特許 5647599 生物学的試料中の物質を検出する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5647599

(24)【登録日】2014年11月14日

(45)【発行日】2015年1月7日

(54)【発明の名称】生物学的試料中の物質を検出する方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/543 20060101AFI20141211BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20141211BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20141211BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/543 501J

   G01N33/53 UZNA

   !C12N15/00 A

【請求項の数】7

【全頁数】43

(21)【出願番号】特願2011-502767(P2011-502767)

(86)(22)【出願日】2010年3月2日

(86)【国際出願番号】JP2010053359

(87)【国際公開番号】WO2010101157

(87)【国際公開日】20100910

【審査請求日】2013年3月4日

(31)【優先権主張番号】特願2009-48661(P2009-48661)

(32)【優先日】2009年3月2日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000004569

【氏名又は名称】日本たばこ産業株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】506056240

【氏名又は名称】株式会社ウイルス医科学研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100075270

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 泰

(74)【代理人】

【識別番号】100080137

【弁理士】

【氏名又は名称】千葉 昭男

(74)【代理人】

【識別番号】100096013

【弁理士】

【氏名又は名称】富田 博行

(74)【代理人】

【識別番号】100107386

【弁理士】

【氏名又は名称】泉谷 玲子

(72)【発明者】

【氏名】高倉 由光

(72)【発明者】

【氏名】岡 直美

(72)【発明者】

【氏名】近藤 一博

【審査官】 藤田 都志行

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００８／１３００５３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００４／００５３１９（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 国際公開第２００８／０８１９３８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開平０４−２３６３５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 邨次 誠，「(６)ビオチンを利用する化学分析法」，ビタミン，日本ビタミン学会，１９９９年１１月２５日，Vol. 73, No. 11，p. 691-697

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／５４３

Ｇ０１Ｎ ３３／５３

Ｃ１２Ｎ １５／０９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣｉＮｉｉ

医中誌ＷＥＢ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

生物学的試料中の物質を検出する方法であって、
１） ビオチンを結合させた担体、及び、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質を準備し；
２） ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、工程１）で準備した担体に融合タンパク質を結合させて、融合タンパク質が結合した担体を作成し；
３） 工程２）で作成した融合タンパク質が結合した担体に、
（ａ） 生物学的試料、及び
（ｂ−ｉ） 工程１）の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、あるいは
（ｂ−ｉｉ） 工程１）の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
を混合して添加する；そして、
４） 融合タンパク質中の検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質に結合した披検物質を検出する
ことを含む、前記方法。

【請求項2】

生物学的試料中の物質を検出する方法であって、
１） ビオチンを結合させた担体、及び、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質を準備し；
２） ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、工程１）で準備した担体に融合タンパク質を結合させて、融合タンパク質が結合した担体を作成し；
３） 工程２）で作成した融合タンパク質が結合した担体に、ビオチン結合性タンパク質を接触させて担体のブロッキングを行い；
４） 工程３）のブロッキング工程後、融合タンパク質が結合した担体に、
（ａ） 生物学的試料、及び
（ｂ−ｉ） 工程１）の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、あるいは
（ｂ−ｉｉ） 工程１）の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
を混合して添加する；そして、
５） 融合タンパク質中の検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質に結合した披検物質を検出する
ことを含む、前記方法。

【請求項3】

請求項１の工程３（ｂ−ｉ）又は請求項２の工程４（ｂ−ｉ）において、細胞破砕抽出液として、任意のベクターを含む細胞から抽出した細胞破砕抽出液を添加する、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

ビオチン結合性タンパク質がタマビジン又はその変異体である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

生物学的試料が、血液、血清、脳脊髄液、唾液、汗、尿、涙、リンパ液、及び母乳からなる群から選択される、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

生物学的試料中の物質を検出するためのキットであって、
Ａ） 検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質が、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合によって結合している、担体；並びに、
Ｂ−ｉ） Ａ）の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、若しくは
Ｂ−ｉｉ） Ａ）の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液を含む、生物学的試料を希釈するための剤
を含むキット。

【請求項7】

さらに、Ｃ） ビオチン結合性タンパク質を含むブロッキング剤を含む、請求項６に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生物学的試料中の物質を定性的、及び／又は、定量的に検出する方法に関する。本発明の方法により、特に生物学的試料中に微量に存在し、通常は検出が困難な物質の検出も可能である。

【背景技術】

【0002】

被検物質に特異的に結合するタンパク質を疎水結合、共有結合等により結合させた担体を利用した物質の検出方法
生物学的試料中の物質を検出するために、当該物質（被検物質）に対し特異的に結合する物質を利用する方法が、従来より広く用いられている。被検物質に特異的に結合させる物質としては、抗体やその他のタンパク質などが多く用いられる。これらはマイクロプレートや微小ビーズ、あるいはセンサーチップなどの担体に固定化されうる。固定化の汎用的な方法として、疎水結合、共有結合などが知られている。

【0003】

「疎水結合」は、担体の疎水性表面と、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質（以下、「特異的タンパク質」と呼称する場合がある）の疎水性部分との相互作用を利用して、担体と特異的タンパク質とを結合させるものであり、特別な試薬を必要としない点で簡便である。しかしながら、概して結合力は弱く、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）等に用いる場合、結合後の洗浄操作等で、タンパク質が担体から離れてしまうことが多い。また、疎水結合により特異的タンパク質と担体を結合させた場合、タンパク質の多くが、その機能を完全に、あるいは部分的に失ってしまう場合がある。

【0004】

「共有結合」は、特異的タンパク質中の官能基（例えばアミノ基）と担体表面に配置された官能基（例えばカルボキシル基）との相互作用を利用するものであり、結合力は強い。しかし、共有結合により特異的タンパク質と担体とを結合させた場合、疎水結合の場合と同様に、多くのタンパク質において、その機能は完全に、あるいは部分的に失われてしまう。

【0005】

疎水結合や共有結合の他にも、複数のヒスチジンをタンパク質の末端に融合させ、このヒスチジンタグをもつ融合タンパク質を、表面にニッケルが配置された、例えばプロテインチップ等の基板などに結合させる方法が知られている。しかしながら、ヒスチジンタグとニッケルイオンの相互作用はあまり強くなく、さらにニッケルイオンには、様々な生体分子との非特異的な結合が知られている。

【0006】

一般に、こうした被検物質に特異的に結合するタンパク質を疎水結合または共有結合により結合させた固相を用いた特異的結合アッセイ系において、バックグラウンドシグナルの原因となる非特異結合を低減させることは、重要な課題である。この課題を解決する方法として、例えば、細菌成分抽出液を検出用試薬に含有させる方法（特開昭５９−９９２５７）、被検物質に特異的に結合する組換えタンパク質産生に使用したベクターと同種でありかつ当該タンパク質をコードする遺伝子を含まないベクターが導入された宿主細胞の培養成分を試料に添加する方法（特開平８−４３３９２）、被検物質に特異的に結合する組換えタンパク質を産生した細胞と同種であり、かつ当該タンパク質を含まない細胞からの水抽出液を加熱処理した後、その水溶性画分を試料に添加する方法（特開２００４−３０１６４６）などが提案されている。これらの方法により、非特異結合の抑制には一定の効果が見られている。

【0007】

アビジン−ビオチン結合を利用した物質の検出方法
アビジンは、卵白由来の糖タンパク質でビオチン（ビタミンＨ）に極めて強く結合する。アビジンとビオチンの相互作用は最も強い非共有結合の一つである（Ｇｒｅｅｎ （１９７５） Ａｄｖ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ ２９： ８５−１３３）。一方、ストレプトアビジンは放線菌由来のアビジン様タンパク質で、やはりビオチンと強く結合する。これまでに（ストレプト）アビジン−ビオチンの相互作用は、その作用力の強さから、例えば、抗原や抗体の検出など分子生物学や生化学の分野で、広範に用いられている（Ｇｒｅｅｎ （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８４： ５１−６７）。

【0008】

このアビジンやストレプトアビジンのビオチン結合性を利用して、タンパク質を担体に結合させる方法が考案されている。すなわち（ストレプト）アビジンを共有結合や疎水結合によりマイクロプレートなどのような基板に結合し、さらにビオチン化したタンパク質と結合させることにより固定化させる方法である。

【0009】

また、ビオチンを結合させた基板に、まずアビジンタンパク質を、アビジン−ビオチン結合によって結合させ、ここへビオチン化した所望のタンパク質を結合させ、アビジンの別のビオチンポケットに結合させることで、基板−ビオチン−アビジン−ビオチン−所望のタンパク質という順序で固定させる技術が報告されている（特開平４−２３６３５３）。このような方法で固定化したプレートを用いて被検物質を検出することができる。

【0010】

しかしながら、アビジン−ビオチン結合を利用したアッセイも、被検物質に特異的にタンパク質を疎水結合、共有結合等により結合させた固相を用いたアッセイと同様に、バックグラウンドシグナルへの対処が大きな問題である。これに対し、上述の非特異抑制方法に加え、不活性化した（ストレプト）アビジンを結合させた固相に試料を接触させた後に、活性（ストレプト）アビジンを結合させた固相に接触させる方法（特開平８−１１４５９０）、アビジン結合固相にビオチン化物質を結合させた後に、ポリエチレングリコールとビオチンとの抱合体を接触させる方法（特開平１１−２１１７２７）やビオチン含有溶液を接触させる方法（特開２００２−４８７９４）などが提案されている。しかしながら、実用上の効果は十分とは言えなかった。

【0011】

これまで、タンパク質の標識、診断マーカーや細胞特異的標的化因子としての使用を目的に、アビジンまたはストレプトアビジンを用いた融合タンパク質が作成されてきた（Ａｉｒｅｎｎｅ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｂｉｏｍｏｌ Ｅｎｇ １６： ８７−９２）。これらのうち特にアビジンまたはストレプトアビジンと、ｓｃＦｖやＦａｂ断片、ＩｇＧのような抗体との融合タンパク質は、ガン細胞等への薬剤の特異的標的への応用研究が進んでいる。また、ストレプトアビジンとｓｃＦｖとの融合タンパク質を用いて、ｓｃＦｖをアビジン−ビオチン結合を介して固定化したカラムの発想が記載されている（Ｋｉｐｒｉｖａｎｏｖ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂ Ｈｙｂｒｉｄ ６： ９３−１０１、Ｄｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １７８： ２０１−２０９）。しかし、ビオチン結合性タンパク質による固定化を利用して生体試料中の被検物質を検出した例は知られていない。ストレプトアビジン融合タンパク質をビオチン化プレートに固定化し、融合させたタンパク質を抗原とする抗体を用いてＥＬＩＳＡを行った例（ＷＯ２００２／０４６３９５）は報告されているが、これは、ストレプトアビジン融合タンパク質を担体に、活性を失わせることなく固定化することが可能であることを示したに過ぎない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】特開昭５９−９９２５７

【特許文献2】特開平８−４３３９２

【特許文献3】特開２００４−３０１６４６

【特許文献4】特開平８−１１４５９０

【特許文献5】特開平１１−２１１７２７

【特許文献6】特開２００２−４８７９４

【特許文献7】ＷＯ２００２／０４６３９５

【特許文献8】ＷＯ０２／０７２８１７

【非特許文献】

【0013】

【非特許文献1】Ｇｒｅｅｎ （１９７５） Ａｄｖ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ ２９： ８５−１３３

【非特許文献2】Ｇｒｅｅｎ （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８４： ５１−６７

【非特許文献3】Ａｉｒｅｎｎｅ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｂｉｏｍｏｌ Ｅｎｇ １６： ８７−９２

【非特許文献4】Ｋｉｐｒｉｖａｎｏｖ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂ Ｈｙｂｒｉｄ ６： ９３−１０１

【非特許文献5】Ｄｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １７８： ２０１−２０９

【非特許文献6】Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ． （２００９） ＦＥＢＳ Ｊ ２７６： １３８３−１３９７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

本発明は、生物学的試料中の物質を定性的、及び／又は、定量的に検出する方法を提供することを目的とする。

【0015】

本発明は特に、生物学的試料中に微量に存在する物質を、バックグラウンドシグナルを抑えつつ、定性的、及び／又は、定量的に検出・測定する方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0016】

本発明者らは、鋭意研究に努めた結果、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間の結合を用いて、披検物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質を担体に固定化した系を開発した。そして、当該系において、特に生物学的試料中に微量に存在する物質を検出するためには、バックグラウンドシグナルへの対処が大きな問題となることを見出し、これを低下する工夫を行って、本発明を想到した。具体的には、生物学的試料に細胞破砕抽出液及びビオチン結合性タンパク質を添加した場合において、非特異結合を下げる効果が顕著であった。あるいは、ビオチン結合性タンパク質を添加する代わりに、遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液を添加しても同様の効果が得られた。

【0017】

また、本発明者らは、検出物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質を担体に固定化した系において、生物学的試料を添加する前に、ビオチン結合性タンパク質を該担体に接触（ブロッキング）させることにより、より低濃度の物質を、バックグラウンドシグナルを抑えつつ、安定して測定することができることを見出した。

【0018】

本発明は、以上の知見に基づき、アビジン−ビオチン結合を用いて、披検物質を特異的に検出する物質を担体に固定化した系において、非特異結合を減少させたより感度の高い検出方法を提供するものである。

【0019】

限定されるわけではないが、本発明は以下の態様を含む。

【0020】

［態様１］
生物学的試料中の物質を検出する方法であって、
１） ビオチンを結合させた担体、及び、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質を準備し；
２） ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、工程１）で準備した担体に融合タンパク質を結合させて、融合タンパク質が結合した担体を作成し；
３） 工程２）で作成した融合タンパク質が結合した担体に、
（ａ） 生物学的試料、及び
（ｂ−ｉ） 工程１）の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、あるいは
（ｂ−ｉｉ） 工程１）の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
を混合して添加する；そして、
４） 融合タンパク質中の検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質に結合した披検物質を検出する
ことを含む、前記方法。

【0021】

［態様２］
生物学的試料中の物質を検出する方法であって、
１） ビオチンを結合させた担体、及び、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質を準備し；
２） ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、工程１）で準備した担体に融合タンパク質を結合させて、融合タンパク質が結合した担体を作成し；
３） 工程２）で作成した融合タンパク質が結合した担体に、ビオチン結合性タンパク質を接触させて担体のブロッキングを行い；
４） 工程３）のブロッキング工程後、融合タンパク質が結合した担体に、生物学的試料を添加し、そして、
５） 融合タンパク質中の検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質に結合した披検物質を検出する
ことを含む、前記方法。

【0022】

［態様３］
生物学的試料中の物質を検出する方法であって、
１） ビオチンを結合させた担体、及び、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質を準備し；
２） ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、工程１）で準備した担体に融合タンパク質を結合させて、融合タンパク質が結合した担体を作成し；
３） 工程２）で作成した融合タンパク質が結合した担体に、ビオチン結合性タンパク質を接触させて担体のブロッキングを行い；
４） 工程３）のブロッキング工程後、融合タンパク質が結合した担体に、
（ａ） 生物学的試料、及び
（ｂ−ｉ） 工程１）の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、あるいは
（ｂ−ｉｉ） 工程１）の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
を混合して添加する；そして、
５） 融合タンパク質中の検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質に結合した披検物質を検出する
ことを含む、前記方法。

