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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】特開2021-4221(P2021-4221A)
(43)【公開日】2021年1月14日
(54)【発明の名称】核酸アプタマー
(51)【国際特許分類】
C07H 21/02 20060101AFI20201211BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20201211BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20201211BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20201211BHJP
A61P 17/14 20060101ALI20201211BHJP
A61K 9/06 20060101ALI20201211BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20201211BHJP
A61K 9/12 20060101ALI20201211BHJP
A61K 9/70 20060101ALI20201211BHJP
C12N 15/115 20100101ALI20201211BHJP
【ＦＩ】
C07H21/02ZNA
A61K31/7088
A61P43/00 111
A61K31/7105
A61P17/14
A61K9/06
A61K9/08
A61K9/12
A61K9/70 401
C12N15/115 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】23
【出願形態】ＯＬ
【全頁数】27
(21)【出願番号】特願2019-119978(P2019-119978)
(22)【出願日】2019年6月27日
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２８年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、研究成果展開事業 マッチングプランナー プログラム「企業ニーズ解決試験」における研究題目「人工核酸の応用による科学的に裏付けされた革新的育毛剤の開発」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】503167042
【氏名又は名称】株式会社アドバンジェン
(74)【代理人】
【識別番号】110001070
【氏名又は名称】特許業務法人ＳＳＩＮＰＡＴ
(72)【発明者】
【氏名】坂本 泰一
(72)【発明者】
【氏名】天野 亮
(72)【発明者】
【氏名】柳澤 拓也
(72)【発明者】
【氏名】笹生 みなみ
(72)【発明者】
【氏名】堀内 正隆
(72)【発明者】
【氏名】田中 陽一郎
(72)【発明者】
【氏名】山本 昌邦
(72)【発明者】
【氏名】行方 昌人
(72)【発明者】
【氏名】ガニ ファロハナ イスラット
【テーマコード（参考）】
4C057
4C076
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C057BB05
4C057CC03
4C057DD03
4C057MM02
4C076AA06
4C076AA11
4C076AA24
4C076AA72
4C076BB15
4C076BB16
4C076BB31
4C076CC18
4C076CC29
4C076FF11
4C076FF68
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA13
4C086MA16
4C086MA17
4C086MA28
4C086MA32
4C086MA63
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZA92
4C086ZC42
(57)【要約】
【課題】本発明は、ＦＧＦ−５（Fibroblast growth factor 5:線維芽細胞増殖因子５）に対して高い阻害効果を有する核酸アプタマー、育毛活性剤および育毛剤組成物を提供する。【解決手段】ＦＧＦ−５に特異的に結合する核酸分子である核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物が、ＦＧＦ−５のシグナル伝達によるヘアサイクルの進行や毛乳頭に対する脱毛シグナルを抑制することで、発毛および育毛に優れた効果を奏する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＦＧＦ−５（Fibroblast growth factor 5:線維芽細胞増殖因子５）に特異的に結合する核酸分子である核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
【請求項2】
前記核酸アプタマーが、前記ＦＧＦ−５と前記ＦＧＦ−５の受容体との結合を阻害する、請求項１に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
【請求項3】
前記ＦＧＦ−５に対する解離定数が１０ｐＭ〜１００ｎＭである、請求項１または２に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
【請求項4】
塩基数が１０以上１００以下である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
【請求項5】
塩基数が５０以上６０以下である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
【請求項6】
前記核酸分子が、配列Ａ、Ｂ、およびＣからなる群から選択される少なくとも一つの配列を有し、
前記配列Ａが配列：５’−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｕ−３’であり、
前記配列Ｂが、配列：５’−Ｘ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ａ−３’（Ｘは任意の塩基を表す）であり、
前記配列Ｃが、配列：５’−Ｕ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−３’である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
前記配列Ａが配列：５’−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｕ−３’であり、
前記配列Ｂが、配列：５’−Ｘ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ａ−３’（Ｘは任意の塩基を表す）であり、
前記配列Ｃが、配列：５’−Ｕ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−３’である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
【請求項7】
前記配列Ｂである、配列：５’−Ｘ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ａ−３’における、前記Ｘがピリミジン塩基である請求項６に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
【請求項8】
前記ＸがＣまたはＵである請求項６または７に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
【請求項9】
前記核酸分子が、配列番号１〜１１、１３、１６、および１７からなる群より選択される配列を有する核酸分子、ならびに前記配列番号１〜１１、１３、１６、および１７からなる群より選択される配列において、該配列が有する前記配列Ａ、Ｂ、およびＣ以外の場所において、１〜５個の塩基の置換、欠失、または挿入された配列を有する核酸分子の変異体から選択される核酸分子である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
【請求項10】
前記核酸分子が、配列番号１〜１１、１３、１６、および１７からなる群より選択される配列を有する核酸分子である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
【請求項11】
前記核酸分子が、配列番号１、４、６、７、１０、１３、１６、および１７からなる群より選択される配列を有する核酸分子である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
【請求項12】
前記核酸分子が、配列番号１、６、１６、および１７からなる群より選択される配列を有する核酸分子である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
【請求項13】
前記核酸分子が、配列番号１または６で表される配列を有する核酸分子である、請求項１１に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
【請求項14】
前記核酸分子が、ＲＮＡである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
【請求項15】
前記ＦＧＦ−５がヒトＦＧＦ−５である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
【請求項16】
前記核酸アプタマーに含まれるヌクレオチドに含まれる、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）の一以上において、リボースの２'位がフッ素原子で置換されている、
