特開 2021-187748 歯根膜細胞由来エクソソームを含む、ＡＲＤＳ治療用組成物、加齢性疾患治療用組成物、創傷治療用組成物、炎症性腸疾患治療用組成物、及び中枢神経疾患治療用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2021-187748(P2021-187748A)

(43)【公開日】2021年12月13日

(54)【発明の名称】歯根膜細胞由来エクソソームを含む、ＡＲＤＳ治療用組成物、加齢性疾患治療用組成物、創傷治療用組成物、炎症性腸疾患治療用組成物、及び中枢神経疾患治療用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/12 20150101AFI20211115BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20211115BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20211115BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20211115BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20211115BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20211115BHJP

   A61K 35/32 20150101ALI20211115BHJP

【ＦＩ】

   A61K35/12

   A61P11/00

   A61P17/02

   A61P29/00

   A61P1/00

   A61P25/00

   A61K35/32

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】14

(21)【出願番号】特願2020-91813(P2020-91813)

(22)【出願日】2020年5月27日

(71)【出願人】

【識別番号】520168804

【氏名又は名称】株式会社ＥｘＴｈｅｒｅａ

(74)【代理人】

【識別番号】110002860

【氏名又は名称】特許業務法人秀和特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ショクヴィスト セバスチャン

(72)【発明者】

【氏名】岩田 隆紀

(72)【発明者】

【氏名】今福 礼

【テーマコード（参考）】

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB46

4C087BB70

4C087CA10

4C087NA14

4C087ZA02

4C087ZA66

4C087ZA89

4C087ZB11

(57)【要約】

【課題】歯根膜細胞由来エクソソームの新たな用途を提供する。
【解決手段】歯根膜細胞由来エクソソームに含まれるタンパク質を同定した結果、歯根膜細胞由来エクソソームを含有するＡＲＤＳ治療用組成物、歯根膜細胞由来エクソソームを含む加齢性疾患治療用組成物、歯根膜細胞由来エクソソームを含む創傷治療用組成物、歯根膜細胞由来エクソソームを含む炎症性腸疾患治療用組成物、及び歯根膜細胞由来エクソソームを含む中枢神経疾患治療用組成物、を提供できた。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

歯根膜細胞由来エクソソームを含む、ＡＲＤＳ治療用組成物。

【請求項2】

歯根膜細胞由来エクソソームを含む、加齢性疾患治療用組成物。

【請求項3】

歯根膜細胞由来エクソソームを含む、創傷治療用組成物。

【請求項4】

歯根膜細胞由来エクソソームを含む、炎症性腸疾患治療用組成物。

【請求項5】

歯根膜細胞由来エクソソームを含む、中枢神経疾患治療用組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、歯根膜細胞由来エクソソームの新たな用途を提供するものである。より詳細には、歯根膜細胞由来エクソソームを含むＡＲＤＳ治療用組成物、歯根膜細胞由来エクソソームを含む加齢性疾患治療用組成物、歯根膜細胞由来エクソソームを含有する創傷治療用組成物、歯根膜細胞由来エクソソームを含有する炎症性腸疾患治療用組成物、及び歯根膜細胞由来エクソソームを含有する中枢神経疾患治療用組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

エクソソーム（細胞外小胞）は、細胞から分泌される膜小胞であり、細胞内のタンパク質、脂質、核酸を細胞外に運搬することにより、局所や全身における細胞間の情報伝達を担っている。

【0003】

近年、エクソソームを疾患への治療薬として使用することが提案されている。
例えば本発明者らは、口腔上皮細胞を培養する際などに培地中に分泌される細胞外小胞を含む組成物が、皮膚や粘膜等の表皮や上皮組織の創傷治癒促進に効果を有することを見出している（特許文献１参照）。
また、ヒートショックにより改良されたエクソソーム組成物を用いて、歯周組織の修復及びやけどの修復を包含する軟組織の損傷を修復することが提案されている（特許文献２参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】国際公開第２０２０／０３２１８６号

