、賦形剤、流動促進剤、結合剤、造粒剤、分散化剤、懸濁化剤、湿潤剤、滑沢剤、崩壊剤、可溶化剤、安定剤、乳化剤、充填剤、保存剤（例えば、酸化防止剤）、キレート剤、矯味矯臭剤、甘味剤、増粘剤、緩衝剤、着色剤等が挙げられる。薬学的に許容される担体は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。

【0026】

本実施形態の医薬組成物は、さらに任意成分を含んでいてもよい。任意成分は、特に限定されず、医薬分野において常用されるものを特に制限なく使用することができる。本実施形態の医薬組成物は、羊膜上皮細胞の分泌物以外の活性成分を含んでいてもよい。活性成分としては、例えば、ビタミン類及びその誘導体類、消炎剤、抗炎症剤、血行促進剤、刺激剤、ホルモン類、刺激緩和剤、鎮痛剤、細胞賦活剤、植物・動物・微生物エキス、鎮痒剤、消炎鎮痛剤、抗真菌剤、抗ヒスタミン剤、催眠鎮静剤、精神安定剤、抗高血圧剤、降圧利尿剤、抗生物質、麻酔剤、抗菌性物質、抗てんかん剤、冠血管拡張剤、生薬、止痒剤、角質軟化剥離剤等が挙げられるが、これらに限定されない。任意成分は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。

【0027】

本実施形態の医薬組成物の剤型は、特に制限されず、医薬品製剤として一般的に用いられる剤型とすることができる。本実施形態の医薬組成物は、経口製剤であってもよく、非経口製剤であってもよい。経口製剤としては、例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、細粒剤、液剤、ドロップ愛、乳剤等が例示される。非経口製剤としては、例えば、注射剤、坐剤、軟膏、スプレー剤、外用液剤、点耳剤、点眼剤、点鼻剤、吸入剤等が例示される。これらの剤型の医薬組成物は、定法（例えば、日本薬局方記載の方法）に従って、製剤化することができる。

【0028】

本実施形態の医薬組成物の投与経路は、特に限定されず、経口又は非経口経路で投与することができる。なお、非経口経路は、経口以外の全ての投与経路、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内、点眼、脳内、直腸内、腟内及び腹腔内等への投与を包含する。また、投与は、局所投与であっても全身投与であってもよい。

【0029】

本実施形態の医薬組成物は、羊膜上皮細胞の分泌物の治療的有効量を投与することができる。「治療的有効量」とは、対象疾患の治療又は予防のために有効な薬剤の量を意味する。例えば、羊膜上皮細胞の分泌物の治療的有効量は、線維性疾患の発症及び／又は進行を遅らせることができる量であり得る。治療的有効量は、患者の症状、体重、年齢、及び性別等、並びに医薬組成物の剤型、及び投与方法等によって適宜決定すればよい。例えば、本実施形態の医薬組成物は、羊膜上皮細胞の分泌物（例えば、羊膜上皮細胞由来エクソソーム、又はｍｉＲ−４８３−５ｐ）の１回の投与量として、投与対象の体重１ｋｇあたり、０．０１〜１０００ｍｇとすることができる。前記投与量は、０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇであってもよく、０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇであってもよく、０．１〜４００ｍｇ／ｋｇであってもよく、０．５〜３００ｍｇ／ｋｇであってもよい。

【0030】

本実施形態の医薬組成物は、単位投与形態あたり、治療的有効量の羊膜上皮細胞の分泌物（例えば、羊膜上皮細胞由来エクソソーム、又はｍｉＲ−４８３−５ｐ）を含んでいてもよい。例えば、本実施形態の医薬組成物における化合物（Ｉ）等の含有量は、０．０１〜９０質量％であってもよく、０．０５〜８０質量％であってもよく、０．１〜６０質量％であってもよい。

【0031】

本実施形態の医薬組成物の投与間隔は、患者の症状、体重、年齢、及び性別等、並びに医薬組成物の剤型、及び投与方法等によって適宜決定すればよい。投与間隔は、例えば、数時間毎、１日１回、２〜３日に１回、１週間に１回等とすることができる。

