特開 2021-56045 新規大腸がんマーカー及び可溶型ＯＸ４０を標的とする新規大腸がん治療薬

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2021-56045(P2021-56045A)

(43)【公開日】2021年4月8日

(54)【発明の名称】新規大腸がんマーカー及び可溶型ＯＸ４０を標的とする新規大腸がん治療薬

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/574 20060101AFI20210312BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20210312BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20210312BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20210312BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20210312BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210312BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210312BHJP

   C07K 14/705 20060101ALN20210312BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20210312BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/574 A

   G01N33/543 545A

   A61K45/00

   A61K39/395 D

   A61P1/04

   A61P35/00

   A61P43/00 111

   C07K14/705ZNA

   C07K16/28

【審査請求】未請求

【請求項の数】14

【出願形態】ＯＬ

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2019-177916(P2019-177916)

(22)【出願日】2019年9月27日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 令和１年９月６日にＯｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓウェブサイトにて発表

(71)【出願人】

【識別番号】501083643

【氏名又は名称】学校法人慈恵大学

(74)【代理人】

【識別番号】110002860

【氏名又は名称】特許業務法人秀和特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】本間 定

(72)【発明者】

【氏名】猿田 雅之

(72)【発明者】

【氏名】澤田 亮一

(72)【発明者】

【氏名】荒井 吉則

【テーマコード（参考）】

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA17

4C084NA14

4C084ZA661

4C084ZB261

4C084ZC411

4C085AA13

4C085EE01

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA75

4H045EA20

4H045EA50

(57)【要約】

【課題】本発明は、大腸がん診断のための新規マーカー及び新規大腸がん治療薬を提供することを課題とする。
【解決手段】大腸がん患者の血液中に可溶型ＯＸ４０タンパク質が存在すること、血液中に局在する可溶型ＯＸ４０タンパク質を高精度な大腸がん診断のためのマーカーとして使用できること、大腸がん患者の血液中の可溶型ＯＸ４０タンパク質を定量することによって、大腸がんの予後を予測できることを見出し、さらに血液中に局在する可溶型ＯＸ４０タンパク質を捕捉することによって、大腸がんの治療効果を導くことができることを見出した。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

被検対象由来の体液試料における可溶型ＯＸ４０タンパク質の量を測定する工程を含む、大腸がん診断のためのデータ取得方法。

【請求項2】

前記体液試料が、血液である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記大腸がんが、進行性大腸がんである、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記測定が、免疫測定法による測定である、請求項１〜３の何れかに記載の方法。

【請求項5】

前記免疫測定法が、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）法である、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記診断が、体液試料における可溶型ＯＸ４０タンパク質の量が健常者におけるレベルより高い場合に大腸がんに罹患している可能性が高いという基準により、大腸がんを診断するためのものである、請求項１〜５の何れかに記載の方法。

【請求項7】

前記診断が、予後の診断である、請求項１〜６の何れかに記載の方法。

【請求項8】

前記予後の診断が、体液試料における可溶型ＯＸ４０タンパク質の量が基準値よりも高い場合に大腸がんの予後が悪いと予測するものである、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

血液中の可溶型ＯＸ４０タンパク質の量を測定する試薬を含む、大腸がん診断用キット。

【請求項10】

前記試薬が、少なくとも抗可溶型ＯＸ４０抗体を含む、請求項９に記載のキット。

【請求項11】

血液中の可溶型ＯＸ４０タンパク質のがんマーカーとしての使用。

【請求項12】

血液中の可溶型ＯＸ４０タンパク質の捕捉剤を含む、大腸がん細胞治療薬。

【請求項13】

前記捕捉剤が、抗可溶型ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはＯＸ４０タンパク質のリガンドを含む捕捉剤である、請求項１２に記載の大腸がん治療薬。

【請求項14】

前記捕捉剤が、可溶型ＯＸ４０タンパク質の吸着剤である、請求項１２または１３に記載の大腸がん治療薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規大腸がんマーカー及び可溶型ＯＸ４０を標的とする新規大腸がん治療薬に関する。

【背景技術】

【0002】

抗腫瘍免疫応答は、免疫刺激ネットワークと免疫抑制ネットワークとの間のわずかなバランスの変化によって、増強したり、減衰したりする。Ｔ細胞が仲介する抗腫瘍免疫応答は、共刺激又は共阻害免疫チェックポイント分子によって調節されることが分かっている（非特許文献１）。

