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特開2021-38265ＰＡＨを治療するための抗増殖剤

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2021-38265(P2021-38265A)

(43)【公開日】2021年3月11日

(54)【発明の名称】ＰＡＨを治療するための抗増殖剤

(51)【国際特許分類】

A61K 31/519 20060101AFI20210212BHJP

A61P 9/12 20060101ALI20210212BHJP

A61K 45/00 20060101ALI20210212BHJP

A61P 43/00 20060101ALI20210212BHJP

A61K 31/506 20060101ALI20210212BHJP

A61P 11/00 20060101ALI20210212BHJP

【ＦＩ】

A61K31/519

A61P9/12

A61K45/00

A61P43/00 121

A61K31/506

A61P43/00 111

A61P11/00

【審査請求】有

【請求項の数】8

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】27

(21)【出願番号】特願2020-199659(P2020-199659)

(22)【出願日】2020年12月1日

(62)【分割の表示】特願2017-201576(P2017-201576)の分割

【原出願日】2017年10月18日

(31)【優先権主張番号】62/410,566

(32)【優先日】2016年10月20日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/548,629

(32)【優先日】2017年8月22日

(33)【優先権主張国】US

(71)【出願人】

【識別番号】593141953

【氏名又は名称】ファイザー・インク

(74)【代理人】

【識別番号】100133927

【弁理士】

【氏名又は名称】四本能尚

(74)【代理人】

【識別番号】100137040

【弁理士】

【氏名又は名称】宮澤純子

(74)【代理人】

【識別番号】100147186

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤眞紀

(74)【代理人】

【識別番号】100174447

【弁理士】

【氏名又は名称】龍田美幸

(74)【代理人】

【識別番号】100185960

【弁理士】

【氏名又は名称】池田理愛

(72)【発明者】

【氏名】スティーブンマーティンエヴァンス

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084AA19

4C084NA14

4C084ZA42

4C084ZA59

4C084ZC20

4C084ZC75

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC42

4C086CB05

4C086CB06

4C086GA07

4C086GA08

4C086GA12

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA42

4C086ZA59

4C086ZC20

4C086ZC75

(57)【要約】

【課題】より良好なＰＡＨ治療方法を提供すること。
【解決手段】肺高血圧、および肺動脈性肺高血圧のような関連疾患は、有効用量のパルボシクリブ、６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−｛［５−（ピペラジン−１−イル）ピリジン−２イル］アミノ｝ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オンを含むＣＤＫ阻害剤、またはその薬学的に許容できる塩を投与することによって治療され得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＰＡＨを治療するために用いられる、有効量の６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−｛［５−（ピペラジン−１−イル）ピリジン−２イル］アミノ｝ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン、またはその薬学的に許容できる塩を含む医薬組成物。

【請求項2】

６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−｛［５−（ピペラジン−１−イル）ピリジン−２イル］アミノ｝ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン、またはその薬学的に許容できる塩が、単回でまたは２４時間内での複数回投与で、１日当たり約０．６から約５００ｍｇの投与量で投与される、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−｛［５−（ピペラジン−１−イル）ピリジン−２イル］アミノ｝ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン、またはその薬学的に許容できる塩が、単回でまたは２４時間内での複数回投与で、１日当たり約２５ｍｇから１２５ｍｇの投与量で投与される、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項4】

１つまたは複数の他の活性物質と組み合わせて用いられる、請求項１から３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項5】

６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−｛［５−（ピペラジン−１−イル）ピリジン−２イル］アミノ｝ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オンを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項6】

他の活性物質がシルデナフィルである、請求項４に記載の医薬組成物。

【請求項7】

有効量のＣＤＫ阻害剤を含む、ＰＡＨを治療するために用いられる医薬組成物であって、前記ＣＤＫ阻害剤が、リボシクリブ、アベマシクリブもしくはジナシクリブ、またはそれらの薬学的に許容できる塩である、医薬組成物。

【請求項8】

有効量のＣＤＫ阻害剤を含む、ＰＡＨを治療するために用いられる医薬組成物であって、前記ＣＤＫ阻害剤が、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６の阻害剤である、医薬組成物。

【請求項9】

他の活性物質が、プロスタグランジン、エンドセリン受容体アンタゴニスト、グアニル酸シクラーゼ阻害剤、血管拡張物質、カルシウムチャネル遮断物質、抗凝固剤、および利尿剤である、請求項４に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

肺高血圧、および肺動脈性肺高血圧のような関連疾患は、有効用量の、パルボシクリブ、６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−｛［５−（ピペラジン−１−イル）ピリジン−２イル］アミノ｝ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オンを含むＣＤＫ阻害剤を投与することによって治療され得る。

【背景技術】

【0002】

肺高血圧（ＰＨ）は、原発性（特発性）または続発性とこれまでに分類されている。最近、世界保健機関（ＷＨＯ）は、肺高血圧を５つの群、すなわち、第１群：肺動脈性肺高血圧（ＰＡＨ）、第２群：左心疾患に伴うＰＨ、第３群：肺疾患および／または低酸素血症に伴うＰＨ、第４群：慢性的な血栓性および／または塞栓性疾患に起因するＰＨ、ならびに第５群：種々雑多な症状（例えば、サルコイドーシス、組織球症Ｘ、リンパ管腫症、および肺血管の圧迫）に分類した。

【0003】

肺動脈性肺高血圧（ＰＡＨ）は、深刻な血管収縮および肺動脈壁における平滑筋細胞の異常な増殖を特徴とする、重篤で、複雑な、進行性の、命に関わる肺血管系の疾患である。肺の血管が重度に狭窄すると、肺動脈圧が非常に高くなる。これらの高い圧力によって、心臓が、酸素供給されるべき血液を肺に送り込むことが困難になる。ＰＡＨ患者は、心臓がこれらの高血圧に対抗して懸命に送り込もうとするため、極度の息切れをする。ＰＡＨ患者は、典型的には、肺血管抵抗（ＰＶＲ）の著しい増大および肺動脈圧（ＰＡＰ）の持続的な上昇を発症し、これは最終的には右心不全および死亡をもたらす。ＰＡＨと診断された患者は、不良な予後およびそれと同時にクオリティー・オブ・ライフを損ない、治療しない場合は診断時から２から５年の平均余命である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】国際公開第ＷＯ２００３／０６２２３６号

【特許文献2】米国特許第６，９３６，６１２号

【特許文献3】米国特許第７，２０８，４８９号

【特許文献4】米国特許第７，４５６，１６８号

【特許文献5】国際公開第ＷＯ２００５／００５４２６号

【特許文献6】米国特許第７，３４５，１７１号

【特許文献7】米国特許第７，８６３，２７８号

【特許文献8】国際公開第ＷＯ２００８／０３２１５７号

【特許文献9】米国特許第７，７８１，５８３号

【特許文献10】国際公開第ＷＯ２０１４／１２８５８８号

【特許文献11】国際出願第ＰＣＴ／ＩＢ２０１６／０５３０４０号

【特許文献12】ＷＯ０７１４０２２２

【特許文献13】ＷＯ１００７５０７４

【特許文献14】ＷＯ１００２０６７５

【特許文献15】ＷＯ１６０１５５９８

【特許文献16】ＷＯ１６０１５５９７

【特許文献17】ＷＯ１６０１５６０５

【特許文献18】ＷＯ１６０１５６０４

【特許文献19】ＷＯ２０１２／０６６５０８

【特許文献20】ＷＯ０４００４６３２

【特許文献21】ＷＯ１１０２６９１１

【特許文献22】ＷＯ１１０２６９０４

【特許文献23】ＷＯ２０１１／１０１４０９

【特許文献24】ＷＯ２００６／０７４９８５

【特許文献25】ＷＯ２０１２／０６１１５６

【特許文献26】ＷＯ１０００９１３

【特許文献27】ＷＯ１０００９１５５

【特許文献28】ＷＯ０１８３４６９

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】ＷＨＯＤｒｕｇＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Vol．２７、Ｎｏ．２、第１７２頁（２０１３）

【非特許文献2】Ｇａｌｉｅら、ＥＲＪ（２００９）１２月、３４（６）、１２１９〜６３

【非特許文献3】Ｓｃｈｅｒｍｕｌｙ，Ｒ．Ｔ．ら、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｄｉｓｅａｓｅ：ｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｉａｌｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅｒｅｖｉｅｗｓ．Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ８、４４３〜４５５（２０１１）

【非特許文献4】Ｈｕｍｂｅｒｔ，Ｍ．＆Ｇｈｏｆｒａｎｉ，Ｈ．Ａ．Ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｔａｒｇｅｔｓｏｆａｐｐｒｏｖｅｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｆｏｒｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｉａｌｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．Ｔｈｏｒａｘ７１、７３〜８３（２０１６）

【非特許文献5】Ｇｕｉｇｎａｂｅｒｔ，Ｃら、Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｉａｌｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ：ｌｅｓｓｏｎｓｆｒｏｍｃａｎｃｅｒ．Ｅｕｒｏｐｅａｎｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｒｅｖｉｅｗ：ａｎｏｆｆｉｃｉａｌｊｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＥｕｒｏｐｅａｎＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＳｏｃｉｅｔｙ２２、５４３〜５５１（２０１３）

【非特許文献6】Ｐｕｌｌａｍｓｅｔｔｉ，ＳＳら、Ａｍｅｒｉｃａｎｊｏｕｒｎａｌｏｆｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙａｎｄｃｒｉｔｉｃａｌｃａｒｅｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０１６）（ＤＯＩ：１０．１１６４／ｒｃｃｍ．２０１６０６−１２２６ＰＰ）

【非特許文献7】Ｈｅｐｐｅ，Ｃ．Ｍ．ら、ＶａｓｃｕｌａｒＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ８３（２０１６）１７〜２５

