特開 2021-8452 抗体精製プロセスにおけるプロテインＡクロマトグラフィーのための洗浄溶液の改善

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】特開2021-8452(P2021-8452A)

(43)【公開日】2021年1月28日

(54)【発明の名称】抗体精製プロセスにおけるプロテインＡクロマトグラフィーのための洗浄溶液の改善

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/22 20060101AFI20201225BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20201225BHJP

   A61P 25/04 20060101ALI20201225BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20201225BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20201225BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20201225BHJP

【ＦＩ】

   C07K1/22ZNA

   A61K39/395 N

   A61P25/04

   A61P29/00

   A61P19/02

   A61P35/00

【審査請求】未請求

【請求項の数】37

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2020-111174(P2020-111174)

(22)【出願日】2020年6月29日

(31)【優先権主張番号】62/869,093

(32)【優先日】2019年7月1日

(33)【優先権主張国】US

(71)【出願人】

【識別番号】593141953

【氏名又は名称】ファイザー・インク

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100120112

【弁理士】

【氏名又は名称】中西 基晴

(74)【代理人】

【識別番号】100135415

【弁理士】

【氏名又は名称】中濱 明子

(72)【発明者】

【氏名】ラッセル・イアン・シュプリッツァー

【テーマコード（参考）】

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C085AA14

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG02

4C085GG04

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045DA75

4H045GA26

(57)【要約】      （修正有）

【課題】プロテインＡクロマトグラフィー工程を含む治療用タンパク質の精製のためのプロセス（方法）の提供。
【解決手段】治療用タンパク質のための精製プロセスのプロテインＡクロマトグラフィー工程における、リパーゼの除去を強化するための、プロテインＡクロマトグラフィー媒体のための洗浄溶液であるＣａＣｌ_２を含む溶液の使用であって、該治療用タンパク質を含むローディング溶液が、プロテインＡクロマトグラフィー媒体上に適用される、上記使用。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

治療用タンパク質のための精製プロセスのプロテインＡクロマトグラフィー工程における、リパーゼの除去を強化するための、プロテインＡクロマトグラフィー媒体のための洗浄溶液であるＣａＣｌ_２を含む溶液の使用であって、該治療用タンパク質を含むローディング溶液が、プロテインＡクロマトグラフィー媒体上に適用される、上記使用。

【請求項2】

ホスホリパーゼＢ様２（ＰＬＢＬ２）の除去を強化するための、請求項１に記載の使用。

【請求項3】

前記洗浄溶液中のＣａＣｌ_２の濃度が、０．２５Ｍ〜３Ｍ、好ましくは０．２５Ｍ〜２Ｍ、好ましくは０．２５Ｍ〜１Ｍ、好ましくは０．２５Ｍ〜０．８Ｍ、好ましくは０．４Ｍ〜０．６Ｍ、さらにより好ましくは約０．５Ｍである、請求項１または２に記載の使用。

【請求項4】

ＣａＣｌ_２を含む前記洗浄溶液が、トリスをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項5】

ＣａＣｌ_２を含む前記洗浄溶液中のトリスの濃度が、４０ｍＭ〜６０ｍＭ、好ましくは約５０ｍＭである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。

【請求項6】

ＣａＣｌ_２を含む前記洗浄溶液のｐＨが、５〜９、好ましくは６〜８．５、好ましくは７〜８、好ましくは約７．５である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。

【請求項7】

前記プロテインＡクロマトグラフィー媒体を前記ＣａＣｌ_２を含む溶液で洗浄する前、前記プロテインＡクロマトグラフィー媒体が、４０ｍＭ〜６０ｍＭの濃度、好ましくは約５０ｍＭの濃度のトリス、および１２０ｍＭ〜１８０ｍＭの濃度、好ましくは約１５０ｍＭの濃度のＮａＣｌを含み、ｐＨ６〜９、好ましくは約７．５のｐＨを有する溶液で洗浄される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。

【請求項8】

前記プロテインＡクロマトグラフィー媒体を前記ＣａＣｌ_２を含む溶液で洗浄した後、前記プロテインＡクロマトグラフィー媒体が、２０ｍＭ〜３０ｍＭの濃度、好ましくは約２５ｍＭの濃度の酢酸塩を含み、ｐＨ４〜７、好ましくは約５．５のｐＨを有する溶液で洗浄される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。

【請求項9】

前記プロテインＡクロマトグラフィー媒体をローディングおよび洗浄する前、前記プロテインＡクロマトグラフィー媒体を、４０ｍＭ〜６０ｍＭの濃度、好ましくは約５０ｍＭの濃度のトリス、および１２０ｍＭ〜１８０ｍＭの濃度、好ましくは約１５０ｍＭの濃度のＮａＣｌを含み、ｐＨ６〜９、好ましくは約７．５のｐＨを有する平衡緩衝液と接触させる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。

【請求項10】

前記プロテインＡクロマトグラフィー媒体を洗浄した後、前記プロテインＡクロマトグラフィー媒体を、前記プロテインＡクロマトグラフィー媒体に結合した前記治療用タンパク質を溶出させるための溶出緩衝液と接触させる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。

【請求項11】

前記溶出緩衝液が、２０ｍＭ〜３０ｍＭの濃度、好ましくは約２５ｍＭの濃度の酢酸塩を含み、２．５〜４．５のｐＨ、好ましくは約３．７のｐＨを有する、請求項１０に記載の使用。

【請求項12】

前記治療用タンパク質が、治療抗体である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用。

【請求項13】

前記治療抗体が、ＣＨＯ細胞から組換え生産される、請求項１２に記載の使用。

【請求項14】

前記治療抗体が、タネズマブである、請求項１３に記載の使用。

【請求項15】

プロテインＡクロマトグラフィー工程を含む治療用タンパク質の精製の方法であって、
− 該治療用タンパク質を含むローディング溶液をプロテインＡクロマトグラフィー媒体と接触させ、それによって、該治療用タンパク質を該プロテインＡクロマトグラフィー媒体に結合させ ；
− 該プロテインＡクロマトグラフィー媒体を、リパーゼの除去を強化するための、少なくとも１種のＣａＣｌ_２を含む洗浄溶液で洗浄し ；
− 該治療用タンパク質を、前記プロテインＡクロマトグラフィー媒体から溶出させる、上記方法。

【請求項16】

前記プロテインＡクロマトグラフィー媒体を、ホスホリパーゼＢ様２（ＰＬＢＬ２）の除去を強化するための、少なくとも１種のＣａＣｌ_２を含む洗浄溶液で洗浄する、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記洗浄溶液中のＣａＣｌ_２の濃度が、０．２５Ｍ〜３Ｍ、好ましくは０．２５Ｍ〜２Ｍ、好ましくは０．２５Ｍ〜１Ｍ、好ましくは０．２５Ｍ〜０．８Ｍ、好ましくは０．４Ｍ〜０．６Ｍ、さらにより好ましくは約０．５Ｍである、請求項１５または１６に記載の方法。