【0003】

このような免疫チェックポイント分子の１つにＯＸ４０（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ ４）がある。ＯＸ４０は腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーに属する分子であり、Ｔ細胞上に発現している分子であり、ＣＤ１３４とも呼ばれる。一方で、ＯＸ４０リガンドは抗原提示細胞上に発現しており、Ｔ細胞上のＯＸ４０と抗原提示細胞上のＯＸ４０リガンドとが結合することによって、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞が増殖し、初期免疫応答に効果があること（非特許文献２、３）及び誘導性制御性Ｔ細胞の産生を減少させること（非特許文献４）が分かっている。

【0004】

近年、細胞が仲介する抗腫瘍免疫のエフェクター因子である腫瘍浸潤Ｔ細胞（ＴＩＬ）を測定することが、ステージＩＶの大腸がんを有する患者の化学療法の効果の予測マーカーとなり得ることが示唆されているが（非特許文献５）、大腸がんの診断、予後の予測、治療の面からはＴＩＬを測定するだけでは十分ではなく、さらなる診断マーカーや治療薬が望まれていた。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Curr Cancer Drug Targets, 2007, 7, 55-70

【非特許文献2】J Immunol, 2000, 165, 3043-3050

【非特許文献3】J Immunol, 2004, 172, 4821-4825

【非特許文献4】Blood, 2007, 110, 2501-2510

【非特許文献5】Eur J Cancer, 2015, 51, 2708-2717

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、大腸がん診断のための新規マーカー及び新規大腸がん治療薬を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、大腸がん患者の血液中に可溶型ＯＸ４０タンパク質が存在することを見出し、血液中に局在する可溶型ＯＸ４０タンパク質を高精度な大腸がん診断のためのマーカーとして使用できることを見出した。

【0008】

さらに、大腸がん患者の血液中の可溶型ＯＸ４０タンパク質を定量することによって、大腸がんの予後を予測できることを見出した。

【0009】

可溶型ＯＸ４０タンパク質が血液中に存在するレベルは、既知の腫瘍マーカーであるＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＲＰ及び可溶型ＰＤ−Ｌ１との間で正の相関を有すること、並びにアルブミン及び全生存率との間で負の相関を有することを見出し、さらに血液中に局在する可溶型ＯＸ４０タンパク質を捕捉することによって、Ｔ細胞による正常な抗がん免疫応答を回復させ、大腸がんの治療効果を導くことができることを見出した。

【0010】

上記のような知見に基づき、本発明を完成させた。

【0011】

すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］被検対象由来の体液試料における可溶型ＯＸ４０タンパク質の量を測定する工程を含む、大腸がん診断のためのデータ取得方法。
［２］前記体液試料が、血液である、［１］に記載の方法。
［３］前記大腸がんが、進行性大腸がんである、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記測定が、免疫測定法による測定である、［１］〜［３］の何れかに記載の方法。
［５］前記免疫測定法が、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）法である、［４］に記載の方法。
［６］前記診断が、体液試料における可溶型ＯＸ４０タンパク質の量が健常者におけるレベルより高い場合に大腸がんに罹患している可能性が高いという基準により、大腸がんを診断するためのものである、［１］〜［５］の何れかに記載の方法。
［７］前記診断が、予後の診断である、［１］〜［６］の何れかに記載の方法。
［８］前記予後の診断が、体液試料における可溶型ＯＸ４０タンパク質の量が基準値よりも高い場合に大腸がんの予後が悪いと予測するものである、［７］に記載の方法。
［９］血液中の可溶型ＯＸ４０タンパク質の量を測定する試薬を含む、大腸がん診断用キット。
［１０］前記試薬が、少なくとも抗可溶型ＯＸ４０抗体を含む、［９］に記載のキット。［１１］血液中の可溶型ＯＸ４０タンパク質のがんマーカーとしての使用。
［１２］血液中の可溶型ＯＸ４０タンパク質の捕捉剤を含む、大腸がん細胞治療薬。
［１３］前記捕捉剤が、抗可溶型ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはＯＸ４０タンパク質のリガンドを含む捕捉剤である、［１２］に記載の大腸がん治療薬。［１４］前記捕捉剤が、可溶型ＯＸ４０タンパク質の吸着剤である、［１２］または［１３］に記載の大腸がん治療薬。

【発明の効果】

【0012】

本発明により、大腸がん診断のための新規マーカー及び可溶型ＯＸ４０を標的とする新規大腸がん治療薬が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】健常成人及び大腸癌（以下、ＣＲＣとも言う）患者の血中の可溶型ＯＸ４０（以下、ｓＯＸ４０とも言う）値の分布を表す。マンホイットニーのＵ検定により統計的差異を決定した。