【0023】

［態様４］
態様１の工程３（ｂ−ｉ）又は態様３の工程４（ｂ−ｉ）において、細胞破砕抽出液として、任意のベクターを含む細胞から抽出した細胞破砕抽出液を添加する、態様１又は３に記載の方法。

【0024】

［態様５］
ビオチン結合性タンパク質がタマビジン又はその変異体である、態様１ないし４のいずれか１項に記載の方法。

【0025】

［態様６］
生物学的試料が、血液、血清、脳脊髄液、唾液、汗、尿、涙、リンパ液、及び母乳からなる群から選択される、態様１ないし５のいずれか１項に記載の方法。

【0026】

［態様７］
生物学的試料中の物質を検出するための担体であって、
１） ビオチンを結合させた担体、及び、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質を準備し；
２） ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、工程１）で準備した担体に融合タンパク質を結合させて、融合タンパク質が結合した担体を作成し；
３） 工程２）で作成した融合タンパク質が結合した担体に、ビオチン結合性タンパク質を接触させて担体のブロッキングを行う
ことを含む方法によって調製された、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質が、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合によって結合している、担体。

【0027】

［態様８］
生物学的試料中の物質を検出するためのキットであって、
Ａ） 検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質が、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合によって結合している、担体；並びに、
Ｂ−ｉ） Ａ）の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、若しくは
Ｂ−ｉｉ） Ａ）の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液を含む、生物学的試料を希釈するための剤；および／又は
Ｃ） ビオチン結合性タンパク質を含むブロッキング剤
を含むキット。

【発明の効果】

【0028】

本発明の方法により、生物学的試料中の被検物質の検出において、バックグラウンドシグナルを抑え、より高感度な検出を安定的に行うことができる。本発明の方法により、特に生物学的試料中に微量に存在し、通常は検出が困難な物質の検出も可能になる。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】図１は、ビオチン結合性タンパク質によるブロッキングの模式図である。白丸はビオチンを、黒い楕円はビオチン結合性タンパク質を、白い楕円は被検物質と特異的に結合するタンパク質を示す。 図１Ａ：ビオチン結合性タンパク質によるブロッキングなし、融合タンパク質の固定化あり； 図１Ｂ：ビオチン結合性タンパク質によるブロッキングなし、融合タンパク質の固定化なし； 図１Ｃ：ビオチン結合性タンパク質によるブロッキングあり、融合タンパク質の固定化あり； 図１Ｄ：ビオチン結合性タンパク質によるブロッキングあり、融合タンパク質の固定化なし。

【図2】図２は、大腸菌で発現させたＳＩＴＨ−１とＴＭ２の融合タンパク質をウェスタンブロットにより検出したものである。対照として、ベクターのみを導入した大腸菌を用いた。

【図3】図３は、非特異的結合に及ぼす血清への大腸菌破砕抽出液の添加効果や、タマビジン２によるブロッキング効果を示す。 図３−１は、ＢＳＡ（のみ）でブロッキングした場合の結果を示す。即ち、ＳＩＴＨ−１−ＴＭ２融合タンパク質固定化プレート（０．５％ ＢＳＡ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ）における測定値から、何も固定化していないビオチン化プレート（０．５％ ＢＳＡ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ）における測定値を差し引いた結果を示す。図３−２は、ＢＳＡとＴＭ２でブロッキングした場合の結果を示す。即ち、ＳＩＴＨ−１−ＴＭ２融合タンパク質固定化プレート（５０μｇ／ｍｌ ＴＭ２／０．５％ ＢＳＡ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ）における測定値から、何も固定化していないビオチン化プレート（５０μｇ／ｍｌ ＴＭ２／０．５％ ＢＳＡ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ）における測定値を差し引いた結果を示す。

【図4】図４のレーン２は、大腸菌で発現させたＨａｒｐｉｎとＴＭ２の融合タンパク質をウェスタンブロットにより検出したものである。対照として、ベクターのみを導入した大腸菌を用いた（レーン１）。

【発明を実施するための形態】

【0030】

Ｉ．本発明の検出方法（態様１）
本発明の検出方法（態様１）は、生物学的試料中の物質を検出する方法であって、
１） ビオチンを結合させた担体、及び、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質を準備し；
２） ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、工程１）で準備した担体に融合タンパク質を結合させて、融合タンパク質が結合した担体を作成し；
３） 工程２）で作成した融合タンパク質が結合した担体に、
（ａ） 生物学的試料、及び
（ｂ−ｉ） 工程１）の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、あるいは
（ｂ−ｉｉ） 工程１）の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
を混合して添加する；そして、
４） 融合タンパク質中の検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質に結合した被検物質を検出する
ことを含む。

【0031】

生物学的試料中の検出物質
本発明は、生物学的試料中の物質を検出する方法に関する。

【0032】

本発明における生物学的試料としては、検出対象となる物質が含まれうるものであれば特段限定されない。生物から採取された細胞、組織またはその破片等を含む試料、例えば体液、さらに好ましくは、血液、血清、脳脊髄液、唾液、汗、尿、涙、リンパ液、及び母乳などである。

【0033】

これらの体液は、必要に応じ希釈して用いる。希釈率は通常２倍ないし１００００倍程度、好ましくは１００倍ないし１０００倍程度であるが、これに限定されない。希釈するための溶液は任意の緩衝液が使用されうるが、適当なブロッキング剤を含んでも良い。ブロッキング剤としては、非特異的な結合を抑制する効果が高いものが良く、ＢＳＡやカゼイン等、当業者に周知のブロッキング剤を使用することができる。なお、本発明の態様２は、ブロッキング剤としてビオチン結合性タンパク質を使用する。これについては後述する。

【0034】

本発明の被検物質としては、生物学的試料中の検出または測定が望まれる物質であれば特段の制限はないが、抗体や抗原などのタンパク質やその断片、ペプチド、核酸、糖質、糖脂質などを好ましく使用することができる。

【0035】

本発明は生物学的試料中、濃度が低く従来の方法では検出や正確な定量が困難であった物質の測定も可能となる。例えば、披検物質が例えば血清中の抗体であって、さらにその抗体価が低い場合（例えば、血清を１０００倍希釈した場合には検出が難しいが、１００倍希釈した場合に、ようやく検出が可能となるような低い抗体価の場合）には、血清の希釈率を抑制することが必要となり、その結果、血清中成分に由来する非特異的な結合も増加してしまうため、既存の方法では当該抗体の検出や定量は困難であるが、本発明の方法によって容易に検出、あるいはより正確に定量することが可能となる。

【0036】

限定されるわけではないが、本発明における被検物質として、例えば、Ｓｍａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｏｆ ＨＨＶ−６ （ＨＨＶ−６の潜伏感染中間段階転写物によってコードされる小タンパク質）（ＳＩＴＨ−１）に対する抗体が含まれる。その他にも、ヘルペスウイルスの上記以外の抗原に対する抗体、サイトメガロウイルス、肝炎ウイルス、HIVウイルス、ＨＴＬＶウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルスなどに由来するウイルス関連抗原に対する抗体、あるいはヘリコバクター・ピロリ菌などに由来する細菌関連抗原に対する抗体、あるいは菌類関連抗原に対する抗体などが挙げられる。

【0037】

ＰＣＴ／ＪＰ２００８／６７３００及び米国仮出願Ｎｏ．６１／１０２４４１の記載内容に基づくＳＩＴＨ−１
（１）ＳＩＴＨ−１タンパク質、核酸
ＳＩＴＨ−１タンパク質、核酸の構造及び機能は、ＰＣＴ／ＪＰ２００８／６７３００に開示されており、その全内容が本明細書中に援用される。

【0038】

ＳＩＴＨ−１は、ヘルペスウイルスの潜伏感染に関与する因子、より詳細にはヘルペスウイルスの潜伏感染時に特異的に発現するタンパク質である。ここで「ヘルペスウイルスの潜伏感染時に特異的に発現する」とは、ヘルペスウイルスが感染している宿主において、ヘルペスウイルスが潜伏感染している（増殖感染していない）際に、特異的に、ヘルペスウイルス由来の遺伝子又は遺伝子産物が発現することをいう。

【0039】

ＳＩＴＨ−１のタンパク質及び核酸としては、例えば、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及びこのタンパク質をコードする核酸が挙げられる。

【0040】

配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＳＩＴＨ−１タンパク質は、後述する参考例に示すように、ヒトヘルペスウイルス−６（ＨＨＶ−６）の潜伏感染時に特異的に発現するタンパク質として単離・同定されたものである。ＳＩＴＨ−１タンパク質は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、１５９アミノ酸からなる、分子量約１７．５ｋＤａのタンパク質である。

【0041】

ＳＩＴＨ−１タンパク質は、ＳＩＴＨ−１遺伝子の核酸によってコードされている。このＳＩＴＨ−１遺伝子のｃＤＮＡは、配列番号３に示すように、１７９５塩基対（約１．７９ｋｂｐ）のサイズを有しており、９５４番目から９５６番目の塩基配列が開始コドン（Ｋｏｚａｋ ＡＴＧ）であり、１４３１番目から１４３３番目の塩基配列が終止コドン（ＴＡＡ）である。したがって、上記ＳＩＴＨ−１核酸は、配列番号３に示す塩基配列のうち、９５４番目から１４３０番目までの塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として有しており、このＯＲＦは、４７７塩基対（約０．４８ｋｂｐ）のサイズを有している。ＳＩＴＨ−１のｃＤＮＡのうち、ＯＲＦ領域を表す塩基配列を配列番号２に示す。なお、配列番号２に示す塩基配列は、ストップコドンの３塩基を含んで記載している。

【0042】

ＳＩＴＨ−１核酸は、ＨＨＶ−６が潜伏感染している細胞の細胞質において常に発現している一方、増殖感染細胞では発現が認められない。ＳＩＴＨ−１タンパク質をコードする核酸は、これまでに報告したＨＨＶ−６潜伏感染特異的遺伝子（Ｈ６ＬＴ）と相補鎖の関係にあるＤＮＡにコードされ、その発現は、ＨＨＶ−６の潜伏感染の中間段階において増強する。これらの事実から、ＳＩＴＨ−１タンパク質は、ＨＨＶ−６の潜伏感染時に特異的に発現するタンパク質であると考えられる。

【0043】

ＳＩＴＨ−１タンパク質は、宿主タンパク質であるＣＡＭＬ（ｃａｌｃｉｕｍ−ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ ｌｉｇａｎｄ、Ａｃｃｅｓｉｏｎ ＃； Ｕ１８２４２、）と結合し、グリア細胞内カルシウム濃度を上昇させる。ＣＡＭＬは宿主生体内において、脳とリンパ球に多く存在し、細胞内のカルシウム濃度を上昇させることが知られているタンパク質である。また、ＳＩＴＨ−１タンパク質の発現による細胞内カルシウム濃度の上昇は、潜伏感染細胞内の全般的なシグナル伝達の活性化をもたらし、ＨＨＶ−６の効率的な再活性化に寄与するものと考えられる。

【0044】

ＨＨＶ−６は脳内のグリア細胞で潜伏感染することが知られており、潜伏感染時や活性の高い潜伏感染状態である中間段階にあるＨＨＶ−６がＳＩＴＨ−１を発現させると、グリア細胞内のカルシウム濃度が上昇するものと考えられる。脳の細胞における細胞内カルシウム濃度の上昇は、気分障害などの精神障害と大いに関係するものと考えられている（理研年報２００３）。

【0045】

ＳＩＴＨ−１タンパク質は、宿主のタンパク質であるＣＡＭＬと結合する活性を保持し、細胞内カルシウム濃度を上昇させる機能を有するものである。また、ＳＩＴＨ−１タンパク質を、このタンパク質が最も強く発現すると考えられる脳内のグリア細胞で発現させることにより、精神障害を誘導できる。それゆえ、ＳＩＴＨ−１タンパク質は、ヘルペスウイルスの潜伏感染時または再活性化初期に発現し、宿主に精神障害を生じさせる機能を有すると考えられる。

【0046】

（２）ＳＩＴＨ−１に対する抗体
ＳＩＴＨ−１に対する抗体は、ＳＩＴＨ−１タンパク質又はその変異体、あるいはそれらの部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得られる。公知の方法としては、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗらの「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８））、岩崎らの「単クローン抗体 ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ、講談社（１９９１）」」に記載の方法が挙げられる。このようにして得られる抗体は、ＳＩＴＨ−１タンパク質の検出・測定などに利用できる。

【0047】

用語「抗体」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ及びこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）₂フラグメント、Ｆｃフラグメント）を意味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体及びヒト化抗体が挙げられるがこれらに限定されるものではない。

【0048】

用語「ＳＩＴＨ−１タンパク質を認識する抗体」は、ＳＩＴＨ−１タンパク質に特異的に結合し得る完全な分子及び抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）₂フラグメント）を含むことを意味する。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）₂並びにＳＩＴＨ−１抗体の他のフラグメントは、本明細書中で開示される方法、又は公知の方法に従って使用され得る。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生じる）又はペプシン（Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントを生じる）のような酵素を使用するタンパク質分解による切断によって産生される。

【0049】

気分障害患者、又は、気分障害の可能性のある個体は、ＳＩＴＨ―１タンパク質の発現量が増加しており、その結果ＳＩＴＨ−１抗体価も上昇していると考えられる。本発明は、一態様において、生物学的試料中のＳＩＴＨ−１抗体を検出することにより、気分障害患者又は気分障害の可能性のある個体を同定することを可能にする。

【0050】

検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質が結合した担体（態様１の工程１）及び２））
本発明の検出方法は、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質が、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合によって結合している、担体を利用する。

【0051】

本発明の担体は、
１） ビオチンを結合させた担体、及び、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質を準備し；
２） ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、工程１）で準備した担体に融合タンパク質を結合させて、融合タンパク質が結合した担体を作成する、
ことを含む方法によって作成することができる。

【0052】

ビオチンを結合させた担体
「ビオチン」とは、Ｄ−［（＋）−ｃｉｓ−ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ−（３，４）−イミダゾール−４−吉草酸］の一般名称である。ビタミンＢ群に分類される水溶性ビタミンの一種で、Ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ₇（ビタミンＢ₇）とも呼ばれる、あるいは、ビタミンＨ、補酵素Ｒとも言われることもある。ビオチンは卵白中に含まれる糖タンパク質の一種、アビジンと非常に強く結合し、その吸収が阻害される。そのため、生卵白の大量摂取によってビオチン欠乏症を生じることがある。