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
【請求項17】
前記核酸アプタマーに含まれるヌクレオチドに含まれる、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）においてリボースの２'位がフッ素原子で置換されている、
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
【請求項18】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、およびこれらの溶媒和物から選択される少なくとも一つを含む、育毛活性剤。
【請求項19】
前記ＦＧＦ−５の作用を阻害する活性を有することを特徴とする、請求項１８に記載の育毛活性剤。
【請求項20】
請求項１８または１９に記載の育毛活性剤を含有する、育毛剤組成物。
【請求項21】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、およびこれらの溶媒和物を、０．００００１〜１０質量％有する、請求項１９に記載の育毛剤組成物。
【請求項22】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、およびこれらの溶媒和物を、０．００００５〜５質量％含有する、請求項１９に記載の育毛剤組成物。
【請求項23】
医薬品である、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の育毛剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、核酸アプタマー、育毛活性剤および育毛剤組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
加齢や遺伝的要素による脱毛、あるいは過度なストレスによる円形脱毛症等、頭髪の脱毛についての悩みを抱える者は多い。男性型および女性型脱毛症診療ガイドライン２０１７年版（日本皮膚科学会ガイドライン）によると、男性型脱毛症（male pattern hair loss, androgenetic alopecia（ＡＧＡ））の発症頻度は全年齢平均で約３０％である。また、平成２６年の政府統計における患者調査（傷病分類変）によると、脱毛症により病院を受診した総患者数だけでも１０万人を超えており、潜在的な脱毛症患者はさらに多いと考えられる。
このような背景から、発毛や育毛、脱毛の抑制を目的とする様々な、頭髪用化粧品、医薬部外品、または医薬品が開発されており、既に市場に出廻っている。
【0003】
しかしながら、ＡＧＡに限ってもその脱毛原因は、男性ホルモンの影響、頭部真皮層の毛細血管網における血行不良、または頭皮表面の状態（乾燥、皮脂過剰等）等多岐にわたっている。現在市場に存在している多数の育毛剤等の多くは、これらの脱毛原因に有効とされる天然物由来の成分や化学物質等を配合した育毛剤等を頭部に塗布して、頭皮表面からこれらの成分を浸透させることで、脱毛の抑制または発毛の促進を行うことを目的としている。しかしながら現在のところ、普遍的に効果を示す育毛剤等は現在のところ存在せず、期待できる効果としても、細くなった毛髪を多少太くしたり、脱毛のサイクルを幾分緩やかにしたりする程度のものであり、またそれらの効果についても個人差も大きいという問題点がある。したがって、普遍的に効果を発揮し、さらに従来品よりも強力な育毛剤等のニーズは、依然として高く、その開発が望まれていた。
【0004】
また、人間の頭髪のみならず、愛玩動物または畜産動物の体毛においても、同様に、皮膚病、加齢、及び飼育環境等からくるストレス等から生ずる脱毛症状に対して、育毛効果を奏する外用組成物の需要がある。
【0005】
頭髪や体毛は通常、成長期、退行期、休止期を繰返しながら成長し、成長期には、毛根を包む皮膚組織である毛包の根元にある毛乳頭細胞が活性化することで毛母細胞が分裂を開始して発毛し、毛母細胞が毛幹として伸長していくことで毛が成長する。その後、退行期に入ると毛の成長は衰え、不可逆的に休止期に入り毛成長は停止し、やがて、脱毛する。成長期から休止期までの毛の成長と脱毛のサイクル（毛周期：ヘアサイクル）は毛１本ごとに異なる繊細な生体機構であり、さまざまな遺伝子およびその産物によって制御されている。
【0006】
近年、毛髪の成長についての研究が進み、毛周期に影響を与える物質の一つとして線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）に注目が集まってきた。ＦＧＦはその名の示すとおり線維芽細胞の増殖に関わる因子であり、線維芽細胞が新たな毛包の形成を支持することが知られている。ＦＧＦには、ファミリータンパク質として、２３種類が存在しており、生体の恒常性を維持するための代謝調節因子等として重要な役割を果たしている多機能性分泌因子であることが知られており、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１８およびＦＧＦ−２２が皮膚および毛包の上皮で発現していることが知られている。これら８種のＦＧＦが、標的となる細胞表面のＦＧＦＲ１〜ＦＧＦＲ４のいずれかに結合することで、細胞内にシグナルが伝達して毛周期が制御されるものと考えられる。例えば、骨と軟骨の形成や成長を制御することが広く知られているＦＧＦ−１８は毛包幹細胞領域で発現し、休止期を維持する（非特許文献１）。
【0007】
また、ＦＧＦファミリータンパク質の一つであるＦＧＦ−５は、毛成長に対して抑制的に働くことが知られている。すなわち、ＦＧＦ−５は、毛包の毛周期における成長期を退行期に誘導する。換言すると、ＦＧＦ−５は、毛包の成長期後期に限定的に発現することにより毛包の成長期を終了させ、毛成長を停止へと導く。例えば、本発明者らは特定のササエキス調製品がＦＧＦ−５作用の阻害活性を有すること、さらにそのようなササエキス調製品を用いたＦＧＦ−５による毛周期制御機構に基づく育毛剤組成物について開示している（特許文献１）。さらに、成長期の毛包に大量に発現するＦＧＦ−５の短鎖形分子であるＦＧＦ−５Ｓは、ＦＧＦ−５に対しアンタゴニスト活性を示すことにより、成長期から退行期への移行を遅らせ、毛成長を促進することも明らかとなった（非特許文献２〜非特許文献５）。しかしながら、ＦＧＦ−５とその受容体の相互作用メカニズムは明らかになっていない。
【0008】
さらに、本発明者らの研究により、ＦＧＦ−５は、毛の成長を阻害し、ヘアサイクルを成長期から退行期へ移行させる作用を有していることが明らかとなり、この知見から本発明者らはＦＧＦ−５を阻害するフィチン酸を含有する育毛剤組成物についても発明を行っている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】特開２００７−２３８５０３号公報
【特許文献2】特開２０１７−４３５９４号公報
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】Kawano M et.al., J Invest Dermatol.124:877-885(2005)
【非特許文献2】Ozawa K et.al., J.Biol.Chem.273:29262-29271(1998)
【非特許文献3】Suzuki et.al., J.Invest.Dermatol.111:963-972(1998)
【非特許文献4】Suzukiet.al., J.Invest.Dermatol.114:456-463(2000)
【非特許文献5】Ota et.al., Biochem.Biophys.Res.Commun.290:169-176(2002)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明者らは、ＦＧＦ−５作用の研究過程で、この作用を阻害する活性を持つ物質が優れた効果を発揮する育毛剤として利用できるとの着想を得た。そしてＦＧＦ−５作用に対し、阻害作用を有する物質を見出すために、さらに鋭意研究を進めた結果、本発明者らは、ＦＧＦ−５の作用を阻害する物質として核酸アプタマーに着目した。核酸アプタマーとは、特有の三次元立体構造をとることで標的分子に特異的に結合する一本鎖の核酸分子であり、標的分子に対する高い結合能と特異性を有し、さらに短時間にまた容易に化学合成が可能で化学修飾も可能であること、免疫原性の小ささ（免疫反応により排除されにくい）や、安定性の高さなどの特性により、医薬品や診断薬などさまざまな分野で実用化されている。
【0012】
本発明者らは、ＦＧＦ−５に対して高い阻害効果を有する核酸アプタマーの開発に成功し、該核酸アプタマーが育毛の活性において高いポテンシャルを有することを見出した。上記を踏まえ、本発明は、ＦＧＦ−５を阻害する核酸アプタマーおよび育毛活性剤等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明はＦＧＦ−５（Fibroblast growth factor 5:線維芽細胞増殖因子５）タンパク質に対して特異的に結合する核酸アプタマー等である。
【0014】
すなわち、本発明は例えば以下の［１］〜［２３］を提供する。[１]
ＦＧＦ−５（Fibroblast growth factor 5:線維芽細胞増殖因子５）に特異的に結合する核酸分子である核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
[２]
前記核酸アプタマーが、前記ＦＧＦ−５とＦＧＦ−５の受容体との結合を阻害する、[１]に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
[３]
前記ＦＧＦ−５に対する解離定数が１０ｐＭ〜１００ｎＭである、[１]または[２]に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
［４］
塩基数が１０以上１００以下である[１]〜[３]のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