【図2】血中のｓＯＸ４０値とＣＲＣ患者の検査所見又は生存期間との相関関係を表す。

【図3】血中のｓＯＸ４０値に対応する全生存期間のカプラン・マイヤー曲線を表す。カプラン・マイヤー推定値を用いて生存期間解析を行った。ログランク検定によってＰ値を算出した。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明は、被検対象由来の体液試料における可溶型ＯＸ４０タンパク質の量を測定する工程を含む、大腸がん診断のためのデータ取得方法を提供する。

【0015】

被検対象とは、大腸がんを起こす可能性のある動物であれば何でもよいが、好ましくは哺乳類動物であり、さらに好ましくはヒトである。

【0016】

可溶型ＯＸ４０タンパク質は、被検対象の体液中に存在するＯＸ４０タンパク質のことである。可溶型ＯＸ４０タンパク質は、好ましくはＴ細胞に発現しているＯＸ４０タンパク質の細胞外領域部分のアミノ酸配列のみを含む。具体的には、可溶型ＯＸ４０タンパク質は、ヒトが被検対象の場合、配列番号１のアミノ酸番号１〜２１４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質が例示される。さらに可溶型ＯＸ４０タンパク質には、該タンパク質と同様の大腸がん関連性を有するタンパク質断片、類似体、及び変異体も包含される。
また、この配列番号１のアミノ酸番号１〜２１４で表されるアミノ酸配列において、１又は数個（例えば１〜２０個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質でもよい。また、被検対象として異なる動物を使用する場合は、該動物由来のホモログタンパク質が測定対象となる。

【0017】

体液試料は、血液、リンパ液、組織液、体腔液、脳脊髄液等が含まれる。可溶型ＯＸ４０タンパク質を測定するためには、血液試料であることが好ましく、血液試料中の、血清又は血漿を用いることがより好ましい。すなわち、血清又は血漿中に存在する可溶型ＯＸ４０タンパク質が大腸がんの診断等に使用し得る好適な指標となる。

【0018】

大腸がんは、大腸における疾患部位、病期、組織型分類等において、特に限定されることはなく、何れの疾患部位、病期、組織型分類等をも包含するものである。大腸がんは、進行性大腸がんであることが好ましい。
本発明において、進行性大腸がんとは、粘膜下層以深に浸潤した大腸がんのことをいう。

【0019】

可溶型ＯＸ４０タンパク質の測定法は、可溶型ＯＸ４０タンパク質を測定できる方法である限り特に限定されることはなく、公知のタンパク質測定方法が使用でき、例えば可溶型ＯＸ４０タンパク質に対する抗体を使用した免疫測定法が好適に使用できる。
免疫測定法は、酵素免疫定量法に従い定量検出する方法や、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法等で測定する方法等が好ましい。酵素免疫定量法は、標識イムノアッセイ法のうち、酵素を標識物質として用いる検出方法である。また、イムノソルベントを用いるＥＬＩＳＡ法を選択することが、特に好ましい。

【0020】

ＥＬＩＳＡ法とは、直接法、間接法、及びサンドイッチ法が例示されるが、何れの方法も使用することができる。

【0021】

ＥＬＩＳＡ法における直接法とは、当該分野に周知の手法を指す。すなわち、固相に固定化された体液試料中の可溶型ＯＸ４０タンパク質に、標識化された抗体を結合させて、標識物質を検出する手法である。

【0022】

ＥＬＩＳＡ法における間接法とは、当該分野に周知の手法を指す。すなわち、固相に固定化された体液試料中の可溶型ＯＸ４０タンパク質に、一次抗体を結合させて免疫複合体を固相表面上に形成させた後、さらに、一次抗体を認識する標識化二次抗体を用いて標識物質を検出する手法である。

【0023】

ＥＬＩＳＡ法におけるサンドイッチ法とは、当該分野に周知の手法を指す。すなわち、固相に固定化された固定化抗体（一次抗体）に、被検対象由来である体液試料中の可溶型ＯＸ４０タンパク質を捕捉させ、さらに捕捉された可溶型ＯＸ４０タンパク質に標識化された二次抗体を結合させて、前記二種類の抗体が結合した免疫複合体を固相表面上に形成
させた後、標識物質を検出する手法である。なお、標識化されていない二次抗体を用い、さらに二次抗体を認識する標識化三次抗体を用いて、検出感度を上げてもよい。
サンドイッチ法において、免疫複合体を形成させる順序は特に限定されない。固定化抗体に対して、可溶型ＯＸ４０タンパク質を含む体液試料、二次抗体の順で添加して結合させてもよいし、まず可溶型ＯＸ４０タンパク質を含む体液試料と二次抗体とを混合して複合体を形成させたものを固定化抗体に対して添加して結合させてもよい。