【請求項18】

前記ＣａＣｌ_２を含む洗浄溶液が、好ましくは４０ｍＭ〜６０ｍＭの濃度、好ましくは約５０ｍＭの濃度のトリスをさらに含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記ＣａＣｌ_２を含む洗浄溶液のｐＨが、５〜９、好ましくは６〜８．５、好ましくは７〜８、好ましくは約７．５である、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記プロテインＡクロマトグラフィー媒体を前記ＣａＣｌ_２を含む溶液で洗浄する前、前記プロテインＡクロマトグラフィー媒体が、４０ｍＭ〜６０ｍＭの濃度、好ましくは約５０ｍＭの濃度のトリス、および１２０ｍＭ〜１８０ｍＭの濃度、好ましくは約１５０ｍＭの濃度のＮａＣｌを含み、ｐＨ６〜９、好ましくは約７．５のｐＨを有する溶液で洗浄される、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記プロテインＡクロマトグラフィー媒体を前記ＣａＣｌ_２を含む溶液で洗浄した後、前記プロテインＡクロマトグラフィー媒体が、２０ｍＭ〜３０ｍＭの濃度、好ましくは約２５ｍＭの濃度の酢酸塩を含み、ｐＨ４〜７、好ましくは約５．５のｐＨを有する溶液で洗浄される、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記プロテインＡクロマトグラフィー媒体をローディングおよび洗浄する前、前記プロテインＡクロマトグラフィー媒体を、４０ｍＭ〜６０ｍＭの濃度、好ましくは約５０ｍＭの濃度のトリス、および１２０ｍＭ〜１８０ｍＭの濃度、好ましくは約１５０ｍＭの濃度のＮａＣｌを含み、ｐＨ６〜９、好ましくは約７．５のｐＨを有する平衡緩衝液と接触させる、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記プロテインＡクロマトグラフィー媒体を洗浄した後、前記プロテインＡクロマトグラフィー媒体を、前記プロテインＡクロマトグラフィー媒体に結合した前記治療用タンパク質を溶出させるための溶出緩衝液と接触させる、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記溶出緩衝液が、２０ｍＭ〜３０ｍＭの濃度、好ましくは約２５ｍＭの濃度の酢酸塩を含み、２．５〜４．５のｐＨ、好ましくは約３．７のｐＨを有する、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記治療用タンパク質が、イオン交換クロマトグラフィー工程および／または陽イオン交換精製工程を含むさらなる精製工程に供される、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記治療用タンパク質が、医薬として使用するために製剤化される、請求項１５〜２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記治療用タンパク質が、治療抗体である、請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記治療抗体が、ＣＨＯ細胞から組換え生産される、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記治療抗体が、タネズマブである、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

請求項１５〜２９のいずれか一項に記載の方法によって精製された治療用タンパク質を含む医薬生成物。

【請求項31】

前記生成物中のＰＬＢＬ２のレベルが、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳまたはＰＬＢＬ２ ＥＬＩＳＡによって測定した場合、約１０ｎｇ／ｍｇ未満かまたはそれに等しい、請求項３０に記載の医薬生成物。

【請求項32】

請求項１５〜２９のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる組成物。

【請求項33】

前記組成物中のＰＬＢＬ２のレベルが、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳまたはＰＬＢＬ２ ＥＬＩＳＡによって測定した場合、約１０ｎｇ／ｍｇ未満かまたはそれに等しい、請求項３２に記載の組成物。

【請求項34】

前記治療用タンパク質が、タネズマブである、請求項３０もしくは３１に記載の医薬生成物、または請求項３２もしくは３３に記載の組成物。

【請求項35】

タネズマブを含む医薬組成物であって、該組成物中のＰＬＢＬ２のレベルが、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳまたはＰＬＢＬ２ ＥＬＩＳＡによって測定した場合、約１０ｎｇ／ｍｇ未満かまたはそれに等しい、上記医薬組成物。

【請求項36】

前記ＰＬＢＬ２のレベルが、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳまたはＰＬＢＬ２ ＥＬＩＳＡによって測定した場合、約５ｎｇ／ｍｇ未満である、請求項３５に記載の医薬組成物。

【請求項37】

前記ＰＬＢＬ２のレベルが、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳまたはＰＬＢＬ２ ＥＬＩＳＡによって測定した場合、約２または１ｎｇ／ｍｇ未満である、請求項３６に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、プロテインＡクロマトグラフィー工程を含む治療用タンパク質の精製のためのプロセス（方法）に関する。

【背景技術】

【0002】

治療用タンパク質、特定には治療抗体は、遺伝子操作された宿主細胞で生産され、バイオリアクターから捕獲され、次いで最終産物に高い純度を付与するように設計された制御された多工程のプロセス下で精製される。

【0003】

主な問題の１つは、不純物、特定には残留した宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）、すなわち治療用タンパク質の生産のために使用される宿主細胞によって発現されるタンパク質の低減である。

【0004】

規制の観点から、全てのバイオ医薬品生成物に対して規定されたＨＣＰの許容レベルは存在しない可能性があるが、個々の場合に応じて、あらゆる関連する安全性のリスクと効能に対する負の作用を最小化するために、ＨＣＰのレベルを最小化することが必要である。

【0005】

治療用タンパク質のための精製プロセスに含まれる従来の工程の１つは、プロテインＡクロマトグラフィー工程からなり、この場合、捕獲工程から収集された治療用タンパク質を含むローディング溶液は、例えばクロマトグラフィーカラムに配置された樹脂の形態でのプロテインＡクロマトグラフィー媒体に適用される。

【0006】

このようなプロテインＡクロマトグラフィーカラムは、結合および溶出様式で操作することができる。それゆえに、このようなプロテインＡクロマトグラフィーカラムを操作する従来のプロセスは、逐次的に、
− 治療用タンパク質をプロテインＡクロマトグラフィー媒体に結合させ、一方で不純物を含む溶液はプロテインＡクロマトグラフィー媒体を通過させる工程；
− 後続の操作で、プロテインＡクロマトグラフィー媒体を、より多くの不純物が樹脂から除去され、治療用タンパク質から分離されるように、１種またはそれより多くの洗浄溶液で洗浄する工程；
− 後続の操作で、プロテインＡクロマトグラフィー媒体を、結合した治療用タンパク質の回収のための溶出緩衝液と接触させる工程
を含み得る。

【0007】

従来のプロセスでは、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液などの塩溶液は、ＨＣＰを除去するための洗浄溶液として使用される。また、同じ目的のために２価カチオンの塩の洗浄液を使用することも、例えばＷＯ２００６／１３８５５３およびＷＯ２００８／０３１２０により公知である。