【非特許文献8】Ｓａｖａｉ，Ｒ．ら、Ｐｒｏ−ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅａｎｄｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｓｉｇｎａｌｉｎｇｃｏｎｖｅｒｇｅｏｎＦｏｘＯ１ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｉｎｐｕｌｍｏｎａｒｙｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅｍｅｄｉｃｉｎｅ２０、１２８９〜１３００（２０１４）

【非特許文献9】Ｃｉｕｃｌａｎ，Ｌ．ら、Ｉｍａｔｉｎｉｂａｔｔｅｎｕａｔｅｓｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｉａｌｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎｐａｔｈｏｌｏｇｙｖｉａｒｅｄｕｃｔｉｏｎｉｎ５−ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔａｍｉｎｅｔｈｒｏｕｇｈｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ａｍｅｒｉｃａｎｊｏｕｒｎａｌｏｆｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙａｎｄｃｒｉｔｉｃａｌｃａｒｅｍｅｄｉｃｉｎｅ１８７、７８〜８９（２０１３）

【非特許文献10】Ｓｃｈｅｒｍｕｌｙ，Ｒ．Ｔ．ら、ＲｅｖｅｒｓａｌｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｐｕｌｍｏｎａｒｙｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎｂｙＰＤＧＦｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆｃｌｉｎｉｃａｌｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ１１５、２８１１〜２８２１（２００５）

【非特許文献11】ＪｏｈｎｓｏｎＤＧ，ＷａｌｋｅｒＣＬ．ＣｙｃｌｉｎｓａｎｄＣｅｌｌＣｙｃｌｅ Cｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．（１９９９）３９：２９５３１２

【非特許文献12】ＭｏｒｇａｎＤＯ．Ｃｙｃｌｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅｓ：ｅｎｇｉｎｅｓ，ｃｌｏｃｋｓ，ａｎｄｍｉｃｒｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．（１９９７）１３：２６１２９１

【非特許文献13】Ｃｈａｒｒｏｎ，Ｔ．ら、Ｔｈｅｃｅｌｌｃｙｃｌｅ：ａｃｒｉｔｉｃａｌｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｔａｒｇｅｔｔｏｐｒｅｖｅｎｔｖａｓｃｕｌａｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｄｉｓｅａｓｅ．ＴｈｅＣａｎａｄｉａｎｊｏｕｒｎａｌｏｆｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ２２ＳｕｐｐｌＢ、４１Ｂ〜５５Ｂ（２００６）

【非特許文献14】Ｓｔｅｎｍａｒｋ，Ｋ．Ｒ．ら、Ａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｓｏｆｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｉａｌｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ：ｔｈｅｈｏｐｅｆｏｒｅｔｉｏｌｏｇｉｃａｌｄｉｓｃｏｖｅｒｙａｎｄｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｃｕｒｅ．Ａｍｅｒｉｃａｎｊｏｕｒｎａｌｏｆｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｌｕｎｇｃｅｌｌｕｌａｒａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ２９７、Ｌ１０１３〜１０３２（２００９）

【非特許文献15】Ｌａｎｇ，Ｍ．ら、ＴｈｅｓｏｌｕｂｌｅｇｕａｎｙｌａｔｅｃｙｃｌａｓｅｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｒｉｏｃｉｇｕａｔａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓｐｕｌｍｏｎａｒｙｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎｉｎｄｕｃｅｄｂｙｈｙｐｏｘｉａａｎｄＳＵ５４１６ｉｎｒａｔｓ．ＰｌｏＳｏｎｅ７、ｅ４３４３３（２０１２）

【非特許文献16】Ｓｔｒｉｎｇｅｒら、（１９８１）Ｃａｔｈｅｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｙｉｎｔｈｅｃｌｏｓｅｄ−ｃｈｅｓｔｒａｔ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５１、１０４７〜１０５０

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

現在のＰＡＨ治療方法は、症候を低減させること、および患者の寿命を延ばすこと、およびクオリティー・オブ・ライフを高めることに焦点を当てている。このような治療方法には、プロスタサイクリン、エポプロステノール、およびシルデナフィルなどの血管拡張剤、ボセンタンなどのエンドセリン受容体アンタゴニスト、アムロジピン、ジルチアゼム、およびニフェジピンなどのカルシウムチャネルブロッカー、ワルファリンなどの抗凝固剤、酸素補充療法、ならびに利尿剤を投与することが含まれる。医療が失敗すると、最終治療オプションは肺および／または心臓−肺移植である。しかし、これらの方法の各々は、有効性の欠如、重篤な副作用、低い患者コンプライアンス、およびＰＡＨの予防が不可能であることなどの１つまたは複数の欠点を有する。したがって、より良好なＰＡＨ治療方法が必要である。本発明は、これらの必要性に対処する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、治療上有効用量のパルボシクリブを含むＣＤＫ阻害剤を投与することによって、ＰＡＨならびに他の関連する疾患および症状を治療する方法を提供する。

【0008】

ＰＡＨへの進行に関与する２つの鍵となる細胞型は、肺動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ）および肺動脈外膜線維芽細胞（ＰＡＡＦ）である。本発明は、一部では、パルボシクリブがヒトおよびラットのＰＡＳＭＣおよびヒトＰＡＡＦにおいて抗増殖効果に著しく作用したという発見に基づく。パルボシクリブはまた、ＰＡＨモデルの血行力学、肺血管細胞増殖、肺動脈形態学、および右心室肥大における変化に著しく作用した。

【0009】

パルボシクリブは、以下の構造を有する、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６の強力かつ選択的な阻害剤である。

【0010】

【化1】

【0011】

パルボシクリブは、ＷＨＯＤｒｕｇＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Vol．２７、Ｎｏ．２、第１７２頁（２０１３）において記載されている。パルボシクリブならびにその薬学的に許容できる塩および製剤は、国際公開第ＷＯ２００３／０６２２３６号ならびに米国特許第６，９３６，６１２号、米国特許第７，２０８，４８９号および米国特許第７，４５６，１６８号；国際公開第ＷＯ２００５／００５４２６号ならびに米国特許第７，３４５，１７１号および米国特許第７，８６３，２７８号；国際公開第ＷＯ２００８／０３２１５７号および米国特許第７，７８１，５８３号；国際公開第ＷＯ２０１４／１２８５８８号；ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＩＢ２０１６／０５３０４０号において開示されている。前述の各参考文献の内容は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。

【0012】

パルボシクリブは、閉経後の女性における最初の内分泌療法であるレトロゾールと組み合わせて、または内分泌療法で疾患が進行した後のフルベストラントと組み合わせて、ホルモン受容体（ＨＲ）陽性でヒト上皮成長因子２（ＨＥＲ２）陰性の進行したまたは転移性の乳癌の治療において、米国で認可されている。

【0013】

本発明の別の実施形態では、パルボシクリブは、限定されるものではないが、特発性ＰＡＨ、遺伝性または家族性ＰＡＨ、および続発性肺高血圧（例えば、肺塞栓症、気腫、肺線維症、および先天性心疾患の結果生じる高血圧）を含む肺高血圧またはＰＡＨと診断されたかまたはそれを発症するリスクのある対象に投与される。一実施形態では、対象は特発性ＰＡＨまたは遺伝性ＰＡＨと診断されている。一部の実施形態では、ＰＡＨを発症するリスクのある対象は、骨形成タンパク質２型受容体をコードする遺伝子に突然変異を有する。

【0014】

本発明はまた、肺動脈性肺高血圧を治療または予防するためのキットを含む。一実施形態では、キットはパルボシクリブおよび投与装置を含む。投与装置は、吸入器、ネブライザー、注入器、点滴、およびエアロゾライザーなどのように、肺送達のために設計され得る。他の実施形態では、投与装置は、カテーテルなどのように、静脈内または動脈内送達のために設計され得る。パルボシクリブは、投与装置内で保存されるように製剤されてもよい。キットはさらに、ＰＡＨまたは本明細書において論じられる他の疾患を治療または予防するためにパルボシクリブを対象（例えばヒト）に投与するための使用説明書を含み得る。一実施形態では、使用説明書は、例えば、２８日サイクルの間にパルボシクリブの投与日数を特定することによって、投与態様を詳述し、適切化する。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】細胞増殖：ＢｒｄＵ組み込みアッセイを行って、連続希釈したパルボシクリブで細胞を処理した後の細胞のＤＮＡ合成速度および増殖を測定した。用量応答曲線は、パルボシクリブがヒトＰＡＳＭＣ（図１ａおよび１ｂ）、ヒトＰＡＡＦ（図１ｃ）、ラットＰＡＳＭＣ（図１ｄ）の増殖を強力に抑制したことを示す。ＥｄＵ組み込みアッセイを行って、連続希釈したパルボシクリブまたは別の既知のＣＤＫ阻害剤で細胞を処理した後の細胞のＤＮＡ合成速度および増殖を測定した。用量応答曲線は、ヒトＰＡＳＭＣ（図１ｅ）、ヒトＰＡＡＦ（図１ｆ）、およびラットＰＡＳＭＣ（図１ｇ）の増殖の抑制を示す。

【図2】Ｒｂリン酸化：網膜芽細胞腫遺伝子産物のリン酸化に対するパルボシクリブの効果。パルボシクリブは、ヒト原発性ＰＡＳＭＣにおいて５％ＦＢＳ（図２ａ）またはＰＤＧＦ−ＢＢ（図２ｂ）によって誘発されるセリン８０７および８１１でのＲｂのリン酸化（ホスホ−Ｒｂ）を強力に遮断したが、総Ｒｂレベルに対してはほとんど影響しなかった。１０％ＦＢＳ（図２ｃ）によって誘発される既知のＣＤＫ阻害剤についての、ヒト原発性ＰＡＳＭＣにおけるホスホ−ＲＢの阻害。

