特許 5647677 新規組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5647677

(24)【登録日】2014年11月14日

(45)【発行日】2015年1月7日

(54)【発明の名称】新規組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/39 20060101AFI20141211BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20141211BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20141211BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20141211BHJP

   A61K 47/10 20060101ALI20141211BHJP

   C12N 15/117 20100101ALN20141211BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/39

   A61K39/00 G

   A61K39/00 H

   A61K9/127

   A61K47/02

   A61K47/10

   !C12N15/00 JZNA

【請求項の数】16

【全頁数】28

(21)【出願番号】特願2012-514447(P2012-514447)

(86)(22)【出願日】2010年6月8日

(65)【公表番号】特表2012-529464(P2012-529464A)

(43)【公表日】2012年11月22日

(86)【国際出願番号】EP2010058017

(87)【国際公開番号】WO2010142685

(87)【国際公開日】20101216

【審査請求日】2012年3月1日

(31)【優先権主張番号】0910046.2

(32)【優先日】2009年6月10日

(33)【優先権主張国】GB

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】305060279

【氏名又は名称】グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム

(74)【代理人】

【識別番号】100091096

【弁理士】

【氏名又は名称】平木 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100118773

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 節

(74)【代理人】

【識別番号】100122389

【弁理士】

【氏名又は名称】新井 栄一

(74)【代理人】

【識別番号】100111741

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 夏夫

(72)【発明者】

【氏名】ヘンドリックス，ヴェロニク

(72)【発明者】

【氏名】ルモワンヌ，ドミニク イングリッド

【審査官】 ▲高▼岡 裕美

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００２−５０１９０４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５２１３８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−０１５４８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５１９３０９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１２−５２９４６５（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／００−３９／４４

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）リポソーム製剤中の３Ｄ−ＭＰＬ及びＱＳ２１と、（ｂ）ソルビトール又はスクロースとを含む水性アジュバント組成物であって、該アジュバント組成物における塩化ナトリウム濃度が３０ｍＭ未満である、上記水性アジュバント組成物。

【請求項2】

前記塩化ナトリウム濃度が１０ｍＭ未満である、請求項１記載の水性アジュバント組成物。

【請求項3】

前記塩化ナトリウム濃度が、５ｍＭ未満である、請求項２記載の水性アジュバント組成物。

【請求項4】

実質的に塩化ナトリウムを含んでいない、請求項３記載の水性アジュバント組成物。

【請求項5】

前記ソルビトールの濃度が３％〜１５％（ｗ／ｖ）である、請求項１〜４のいずれかに記載の水性アジュバント組成物。

【請求項6】

前記ソルビトールの濃度が４％〜１０％（ｗ／ｖ）である、請求項５記載の水性アジュバント組成物。

【請求項7】

５ｍＭの塩化ナトリウム及び５％〜６％ｗ／ｖのソルビトールを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の水性アジュバント組成物。

【請求項8】

前記アジュバント組成物におけるイオン強度が１００ｍＭ未満である、請求項１〜７のいずれかに記載の水性アジュバント組成物。

【請求項9】

抗原と、請求項１〜８のいずれかに記載の水性アジュバント組成物とを含む、免疫原性組成物であって、該抗原は、ＰＲＡＭＥ若しくはＮＹＥＳＯ−１のいずれか、又はその断片から選択され、該断片は、少なくとも８アミノ酸長であり、主要なエピトープが保持され、そして前記断片が天然の抗原と交差反応する免疫応答を誘導できるものである、前記免疫原性組成物。

【請求項10】

ＣｐＧオリゴヌクレオチドを更に含む、請求項９に記載の免疫原性組成物。

【請求項11】

少なくとも一種の抗原を含む凍結乾燥組成物を、請求項１〜８のいずれかに記載の水性アジュバント組成物で再構成する工程を含む、請求項９又は１０に記載の免疫原性組成物を調製する方法であって、該抗原は、ＰＲＡＭＥ若しくはＮＹＥＳＯ−１のいずれか、又はその断片から選択され、該断片は、少なくとも８アミノ酸長であり、主要なエピトープが保持され、そして前記断片が天然の抗原と交差反応する免疫応答を誘導できるものである、前記方法。

【請求項12】

前記凍結乾燥組成物が、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを更に含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記抗原が、イオン強度が１００ｍＭを超える溶液中で可溶性ではない、請求項１１又は１２に記載の方法。