【0008】

本発明は、より具体的には、プロテインＡクロマトグラフィー媒体を洗浄するため、さらに、特定のＨＣＰの除去を強化するために使用される溶液に関する。
特定のＨＣＰ、例えばリパーゼ、より具体的にはホスホリパーゼＢ様２（ＰＬＢＬ２）の存在は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）で発現された治療抗体のための精製プロセスの様々な段階で見られ、特に問題である。例えば、ＰＬＢＬ２は、従来の賦形剤、例えばポリソルベート、特定にはポリソルベート８０（ＰＳ８０）およびポリソルベート２０（ＰＳ２０）の分子結合に干渉することが見出されたが、それにより得られた薬物生成物の安定性が影響を受ける。ＰＳ２０分解へのＰＬＢＬ２の影響は、例えば以下の出版物：「Residual Host Cell Protein Promotes Polysorbate 20 Degradation in a Sulfatase Drug Product Leading to Free Fatty Acid Particles」-Nitin Dixitら、-Journal of Pharmaceutical Sciences、第105巻、5号、2016年5月、1657〜1666頁で報告されている。

【0009】

ＰＬＢＬ２は、特定のレベルで、生成物の免疫原性に影響を与える可能性がある。
ＰＬＢＬ２の免疫原性能およびそのモノクローナル抗体の免疫原性に対する考えられる影響は、例えば、以下の出版物：「Specific Immune Response to Phospholipase B-Like ２ Protein, a Host Cell Impurity in Lebrikizumab Clinical Material」-Saloumeh Kadkhodayan Fischerら、The AAPS Journal((C)2016)で評価され、報告された。

【0010】

この治療抗体精製の問題に取り組む必要があり、本発明の目的は、プロテインＡクロマトグラフィー媒体から回収した溶出プール中の、さらに、薬物生成物中のリパーゼ、特定にはＰＬＢＬ２の量を徹底的に低減させるのに効果的な洗浄溶液を提供することである。

【0011】

抗体精製プロセスにおいてＰＬＢＬ２を除去することに関連する具体的な問題は、例えば以下の論文：「Investigating interactions between phospholipase B-Like ２ and antibodies during Protein A chromatography」-B. Tranら、Journal of Chromatography A 1438（2016）31〜38で文書化されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】ＷＯ２００６／１３８５５３

【特許文献2】ＷＯ２００８／０３１２０

【非特許文献】

【0013】

【非特許文献1】「Residual Host Cell Protein Promotes Polysorbate 20 Degradation in a Sulfatase Drug Product Leading to Free Fatty Acid Particles」-Nitin Dixitら、-Journal of Pharmaceutical Sciences、第105巻、5号、2016年5月、1657〜1666頁

【非特許文献2】「Specific Immune Response to Phospholipase B-Like ２ Protein, a Host Cell Impurity in Lebrikizumab Clinical Material」-Saloumeh Kadkhodayan Fischerら、The AAPS Journal（（Ｃ）2016）

【非特許文献3】「Investigating interactions between phospholipase B-Like ２ and antibodies during Protein A chromatography」-B. Tranら、Journal of Chromatography A 1438（2016）31〜38

【発明の概要】

【0014】

本発明の第１の形態によれば、ＣａＣｌ_２を含む溶液は、リパーゼの除去を強化するための、プロテインＡクロマトグラフィー媒体のための洗浄溶液として使用される。
本発明のさらなる形態によれば、ＣａＣｌ_２を含む溶液は、ＰＬＢＬ２の除去を強化するための、プロテインＡクロマトグラフィー媒体のための洗浄溶液として使用される。

【0015】

例えば、このようなＣａＣｌ_２洗浄溶液の使用は、特定にはＮａＣｌ溶液などの従来の洗浄溶液と比較して、溶出プール中の、さらには薬物生成物中の、リパーゼ、より具体的にはＰＬＢＬ２の、治療用タンパク質に対する重量比を、少なくとも２分の１、さらには少なくとも７分の１、またはさらには少なくとも３０分の１に低減できることが見出されている。特定には、このようなＣａＣｌ_２洗浄溶液の使用は、リパーゼ、より具体的にはＰＬＢＬ２の重量比を低減でき、同時に、ＨＣＰの全体的な低減に関して、従来の洗浄溶液、例えば特定にはＮａＣｌ溶液と少なくとも同程度に有効である。

【0016】

本発明のさらなる形態において、プロテインＡクロマトグラフィー工程を含む治療用タンパク質の精製のプロセス（方法）であって、
− 治療用タンパク質を含むローディング溶液をプロテインＡクロマトグラフィー媒体と接触させ、それによって、治療用タンパク質をプロテインＡクロマトグラフィー媒体に結合させ；
− プロテインＡクロマトグラフィー媒体を、リパーゼの除去を強化するための、特定にはＰＬＢＬ２の除去を強化するための、少なくとも１種のＣａＣｌ_２を含む洗浄溶液で洗浄し；
− 治療用タンパク質を、プロテインＡクロマトグラフィー媒体から溶出させる、プロセスが提供される。

【0017】

本発明のさらなる形態において、本発明に係るプロセスによって精製された治療用タンパク質を含む医薬生成物が提供される。
本発明の好ましい実施態様によれば、全てのその形態において、以下の通りである：
− 洗浄溶液中のＣａＣｌ_２の濃度は、０．２５Ｍ〜３Ｍ、好ましくは０．２５Ｍ〜２Ｍ、好ましくは０．２５Ｍ〜１Ｍ、好ましくは０．２５Ｍ〜０．８Ｍ、好ましくは０．４Ｍ〜０．６Ｍ、さらにより好ましくは約０．５Ｍである；
− ＣａＣｌ_２を含む洗浄溶液は、トリスをさらに含む；
− ＣａＣｌ_２を含む洗浄溶液中のトリスの濃度は、４０ｍＭ〜６０ｍＭ、好ましくは約５０ｍＭである；
− ＣａＣｌ_２を含む洗浄溶液のｐＨは、５〜９、好ましくは６〜８．５、好ましくは７〜８、好ましくは約７．５である；
− プロテインＡクロマトグラフィー媒体をＣａＣｌ_２を含む溶液で洗浄する前、プロテインＡクロマトグラフィー媒体は、４０ｍＭ〜６０ｍＭの濃度、好ましくは約５０ｍＭの濃度のトリス、および１２０ｍＭ〜１８０ｍＭの濃度、好ましくは約１５０ｍＭの濃度のＮａＣｌを含み、ｐＨ６〜９、好ましくは約７．５のｐＨを有する溶液で洗浄される；
− プロテインＡクロマトグラフィー媒体をＣａＣｌ_２を含む溶液で洗浄した後、プロテインＡクロマトグラフィー媒体は、２０ｍＭ〜３０ｍＭの濃度、好ましくは約２５ｍＭの濃度の酢酸塩を含み、ｐＨ４〜７、好ましくは約５．５のｐＨを有する溶液で洗浄される；
− プロテインＡクロマトグラフィー媒体をローディングおよび洗浄する前、プロテインＡクロマトグラフィー媒体を、４０ｍＭ〜６０ｍＭの濃度、好ましくは約５０ｍＭの濃度のトリス、および１２０ｍＭ〜１８０ｍＭの濃度、好ましくは約１５０ｍＭの濃度のＮａＣｌを含み、ｐＨ６〜９、好ましくは約７．５のｐＨを有する平衡緩衝液と接触させる；
− プロテインＡクロマトグラフィー媒体を洗浄した後、プロテインＡクロマトグラフィー媒体を、プロテインＡクロマトグラフィー媒体に結合した治療用タンパク質を溶出させるための溶出緩衝液と接触させる；
− 前記溶出緩衝液は、２０ｍＭ〜３０ｍＭの濃度、好ましくは約２５ｍＭの濃度の酢酸塩を含み、２．５〜４．５のｐＨ、好ましくは約３．７のｐＨを有する；
− 治療用タンパク質は、治療抗体である；
− 治療抗体は、ＣＨＯ細胞から組換え生産される；
− 治療抗体は、タネズマブである。