【0053】

本明細書中において「ビオチン」とは、上記ビオチンの他、イミノビオチン（ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ）（Ｈｏｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９８０） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７：４６６６−４６６８）や、デスチオビオチン（ｄｅｓｔｈｉｏｂｉｏｔｉｎ）（Ｈｉｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３０８： ３４３−３５７）、あるいはビオシチン（ｂｉｏｃｙｔｉｎ）やＢｉｏｔｉｎ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ等のビオチン類縁体も含む。

【0054】

ビオチン−アビジン（ビオチン結合性タンパク質）複合体を用いたシステムは、組織免疫学やＤＮＡ分析、臨床検査などの分野で広く利用されている。本発明のタンパク質を担体に結合する方法は、ビオチン結合性タンパク質に所期のタンパク質を結合させた融合タンパク質を、ビオチン−アビジン結合を利用して、担体に結合させるものである。本発明の方法では、従来のビオチン−アビジン結合を利用した結合と比較して、タンパク質の機能を損なうことなく、遥かに効率良く作用させることが可能になる。

【0055】

固体担体を構成する材料は、セルロース、テフロン（登録商標） 、ニトロセルロース、アガロース、デキストラン、キトサン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリプロピレン、ナイロン、ポリジビニリデンジフルオライド、ラテックス、シリカ、ガラス、ガラス繊維、金、白金、銀、銅、鉄、ステンレススチール、フェライト、シリコンウエハ、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリ乳酸、樹脂、多糖類、タンパク（アルブミン等）、炭素またはそれらの組合せ、などを含むがこれらに限定されない。また、一定の強度を有し、組成が安定し、かつ非特異結合が少ないものが好ましい。

【0056】

固体担体の形状は、ビーズ、磁性ビーズ、薄膜、微細管、フィルター、プレート、マイクロプレート、カーボンナノチューブ、センサーチップなどを含むがこれらに限定されない。薄膜やプレートなどの平坦な固体担体は、当該技術分野で知られているように、ピット、溝、フィルター底部などを設けてもよい。

【0057】

発明の一態様において、ビーズは、約２５ｎｍ〜約１ｍｍの範囲の球体直径を有しうる。好ましい態様では、ビーズは約５０ｎｍ〜約１０μｍの範囲の直径を有する。ビーズのサイズは特定の適用に応じて選択されうる。いくらかの細菌スポアは約１μｍのオーダーのサイズを有するので、かかるスポアを捕捉するための好ましいビーズは１μｍよりも大きい直径を有する。

【0058】

限定されるものではないが、例えば、高い検出感度が望まれる場合においては、検出すべき物質とこれに特異的に結合する物質との接触頻度や洗浄操作の容易性といった観点から、固体担体として上記のようなビーズを好ましくは使用することができる。

【0059】

ビオチンを担体に結合させる方法として、例えばビオチン化試薬を用いる方法が挙げられる。ビオチン化試薬として例えば、ＰＩＥＲＣＥ社製の（カッコ内は順にリンカー長、反応基） ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標） Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（１３．５Å、１級アミン）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標） Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（２２．４Å、１級アミン）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標） Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（３０．５Å、１級アミン）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標） ＰＦＰ−Ｂｉｏｔｉｎ（９．６Å、アミン）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標） Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＯ₂−Ｂｉｏｔｉｎ（２９．１Å、チオール基）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標） Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＯ₂ Ａｍｉｎｅ（２０．４Å、カルボキシル基）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標） Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＯ₃−ＬＣ Ａｍｉｎｅ（２２．９Å、カルボキシル基）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標） Ｂｉｏｔｉｎ−Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（１５．７Å、アルデヒド基）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標） Ｂｉｏｔｉｎ−ＬＣ−Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（２４．７Å、アルデヒド基）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標） ＮＨＳ−Ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ（１３．５Å、１級アミン）などを利用できるが、これらに限定されるものではない。

【0060】

上記ビオチン化試薬を用いて、マイクロプレート、微小ビーズ、あるいはセンサーチップなど所望の担体に、公知の方法を使用してビオチンを結合させることができる。例えば、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、トシル基、エポキシ基、マレイミド基、活性化エステルなど種々の官能基を持つ担体（例えば磁性ビーズ、セファロースビーズ、アガロースビーズ、ラテックスビーズ、マイクロタイタープレートなど）を用いる方法がある。この場合例えば、ＮＨＳエステルを含むビオチン化試薬を用いる場合は、ＤＭＳＯ（ｄｅｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）のような有機溶媒か、ｐＨ７−９のリン酸緩衝液で溶解し、アミノ基を持つ固定化担体に添加することによってビオチンを結合させることができる。また、例えばアミノ基を含むビオチン化試薬を用いる場合は、ＥＤＣ（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ） ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）のようなカルボジイミドを用いて固定化担体のカルボキシル基を活性化エステルに変換させた後、ｐＨ５付近の緩衝液で溶解したビオチン化試薬を添加して、ビオチンを結合させてもよい。なお、ビオチン化した固定化担体は、好ましくは未反応の官能基を不活性化した後、ＢＳＡなどでブロッキングする。

【0061】

また、ビオチン化された市販担体を利用することもできる。ビオチン化されたマイクロプレートとしては、例えば、Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ^TM Ｂｉｏｔｉｎ Ｃｏａｔｅｄ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｐｌａｔｅｓ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を利用できるが、これに限定されるものではない。ビオチン化された微小ビーズとしては、例えば、磁性ビーズとして、ＢｉｏＭａｇ Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）が、ナノ磁性ビーズとして、コアフロント社製のｎａｎｏｍａｇ（登録商標）−Ｄ ｂｉｏｔｉｎ、ｎａｎｏｍａｇ（登録商標）−ｓｉｌｉｃａ ｂｉｏｔｉｎが、ポリスチレン製マイクロビーズとして、Ｂｅａｄｌｙｔｅ（登録商標） Ｂｉｏｔｉｎ Ｂｅａｄｓ（Ｕｐｓｔａｔｅ社製）が、アガロースとしてＳｉｇｍａ社製の、Ｂｉｏｔｉｎ Ａｇａｒｏｓｅ、２−ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ−Ａｇａｒｏｓｅが、高架橋アガロースとして、Ｂｉｏｔｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（バイオリサーチテクノロジー社製）を利用できるが、これらに限定されるものではない。

【0062】

担体とビオチンと繋ぐリンカーの長さは、少なくとも５Åより長いことが好ましく、より好ましくは１３．５Å以上、より好ましくは２２．４Å以上、さらにより好ましくは３０．５Å以上である。

【0063】

検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質
被検物質と特異的に結合するタンパク質（以下、「特異的タンパク質」と呼称する場合がある）は、特に限定されない。当該発明による一つの態様としては、例えばこれらに限定されるものではないが、抗原と抗体、ホルモン等のリガンドと受容体、レクチンと糖、核酸の相補的結合等において、その一方を、他方との特異的な複合体形成能力を利用して、被検試料から選択的に分析する。

【0064】

より詳細には、例えばタンパク質としては、抗体、抗原タンパク質、レクチン、ペプチド、あるいはプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、受容体、酵素タンパク質などが挙げられる。抗体としては、ＩｇＧの他、ｓｃＦｖやＦａｂ等の抗原結合部位を含む抗体断片が、抗原タンパク質としては、Ｂ型・Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペスウイルス等のウイルス由来のタンパク質や、ヘリコバクター・ピロリ等の細菌由来のタンパク質、あるいはＣＥＡ、ＰＳＡ等の腫瘍マーカー、性ホルモンなどが挙げられる。レクチンは、糖結合性タンパク質であり、マンノース特異的レクチン、ＧａｌＮＡｃ特異的レクチン、ＧｌｃＮＡｃ特異的レクチン、フコース特異的レクチン、シアル酸特異的レクチンなどの単糖特異的レクチン、オリゴ糖特異的レクチンなどが挙げられる。また、ＤＮＡ／ＲＮＡ結合タンパク質等も挙げられる。更にペプチドとしては、２〜１００アミノ酸からなるもの、好ましくは４〜５０アミノ酸からなるもの、より好ましくは６〜３０アミノ酸からなるものが、例として挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0065】

また、限定されるわけではないが、本発明において、被検物質と特異的に結合するタンパク質の例として、ＳＩＴＨ−１タンパク質を挙げることができる。

【0066】

ビオチン結合性タンパク質
本発明は、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質の間の結合を利用して、被検物質と特異的に結合するタンパク質を担体に固定することを含む。本発明において、「ビオチン−ビオチン結合性タンパク質の間の結合」を「アビジン−ビオチン結合」と呼称する場合がある。

【0067】

ビオチン結合性タンパク質としては、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ＡＶＲタンパク質（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．，（２００２）， ３６３： ６０９−６１７）、ブラダビジン（Ｂｒａｄａｖｉｄｉｎ）（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，（２００５）， ２８０： １３２５０−１３２５５）、リザビジン（Ｒｈｉｚａｖｉｄｉｎ）（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， （２００７），４０５：３９７−４０５）、タマビジン（ＷＯ０２／０７２８１７）やこれらの変異体等、ビオチンと強く結合するタンパク質であれば、いずれも好適に使用することができる。好ましくは、少なくともビオチンとの解離定数（ＫＤ）が１０^-6、さらに好ましくは１０^-8以下、さらに好ましくは１０^-10以下である。但し、被検試料に添加するビオチン結合性タンパク質、ならびに担体ブロッキングに使用するビオチン結合性タンパク質については、後述のとおりである。

【0068】

ビオチン結合性タンパク質として、特に、大腸菌で高発現するタマビジンとその変異体を好ましく用いることができる。タマビジンは、食用キノコである担子菌タモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｃｏｎｕｃｏｐｉａｅ）から発見されたビオチン結合性タンパク質である（ＷＯ０２／０７２８１７、Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ． （２００９） ＦＥＢＳ Ｊ ２７６： １３８３−１３９７）。タマビジンの変異体としては、例えば、高結合能・低非特異結合タマビジン（ＰＣＴ／ＪＰ２００９／６４３０２）等が挙げられる。

【0069】

本発明における「タマビジン」は、タマビジン１、タマビジン２、またはそれらの変異体を意味する。具体的には、本発明のタマビジンは典型的には、配列番号５もしくは配列番号７のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、または、配列番号４もしくは配列番号６の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質、であってよい。あるいは、本発明のタマビジンは、配列番号５もしくは配列番号７のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、または、配列番号４もしくは配列番号６の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質、の変異体であって、タマビジン１または２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質、あるいは、高結合能・低非特異結合の活性を有するタンパク質であってよい。本明細書において、タマビジン１、タマビジン２、およびそれらの変異体を総称して、単にタマビジンと呼ぶことがある。

【0070】

タマビジン１または２の変異体は、配列番号５または７のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、タマビジン１または２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質であってもよい。置換は、保存的置換であってもよく、これは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることである。保存的置換の非限定的な例には、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａ相互の置換のような脂肪族基含有アミノ酸残基の間の置換、ＬｙｓおよびＡｒｇ、ＧｌｕおよびＡｓｐ、ＧｌｎおよびＡｓｎ相互の置換のような極性残基の間での置換などが含まれる。

【0071】

アミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加による変異体は、野生型タンパク質をコードするＤＮＡに、例えば周知技術である部位特異的変異誘発（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ．１０， Ｎｏ． ２０， ｐ．６４８７−６５００， １９８２参照、引用によりその全体を本明細書に援用する）を施すことにより作成することができる。本明細書において、「１または複数のアミノ酸」とは、好ましくは部位特異的変異誘発法により欠失、置換、挿入および／または付加できる程度のアミノ酸を意味する。また、本明細書において「１または複数のアミノ酸」とは、場合により、１または数個のアミノ酸を意味してもよい。限定されるわけではないが、「１または複数のアミノ酸」とは、５０個以内、好ましくは、４０個以内、３０個以内、２０個以内、１０個以内、８個以内、５個以内、３個以内のアミノ酸を意味する。 タマビジン１または２の変異体はさらに、配列番号５または７のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上、好ましくは６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上、より好ましくは９９．３％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、タマビジン１または２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質、あるいは、高結合能・低非特異結合の活性を有するタンパク質であってもよい。

【0072】

２つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査および数学的計算によって決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ， Ｓ． Ｂ． 及びＷｕｎｓｃｈ， Ｃ． Ｄ． （Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４８： ４４３−４５３， １９７０）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｓ． 及びＨｅｎｉｋｏｆｆ， Ｊ． Ｇ． （Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９： １０９１５−１０９１９， １９９２）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。

【0073】

当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。同一性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ．， ２５， ｐ．３３８９−３４０２， １９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。または、２つのアミノ酸配列の同一性％は、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．７（ゼネティックス製）などのプログラム、または、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなどを用いて決定してもよい。その際、検索はデフォルト値を用いてよい。

【0074】

２つの核酸配列の同一性％は、視覚的検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １２： ３８７）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの核酸配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。

【0075】

なお、担体に結合させる融合タンパク質を構成する「ビオチン結合性タンパク質」は、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、担体に融合タンパク質を結合させて、融合タンパク質が結合した担体を作成するために利用されるものである。よって、限定されるわけではないが、上記タマビジン１又はタマビジン２の変異体は、これらの野生型を利用して融合タンパク質を形成した場合と比較して、ビオチン結合活性が大きく減少していないことが好ましい。

【0076】

よって、非限定的に、タマビジン１の変異体は、配列番号５のアミノ酸配列において、Ｎ１４、Ｓ１８、Ｙ３４、Ｓ３６、Ｓ７８、Ｗ８２、Ｗ９８、Ｗ１１０、Ｄ１１８が改変されないことが好ましい。なお表記の、例えばＹ３４は、配列番号５のアミノ酸配列の第３４番目のチロシン残基を意味する。あるいは、これらを改変する場合には、性質あるいは構造が類似したアミノ酸に改変することが好ましく、例えばアスパラギン（Ｎ１４）の場合は、グルタミン（Ｑ）やアスパラギン酸（Ｄ）へ、好ましくはアスパラギン酸へ、セリン（Ｓ１８、Ｓ３６、Ｓ７８）の場合は、スレオニン（Ｔ）あるいはチロシン（Ｙ）へ、好ましくはスレオニンへ、チロシン（Ｙ３４）の場合は、セリン（Ｓ）やスレオニン（Ｔ）あるいはフェニルアラニン（Ｆ）へ、好ましくはフェニルアラニンへ、トリプトファン(Ｗ８２、Ｗ９８、Ｗ１１０)の場合は、フェニルアラニン（Ｆ）へ、アスパラギン酸（Ｄ１１８）の場合は、グルタミン酸（Ｅ）やアスパラギン（Ｎ）へ、好ましくはアスパラギンへ、それぞれ改変することが好ましい。