［５］
塩基数が５０以上６０以下である、[１]〜[４]のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
[６]
前記核酸分子が、配列Ａ、Ｂ、およびＣからなる群から選択される少なくとも一つの配列を有し、
前記配列Ａが配列：５’−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｕ−３’であり、
前記配列Ｂが、配列：５’−Ｘ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ａ−３’（Ｘは任意の塩基を表す）であり、
前記配列Ｃが、配列：５’−Ｕ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−３’である、[１]〜[５]のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
[７]
前記配列Ｂである、配列：５’−Ｘ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ａ−３’における、前記Ｘがピリミジン塩基である[６]に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
[８]
前記ＸがＣまたはＵである[６]または[７]に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
[９]
前記核酸分子が、配列番号１〜１１、１３、１６、および１７からなる群より選択される配列を有する核酸分子、ならびに前記配列番号１〜１１、１３、１６、および１７からなる群より選択される配列において、該配列が有する前記配列Ａ、Ｂ、およびＣ以外の場所において、１〜５個の塩基の置換、欠失、または挿入された配列を有する核酸分子の変異体から選択される核酸分子である、[６]〜[８]のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
[１０]
前記核酸分子が、配列番号１〜１１、１３、１６、および１７からなる群より選択される配列を有する核酸分子である、[１]〜[９]のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
[１１]
前記核酸分子が、配列番号１、４、６、７、１０、１３、１６、および１７からなる群より選択される配列を有する核酸分子である、[１]〜[１０]のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
[１２]
前記核酸分子が、配列番号１、６、１６、および１７からなる群より選択される配列を有する核酸分子である、請求項[１]〜[１１]のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
[１３]
前記核酸分子が、配列番号１または６で表される配列を有する核酸分子である、[１１]に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
[１４]
前記核酸分子が、ＲＮＡである、[１]〜[１２]のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
[１５]
前記ＦＧＦ−５がヒトＦＧＦ−５である、[１]〜[１３]のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
[１６]
前記核酸アプタマーに含まれるヌクレオチドに含まれる、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）の一以上において、リボースの２'位がフッ素原子で置換されている、
[１]〜[１５]のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
[１７]
前記核酸アプタマーに含まれるヌクレオチドに含まれる、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）においてリボースの２'位がフッ素原子で置換されている、
[１]〜[１６]のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、またはこれらの溶媒和物。
[１８]
[１]〜[１７]のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、およびこれらの溶媒和物から選択される少なくとも一つを含む、育毛活性剤。
[１９]
前記ＦＧＦ−５の作用を阻害する活性を有することを特徴とする、[１８]に記載の育毛活性剤。
[２０]
[１８]または[１９]に記載の育毛活性剤を含有する、育毛剤組成物。
[２１]
[１]〜[１７]のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、およびこれらの溶媒和物を、０．００００１〜１０質量％有する、[２０]に記載の育毛剤組成物。
[２２]
[１]〜[１７]のいずれか１項に記載の核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、およびこれらの溶媒和物を、０．００００５〜５質量％含有する、[２０]に記載の育毛剤組成物。
[２３]
医薬品である、[２０]〜[２２]のいずれか１項に記載の育毛剤組成物。
【発明の効果】
【0015】
本発明の核酸アプタマーによれば、従来品と比べて育毛効果をより確実に期待でき、かつ物理的に安定な育毛活性剤、育毛剤組成物を提供することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図3】図３はアプタマーＦ−０２、Ｆ−５８、Ｆ−３３、Ｆ−０５、Ｆ−０６、Ｆ−１８、Ｆ−１４、Ｆ−１９、Ｆ−４６、Ｆ−５２、Ｆ−３９においてシトシンおよびウラシルがフッ素化されていることを明示した配列である。ただしＣ（Ｆ）はフッ素化したシトシンを、Ｕ（Ｆ）はフッ素化したウラシルを示す。
【発明を実施するための形態】
【0017】
本発明の「核酸アプタマー」は、ターゲット分子に特異的に結合する核酸分子である核酸アプタマーであり、当該アプタマーは薬学的に許容できる、塩または溶媒和物の形態をとっていてもよい。本発明の核酸アプタマーのターゲット分子は、ＦＧＦ−５（Fibroblast growth factor 5:線維芽細胞増殖因子５）タンパク質である。本発明の核酸アプタマーは、ＦＧＦ−５に対して特異的に結合する核酸分子である、ＦＧＦ−５とＦＧＦ−５受容体との結合を直接阻害することにより、ＦＧＦ−５のシグナル伝達によるヘアサイクルの進行や毛乳頭に対する脱毛シグナルを抑制することで、発毛および育毛に優れた効果がある。
【0018】
＜核酸アプタマー＞本発明に係る核酸アプタマーは、ターゲット分子であるＦＧＦ−５に特異的に結合する核酸分子である。前記核酸アプタマーは該核酸アプタマーの薬学的に許容される塩または溶媒和物であってもよい。前記ＦＧＦ−５は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、スナネズミ、ハムスター、フェレット、イヌ、ミニブタ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジなどのいずれの動物種のＦＧＦ−５であってもよいが、ヒトＦＧＦ−５であることがより好ましい。前記核酸分子としては、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれであってもよいが、一本鎖ＲＮＡであることが好ましい。また、前記核酸分子としては、人工核酸分子または天然核酸分子のいずれであってもよいが、人工核酸分子であることが好ましい。
【0019】
前記核酸アプタマーはＦＧＦ−５に特異的に結合することでＦＧＦ−５とその受容体との結合を阻害し、ＦＧＦ−５のシグナル伝達を直接的に抑制する。ＦＧＦ−５が関連する、毛乳頭に対する脱毛シグナルの抑制という観点から、前記核酸アプタマーとＦＧＦ−５との結合は強い方が好ましく、つまり両者の解離定数は小さいほうが好ましい。ＦＧＦ−５とＦＧＦ−５受容体との解離定数は１０ｐＭ〜１００ｎＭであることが好ましく、１０ｐＭ〜１０ｎＭであることがより好ましい。
【0020】
前記核酸アプタマーである核酸分子に含まれる塩基数は１０以上１００以下であることが好ましく、５０以上６０以下であることがより好ましい。なお、一塩基の平均分子量は約３３０であることから、本発明の核酸アプタマーの分子量は約３３００〜３３０００であることが好ましく、約１６５００〜１９８００であることがより好ましいといえる。前記核酸分子に含まれるヌクレオチドとしてはアデニン（略称：Ａ）、グアニン（略称：Ｇ）、シトシン（略称：Ｃ）、チミン（略称：Ｔ）、ウラシル（略称：Ｕ）が一般的に用いられる。上記天然のヌクレオチドをそのまま用いることもできるが、典型的には安定性の観点から、フッ素化（Ｆ化）、メチル化等の修飾された上記ヌクレオチドを用いることが好ましい。また上記以外の天然のヌクレオチドや非天然型のヌクレオチドを用いることもできる。
【0021】