【0018】

本発明に係るプロセスの好ましい実施態様によれば、
− 治療用タンパク質は、イオン交換クロマトグラフィー工程および／または陽イオン交換精製工程を含むさらなる精製工程に供される；
− 治療用タンパク質は、医薬として使用するために製剤化される。

【発明を実施するための形態】

【0019】

定義
発明の説明および特許請求の範囲では、以下の定義が使用される。
− 用語「プロテインＡ」は、それらの天然源から回収されたプロテインＡ、合成的に生産されたプロテインＡ（例えばペプチド合成、組換え技術によって、など）、およびＣＨ２／ＣＨ３領域を有するＣＨ２／ＣＨ３領域を有するタンパク質と結合する能力を保持するそれらのバリアントを包含する。

【0020】

− 用語「捕獲された溶液」は、同様に存在する他の物質から精製しようとする少なくとも１種の標的物質を含有する溶液を指す。捕獲された溶液は、多くの生体分子（例えばタンパク質、抗体、ホルモン、およびウイルス）、小分子（例えば塩、糖、脂質など）、さらには微粒子状の物質を含有する複雑な混合物であることが多い。典型的な生物学的起源の捕獲された溶液は水溶液または懸濁液であり得るが、例えば溶媒沈殿、抽出などの初期の分離工程で使用される有機溶媒を含有していることもある。本発明の様々な実施態様による精製で処理できる有用な生物学的物質を含有し得る捕獲された溶液の例としては、これらに限定されないが、バイオリアクターからの培養上清、ホモジナイズした細胞懸濁液、血漿、血漿分画、および乳が挙げられる。

【0021】

− 用語「ローディング溶液」は、捕獲された溶液から得られた溶液であって、さらに遠心分離されていてもよいし、深層ろ過されていてもよいし、またはそれ以外の方法で予備的に精製されていてもよく、プロテインＡクロマトグラフィーカラムにローディングされるものを意味する。

【0022】

− 用語「治療用タンパク質」は、捕獲された溶液から精製しようとするタンパク質を指す。
− 用語「不純物」は、捕獲された溶液またはローディング溶液中の、治療用タンパク質と異なる物質であって、最終的な治療用タンパク質製剤から排除されることが望ましいものを指す。典型的な不純物としては、核酸、タンパク質（例えば、ＨＣＰ、低分子量の種、およびジスルフィド結合した種など）、ペプチド、内毒素、ウイルスおよび小分子が挙げられる。

【0023】

− 用語「リパーゼ」は、脂肪の分解を触媒するあらゆる酵素を指す。
− 用語「ＰＬＢＬ２」は、リパーゼであるホスホリパーゼＢ様２を意味し、さらに、リパーゼであるホスホリパーゼＢ様２から得られた捕獲された溶液中に存在し得るフラグメントまたはバリアントを意味する。本発明に係るＰＬＢＬ２は、当業界で公知のように、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（Liquid Chromatography - tandem Spectrometry；ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって、またはＰＬＢＬ２ ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）キットを用いて測定することができる。ＰＬＢＬ２ ＥＬＩＳＡは、溶液中のＰＬＢＬ２、例えばチャイニーズハムスターＰＬＢＬ２に結合し、その定量を可能にするポリクローナル抗体を利用するサンドイッチベースのＥＬＩＳＡである。

【0024】

− 用語「洗浄溶液」は、治療用タンパク質を結合させるクロマトグラフィー媒体から不純物を取り去るのに使用される液体を指す。１種より多くの洗浄溶液が、逐次的に、例えば、クロマトグラフィー媒体に非特異的に会合する様々なタイプの不純物を解離させて除去するように設計された、ｐＨ、伝導率、溶媒濃度などの特性を変更した連続する洗浄溶液と逐次的に採用することができる。

【0025】

− 用語「溶出緩衝液」は、本明細書では、クロマトグラフィー媒体を１種またはそれより多くの洗浄溶液で洗浄した後にクロマトグラフィー媒体から治療用タンパク質を解離させるのに使用される液体を指す。溶出緩衝液は、治療用タンパク質を不可逆的に変性させることなく解離させるように作用する。典型的な溶出緩衝液はクロマトグラフィー技術において周知であり、より高い濃度の塩、遊離の親和性リガンドもしくは類似体、またはクロマトグラフィー媒体からの治療用タンパク質の解離を促進する他の物質を含んでいてもよい。また典型的な溶出様式も、溶出緩衝液のｐＨに基づいていてもよい。

【0026】

− 用語「溶出プール」は、溶出工程によって生産された液相であって、溶出緩衝液およびクロマトグラフィー媒体から溶出させたタンパク質を含むものを指す。
− 用語「医薬物質」は、本発明のプロセス（方法）によって得ることができる医薬有効成分としての治療用タンパク質を指す。

【0027】

− 用語「薬物生成物」または「医薬生成物」は、治療用タンパク質を賦形剤と共に含有する完成した剤形を指す。
− 用語「賦形剤」は、最終的な治療用タンパク質製剤の、治療用タンパク質ではない成分を意味する。賦形剤としては、典型的には、タンパク質安定剤、界面活性剤、アミノ酸、例えばタンパク質の安定化に寄与するアミノ酸などが挙げられる。

【0028】

− 別段の指定がない限り、数値に関連する用語「約」は、前記値の±５％の範囲であることを意味する。
本発明は、ＣａＣｌ_２を含む溶液に関する。このような溶液は、治療用タンパク質、特定には治療抗体を精製するための方法で使用されるプロテインＡクロマトグラフィー媒体のための洗浄溶液として使用することができる。