【0077】

また、タマビジン２の変異体は、配列番号７のアミノ酸配列において、４つのトリプトファン残基（Ｗ６９、Ｗ８０、Ｗ９６、Ｗ１０８）が改変されないことが好ましい。あるいは、これらを改変する場合には、性質あるいは構造が類似したアミノ酸、例えばフェニルアラニン（Ｆ）への改変が好ましい。また、ビオチンと直接相互作用すると考えられるアミノ酸残基（Ｎ１４、Ｓ１８、Ｙ３４、Ｓ３６、Ｓ７６、Ｔ７８、Ｄ１１６）についても改変されないことが望ましい。あるいは、これらを改変する場合にはビオチンとの結合を維持できるよう、性質あるいは構造が類似したアミノ酸に改変することが好ましく、例えばアスパラギン（Ｎ１４）の場合は、グルタミン（Ｑ）やアスパラギン酸（Ｄ）へ、好ましくはアスパラギン酸へ、アスパラギン酸（Ｄ４０）の場合は、アスパラギン（Ｎ）へ、セリン（Ｓ１８、Ｓ３６、Ｓ７６）の場合は、スレオニン（Ｔ）あるいはチロシン（Ｙ）へ、好ましくはスレオニンへ、チロシン（Ｙ３４）の場合は、セリン（Ｓ）やスレオニン（Ｔ）あるいはフェニルアラニン（Ｆ）へ、好ましくはフェニルアラニンへ、スレオニン（Ｔ７８）の場合は、セリン（Ｓ）やチロシン（Ｙ）へ、好ましくはセリンへ、アスパラギン酸（Ｄ１１６）の場合は、グルタミン酸（Ｅ）やアスパラギン（Ｎ）へ、好ましくはアスパラギンへ、それぞれ改変することが好ましい。

【0078】

本発明において、好ましいタマビジン改変体には以下のものが含まれる。（ＰＣＴ／ＪＰ２００９／６４３０２）。

【0079】

配列番号７に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、以下のグループ
１）配列番号７の１０４番目のアルギニン残基；
２）配列番号７の１４１番目のリジン残基；
３）配列番号７の２６番目のリジン残基；及び
４）配列番号７の７３番目のリジン残基
から選択される１または複数の残基が、酸性アミノ酸残基又は中性アミノ酸残基に置換されていることを特徴とする、改変型ビオチン結合タンパク質である。

【0080】

より好ましくは、配列番号７において、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｒ１０４Ｅ−Ｋ１４１Ｅ）；
配列番号７において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、そして、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｒ１０４Ｅ）；
配列番号７において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｋ１４１Ｅ）；並びに、
配列番号７において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｒ１０４Ｅ−Ｋ１４１Ｅ）、
からなるグループから選択される、改変型ビオチン結合タンパク質である。

【0081】

被検物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質
本発明は、被検物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質（以下、「ビオチン結合性タンパク質融合タンパク質」、又は「融合タンパク質」と呼称する場合がある。）を担体に固定する。

【0082】

ビオチン結合性タンパク質融合タンパク質の準備の方法は特に限定されず、例えば公知の遺伝子工学的手法を用いて発現させてもよい。例えば、ビオチン結合性タンパク質と所望のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を、大腸菌等の発現システムを用いて発現することによって取得することができる。なお大腸菌で高発現させるにはタマビジンやその変異体が好適である。

【0083】

ビオチン結合性タンパク質融合タンパク質において、ビオチン結合性タンパク質と所望のタンパク質は直接結合していてもよく、あるいはリンカーを介して結合していてもよいが、アミノ酸のリンカーを介した結合が好ましい。このリンカーの長さは、少なくとも１アミノ酸以上であればよいが、好ましくは５アミノ酸以上、さらに好ましくは６アミノ酸以上である。また、担体と結合しているビオチンとタマビジンとの結合力を一層向上させるためには、好ましくは１０アミノ酸以上、より好ましくは１２アミノ酸以上、１５アミノ酸以上、１８アミノ酸以上、更に好ましくは２５アミノ酸以上である。また、このようなリンカーはタマビジン融合タンパク質の活性をも向上させると推測される。このリンカーを構成するアミノ酸は特に限定されないが、好ましくは、グリシン、セリン、あるいはアラニンのような中性アミノ酸の繰り返しからなる。例えば、これらに限定されないが、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＳＧＧ、ＧＡＳＡＧ、ＧＳＧＡＡ、ＧＳＧＳＡ、ＧＧＧＧＳＧ、ＧＧＧＳＧＧＳ、ＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＡＡＡＡＧＳＧＡＡ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８−１８）などが挙げられる。

【0084】

またビオチン結合性タンパク質は、所望のタンパク質のＮ末端側、もしくはＣ末端側のどちらに結合させても良い。また所望のタンパク質を発現させるにあたり、例えば大腸菌の細胞質よりもペリプラズム空間の方が適する場合には、ペリプラズムに標的するためのリーダー配列を用いても良い。このようなリーダー配列として、ＰｅｌＢ（Ｌｅｉ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １６９： ４３７９−４３８３）やＯｍｐＡ（Ｇｅｎｔｒｙ−Ｗｅｅｋｓ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７４： ７７２９−７７４２）等があるが、これらに限定されるものではない。

【0085】

ビオチン結合性タンパク質融合タンパク質が可溶性画分から得られる場合は、粗タンパク抽出液を精製することなく、ビオチン化担体と接触させ、融合タンパク質をビオチン化担体に結合させてもよい。これをその後十分に洗浄することで、融合タンパク質の精製と担体への固定化が一度でできる。あるいはイミノビオチン等（Ｈｏｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９８０） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７： ４６６６−４６６８）のビオチン類縁体の結合したカラムを用いて精製してから、ビオチン化担体に結合させることもできる。

【0086】

あるいはまた、ビオチン結合性タンパク質融合タンパク質のＮ末端若しくはＣ末端に、さらに精製用のタグを付加しても良い。このようなタグとして例えば、ｃ−ｍｙｃエピトープタグ（Ｍｕｎｒｏ ａｎｄ Ｐｅｌｈａｍ （１９８６） Ｃｅｌｌ ４６： ２９１−３００）やヒスチジンタグ（Ｈｏｃｈｕｌｉ ｅｔ ａｌ （１９８８） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ ６： １３２１−１３２５、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６３： ７２１１−７２１５）、Ｈａｌｏタグ（Ｌｏｓ ａｎｄ Ｗｏｏｄ （２００７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３５６： １９５−２０８）、Ｆｌａｇタグ（Ｅｉｎｈａｕｅｒ ａｎｄ Ｊｕｎｇｂａｕｅｒ （２００１） Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４９： ４５５−４６５）等があり、あるいはそれらの組合せも考えられるが、これらに限定されるものではない。

【0087】

融合タンパク質が不溶性画分から得られる場合は、例えば尿素や塩酸グアニジンのようなカオトロピック塩を用いて、一度タンパク質を可溶化し、その後透析等を用いて、カオトロピック塩を徐々に抜きながら、タンパク質のリフォルディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）を促す、公知の方法が取られる（Ｓａｎｏ ａｎｄ Ｃａｎｔｏｒ （１９９１） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９： １３７８−１３８１、Ｓａｎｏ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９： １５３４−１５３８）。

【0088】

あるいはまた、所望のタンパク質が大腸菌内で不溶性画分に発現する場合、例えば、マルトース結合タンパク質（Ｂａｃｈ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３１２： ７９−９３）や、チオレドキシン（Ｊｕｒａｄｏ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３５７： ４９−６１）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（Ｔｕｄｙｋａ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ （１９９７） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ６： ２１８０−２１８７）、あるいはＩｄｅｎｏ ｅｔ ａｌ （２００４） Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ６４： ９９−１０５に記載されているようなシャペロン類を共発現させるか、もしくは融合タンパク質にさらにシャペロンを融合させた３連融合タンパク質を作製してもよい。なお、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン、グルタチオンＳトランスフェラーゼは精製用のタグとしても利用できる。

【0089】

融合タンパク質の発現システムとして、昆虫細胞や植物細胞、哺乳類細胞、酵母細胞、枯草菌細胞、無細胞発現系など、他の公知の発現系で発現させてもよい。特に融合相手のタンパク質が植物細胞で発現する場合（例えば植物レクチンなど）は、当該融合タンパク質も植物細胞の発現系で発現させることが好ましい。当業者は、融合相手のタンパク質の性質を考慮し適切な発現系を選択することが可能である。

【0090】

融合タンパク質の担体への結合
本発明においては、ビオチンを結合させた担体と、ビオチン結合性タンパク質融合タンパク質を準備し、両者を接触させることにより、アビジン−ビオチン結合を介して担体にタンパク質を結合させることができる。

【0091】

限定されるわけではないが、ビオチン結合性タンパク質融合タンパク質を含む細胞破砕粗抽出液を、０．１ｍｇ/ｍｌないし５ｍｇ/ｍｌ、好ましくは０．２ｍｇ/ｍｌないし２ｍｇ/ｍｌの総タンパク質濃度で準備する。これを、１０℃ないし４０℃で、好ましくは２０℃ないし３０℃で、５分ないし２時間、好ましくは３０分ないし１時間、ビオチンを結合させた担体と接触させる。あるいはまた、０．１μｇ/ｍｌないし５μｇ/ｍｌの濃度の精製したビオチン結合性タンパク質融合タンパク質を、ビオチンを結合させた担体と接触させてもよい。

【0092】

担体への生物学的試料の添加（態様１の工程３）
本発明の態様１の方法は、融合タンパク質が結合した担体を準備した後に、工程３）として、
工程２）で作成した融合タンパク質が結合した担体に、
（ａ） 生物学的試料、及び
（ｂ−ｉ） 工程１）の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、あるいは
（ｂ−ｉｉ） 工程１）の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
を混合して添加する、ことを含む。

【0093】

一般に、担体を利用した検出方法において、バックグラウンドシグナルの原因となる非特異結合を低減させるため、細菌成分抽出液を検出用試薬に含有させる方法（特開昭５９−９９２５７）、被検物質に特異的に結合する組換えタンパク質産生に使用したベクターと同種でありかつ当該タンパク質をコードする遺伝子を含まないベクターが導入された宿主細胞の培養成分を試料に添加する方法（特開平８−４３３９２）、被検物質に特異的に結合する組換えタンパク質を産生した細胞と同種であり、かつ当該タンパク質を含まない細胞からの水抽出液を加熱処理した後、その水溶性画分を試料に添加する方法（特開２００４−３０１６４６）などが知られている。

【0094】

本発明者らは、上記の方法を融合タンパク質の系に試みたが、十分な効果を得ることができなかった。しかし、鋭意研究の結果、より顕著な効果を得る方法を想到した。具体的には、被検試料を担体に接触させる際に、細胞破砕抽出液、並びにビオチン結合性タンパク質の両方を同時に存在させると好ましいことを見いだした。

【0095】

一態様において、融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質を、生物学的試料と混合して添加する。被検試料に、ビオチン結合性タンパク質と細胞の破砕抽出液を加える場合、いずれを先に添加してもよく、また同時に添加してもよい。あるいはビオチン結合性タンパク質と細胞の破砕抽出液を混合した後に被検試料に添加してもよい。

【0096】

別の一態様において、融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液を被検試料に混合して添加してもよい。具体的には、ビオチン結合性タンパク質をコードする核酸を発現ベクターに組み込んで、組換えタンパク質を細胞に発現させ、この細胞の破砕抽出液を用いても良い。

【0097】

被検試料が血清等の場合、通常血清を細胞破砕抽出液で１０倍から１００００倍、好ましくは１００倍から１０００倍、より好ましくは１００倍から５００倍に希釈して用いる。

【0098】

細胞破砕抽出液が由来する細胞は、大腸菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞など、特段の制限はないが、融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞であることが好ましい。例えば、融合細胞を大腸菌で調製した場合、細胞破砕抽出液も大腸菌から調製することが望ましい。また、無細胞系により融合タンパク質を発現させた場合は、使用した細胞破砕抽出液をそのまま、あるいは所望の緩衝液に懸濁して、使用することができる。

【0099】

より好ましくは、細胞は、生物学的試料が由来する生物とは異なる種の生物由来の細胞であることは好ましい。例えば、生物学的試料がヒト由来の試料である場合、好ましくは、細胞破砕抽出液もヒト以外の生物に由来する細胞から調製するのが好ましい。しかしながら、例えば、融合タンパク質を哺乳動物細胞で発現させる場合、特定の癌細胞等から調製した培養細胞株を使用する場合が一般的である。このような場合、ヒト培養細胞株と生物学的試料が由来する（例えば）生体中のヒト細胞は内容物が実質的に大きく異なるため、ヒト由来の培養細胞株から細胞破砕抽出液を利用した場合でも、本発明の効果を得ることが可能である。

【0100】

また、細胞破砕抽出液を調製するための細胞は、任意のベクター、好ましくは空ベクターを含んでもよい。空ベクターとは、被検物質と特異的に結合するタンパク質またはその融合タンパク質を発現させた時に用いたベクターと同種で、かつこれらのタンパク質をコードする遺伝子を含まないベクターであってもよく、また、例えば、これらの空ベクターにさらに任意の核酸を含む、任意のベクターであってもよい。また、被検物質と特異的に結合するタンパク質またはその融合タンパク質を発現させた時に用いたベクターとは、無関係の公知の任意のベクターであってもよい。

【0101】

細胞の破砕抽出液としては、細胞に由来する成分であれば特に制限されず、例えば、そのタンパク質成分、糖質成分、脂質成分又はその混合成分を使用することができる。好ましくは、細胞の可溶性抽出物を使用することができる。

【0102】

細胞の破砕抽出液の調製方法としては、特に制限されず、各種の方法を使用することができる。通常、適切な培地で培養した細胞を、超音波などの物理的手段あるいは界面活性剤などを用いた化学的手段あるいは酵素処理等で破砕若しくは可溶化し、遠心分離又は濾過等の操作により、可溶性成分として調製することができる。また、保存寿命をのばすためには、遠心分離又は濾過等により清澄にした液に、例えばプロテアーゼインヒビターの添加、又はオートクレーブ処理等の加熱処理を施して、細胞由来の各種酵素等を抑制又は失活させることが好ましい。細胞の破砕抽出液を加える濃度は、生じる非特異反応の強さに応じて変えてもよく、該非特異反応を吸収するに充分な濃度を適宜設定することができる。

【0103】

細胞破砕抽出液を調製する具体的な方法の例としては、これに限定されるわけではないが、例えば大腸菌細胞の場合、大腸菌（ベクターを含んでもよく、またベクターにはビオチン結合性タンパク質をコードする遺伝子を含んでも良い）を、抗生物質を含むＬＢ培地に接種し、ＯＤ６００における吸光度が０．２５ないし１、好ましくは０．４ないし０．６に達するまで、２５℃ないし３７℃で振とう培養した後、０．１ｍＭないし５ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭないし１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、さらに２５℃ないし３７℃で、２時間ないし２４時間、好ましくは４時間ないし１６時間振とう培養を行う。培養液から遠心にて菌体を回収し、菌体を所望の緩衝液中に懸濁後、破砕し、破砕液を遠心し、その上清を大腸菌粗抽出液として回収すればよい。