また修飾されたヌクレオチドを用いる場合、各ヌクレオチド内の修飾部位は特に限定されないが、ヌクレオチドにおけるリボースの２’位に修飾を行うことが好ましい。特に、後述するようにＳＥＬＥＸ法でアプタマーを取得する際、ＲＮＡ分解酵素に対する耐性という観点から、ＣとＵはリボースの２’位がＦ化したものを用いることが通常の技術手段である。したがって、前記核酸アプタマーに含まれるヌクレオチドに含まれる、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）の一以上において、リボースの２'位がフッ素原子で置換されていることが好ましく、さらに前記核酸アプタマーに含まれるヌクレオチドに含まれる、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）においてリボースの２'位がフッ素原子で置換されていることが好ましい。なお、ここでシトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）は実質的に全てのシトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を指し、具体的には９５〜１００％のシトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）がＦ化したものであることが好ましく、９８〜１００％のシトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）がＦ化したものであることがより好ましく、９９〜１００％のシトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）がＦ化したものであることが特に好ましい。また、他の修飾や保護、脱保護等により、人工的に所望の性質を付与したヌクレオチドを用いてもよい。また、前記核酸分子は、安定性や体内動態の向上の観点から、適宜長さや大きさを調製してもよいし、前記核酸分子の末端にＰＥＧ修飾等の化学修飾等をおこなってもよい。また、一般にＰＥＧは体内動態の向上に重要であることがわかっている。なお、特段の事情がない限り、本明細書（請求項、図を含む）において上記５つのヌクレオチドについては各略称を用いて表記する。
【0022】
（核酸アプタマーの配列-１）以下、前記ターゲット分子がＦＧＦ−５である、核酸アプタマーについて説明する。
【0023】
上述したように、前記核酸分子に含まれる塩基数は１０以上１００以下であることが好ましく、５０以上６０以下であることがより好ましい。前記核酸アプタマーである核酸分子はその分子中に、配列Ａ：５’−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｕ−３’、配列Ｂ：５’−Ｘ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ａ−３’（Ｘは任意の塩基を表す）、配列Ｃ：５’−Ｕ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−３’の少なくとも一つの配列を有することが好ましく、配列Ａ〜Ｃのすべてを有することが特に好ましい。前記核酸分子が配列Ａ〜Ｃのすべてを有する場合においては各配列の数は特に限定されるものではないが、各配列を一つずつ有することが好ましい。当該核酸分子が配列Ａ〜Ｃのすべてを一つずつ有する場合において、その順番は特に限定されないが、５’−配列Ａ−配列Ｂ−配列Ｃ−３’（「−」は各配列を連結するリンカー配列を示し、その配列は特に限定されるものではない）の順であることが好ましい。
【0024】
前記配列Ｂ：５’−Ｘ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ａ−３’において、上述したとおりＸは任意の塩基であるが、ピリミジン塩基であることが好ましく、ＣまたはＵであることがより好ましい。
【0025】
前記核酸分子は、配列番号１〜１１、１３、１６、および１７からなる群より選択される配列を有する核酸分子、ならびに前記配列番号１〜１１、１３、１６、および１７からなる群より選択される配列において、該配列が有する前記配列Ａ、Ｂ、およびＣ以外の場所において、１〜５個の塩基の置換、欠失、または挿入された配列を有する核酸分子の変異体から選択される核酸分子であることが好ましい。核酸分子は、１〜１１、１３、１６、および１７からなる群より選択される配列を有する核酸分子であることがより好ましく、配列番号１、４、６、７、１０、１３、１６、および１７からなる群より選択される配列を有する核酸分子であることがさらに好ましく、配列番号１、６、１６、および１７からなる群より選択される配列を有する核酸分子であることがよりさらに好ましく、配列番号１または６で表される配列を有する核酸分子であることが特に好ましい。配列番号２および３で表される配列は、配列番号１で表される配列の類似配列であることから、好ましい。配列番号１３および１６で表される配列は配列番号１で表される配列を短鎖化したものであることから、好ましい。また配列番号１７で表される配列は配列番号６で表される配列を短鎖化したものであることから、好ましい。また、結合阻害力の強さという観点からは配列番号６、７および１０、ならびに配列番号４およびその類似配列である配列番号５で表される配列を有する核酸分子もまた好ましい。
【表1】
【0026】
なお、本明細書においては配列番号１を有するアプタマーをＦ−０２、配列番号２を有するアプタマーをＦ−５８、配列番号３を有するアプタマーをＦ−３３、配列番号４を有するアプタマーをＦ−０５、配列番号５を有するアプタマーをＦ−０６、配列番号６を有するアプタマーをＦ−１８、配列番号７を有するアプタマーをＦ−１４、配列番号８を有するアプタマーをＦ−１９、配列番号９を有するアプタマーをＦ−４６、配列番号１０を有するアプタマーをＦ−５２、配列番号１１を有するアプタマーをＦ−３９、配列番号１２を有するアプタマーをＦ−５１、配列番号１５を有するアプタマーをＦ−０２−４０、配列番号１４を有するアプタマーをＦ０２−４２、および配列番号１３を有するアプタマーをＦ０２−５２と称する。また、配列番号１６を有するアプタマーをＦ−０２−５６、および配列番号１７を有するアプタマーをＦ−１８−５６と称する。
【0027】
前記核酸分子は、該配列中に含まれうる配列Ａ、Ｂ、およびＣ以外の場所において、１〜５個の塩基、好ましくは１〜２個の塩基が、置換、欠失、または挿入されていてもよい。塩基の置換、欠失、または挿入がおきた核酸分子の例示としては、配列番号１〜１１、１３、１６、および１７からなる群より選択される配列において、該配列が有する前記配列Ａ、Ｂ、およびＣ以外の場所において、１〜５個の塩基の置換、欠失、または挿入された配列を有する核酸分子の変異体が挙げられ、１〜２個の塩基の置換、欠失、または挿入された配列を有する核酸分子の変異体が好ましい。
【0028】
（核酸アプタマーの選択）本発明の核酸アプタマーを取得する方法は、特に限定されないが、一般的にＳＥＬＥＸ（Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment）法など、核酸ライブラリから取得する方法が一般的である。
特にある目的のタンパク質に特異的に結合する核酸アプタマーを取得する場合、ＳＥＬＥＸ法は広く用いられている。この方法は、１０14程度のランダム配列の核酸ライブラリとターゲット分子とを混合した後、ターゲット分子に結合している核酸をＲＮＡの場合はＲＴ−ＰＣＲ法などの手法を用いて増幅させるものであり、シークエンス解析で配列を決定して目的となる核酸アプタマーを特定する方法である。このようにＳＥＬＥＸ法でアプタマーを取得する際には前述したＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕが用いられるが、ＲＮＡ分解酵素に対する耐性という観点から、ＣとＵは２’位がＦ化したものを用いることが通常の技術手段である。
また、近年では増幅時に核酸に変異導入を行いながら選別を行うことにより、天然には存在しない、目的の機能に最も適したＲＮＡ配列を選別することが可能である手法も行われている。
【0029】
（核酸アプタマーの構造決定）核酸アプタマーはターゲット分子に特異的に結合することでターゲット分子の機能を阻害するものであるため、配列のみならず、その立体構造が重要となる。
核酸の二次構造については、核酸分子中の塩基が塩基対を形成する際の自由エネルギー変化に基づいて二次構造を予測するツールである、mfoldやCentroidFoldなどのフリーツールが公開されており、それらを適宜用いて予測することができる。
また核酸アプタマーの三次元以上の立体構造または、核酸アプタマーとターゲット分子との結合した際における立体構造の決定においては、核磁気共鳴法、Ｘ線結晶構造解析等の手法を用いることができる。
【0030】
＜育毛活性剤＞本発明の育毛活性剤は、前記核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、およびこれらの溶媒和物から選択される少なくとも一つを含む。
本発明の育毛活性剤は、前記核酸アプタマーそのもの、前記塩そのもの、前記溶媒和物そのもの、のいずれであってもよく、これらの混合物であってもよい。本発明の育毛活性剤は、前記核酸アプタマー、該核酸アプタマーの薬学的に許容できる塩、およびこれらの溶媒和物から選択される１種または２種以上の成分のみからなることが好ましい。
本発明の育毛活性剤は、ＦＧＦ−５の作用を阻害する活性を有しており、育毛効果に優れている。
【0031】
＜育毛剤組成物＞本発明の育毛剤組成物は、前記育毛活性剤を含有する。
本発明の育毛剤組成物に含有されるアプタマーの量は、育毛剤組成物の提供される形態によって大きく異なり、特に限定されることはないが、例えば前記育毛活性剤がエマルションの形態で提供されるとき、前記アプタマーは０．００００１〜１０質量％含有することが好ましく、０．００００５〜５質量％含有することがさらに好ましく、０．００１〜１質量％含有することがさらに好ましい。
【0032】
本発明の育毛剤組成物は、保存時および使用時のｐＨが４．５〜６．２であることが好ましい。ｐＨが低すぎる（強酸性）と、育毛剤組成物におけるアプタマーが不溶化することにより分離しやすくなる。一方、ｐＨが高すぎる（アルカリ性）と、核酸アプタマーが分解しやすくなる。したがって、上記観点から、皮膚のｐＨ（約５．３：弱酸性）に近いｐＨ（例えばｐＨ５．０〜５．６）に調整することが最も好ましい。
【0033】
本発明の育毛剤組成物は、液剤状、乳剤状、ゲル状、クリーム状、軟膏状、フォーム状、ミスト状、ジェル状など、種々の剤型をとり得る。例えば、本発明の育毛剤組成物は水性溶液またはシリコン相中の水性相（Ｗ／Ｓｉ）における脂肪相の分散によって得られる水中油型（Ｏ／Ｗ型）エマルションとして製造してもよいし、また脂肪相中の水性相の分散によって得られる油中水型（Ｏ／Ｗ型）エマルションとして製造してもよい。