【0029】

本発明に係る方法で精製される治療抗体の例としては、ＣＨＯ細胞から組換え生産された治療抗体が挙げられる。好ましくは、治療抗体は、タネズマブである。
好ましくは、本発明の方法におけるＣａＣｌ_２を含む溶液の使用は、ＰＬＢＬ２の除去を強化する。ＰＬＢＬ２の存在は、当業界において公知の方法で測定することができる。例えば、ＰＬＢＬ２の存在は、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって、またはＰＬＢＬ２ ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）キットを用いて測定することができる。

【0030】

したがって、本発明の一実施態様において、ＰＬＢＬ２は、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって測定される。
本発明の別の実施態様において、ＰＬＢＬ２は、ＰＬＢＬ２ ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）を用いて測定される。

【0031】

このような除去の強化は、溶出プール中に存在するＰＬＢＬ２の量が、標準的なプロセスにおける量の少なくとも２分の１、７分の１、または一部の好ましい実施態様では３０分の１になるような強化であり得る。標準的プロセスは、下記の「実施例」セクションにおいて、表２および３に示した試験結果と関連して定義される。

【0032】

好ましくは、治療抗体の量は、本発明に係る使用およびプロセス（方法）によって、ＰＬＢＬ２の除去中に実質的に減少しない。例えば、本発明によれば、溶出プール中に存在する治療抗体の量は、標準的なプロセスと比較して、ほぼ同じであり得る。別の例において、溶出プール中に存在する治療抗体の量は、標準的なプロセスと比較して、それより多くてもよい。

【0033】

したがって、好適なＣａＣｌ_２を含む溶液は、これに限定されないが、以下の例示的な溶液：５０ｍＭのトリス、０．５ＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ７．５を含む。
プロテインＡクロマトグラフィー工程を使用する治療用タンパク質のための精製プロセスは当業界において周知であり、本発明のＣａＣｌ２を含む溶液と共に採用することができる。

【0034】

本発明によれば、プロテインＡクロマトグラフィーカラムは、結合および溶出様式で操作することができる。それゆえに、結合および溶出においてこのようなプロテインＡクロマトグラフィーカラムを操作するプロセスは、逐次的に、
− 治療用タンパク質をプロテインＡクロマトグラフィー媒体に結合させ、一方で不純物を含む溶液はプロテインＡクロマトグラフィー媒体を通過させる工程；
− 後続の操作で、プロテインＡクロマトグラフィー媒体を、より多くの不純物が樹脂から除去され、治療用タンパク質から分離されるように、１種またはそれより多くの洗浄溶液で洗浄する工程；
− 後続の操作で、プロテインＡクロマトグラフィー媒体を、結合した治療用タンパク質の回収のための溶出緩衝液と接触させる工程
を含み得る。

【0035】

驚くべきことに、結合および溶出様式で操作されるプロテインＡクロマトグラフィーカラムと共に、このようなＣａＣｌ_２洗浄溶液を使用することは、溶出プール中におけるＰＬＢＬ２の治療用タンパク質に対する重量比を、好ましくは１０ｎｇ／ｍｇ未満に低減できることが見出された。より好ましくは、そのような使用は、溶出プール中におけるＰＬＢＬ２の治療用タンパク質に対する重量比を、８ｎｇ／ｍｇ未満に、さらにより好ましくは６ｎｇ／ｍｇ未満に低減させることができる。

【0036】

特定には、このようなＣａＣｌ_２洗浄溶液の使用は、溶出プール中におけるＰＬＢＬ２の治療用タンパク質に対する重量比を１０ｎｇ／ｍｇ未満に低減でき、同時に、他の従来の洗浄溶液、例えば、特定にはＨＣＰの一般的な低減のためのＮａＣｌ溶液と少なくとも同程度に有効である。

【0037】

ＣａＣｌ_２洗浄溶液に加えて、他の従来の洗浄溶液も任意選択で使用することができる。例えば、ＣａＣｌ_２洗浄溶液の前に、好ましくは、ｐＨ７．５の５０ｍＭのトリスおよび１５０ｍＭのＮａＣｌを含む洗浄溶液を使用することができる。さらにより好ましくは、ＣａＣｌ_２洗浄溶液の後にｐＨ５．５の２５ｍＭの酢酸塩を含むさらなる洗浄溶液を使用することができる。

【0038】

「ＨＣＰの一般的な低減」は、溶出プール中に存在するＨＣＰ種の治療用タンパク質に対する重量比が低減されることを意味する。ＨＣＰの一般的な低減は、ＨＣＰ ＥＬＩＳＡ（通常、一次的なツールとして使用される）およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳなどの当業界において公知の方法で測定することができる。

【0039】

したがって、本発明の一形態において、プロテインＡクロマトグラフィー工程を含む治療用タンパク質の精製のプロセスであって、
− 治療用タンパク質を含むローディング溶液をプロテインＡクロマトグラフィー媒体と接触させ、それによって、治療用タンパク質をプロテインＡクロマトグラフィー媒体に結合させ；
− プロテインＡクロマトグラフィー媒体を、ホスホリパーゼＢ様２（ＰＬＢＬ２）の除去を強化するための、少なくとも１種のＣａＣｌ_２を含む洗浄溶液で洗浄し；
− 治療用タンパク質を、プロテインＡクロマトグラフィー媒体から溶出させる、上記プロセスが提供される。

【0040】

好ましくは、前記少なくとも１種の洗浄溶液中のＣａＣｌ_２の濃度は、約０．４Ｍ〜約０．５Ｍ、好ましくは約０．５Ｍである。
好ましくは、ＣａＣｌ_２を含む洗浄溶液は、好ましくは約５０ｍＭの濃度のトリスをさらに含む。

【0041】

好ましくは、ＣａＣｌ_２を含む洗浄溶液は、約７．５のｐＨを有する。
本発明のさらなる形態において、ホスホリパーゼＢ様２（ＰＬＢＬ２）の除去を強化するための、プロテインＡクロマトグラフィー媒体のための洗浄溶液であるＣａＣｌ_２を含む溶液の使用が提供される。

【0042】

本発明の好ましい実施態様において、プロテインＡクロマトグラフィー媒体をＣａＣｌ_２を含む溶液で洗浄する前、プロテインＡクロマトグラフィー媒体が、約５０ｍＭの濃度のトリス、および約１５０ｍＭの濃度のＮａＣｌを含み、約７．５のｐＨを有する溶液で洗浄される。

【0043】

本発明の好ましい実施態様において、プロテインＡクロマトグラフィー媒体をＣａＣｌ_２を含む溶液で洗浄した後、プロテインＡクロマトグラフィー媒体が、約２５ｍＭの濃度の酢酸塩を含み、約５．５のｐＨを有する溶液で洗浄される。

【0044】

本発明の好ましい実施態様において、プロテインＡクロマトグラフィー媒体をローディングおよび洗浄する前、プロテインＡクロマトグラフィー媒体を、約５０ｍＭの濃度のトリスおよび約１５０ｍＭの濃度のＮａＣｌを含み、約７．５のｐＨを有する平衡緩衝液と接触させる。