【特許文献2】特表２０１８−５２２５９３号広報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

上記のとおり、エクソソームによる疾患の治療薬の開発が進んでいる。本発明は、歯根膜細胞由来エクソソームの新たな用途を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、歯根膜細胞由来エクソソームに対し網羅的なタンパク質解析を行い、歯根膜細胞由来エクソソームが有するタンパク質を同定した。そして、歯根膜細胞由来エクソソームが有する、以下の４つのタンパク質に着目した。
ｉ）Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ−ＩＩＩ
ｉｉ）Ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ
ｉｉｉ）Ｌａｃｔａｄｈｅｒｉｎ
ｉｖ）Ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｋｉｎａｓｅ

【0007】

これらのタンパク質は既知のタンパク質である。
上記ｉ）タンパクは、抗炎症作用、抗血栓作用などを有することが知られている（例えば、Okajima K et al. Semin Thromb Hemost. 1998;24(1):27-32. The anti-inflammatory properties of antithrombin III: new therapeutic implications. Dickneite G et al. Influence of Antithrombin III on Coagulation and Inflammation in Porcine Septic Shock. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 1999;19:1566-1
572. 参照）。
上記ｉｉ）タンパクは、抗炎症作用などを有することが知られている（例えば、Shan YS et al. Argininosuccinate synthetase 1 suppression and arginine restriction inhibit cell migration in gastric cancer cell lines. Sci Rep. 2015;30;:9783. Gyeong IM et al. Endothelial Argininosuccinate Synthetase 1 Regulates Nitric Oxide Production and Monocyte Adhesion under Static and Laminar Shear Stress Conditions. Mun, J Biol Chem. 2011;286;2536-2542. Guillamat-Prats R et al. Effect of antithrombin in an in vitro model of acute respiratory distress syndrome. European Respiratory Journal. 2016;48参照）。
上記ｉｉｉ）タンパクは、血管新生作用、創傷治癒作用などを有することが知られている（例えば、Uchiyama A et al. MFG-E8 Regulates Angiogenesis in Cutaneous Wound Healing. Am J Pathol. 2014;184:1981-1990. Uchiyama A et al. Mesenchymal stem cells-derived MFG-E8 accelerates diabetic cutaneous wound healing. J Dermatol Sci. 2017;86:187-197. 参照）。
上記ｉｖ）タンパクは、幹細胞増殖作用などを有することが知られている（例えば、Yamabi et al. Overexpression of integrin-linked kinase induces cardiac stem cell expansion, The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 2006;132:1272-1279. Mao et al, ILK promotes survival and self-renewal of hypoxic MSCs via the activation of lncTCF7-Wnt pathway induced by IL-6/STAT3 signaling Citation metadata. Gene Ther. 2019:26:165-176. 参照）。
これらの事実より本発明者は、歯根膜細胞由来エクソソームが、上記タンパク質の作用により改善し得る疾患の治療薬として有効であることを見出し、その薬効を確認して、本発明を完成させた。

【0008】

本発明の一形態は、歯根膜細胞由来エクソソームを含む、ＡＲＤＳ治療用組成物であり得る。
また、本発明の別の形態は、歯根膜細胞由来エクソソームを含む、加齢性疾患治療用組成物であり得る。
また、本発明の別の形態は、歯根膜細胞由来エクソソームを含む、創傷治療用組成物であり得る。
また、本発明の別の形態は、歯根膜細胞由来エクソソームを含む、炎症性腸疾患治療用組成物であり得る。
また、本発明の別の形態は、歯根膜細胞由来エクソソームを含む、中枢神経疾患治療用組成物であり得る。

【0009】

また、本発明の別の形態は、疾患患者の投与を必要とする箇所に、歯根膜細胞由来エクソソームを投与するステップを含む、ＡＲＤＳの治療方法、加齢性疾患の治療方法, 創傷治療方法、炎症性腸疾患の治療方法、及び中枢神経疾患の治療方法であり得る。