【0104】

担体への生物学的試料、及び、細胞破砕抽出液の添加は任意の方法で行うことができる。ただし、生物学的試料が担体と接触するよりも前に、生物学的試料が細胞破砕抽出液と接触しなければならない。すなわち、生物学的試料と細胞破砕抽出液が十分に接触すればよく、細胞破砕抽出液由来の成分は必ずしも最終的に生物学的試料とともに担体に添加される必要はない。例えば、細胞破砕抽出液成分を結合した担体を作成し、そこへ生物学的試料を処理したものを使用してもよい。具体的には、生物学的試料を、細胞破砕抽出液成分カラムに通す、などの態様が挙げられる。

【0105】

生物学的試料に、細胞破砕粗抽出液を混合する場合、限定されるわけではないが、試料に、所望の緩衝液（BSAやカゼイン、市販のブロッキング剤などを含んでも良い）で０．０５ｍｇ/ｍｌないし５ｍｇ/ｍｌ、好ましくは０．５ｍｇ/ｍｌないし５ｍｇ/ｍｌの総タンパク質濃度に調製した細胞破砕粗抽出液を、１０℃ないし３０℃で、好ましくは２０℃ないし３０℃で、３０分ないし４時間、好ましくは１時間ないし２時間反応させる。なお、生物学的試料が血清の場合、これに限定されるわけではないが、上記細胞破砕粗抽出液で１００倍ないし１０００倍に希釈すると良い。

【0106】

被検試料へのビオチン結合性タンパク質の添加
本発明はその特徴の１つとして、生物学的試料へ融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞から調製した細胞破砕抽出液、並びにビオチン結合性タンパク質を混合して担体に添加する（工程ｂ−i）か、あるいは、融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液を被検試料に混合して担体に添加する（工程ｂ−ｉｉ）。

【0107】

本発明の方法において、被検試料にビオチン結合性タンパク質を添加することにより、最終的にバックグラウンドシグナルを抑制することができる。

【0108】

このようなビオチン結合性タンパク質は、融合タンパク質を構成するビオチン結合性タンパク質と、同じであっても異なっていてもよい。また、野生型であっても変異体であってもよく、ビオチン結合能は野生型と比較して、同等であっても、高くてもよく、低くてもよい。

【0109】

また、添加の態様として、ビオチン結合性タンパク質（天然由来でも、遺伝子工学的に発現させたものでもよい）の粉末を直接添加してもよく、適当な液に溶解してから添加してもよい。また例えば、ビオチン結合性タンパク質を試料に直接添加するのではなく、試料と細胞破砕抽出液の混合物をビオチン結合性タンパク質を固定した担体で処理する（例えばカラムに通す）態様でもよい。（工程ｂ−ｉ）。

【0110】

ビオチン結合性タンパク質を細胞破砕粗抽出液に添加する場合、これに限定されるわけではないが、ビオチン結合性タンパク質の濃度は最終濃度で、１μｇ/ｍｌないし５００μｇ/ｍｌ、好ましくは１０μｇ/ｍｌないし１００μｇ/ｍｌで添加する。当該細胞中でビオチン結合性タンパク質を遺伝子工学的に発現させる場合の、ビオチン結合性タンパク質の濃度に関しても、これに限定されるわけではないが、同様の濃度であっても良い。

【0111】

あるいは、ビオチン結合性タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞に導入し発現させ、当該宿主細胞を破砕して得られたビオチン結合性タンパク質を含む細胞抽出液として使用してもよい（工程ｂ−ｉｉ）。この場合、ビオチン結合性タンパク質は所望の宿主で、当業者に周知の方法で発現されば良いが、被検物質と特異的に結合するタンパク質ビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質を遺伝子工学的に発現させた場合は、その宿主と同種のものが好ましい。

【0112】

宿主が大腸菌の場合、ビオチン結合性タンパク質をコードする遺伝子を発現ベクターに組み込み、これを大腸菌に導入し、タンパク質発現を誘導しつつ、大腸菌の培養を行なう。発現ベクターや宿主大腸菌株、培地成分、ＩＰＴＧ濃度や培養温度などの誘導条件は、適宜選択すればよい。

【0113】

被検物質の検出方法（態様１の工程４）
本発明の検出方法は、融合タンパク質中の検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質に結合した披検物質を検出する。

【0114】

被検物質を検出する方法は、所望のタンパク質の性質に基づき、当業者が適切に選択できる。好ましいものとして、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を含む）や放射性イムノアッセイ法（ＲＩＡ）などのイムノアッセイ法、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ法、表面プラズモン共鳴法などのようなアッセイ法が挙げられる。アビジン−ビオチン結合を用いて固相化された、被検物質と特異的に結合・相互作用する物質に対し、被検試料を反応させた後、当該被検物質を検出する。

【0115】

イムノアッセイにおいて、例えば測定すべき物質が抗体の場合、抗原を固相化し、被検試料中に存在する抗体を抗原と反応させ、当業者に周知の方法で検出される。例えば被検試料がヒト由来の場合、抗原に結合したヒト抗体を、抗ヒト抗体を用いて検出する。この際、この抗ヒト抗体は、蛍光や酵素、あるいは放射性同位元素で標識しておくことで、最終的に蛍光量や酵素活性、あるいは放射性量を測定することで、間接的に抗体の量を測定、定量する。また測定すべき物質が抗原の場合、その抗原のある部分（エピトープ）に対する抗体を固相化し、被検試料中に存在する抗原と反応させた後、さらにその抗原の別のエピトープに対する抗体を反応させる。この別のエピトープに対する二次抗体を上記のように標識しておけば、間接的に抗原の量を測定することが出来る。あるいはまた、核酸ハイブリダイゼーションアッセイでは、測定すべき核酸と相補的な配列領域を有する数十から数百、あるいは数千塩基の核酸をアビジン−ビオチン結合を用いて固相化しておく。ここへ予め蛍光や放射性同位元素で標識した核酸を含む被検試料を反応させ、蛍光量や放射性量を測定する。

【0116】

上記標識は当業者に周知の方法で行えばよく、また市販の、蛍光や酵素標識された抗ヒト抗体等を用いてもよい。蛍光標識としては例えばフルオレセインおよびローダミンなどによる標識や、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質による標識も考えられる。酵素標識としてはペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼ、あるいはルシフェラーゼやグルコースオキシダーゼ等が利用され得るがこれらに限定されない。これらの酵素による測定のための基質は市販されており、例えばペルオキシダーゼの場合、ＴＢＡやケミルミネッセンス用の基質を用いることが出来る。また、放射性同位元素として例えば、ヨウ素（¹²⁵Ｉ、¹²¹Ｉ）、炭素（¹⁴Ｃ）、イオウ（³⁵Ｓ）、およびトリチウム（³Ｈ）、核酸の場合はリン（³²Ｐ）などが挙げられる。

【0117】

生物学的試料（サンプル）中に存在する抗原や抗体の量は、例えば、直線回帰コンピューターアルゴリズムを使用して、標準的な調製物（例えば臨床検体の場合、健常者の標準試料若しくは典型的な患者の標準試料）中に存在する量との比較によって簡易に算出され得る。抗原や抗体を検出するためのこのようなアッセイ法は、例えば、ＥＬＩＳＡについて、Ｉａｃｏｂｅｌｌｉら、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ １１： １９−３０ （１９８８） に記載されている。

【0118】

あるいは、例えば、生物学的試料中の検出すべき物質、例えば、抗体が少ない場合（抗体価が低い場合）や、血清などの生物学的試料そのものに非特異的な結合が多い場合には、非特異結合によるバックグラウンドシグナルの影響が大きくなる。そのため、測定値よりバックグラウンドシグナルを適切に差し引くことで、検出したい物質をより正確に測定することが可能になる。差し引くバックグラウンドは実験系に応じて当業者が適切に判断しうる。

【0119】

例えば、このような態様の例として、血清中に存在するコラーゲンに対する抗体を検出する「ヒト／サル抗Ｉ型及びＩＩ型コラーゲンＩｇＧ抗体測定キット」（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ社製）がある。このキットではサンプル測定値からバックグラウンドの値（血清は加えず二次抗体のみによる測定値）を差し引いて算出する。

【0120】

また、血清のように、生物学的試料そのものに非特異的な結合が多い場合には、そのような非特異反応によるバックグラウンドを差し引くために、実施例２に記載したように、ＳＩＴＨ−１抗原（検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質）とタマビジンの融合タンパク質を固定化した担体（プレート）における測定値から、ＳＩＴＨ−１抗原を固定化していない区（ただしＳＩＴＨ−１抗原を固定化した区と同様に、ＢＳＡなどによるブロッキング操作は行われ、かつ抗ＳＩＴＨ−１抗体（生物学的試料中の検出したい物質）を含む血清（生物学的試料）を添加した区）の測定値を差し引く態様も有効である。あるいは、実施例２または実施例３に記載したように、ＳＩＴＨ−１抗原とタマビジンの融合タンパク質を固定化した担体（プレート又は磁性ビーズ）における測定値から、タマビジンのみを固定化（結合）した担体における測定値を差し引いて算出してもよい。

【0121】

サンプルに固有の非特異反応を差し引くための態様のさらなる例としては、上述の「ヒト／サル抗Ｉ型及びＩＩ型コラーゲンＩｇＧ抗体測定キット」のように、コラーゲンを固定化したマイクロタイタープレートのウェルを用いた血清中コラーゲン抗体の測定値から、コラーゲンを固定化していないウェルの測定値を差し引く場合もある。さらに、類似の態様を取るキットとして、血清又は血漿中の抗単純ヘルペスウイルスＩｇＭ型抗体の検出に用いる「ウイルス抗体ＥＩＡ「生研」ヘルペスＩｇＭ」（デンカ生研社製）がある。

【0122】

また、好ましくは、試料が由来する生物（例えば、ＳＩＴＨ−１の場合はヒト）が抗体を有しない任意のタンパク質（制限されるものではないが、上記生物が哺乳類の場合は、例えばＧＦＰなどを挙げることができる）を固相化した区の測定値を差し引くことで、より正確に求めることが出来る。固相化の方法としては、特に限定はされないが、ビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質を作製し、ビオチン化担体に、ビオチン-アビジン結合により固相化することが好ましい。

【0123】

以上のような算出方法は、生物学的試料の性質や使用する抗体の特徴などを踏まえ、当業者が適切に設計、選択することができる。

【0124】

本発明の検出方法は、好ましくは血清中の抗体価の低い抗体を特異的に検出することが可能である。

【0125】

本発明の態様１の効果は、例えば、実施例２において図３−１のＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａ／ＢＬ２１細胞破砕抽出液（黒三角）の結果を、ＰＢＳ（白四角）またはｐＴｒｃ９９Ａ／ＢＬ２１細胞破砕抽出液（黒丸）の結果と比較することによって理解される。さらに、実施例３において表３のＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａ導入ＢＬ２１粗抽出液のＳ／Ｎ比を、ＰＢＳまたはｐＴｒｃ９９Ａ導入ＢＬ２１細胞破砕抽出液のＳ／Ｎ比と比較することによっても理解される。

【0126】

ＩＩ．本発明の検出方法（態様２）
本発明の検出方法（態様２）は、生物学的試料中の物質を検出する方法であって、
１） ビオチンを結合させた担体、及び、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質を準備し；
２） ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、工程１）で準備した担体に融合タンパク質を結合させて、融合タンパク質が結合した担体を作成し；
３） 工程２）で作成した融合タンパク質が結合した担体に、ビオチン結合性タンパク質を接触させて担体のブロッキングを行い；
４） 工程３）のブロッキング工程後、融合タンパク質が結合した担体に、生物学的試料を添加し、そして、
５） 融合タンパク質中の検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質に結合した被検物質を検出する
ことを含む。

【0127】

本発明の態様２の方法において、工程１および２の、融合タンパク質が結合した担体の調製方法は、態様１と同様である。また、最後の融合タンパク質中の検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質に結合した被検物質を検出する工程（態様１の工程４、態様２の工程５）も同様である。

【0128】

態様２の方法は、生物学的試料を担体に添加する前に、担体のブロッキング工程（態様２の工程３）を行うことを特徴とする。

【0129】

本発明において、融合タンパク質が結合した担体に、生物学的試料を担体に添加する前に、更にビオチン結合性タンパク質を担体に接触させることにより、一層バックグラウンドシグナルを抑制することができる。理論に拘束されるわけではないが、これは、担体表面において、融合タンパク質が結合しておらず遊離の状態（ｆｒｅｅ）になっているビオチン部分に、ビオチン結合性タンパク質が結合するためと考えられる（図１）。

【0130】

結合担体に接触させるビオチン結合性タンパク質は、融合タンパク質を構成するビオチン結合性タンパク質と、同じであっても異なっていてもよい。また野生型であっても変異体であっても構わない。ビオチン結合能は、野生型と比較して、同等であっても、高くてよく、低くてもよいが、好ましくは同等又はそれ以下である。限定されるわけではないが、例えば、野生型タンパク質よりもビオチン結合能が低く、かつ、ビオチンとの解離定数（ＫＤ）が１０^-5（Ｍ）よりも小さいタンパク質であってもよい。このようなビオチン結合タンパク質を作製するためには、化学的に修飾する方法（ＵＳ−Ａ−５０５１３５６）などがあるが、アミノ酸配列を改変する方法が最も好ましい（Ｑｕｒｅｓｈｉ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｊ． Ｂiol． Ｃhem．、２７６、４６４２２−４６４２８）。

【0131】

本発明において、ビオチン結合性タンパク質を結合担体に接触させる場合、その方法に特段の制限はない。すなわち、ビオチン結合性タンパク質を直接添加してもよいし、適当な液に溶解して担体と接触させてもよい。さらにＢＳＡやカゼイン等、当業者に周知のブロッキング剤を同時に使用しても良い。

【0132】

限定されるわけではないが、所望の緩衝液（例えば０．０２％ないし１％、好ましくは０．１ないし０．５％の濃度のＴｗｅｅｎ−２０やＴｒｉｔｏｎを含むＴＢＳやＰＢＳ）に、最終濃度で１μｇ／ｍｌないし５００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌないし１００μｇ／ｍｌのビオチン結合性タンパク質を添加する。またここへ最終濃度で１μｇ／ｍｌないし５０μｇ／ｍｌ、好ましくは５μｇ／ｍｌないし１０μｇ／ｍｌのＢＳＡやカゼインを添加してもよい。このブロッキング溶液を、１０℃ないし４０℃で、好ましくは２０℃ないし３０℃で、１０分ないし２時間、好ましくは３０分ないし１時間、ビオチン結合性タンパク質融合タンパク質を、アビジン−ビオチン結合により結合させた担体と接触させる。