【0024】

ＥＬＩＳＡ法に用いる抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでもよいが、安定した品質の抗体を安定して供給するためには、モノクローナル抗体であることが好ましい。Ｆ（ａｂ’）_２などのモノクローナル抗体の断片でもよい。
また、各抗体は一般的に用いられているマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、トリ由来のもの等が使用できるがこれらに限定されず、可溶型ＯＸ４０タンパク質に特異的に結合する抗体であれば何れも使用できる。

【0025】

血漿等の試料中の可溶型ＯＸ４０タンパク質を測定するためには、可溶型ＯＸ４０タンパク質を認識できる抗体であれば、ＯＸ４０タンパク質のいかなるドメインを認識する抗体を使用してもよい。抗ＯＸ４０タンパク質抗体は、市販されているものを使用することもできるし、当業者に周知慣用のモノクローナル抗体作製方法により入手したものを使用してもよい。可溶型ＯＸ４０タンパク質を認識できる抗体としては、配列番号１のアミノ酸番号１〜２１４で表されるアミノ酸配列またはそのホモログ配列のいずれかの部分にエピトープを有する抗体が例示される。

【0026】

標識化二次抗体は、一次抗体を認識するものであれば特に限定されず使用できる。例えば、一次抗体がラビット抗体である場合は標識化抗ラビットＩｇＧ抗体を、一次抗体がマウス抗体である場合は標識化抗マウスＩｇＧ抗体を、二次抗体として用いることができる。

【0027】

標識物質は、酵素、放射線同位元素、蛍光物質、発光物質、金コロイド等が挙げられる。
これらのうち、感度及び操作の簡便さの観点から酵素が好ましく、西洋わさび過酸化酵素（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）等がより好ましい。標識物質としてＨＲＰを用いる場合はＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）等を、ＡＰを用いる場合はＡＭＰＰＤ（３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’’−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン・２ナトリウム塩）、９−（４−クロロフェニルチオホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチルアクリダン二ナトリウム塩等を基質として使用することができる。また、標識物質としては、他にＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙ
ａｎａｔｅ）、ローダミン等の蛍光色素等も使用することができる。

【0028】

測定対象物質の検出・定量方法は、標識の方法によって異なり、当業者に周知慣用の方法で行うことができ、特に限定されない。例えば、標識物質としてＨＲＰ、ＡＰ、ＧＯＤ等を用いた場合は、発色基質や発光基質を添加することで、吸光度や発光強度の変化を測定して測定対象物質を定量することができる。また、標識物質として蛍光物質を用いた場合は、その蛍光強度を測定することで測定対象物質を定量することができる。また、標識物質として放射性同位元素を用いた場合は、放射能を測定することで測定対象物質を定量することができる。また、標識物質として金コロイドを用いた場合は、吸光度を測定することで測定対象物質を定量することができる。
定量の際は、例えば、予め既知の濃度の試料で検量線（標準曲線）を作成しておき、測定値を検量線に照合して試料中の可溶型ＯＸ４０タンパク質濃度を算出することができる。

【0029】

固定化抗体を固定化する固相は、通常ＥＬＩＳＡ法に用いられるものであれば特に限定されず、その形態はマルチウェルプレート、シャーレ、微粒子等が挙げられ、またその素材はポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、磁性素材等が挙げられる。

【0030】

固定化抗体の固相への固定化量は、抗原−抗体反応及び標識物質の検出を妨げない限り、また体液試料中の可溶型ＯＸ４０タンパク質量に対して過度に少なくない限り、特に限定されない。
固定化抗体の固相への固定化後は非特異吸着を防ぐため、スキムミルク、アルブミン、カゼイン等で適宜ブロッキングしてもよい。

【0031】

二次抗体溶液の濃度は、抗原−抗体反応を妨げない限り、また体液試料中の可溶型ＯＸ４０タンパク質に対して過度に少なくない限り、特に限定されない。
本発明において、抗原−抗体反応を行う時間、本発明の方法を行う温度、試料や試薬の希釈液及び洗浄液の組成やｐＨ等は特に限定されず、一般的に行われるＥＬＩＳＡ法に適用する条件でよい。

【0032】

本発明の方法は、特に限定されることはないが、例えば、体液試料における可溶型ＯＸ４０タンパク質の量が健常者におけるレベルより高い場合に大腸がんに罹患している可能性が高いという基準により、大腸がんを診断するために用いる方法である。

【0033】

健常者とは、一般には、特定の慢性疾患を有していない者と定義される。本発明においては、該定義通りでの意味で用いられてもよいが、大腸がんを有していないが他の疾患は有している者の意味で用いられてもよい。