【0045】

本発明の好ましい実施態様において、プロテインＡクロマトグラフィー媒体を洗浄した後、プロテインＡクロマトグラフィー媒体を、プロテインＡクロマトグラフィー媒体に結合した治療用タンパク質を溶出させるための溶出緩衝液と接触させ、前記溶出緩衝液は、約２５ｍＭの濃度の約３．７のｐＨを有する酢酸塩を含む。

【0046】

本発明の好ましい実施態様において、プロテインＡクロマトグラフィー媒体を洗浄した後、プロテインＡクロマトグラフィー媒体を、プロテインＡクロマトグラフィー媒体に結合した治療用タンパク質を溶出させるための溶出緩衝液と接触させ、治療用タンパク質を含む溶出プールを収集する。

【0047】

好ましい実施態様において、治療用タンパク質は、治療抗体であり、好ましくはＣＨＯ細胞で発現される治療抗体（またはＣＨＯ細胞から組換え生産された治療抗体）であり、より好ましくはタネズマブである。

【0048】

タネズマブは、抗神経成長因子（ＮＧＦ）抗体である。以下の表１にタネズマブの配列を示す。タネズマブは、ＷＯ２００４／０５８１８４では抗体Ｅ３として記載される。

【0049】

【表1】

【0050】

本発明のさらなる形態は、本明細書に記載される発明のプロセスによって精製された治療用タンパク質を含む医薬生成物を提供する。好ましい実施態様において、治療用タンパク質は、治療抗体であり、好ましくはＣＨＯ細胞で発現される治療抗体（またはＣＨＯ細胞から組換え生産された治療抗体）であり、より好ましくはタネズマブである。

【0051】

好ましい実施態様において、生成物中のＰＬＢＬ２のレベルは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳまたはＰＬＢＬ２ ＥＬＩＳＡによって測定した場合、約１０ｎｇ／ｍｇ未満かまたはそれに等しい。一部の実施態様において、ＰＬＢＬ２のレベルは、約９ｎｇ／ｍｇ未満、約８ｎｇ／ｍｇ未満、約７ｎｇ／ｍｇ未満、約６ｎｇ／ｍｇ未満、約５ｎｇ／ｍｇ未満、約４ｎｇ／ｍｇ未満、約３ｎｇ／ｍｇ未満、約２ｎｇ／ｍｇ未満または約１ｎｇ／ｍｇ未満である。好ましい実施態様において、ＰＬＢＬ２のレベルは、約２ｎｇ／ｍｇ未満または約１ｎｇ／ｍｇ未満である。

【0052】

本発明のさらなる形態は、本明細書に記載される発明のプロセスによって得ることができる組成物を提供する。好ましい実施態様において、治療用タンパク質は、治療抗体であり、好ましくはＣＨＯ細胞で発現される治療抗体（またはＣＨＯ細胞から組換え生産された治療抗体）であり、より好ましくはタネズマブである。

【0053】

好ましい実施態様において、組成物中のＰＬＢＬ２のレベルが、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳまたはＰＬＢＬ２ ＥＬＩＳＡによって測定した場合、約１０ｎｇ／ｍｇ未満かまたはそれに等しい。一部の実施態様において、ＰＬＢＬ２のレベルは、約９ｎｇ／ｍｇ未満、約８ｎｇ／ｍｇ未満、約７ｎｇ／ｍｇ未満、約６ｎｇ／ｍｇ未満、約５ｎｇ／ｍｇ未満、約４ｎｇ／ｍｇ未満、約３ｎｇ／ｍｇ未満、約２ｎｇ／ｍｇ未満または約１ｎｇ／ｍｇ未満である。好ましい実施態様において、ＰＬＢＬ２のレベルは、約２ｎｇ／ｍｇ未満または１ｎｇ／ｍｇ未満である。

【0054】

本発明のさらなる形態は、タネズマブを含む医薬組成物であって、組成物中のＰＬＢＬ２のレベルが、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳまたはＰＬＢＬ２ ＥＬＩＳＡによって測定した場合、約１０ｎｇ／ｍｇ未満かまたはそれに等しい、上記医薬組成物を提供する。

【0055】

一部の実施態様において、ＰＬＢＬ２のレベルは、約９ｎｇ／ｍｇ未満、約８ｎｇ／ｍｇ未満、約７ｎｇ／ｍｇ未満、約６ｎｇ／ｍｇ未満、約５ｎｇ／ｍｇ未満、約４ｎｇ／ｍｇ未満、約３ｎｇ／ｍｇ未満、約２ｎｇ／ｍｇ未満または約１ｎｇ／ｍｇ未満である。好ましい実施態様において、ＰＬＢＬ２のレベルは、約２ｎｇ／ｍｇ未満または約１ｎｇ／ｍｇ未満である。

【0056】

本発明の組成物はさらに、医薬的に許容される担体、賦形剤、または安定剤（Remington：The Science and practice of Pharmacy、第20版、2000、Lippincott Williams and Wilkins、K. E. Hoover編）を、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で含んでいてもよい。許容できる担体、賦形剤、または安定剤は、投薬量および濃度でレシピエントにとって非毒性であり、その例としては、緩衝剤、例えばリン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸およびメチオニン；保存剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量の（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシン；単糖、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストランなどの他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩を形成する対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；および／または非イオン界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み得る。医薬的に許容される賦形剤は、本明細書にさらに記載される。

【0057】

実際に、本明細書で使用される場合、「医薬的に許容される担体」または「医薬的な許容できる賦形剤」は、活性成分と組み合わせた場合、その成分の生物学的活性の保持を可能にし、対象の免疫系と非反応性であるあらゆる材料を含む。その例としては、これらに限定されないが、標準的な医薬用担体のいずれか、例えば、リン酸緩衝食塩水、水、エマルジョン、例えば油／水エマルジョン、および様々な種類の湿潤剤が挙げられる。エアロゾルまたは非経口投与のための好ましい希釈剤は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）または生理（０．９％）食塩水である。このような担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって製剤化される（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版、A. Gennaro編、Mack Publishing Co.、ペンシルバニア州イーストン、1990；およびRemington、The Science and Practice of Pharmacy、第20版、Mack Publishing、2000を参照）。

【0058】

医薬的に許容される賦形剤は当業界において公知であり、薬理学的に有効な物質の投与を容易にする比較的不活性な物質である。例えば、賦形剤は、形状または硬さを付与することもでき、または希釈剤として作用することもできる。好適な賦形剤としては、これらに限定されないが、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、浸透圧モル濃度を変更するための塩、封入剤、緩衝液、ならびに皮膚浸透促進剤が挙げられる。非経口および非経口以外の薬物送達のための賦形剤、加えて製剤は、Remington、The Science and Practice of Pharmacy、第20版、Mack Publishing、2000に記載されている。