【図3】ラットモノクロタリン（ＭＣＴ）モデルにおける、ＰＡＨ病理に関連する血行力学的および構造的変化。図３ａは、研究対象薬剤の投与頻度を示す。実験結果は、平均肺動脈圧（ＭＰＡＰ、図３ｂ）、収縮期肺動脈圧（ＳＰＡＰ、図３ｈ）および拡張期肺動脈圧（ＤＰＡＰ、図３ｉ）、フルトン・インデックス（ＲＶ／（ＬＶ＋Ｓ）、図３ｃ）、血管壁厚（図３ｄ）、筋化腺房内血管密度（図３ｅ）、病理組織学（図３ｆ）、疾患重症度スコア（図３ｇ）、ならびに心重量（図３ｊ）として示される。

【図4】ラットＳｕＨｘＰＡＨモデルの肺血管系における血行力学的変化および著しい構造的改善。図４ａは、研究対象薬剤の投与頻度を示す（図４ａ）。実験結果は、平均肺動脈圧（ＭＰＡＰ、図４ｂ）、ＳＰＡＰ（図４ｈ）、ＤＰＡＰ（図４ｉ）、フルトン・インデックス（ＲＶ／（ＬＶ＋Ｓ）、図４ｃ）、血管壁厚（図４ｄ）、筋化腺房内血管密度（図４ｅ）、病理組織学（図４ｆ）、疾患重症度スコア（図４ｇ）、および心重量（図４ｊ）として示される。

【図5】肺血管系において評価された細胞増殖。ラット肺切片における二重染色したαＳＭＡ／Ｋｉ６７（図５ａ）およびＣＤ３１／ホスホＲｂ（図５ｂ）のＩＨＣ。実験結果ｐＲｂは、Ｋｉ６７（図５ｃ）、および血管関連網膜芽細胞腫タンパク質のリン酸化（図５ｄ）として示される。

【発明を実施するための形態】

【0016】

全身性高血圧のような肺高血圧は、単一の疾患ではなく、平均肺動脈圧が≧２５ｍｍＨｇという決定要因を共有する疾患群である。ＰＨは、５つの群に分類および分割されている（Ｇａｌｉｅら、ＥＲＪ（２００９）１２月、３４（６）、１２１９〜６３）。本発明は概して、限定されるものではないが、肺動脈圧の上昇および前毛細血管性肺微小血管症に起因する血流抵抗の上昇を特徴とする、世界保健機関（ＷＨＯ）第１群の疾患またはＰＡＨ疾患群の治療に関する。

【0017】

ＰＡＨ肺における主な特徴は異常な細胞増殖であり、これは肺血管系の管腔の進行性閉塞をもたらし、血管抵抗の病理学的増大を生じさせる。肺血管リモデリングは、細胞の成長、細胞死、細胞移動、細胞分化、および細胞外マトリクスの合成または分解における変更に本質的に関連する構造的変化の活性なプロセスである。Ｓｃｈｅｒｍｕｌｙ，Ｒ．Ｔ．ら、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｄｉｓｅａｓｅ：ｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｉａｌｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅｒｅｖｉｅｗｓ．Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ８、４４３〜４５５（２０１１）。多くの薬理学的クラスが臨床的ＰＡＨにおける認可された治療法として既に存在するが、これらは血管弛緩を主に誘発し、それによって肺血管抵抗を低減させる。さらに、単剤療法は、患者の個体差を考慮すると不十分であり得る。Ｈｕｍｂｅｒｔ，Ｍ．＆Ｇｈｏｆｒａｎｉ，Ｈ．Ａ．Ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｔａｒｇｅｔｓｏｆａｐｐｒｏｖｅｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｆｏｒｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｉａｌｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．Ｔｈｏｒａｘ７１、７３〜８３（２０１６）。したがって、これらの治療法は血管リモデリングの複雑性に対処しない。

【0018】

肺血管系の変化は、ＰＡＳＭＣ、ＰＡＡＦ、および肺動脈内皮細胞（ＰＡＥＣ）を伴う。Ｇｕｉｇｎａｂｅｒｔ，Ｃら、Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｉａｌｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ：ｌｅｓｓｏｎｓｆｒｏｍｃａｎｃｅｒ．Ｅｕｒｏｐｅａｎｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｒｅｖｉｅｗ：ａｎｏｆｆｉｃｉａｌｊｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＥｕｒｏｐｅａｎＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＳｏｃｉｅｔｙ２２、５４３〜５５１（２０１３）。ＰＡＨ研究の最近の批評では、複数のシグナル伝達経路を標的化するための増殖シグナル伝達の「ハブ」を論じた。２０１６年９月１４日にオンラインでＤＯＩ：１０．１１６４／ｒｃｃｍ．２０１６０６−１２２６ＰＰとして最初に公開された、Ｐｕｌｌａｍｓｅｔｔｉ，ＳＳら、Ａｍｅｒｉｃａｎｊｏｕｒｎａｌｏｆｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙａｎｄｃｒｉｔｉｃａｌｃａｒｅｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０１６）。別の論評は、肺血流量の変化と肺血管壁の内皮細胞における癌様変化との間の関係について検討した。Ｈｅｐｐｅ，Ｃ．Ｍ．ら、ＶａｓｃｕｌａｒＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ８３（２０１６）１７〜２５。

【0019】

新たなアプローチは、有効性の向上および生存促進を達成することを目的として、ＰＡＨ患者における肺血管リモデリングを支える増殖性表現型を標的化することに焦点を置いてきた。腫瘍学的薬剤が前臨床研究においてＰＡＨ疾患の進行の減速に有効であることが示されたいくつかの例がある。Ｓａｖａｉ，Ｒ．ら、Ｐｒｏ−ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅａｎｄｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｓｉｇｎａｌｉｎｇｃｏｎｖｅｒｇｅｏｎＦｏｘＯ１ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｉｎｐｕｌｍｏｎａｒｙｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅｍｅｄｉｃｉｎｅ２０、１２８９〜１３００（２０１４）；Ｃｉｕｃｌａｎ，Ｌ．ら、Ｉｍａｔｉｎｉｂａｔｔｅｎｕａｔｅｓｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｉａｌｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎｐａｔｈｏｌｏｇｙｖｉａｒｅｄｕｃｔｉｏｎｉｎ５−ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔａｍｉｎｅｔｈｒｏｕｇｈｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ａｍｅｒｉｃａｎｊｏｕｒｎａｌｏｆｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙａｎｄｃｒｉｔｉｃａｌｃａｒｅｍｅｄｉｃｉｎｅ１８７、７８〜８９（２０１３）；およびＳｃｈｅｒｍｕｌｙ，Ｒ．Ｔ．ら、ＲｅｖｅｒｓａｌｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｐｕｌｍｏｎａｒｙｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎｂｙＰＤＧＦｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆｃｌｉｎｉｃａｌｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ１１５、２８１１〜２８２１（２００５）を参照されたい。

【0020】

サイクリン依存性キナーゼおよび関連するセリン／スレオニンプロテインキナーゼは、細胞の分裂および増殖の調節において必須の機能を行う重要な細胞酵素である。サイクリン依存性キナーゼの触媒ユニットは、サイクリンとして知られている調節サブユニットによって活性化される。少なくとも１６の哺乳動物サイクリンが同定されている（ＪｏｈｎｓｏｎＤＧ，ＷａｌｋｅｒＣＬ．ＣｙｃｌｉｎｓａｎｄＣｅｌｌＣｙｃｌｅＣｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．（１９９９）３９：２９５３１２）。サイクリンＢ／ＣＤＫ１、サイクリンＡ／ＣＤＫ２、サイクリンＥ／ＣＤＫ２、サイクリンＤ／ＣＤＫ４、サイクリンＤ／ＣＤＫ６、ならびに、ＣＤＫ３およびＣＤＫ７を含む適当な他のヘテロダインは、細胞サイクルの進行の重要な調節因子である。サイクリン／ＣＤＫヘテロダインのさらなる機能には、転写調節、ＤＮＡ修復、分化、およびアポトーシスが含まれる（ＭｏｒｇａｎＤＯ．Ｃｙｃｌｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅｓ：ｅｎｇｉｎｅｓ，ｃｌｏｃｋｓ，ａｎｄｍｉｃｒｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．（１９９７）１３：２６１２９１）。

【0021】

肺血管リモデリングの複雑性は、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）として知られているタンパク質を伴う細胞増殖サイクルの標的化などの研究のための多くの経路を提供している。これらのＣＤＫは、活性に必要なホロ酵素複合体を形成するための特異的なサイクリンと結び付く。増殖サイクルの各ステップで、異なるサイクリンが必要であり、各サイクリンタンパク質の相対的発現は増大および／または減少して、それらの特異的ＣＤＫを定期的に活性化する。Ｃｈａｒｒｏｎ，Ｔ．ら、Ｔｈｅｃｅｌｌｃｙｃｌｅ：ａｃｒｉｔｉｃａｌｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｔａｒｇｅｔｔｏｐｒｅｖｅｎｔｖａｓｃｕｌａｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｄｉｓｅａｓｅ．ＴｈｅＣａｎａｄｉａｎｊｏｕｒｎａｌｏｆｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ２２ＳｕｐｐｌＢ、４１Ｂ〜５５Ｂ（２００６）。