【0133】

本発明の態様２の効果は、例えば、実施例２において、抗体が０の際の図３−１と図３−２のｐＴｒｃ９９Ａ／ＢＬ２１細胞破砕抽出液（黒丸）の値を比較することによって、理解される。抗体が０の場合には抗体が存在しないため、仮に非特異的結合がなければ、蛍光は０になるはずである。ここにおいて、図３−１と図３−２の抗体０における黒丸同士を比較すると、ＴＭ２による担体のブロッキングが行われた場合には、蛍光値が半分近くまで下がっており、非特異的結合が大幅に低下していることが理解される。また、ＴＭ２による担体のブロッキングを行った図３−２では、図３−１に比較して、グラフ全体が下方にシフトしている。さらに、実施例２の表２のｐＴｒｃ９９Ａ／ＢＬ２１細胞破砕抽出液の結果について、「ＢＳＡによるブロッキング」の値と「ＢＳＡとＴＭ２によるブロッキング」の値とを比較することによっても理解される。

【0134】

ＩＩＩ．本発明の検出方法（態様３）
本発明の検出方法（態様３）は、生物学的試料中の物質を検出する方法であって、
１） ビオチンを結合させた担体、及び、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質を準備し；
２） ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、工程１）で準備した担体に融合タンパク質を結合させて、融合タンパク質が結合した担体を作成し；
３） 工程２）で作成した融合タンパク質が結合した担体に、ビオチン結合性タンパク質を接触させて担体のブロッキングを行い；
４） 工程３）のブロッキング工程後、融合タンパク質が結合した担体に、
（ａ） 生物学的試料、及び
（ｂ−ｉ） 工程１）の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、あるいは
（ｂ−ｉｉ） 工程１）の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
を混合して添加する；そして、
５） 融合タンパク質中の検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質に結合した被検物質を検出する
ことを含む。

【0135】

態様３は、態様１と態様２を組み合わせた態様である。具体的には、態様１の細胞破砕抽出液及びビオチン結合性タンパク質の添加、と態様２のビオチン結合性タンパク質による担体のブロッキングの双方を行うものである。

【0136】

本発明の態様３の効果は、例えば、実施例２において図３−２のＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａ／ＢＬ２１細胞破砕抽出液（黒三角）の結果を、図３−１、図３−２中の他の結果、例えば、ＰＢＳ（白四角）の結果と比較することによって理解される。さらに、実施例４において、表５のＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａ導入ＢＬ２１粗抽出液のＳ／Ｎ比を、他の結果、すなわち、ＰＢＳ、大腸菌（ＢＬ２１）またはｐＴｒｃ９９Ａ導入ＢＬ２１細胞破砕抽出液のＳ／Ｎ比と比較することによって理解される。

【0137】

ＩＶ．融合タンパク質が結合した担体
本発明はまた、生物学的試料中の物質を検出するための担体を提供する。本発明の担体は、
１） ビオチンを結合させた担体、及び、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質を準備し；
２） ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、工程１）で準備した担体に融合タンパク質を結合させて、融合タンパク質が結合した担体を作成し；
３） 工程２）で作成した融合タンパク質が結合した担体に、ビオチン結合性タンパク質を接触させて担体のブロッキングを行う
ことを含む方法によって調製された、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質が、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合によって結合している、ことを特徴とする。本発明の担体は、生物学的試料を添加する前に予めビオチン結合性タンパク質によりブロッキングされている。

【0138】

よって、本発明の担体は、好ましくは、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質がアビジン−ビオチン結合により結合しており、さらに担体上の未反応のビオチンに、ビオチン結合性タンパク質がアビジン−ビオチン結合により結合している。

【0139】

ＶＩＩ．キット
本発明はまた、生物学的試料中の物質を検出するためのキットを提供する。本発明のキットは、
Ａ） 検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質とビオチン結合性タンパク質との融合タンパク質が、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合によって結合している、担体；並びに、
Ｂ−ｉ） Ａ）の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、若しくは
Ｂ−ｉｉ） Ａ）の融合タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液を含む、生物学的試料を希釈するための剤；および／又は
Ｃ） ビオチン結合性タンパク質を含むブロッキング剤
を含む。

【0140】

生物学的試料を希釈するための剤は、細胞破砕抽出液（及びビオチン結合性タンパク質）そのものであってよく、あるいは、細胞破砕抽出液を生物学的試料とともにさらに希釈する剤であって、適当な緩衝液や市販の細胞希釈液あるいは血清希釈液などの溶剤を含んでもよい。

【実施例】

【0141】

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。

【0142】

本実施例１、２では、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）由来のＳＩＴＨ−１タンパク質とタマビジン２との融合タンパク質を大腸菌で発現させ、超音波破砕により得られた大腸菌粗抽出液を直接ビオチン化マイクロプレートに反応させ、融合タンパク質をタマビジンービオチン結合により固定化させた。こうして得られたＳＩＴＨ−１プレートに、大腸菌粗抽出液で希釈したヒト血清（ウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体を含む。本試験では市販のヒト血清にウサギの抗ＳＩＴＨ−１抗体（抗血清）を段階希釈して加えた血清を、擬似臨床検体として用いた。）を反応させ、ヒト血清中に含まれる抗ＳＩＴＨ−１抗体量を測定した。

【0143】

実施例１ ＳＩＴＨ−１遺伝子とタマビジン２の融合タンパク質発現用ベクターの構築
本実施例では、ＳＩＴＨ−１のＣ末側にリンカーを介して、タマビジン２（以下、ＴＭ２）が配置された融合タンパク質をコードする遺伝子を設計した。

【0144】

１−１．プライマーの設計
ＳＩＴＨ１−ＴＭ２融合遺伝子構築のために、まず、ＳＩＴＨ−１とＴＭ２の両遺伝子をリンカー（５ｘｌｉｎｋｅｒ： ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号１８）を介し融合させるためのプライマーを設計した。

【0145】

即ち、５’側にＳＩＴＨ−１の Ｃ末端部位、中央にリンカー、３’側にＴＭ２の Ｎ末端部位をコードするＤＮＡ配列からなるプライマー（ＳＩＴＨ１Ｃ−５ｘｌｉｎｋ−ＴＭ２Ｎ−Ｆ）（配列番号１９）、５’側にＴＭ２ のＮ末端部位、リンカー、３’側にＳＩＴＨ−１の Ｃ末端部位を逆向きにコードするＤＮＡ配列からなるプライマー（ＳＩＴＨ１Ｃ−５ｘｌｉｎｋ−ＴＭ２Ｎ−Ｒ）（配列番号２０）を設計した。

【0146】

次に、ＳＩＴＨ−１のＮ末端部位を含む５’部分と、その上流にＥｃｏＲ Ｉ制限酵素切断部位（ＣＣＡＴＧＧ）が配置されたプライマー（ＳＩＴＨ１ ５’ ＥｃｏＲＩ−Ｆ（配列番号２１））、また、ＴＭ２遺伝子の３’部分とその下流にＢａｍＨ Ｉ制限酵素切断部位（ＧＧＡＴＣＣ）をコードする配列からなるプライマー（ＴＭ２ＣｔｅｒｍＢａｍ）（配列番号２２）を設計した。ＳＩＴＨ−１とＴＭ２との融合遺伝子構築用プライマーを表１にまとめた。

【0147】

【表1】

【0148】

１−２．ＰＣＲ
ＳＩＴＨ１−ＴＭ２融合遺伝子を構築するために、二段階のＰＣＲを行った。

【0149】

一段階目のＰＣＲは、ＳＩＴＨ−１遺伝子（ＯＲＦ）（配列番号２）がＦＬＡＧ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ （ＳＩＧＭＡ）に組み込まれているプラスミドを鋳型にして、プライマーＳＩＴＨ１ ５’ ＥｃｏＲＩ−ＦとＳＩＴＨ１Ｃ−５ｘｌｉｎｋ−ＴＭ２Ｎ−Ｒを用いてＳＩＴＨ−１部位の増幅を、また、ＴＭ２遺伝子がベクターｐＴｒｃ９９Ａに組み込まれたプラスミド（ＷＯ０２／０７２８１７）を鋳型にして、プライマーＳＩＴＨ１Ｃ−５ｘｌｉｎｋ−ＴＭ２Ｎ−ＦとＴＭ２ＣｔｅｒｍＢａｍを用いてＴＭ２部位の増幅をそれぞれ行った。

【0150】

ＰＣＲ反応条件は、２０μｌの反応液中に鋳型ＤＮＡを５００ｎｇ、１０(ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ社）を２μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰを１．６μｌ、プライマーを各２０ｐｍｏｌｅｓ、５Ｕ／μｌ Ｅｘ Ｔａｑを０．１(ｌ添加し、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ）を用いて９６℃、３分を１回、９５℃、１分，６０℃、１分，７２℃、２分を２０回、７２℃、６分を１回行った。その結果、ＳＩＴＨ−１部分においては、５７９ｂｐ、ＴＭ２部分においては５２８ｂｐのＰＣＲ産物が得られた。これらのＰＣＲ産物をＴＡＥ緩衝液中で、アガロースゲル電気泳動を用い分画した。各ＰＣＲ産物をゲルごと切り出し、ＱＩＡＥＸ ＩＩゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてそれら産物を回収した。抽出方法はキット添付の説明書に従った。

【0151】

上記２つのＰＣＲ産物を鋳型にして、プライマーＳＩＴＨ１ ５’ ＥｃｏＲＩ−ＦとＴＭ２ＣｔｅｒｍＢａｍを用いて二段階目のＰＣＲを行った。反応条件は、２０μｌの反応液中に鋳型ＤＮＡを各５００ｎｇ、１０(Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ社）を２μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰを１．６μｌ、プライマーを各２０ｐｍｏｌｅｓ、５Ｕ／(ｌ Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．１μｌ添加し、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ）を用いて９６℃、３分を１回、９５℃、１分，６０℃、１分，７２℃、２分を２０回、７２℃、６分を１回行った。その結果、９９０ｂｐのＰＣＲ産物が得られた。

【0152】

１−３．クローニング
ＰＣＲによって得られたＳＩＴＨ１−ＴＭ２融合遺伝子をベクターｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。

【0153】

具体的には先ず、ベクターキット添付の説明書に従って、ライゲーション反応をおこなった。大腸菌ＴＢ１にエレクトロポレーション法を用いてＤＮＡを導入し、常法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ２^nd ｅｄｉｔｉｏｎ）に従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。インサートの存在が確認されたプラスミドに関してＭ１３プライマー（ＴａＫａＲａ社）と、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ蛍光シークエンサー（Ｍｏｄｅｌ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ， Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用いて塩基配列を決定し、設計した遺伝子の配列と比較して、変異がないことを確認した。融合遺伝子が組み込まれたプラスミドをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで二重消化し、前述と同様の方法でアガロースゲル電気泳動と精製を行い、ＤＮＡ断片を回収した。この断片を予めＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化しておいた大腸菌用の発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用いてライゲーションさせた。ライゲーション産物を大腸菌ＴＢ１に形質転換し、プラスミドＤＮＡを抽出し、さらに大腸菌ＢＬ２１に形質転換した。得られた大腸菌コロニーを鋳型に、ＳＩＴＨ１ ５’ ＥｃｏＲＩ−ＦとＴＭ２ＣｔｅｒｍＢａｍを用いてＰＣＲによる挿入遺伝子部位の増幅を行い、挿入遺伝子の有無を確認した。

【0154】

以上のように、ＳＩＴＨ−１とＴＭ２の融合タンパク質発現用のベクターＳＩＴＨ１−ＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａを完成させた。発現用のベクターＳＩＴＨ１−ＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａ中のＳＩＴＨ１−ＴＭ２をコードする塩基配列を配列番号２３に、コードされるアミノ酸配列を配列番号２４に示す。

【0155】

ＳＩＴＨ１−ＴＭ２は、５'側については、ＥｃｏＲＩ部位を用いてｐＴｒｃ９９Ａに組み込んだため、翻訳開始メチオニンの後ろに２つのアミノ酸残基が付加されている（配列番号２３の塩基番号４−９、配列番号２４のアミノ酸残基番号２−３）。次いで、ＳＩＴＨ−１の配列（配列番号２３の塩基番号１０−４８３、配列番号２４のアミノ酸残基番号４−１６１）、５ｘｌｉｎｋｅｒ（配列番号２３の塩基番号４８４−５５８、配列番号２４のアミノ酸残基番号１６２−１８６）、ＴＭ２の配列（Ｍｅｔを除去したもの）（配列番号２３の塩基番号５５９−９８１、配列番号２４のアミノ酸残基番号１８７−３２６）が続く。

【0156】

１−４．大腸菌発現
ＳＩＴＨ１−ＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａを導入した大腸菌ＢＬ２１を、抗生物質アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地５０ｍｌに接種し、ＯＤ６００における吸光度が０．５に達するまで３０℃で振とう培養した。その後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、さらに３０℃で５時間振とう培養した。培養液５０ｍｌから遠心にて菌体を回収した。菌体は０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）３ｍｌ中に懸濁後、超音波により破砕した。破砕液を遠心（１５，０００ｒｐｍ）し、その上清を大腸菌粗抽出液とした。ＴＭ２融合ＳＩＴＨ−１タンパク質の発現を確認するため、粗抽出液中に含まれるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、ウェスタンブロッティングにより解析した。

【0157】

ＳＩＴＨ−１の検出にはウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体（大腸菌で発現させたＳＩＴＨ−１を精製し、ウサギに免疫して作成した抗ＳＩＴＨ−１抗体（抗血清））とアルカリフォスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を各々１０００倍希釈して用いた。結果を図２に示す。ＴＭ２融合ＳＩＴＨ−１発現大腸菌からは３５ｋＤａ付近にバンドが検出された。このサイズはＴＭ２融合ＳＩＴＨ−１の分子量３４．８ｋＤａとほぼ一致した。なお、ｐＴｒｃ９９ＡやＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａを導入した大腸菌ＢＬ２１（Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ． （２００９）ＦＥＢＳ Ｊ．２７６：１３８３−１３９７）に関しても上記と同様に、ＩＰＴＧ存在下で培養後、大腸菌粗抽出液を調製した。

【0158】

実施例２ ＥＬＩＳＡによるヒト血清存在下での抗ＳＩＴＨ−１抗体の検出
実施例１で得られたＴＭ２融合ＳＩＴＨ−１を発現した大腸菌粗抽出液を２ｍｇ総可溶性タンパク質／ｍｌとなるように０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）で希釈し、ビオチンプレート（住友ベークライト社製）に１００μｌずつ添加した。室温で１時間静置し、タマビジン‐ビオチン結合によりＴＭ２融合ＳＩＴＨ−１タンパク質をビオチンプレートに固定化した。その後、プレートの各ウェルを０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ緩衝液（ＴＢＳＴ）で３回洗浄し、５μｇ／ｍｌ ＢＳＡ／ＴＢＳＴ溶液もしくは５０μｇ／ｍｌ 精製ＴＭ２／５μｇ／ｍｌ ＢＳＡ／ＴＢＳＴ溶液を各ウェルに２５０μｌ添加し、室温で１時間静置し、ブロッキングを行った。その後、各ウェルはＴＢＳＴで３回洗浄した。