【0059】

一部の実施態様において、これらの物質は、注射（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内、関節内など）による投与のために製剤化される。したがって、これらの物質は、医薬的に許容されるビヒクル、例えば食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液などと組み合わせることができる。特定の投薬レジメン、すなわち用量、タイミングおよび反復は、特定の個体およびその個体の病歴に依存すると予想される。

【0060】

一部の実施態様において、タネズマブを含む組成物は、参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１０／０３２２２０に記載される組成物である。
一部の実施態様において、上記組成物は、液体製剤であり、約２．５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌまたは２０ｍｇ／ｍｌの濃度のタネズマブ；およびヒスチジン緩衝液を含む。

【0061】

一部の実施態様において、製剤は、界面活性剤をさらに含み、界面活性剤は、ポリソルベート２０であり得る。一部の実施態様において、製剤は、トレハロース無水物またはスクロースをさらに含む。一部の実施態様において、製剤は、キレート剤をさらに含み、キレート剤は、ＥＤＴＡであってもよく、一部の実施態様において、ＥＤＴＡ二ナトリウムである。一部の実施態様において、製剤は、ｐＨ６．０±０．３を有する。

【0062】

一部の実施態様において、製剤は、約２．５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌまたは２０ｍｇ／ｍｌのタネズマブ；約１０ｍＭのヒスチジン緩衝液；約８４ｍｇ／ｍｌのトレハロース無水物；約０．１ｍｇ／ｍｌのポリソルベート２０；約０．０５ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡ二ナトリウムを含み、製剤は、ｐＨ６．０±０．３を有する。

【0063】

一部の実施態様において、製剤は、約２．５ｍｇ／ｍｌまたは５ｍｇ／ｍｌを含む。一部の実施態様において、製剤は、約１ｍｌの総体積を有する。
一部の実施態様において、製剤は、ガラスまたはプラスチックのバイアルまたはシリンジに含有される。一部の実施態様において、製剤は、プレフィルドのガラスまたはプラスチックのバイアルまたはシリンジに含有される。一部の実施態様において、製剤は、自己注入式のシリンジに含有される。

【0064】

一部の実施態様において、組成物は、全身投与（例えば、静脈内または皮下投与）を介して対象に投与される。好ましくは、組成物は、皮下注射を介して投与される。
一部の実施態様において、タネズマブを含む本発明の組成物または医薬生成物は、変形性関節症の疼痛、下背部痛、およびがん性疼痛などの疼痛の処置方法での使用のためである。変形性関節症の疼痛および下背部痛の処置におけるタネズマブの使用は、それぞれその内容が参照により本明細書に組み入れられる国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ２０２０／０５０６１１号およびＰＣＴ／ＩＢ２０２０／０５１２８１号でさらに記載されている。本明細書に記載される処置方法について述べた実施態様において、このような実施態様は、その処置で使用するための、または代替として、その処置で使用するための医薬を製造するためのさらなる実施態様でもある。

【実施例】

【0065】

ここで本発明を、具体的な治療用モノクローナル抗体に適用した精製プロセスに対応する以下の実施例によってさらに例示し、様々なプロテインＡクロマトグラフィー洗浄戦略を用いて評価する。実施例は、単に例示的な目的のために提供され、本発明の範囲の限定として解釈されるべきではない。

【0066】

例証的な実施例において、治療用タンパク質は、タネズマブ（配列は、上記の表１に示され、さらにＷＯ２００４／０５８１８４にお記載される）であり、これは、ＮＧＦ（神経成長因子）に特異的に結合し、変形性関節症の疼痛、下背部痛、およびがん性疼痛などの疼痛のための処置として使用できる抗体である。

【0067】

この実施例において、バイオリアクターから収集されるローディング溶液中に存在する治療用タンパク質は、逐次的に以下を含む多工程の精製プロセスによって精製される。
− 最初の遠心分離工程；
− 最初の深層ろ過工程；
− プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー工程であって、プロテインＡクロマトグラフィー媒体、例えば、ＧＥヘルスケア（GE Healthcare）より入手可能な、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）もしくはＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＬＸ（商標）樹脂、またはミリポアシグマ（Millipore Sigma）より入手可能な、Ｅｓｈｍｕｎｏ（商標）ＡもしくはＰｒｏＳｅｐ（商標）ウルトラプラス樹脂を含むクロマトグラフィーカラムで泳動させる、工程。最初に、樹脂を平衡緩衝液で平衡化する。次いで標的抗体が樹脂に結合するようにカラムにローディングする。その後、樹脂を１種またはそれより多くの洗浄溶液で洗浄し、次いで溶出緩衝液を適用することにより、標的抗体を、樹脂から溶出プール中に溶出させる。プロテインＡクロマトグラフィー工程の主要な目的は、清澄化した無細胞馴化培地からの生成物の捕捉、およびプロセスによって生じた不純物からのタネズマブの分離を含む；
− 低ｐＨのウイルス不活性化工程；
− 陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー工程であって、ＧＥヘルスケアより入手可能な、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、Ｃａｐｔｏ（商標）ＱもしくはＣａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ（商標）樹脂、東ソー・バイオサイエンス（Tosoh Bioscience）より入手可能な、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＧｉｇａＣａｐ（商標）Ｑ−６５０Ｍ樹脂、またはミリポアシグマより入手可能な、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ ＴＭＡＥ ＨｉＣａｐ（Ｍ）もしくはＥｓｈｍｕｎｏ（商標）Ｑ樹脂などの媒体を含むクロマトグラフィーカラムで泳動させる、工程；
− 陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー工程であって、ＧＥヘルスケアより入手可能な、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＦ、Ｃａｐｔｏ ＳもしくはＣａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓ樹脂、東ソー・バイオサイエンスより入手可能な、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＧｉｇａＣａｐ（商標）Ｓ−６５０Ｍ樹脂、またはミリポアシグマより入手可能な、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ商標）ＥＭＤＳＯ３−（Ｍ）もしくはＥｓｈｍｕｎｏ（商標）Ｓ樹脂などの媒体を含むクロマトグラフィーカラムで泳動させる、工程；
− 旭化成（Asahi Kasei）より入手可能な、Ｐｌａｎｏｖａ（商標）フィルター、またはミリポアシグマより入手可能な、ＶｉｒｅｓｏｌｖｅＰｒｏ（商標）フィルターを使用するウイルスろ過工程；
− 限外ろ過／透析ろ過工程；ならびに
− 最終的な製剤およびろ過工程。

【0068】

プロテインＡクロマトグラフィー洗浄緩衝液の評価
３つのバッチ（パイロットバッチ１〜３）を、プロテインＡクロマトグラフィーカラムのための２回の逐次的な洗浄を含む上記の精製プロセスを使用して、５００Ｌのパイロットプラントで泳動した。第１の洗浄溶液は、５０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７の１ＭのＮａＣｌ溶液であり、第２の洗浄溶液は、ｐＨ５．５の２５ｍＭの酢酸塩溶液である。ｐＨ３．７の２５ｍＭの酢酸塩の溶出緩衝液を用いて溶出を実行する。このプロセスは、以降、「標準プロセス」と称する。