【0010】

また、本発明の別の形態は、歯根膜細胞由来エクソソーム中の以下のいずれかのタンパク質を濃縮するステップ、を含む、ＡＲＤＳ治療用組成物の製造方法、加齢性疾患治療用組成物の製造方法、創傷治療用組成物の製造方法、炎症性腸疾患治療用組成物の製造方法、及び中枢神経疾患治療用組成物の製造方法であり得る。
ｉ）Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ−ＩＩＩ
ｉｉ）Ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ
ｉｉｉ）Ｌａｃｔａｄｈｅｒｉｎ
ｉｖ）Ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｋｉｎａｓｅ
上記濃縮するステップは、上記タンパク質をソーティングすることで行うことが好ましい。

【0011】

また、本発明の別の形態は、歯根膜細胞由来エクソソーム中の、以下のいずれかのタンパク質をソーティングするステップを含む、タンパク質の精製方法であり得る。
ｉ）Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ−ＩＩＩ
ｉｉ）Ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ
ｉｉｉ）Ｌａｃｔａｄｈｅｒｉｎ
ｉｖ）Ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｋｉｎａｓｅ
上記ソーティングするステップは、ソーティングするタンパク質の抗体を用いて行うことが好ましい。

【発明の効果】

【0012】

本発明により、歯根膜細胞由来エクソソームの新たな用途、即ち歯根膜細胞由来エクソソームを含む、ＡＲＤＳ治療用組成物、加齢性疾患治療用組成物、創傷治療用組成物、炎症性腸疾患治療用組成物、及び中枢神経疾患治療用組成物を提供できる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】実験で培養した歯根膜細胞由来エクソソームの形態を示す顕微鏡画像である（図面代用写真）。

【図2】実験で行った、プロテオーム解析の結果を示す図である。

【図3】実験で行った、エクソソームを投与したラットの体重増加を示すグラフである。

【図4】実験で行った、ＰＢＳ及びエクソソーム局所投与後の創傷治癒を示す偏光顕微鏡である（図面代用写真）。

【図5】実験で行った、ＰＢＳ及びエクソソーム局所投与後の創傷治癒を示すヘマトキシリンエオジン染色写真である（図面代用写真）。

【発明を実施するための形態】

【0014】

以下、本発明について詳細に説明するが、以下に記載する構成要件の説明は、本発明の実施形態の一例（代表例）であり、本発明はこれらの内容に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。

【0015】

本発明の一形態は、歯根膜細胞由来エクソソームを含む、ＡＲＤＳ治療用組成物であり得る。また、本発明の別の形態は、歯根膜細胞由来エクソソームを含む、加齢性疾患治療用組成物であり得る。また、本発明の別の形態は、歯根膜細胞由来エクソソームを含む、創傷治療用組成物であり得る。また、本発明の別の形態は、歯根膜細胞由来エクソソームを含む、炎症性腸疾患治療用組成物であり得る。また、本発明の別の形態は、歯根膜細胞由来エクソソームを含む、中枢神経疾患治療用組成物であり得る。
歯根膜は歯根と歯槽骨との間に存在する組織で、歯周靭帯とも呼ばれる。歯根膜を構成する細胞は、主に線維芽細胞であるが、間葉系幹細胞も含まれる。またこれに限られるものではなく、骨芽細胞、破骨細胞、セメント芽細胞、マクロファージなどが含まれ得る。その採取方法は特に限定されず、既知の方法を適用できる。また、研究用に市販されている歯根膜細胞を用いてもよい。
細胞の由来は特に限定されないが、哺乳類由来の細胞であることが好ましく、治療の安全性からはヒトの歯根膜細胞であることが好ましい。
歯根膜細胞からのエクソソームの単離は、既知の方法で行うことができる。