【0034】
さらに当該エマルションを液体、半液体稠度を有するローション、セラム型製剤、もしくはミルク状の製剤として調製してもよいし、また、クリーム状もしくはゲル状の柔らかい稠度を有する水性もしくは無水懸濁液としてもよい。また前記エマルションをマイクロカプセル、微小粒子、又はイオン性及び/若しくは非イオン性型小胞に含有させることで、液中にさらに分散させた分散液に調製してもよいし、または当該エマルションをフォーム状に調製してもよい。これらの調整方法は従来用いられている任意の手法で行うことができる。なお、本発明による組成物の様々な成分の量は、当該分野において典型的に使用されている量である。具体的には本発明の育毛剤組成物は、スカルプ、頭髪、まつ毛、眉毛あるいはその他の増毛したい部位のためのローション、トニック、ジェル、クリーム、トリーメント、フォーム、ミスト、シャンプー、コンディショナーなどの形態で提供され得る。
【0035】
（補助成分）本発明の育毛剤組成物においては、一般の育毛剤組成物に使用される種々の物質、例えば、血管拡張剤、抗炎症剤、角質溶解剤、殺菌剤、保湿剤、各種動植物の抽出物、抗酸化剤、溶解補助剤、代謝賦活剤、増粘剤、粘着剤、香料、清涼化剤などを本発明の効果を損なわない範囲で補助成分として添加してもよい。また、後述の医薬品の項目で記載した添加剤を、育毛剤組成物の補助成分として添加してもよい。当該補助成分は植物等の天然物由来（センブリ抽出液等）であってもよいし、人工的に合成した化合物であってもよい。
【0036】
＜医薬品＞本発明の育毛剤組成物は、医薬品であってもよい。上述したような核酸アプタマー（育毛活性剤）を有効成分として含有することが好ましい。使用の様態または症状により、含有量は適宜変更してもよいし、また必要に応じて薬学的に許容される各種の添加剤をさらに含有させて製剤化してもよい。また、適宜基材に内包させてナノカプセル状にしてもよい。
【0037】
（症状）前記症状にはヘアサイクルが短くなることを原因とする毛髪の成長の遅さ、毛髪の細さ、脱毛等が含まれる。「治療」には前記症状を治癒することと共に、それを緩和（軽快）すること、予防することも含まれる。なお、「予防」には、前記症状を未然に防ぐことと共に、治癒後にその再発を防ぐことも含まれる。
【0038】
医薬品の投与部位は、発毛、または前記症状を抑制することが望まれる箇所であれば特に限定されない。投与対象がヒトであれば、通常は頭皮に投与されるが、投与対象が、動物の場合には全身または局所的に脱毛等が起きている場所に投与されることができる。
【0039】
例えば頭髪などの発毛において重要であり、ＦＧＦ−５が脱毛について関与している毛乳頭は、通常、皮膚の真皮質から皮下脂肪を含む皮下組織に存在するため、医薬品は、その付近の表皮を介して投与されることが好ましい。特に方法は限定されないが、軟膏、液剤、スプレー剤当の剤型をとるものについては表皮に直接塗布したり、また医薬品を塗布したシート剤、パッチ剤を貼付することにより投与したりすることが好ましい。また、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射等の注射投与によっても投与することができる。
【0040】
医薬品（ないしそこに含まれる有効成分）の１回あたりの投与量および投与回数は、患者の年齢、性別、症状、必要とされる治療効果の程度、投与方法、有効成分（核酸アプタマー等）の含有量などにより異なり、適宜調整されることができる。
【0041】
（添加剤）本発明に係る医薬品は、必要に応じて、薬学的に許容され得る添加剤を含んでいてもよい。
【0042】
薬学的に許容され得る添加剤とは、医薬品の目的に反しないものである限り特に限定されず、例えば、増粘剤、粘稠剤、乳化剤、希釈剤、抗酸化剤、亜硫酸塩等の安定剤（防腐剤）、着色剤などの添加剤等が挙げられ、また症状等によっては保湿剤、抗脂漏剤、血行促進剤等を含んでいてもよい。
【0043】
例えば、本発明の医薬品の剤形が塗布剤である場合、医薬品に含まれる有効成分の表皮から真皮あるいは皮下組織（毛乳頭）までの到達性を上昇させる観点から、粘稠剤や増粘剤を配合することにより、所望の粘度や有効成分含有濃度になるように、調製することが好ましい。
【0044】
また、動物に対して本発明の医薬品を投与する場合にはその動物種等によって皮膚の厚さや性質が異なることから、前記有効成分の濃度や添加剤の含有量を適宜調整することが好ましい。
【0045】
<医療用培地添加剤>本発明のアプタマーは、植毛用に頭皮から分離された毛包の維持用培地に添加することができる。また、再生医療の分野でｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、幹細胞等から分化した細胞、あるいは生体から分離した毛乳頭等の通常細胞を使用して再構成した毛包用の培地としても使用できる。添加量としては特に限定されず、用いる培地または細胞によって適宜選択することができる。前記培地も動物細胞培養用培地であれば特に限定されることはなく、また、血清や抗生物質、成長・増殖に関わる因子等をさらに適宜含んだものであってもよい。
【実施例】
【0046】
次に本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこのような実施例にのみによって限定されるものではない。なお特にことわらない限り、「％」は、「質量％」を意味する。
【0047】
［作製例１］＜水溶性ＦＧＦ−５タンパク質（ｇｐｈｍ−ｈＦＧＦ−５（２１−２４２）−Ｈｉｓ）の調製＞
ＧＲＰ−ｔａｇおよびＨｉｓ−ｔａｇが結合したＦＧＦ−５タンパク質（ＧＲＰ−３Ｃ−ｈＦＧＦ−５（２１−２４２）−Ｈｉｓ）を作製し、さらにＧＲＰ−ｔａｇを外すことで水溶性の高いＦＧＦ−５タンパク質である、ｇｐｈｍ−ｈＦＧＦ−５（２１−２４２）−Ｈｉｓを調製した。
具体的にはＧＲＰ−３Ｃ−ｈＦＧＦ−５（２１−２４２）−Ｈｉｓの発現プラスミドを構築し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳにおいて発現させ、Ｎｉキレートアフィニティクロマトグラフィーおよびヘパリンアフィニティカラムクロマトグラフィーにより、Ｈｉｓ−ｔａｇを有する水溶性ＦＧＦ−５タンパク質を調製し、その後ＧＲＰ−ｔａｇを外すことにより調製を行った。詳細を以下に示す。
【0048】
Inoue et al.,Gene, 96, p23-128, 1990の手法により、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（株式会社バイオダイナミクス研究所、品番：ＤＳ２６０）をプラスミドpET-GRP-3C-hＦＧＦ−５ (21-242)-His（Merck社、品番： ６９７４２−３ＣＮ）により形質転換した大腸菌コロニーを、２×ＹＴ培地（５０μｇ／ｍＬ カルベニシリン二ナトリウム塩（ナカライテスク社、品番：０７１２９−０１）および３４μｇ／ｍＬ クロラムフェニコール（ナカライテスク社、品番：０８０２７−１４）、ならびに１６ｍｇ／ｍｌ トリプシン（ナカライテスク社、品番：３５６４０−９５）、１０ｍｇ／１ｍｌ Extract Yeast Dried （ナカライテスク社、品番：１５８３８−４５）、５ｍｇ／１ｍｌ 塩化ナトリウム（和光純薬工業社、品番１９１−０１６６５）を含有したもの）１０ｍＬ中に直接加え、３７℃、１７０ｒｐｍの条件下で１３時間振とう培養を行った。この培養液８５０μＬにグリセロール１５０μＬを加えて混和後、グリセロールストックとして−８５℃で保存した。
【0049】
前記グリセロールストック０．０１ｍＬを、２×ＹＴ培地１０ｍＬ（５０μｇ／ｍＬ カルベニシリン二ナトリウム塩および３４μｇ／ｍＬ クロラムフェニコールを含有したもの）に加え、３７℃、１７０ｒｐｍの条件下で１３時間振とう培養を行なうことで前培養液を作製した。この前培養液を１，６８０ｇ、２５℃、１０分間遠心し、得られた菌体を当該組成の２×ＹＴ培地１Ｌに植菌した。これをさらに３７℃、１２０ｒｐｍ、２時間振とう培養を行った後、１時間で培養温度を１６℃まで低下させた。ここに、０．１Ｍ イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、ナカライ社、品番１９７４２−９４）１ｍＬを添加し（終濃度０．１ｍＭ）、１６℃、１２０ｒｐｍ、２４時間振とう培養を行うことで、組換えタンパク質（ＧＲＰ−３Ｃ−ｈＦＧＦ−５（２１−２４２）−Ｈｉｓ）の発現誘導をおこなった。培養後の培養液を、８０００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心することで菌体を回収し、−８０℃で凍結保存した。
【0050】
上記凍結した菌体１ｇあたり、Ｎｉ−ＮＴＡ洗浄バッファー（３．６ｍＬ、２５ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、Benzonase （登録商標）nuclease (SIGMA-ALDRICH社、品番: Ｅ−１０１４）、５０ｍＭ ｐＨ８．０ リン酸ナトリウムバッファー、３００ｍＭ 塩化ナトリウム、および２０ｍＭ イミダゾールを含有) に懸濁し、３０分間氷冷した後、２１Ｇ ニードルを２回通過させた。この懸濁液に、さらに１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有させたＮｉ−ＮＴＡ 洗浄バッファーを菌体１ｇあたり０．４ｍＬ加え、３０分間氷冷した後、２１Ｇ ニードルを４回通過させた。この菌体破砕液を１８０００ｒｐｍ、４℃、３０分間遠心し,
得られた上清をMinisart（登録商標） NML Plusメンブレンフィルター (Sartorius社,
品番：１７８２９Ｋ）でろ過した。
【0051】