【0034】

可溶型ＯＸ４０タンパク質の量に関し、「レベル」とは、上記測定法による実際の測定値すなわち実測値でもよく、陰性対照の測定値等で補正した補正値でもよく、又は相対指数で補正したインデックス値等でもよい。これらは単なる例示に過ぎず、これらの値に限定されることはなく、他の値を採用することもできる。

【0035】

本発明の方法は、特に限定されることはないが、予後の診断のために用いる方法であってもよい。

【0036】

予後の診断は、特に限定されることはないが、例えば、体液試料における可溶型ＯＸ４０タンパク質の量が基準値よりも高い場合に大腸がんの予後が悪いと予測するものである。予後としては、生存率、がんのステージ進行などが挙げられる。
基準値は、特に限定されることはないが、測定対象とする体液試料ごとに統計学的手法により事前に求めることが好ましい。具体的には、体液試料として血漿を用いる場合には、例えば、１５０ｐｇ／ｍＬである。

【0037】

大腸がんの診断においては、他の大腸がんマーカーと組み合わせてもよい。

【0038】

可溶型ＯＸ４０タンパク質の測定結果をもとに大腸がんを診断することができ、その結果をもとに、治療方針を策定することができる。

【0039】

本発明の他の態様は、血液中の可溶型ＯＸ４０タンパク質の量を測定する試薬を含む、大腸がん診断用キットである。
血液中の可溶型ＯＸ４０タンパク質の量を測定する試薬としては、例えば、抗ＯＸ４０抗体のようなＯＸ４０タンパク質に特異的に結合する物質が挙げられる。

【0040】

キットは、反応用容器、反応用緩衝液、洗浄液、標準物質などが含まれてもよい。また、標識化二次抗体、標識が酵素である場合その基質、ＢＳＡ等のブロッキング剤等の試薬を含むこともでき、他の大腸がんマーカーを検出するための試薬を含んでもよい。さらに、手順や診断基準を記載した添付文書を含んでもよい。

【0041】

本発明の他の態様は、血液中の可溶型ＯＸ４０タンパク質のがんマーカーとしての使用である。ここでがんは大腸がんに限定されず、血液中の可溶型ＯＸ４０タンパク質が増加するがん全般に適用できる。

【0042】

本発明の他の態様は、血液中の可溶型ＯＸ４０タンパク質の捕捉剤を含む、大腸がん治療薬である。

【0043】

捕捉剤は、可溶型ＯＸ４０タンパク質を捕捉できるものであれば特に限定されないが、例えば、抗ＯＸ４０タンパク質抗体又はＯＸ４０タンパク質のリガンドが挙げられる。

【0044】

抗ＯＸ４０抗体は、可溶型ＯＸ４０タンパク質と結合できるものであれば特に限定されることはないが、可溶型ＯＸ４０タンパク質と結合して、可溶型ＯＸ４０タンパク質の作用を中和するものであることが好ましい。
ここで、可溶型ＯＸ４０タンパク質の作用とは、例えば、大腸がん細胞に対する作用であり、作用の中和とは、可溶型ＯＸ４０タンパク質が抗原提示細胞表面のＯＸ４０タンパク質リガンドに作用することにより、Ｔ細胞上に発現しているＯＸ４０タンパク質と抗原提示細胞上に発現するＯＸ４０タンパク質リガンドとの相互作用を阻害し、Ｔ細胞の正常な抗がん免疫作用を抑制するものである。
可溶型ＯＸ４０タンパク質を捕捉することで、Ｔ細胞の正常な抗がん免疫作用を回復させることができ、これにより、大腸がんなどのがん治療効果が期待できる。

【0045】

本発明において使用される抗ＯＸ４０抗体は、体液中、特に血液中に存在する可溶型ＯＸ４０を認識する抗体である限り、そのエピトープは特に制限されないが、好ましくはＴ細胞に発現しているＯＸ４０タンパク質の細胞外領域部分のアミノ酸配列を認識する抗体である。具体的には、配列番号１のアミノ酸番号１〜２１４に示すアミノ酸配列を認識する抗体が挙げられる。また配列番号１のアミノ酸番号１〜２１４に示すアミノ酸配列の一部のみを認識する抗体であってもよい。または、配列番号１のアミノ酸番号１〜２１４に示されるアミノ酸配列と、９５％以上、好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を認識する抗体でもよい。