【0016】

ＡＲＤＳは、急性呼吸促拍症候群の略であり、急性肺疾患の一種である。歯根膜細胞由来のエクソソームに含まれるＡｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ−ＩＩＩ、 Ａｒｇｉｎｉｎｏｓ
ｕｃｃｉｎａｔｅは、抗炎症作用を有しており、特に呼吸器に生じる炎症を抑制する作用を有することから、歯根膜細胞由来のエクソソームを投与することで、ＡＲＤＳの症状が改善され得る。
加齢性疾患は、フレイル、動脈硬化、心血管病変、骨粗しょう症等を含み、軟組織の損傷は含まない。歯根膜細胞由来のエクソソームに含まれるＡｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ−ＩＩＩ、 Ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｋｉ
ｎａｓｅは、抗炎症作用、抗血栓作用、幹細胞増殖作用を有しており、加齢による慢性的な炎症や血栓を改善する作用および内因性幹細胞枯渇状態を改善する作用を有することから、歯根膜細胞由来のエクソソームを投与することで、加齢性疾患の症状が改善され得る。

【0017】

創傷治癒に関しては、歯根膜細胞由来のエクソソームに含まれるＬａｃｔａｄｈｅｒｉｎ、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｋｉｎａｓｅは血管新生作用、創傷治癒作用、幹細胞増殖作用を有しており、創傷治癒効果を有する。
炎症性腸疾患に関しては、歯根膜細胞由来のエクソソームに含まれるＡｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ−ＩＩＩ、 Ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅは、抗炎症作用を有しており
、歯根膜細胞由来のエクソソームを投与することで、炎症性腸疾患の症状が改善され得る。
中枢神経疾患に関しては、歯根膜細胞由来のエクソソームに含まれるＡｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ−ＩＩＩ、 Ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅは、抗炎症作用を有しており
、歯根膜細胞由来のエクソソームを投与することで、中枢神経疾患の症状が改善され得る。

【0018】

本実施形態の治療用組成物は、有効成分として治療上有効量の歯根膜細胞由来のエクソソームが含まれていれば、治療用組成物として生理学的に許容される他の成分を含んでいてもよい。例えば、治療用組成物中に、歯根膜細胞由来のエクソソームを０．１質量％以上含んでいてもよく、１質量％以上含んでいてもよく、５質量％以上含んでいてもよく、１０質量％以上含んでいてもよく、２５質量％以上含んでいてもよく、５０質量％以上含んでいてもよく、７５質量％以上含んでいてもよく、９０質量％以上含んでいてもよい。
また、本実施形態は、歯根膜細胞由来のエクソソーム１００％、即ち歯根膜細胞由来のエクソソームからなるＡＲＤＳ治療用医薬、加齢性疾患用医薬、創傷治療用医薬、炎症性腸疾患治療用医薬、又は中枢神経疾患治療用医薬であってもよい。
他の成分としては、生理食塩水、細胞保存液、細胞培養液、ハイドロゲル、細胞外マトリクス、凍結保存液当が挙げられる。

【0019】

治療用組成物又は治療用医薬の投与方法は特に限定されず、経皮投与、経口投与、注射などの直接投与があげられる。直接投与の場合には、疾患を有する生体組織へ、及び／又はその近傍へ、治療用組成物又は医薬を注射してもよい。経皮投与の場合には、液剤、クリーム剤、軟膏、貼付剤など、既知の経皮投与剤型とすることができる。経口投与の場合には、粉末、錠剤、液剤など既知の経口投与剤型とすることができる。

【0020】

歯根膜細胞由来のエクソソームは、上記ｉ）〜ｉｖ）のタンパク質の抗体を用いて、エクソソーム中の上記ｉ）〜ｉｖ）のタンパク質をソーティングすることで、当該タンパク質を濃縮するステップを経由して、治療用組成物を製造してもよい。このように治療用組成物の上記タンパク質濃度を上げることで、治療効果の向上が期待され得る。
また、エクソソーム中の上記ｉ）〜ｉｖ）のタンパク質をソーティングすることで、当該タンパク質精製することもできる。精製には、上記ｉ）〜ｉｖ）のタンパク質の抗体を用いることができる。