【0032】

［他の態様］
一実施形態において、本発明は、羊膜上皮細胞の分泌物（例えば、羊膜上皮細胞由来エクソソーム、又はｍｉＲ−４８３−５ｐ）を含む、線維性疾患を治療又は予防するための医薬組成物を提供する。
一実施形態において、本発明は、線維性疾患を治療又は予防するための医薬組成物の製造における、羊膜上皮細胞の分泌物（例えば、羊膜上皮細胞由来エクソソーム、又はｍｉＲ−４８３−５ｐ）の使用を提供する。
一実施形態において、本発明は、線維性疾患を治療又は予防に使用するための、羊膜上皮細胞の分泌物（例えば、羊膜上皮細胞由来エクソソーム、又はｍｉＲ−４８３−５ｐ）の使用を提供する。
一実施形態において、本発明は、前記羊膜上皮細胞の分泌物（例えば、羊膜上皮細胞由来エクソソーム、又はｍｉＲ−４８３−５ｐ）を対象（例、線維性疾患に罹患している患者など）に投与することを含む、線維性疾患の治療方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、線維性疾患を治療又は予防するための、羊膜上皮細胞の分泌物（例えば、羊膜上皮細胞由来エクソソーム、又はｍｉＲ−４８３−５ｐ）を提供する。

【実施例】

【0033】

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0034】

［実施例１］
１．細胞
ヒト羊膜上皮細胞は、帝王切開で得られた正常ヒト胎盤より羊膜を分離し、酵素法を用いて羊膜上皮細胞を分離した。ヒト羊膜上皮細胞は、遠心分離法によってエクソソームを除去したｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ （ＫＳＲ）１０％を含むＤＭＥＭ培地を用いて維持した。
ヒト肝星培養細胞であるＬＸ−２細胞は、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）より購入したものを用いた。ＬＸ−２細胞は、高濃度グルコース（４．５ｇ／ｄＬ），２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ），１Ｘ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ １Ｘ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅを含むＤＭＥＭ培地を用いて維持した。

【0035】

２．ヒト羊膜上皮細胞由来エクソソームの回収
ヒト初代羊膜上皮細胞を１０ｍＬのＤＭＥＭ・ＫＳＲ培地を用いて、５％ＣＯ_２、３７℃で２日間培養した。培養液を遠心分離して培養上清を回収した。さらに、培養上清から、段階遠心分離法（３００ ｘ ｇ ｆｏｒ １０ｍｉｎ，２，０００ ｘ ｇ ｆｏｒ １０ｍｉｎ，ａｎｄ １０，０００ × ｇ ｆｏｒ ３０ｍｉｎ ａｔ ４°Ｃ）により、エクソソームを回収した。

【0036】

３．線維化抑制能の評価
ヒト肝星培養細胞であるＬＸ−２細胞は、２％ＦＢＳを含む低濃度グルコース（１ｇ／ｄＬ）ＤＭＥＭで４８時間培養したのち、ヒト羊膜上皮細胞由来エクソソーム及び担体であるリン酸バッファーのみを培養液に添加した。５％ＣＯ_２、３７℃で１７時間培養したのち、ヒトＴＧＦβ―１（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＴＧＦβ１、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を以下のように添加した。
（１）リン酸バッファーのみ添加、ＴＧＦβ−非添加
（２）リン酸バッファーのみ添加、ＴＧＦβ−添加（終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
（３）ヒト羊膜上皮細胞由来エクソソーム添加（終濃度１０ｕｇ／ｍｌ）、ＴＧＦβ−添加（終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）

【0037】

ＴＧＦβ―１添加後４８時間培養後、上記（１）〜（３）のヒト肝星細胞からフェノール/グアニジンイソチオシアネート法（Ｔｒｉｚｏｌ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。次いで、定量ＲＴ−ＰＣＲにより、α−ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ（α−ＳＭＡ）のｍＲＮＡを定量した。定量ＲＴ−ＰＣＲは、α−ＳＭＡとｐｅｐｔｉｄｙｌｐｒｏｌｙｌ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ Ａ（ＰＰＩＡ）に特異的なプライマーセットとＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓを用いて、ＶｉｉＡ（登録商標）７リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により行った。α−ＳＭＡは、肝星細胞の活性化マーカーであり、ＰＰＩＡは、内在性コントロールである。