【0046】

抗ＯＸ４０抗体は、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の何れでもよいが、治療効果の安定性の観点からモノクローナル抗体であることが好ましい。
さらにヒトの治療に用いるためには、抗原性の低くする観点から、抗ＯＸ４０抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体であることが好ましい。
抗ＯＸ４０抗体の完全ヒト抗体は、ヒト抗体を産生することのできる遺伝子改変マウス等を用いて、ＯＸ４０を抗原として免疫を行い、その遺伝子改変マウスから得られた抗ＯＸ４０抗体産生細胞を回収し、骨髄腫細胞と融合させ、抗ＯＸ４０抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択することによって、そのハイブリドーマ細胞の培養上清中から得ることができる。
また、抗ＯＸ４０抗体の完全ヒト抗体は、当業者に公知の方法であるファージディスプレイ法を用いることによっても作製することができる。

【0047】

抗原結合フラグメントとしては、抗原タンパク質であるＯＸ４０と結合することが出来る限り特に限定されることはないが、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦａｂ、ｓｃＦｖ、ジアボディ、トリアボディ又はミニボディが挙げられる。これらの抗
原結合フラグメントはいずれも、当業者に公知の遺伝子改変技術を利用することによって、産生することができる。

【0048】

抗体は、市販の抗体を使用してもよいが、当業者に公知の方法で作製した抗体を使用することもできる。
抗体を作成する方法は、例えば、モノクローナル抗体の場合、ＯＸ４０を抗原としてマウス等の動物に免疫を行い、ＯＸ４０抗原タンパク質に対する抗体を産生する細胞を回収し、回収した細胞を同種又は異種の骨髄腫細胞と融合させ、抗ＯＸ４０モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択することによって、そのハイブリドーマ細胞の培養上清中から得ることが出来る。
さらに、上記のハイブリドーマ細胞をさらに改変させることによって、キメラ抗体又はヒト化抗体を得ることが出来る。具体的には、例えば、上記のハイブリドーマ細胞から抽出した遺伝子において、当業者に公知の方法である遺伝子組換え技術によって、この遺伝子中のＦｃ領域をコードする部分を、ヒトのＦｃ領域をコードする遺伝子で置き換える等の操作をすることによって、目的の抗体を得ることができる。

【0049】

ＯＸ４０リガンドとしては、ＯＸ４０に結合してＯＸ４０からのシグナルを細胞内に伝達することのできる分子を意味し、例えば、非特許文献２や３に開示されている。ＯＸ４０リガンドはＯＸ４０を捕捉できるものであれば、部分断片を用いてもよい。

【0050】

可溶型ＯＸ４０タンパク質の吸着剤は、血液中の可溶型ＯＸ４０タンパク質を吸着させることができる限り特に限定されることはなく、生体内又は生体外のいずれで使用できるものであってもよい。例えば、生体外で可溶型ＯＸ４０タンパク質を吸着させるものとしては、血液を体外循環させることにより可溶型ＯＸ４０タンパク質を吸着除去する際に使用される可溶型ＯＸ４０タンパク質の吸着剤でもよい。体外循環において、吸着剤は、例えばフィルター膜又は吸着ビーズなどを使用することができる。
例えば、上記のような抗ＯＸ４０抗体やＯＸ４０リガンドを担体に固定化し、フィルターやビーズなどに付着させて用いることができる。

【0051】

本発明の他の態様は、生体内に投与できる成分を有効成分として含む、大腸がん治療薬である。

【0052】

本発明の大腸がん治療薬は、そのまま対象に投与することもできるが、他の有効成分や薬理学的に許容される担体と混合して対象に投与することもできる。

【0053】

大腸がん治療薬中の可溶型ＯＸ４０タンパク質の捕捉剤の含有量は、Ｔ細胞による正常な抗がん免疫応答を回復することができる限り、特に限定されることはない。例えば、１μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬとすることができる。

【0054】

本発明の大腸がん治療薬は、任意の剤形で製剤化されていてよい。例えば、液剤、懸濁剤、注射剤が挙げられるが、注射剤であることが好ましい。

【0055】

投与態様は、特に限定されないが、注射等により患部又はその周辺に局所投与すること又は静脈注射すること等が好ましい。

【0056】

他の有効成分としては、例えば、サイトカイン等の免疫賦活物質、化学療法剤等が挙げられる。これらの他の有効成分は、適宜、適量で用いる事ができる。

【0057】

薬理学的に許容される担体としては、例えば、溶剤、蒸留水、生理食塩水、希釈剤、界面活性剤、安定化剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、緩衝剤、保存剤等が挙げられる。
さらに、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、吸着剤、湿潤剤等の添加物を用いる事ができる。これらの担体は、適宜、適量で用いる事ができる。