【実施例】

【0021】

以下、本発明に到達したことを示す実験を説明する。
＜歯根膜細胞培養と、エクソソームの単離＞
５代継代のヒト由来凍結歯根膜細胞を解凍し、完全培地を備えた１５０ｍｍの細胞培養
皿に播種した。培地は、１０％ＦＢＳ（日本バイオセラム社製）と１％の抗生物質（ペニシリン−ストレプトマイシン、和光純薬製）を含むａｌｐｈａ−ＭＥＭ培地を用いた。翌日、細胞はリン酸バッファ生理食塩水（ＰＢＳ、和光純薬製）で洗浄し、フレッシュな培地を添加した。細胞は一代継代し、ＰＢＳで洗浄し、２４時間血清無培地（１％の抗生物質を含むａｌｐｈａ−ＭＥＭ）で２４時間インキュベーションした後、１２日〜１３日増殖させた。その培地を収集し、トリパンブルー色素排除試験（サーモフィッシャーサイエンティフィック）により細胞の数と活性を測定した。培地は４℃で１０分間、３００ｘｇで遠心分離し、得られた上清を新たなチューブに移し、４℃で１０分間、３０００ｘｇで遠心分離して上清を収集した。得られた上清を１００ｋＤａの限外ろ過フィルタ（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１４、メルクミリポール製）を用いて、約３００ｍＬから２．５ｍＬ以下の体積まで濃縮し、更に１０ｋＤａの限外ろ過フィルタ（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４、メルクミリポール製）を用いて５００μＬ以下に濃縮した。濃縮物は、サイズ排除クロマトグラフィを用いて、エクソソームを含まない蛋白質からエクソソームを分離し、エクソソームサンプルを得た。

【0022】

＜プロテオーム解析＞
エクソソームサンプルは２％ＳＤＳ溶解バッファに溶解し、ＳＰ３プロテインクリーンアップとダイジェスチョンプロトコルの改良版を用いて、タンパク質量分析の準備をした。５〜１０μｇのタンパク質に対し、それぞれ４ｍＭのクロロアセトアミドでアルキレートした。Ｓｅｒａ−Ｍａｇ ＳＰ３ビーズミックス（２０μＬ）を１００％アセトニトリルと共にタンパク質サンプルに移し、終濃度を７０％とした。この混合物を室温下１８分間撹拌しながらインキュベートした。この混合物を磁気ラック上に配置して上清を捨て、次いで７０％エタノール溶液で２回洗浄し、１００％アセトニトリルで１回洗浄した。ビーズ−タンパク質混合物は、１００μＬのＬｙｓＣバッファ（０．５Ｍ尿酸、５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、ＬｙｓＣとタンパク質の割合１：５０）に再溶解し、一晩インキュベートした。最終的にトリプシンを加えて一晩インキュベートし、その後ＳＣＸによりクリーンアップした。最終的なペプチド濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＤＣ Ａｓｓａｙにより決定した。
得られたサンプル約１０μｇをＬＣモバイルフェーズＡに懸濁し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムに注入した。