【0069】

液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）の従来の試験技術によるＨＣＰの分析を含む特徴付けの作業をこれらの３つのバッチに実行した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの結果から、タネズマブ医薬物質中に残存する単一のＨＣＰであるホスホリパーゼＢ様２（ＰＬＢＬ２）の存在が明らかになった。

【0070】

全ての３つのバッチを同じプロセスで泳動したが、バッチ３は、低ｐＨのウイルス不活性化およびプロテインＡプールの中和後に深層フィルターを含んでいた。微粒子を除去し、後続の０．２μｍフィルターの目詰まりを防止するために、深層フィルターを追加した。

【0071】

表２にこの試験の結果を示す。

【0072】

【表2】

【0073】

表３に、商業的に入手可能なＰＬＢＬ２ ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）キットを使用したプールの追加の試験からの結果を示す。

【0074】

【表3】

【0075】

ＰＬＢＬ２ ＥＬＩＳＡの結果は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳとよく一致することから、低レベルのＰＬＢＬ２は、このプロセスで排除されないことを示す。バッチ３における深層フィルターの包含は、医薬物質中のより低いＰＬＢＬ２のレベルをもたらさなかったが、ＰＬＢＬ２を除去するためのよりロバストな溶液が確認されることが決定された。

【0076】

これらの結果に基づき、ＰＬＢＬ２をうまく除去する０．５ＭのＣａＣｌ_２を含有する新しい洗浄緩衝液が実現した。以下に、この洗浄工程の開発の詳細を記載する。
０．５ＭのＣａＣｌ_２を含有する洗浄緩衝液は、全般的に、１ＭのＮａＣｌを含有する洗浄緩衝液よりロバストな不純物除去を提供することが観察された。

【0077】

パイロットバッチ１のプロテインＡのローディングを使用した最初の洗浄による選別を０．６ｍＬのミニカラムを用いて実行して、０．５ＭのＣａＣｌ_２の洗浄緩衝液の取込みがＰＬＢＬ２のレベルを効果的に低減できるかどうかを評価した。

【0078】

以下の表４は、評価された異なる洗浄条件および溶出プールで測定されたＨＣＰレベルを示す。
条件１は、３つのパイロットバッチに使用された標準的なプロセスの洗浄スキームを表す。

【0079】

条件２は、０．５ＭのＣａＣｌ_２での洗浄を追加し、洗浄１のリン酸塩をトリスで置き換えて、カルシウムとリン酸が接触することによる沈殿を防止する。
条件３は、平衡および洗浄１緩衝液中の１ＭのＮａＣｌが１５０ｍＭのＮａＣｌに低減されていることを除き、条件２と同じである。

【0080】

【表4】

【0081】

条件２と条件３はどちらもＣａＣｌ_２洗浄を含み、その結果、１ＭのＮａＣｌでの洗浄と比較してＰＬＢＬ２の有意な低減がもたらされる。加えて、ＥＬＩＳＡによって測定した場合の全ＨＣＰの除去は、ＣａＣｌ_２の洗浄で適度に改善される。ＮａＣｌ濃度の低減を１Ｍから１５０ｍＭにさせた条件２と条件３との間で、特筆すべき差はなかった。

【0082】

最初の洗浄による選別の結果に基づき、３つ全てのパイロットスケールのバッチからのローディング材料を使用した認可を受けた実験スケールのカラムにおいて、ＣａＣｌ_２での洗浄を、ＮａＣｌでの洗浄と直接評価した。

【0083】

その後、各泳動からのプロテインＡプールをＡＥＸカラムで処理した。
表５にＰＬＢＬ２ ＥＬＩＳＡの結果を示し、パイロットバッチ１の結果をＬＣ−ＭＳ／ＭＳによっても確認した。

【0084】

【表5】

【0085】

結果から、ＣａＣｌ_２での洗浄は一貫して、３つの全てのパイロットバッチからのローディング材料を使用して、ＰＬＢＬ２のレベルを１０ｎｇ／ｍｇ未満に低減することが実証される。

【0086】

ＣａＣｌ_２での洗浄のロバスト性をさらに確認するために、ＣａＣｌ_２の濃度を変更して複数の泳動を実行した。表６に結果を示し、より一層低いＣａＣｌ_２のレベルでのＰＬＢＬ２除去のロバスト性を確認する。

【0087】

【表6】

【0088】

表７に、タネズマブのプロテインＡクロマトグラフィー工程に最適と見出された最終的なプロセス（表の第２の列）を要約し、標準的なプロセスからなされた最適化（第１の列）を強調する。

【0089】

【表7】

【0090】

ＣａＣｌ_２での洗浄のＰＬＢＬ２をきれいにする能力のさらなる確認として、表７で概説される最適化したプロセスを使用して、追加のパイロットスケールのバッチを泳動した。表８に結果を示し、ＰＬＢＬ２をＰＬＢＬ２ ＥＬＩＳＡアッセイの定量限界未満にすることが実証される。

【0091】

【表8】

【0092】

結論として、上述した実験は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー工程のための洗浄溶液におけるＣａＣｌ_２の使用に関連するＰＬＢＬ２レベルの一貫した低減を実証する。

【0093】

開示された教示を様々な適用、プロセスおよび組成物を参照しながら説明したが、本明細書に記載の教示および下記の特許請求された発明から逸脱することなく様々な変更および改変をなし得ることが理解されると予想される。前述の実施例は、開示された教示をよりよく例示するために提供され、本明細書で示された教示の範囲を限定することは意図していない。本発明の教示をこれらの例示的な実施態様に関して説明したが、当業者は、余計な実験を行うことなく、これらの例示的な実施態様の多数のバリエーションおよび改変が考えられることを容易に理解すると予想される。このような全てのバリエーションおよび改変は、本発明の教示の範囲内である。

【0094】

特許、特許出願、論文、教本など、およびそこで引用された文献を含む本明細書において引用された全ての参考文献は、まだ引用されていない範囲にわたり、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。これらに限定されないが、例えば、定義された用語、用語の用法、記載された技術などの事柄において、組み入れられた文献および類似の資料の１つまたはそれより多くが本出願と異なるかまたは矛盾する場合、本出願が優勢である。

【0095】

前述の説明および実施例は、本発明の特定の具体的な実施態様を詳述し、本発明者らによって予期される最良の形態を記載している。しかしながら、文書中に前述の内容がどれだけ詳細に記載されていても、本発明は多くの方法で実施でき、本発明は、添付の特許請求の範囲およびそれらのあらゆる均等物に従って解釈されるものとする。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]

【外国語明細書】

2021008452000001.pdf