【0022】

本発明は、一部では、ＣＤＫ阻害剤（ＣＤＫｉ）が、ヒトおよびラットのＰＡＳＭＣおよびヒトＰＡＡＦにおいてマイトジェンの増殖効果を阻害し、ＰＡＨモデルにおいて血行力学の上昇、肺血管細胞増殖、肺動脈形態学、および右心室肥大を低減させるという発見に基づく。

【0023】

本発明はさらに、一部では、パルボシクリブが、ヒトおよびラットのＰＡＳＭＣならびにヒトＰＡＡＦにおいて抗増殖効果に著しく作用し、ＰＡＨモデルにおいて血行力学の変化、肺血管細胞増殖、肺動脈形態学、および右心室肥大に著しく作用したという発見にさらに基づく。

【0024】

本発明の別の実施形態は、それを必要とする対象に、有効量の６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−｛［５−（ピペラジン−１−イル）ピリジン−２イル］アミノ｝ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン、またはその薬学的に許容できる塩を投与することを含む、ＰＡＨ（肺動脈性肺高血圧）を治療する方法を含む。

【0025】

本発明の別の実施形態は、それを必要とする対象に、有効量の６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−｛［５−（ピペラジン−１−イル）ピリジン−２イル］アミノ｝ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オンを投与することを含む、ＰＡＨ（肺動脈性肺高血圧）を治療する方法を含む。

【0026】

本発明の別の実施形態は、それを必要とする対象に、有効量のＣＤＫ阻害剤を投与することを含む、ＰＡＨを治療する方法を含む。

【0027】

本発明の別の実施形態は、それを必要とする対象に、有効量の、以下の化合物：トリラシクリブ（Ｇ１Ｔ２８）、Ｇ１Ｔ３８、アルボシジブ、ＳＥＬ−２４、ミルシクリブ、ＡＧＭ−１３０、ＡＴ７５１９、ＢＡＹ１１４３５７２／１１１２０５４、ＢＣＤ−１１５、ＣＹＣ０６５、ＦＬＸ９２５、ＳＨＲ６３９０、ＴＧ−０２、Ａ−１４６７７２９、ＡＢＣ１１８３、ＡＺＤ５５７６、ＢＰＩ１１７８、セネキシン、ＩＣＥＣ０９４２、ＣＣＴ−６８１２７、ＣＣＴ−２５１９２１、ＯＮ１２３３００、ボルシクリブ、ＳＥＬ１２０−３４、ＳＲＸ−３１７７、ＴＰ１２８７、ＳＹ１３６５、ＵＤ−０１７、もしくはＶＳ２−３７０、またはその薬学的に許容できる塩のいずれかから選択されるＣＤＫ阻害剤を投与することを含む、ＰＡＨを治療する方法を含む。

【0028】

本発明の別の実施形態は、それを必要とする対象に、有効量の、
１．リボシクリブ（７−シクロペンチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−（（５−（ピペラジン−１−イル）ピリジン−２−イル）アミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−カルボキサミド）、もしくはその薬学的に許容できる塩：潜在的抗腫瘍活性を有するＣＤＫｉ標的化サイクリンＤ１／ＣＤＫ４およびサイクリンＤ３／ＣＤＫ６細胞サイクル経路、リボシクリブはＣＤＫ４および６を特異的に阻害、
２．アベマシクリブ（２−ピリミジンアミン，Ｎ−（５−（（４−エチル−１−ピペラジニル）メチル）−２−ピリジニル）−５−フルオロ−４−（４−フルオロ−２−メチル−１−（１−メチルエチル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル））もしくはその薬学的に許容できる塩：ＣＤＫ４およびＣＤＫ６細胞サイクル経路を標的化するＣＤＫｉ、または
３．ジナシクリブ（２−［（２Ｓ）−１−［３−エチル−７−［（１−オキシドピリジン−１−イウム−３−イル）メチルアミノ］ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−５−イル］ピペリジン−２−イル］エタノール）もしくはその薬学的に許容できる塩：ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ５、およびＣＤＫ９を選択的に標的化するＣＤＫｉ
から選択されるＣＤＫ阻害剤を投与することを含む、ＰＡＨを治療する方法を含む。

【0029】

本発明の別の実施形態は、それを必要とする対象に有効量の、ＷＯ０３／０６２２３６、ＷＯ０７１４０２２２、ＷＯ１００７５０７４、ＷＯ１００２０６７５、ＷＯ１６０１５５９８、ＷＯ１６０１５５９７、ＷＯ１６０１５６０５、ＷＯ１６０１５６０４、ＷＯ２０１２／０６６５０８、ＷＯ０４００４６３２、ＷＯ１１０２６９１１、ＷＯ１１０２６９０４、ＷＯ２０１１／１０１４０９、ＷＯ２００６／０７４９８５、ＷＯ２０１２／０６１１５６、ＷＯ１０００９１３、ＷＯ１０００９１５５、およびＷＯ０１８３４６９を含む非排他的なリスト内のいずれか１つまたは組み合わせにおいて表示されているＣＤＫ阻害剤、またはその薬学的に許容できる塩を投与することを含む、ＰＡＨを治療する方法を含む。

【0030】

治療対象の関連疾患には、以下のいずれか１つまたは複数または組み合わせが含まれる：肺毛細血管腫症（ＰＣＨ）（第１群）、左心疾患に起因する肺高血圧（第２群ＰＨ）、肺疾患および／もしくは低酸素症に起因する肺高血圧（第３群）、慢性的血栓塞栓性肺高血圧（第４群）、病因が不明もしくは多因子性の肺高血圧（第５群）、突発型の肺血管疾患もしくは急性的および慢性的な肺の損傷および炎症のあらゆる形態（ＡＲＤＳ、ＩＬＤ、肺炎、ＣＯＰＤ、喘息）を含む肺障害、または原発性の肺血管障害（特発性の、膠原血管関連の、肝臓病関連の、薬剤関連の、ＨＩＶ関連の、凝血塊誘発型の肺高血圧）。本発明の別の実施形態は、それを必要とする対象に、有効量の６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−｛［５−（ピペラジン−１−イル）ピリジン−２イル］アミノ｝ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オンまたはその薬学的に許容できる塩もしくはそうでない塩を投与することを含む、本明細書において論じられる関連疾患を治療する方法を含む。

【0031】

パルボシクリブを、ヒトおよびラットのＰＡＳＭＣのＰＤＧＦ−ＢＢまたは血清誘発型の増殖におけるその活性について調べた。実施例１を参照されたい。パルボシクリブは、ヒト原発性ＰＡＳＭＣのＰＤＧＦ−ＢＢ誘発型の増殖を７．４ｎＭのＩＣ_５０で強力に阻害し、３つの平均（図１ａ）をＢｒｄＵによって得、相対蛍光単位（ｒＦＵ）として表した。５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）によって誘発されたヒトおよびラットの原発性ＰＡＳＭＣの両方の増殖も、パルボシクリブ治療によって同様に阻害された（ＩＣ_５０はそれぞれ７．４ｎＭおよび２７．４ｎＭであり、それぞれ３つの平均である）（図１ｂおよび図１ｄ）。パルボシクリブはまた、血管リモデリングに関与する別の細胞型である外膜線維芽細胞（ＰＡＡＦ）に対して非常に強力であった。ヒト原発性ＰＡＡＦの血清誘発型の増殖は、３つの平均で、２１．６ｎＭのＩＣ_５０で阻害された（図１ｃ）。

【0032】

ＰＡＳＭＣおよびＰＡＡＦに対するＣＤＫ阻害剤の抗増殖効果の実証は、ＣＤＫ活性の薬理学的阻害を介して達成され、３つのさらなる化合物（アベマシクリブ、ジナシクリブ、およびリボシクリブ）を、パルボシクリブと同時にプロファイリングした。表１は、図１ｅ、１ｆ、および１ｇで表される増殖の効果％に基づくＩＣ_５０値を示す。

【0033】

実験ロジスティクスに起因して、図１ａおよび１ｂならびに図２ａおよび２ｂに関連するヒトＰＡＳＭＣドナー細胞はある１人のドナーの細胞を用いて生成され、図１ｅおよび図２ｃに関連するデータは異なるドナーから生成されたことに留意されたい。同様に、図１ｃおよび１ｆをサポートするヒトＰＡＡＦは、異なるドナー細胞に由来するものであった。最後に、図１ｄおよび１ｇのラットＰＡＳＭＣ調製物は、異なる動物に由来する細胞調製物から生成された。実施例１で論じられたアッセイの間にも差があった。

【0034】

【表1】

【0035】

パルボシクリブを次いで、ｉｎ−ｃｅｌｌウェスタン分析を用いて、ヒトＰＡＳＭＣにおけるＲｂのリン酸化に対するその効果について試験した。実施例１を参照されたい。パルボシクリブは、ＰＤＧＦ−ＢＢまたは血清誘発型のＲｂリン酸化を、それぞれ５．２ｎＭ（図２ｂ）および１４．９ｎＭ（図２ａ）のＩＣ_５０で強力に阻害した。したがって、パルボシクリブは、ＰＡＨにおける病理学的血管リモデリングに関与する主な細胞型の増殖の遮断において非常に効果的である。

【0036】

さらなる研究において、パルボシクリブをアベマシクリブ、ジナシクリブ、およびリボシクリブと同時に試験した場合、増殖は１０％ＦＢＳの使用で誘発され、全てのＣＤＫ阻害剤は、誘発されたＲｂリン酸化の阻害を示した。図２ｃで表されるデータに基づく表２を参照されたく、ここで、効果のパーセントは、増殖についての効果のパーセントと同様に計算されている。