【0058】

投与対象は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
大腸がん治療薬の投与量は、有効成分である可溶型ＯＸ４０タンパク質の捕捉剤が、Ｔ細胞による正常な抗がん免疫応答を回復させ、大腸がん治療効果を発揮する量であればよい。投与量は、投与対象の年齢、性別、体重、症状、治療効果、治療部位の面積、投与方法等に応じて適宜調節することが出来るが、例えば、約６０ｋｇの体重を有する平均的なヒトを対象とした場合、１日当たり０．０１ｍｇ〜５０００ｍｇ程度が好ましく、０．１ｍｇ〜５００ｍｇ程度がより好ましい。１日当たりの総投与量は、単一投与量であっても分割投与量であってもよい。

【0059】

治療効果に関しては、生体内での解析の場合は、大腸がん治療薬による処置を行った結果、大腸がん治療薬による処置を行う前と比較して又は大腸がん治療薬による処置を行わなかった対照と比較して、大腸がん細胞の増殖が抑制されたこと、大腸がん細胞が減少したこと、大腸がんの大きさが小さくなったこと等が確認できた場合に、治療効果があったと判断することができる。この時、解析方法は特に限定されることはなく、当業者に公知の方法で行うことができる。

【0060】

また、細胞生物学的解析の場合は、治療薬による処置後の検体と治療薬による処置前の検体とを比較することで、生体内での治療薬の治療効果を予測することができる。細胞生物学的解析としては、特に限定されることはないが、例えば細胞増殖アッセイ、細胞塊（スフェロイド）形成アッセイ、ウェスタンブロット法等が挙げられるが、当業者に公知の方法で行うことができる。

【実施例】

【0061】

実施例は、開示する目的のために記載されており、本発明の範囲を制限する意図はない。

【0062】

＜材料及び方法＞
患者
血液試料及び臨床情報を、東京慈恵会医科大学附属病院（日本、東京）において進行性ＣＲＣ又は術後再発性ＣＲＣと組織学的もしくは細胞学的に診断された２２名の患者から遡及的に採取した。生存期間は、血液試料採取から死亡又は最後の追跡観察までの期間として定義した。試験実施計画書は東京慈恵会医科大学の倫理委員会により認可され（３０−３９７ ９４１８）、ヘルシンキ宣言に従って実施された。

【0063】

試料採取、手順及び貯蔵
クエン酸ナトリウム（ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標） ＣＰＴ（商標）；ＢＤバイオサイエンス社）を含む細胞調製チューブに血液を採取し、室温にて２０分間６２０ｇで遠心分離した。血漿試料を−８０℃において１ｍｌアリコートで貯蔵した。末梢単核球（ＰＢＭＣ）を採取し、セルリザーバーワン（ナカライテスク社）を用いて冷凍貯蔵した。回収した血漿試料は適宜当業者に公知の方法により血清化した。

【0064】

ｓＯＸ４０の定量
製造元の指示書に従ってｓＯＸ４０（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）のためのＥＬＩＳＡキットを用いて血中ｓＯＸ４０濃度を測定した。定量範囲は１５．６〜１，０００ｐｇ／ｍｌであった。健常対象のｓＯＸ４０の血中値は７８．７±２８．５ｐｇ／ｍｌであった。各試料は二重に分析した。ジャーカット細胞の培養上清中のｓＯＸ４０量を同じＥＬＩＳＡアッセイキットを用いて決定した
。

【0065】

細胞培養
ジャーカット細胞（ヒトＴ細胞株）をアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手し、１０％ウシ胎仔血清、１００単位／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。ジャーカット細胞の活性化のためにホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート（ＰＭＡ；シグマアルドリッチ；Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）を使用した。

【0066】

フローサイトメトリー
フローサイトメトリーにより、細胞表面のＯＸ４０発現を調べた。ＰＭＡ未処置又はＰＭＡ処置したジャーカット細胞の懸濁液を、暗所において４℃、３０分間フィコエリトリン（ＰＥ）結合抗ヒトＯＸ４０（クローンＢｅｒ−Ａ ＣＴ３５；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｉｎｃ．）及び適切なアイソタイプコントロール（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｉｎｃ．）で染色した。ＭＡＣＳＱｕａｎｔｉｆｙソフトウェア バージョン２．０を用いて、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）で細胞を解析した。

【0067】

定量ＲＴ−ＰＣＲ
前述したように定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＩＬ−６（アッセイＩＤ：Ｈｓ００１７４１３１＿ｍ１）、ＩＬ-１０（アッセイＩＤ：Ｈｓ００９６１６２２＿ｍ１）、ＩＬ-４（アッセイＩＤ：Ｈｓ００１７４１２２＿ｍ１）、ＩＦＮ-γ（アッセイＩＤ：Ｈｓ００９
８９２９１＿ｍ１）、ＯＸ４０（アッセイＩＤ：Ｈｓ００９３７１９５＿ｇ１）及び１８ＳリボソームＲＮＡ（アッセイＩＤ：Ｈｓ９９９９９９０１＿ｓ１）遺伝子用ＴａｑＭａｎプライマーをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入した。ΔΔＣｑ法を用いて相対発現を算出した。