【0023】

＜ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ＞
Ｄｉｏｎｅｘ ＵｌｔｉＭａｔｅ（登録商標）３０００ＲＳＬＣ ｎａｎｏ ＳｙｓｔｅｍとＱ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量計（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いてＱ−ＥｘａｃｔｉｖｅオンラインＬＣ−ＭＳを実施した。それぞれのサンプルを５μＬ注入した。サンプルはＣ１８ガード脱塩カラムでトラップし、５０ｃｍ長のＣ１８カラムで分離した。ナノキャピラリー溶媒Ａは、９５％の水、５％のＤＭＳＯ、０．１％のギ酸であり、溶媒Ｂは５％の水、５％のＤＭＳＯ、９５％のアセトニトリル、０．１％のギ酸であった。０．２５μＬ／ｍｉｎの定量流量で、１８０分間かけて溶媒Ｂの量を６％〜４３％に上昇させ、その後５分間で溶媒Ｂが１００％となるように、溶媒Ｂの量を増加させた。
６０，０００解像度（質量レンジが３００〜１５００ｍ／ｚ）のＦＴＭＳマスタースキャンは、トップ５イオンでのデータ従属ＭＳ／ＭＳ（３０，０００解像度）に従い、３０％の規格化衝突エネルギーで、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）を行った。前駆体は、２ｍ／ｚウインドウで単離した。自動ゲインコントロール（ＡＧＣ）ターゲットはＭＳ１で１×１０^６、ＭＳ２で１×１０^５とした。全体のデューティサイクルは、２．５ｓまで続けた。ダイナミックエクスクルージョンは６０ｓデュレーションとした。未配当チャージステートと、チャージステート１は除いた。アンダーフィル率１％を用いた。

【0024】

＜ペプチド及びタンパク質の同定＞
Ｓｅｑｕｅｓｔ−ＰｅｒｃｏｌａｔｏｒまたはＴａｒｇｅｔ Ｄｅｃｏｙ ＰＳＭ Ｖａｌｉｄａｔｏｒを用いて、プロテオームディスカバ１．４（サーモフィッシャーサイエンティッフィク）ソフトウエアプラットフォームで、ホモサピエンスユニプロットデータベースに対して、上記ＭＳの生データファイルを解析した。１％のＦＤＲカットオフでフィルタをかけた。１０ｐｐｍの前駆体イオン質量許容、ＨＣＤ−ＦＴＭＳでは０．０２Ｄａ、ＣＩＤ−ＩＴＭＳでは０．８Ｄａのプロダクトイオン質量許容、を用いた。アルゴリズムは、最大２つの欠落した切断を有するトリプシンペプチドと考えられた。固定された修飾としてカルバミドメチル化（Ｃ）、変位し得る修飾として酸化（Ｍ）であった。
ＶＥＮＮダイアグラムは、エンリッチメント解析（ＦＵＮＲＩＣＨ）を用いて生成された。ネットワークと遺伝子オントロジータームエンリッチメント分析はオープンソースＳＴＲＩＮＧデータベースを用いて行った。一般的なタンパク質のコンタミネーションリストは、アフィニティー精製−質量分析オープンソースコンタミリポジトリ−から得、５回以上の平均スペクトルカウントを有するタンパク質は、コンタミネーションと考えた。

【0025】

＜結果＞
＜エクソソーム分離＞
歯根膜細胞は播種後、再現性良く増殖し、線維芽細胞様の形態を呈した。形態を図１に示す。継代中や血清無培地への曝露後の形態の変化は観察されず、培地回収時の細胞活性は９８〜１００％であった。サイズ排除クロマトグラフィを用いてエクソソームを含まないタンパク質からエクソソームを分離した。

【0026】

＜エクソソームのプロテオミックアナリシス＞
質量分析を用いて、２７０種、３４１種、４４５種のタンパク質を、３つに分離されたエクソソームバッチから同定した。そして１７３種類は、全てのサンプルから同定された。これらの１７３種類のタンパク質のうち５０は既にコンタミタンパクとして同定されていたため、これらのタンパク質は除外した。残りの１２３種類のタンパク質の一覧を以下の表１に示す。また、包括的なプロテオミックアナリシスの結果を図２に示す。

【0027】

【表1-1】

【0028】

【表1-2】

【0029】

【表1-3】

【0030】

これら同定されたタンパク質のうち、Ｎｏ．３０、４６、５４、１０１タンパク質に着目した。これらのタンパク質は、上記説明したとおり既知のタンパク質であり、その作用が報告されている。これらの事実から、歯根膜細胞エクソソームには、ＡＲＤＳ治療、加齢性疾患治療、創傷治療、炎症性腸疾患治療、及び中枢神経疾患治療に効果があると、合理的に推測された。