【0037】

【表2】

【0038】

ＭＣＴは、主に毒性代謝産物であるモノクロタリンピロールの肝臓生成後に肺血管損傷を誘発することが示されている。ＭＣＴモデルは、血管リモデリング、平滑筋細胞の増殖、内皮機能障害、炎症性サイトカインの増加、および右心室（ＲＶ）不全を含む、ヒトＰＡＨのいくつかの鍵となる態様に有利である。Ｓｔｅｎｍａｒｋ，Ｋ．Ｒ．ら、Ａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｓｏｆｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｉａｌｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ：ｔｈｅｈｏｐｅｆｏｒｅｔｉｏｌｏｇｉｃａｌｄｉｓｃｏｖｅｒｙａｎｄｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｃｕｒｅ．Ａｍｅｒｉｃａｎｊｏｕｒｎａｌｏｆｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｌｕｎｇｃｅｌｌｕｌａｒａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ２９７、Ｌ１０１３〜１０３２（２００９）。図３および４では、Ｐａｌｂｏはパルボシクリブ、Ｓｉｌｄはシルデナフィル、Ｒｉｏはリオシグアト、およびＶｅｈは媒体である。実施例３で記載されるＭＣＴＰＡＨモデルにおいて、ＭＣＴに暴露されたラットは肺高血圧を常に発症し、平均（ＭＰＡＰ）、収縮期の（ＳＰＡＰ）、および拡張期の（ＤＰＡＰ）肺動脈圧が増大した。フルトン・インデックスもまた、ＭＣＴ暴露後に増大した。フルトン・インデックスは、重量に基づく以下の比率である。
右心室［ＲＶ］／（左心室［ＬＶ］＋中隔［Ｓ］）

【0039】

これらの研究では、ＰＡＨ症候をモデルにおいて発症させるために第２の作用物質、例えばＭＣＴが投与された日と同日である０日目に、ある作用物質が最初に投与された場合、その作用物質は予防的に投与されたと考えられた。しかし、動物がＰＡＨの症候を発症した後に作用物質が投与された場合、例えば、その作用物質が研究の１４日目に最初に投与された場合、その作用物質は治療的に投与されたと考えられた。

【0040】

予想通り、シルデナフィル（５０ｍｇ／ｋｇ／用量、ＰＯＢＩＤ）は、予防的に投与された場合（０〜２８日目）、ＭＰＡＰ（図３ｂ）、ＳＰＡＰ（図３ｈ）、ＤＰＡＰ（図３ｉ）、フルトン・インデックス（図３ｃ）、および心重量（図３ｊ）のＰＡＨ関連の増大を有意に低減させた。しかし、治療的に投与された場合は（１４〜２８日目）、ＰＡＨの承認された治療法であるシルデナフィルは、この研究においてＭＰＡＰ、ＳＰＡＰ、ＤＰＡＰ、フルトン・インデックス、および心重量のわずかなおよび有意でない低減を示したに過ぎなかった。

【0041】

パルボシクリブ（１００ｍｇ／ｋｇ／日、ＰＯ、ＱＤ）は、治療的に投与された場合（１４〜２８日目）、予想を大きく上回った。図３ａは、研究対象薬剤の投与頻度を示す。パルボシクリブは、予防的に投与された場合、シルデナフィルの正の血行力学的および生理学的効果に匹敵するのみならず、それを上回った。

【0042】

組織形態計測的に、パルボシクリブは、肺血管系の構造的変化を劇的に改善し、一部のケースでは完全に正常化したが、シルデナフィルはそうではなかった（図３ｆ）。パルボシクリブ投与群（１４〜２８日目）は、媒体／ＭＣＴ投与群と比較して、腺房内（≦５０μｍの外径）および前腺房（５１〜１００μｍの外径）肺動脈の両方で、平均血管壁厚（エラスチン染色）が有意に小さく（０．５８×ＭＣＴに低下した）、シルデナフィル（０〜２８日目）（０．７６×ＭＣＴ）の有利な効果を上回ったが、シルデナフィル群（１４〜２８日目）はこれらの測定値にほとんど影響を有さなかった（図３ｄ）。パルボシクリブ（１４〜２８日目）はまた、完全に筋化した腺房内血管の密度を、０日目から２８日目まで投与された間にのみ効果的であったシルデナフィルよりも大きく低減させた（αＳＭＡ染色、図３ｅ）。さらに、パルボシクリブ投与群（１４〜２８日目）はまた、媒体／ＭＣＴ投与群（１〜４の範囲、平均３）と比較して著しく低い疾患重症度スコア（０〜２の範囲、平均１）を有し、ここでも、シルデナフィル投与群よりも性能が優れていた（０〜２８日目、１〜４の範囲、平均２．５）（図３ｇ）。

【0043】

慢性的低酸素症に血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体遮断（セマキシニブ／Ｓｕ５４１６）が合わさると、ラットにおいて重篤なＰＡＨが生じる。先のＳｔｅｎｍａｒｋ，Ｋ．Ｒ．。Ｓｕ５４１６／ＨｘＰＡＨモデルにおいて、実施例４に記載するように、パルボシクリブ（１００ｍｇ／ｋｇ／日、ＰＯ、ＱＤ）を、ＰＡＨ患者を治療するために一般的に使用される２つの薬剤であるシルデナフィル（３０ｍｇ／ｋｇ／用量、ＰＯ、ＢＩＤ）およびリオシグアト（１０ｍｇ／ｋｇ／日、ＰＯ、ＱＤ）に対して評価した。Ｌａｎｇ，Ｍ．ら、ＴｈｅｓｏｌｕｂｌｅｇｕａｎｙｌａｔｅｃｙｃｌａｓｅｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｒｉｏｃｉｇｕａｔａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓｐｕｌｍｏｎａｒｙｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎｉｎｄｕｃｅｄｂｙｈｙｐｏｘｉａａｎｄＳＵ５４１６ｉｎｒａｔｓ．ＰｌｏＳｏｎｅ７、ｅ４３４３３（２０１２）。全ての３つの薬剤を、７から２８日目に投与した（図４ａ）。媒体／Ｓｕ５４１６／Ｈｘ群と比較して、予想通り、シルデナフィルでの予防的処理はＭＰＡＰ（図４ｂ）、ＳＰＡＰ（図４ｈ）、およびＤＰＡＰ（図４ｉ）を有意に低減させ、リオシグアトでの予防的処理はＭＰＡＰおよびＤＰＡＰを有意に低減させたが、いずれかの作用物質を使用しての治療処置は、この研究においてフルトン・インデックスをわずかに低減させたにすぎず、肺または心重量に変化はなかった。しかし、パルボシクリブは、血行力学的エンドポイントを非疾患対照群近くまで戻し、シルデナフィルおよびリオシグアトの両方に取って代わった（ＭＰＡＰの結果を比較する図４ｂ、およびフルトン・インデックス値を比較する図４ｃ）。治療処置を見ると、パルボシクリブ群のみがフルトン・インデックス（図４ｃ）および心重量（図４ｊ）の有意な低減を示した。

【0044】

組織形態計測的に、パルボシクリブは、肺血管系の構造的変化を劇的に改善し、一部のケースでは完全に正常化したが、シルデナフィルまたはリオシグアトはそうではなかった（図４ｆ）。組織形態計測的分析は、パルボシクリブが腺房内および前腺房血管の両方で平均血管壁厚を有意に低減させたが、リオシグアトまたはシルデナフィルはそうではなかったことを示した（図４ｄ）。パルボシクリブ投与群はまた、媒体／Ｓｕ５４１６／Ｈｘ群と比較して有意に低い（０．６８×Ｓｕ５４１６／Ｈｘ）筋化腺房内血管密度を有していた。シルデナフィル投与群およびリオシグアト投与群の平均は、媒体／ＳｕＨｘ群と統計上有意に異ならなかった（図４ｅ）。さらに、パルボシクリブ投与群は、媒体／Ｓｕ５４１６／Ｈｘ群（３〜４の範囲、平均３．６５）と比較してほぼ完全に正常化した疾患重症度スコア（０〜１．５の範囲、平均０．２５）を有しており、シルデナフィル投与群およびリオシグアト投与群より性能が優れていた（図４ｇ）。驚くべきことに、パルボシクリブ治療は、ラットＳｕ５４１６／ＨｘＰＡＨモデルの肺血管系における血行力学的変化のほぼ完全な抑制および有意な構造的向上をもたらし、シルデナフィルおよびリオシグアトの両方よりも性能が優れていた。

【0045】

インビボ研究からの二重αＳＭＡ／Ｋｉ６７染色された、および二重ＣＤ３１／ホスホＲｂ染色されたラット肺切片（図５ａおよび図５ｂ）のＩＨＣ分析は、ＭＣＴが血管関連Ｋｉ６７^＋増殖細胞（図５ｃ）の有意な増大、および血管関連ホスホＲｂ^＋細胞（図５ｄ）の数の増大の傾向を生じさせることを示した。実施例５を参照されたい。これらの標的特異的エンドポイントは、パルボシクリブ投与によって対照レベルまで劇的に減少した（図５ｃ）。同様に、低酸素症と組み合わされたＳｕ５４１６／治療は、肺血管系における血管関連Ｋｉ６７^＋およびｐＲｂ^＋細胞の有意な増大を誘発した。パルボシクリブはこれらの増大を完全に逆転させ、一方、シルデナフィルまたはリオシグアトは、これらのバイオマーカーに対する有意の有益な効果を示さなかった。パルボシクリブは、ＰＡＨ疾患モデルの肺血管系における細胞増殖を抑制した。