前記濾液を金属キレートアフィニティゲル担体カラム Ni-NTA superflow (QIAGEN社、品番:３０４１０） (直径１０ｍｍ×長さ１００ｍｍ、自作カラム) に流速２ｍＬ／ｍｉｎで添加し、Ｎｉ−ＮＴＡ Ｌｙｓｉｓ バッファー（５０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ８．０ ３００ｍＭ 塩化ナトリウム ８０ｍＬ）で洗浄した。その後、２０カラム容量の０−５００ｍＭ イミダゾール含有Ｎｉ−ＮＴＡ Ｌｙｓｉｓ バッファーによるリニアグラジエント法を用いて、タンパク質（ＧＲＰ−３Ｃ−ｈＦＧＦ−５ （２１−２４２）−Ｈｉｓ）を溶出した。
【0052】
ＧＲＰ−３Ｃ−ｈＦＧＦ−５（２１−２４２）−Ｈｉｓタンパク質を含む画分を、ヘパリン担体カラムＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ ＨＰ(ベッド容量５ｍＬ）に流速２ｍＬ／ｍｉｎで添加し、その後、カラムを２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ バッファーｐＨ７．５ ５０ｍＬで洗浄した。引き続き、２０カラム容量の０〜３Ｍ 塩化ナトリウム含有２０ｍＭ Hepes-NaOH バッファー ｐＨ ７．５によるリニアグラジエント法を用いて、カラムに吸着していたＧＲＰ−３Ｃ−ｈＦＧＦ−５（２１−２４２）−Ｈｉｓを溶出した。溶出画分を、限外ろ過フィルター Amicon ultra 4 (分画分子量3000)(Merck Millipore Ltd.社、品番: UFC800324) により３０００ｇ、４℃遠心し，１．２ｍＬまで濃縮した。そのうち０．６ｍＬを、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨバッファーおよびｐＨ ７．５ １Ｍ 塩化ナトリウムで平衡化したゲルろ過カラムSuperdex 75 10/300GL (GE Healthcare社、品番: 17-5174-01）に添加して精製した。分取された単一ピーク画分を、精製されたＧＲＰ−３Ｃ−ｈＦＧＦ−５（２１−２４２）−Ｈｉｓタンパク質を含む画分として取得した。
【0053】
前記溶出画分に、Ni-NTA Lysis バッファーに懸濁した５０％（ｖ／ｖ）カードランビーズ（ビーズ直径：７５〜１５０μｍ、自作）８ｍＬを添加後、４℃、１時間転倒混和することで、ＧＲＰ−３Ｃ−ｈＦＧＦ−５（２１−２４２）−Ｈｉｓをカードランビーズに吸着させた。吸着後のカードランビーズは１、０００ｇ、４℃、２分間の遠心により回収した。回収したビーズをＮｉ−ＮＴＡ洗浄バッファー８０ｍＬで洗浄後、さらにＮｉ−ＮＴＡ洗浄バッファー２０ｍＬおよびＧＳＴ−ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ０．２ｍＬを添加し、４℃、３５時間転倒混和することでＧＲＰ−ｔａｇを切断し、ｇｐｈｍ−ｈＦＧＦ−５（２１−２４２）−Ｈｉｓを取得した。１０００ｇ、４℃、２分間の遠心によって得られた上清を回収し、残ったビーズにさらにＮｉ−ＮＴＡ 洗浄バッファー ２０ｍＬを加えて転倒混和後、再び１０００ｇ、４℃、２分間の遠心によって得られた上清を、先の上清と合わせ、Minisart NML Plusメンブレンフィルターで濾過した。前記濾液をＧＲＰ−３Ｃ−ｈＦＧＦ−５（２１−２４２）−Ｈｉｓ画分を取得した際と同様の操作で、HiTrap Heparin HPカラムによるヘパリンアフィニティークロマトグラフィーおよびSuperdex 75 10/300GLカラムによるゲルろ過を行い、分取された単一ピーク画分を、精製されたｇｐｈｍ−ｈＦＧＦ−５（２１−２４２）−Ｈｉｓとして取得し、これを本実験例における水溶性ＦＧＦ−５タンパク質とした。
【0054】
［実験例１］＜水溶性ＦＧＦ−５の活性確認＞
ＦＧＦ−５に対して増殖応答性のあるＦＲ−Ｂａ／Ｆ３細胞(細胞表面にｈＦＧＦＲ１を有する)を用いて、ＦＧＦ−５の添加効果を用量依存性（dose-dependence）の見地から検討した。
１０％ウシ胎児血清および抗生物質(Ｇ４１８)を含むＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁したＦＲ−Ｂａ／Ｆ３細胞を、９６穴培養用プレートに１００００細胞／ウェルで播き換え、５μｇ／ｍｌのヘパリン（シグマ・アルドリッチ社製）ならびに所定の濃度に希釈したＦＧＦ−５を含むＲＰＭＩ１６４０（富士フィルム和光純薬株式社製）培地で各ウェルの容量を１００μｌとし、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で３日間培養した。その後、各ウェルにＷＳＴ−８セルカウントキット（同仁化学社製）を添加し、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で２時間培養して発色後、マイクロプレートリーダー（４５０ｎｍ）を用いて吸光度を測定し細胞増殖の様子を調べた。その結果を図１に示す。上述した手法により作成した水溶性ＦＧＦ−５（グラフ内１：ｇｐｈｍ−ｈＦＧＦ−５）は本研究分野で標準的なＦＧＦ−５試薬として用いられているＲ＆Ｄ社で市販されているＦＧＦ−５（グラフ内３）に比較して有意に活性が高く、オリエンタル酵母工業株式会社にて委託製造されたＦＧＦ−５試薬（グラフ内４）と同程度の活性があった。
【0055】
［作製例２］＜核酸アプタマーのスクリーニング＞
作製例１で調製したＨｉｓタグを有する水溶性ＦＧＦ−５タンパク質であるｇｐｈｍ−ｈＦＧＦ−５（２１−２４２）−Ｈｉｓ、およびランダムなＤＮＡ配列のライブラリを用いて、以下の手法によるＳＥＬＥＸ法により核酸アプタマーのスクリーニングを行った。
鋳型ＤＮＡ (株式会社ジーンデザインに合成依頼）として、５’−ＧＧＧＴＧＴＴＡＧＣＴＧＴＴＡＧＴＡＴＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＧＴＡＣＧＡＴＣＡＧＣＴＡＧＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ−３’（Ｎは任意の塩基）を用い、フォワードプライマー：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＡＧＣＴＧＡＴＣＧＴＡＣＣ−３’およびリバースプライマー：５’−ＧＧＧＴＧＴＴＡＧＣＴＧＴＴＡＧＴＡＴＣ−３’（北海道システムサイエンス社）ならびに２’−Ｆ修飾したＵＴＰとＣＴＰおよび天然型ＡＴＰとＧＴＰを用いて、変異型Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼにより３７℃で５時間転写することでＲＮＡプールを作成した。
【0056】
前記ＲＮＡプールと作製例１で調製したＨｉｓタグを有する水溶性ＦＧＦ−５タンパク質であるｇｐｈｍ−ｈＦＧＦ−５（２１−２４２）−Ｈｉｓが固定化された樹脂ビーズとをＳＥＬＥＸバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＣａＣｌ2、０．０５％ ＴＷＥＥＮ２０、１０％ グリセロール）中で２５℃、３０分反応させることで、ＲＮＡプールとＦＧＦ−５の結合を行った。この際、非特異的結合を抑える競合剤として，ＨｅｐａｒｉｎとＢＳＡを使用した。反応後、洗浄用バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＣａＣｌ2、０．０５％ ＴＷＥＥＮ２０、１０％ グリセロール）で非特異的に結合したＲＮＡを洗い流した。その後，溶出バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、６Ｍ 塩化グアニジニウム）でＦＧＦ−５と結合したＲＮＡをフェノールクロロホルム処理，エタノール沈殿により回収し、プライマー（北海道システムサイエンス社に合成依頼）としてフォワードプライマー:５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＡＧＣＴＧＡＴＣＧＴＡＣＣ−３’、リバースプライマー:５’−ＧＧＧＴＧＴＴＡＧＣＴＧＴＴＡＧＴＡＴＣ−３’を用いて，逆転写ＰＣＲを行い、ＤＮＡライブラリを再構築した。同様の操作を７回行い（前記樹脂ビーズとして２回目、４回目、および６回目の操作においてはTALON Magnetic Beads（クロンテック社）、１回目および５回目の操作においてはNi-NTA Agarose（株式会社キアゲン社）、３回目および７回目の操作においてはHis60 Ni Superflow Resin（クロンテック社）を用い、また、後半の洗浄バッファーには上記組成にさらに３Ｍ 尿素を加えたものを使用した）、６１個のクローンを得た。
【0057】
６１個のクローンの配列についてそれぞれシークエンス解析を行った。そのうち１５クローンがＦ−０２（配列番号１）の配列であることがわかった。さらに得られた６１個のクローンからＦ−０２と類似性のあるモチーフを有すること、配列の保存性および二次構造の予測に基づいたＦＧＦ−５との結合活性等の観点から、重要と思われる３７クローン（Ｆ−０２を含め１１配列）を抽出した。抽出した各アプタマー（Ｆ−０２（配列番号１）およびこれに類似するＦ−５８（配列番号２）、Ｆ−３３（配列番号３）、Ｆ−０５（配列番号４）およびこれに類似するＦ−０６（配列番号５）、Ｆ−１８（配列番号６）、Ｆ−１４（配列番号７）、Ｆ−１９（配列番号８）およびこれに類似するＦ−４６（配列番号９）、Ｆ−５２（配列番号１０）、ならびにＦ−３９（配列番号１１））の配列と出現頻度（Frequency）を図２に示す。四角で囲まれた塩基が共通配列（上述した配列Ａ〜Ｃ）である。Ｆ−５８とＦ−３３の二重下線はＦ−０２と異なる塩基、Ｆ−０６の二重下線はＦ−０５と異なる塩基、Ｆ−４６の二重下線はＦ−１９と異なる塩基を示す。また、それぞれの配列においてシトシンおよびウラシルがフッ素化されていることを明示した配列を図３に示す。該図においてＣ（Ｆ）はフッ素化したシトシンを、Ｕ（Ｆ）はフッ素化したウラシルを示す。
【0058】