【0159】

次に、ヒト血清（Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ ｐｏｏｌ，Ｃｏｓｍｏ−Ｂｉｏ社製）をＰＢＳ、あるいは、実施例１−４で調製した５ｍｇ総可溶性タンパク質／ｍｌのｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液、又は、５ｍｇ総可溶性タンパク質／ｍｌのＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液で１００倍希釈した溶液に、ウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体（抗血清）を体積比で０．００２、０．００１、０．０００５、０．０００２５となるように段階希釈して加え、ＴＭ２融合ＳＩＴＨ−１を固定化したプレートに１００μｌずつ添加し、１時間室温で反応させた。

【0160】

ウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体（抗血清）の血清中抗体価は、典型的なうつ病（気分障害）患者の血清中抗ＳＩＴＨ−１抗体価に比べ、およそ５０倍程度高いと推定される。従って市販（健常者）ヒト血清に体積比で１／５０量のウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体（抗血清）を混ぜると、典型的なうつ病患者血清の擬似検体となると考えられる。よって、上記の抗体希釈率は、うつ病患者血清をおよそ１０倍から８０倍希釈して用いる場合と同程度とみなすことができる。

【0161】

対照として、何も固定化していないビオチンプレートに、上記ＢＳＡのみによるブロッキングと、ＢＳＡとＴＭ２によるブロッキングの、２種類のブロッキング操作をそれぞれ行った区を設けた。なお、タマビジンを含む溶液でブロッキング操作を行った場合においては、ブロッキング溶液中のタマビジンの一部がプレート上のビオチンに特異的に結合しるため、タマビジン固定化プレートを利用しているのと同じ状態になると考えられる。その後、上記と同様にＰＢＳ溶液や、ｐＴｒｃ９９Ａ導入あるいは ＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液（５ｍｇ総可溶性タンパク質／ｍｌ）で１００倍希釈したヒト血清に、段階的に希釈したウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体を加えたものを１００μｌずつ添加し、室温で１時間反応させた。ヒト血清存在下で、ウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体をＴＭ２融合ＳＩＴＨ−１と反応させた後、ＴＢＳＴで３回洗浄した。

【0162】

その後、プレートにタマビジンを介して固定化されたＳＩＴＨ−１に、反応・結合したウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体、ならびに各ウェル中で非特異的に結合していると考えられる血清中のヒトＩｇＧを、それぞれ検出するために、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体、ならびにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を、それぞれＴＢＳＴで５０００倍希釈した混合溶液を１００μｌずつ添加し、１時間室温で静置した。その後、ＴＢＳＴで３回洗浄し、ペルオキシダーゼ活性を検出した。活性は各ウェルに、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＰＩＥＲＣＥ）を１００μｌずつ添加し、５分間室温で静置した後発光量をプレートリーダーＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００（ＴＥＣＡＮ社製）によって測定した。

【0163】

なお、データ値としては、ウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体の各濃度区それぞれにおいて、対照区（ＴＭ２融合ＳＩＴＨ−１を固定していないが、ＢＳＡまたはＢＳＡとＴＭ２によりブロッキング操作は行なわれ、かつ各濃度の抗ＳＩＴＨ−１抗体を含むヒト血清を処理した区）の各発光量の測定も併せて行い、その対照区の値を、ＴＭ２融合ＳＩＴＨ−１を固定化した区の発光量の値から差し引いた。これを血清中に含まれる抗ＳＩＴＨ−１抗体の検出量とした。

【0164】

非特異結合に及ぼす、血清への大腸菌破砕抽出液の添加効果や、ＴＭ２によるブロッキング効果の結果を図３に示す。図３では、血清を、ＰＢＳで１００倍希釈した区を白四角、発現ベクターのみを持つ大腸菌破砕抽出液で１００倍希釈した区を黒丸、ＴＭ２を発現させた大腸菌破砕抽出液で１００倍希釈した区を黒三角で示した。各グラフの縦軸（ルミネッセンス）は抗ＳＩＴＨ−１抗体の検出量を示し、横軸は段階希釈した抗ＳＩＴＨ−１抗体の希釈割合を示す。

【0165】

図３−１は、ビオチン結合性タンパク質（ＴＭ２）によるブロッキングを行わない場合において、ヒト血清をＰＢＳ（白四角）、ｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液（黒丸）、又はＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液（黒三角）で希釈した場合の、血清中抗ＳＩＴＨ−１抗体量の検出の結果を示す。

【0166】

図３−２は、ビオチン結合性タンパク質（ＴＭ２）によるブロッキングを行った場合において、ヒト血清をＰＢＳ（白四角）、ｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液（黒丸）、又はＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液（黒三角）で希釈した場合の、血清中抗ＳＩＴＨ−１抗体量の検出の結果を示す。

【0167】

さらに、ブロッキングの効果や各血清希釈液の効果の比較を行うために、Ｓ／Ｎ比を以下に示す式によって算出した。

【0168】

Ｓ／Ｎ比＝抗ＳＩＴＨ−１抗体を各濃度で加えた区の抗ＳＩＴＨ−１抗体検出量／抗ＳＩＴＨ−１抗体を加えない区の抗ＳＩＴＨ−１抗体検出量
従って、Ｓ／Ｎ比が大きいほど検出感度が高いことを示している。

【0169】

各区におけるＳ／Ｎ比の計算結果を表２に示す。

【0170】

【表2】

【0171】

血清中に含まれる抗ＳＩＴＨ−１抗体は、血清をＰＢＳで希釈した区では、非特異結合が多く、抗ＳＩＴＨ−１抗体を添加していない区でも高い発光量が検出された。一方、ｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液やＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液を添加した区においては、ＳＩＴＨ−１抗体を加えない区におけるルミネッセンス値が相当低く、非特異結合が劇的に減少していた。特にＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液を添加した区においては非特異結合が低かった（図３−１、図３−２）。この場合、ＢＳＡのみのブロッキングよりもＴＭ２をさらに添加したブロッキング（ＢＳＡ＋ＴＭ２）の方が、特に低濃度（希釈率０．０００５以下）の抗体の検出に定量性が見られた（図３−２）。

【0172】

さらにｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液を添加した区、ならびにＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液を添加した区においては、ＴＭ２を加えたＢＳＡでブロッキングするとＳ／Ｎ比が上昇し、より高感度に抗ＳＩＴＨ−１抗体を検出できることが明らかとなった（表２）。特にＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液を添加した区においてはＳ／Ｎ比の上昇が顕著であった。

【0173】

以上のことから、ＴＭ２融合ＳＩＴＨ−１固定化プレートを、ＴＭ２を含む溶液でブロッキングした後、ＴＭ２が発現している大腸菌粗抽出液でヒト血清を希釈することで、ヒト血清由来非特異結合を減少させ、極めて低い濃度の抗ＳＩＴＨ−１抗体も感度良く安定的かつ定量的に検出できることが示された。

【0174】

実施例３ 磁性ビーズを用いたＥＬＩＳＡによるヒト血清存在下での抗ＳＩＴＨ−１抗体の検出
本実施例では、非常に薄い濃度のＳＩＴＨ−１抗体を検出する場合について、ＴＭ２融合ＳＩＴＨ−１をビオチン化磁性ビーズへ固定化した系における各種血清希釈液の効果を調査した。

【0175】

３−１．ＴＭ２融合ＳＩＴＨ−１固定化磁性ビーズの調製
磁性ビーズのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ Ａｍｉｎｅ （ＤｙｎａｌＢｉｏｔｅｃｈ社製）１ｍＬ（３０ｍｇビーズ／ｍＬ）に、１０ｍＭ ＮＨＳ−Ｌｃ−Ｌｃ−Ｂｉｏｔｉｎ （ＰＩＥＲＣＥ社製）１ｍＬを添加した。室温で３０分間転倒混和することでアミノ基とＮＨＳ活性エステル基を反応させ、ビオチンと磁性ビーズを共有結合させた。その後、磁性ビーズを０．１％ ＢＳＡ／ ０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０／ ＰＢＳ溶液で２回洗浄し、最後にＰＢＳ緩衝液に懸濁した。得られた磁性ビーズ（３０ｍｇビーズ／ｍＬ ＰＢＳ）をビオチン化磁性ビーズとした。

【0176】

ＴＭ２融合ＳＩＴＨ−１を上述の実施例１−４と同様に大腸菌で発現させ、調製した大腸菌粗抽出液を、総可溶性タンパク質濃度が５ｍｇ／ｍｌとなるように０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ （ｐＨ７．４）で希釈し、ここにビオチン化磁性ビーズを添加した。室温で１時間転倒混和することで、タマビジンービオチン結合によりＴＭ２融合ＳＩＴＨ−１を磁性ビーズに固定化した。その後、磁性ビーズを０．２％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ緩衝液（ＴＴＢＳ）で３回洗浄した。

【0177】

さらに、ＴＭ２が発現した大腸菌（Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ． （２００９） ＦＥＢＳ Ｊ ２７６： １３８３−１３９７）の粗抽出液を、総可溶性タンパク質濃度が５ｍｇ／ｍｌとなるように０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）で希釈し、ここへビオチン化磁性ビーズを添加した。室温で１時間転倒混和することで、タマビジンービオチン結合によりＴＭ２を固定化した。上記と同様に洗浄後、完成したＴＭ２固定化磁性ビーズ（３０ｍｇビーズ／ｍＬ ＰＢＳ）は血清サンプル固有の非特異結合を差し引くために用いられた。

【0178】

３−２．磁性ビーズを用いたＥＬＩＳＡ分析
市販のヒト血清（Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ ｐｏｏｌ、Ｃｏｓｍｏ−Ｂｉｏ社製）に、実施例２のウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体を１／５０量加えて、ＳＩＴＨ−１抗体を含むヒト血清を調製した。一方、ＳＩＴＨ−１抗体を加えないヒト血清を対照とした。

【0179】

ヒト血清もしくは、ウサギＳＩＴＨ−１抗体を含むヒト血清を、ＰＢＳもしくは、総可溶性タンパク質濃度が５ｍｇ／ｍｌとなるように０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）で調整したｐＴｒｃ９９Ａベクター産物発現大腸菌粗抽出液、もしくは総可溶性タンパク質濃度が５ｍｇ／ｍｌとなるように０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）で調整したＴＭ２発現大腸菌粗抽出液で、１０００倍に希釈した溶液に、さらに、最終濃度が２％（ｗ／ｖ）となるようにＢＳＡを添加した。なお、上記実施例２においては、ヒト血清を１００倍希釈した後に、その希釈後の血清に対する体積比で０．０００２５から０．００２となるようにウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体を加えた。しかしながら、本実施例３−２では、ウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体をヒト血清に１／５０量（体積比で０．０２）を加えてから、１０００倍希釈しているので、ウサギＳＩＴＨ−１抗体の希釈率は１／５００００となる。従って、上記の抗体希釈率は、うつ病患者血清をおよそ１０００倍希釈して用いる場合と同程度となる。

【0180】

こうして調製した希釈血清１ｍＬに、ＴＭ２融合ＳＩＴＨ−１固定化磁性ビーズ、もしくはＴＭ２固定化磁性ビーズを各１０μｌずつ添加し、１時間室温で転倒混和し反応させた。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、磁性ビーズに固定化したＳＩＴＨ−１抗原に結合したウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体を検出するために、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を、また、各磁性ビーズに非特異結合しているヒトＩｇＧを検出するために、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を、それぞれ２％ＢＳＡを含むＴＢＳＴで５０００倍希釈してから混合し、このペルオキシダーゼ標識二次抗体混合溶液を各磁性ビーズに１０００μｌずつ添加し、１時間室温で転倒混和した。その後さらにＴＢＳＴで３回洗浄し、検出試薬１ ｓｔｅｐ ＥＬＩＳＡ ｕｌｔｒａＴＭＢ （ＰＩＥＲＣＥ）を１００μｌ添加し、室温で１分間反応させた。２Ｍ硫酸を１００ｕｌ添加することで反応を停止させ、発色度合い（波長４５０ｎｍにおける吸光度、Ａ４５０）をプレートリーダーＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００（ＴＥＣＡＮ社製）によって測定した。測定は処理区ごとに２回実施し平均値を求めた。

【0181】

データ値としては、ＴＭ２融合ＳＩＴＨ−１固定化磁性ビーズにおいて、各血清希釈液（ＰＢＳ、ｐＴｒｃ９９Ａベクター産物発現大腸菌粗抽出液、ＴＭ２発現大腸菌粗抽出液）を用いた場合のＡ４５０の値から、各血清希釈液ごとにそれぞれ、ＴＭ２固定化磁性ビーズを用いた場合のＡ４５０の値を差し引いたものを用いた。結果を表３に示す。

【0182】

【表3】

【0183】

その結果、表３に示したように、ヒト血清中のＳＩＴＨ−１抗体のＡ４５０の値（Ｓ）は、血清希釈液としてＰＢＳを用いた場合が、最も高い値を示したが、同時にＳＩＴＨ−１抗体を含まない血清におけるＡ４５０値（Ｎ）も極めて高く、結果、ＰＢＳではＳ／Ｎ比（ウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体を加えたヒト血清における発色度合い／ウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体を加えない血清における発色度合い）は最も低かった。

【0184】

一方、ＴＭ２発現大腸菌粗抽出液を血清希釈液として用いた場合は、ＳＩＴＨ−１抗体を含まない血清におけるＡ４５０値が最も低く、非特異結合を大きく抑制することができた。さらに、Ｓ／Ｎ比はＴＭ２発現大腸菌粗抽出液を血清希釈液として用いた場合が最も高く、値として１０を越えた。このことから、ＴＭ２融合ＳＩＴＨ−１固定化磁性ビーズを用いた場合、ＴＭ２発現大腸菌粗抽出液をヒト血清に混合することで、非特異結合を減少させ、高感度で抗ＳＩＴＨ−１抗体を検出できることが示された。

【0185】

なお、ＳＩＴＨ−１抗体の定量によりうつ病（気分障害）の診断を行う場合を想定すると、本明細書中において用いた、ウサギＳＩＴＨ−１抗体を加えたヒト血清、ウサギＳＩＴＨ−１抗体を加えないヒト血清は、それぞれうつ病（気分障害）患者血清、健常者血清とみなすこともできる。ここで表３において、血清希釈液としてＰＢＳを用いた場合は、うつ病患者（Ｓ）で０．６４、健常者（Ｎ）で０．２５という値となり、一方血清希釈液として、ＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａ導入ＢＬ２１粗抽出液を用いた場合は、うつ病患者（Ｓ）で０．２２、健常者（Ｎ）で０．０２という値となる。多くの臨床検体（血清）の中には、健常者であっても非特異結合の高い血清が含まれ、さらにうつ病であっても、ＳＩＴＨ−１抗体価がはっきり高くない血清も含まれると考えられる。従って、それらの差を検出するための測定方法としては、極力非特異結合（Ｎ）が少なく、かつ特異的な結合（Ｓ）も確実に検出できる測定方法が望ましい。本実施例におけるＳ／Ｎ比は、このような観点からの、各血清希釈液などの効果を比較するためにも有効な指標となる。