【0046】

本発明は、ＰＡＨまたは本明細書において開示されている障害を治療する方法を含み、本方法は、パルボシクリブを単剤療法として使用すること、または、治療を必要としている患者に、ＰＡＨの治療、ＰＡＨに関連する症状の治療、もしくは本明細書において開示されている障害の治療について認可された１つもしくは複数の薬剤（活性物質とも呼ばれる）と組み合わせてパルボシクリブを投与する、併用療法においても使用すること、またはその組み合わせとして使用することを含む。例えば、さらなる活性物質には、限定されるものではないが、プロスタグランジン（例えば、エポプロステノール、トレプロスチニル、イロプロスト、セレキシパグ）、エンドセリン受容体アンタゴニスト（例えば、ボセンタン、アンブリセンタン、マシテンタン）、グアニル酸シクラーゼ阻害剤（例えばリオシグアト）、血管拡張物質（例えば、プロスタサイクリンおよびシルデナフィル）、カルシウムチャネル遮断物質（例えば、アムロジピン、ジルチアゼム、およびニフェジピン）、抗凝固剤（例えばワルファリン）、および利尿剤が含まれ得る。薬剤に言及すると、例えばシルデナフィルには、シルデナフィルおよび全ての薬学的に許容できる塩、例えばクエン酸シルデナフィルが含まれる。

【0047】

別の態様において、パルボシクリブは、ＰＡＨの治療または予防のための医薬の製造において使用される。さらに別の態様において、パルボシクリブは、本明細書において論じられる関連疾患の治療または予防のための医薬の製造において使用される。様々な実施形態では、医薬は、即時放出および持続放出医薬品製剤の両方を含む、経口投与製剤である。他の実施形態では、医薬は、吸入による投与のために製剤される。これらの実施形態の全てにおいて、本発明は、医薬の単位用量形態を提供する。

【0048】

本発明はまた、パルボシクリブと同一であるが、実際は１つまたは複数の原子が自然界で通常見られる原子質量または質量数と異なる原子質量または質量数を有する原子に置き換えられている、同位体標識された化合物を含む。本発明の化合物に組み込まれ得る同位体の例には、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、および塩素の同位体、例えばそれぞれ^２Ｈ、^３Ｈ、^１３Ｃ、^１１Ｃ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^１８Ｏ、^１７Ｏ、^３１Ｐ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１８Ｆ、および^３６Ｃｌが含まれる。本発明の化合物、そのプロドラッグ、ならびに前述の同位体および／または他の原子の他の同位体を含有する前記化合物または前記プロドラッグの薬学的に許容できる塩は、本発明の範囲内である。ある特定の同位体標識された本発明の化合物、例えば、^３Ｈおよび^１４Ｃなどの放射性同位体が組み込まれた化合物は、薬剤および／または基質の組織分布アッセイにおいて有用である。トリチウム標識されたもの、すなわち^３Ｈ同位体、および炭素−１４、すなわち^１４Ｃ同位体が、それらの調製容易性および検出性から特に好ましい。さらに、重水素、すなわち^２Ｈなどのより重い同位体での置換は、より優れた代謝安定性の結果生じるある一定の治療的利点、例えばインビボでの半減期の増加または投与必要条件の低減をもたらし得、したがって、一部の状況では好ましい場合がある。同位体標識されたパルボシクリブおよびそのプロドラッグは、通常、同位体標識されていない試薬を容易に入手可能な同位体標識された試薬で置き換え、以下のスキームおよび／または実施例および調製の節において開示される手順を実施することによって調製され得る。

【0049】

本明細書におけるパルボシクリブに言及すると、これには、６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−｛［５−（ピペラジン−１−イル）ピリジン−２イル］アミノ｝ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン、または、塩を含む薬学的に許容できる製剤を形成するその薬学的に許容できる塩が含まれ、前記塩には、限定されるものではないが、パルボシクリブの酸付加塩、溶媒和物、およびＮ−オキシドが含まれる。参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ０３／０６２２３６を参照されたい。

【0050】

本明細書において用いられる用語「対象」は、ヒト、霊長類、コンパニオンアニマル（猫または犬を含む）を指す。用語「対象」には、患者が含まれる。

【0051】

本明細書において用いられる用語「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、このような用語が適用される障害もしくは症状の進行を逆転、軽減、阻害すること、このような障害もしくは症状を予防すること、またはこのような症状もしくは障害の１つもしくは複数の症候を予防することを指す。本明細書において用いられる用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」をすぐ直前に定義したように、治療する行為を指す。

【0052】

パルボシクリブは、広範な経口、ならびに経皮および直腸投与を含む非経口投与形態で製剤および投与され得る。当業者には、以下の投与形態が、活性成分として、パルボシクリブ、またはパルボシクリブの対応する薬学的に許容できる塩もしくは溶媒和物を含み得ることが認識されよう。

【0053】

本発明はまた、治療上有効量のパルボシクリブとその薬学的に許容できる担体、希釈剤、または賦形剤とを共に含む医薬品製剤を含む。本発明の化合物を有する医薬組成物の調製では、薬学的に許容できる担体は、固体または液体のいずれかであり得る。固体形態の調製物には、粉末、錠剤、ピル、カプセル、カシェ剤、坐剤、および分配可能な顆粒が含まれる。固体担体は、希釈剤、着香料、結合剤、防腐剤、錠剤崩壊剤、またはカプセル化材料としても作用し得る１つまたは複数の物質であり得る。錠剤投与形態では、用量に応じて、パルボシクリブは、投与形態の１重量％から８０重量％、典型的には５重量％から６０重量％、さらに典型的には約１０重量％から約３５重量％、またはさらに典型的には投与形態の約１５重量％から約２５重量％を占め得る。具体的な実施形態では、パルボシクリブは、投与形態の約２０重量％を占める。

【0054】

本発明の固体投与形態において、担体は、例えば、希釈剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、流動促進剤、および界面活性剤を含む、様々な薬学的に許容できる賦形剤を含み得る。製剤にはまた、防腐剤、抗酸化剤、着香料、および着色剤などの賦形剤、ならびに当技術分野において知られている他の賦形剤が含まれ得る。

【0055】

錠剤などの固体投与形態は、典型的には、希釈剤、例えば、ラクトース（一水和物、スプレー乾燥された一水和物、無水物など）、マンニトール、キシリトール、デキストロース、ショ糖、ソルビトール、圧縮性の糖、微晶質セルロース、粉末化されたセルロース、デンプン、アルファデンプン、デキストレート、デキストラン、デキストリン、デキストロース、マルトデキストリン、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、第三リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、ポロクサマー、ポリエチレンオキシド、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびその混合物を含有する。異なるタイプの微晶質セルロースが、本明細書において記載される製剤における使用に適切であり得る。微晶質セルロースの例には、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）タイプ：ＰＨ１０１、ＰＨ１０２、ＰＨ１０３、ＰＨ１０５、ＰＨ１１２、ＰＨ１１３、ＰＨ２００、ＰＨ３０１、および他のタイプの微晶質セルロース、例えばケイ化型微晶質セルロース（ＳＭＣＣ）が含まれる。一部の実施形態では、希釈剤は、微晶質セルロース、ラクトース一水和物、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、炭酸マグネシウム、第二リン酸カルシウム、第三リン酸カルシウム、またはその混合物からなる群から選択される。一部の実施形態では、希釈剤は微晶質セルロースを含む。いくつかの実施形態では、希釈剤は、１つまたは複数のタイプの微晶質セルロース、例えば、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０５、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ２００、またはその混合物を含む。一部のこのような実施形態では、希釈剤は、ラクトース一水和物を含まない。他のこのような実施形態では、希釈剤は微晶質セルロースを含み、ラクトース一水和物をさらに含む。希釈剤は、固体投与形態の約２５重量％から約７５重量％、好ましくは投与形態の約５０重量％から約７５重量％を占めることが多い。

【0056】

固体投与形態は、崩壊剤を含有することが多い。崩壊剤の例には、デンプングリコール酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、微晶質セルロース、低アルキル置換型ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、アルファデンプン、およびアルギン酸ナトリウムが含まれる。一部の実施形態では、崩壊剤はクロスポビドンである。あらゆるグレードのクロスポビドンが使用され得、例えば、ＣＬ、ＣＬ−ＳＦ、およびＸＬグレードのクロスポビドンが、本明細書において記載される製剤における使用に適切である。具体的な例には、Ｋｏｌｌｉｄｏｎ、ＫｏｌｌｉｄｏｎＣＬ（登録商標）、ＫｏｌｌｉｄｏｎＣＬ−Ｍ（登録商標）、ＰｏｌｙｐｌａｓｄｏｎｅＸＬ（登録商標）、ＰｏｌｙｐｌａｓｄｏｎｅＸＬ−１０（登録商標）、およびＰｏｌｙｐｌａｓｄｏｎｅＩＮＦ−１０（登録商標）が含まれる。一部の実施形態では、担体は、クロスポビドン、クロスカルメロースナトリウム、およびデンプングリコール酸ナトリウムからなる群から選択される少なくとも１つの崩壊剤を含む。具体的な実施形態では、崩壊剤はクロスポビドンである。崩壊剤は、投与形態の約１重量％から約２５重量％、好ましくは約５重量％から約２０重量％、さらに好ましくは約５重量％から約１０重量％を占めることが多い。

【0057】

結合剤は、錠剤製剤に接着性を付与するために使用され得る。適切な結合剤には、微晶質セルロース、ゼラチン、糖、ポリエチレングリコール、天然および合成ゴム、ポリビニルピロリドン、アルファデンプン、ヒドロキシプロピルセルロース、ならびにヒドロキシプロピルメチルセルロースが含まれる。一部の実施形態では、結合剤は、微晶質セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、およびヒドロキシプロピルメチルセルロースからなる群から選択される。具体的な実施形態では、結合剤は、微晶質セルロース、例えばＡｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０５である。存在する場合、結合剤は、投与形態の約０重量％から約１５重量％、または約０．２重量％から約１０重量％を占め得る。一部の実施形態では、結合剤は、投与形態の約５重量％から約１０重量％を占める。特定の実施形態では、結合剤は、投与形態の約１０重量％を占める。