Ｆ−０２（配列番号１）の鋳型ＤＮＡを北海道システムサイエンス社において短鎖化し、該短鎖化した鋳型ＤＮＡならびに２’−Ｆ修飾したＵＴＰとＣＴＰおよび天然型ＡＴＰとＧＴＰを用いて転写反応を行うことでＦ−０２を短鎖化したＦ−０２−５２（配列番号１３）、Ｆ−０２−４２（配列番号１４）、Ｆ−０２−４０（配列番号１５）、Ｆ−０２−５６（配列番号１６）を作成し、また同様の方法でＦ−１８を短鎖化したＦ−１８−５６（配列番号１７）を作成した。それぞれの配列を図４（Ａ）に示す。なお、実験例７において示されるように、Ｆ−０２−４０（配列番号１５）、Ｆ−０２−４２（配列番号１４）は本発明の効果は奏さないことから比較例として用いられる。また、それぞれの配列においてシトシンおよびウラシルがフッ素化されていることを明示した配列を図４（Ｂ）に示す。該図においてＣ（Ｆ）はフッ素化したシトシンを、Ｕ（Ｆ）はフッ素化したウラシルを示す。
【0059】
主なアプタマー、およびＦ−０２を短鎖化したＦ−０２−５２について、フリーツール「mfold」を用いた二次構造予測を図５に示す（（Ａ）Ｆ−０２（配列番号１）、（Ｂ）Ｆ−０５（配列番号４）、（Ｃ）Ｆ−１４（配列番号７）、（Ｄ）Ｆ−１８（配列番号６）、（Ｅ）Ｆ−１９（配列番号８）、（Ｆ）Ｆ−３９（配列番１１）、（Ｇ）Ｆ−５２（配列番号１０）、（Ｈ）Ｆ−０２−５２（配列番号１３））。また、前記配列Ｆ−０２および該配列を短鎖化したＦ−０２−５２（配列番号１３）について、千葉工業大学により行われた同配列の二次構造予測を図６に示す。
［実験例２］
【0060】
＜アプタマーと水溶性ＦＧＦ−５タンパク質との結合能＞Electrophoresis Mobility Shift Assay （ＥＭＳＡ）により核酸アプタマーのヒトＦＧＦ−５結合能の解析を試みた。作製例２で作製した０．３μＭの各アプタマーと作製例１で作製した水溶性ＦＧＦ−５をモル比１：１で混和し、ＳＥＬＥＸバッファー中で２５℃で３０分置いた後、１０％非変性ＰＡＧＥ（native PAGE）を行った。１００Ｖで４０分電気泳動を行った後、CYBR Goldで染色した。染色図を図７に示す。
前記共通配列（配列Ａ〜Ｃ）を持つアプタマーは（Ｆ−０２、Ｆ−０５、Ｆ−１４、Ｆ−１８、Ｆ−１９、Ｆ−３９、Ｆ−５２）、ＦＧＦ−５タンパク質を加えるとＦＧＦ−５タンパク質と結合することが確認されたが、共通配列を持たないアプタマー（Ｆ−５１）ではＦＧＦ−５タンパク質との結合は見られなかった。
また、得られたアプタマーのうち、特にＦ−０２、Ｆ−０５、Ｆ−１４およびＦ−１８がＦＧＦ−５と高い特異性で相互作用することがわかる。
【0061】
［実験例３］＜アプタマーＦ−０２と水溶性ＦＧＦ−５タンパク質との結合能-１＞
ＳＰＲシグナルを利用したBiacore（商標）システムである、BiacoreX（GE Healthcare社）を用いて、作製例１で作製したアプタマーであるＦ−０２とＦＧＦ−５との結合の評価を行った。
ストレプトアビジンが固定化されているセンサーチップにビオチンを付加したｐｏｌｙｄＴ（１６塩基）を固定化し、ＰＣＲにより作製したｐｏｌｙＡ（１６塩基）を付加したアプタマーを、前記センサーチップ上のｐｏｌｙｄＴに結合させることで、アプタマーをセンサーチップに固定した。
チップへの非特異的な結合を抑えるために４μｇ／ｍｌのヘパリンをＳＥＬＥＸバッファーと同様の組成のバッファーに加え、当該バッファーで１００ｎＭに調製したＦＧＦ−５をシステム内にインジェクションした。ＦＧＦ−５と、同量のＦ−０２またはランダムな配列を有するＲＮＡ（ＲＮＡプール）とを反応させて分子間相互作用量（Response unit価：RU）を計測した。その結果、Ｆ−０２とＦＧＦ−５とを反応させた結果においては、ＦＧＦ−５とＲＮＡプールとを反応させた場合に比べて、Response unit価は優位に高く、したがってＦＧＦ−５はＦ−０２と特異的に結合するということが判った。結果を図８に示す。
【0062】
［実験例４］＜アプタマーＦ−０２とＦＧＦファミリータンパク質との結合能-２＞
実験例３と同様の手法でアプタマーＦ−０２をセンサーチップに固定化し、１００ｎＭに調製したＦＧＦ−５、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、およびＦＧＦ−６(発明者作製またはＲ＆Ｄシステムズ社製)をそれぞれシステム内にインジェクションして、ＦＧＦ−５とＦ−０２、ＦＧＦ−１とＦ−０２、ＦＧＦ−２とＦ−０２、ＦＧＦ−４とＦ−０２、および、ＦＧＦ−６とＦ−０２との間の分子間相互作用量（Response unit価：RU）を計測した。その結果、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、および、ＦＧＦ−６を反応させた場合に比べて、ＦＧＦ−５を反応させたときのResponse unit価は有意に高く、したがってＦＧＦ−５はＦ−０２と特異的に結合する一方、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、および、ＦＧＦ−６はＦ−０２とは結合しないということが判った。結果を図９に示す。このうち、ＦＧＦ−４とＦＧＦ−６は、ＦＧＦ−５は同じサブファミリーに属しており、立体構造的に特に近いとされるこれらＦＧＦファミリータンパク質と比較しても、Ｆ−０２のＦＧＦ−５に対する特異性は高いことが判った。
【0063】
［実験例５］＜アプタマーＦ−０２と水溶性ＦＧＦ−５タンパク質との結合能-３＞
アプタマーＦ−０２について、水溶性ＦＧＦ−５との解離定数を求めた。実験例３と同様の手法でアプタマーＦ−０２をセンサーチップに固定化し、２．５〜２０ｎＭに調製したＦＧＦ−５をシステム内にインジェクションして、ＦＧＦ−５とＦ−０２の間の分子間相互作用量（Response unit価：RU）を計測した（図１０）。BiacoreXに付属のソフトウエアBIA evaluation を用いて，Langmuir (1:1)結合モードで解離定数を算出し、０．２８±０．０４ｎＭという値を得た。
【0064】
［実験例６］＜ＦＧＦ−５依存的細胞増殖への影響＞
ＦＧＦ−５はＦＧＦＲ１と結合して相互作用することで、ＦＧＦＲ１を発現している細胞を増殖させることが知られている。ＦＧＦＲ１を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞（マウス胎児線維芽細胞）を用いて、それぞれの核酸アプタマーによるＦＧＦ−５依存的細胞増殖阻害能を確認した。アプタマーの用量は希釈倍率を変えて少なくとも数点設定し、添加効果を用量依存性（dose-dependence）の観点から検討した。
【0065】
９６穴培養用プレートに、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を５０００細胞／ウェルで播き換え、１０％血清および抗生物質を含むＤ−ＭＥＭ培地中で３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下、１日培養した後、ウェル内の上清を除去し、１００μｌ／ウェルのＰＢＳで洗浄および除去した。５０ｎｇ／ｍｌのインスリン（富士フィルム和光純薬株式会社製）、５μｇ／ｍｌのヘパリン（シグマ・アルドリッチ社製、事前に２５ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液を調製）を含む無血清ＤＭＥＭ（富士フィルム和光純薬株式会社製）培地に、終濃度３ｎＭとなるようにＦＧＦ−５（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、事前に１００μｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液を調製）を添加し、さらに各濃度になるように各アプタマーを添加して、各ウェルの容量を１００μｌとした（コントロールとしては、ＦＧＦ−５およびヘパリンを含まないＰＢＳを添加した培地を用いた）。３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で２日間培養した後、各ウェルにＷＳＴ−８セルカウントキット（同仁化学社製）を添加し、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で２時間培養して発色後、マイクロプレートリーダー（４５０ｎｍ）を用いて吸光度を測定し細胞増殖について確認した。その結果を図１１に示す。ＦＧＦ−５を培地に添加していないコントロール（ＰＢＳ）ではいずれも細胞の増殖は見られない。一方、ＦＧＦ−５を培地に添加したもの（ＦＧＦ−５ ３ｎＭ）においては、Ｆ−０２、Ｆ−０５、Ｆ−１４、Ｆ−１８、Ｆ−１９、Ｆ−３９、およびＦ−５２のアプタマーによって、用量依存的に細胞が減少していることが確認されたが、共通配列を持たないアプタマー（Ｆ−５１）についてはＦＧＦ−５依存的細胞増殖におけるアプタマーの影響は観察できなかった。
したがって、これらの共通配列を有するアプタマーはＦＧＦ−５に結合することでＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖を阻害していることが推測される。
【0066】
表１は上記実験による各アプタマーの性能をまとめたものあり、ここでＩＣ50（５０％阻害濃度）とは、アプタマー無添加時の５０％まで細胞増殖を阻害するときのアプタマー濃度を示す。上記共通配列（配列Ａ〜Ｃ）を持つアプタマー（Ｆ−０２、Ｆ−０５、Ｆ−１４、Ｆ−１８、Ｆ−１９、Ｆ−３９、Ｆ−５２）はいずれもＩＣ50値は１０ｎＭ以下という、低い濃度で細胞増殖阻害効果があることが明らかとなった（表１中欄）。また、表１右欄はＩＣ50（モル濃度）をＦＧＦ−５モル濃度で割った値を示している。比較的ＦＧＦ−５との結合能が弱いＦ−１９およびＦ−３９（実験例２および図７参照）を除いたアプタマーについてはいずれも当該数値は２〜３という小さな値を示しており、ＦＧＦ−５と各アプタマーとの良好な結合状態を示唆している。ここまでの結果から、細胞増殖阻害効果を示すアプタマーはＦＧＦ−５と結合することで、ＦＧＦ−５とその受容体であるＦＧＦＲ１との結合を阻害することで細胞増殖阻害効果を示すということが示唆される。