【0068】

統計解析
統計解析のためにソフトウェアパッケージＳｔａｔＦｌｅｘ（バージョン６；株式会社アーテック、日本、大阪）を使用した。ピアソンの相関係数を使用して、ＯＸ４０値と臨床的特徴との関連性を解析した。単変量及び多変量コックス比例ハザードモデルを行い、予後因子を得た。カプラン・マイヤー推定値を用いて生存期間解析を行った。ログランク検定に従ってＰ値を算出した。Ｐ＜０．０５の場合に統計的有意差があるとした。
ジャーカット細胞を用いた実験におけるＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリーのデータは、平均値±標準偏差（ＳＤ）として表した。ダネット多重比較検定により未処置コントロール及び薬剤処置群間の比較を行った。統計解析のために、ソフトウェアパッケージＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７バージョン（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用した。Ｐ値＜０．０５は、統計的有意差があるとした。

【0069】

＜実施例１：血中ｓＯＸ４０値は腫瘍マーカー及びＣＲＰの血中値と正に相関するが、アルブミンの血中値と負に相関する＞
表Ｉは、進行性ＣＲＣ患者２２名の特徴を示す。１２名の男性及び１０名の女性を検査対象とした。検査対象の年齢のメジアンは７１．５歳（２９歳〜８１歳）であった。９名の患者は初めてがんと診断され、残り１３名の患者は術後再発であった。２２名の患者のうち１８名はステージＩＶであり、２名はステージＩＩＩであり、２名はステージＩＩのＣＲＣであった。全患者は、テガフール・ウラシル配合剤（ＵＦＴ）又はシスプラチンベースの化学療法（術後補助（アジュバント）４名；初回１８名）を受けた。

【0070】

【表1】

【0071】

ＣＲＣ患者のｓＯＸ４０の血中値は健常成人の血中値より有意に高かった（図１）。健常成人の血中ｓＯＸ４０値のメジアン値は７１．０（ｎ＝１０）であり、ＣＲＣ患者では１５０．５（ｎ＝２２）であった。
患者の血中ｓＯＸ４０値と臨床的特徴との関連性を調査した。血中ｓＯＸ４０値は、臨床的特徴において生存期間と負に相関した（表ＩＩ及び図２）。検査所見では、血中ｓＯＸ４０値は、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＲＰ及びｓＰＤ−Ｌ１の血中値と正に相関し、血中アルブミン値と負に相関した（表ＩＩ及び図２）。

【0072】

【表2】

【0073】

＜実施例２：血中ｓＯＸ４０値は、ＰＢＭＣにおけるサイトカインまたはＰＤ−１の発現と相関しない＞
細胞ＯＸ４０は概して活性化免疫細胞上で発現することがこれまでに明らかになっている。したがって、Ｔ細胞免疫を正又は負に調節するサイトカインをコードするｍＲＮＡの発現を、血中ｓＯＸ４０値の関連性に関して検査した。血中ｓＯＸ４０値は、ＩＬ-６、
ＩＬ-１０、ＩＬ-４及びＩＦＮ-γをコードするｍＲＮＡ発現又はＩＬ-１０／ＩＦＮ-γ
比と相関しなかった（表ＩＩＩ）。Ｔ細胞上で発現されるＰＤ-１はＴ細胞活性化マーカ
ー又はＴ細胞疲弊マーカーであり、血中ｓＯＸ４０値は、ＰＤ−１発現免疫細胞の発生頻度と相関しなかった（表ＩＩＩ）。

【0074】

【表3】

【0075】

＜実施例３：血中ｓＯＸ４０値が高いことは、ＣＲＣ患者の生存期間減少と有意に相関する＞
ＣＲＣ患者の臨床因子の予後値を検査した。単変量及び多変量解析のどちらにおいても、血中ｓＯＸ４０値は患者の生存期間と負に相関すること、及び血中ｓＯＸ４０値が高いことが患者の生存期間減少と有意に相関することが示された（表ＩＶ）。他の因子に予後因子であることを示すものはなかった。図３は、ｓＯＸ４０の血中値に基づく患者の全生存期間のカプラン・マイヤー曲線を示す。血中ｓＯＸ４０値が≦１５０ｐｇ／ｍｌである患者は生存期間がより長かったが、血中ｓＯＸ４０値が＞１５０ｐｇ／ｍｌの患者は生存期間が有意に短いことを示した。

【0076】

【表4】

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]