【0058】

固体投与形態は、１つまたは複数の潤滑剤を含有することが多い。潤滑剤の例には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、フマル酸ステアリルナトリウム、ステアリン酸マグネシウムとラウリル硫酸ナトリウムとの混合物、またはこれらの２つ以上の混合物が含まれる。一部の実施形態では、潤滑剤は、ステアリン酸マグネシウムおよび／またはフマル酸ステアリルナトリウムである。一部の実施形態では、潤滑剤はステアリン酸マグネシウムである。一部のこのような実施形態では、固体投与形態は、顆粒内および顆粒外のステアリン酸マグネシウムを含む錠剤である。他の実施形態では、固体投与形態は、顆粒内ステアリン酸マグネシウムおよび顆粒外フマル酸ステアリルナトリウムを含む錠剤である。存在する場合、潤滑剤は、投与形態の約０．２５重量％から約１０重量％、好ましくは約０．５重量％から約６重量％を占めることが多い。

【0059】

錠剤はまた、流動促進剤、例えば、二酸化ケイ素、コロイド状二酸化ケイ素、ケイ酸マグネシウム、三ケイ酸マグネシウム、タルク、および他の形態の二酸化ケイ素、例えば、凝集型のケイ酸塩およびケイ酸を含み得る。一部の実施形態では、流動促進剤は二酸化ケイ素である。存在する場合、流動促進剤は、錠剤の約０重量％から約１０重量％、好ましくは約０．２重量％から約５重量％、または約０．５重量％から約２重量％を占め得る。

【0060】

錠剤は、ラウリル硫酸ナトリウムおよびポリソルベート８０などの界面活性剤を含んでいてもよい。存在する場合、界面活性剤は、錠剤の０重量％から１０重量％、または好ましくは０．２重量％から５重量％を占め得る。

【0061】

通常、本発明の固体投与形態は、薬化学において一般的な方法に従って調製される。選択される賦形剤は、活性医薬品成分と共に、顆粒外または顆粒内区画のいずれかまたは両方に組み込まれ得る。

【0062】

パルボシクリブの治療上有効用量は、１日当たり、体重１ｋｇ当たりおよそ０．０１ｍｇからおよそ１００ｍｇで変化する。典型的な成人用量は、１日当たりおよそ０．１ｍｇからおよそ３０００ｍｇである。さらに典型的には、パルボシクリブの治療上効果的な成人用量は、１日当たり７５ｍｇ、１００ｍｇ、または１２５ｍｇである。単位用量調製物内の活性成分の量は、特定の適用に従って、およそ０．１ｍｇからおよそ５００ｍｇ、好ましくは約２５ｍｇから約１２５ｍｇで変化し得るかまたは調整され得る。組成物は、必要に応じて、他の適合性の治療物質も含有し得る。パルボシクリブでの治療が必要な対象は、単回投与でまたは２４時間内での複数回投与で、１日当たり約０．６から約５００ｍｇ、好ましくは１日当たり約２５ｍｇから１２５ｍｇの投与量で投与される。このような治療は、必要な限り長く、連続的な間隔で反復され得る。

【実施例】

【0063】

（実施例１）
細胞増殖アッセイ。正常なヒト対象の原発性ＰＡＳＭＣおよびＰＡＡＦ（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ならびにラット原発性ＰＡＳＭＣ（ＣｅｌｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）内でＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）９６ウェルプレートに播種し、０．１％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ内で２４時間、血清飢餓させた。細胞をまず異なる濃度のパルボシクリブ（３セット）と３０分プレインキュベートし、次いで、３０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢまたは５％ＦＢＳを添加して細胞増殖を刺激した。細胞を４８時間維持し、その後、増殖率を、ＣｅｌｌＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎＥＬＩＳＡＢｒｄＵ（ブロモデオキシウリジン）ＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＫｉｔ（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて評価した。ＢｒｄＵを、ＢｒｄＵ組み込みの定量化の１６時間前に培地に添加した。この手順を使用して、少なくとも図１ａ、１ｂ、１ｃ、および１ｄで表されるデータを得た。系に適用される応答の５０％を阻害するために必要な化合物の濃度を判定することによって、ＩＣ_５０値をあらゆる所与の阻害剤について計算した。ＩＣ_５０値は、化合物濃度応答データにフィットする４つのパラメータロジスティック方程式から得た。

【0064】

あるいは、ＢｒｄＵを使用するよりむしろ、ＥｄＵ（５−エチニル−２’−デオキシウリジン）を使用することができる。細胞をまず異なる濃度のＣＤＫ阻害剤と３０分プレインキュベートし、次いで、５％ＦＢＳを添加して細胞増殖を刺激した。細胞を２４時間維持し、その後、増殖率を、ＥＤＵＣｌｉｃｋ−ｉＴＥｄＵＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７ＨＣＳＡｓｓａｙ（ＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）用いて評価した。ＥｄＵを、ＥｄＵ組み込みの定量化の１６時間前に培地に添加した。Ｃｌｉｃｋ−ｉＴアッセイの一部として、ＤＡＰＩ（４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）またはＨｏｅｃｈｓｔ染色およびシアニン５色素のための適切な蛍光顕微鏡フィルターを備えた自動ハイコンテントイメージングプラットフォームを用いて９６ウェルプレートをスキャンすることによって、増殖を定量化した。シアニン５で検出された増殖ＥｄＵ陽性細胞を定量化し、ウェル当たりの総細胞数に対して正規化し、ここで、細胞当たりの総細胞数は、ＤＡＰＩまたはＨｏｅｃｈｓｔシグナルによって同定した。効果％を次いで計算した。
（濃度当たりの増殖細胞の平均量−増殖の平均最小量）／（増殖の平均最大量−増殖の平均最小量）

【0065】

ＦＢＳが存在するＣＤＫ阻害剤濃度当たりの増殖細胞の平均量。使用したＣＤＫ阻害剤は、パルボシクリブ、アベマシクリブ、ジナシクリブ、およびリボシクリブであった。

【0066】

増殖の最小量は、ＦＢＳが添加されておらずＣＤＫ阻害剤が存在しないウェル内の細胞数に基づく。

【0067】

増殖の最大量は、ＦＢＳが添加されＣＤＫ阻害剤が存在しないウェル内の細胞数に基づく。

【0068】

この手順を用いて、少なくとも図１ｅ、１ｆ、および１ｇで表されるデータを得た。

【0069】

Ｉｎ−ｃｅｌｌウェスタン分析。正常なヒト対象の原発性ＰＡＳＭＣを上記のように培養し、血清飢餓させた。細胞をまず異なる濃度のパルボシクリブと６０分プレインキュベートし、次いで、５％ＦＢＳまたは１０％ＦＢＳまたは３０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢのいずれかを添加して細胞増殖およびＲｂリン酸化を刺激した。Ｒｂリン酸化に対するパルボシクリブの効果を、ｉｎ−ｃｅｌｌウェスタンアッセイを製造者の使用説明書に従って用いて（Ｌｉ−ＣｏｒＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ、ＵＳＡ）、２４時間後に評価した。リン酸化したＲｂを、ウサギモノクローナル抗体抗ホスホ−Ｒｂ（Ｓｅｒ８０７／８１１）（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて測定し、その後、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ赤外蛍光色素標識されたヤギ抗ウサギ二次抗体で検出した。アクチンレベルを、マウス抗アクチンモノクローナル抗体（ｐａｎＡｂ−５）（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、ＵＳＡ；ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を用いて測定し、その後、ＩＲＤｙｅ６８０ＲＤ標識されたヤギ抗マウス二次抗体で検出した。５％ＦＢＳを使用した図２ａ、ＰＤＧＦ−ＢＢを使用した図２ｂ、および１０％ＦＢＳを使用した図２ｃを参照されたい。

【0070】

（実施例２）
ラットＭＣＴ誘発型ＰＡＨモデル：オスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（２６０〜２８０ｇ；媒体対照群、ｎ＝６；全ての他の群、ｎ＝１５）に、媒体（３３．３％の１ＮＨＣｌ、１４．８％の１ＮＮａＯＨ、５２．２％のｄｉＨ_２Ｏ）内に溶解したＭＣＴ（５０ｍｇ／ｋｇ、ＳＣ；１ｍｌ／ｋｇＢＷ）、または媒体のみを０日目に投与した。シルデナフィル（５０ｍｇ／ｋｇ／用量、ＢＩＤ）を、０〜２８日目に予防的に、または１４〜２８日目に治療的に投与した（５ｍｌ／ｋｇ、ＰＯ）。パルボシクリブ（１００ｍｇ／ｋｇ、ＱＤ）を治療的に投与した（１４〜２８日目）。シルデナフィルおよびパルボシクリブの両方を媒体（０．５％メチルセルロース）内に再懸濁し、経口投与した（５ｍｌ／ｋｇ）。２８日目に、イソフルランを介して動物を麻酔し、血行力学的パラメータを評価し、安楽死後に組織を採取した。

【0071】

（実施例３）
ラットＭＣＴ誘発型ＰＡＨモデル：オスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（２６０〜２８０ｇ；媒体対照群、ｎ＝６；全ての他の群、ｎ＝１５）に、媒体（３３．３％の１ＮＨＣｌ、１４．８％の１ＮＮａＯＨ、５２．２％のｄｉＨ_２Ｏ）内に溶解したＭＣＴ（５０ｍｇ／ｋｇ、ＳＣ；１ｍｌ／ｋｇＢＷ）、または媒体のみを０日目に投与した。シルデナフィル（５０ｍｇ／ｋｇ／用量、ＢＩＤ）を、０〜２８日目に予防的にまたは１４〜２８日目に治療的に投与した（５ｍｌ／ｋｇ、ＰＯ）。パルボシクリブ（１００ｍｇ／ｋｇ、ＱＤ）を治療的に投与した（１４〜２８日目）。シルデナフィルおよびパルボシクリブの両方を媒体（０．５％メチルセルロース）内に再懸濁し、経口投与した（５ｍｌ／ｋｇ）。２８日目に、イソフルランを介して動物を麻酔し、血行力学的パラメータを評価し、安楽死後に組織を採取した。