【0186】

実施例４． Ｈａｒｐｉｎとタマビジンとの融合タンパク質を用いたＥＬＩＳＡにおけるヒト血清存在下での抗Ｈａｒｐｉｎ抗体の検出
本実施例では植物病原細菌由来タンパク質であるＨａｒｐｉｎ（ｈｒｐＺｐｓｓタンパク、Ｔａｋａｋｕｒａら、２００４、Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｍｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ． ６４， ８３(８９）とタマビジン２（ＴＭ２）との融合タンパク質を大腸菌で発現させ、ビオチン化マイクロプレートにタマビジンービオチン結合により固定化させた。こうして得られたＨａｒｐｉｎプレートに、タマビジン２によるブロッキングを行った上で、各種大腸菌粗抽出液で希釈した血清（ウサギ抗Ｈａｒｐｉｎ抗体とヒト血清を混合した血清）を反応させた後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体により抗Ｈａｒｐｉｎ抗体を検出した。以下、詳細に説明する。

【0187】

４−１．Ｈａｒｐｉｎとタマビジン２の融合タンパク質発現用ベクターの構築と大腸菌発現
ＰＣＲを用いてＴＭ２の配列をＨａｒｐｉｎのＣ末端側に接続させた融合タンパク質をコードする遺伝子を構築した。Ｈａｒｐｉｎ−ＴＭ２融合遺伝子構築のために、Ｈａｒｐｉｎ、ＴＭ２両遺伝子をリンカー（５ｘｌｉｎｋｅｒ： ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号１８）を介し結合させるためのプライマーを設計した。設計したプライマーを表４に示す。

【0188】

【表4】

【0189】

表４に示した通り、５’側にＨａｒｐｉｎ Ｃ末端部位、中央にリンカー、３’側にＴＭ２ Ｎ末端部位からなるプライマー（ＨａｒｐｉｎＣ−５ｘｌｉｎｋ−ＴＭ２Ｎ−Ｆ、表４、配列番号２７）、５’側にＴＭ２ Ｎ末端部位、中央にリンカー、３’側にＨａｒｐｉｎ Ｃ末端部位を逆向きにコードするＤＮＡ配列からなるプライマー（ＨａｒｐｉｎＣ−５ｘｌｉｎｋ−ＴＭ２Ｎ−Ｒ、表４、配列番号２６）を設計した。また、ＨａｒｐｉｎのＮ末端部位のプライマーＨａｒｐｉｎＮｔｅｒｍＥｃｏＲＩ−Ｆ（５’末端にＥｃｏＲＩ切断配列を含む、表４、配列番号２５）を設計した。

【0190】

Ｈａｒｐｉｎ−ＴＭ２融合遺伝子を構築するために、二段階のＰＣＲを行った。一段階目のＰＣＲは、Ｈａｒｐｉｎ遺伝子（ＯＲＦ）（配列番号２８）（コードアミノ酸配列：配列番号２９）がｐＣＲ２．１ Ｖｅｃｔｏｒ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み込まれているプラスミド（Ｔａｋａｋｕｒａら、２００４、Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｍｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ． ６４， ８３(８９）を鋳型にして、プライマーＨａｒｐｉｎＮｔｅｒｍＥｃｏＲＩ−ＦとＨａｒｐｉｎＣ−５ｘｌｉｎｋ−ＴＭ２Ｎ−Ｒを用いてＨａｒｐｉｎ部位の増幅を行った。また、別個に、ＴＭ２遺伝子がベクターｐＴｒｃ９９Ａに組み込まれたプラスミド（ＷＯ０２／０７２８１７）を鋳型にして、プライマーＨａｒｐｉｎＣ−５ｘｌｉｎｋ−ＴＭ２Ｎ−ＦとＴＭ２ＣｔｅｒｍＢａｍを用いてＴＭ２部位の増幅を行った。

【0191】

ＰＣＲ反応条件は、２０μｌの反応液中に鋳型ＤＮＡを１００ｎｇ、１０(ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ社）を２μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰを１．６μｌ、プライマーを各２０ｐｍｏｌｅｓ、５Ｕ／μｌ Ｅｘ Ｔａｑを０．１(ｌ添加し、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ）を用いて、９４℃、６０℃、７２℃各３０秒を２５回行った。その結果、Ｈａｒｐｉｎ部分においては、約１ｋｂｐ、ＴＭ２部分においては約０．５ｋｂｐのＰＣＲ産物が得られた。これらのＰＣＲ産物をＴＡＥ緩衝液中で、アガロースゲル電気泳動を用い分画した。各ＰＣＲ産物をゲルごと切り出し、ＱＩＡＥＸ ＩＩゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてそれら産物を回収した。抽出方法はキット添付の説明書に従った。

【0192】

上記２つのＰＣＲ産物を鋳型にして、プライマーＨａｒｐｉｎＮｔｅｒｍＥｃｏＲＩ−ＦとＴＭ２ＣｔｅｒｍＢａｍを用いて二段階目のＰＣＲを行った。反応条件は、２０μｌの反応液中に鋳型ＤＮＡを各１００ｎｇ、１０(Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ社）を２μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰを１．６μｌ、プライマーを各２０ｐｍｏｌｅｓ、５Ｕ／μｌ Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．１μｌ添加し、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ）を用いて９４℃、３０秒，６０℃、１分，７２℃、１．５分を２５回行った。その結果、約１．５ｋｂｐのＰＣＲ産物が得られた。

【0193】

ＰＣＲによって得られたｈａｒｐｉｎ−ＴＭ２融合遺伝子をベクターｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。塩基配列を確認した後、融合遺伝子が組み込まれたプラスミドをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで二重消化し、前述と同様の方法でアガロースゲル電気泳動と精製を行い、ＤＮＡ断片を回収した。この断片を予めＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化しておいた大腸菌用の発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用いてライゲーションさせた。ライゲーション産物を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、塩基配列を確認した。

【0194】

以上のように、ｈａｒｐｉｎとＴＭ２の融合タンパク質発現用のベクターｈａｒｐｉｎ−ＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａを完成させた。ｈａｒｐｉｎ−ＴＭ２をコードする塩基配列を配列番号３０に、コードされるアミノ酸配列を配列番号３１に示す。

【0195】

Ｈａｒｐｉｎ−ＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａを導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、抗生物質アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地５０ｍｌに接種し、ＯＤ６００における吸光度が０．５に達するまで３０℃で振とう培養した。その後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、さらに３０℃で５時間振とう培養した。培養液５０ｍｌから遠心にて菌体を回収した。菌体は０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）３ｍｌ中に懸濁後、超音波により破砕した。破砕液を遠心（１５，０００ｒｐｍ）し、その上清を大腸菌粗抽出液とした。ＴＭ２融合ｈａｒｐｉｎタンパク質の発現を確認するため、粗抽出液中に含まれるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、ウェスタンブロッティングにより解析した。

【0196】

Ｈａｒｐｉｎの検出にはウサギ抗ｈａｒｐｉｎ抗体（Ｔａｋａｋｕｒａら、２００４、Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｍｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ． ６４，８３(８９）とアルカリフォスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を各々１０００倍希釈して用いた。

【0197】

結果を図４に示す。インサートを含まない発現ベクターのみを発現させた大腸菌抽出液からは、特異的なバンドが検出されなかったが（図４レーン１）、一方ＴＭ２融合ｈａｒｐｉｎ発現大腸菌からは、約５０ｋＤａ付近にバンドが検出された（図４レーン２）。このサイズはＴＭ２融合ｈａｒｐｉｎの分子量５１．４ｋＤａとほぼ一致した。

【0198】

４−２． ＥＬＩＳＡによるヒト血清存在下での抗Ｈａｒｐｉｎ抗体の検出
ＴＭ２融合Ｈａｒｐｉｎ大腸菌粗抽出液を、総可溶性タンパク質濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるように０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）で希釈し、これをビオチンプレート（住友ベークライト）に１００μｌずつ添加した。室温で１時間静置することでタマビジンービオチン結合によりＴＭ２融合Ｈａｒｐｉｎを固定化した。その後、プレートの各ウェルを０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ緩衝液（ＴＢＳＴ）で３回洗浄した。５０μｇ／ｍｌ 精製ＴＭ２（ＷＯ０２／０７２８１７）／０．５％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ溶液を各ウェルに２５０ｕｌ添加し、室温で１時間静置することで、ＴＭ２とＢＳＡでブロッキングを行った。ブロッキング後、各ウェルはＴＢＳＴで３回洗浄した。

【0199】

次にヒト血清（Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ ｐｏｏｌ、Ｃｏｓｍｏ−Ｂｉｏ社製）を、ＰＢＳもしくは５ｍｇ総可溶性タンパク質／ｍｌ（０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７．４）の大腸菌粗抽出液、５ｍｇ総可溶性タンパク質／ｍｌ（０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ ｐＨ７．４）のｐＴｒｃ９９Ａベクター産物発現大腸菌粗抽出液もしくは５ｍｇ総可溶性タンパク質／ｍｌ（０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７．４）のＴＭ２発現大腸菌粗抽出液で１００倍希釈した。さらにこの溶液に１％ＢＳＡを添加後、１／５００量のウサギ抗Ｈａｒｐｉｎ抗体を加え、抗Ｈａｒｐｉｎ抗体含有血清を調製した。なお、Ｈａｒｐｉｎ抗体を加えない血清を対照とした。

【0200】

これらの血清をＴＭ２融合Ｈａｒｐｉｎを固定化したプレートに１００ｕｌずつ添加し、１時間室温で静置し反応させた後、ＴＢＳＴで３回洗浄した。Ｈａｒｐｉｎ抗原に結合したウサギ抗Ｈａｒｐｉｎ抗体を検出するために、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を、また、ウェルに非特異結合しているヒトＩｇＧを検出するために、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を、それぞれ１％ＢＳＡを含むＴＢＳＴで５０００倍希釈してから混合し、このペルオキシダーゼ標識二次抗体混合溶液を各ウェルに１００ｕｌずつ添加し、１時間室温で静置し、反応させた。その後、さらにＴＢＳＴで３回洗浄し、検出試薬 １ｓｔｅｐ ＥＬＩＳＡ ｕｌｔｒａＴＭＢ （ＰＩＥＲＣＥ）を１００ｕｌ添加し、室温で５分間反応させた。２Ｍ硫酸を１００ｕｌ添加することで反応を停止させ、発色度合い（波長４５０ｎｍにおける吸光度、Ａ４５０）をプレートリーダーＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００（ＴＥＣＡＮ社製）によって測定した。測定は処理区ごとに３回実施し平均値を求めた。なお、本実施例においては、抗体の濃度が比較的高く、また非特異結合も少ない系となったため、抗原を固相化していない区の測定値を差し引く必要がなかった。

【0201】

結果を表５に示す。

【0202】

【表5】

【0203】

表５に示したように、ヒト血清中のｈａｒｐｉｎ抗体のＡ４５０の値（Ｓ）は、各血清希釈液間で大きな差はなかったが、対照としたｈａｒｐｉｎ抗体を含まない血清における値（Ｎ）は、ＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａ導入ＢＬ２１粗抽出液、ｐＴｒｃ９９Ａ導入ＢＬ２１粗抽出液、大腸菌（ＢＬ２１）粗抽出液、ＰＢＳの順に低かった。このことは、ＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａ導入ＢＬ２１粗抽出液が最も非特異結合を抑制することができたことを示す。また、Ｓ／Ｎ比（ウサギ抗Ｈａｒｐｉｎ抗体を加えたヒト血清における発色度合い／ウサギ抗Ｈａｒｐｉｎ抗体を加えない血清における発色度合い）についても、タマビジン２を発現させた大腸菌抽出液（ＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａ導入ＢＬ２１粗抽出液）を血清希釈液として用いた場合が最も高かった。

【0204】

以上のことから、タマビジン２を発現させた大腸菌抽出液を用いてヒト血清を希釈することで、非特異的な結合が抑制され、感度の高い検出ができることが示された。

【配列表フリーテキスト】

【0205】

配列番号１：ＳＩＴＨ−１のアミノ酸配列。

【0206】

配列番号２：ＳＩＴＨ−１ ＯＲＦの塩基配列。

【0207】

配列番号３：ＳＩＴＨ―１ ｃＤＮＡの塩基配列。

【0208】

配列番号４：タマビジン１の塩基配列。

【0209】

配列番号５：タマビジン１のアミノ酸配列。

【0210】

配列番号６：タマビジン２の塩基配列。

【0211】

配列番号７：タマビジン２のアミノ酸配列。

【0212】

配列番号８：リンカー配列の例。

【0213】

配列番号９：リンカー配列の例。

【0214】

配列番号１０：リンカー配列の例。

【0215】

配列番号１１：リンカー配列の例。

【0216】

配列番号１２：リンカー配列の例。

【0217】

配列番号１３：リンカー配列の例。

【0218】

配列番号１４：リンカー配列の例。

【0219】

配列番号１５：リンカー配列の例。

【0220】

配列番号１６：リンカー配列の例。

【0221】

配列番号１７：リンカー配列の例。

【0222】

配列番号１８：リンカー配列の例（実施例で使用）。

【0223】

配列番号１９：プライマーＳＩＴＨ１Ｃ−５ｘｌｉｎｋ−ＴＭ２Ｎ−Ｆの塩基配列。

【0224】

配列番号２０：プライマーＳＩＴＨ１Ｃ−５ｘｌｉｎｋ−ＴＭ２Ｎ−Ｒの塩基配列。

【0225】

配列番号２１：プライマーＳＩＴＨ１ ５’ ＥｃｏＲＩ−Ｆの塩基配列。

【0226】

配列番号２２：プライマーＴＭ２ＣｔｅｒｍＢａｍの塩基配列。

【0227】

配列番号２３：ＳＩＴＨ−１―ＴＭ２の塩基配列。

【0228】

配列番号２４：ＳＩＴＨ−１−ＴＭ２のアミノ酸配列。

【0229】

配列番号２５：プライマーＨａｒｐｉｎＮｔｅｒｍＥｃｏＲＩ−Ｆの塩基配列。

【0230】

配列番号２６：プライマーＨａｒｐｉｎＣ−５ｘｌｉｎｋ−ＴＭ２Ｎ−Ｒの塩基配列。

【0231】

配列番号２７：プライマーＨａｒｐｉｎＣ−５ｘｌｉｎｋ−ＴＭ２Ｎ−Ｆの塩基配列。

【0232】

配列番号２８：Ｈａｒｐｉｎ遺伝子（ＯＲＦ）の塩基配列。

【0233】

配列番号２９：Ｈａｒｐｉｎ遺伝子（ＯＲＦ）によってコードされるアミノ酸配列。

【0234】

配列番号３０：ｈａｒｐｉｎ−ＴＭ２の塩基配列。

【0235】

配列番号３１：ｈａｒｐｉｎ−ＴＭ２のアミノ酸配列。

【図1】

【図3】

【図2】

【図4】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]