【0038】

結果を図１に示す。図１では、ＰＰＩＡに対するα―ＳＭＡの相対発現量を示した。ヒト羊膜上皮細胞由来エクソソームは、ＴＧＦβ−１によるα−ＳＭＡの発現上昇を有意に抑制することが確認された。この結果は、ヒト羊膜上皮細胞由来エクソソームがα−ＳＭＡの発現を抑制し、肝星細胞の活性化すなわち線維化を抑制することを示唆している。

【0039】

［実施例２］
１．細胞
ヒト羊膜上皮細胞は、上記と同様のものを用いた。
正常ヒト新生児皮膚線維芽細胞は、ＬＯＮＺＡ（ＮＨＤＦ−Ｎｅｏ，ＣＣ−２５０９）より購入したものを用いた。ヒト新生児皮膚線維芽細胞は、ヒト羊膜上皮細胞と同様のＤＭＥＭ・ＫＳＲ培地を用いて維持した。

【0040】

２．ヒト羊膜上皮細胞由来エクソソーム及びヒト新生児皮膚線維芽細胞由来エクソソームの回収
実施例１と同様の方法で、ヒト羊膜上皮細胞及びヒト新生児皮膚線維芽細胞をそれぞれ培養し、それぞれの培養上清を回収した。

【0041】

３．ｍｉＲＮＡの網羅的解析
ヒト羊膜上皮細胞培養上清及びヒト新生児皮膚線維芽細胞培養上清は、Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）において、Ｅｘｏ−ＮＧＳ（登録商標）（Ｅｘｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ−Ｓｅｑ）サービスにより、エクソソームの抽出、全エクソソーマルＲＮＡの配列解析を行い、各細胞由来エクソソームに含まれるｍｉＲＮＡを同定した。ヒト羊膜上皮細胞由来エクソソームに由来するｍｉＲＮＡと、ヒト新生児皮膚線維芽細胞由来エクソソームに由来するｍｉＲＮＡとを比較し、ヒト羊膜上皮細胞由来エクソソームに特異的なｍｉＲＮＡを同定した。

【0042】

結果を図２及び図３に示す。ヒト羊膜上皮細胞由来エクソソームに特異的なｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ−４８３−５ｐが同定された。

【0043】

［実施例３］
１．ｍｉＲＮＡ
ｍｉＲＮＡは、合成ｍｉＲ−４８３−５ｐとネガティブコントロールとしてｍｉＲ−４８３−５ｐの塩基組成をスクランブルにしたスクランブルｍｉＲを用いた。これらの合成ｍｉＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ （ＢＣ，Ｃａｎａｄａ） から購入した。

【0044】

２．線維化抑制能の評価
実施例１と同様にヒト星細胞を培養した。この際、ｍｉＲ−４８３−５ｐ、スクランブルＲＮＡ（Ｓｃｒ；Ｇ，Ａ，Ｕ，Ｃそれぞれのヌクレオチドの比率を変えずに配列だけをランダムに変更したＲＮＡ）及びヒトＴＧＦβ―１（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＴＧＦβ１、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ）を以下のように培養液に添加した。
（１）ｍｉＲＮＡ非添加、ＴＧＦβ−非添加
（２）ｍｉＲＮＡ非添加、ＴＧＦβ−添加（終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
（３）ｍｉＲ−４８３−５ｐ添加（終濃度７５ ｐｍｏｌ ）、ＴＧＦβ−添加（終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
（４）スクランブルＲＮＡ添加（終濃度７５ ｐｍｏｌ ）、ＴＧＦβ−添加（終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）

【0045】

培養後、上記（１）〜（４）の培養液からヒト肝星細胞培養液を遠心分離により回収し、全ＲＮＡを抽出した。次いで、実施例１と同様に、定量ＲＴ−ＰＣＲにより、α−ＳＭＡのｍＲＮＡを定量した。

【0046】

結果を図４に示す。図４では、ＰＰＩＡに対するα―ＳＭＡの相対発現量を示した。ｍｉＲ−４８３−５ｐは、ＴＧＦβ−１によるＰＤＬＩＭ３の発現上昇を有意に抑制することが確認された。この結果は、ｍｉＲ−４８３−５ｐがα−ＳＭＡの発現を抑制し、線維化を抑制することを示唆している。

【産業上の利用可能性】

【0047】

本発明によれば、新規線維化抑制剤、及び線維性疾患を治療又は予防するための医薬組成物が提供される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]