【0072】

血行力学的測定−モノクロタリン（ＭＣＴ）研究：２８日目に、陽圧ベンチレーター内で２％イソフルランを介して動物を麻酔した。イソフルラン陽圧換気された動物において、肺の血行力学を、事前に較正された圧力変換器を用いて測定した。定常状態の肺および全身の動脈圧を、右頚動脈を介して大動脈弓のレベルで肺動脈幹に導入されたＭｉｌｌａｒＳｏｌｉｄＳｔａｔｅＭｉｋｒｏ−ｔｉｐカテーテル（ＭｉｌｌａｒＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）を用いて測定した。血行力学的値を、生理学的データ収集システムＡＤＩＣｈａｒｔ（ＡＤＩＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＣｏｌｏｒａｄｏＳｐｒｉｎｇ、ＣＯ）（ＰｌａｔｏＢｉｏＰｈａｒｍａ）によって自動計算した。

【0073】

（実施例４）
ＳｕＨｘ誘発型の肺動脈性肺高血圧：Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットをＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した（２００〜３００ｇ；媒体対照、ｎ＝５；全ての他の群、ｎ＝１０）。ラットに、ＤＭＳＯに溶解したセマキシニブを０日目に投与し、その後、低（１３％）酸素下で２８日目まで飼育した。媒体（０．５％メチルセルロース）内のシルデナフィル（３０ｍｇ／ｋｇ／用量、ＢＩＤ）、リオシグアト（１０ｍｇ／ｋｇ、ＱＤ）、またはパルボシクリブ（１００ｍｇ／ｋｇ、ＱＤ）を、７〜２８日目に投与した。末端血行力学的評価および剖検を、ＭＣＴ研究と同様の様式で２８日目に行った。

【0074】

血行力学的測定Ｓｕ／Ｈｘ研究：２８日目に、ケタミン／キシラジン（８０／１０ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射を介して動物を麻酔した。Ｍｉｌｌａｒカテーテルを肺動脈に挿入し、肺圧および血行力学を、Ｓｔｒｉｎｇｅｒら、（１９８１）Ｃａｔｈｅｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｙｉｎｔｈｅｃｌｏｓｅｄ−ｃｈｅｓｔｒａｔ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５１、１０４７〜１０５０に記載されているように測定した。血行力学的値を、ＮＯＴＯＣＯＲＤ−Ｈｅｍソフトウェア（ＮＯＴＯＣＯＲＤ，Ｉｎｃ．、ＣｒｏｉｓｓｙｓｕｒＳｉｅｎｎｅ、Ｆｒａｎｃｅ）（ＣｏｒＤｙｎａｍｉｃｓ）を用いて計算した。

【0075】

ＲＶ肥大の測定。剖検で心臓を回収した後、心房および大血管を除去した。ＲＶをＬＶおよびＳから分離した。ＲＶおよびＬＶ＋Ｓの湿重量を測定してフルトン・インデックスを計算した。

【0076】

（実施例５）
組織の調製。麻酔下で動物を瀉血し、肺循環に、酸素供給された（実施例３［ＭＣＴ］の動物）またはヘパリン化された（実施例４［Ｓｕ５４１６／Ｈｘ］の動物）生理食塩水を流し込んだ。気管、肺、および心臓を胸腔から無傷の状態で取り出し、氷冷した生理食塩水内に置いた。右肺葉を取り出し、秤量し、即座に液体窒素内で急速冷凍した。先端の丸い針（２０ｇ）が付いた、定着剤（１０％ＮＢＦ）を満たした１０ｍＬのシリンジを使用して左肺葉を膨らませ、気道を結紮して気道が一定に広がったままとなるようにした。左肺を次いで、１０％ＮＢＦ内に最大４８時間浸して固定し、次いで、７０％ＥｔＯＨに移して最大５日置いた。

【0077】

組織形態計測的分析。３つの３〜５μｍ厚の左肺葉の横断切片を組織形態計測的分析に使用した。全体的な疾患重症度スコアを、有資格の獣医学病理学者による、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した肺切片の光学顕微鏡評価によって判定した。スコアは、０（不存在）、１（最小）、２（穏やか）、３（中度）、４（顕著）から５（重症）の範囲であり、ＰＡＨモデルの組織変化（炎症性、退行性、血管性、および／または増殖性）特徴の影響を受けた組織のおよそのパーセンテージに従って割り当てられた。平均血管壁厚を、修正型のヴァーヘフ−ヴァンギーソンエラスチン染色で調製された肺切片を使用して評価した。画像分析を、組織区域の１０％のランダム領域サンプリング（ＶｉｓｉｏｐｈａｒｍｎｅｗＣＡＳＴ）と、腺房内および前腺房血管の観察者による同定と、血管壁厚の測定のための核形成因子プローブの適用とを使用して行った。完全に筋化した腺房内血管密度を、二重αＳＭＡ／Ｋｉ６７ＩＨＣ染色した切片を使用して同様の様式で評価し、７０％以上筋化した（すなわちＳＭＡ^＋）、横断切片化された、≦５０μｍの外径の、同定可能な内腔を有する腺房内血管を観察者によって計数した。血管に関連するＫｉ６７^＋およびｐＲｂ^＋細胞を、組織区域の１０％のランダム領域サンプリングを用いて、αＳＭＡ／Ｋｉ６７ＩＨＣ染色された肺切片およびＣＤ３１／ｐＲｂＩＨＣ染色された肺切片においてそれぞれ計数し、≦１００μｍの外径の血管の壁（すなわち、内膜または中膜内）に関連するＫｉ６７^＋またはｐＲｂ^＋細胞を観察者によって同定した。

【0078】

免疫組織化学。二重α−ＳＭＡ／Ｋｉ６７核抗原：全てのＩＨＣステップを、ＬｅｉｃａＢｏｎｄＲｘ自動免疫組織化学染色機で、３μｍ厚のホルマリン固定されパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）切片で行った。機器を、スライドをベイクし、脱ワックスするようにプログラムした。一次抗体である抗ヒトαＳＭＡ（ウサギポリクローナルａｂ５６９４、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を、Ｂｏｎｄ（商標）ＰｒｉｍａｒｙＡｎｔｉｂｏｄｙＤｉｌｕｅｎｔ（ＰＶ６１２３）内で１：２００に希釈し、スライドにアプライし、３０分インキュベートし、Ｂｏｎｄ（商標）ＰｏｌｙｍｅｒＲｅｆｉｎｅＡＰ−Ｒｅｄ検出キット（ＤＳ９３９０、ＬｅｉｃａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＢｕｆｆａｌｏＧｒｏｖｅ、ＩＬ）を使用して検出した。このステップの後、Ｂｏｎｄ（商標）ＥｐｉｔｏｐｅＲｅｔｒｉｅｖａｌ１（ＥＲ１）溶液（ＡＲ９９６１、ＬｅｉｃａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、２０分の熱誘発型のエピトープ回復を行った。二次抗体である抗Ｋｉ６７（マウスモノクローナルＫｉ−６７［ＭＭ１］核抗原ＲＴＵ、ＰＡ０１１８［Ｌｅｉｃａ］）を１５分アプライし、その後、Ｂｏｎｄ（商標）ＰｏｌｙｍｅｒＲｅｆｉｎｅＨＲＰＤＡＢ検出系（ＤＳ９８００）で検出した。スライドを対比染色し、脱水し、カバーガラスをかけた。

【0079】

二重ＣＤ３１／ホスホＲｂ：最初のステップは上記と同じであった。熱誘発型のエピトープ回復を、Ｂｏｎｄ（商標）ＥｐｉｔｏｐｅＲｅｔｒｉｅｖａｌ２（ＥＲ２）溶液（ＡＲ９６４０）で２０分行った。Ｂｏｎｄ（商標）ＰｒｉｍａｒｙＡｎｔｉｂｏｄｙＤｉｌｕｅｎｔ内で１：６００に希釈した一次抗体である抗ホスホＲｂ（ウサギポリクローナルホスホ−Ｒｂ［ｓｅｒ８０７／８１１］、９３０８、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）をスライドにアプライし、３０分インキュベートした。Ｂｏｎｄ（商標）ＰｏｌｙｍｅｒＨＲＰ−ＤＡＢＲｅｆｉｎｅ検出キットを一次抗体の次に使用した。このステップの後に、Ｂｏｎｄ（商標）ＥｐｉｔｏｐｅＲｅｔｒｉｅｖａｌ１（ＥＲ１）溶液（ＡＲ９９６１、ＬｅｉｃａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、１０分の熱誘発型のエピトープ回復を行った。二次抗体である抗ＣＤ３１（ウサギモノクローナル［ＥＰＲ３０９４］、ａｂ７６５３３、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を４５分アプライし、その後、Ｂｏｎｄ（商標）ＰｏｌｙｍｅｒＲｅｆｉｎｅＡＰ−Ｒｅｄ検出キット（ＤＳ９３９０、ＬｅｉｃａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で検出した。スライドを対比染色し、脱水し、カバーガラスをかけた。

【0080】

統計分析
データは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表される。群間の統計分析を、一方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて行い、その後、テューキーの多重比較検定（ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６、ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を行った。統計的有意性のレベルは、０．０５（†または^＊と標識される）または０．０１（††または^＊＊と標識される）の多重性調整されたＰ値と設定した。

【図1-1】