【0031】

＜創傷治癒効果の確認＞
８匹の雄スプラーグドーリーラットを用いて全層創傷ラットを作成した。ラットは、イソフルラン吸入および、メデトミジンとミダゾラムと酒石酸ブトルファノールを皮下注射することで麻酔した。電気バリカンで背毛を剃り、毛は脱毛クリームで除去した。洗浄後、５ｍｍの生検パンチを使用して、２つの平行する全層創傷を作成した。それぞれのラットの、１つの創傷は局所塗布により治療し、他の創傷は２か所の創傷部への注射により治療した。
局所塗布において、歯根膜由来エクソソームを創傷に塗布後４５分間静置し、その上からデガダーム創傷被覆材を貼った。
ラットのうち半分はコントロールとしてＰＢＳを、他の半分は歯根膜由来エクソソームを、１つの創傷に対し０．７５μｇ投与した。

【0032】

ラットの体重は０日、２日目、４日目、６日目、７日目で計測した。顕微鏡写真を０日、２日目、４日目、７日目で撮影した。ラットは７日目に犠牲死し、創傷は８ｍｍの生検パンチを用いて切除し、半分に切断しＯＣＴコンパウンド中に凍結した。そして、８μｍの凍結切片をクライオスタットで作製した。
切片はヘマトキシリンーエオシン（Ｈ＆Ｅ）とピクロシリウスレッドとを用いて染色した。Ｈ＆Ｅスライドは光学顕微鏡で可視化され、一方ピクロシリウスレッドスライドは偏光顕微鏡で可視化された。創傷の幅はイメージＪ（ナショナル インスティテュート オブ ヘルス、米国）を用いて、１つの画像ごとに３つの線、即ち真皮の上部、中間及び下部を測定することで、計測した。
エクソソームで治療したラットは、ＰＢＳを投与したコントロール群と比べて４日目から研究終了までの間、有意に体重が増加した（図３参照）。

【0033】

断面組織学的評価においては、創傷の幅が減少し、コラーゲン沈着が増加したことから、エクソソームを局所投与したグループの創傷治癒がより進んだことが明らかになった（図４参照）。
また、創傷領域はエクソソームを投与した領域が明らかに小さくなった（図５参照）。

【0034】

＜その他の治療効果の確認＞
歯根膜細胞由来エクソソームの治療効果を確認するため、以下の試験を行う。
（１）歯根膜細胞由来エクソソームの、抗炎症作用／免疫調整作用を、混合リンパ球反応アッセイにより確認する。
（２）歯根膜細胞由来エクソソームの、抗凝固作用を、エカリン凝固時間アッセイにより確認する。
（３）歯根膜細胞由来エクソソームの、創傷治癒特性を、スクラッチアッセイにより確認する。
（４）歯根膜細胞由来エクソソームが、幹細胞の増殖を刺激することを確認する。
具体的には、以下の４つのタンパク質をノックアウトした歯根膜細胞由来のエクソソーム及び／又は中和抗体を用いて、確認を行う。
ｉ）Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ−ＩＩＩ
ｉｉ）Ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ
ｉｉｉ）Ｌａｃｔａｄｈｅｒｉｎ
ｉｖ）Ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｋｉｎａｓｅ
なお、上記（１）の試験については、ｉ）Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ−ＩＩＩとｉｉ）Ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅを対象とし、上記（２）の試験はｉ）Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ−ＩＩＩを対象とし、上記（３）の試験はｉｉｉ）Ｌａｃｔａｄｈｅｒｉｎを対象とし、上記（４）の試験は、ｉｉｉｉ）Ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｋｉｎａｓｅを対象として行う。
上記４つのタンパク質は、その作用が報告されており、歯根膜細胞由来エクソソームの薬効は、合理的に期待される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】