【表2】
【0067】
［比較例１］＜ランダムアプタマーによるＦＧＦ−５依存的細胞増殖への影響＞
ランダムな核酸配列を有するＲＮＡアプタマー（ランダムアプタマー）による、ＦＧＦ−２またはＦＧＦ−５依存的細胞増殖阻害能を確認した。ＦＧＦ−５試験区に加えて、ＦＧＦ−５と同様にＦＧＦＲ１と結合して相互作用することでＦＧＦＲ１を発現している細胞を増殖させることが知られているＦＧＦファミリータンパク質の一つであるＦＧＦ−２（終濃度０．１ｎＭ：Ｒ＆Ｄシステムズ社製、事前に１００μｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液を調製）試験区、および、ＦＧＦ−５およびＦＧＦ−２を含まないＰＢＳをコントロール試験区とし、実験例６で用いたアプタマーをランダムアプタマーに変えたこと以外は実験例６と同じ手法で細胞を培養し、ＦＧＦ−２またはＦＧＦ−５依存的細胞増殖度を測定した。結果を図１２に示す。
その結果、ランダムアプタマーの量に関わらず、ＦＧＦ−２またはＦＧＦ−５依存的細胞増殖度に影響はなく、したがって、ランダムアプタマーではＦＧＦ−２またはＦＧＦ−５依存的細胞増殖の阻害は引き起こされないことが示唆された。
【0068】
［比較例２］＜ＦＧＦ−２依存的細胞増殖阻害への影響＞
上述したようにＦＧＦファミリータンパク質の一つであるＦＧＦ−２もＦＧＦＲ１と結合して相互作用することで、ＦＧＦＲ１を発現している細胞を増殖させることが知られている。
ＦＧＦ−５の代わりにＦＧＦ−２（終濃度０．１ｎＭ：Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を用いる他は実験例６と同じ手法で細胞を培養し、ＦＧＦ−２依存的細胞増殖度を測定した。
その結果、アプタマーの有無に関わらず、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖度に影響はなく、したがって、各核酸アプタマーによるＦＧＦ−２依存的細胞増殖の阻害は観察されなかった（図１３）。
【0069】
［比較例３］＜ＦＧＦ−１依存的細胞増殖阻害への影響＞
ＦＧＦファミリータンパク質の一つであるＦＧＦ−１も、ＦＧＦ−５やＦＧＦ−２と同様にＦＧＦＲ１と結合して相互作用することで、ＦＧＦＲ１を発現している細胞を増殖させることが知られている。アプタマーＦ−０２による、ＦＧＦ−１依存的細胞増殖能を確認した。
ＦＧＦ−５（終濃度３ｎＭ：Ｒ＆Ｄシステムズ社製）またはＦＧＦ−１（終濃度０．１ｎＭ：Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を用いて、実験例６と同様と同じ手法で細胞を培養し、細胞増殖度を測定した。その結果、実験例６と同様に、Ｆ−０２はＦＧＦ−５依存的細胞増殖を阻害していることが確認できたが、ＦＧＦ−１依存的細胞増殖は阻害しなかった（図１４）。
以上、実験例６および比較例２および３の結果から、Ｆ−０２はＦＧＦ−５依存的細胞増殖能を阻害する一方で、ＦＧＦ−５と共通の受容体と相互作用するＦＧＦ−２およびＦＧＦ−１依存的細胞増殖は阻害しないということが判り、ここから、アプタマーＦ−０２はＦＧＦ−５と特異的に結合することが示唆される。
【0070】
［実験例７］＜短鎖化アプタマーによるＦＧＦ−５依存的細胞増殖阻害への影響＞
さらに、核酸アプタマーを短鎖化したものを用いて同様の実験を行い、ＦＧＦ−５依存的細胞増殖阻害能が維持されるかどうかを確認した。
Ｆ−０２（配列番号１）およびＦ−１８（配列番号６）の鋳型ＤＮＡを北海道システムサイエンス社において短鎖化し、該短鎖化した鋳型ＤＮＡを用いて転写反応を行うことで、短鎖化したアプタマーＦ−０２−４０（配列番号１５）、Ｆ−０２−４２（配列番号１４）、Ｆ−０２−５２（配列番号１３）、Ｆ−０２−５６（配列番号１６）、Ｆ−１８−５６（配列番号１７））を調製した。なお、いずれの短鎖化アプタマーも共通配列Ａ〜Ｃを有していることが確認された。これらを用いてＦＧＦ−５（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）との結合能について調べたところ、Ｆ−０２−４０（配列番号１５）、Ｆ−０２−４２（配列番号１４）のみＦＧＦ−５との結合が確認できなかった。さらに各アプタマーについてＦＧＦ−５依存的細胞増殖阻害能を調べた結果、Ｆ−０２−４０（配列番号１５）、Ｆ−０２−４２（配列番号１４）に関しては、ＦＧＦ−５依存的細胞増殖阻害はなかったが、F−０２−５２（配列番号１３）、Ｆ−０２−５６（配列番号１６）、Ｆ１８−５６（配列番号１７）にはＦＧＦ−５依存的細胞増殖阻害能があった（図１５）。したがってＦＧＦ−５との結合がＦＧＦ−５依存的細胞増殖阻害能にとって必要だといえる。また、Ｆ−０２−４０（配列番号１５）、Ｆ−０２−４２（配列番号１４）が共通配列を有しているにも関わらずＦＧＦ−５との結合およびＦＧＦ−５依存的細胞増殖阻害能が確認できなかった理由としては、当該配列が他のアプタマーよりも短いため、ＦＧＦ−５との結合に必要な構造をとれず、その結果ＦＧＦ−５依存的細胞増殖阻害能を奏し得なかったのではないかと推測できる。
【0071】
［実験例８］＜毛乳頭細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）発現解析＞
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）は毛包で発現する毛包誘導マーカーであり、発毛誘導能を含む毛乳頭細胞の活性の指標となることが知られている。
１２穴培養用プレートに、ヒト毛乳頭細胞(Human Follicle Dermal Papilla Cells（HFDPC細胞）：PromoCell社製)を５００００細胞／ウェルで播き、１０％ウシ胎児血清、２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３a、および抗生物質（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を含むＤ−ＭＥＭ培地中で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下、培養した。３日後、ウェル内の培養上清を除去し、１ｍｌ／ウェルのＰＢＳを用いて洗浄しＰＢＳを除去した。
これに２％ Ｂ−２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ社製）、５μｇ／ｍｌのヘパリン（シグマ・アルドリッチ社製）を含むＤ−ＭＥＭ（富士フィルム和光純薬株式会社製）培地で終濃度３ｎＭになるように希釈したＦＧＦ−５タンパク質（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）、または、２％Ｂ−２７サプリメントを含むＤ−ＭＥＭ培地で希釈したＰＢＳ(ＦＧＦ−５タンパク質のベヒクル)を添加した。
【0072】
各ウェルに２％ Ｂ−２７サプリメントを含むＤ−ＭＥＭ培地で終濃度１０ｎＭになるように希釈したアプタマーＦ−０２（実施例）、２％Ｂ−２７サプリメントを含むＤ−ＭＥＭ培地で希釈したＰＢＳ(無添加区)、および２％Ｂ−２７サプリメントを含むＤ−ＭＥＭ培地で終濃度１０ｎＭに希釈したＲａｎｄｏｍ Ａｐｔａｍｅｒ(参考例)をそれぞれ添加して各ウェルの容量を１ｍｌとし、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で３日間培養した。その後、各ウェル内の培養上清を除去し、１ｍＬ／ウェルのＰＢＳで洗浄しＰＢＳを除去した。
【0073】
各ウェル内に接着したヒト毛乳頭細胞からＲｎｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてＲＮＡを抽出した。さらに抽出したＲＮＡをＲｉｖｅｒＴｒａＡｃｅ‐α‐（東洋紡社製）を用いて逆転写しｃＤＮＡを得た。得られた各ｃＤＮＡについて定量ＰＣＲを行い、ＡＬＰ遺伝子に対するＣｙｃｌｉｃ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（Ｃｔ）値をもとめた。このとき併せてハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンのＣｔ値をもとめ、両者のＣｔ値を用いてΔΔＣｔ法によりＡＬＰ遺伝子転写量の相対定量値を算出した。その結果を図１６に示す。
【0074】
無添加区および参考例においてはＦＧＦ−５を添加することによってＡＬＰの転写量は有意に減少したが、アプタマーＦ−０２を加えた細胞についてはＡＬＰの転写量に変化は見られなかった。このことはアプタマーＦ−０２がＦＧＦ−５の活性を抑制することで、ＦＧＦ−５によるＡＬＰの転写抑制が抑えられることを示しており、ＦＧＦ−５の存在下においても毛乳頭細胞が活性し得ることを示唆している。
【0075】
（考察）上述したように、ＦＧＦ−５タンパク質はその受容体であるＦＧＦＲ１を介して、毛の成長を阻害し、ヘアサイクルを成長期から退行期へ移行させる作用を有していることが知られていた。
本発明のアプタマーはＦＧＦ−５に対して特異的に結合することで、ＦＧＦ−５とＦＧＦＲ１との結合を阻害することが明らかになった。その結果、本発明のアプタマーはＦＧＦ−５とＦＧＦＲ１との間のシグナル伝達を抑制することができ、その結果毛周期の成長期を継続させることで、脱毛抑制効果を奏することが期待できる。実際にアプタマーＦ−０２を加えた毛乳頭細胞を用いた実験においては毛包で発現する毛包誘導マーカーであるＡＬＰのＦＧＦ−５による発現抑制を抑える効果が示唆されていることから、当該アプタマーについての脱毛抑制効果はさらに強く示唆される。また、各アプタマーについて、短鎖化を行うことで、より脱毛抑制について好適化されたアプタマーを取得することができることから、該アプタマーを含有する育毛活性剤、育毛剤組成物、および医薬品などの開発に応用することが期待できる。
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]