【請求項14】

（ｉ）抗原を含む凍結乾燥組成物（ここで、該抗原は、ＰＲＡＭＥ若しくはＮＹＥＳＯ−１のいずれか、又はその断片若しくは誘導体から選択される）と、（ｉｉ）請求項１〜８のいずれかに記載の水性アジュバント組成物とを含む、キット。

【請求項15】

前記凍結乾燥組成物がＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを更に含む、請求項１４記載のキット。

【請求項16】

前記抗原が、前記イオン強度が１００ｍＭを超える溶液中で可溶性ではない、請求項１４又は１５に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、非イオン性等張化剤を含み、且つ、低濃度の塩、具体的には、１００ｍＭ以下の濃度で塩化ナトリウムを有する水性アジュバント組成物に関する。また、本発明は、抗原又は抗原性調製物と、前記水性アジュバント組成物とを含む免疫原性組成物にも関する。

【背景技術】

【0002】

アジュバントは、任意の所与の抗原に対する免疫応答を改善するために用いられることがある。しかしながら、ワクチン又は免疫原性組成物中へアジュバントを含有させることは、成分の調製の複雑性ならびにワクチン組成物の分配及び製剤化の複雑性を増大させる。調剤者は、アジュバント成分ならびに抗原成分のそれぞれの調製を考慮しなければならない。特に、抗原成分とアジュバント成分との適合性を考慮すべきである。これは、特に、凍結乾燥された抗原又は抗原性調製物がアジュバント調製物と一緒に再構成されることが意図される場合である。係る場合では、アジュバント調製物のバッファが、抗原又は抗原性調製物に適していて、且つ、抗原の免疫原性又は溶解性がアジュバントから影響を受けないことが重要である。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0003】

本発明者らは、いくつかの抗原は、塩化ナトリウムなどのような塩による飽和によって溶液からタンパク質が沈殿すると定義できる「塩析」として知られている現象に特に敏感であることを見出した。本発明者らは、感受性抗原は、１５０ｍＭもの低い塩化ナトリウム濃度で凝集し沈殿し得ることを見出した。

【0004】

而して、本発明は、リポソーム製剤中Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）４アゴニスト及びサポニン、及び非イオン性等張化剤を含む水性等張性アジュバント組成物を提供し、そしてその場合、前記組成物における塩化ナトリウムの濃度は１００ｍＭ未満である。

【0005】

更に、本発明は、リポソーム製剤中ＴＬＲ−４アゴニスト及びサポニン、及び非イオン性等張化剤を含む水性等張性アジュバント組成物を提供し、そしてその場合、前記組成物におけるイオン強度は１００ｍＭ未満である。

【0006】

更に、本発明は、「塩析」し易いタンパク質抗原ならびに「塩析」し易くないタンパク質抗原を含む広範なタンパク質抗原のために使用できる水性等張性アジュバント組成物を提供する。

【0007】

また、本発明は、抗原又は抗原性調製物と、リポソーム製剤中ＴＬＲ−４アゴニスト及びサポニン、及び非イオン性等張化剤を含む水性等張性アジュバント組成物とを含む免疫原性組成物及び前記免疫原性組成物を作る方法も提供する。前記アジュバント組成物における塩化ナトリウム濃度は１００ｍＭ未満である。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】ＱＳ２１の溶解活性曲線を示している図である。

【図2】異なるＡＳＡ製剤における各３Ｄ−ＭＰＬ同族体の％を示している図である。

【図3】ＰＲＡＭＥ／ＣｐＧの凍結乾燥のために使用される凍結・乾燥サイクルを示している図である。

【図4】ＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）及びＡＳＡ（ソルビトール）中で再構成されたＰＲＡＭＥとＮＹＥＳＯ−１の画像による比較を示している図である。

【図5】実験１において異なるアジュバント組成物と一緒に配合されたＰＲＡＭＥ／ＣｐＧで免疫されたマウスの体液性応答を示しているグラフである。

【図6】実験１において異なるアジュバント組成物と一緒に配合されたＰＲＡＭＥ／ＣｐＧで免疫されたマウスの腫瘍防御を示しているグラフである。

【図7】実験２においてＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）、ＡＳＡ（ソルビトール）、又は液体製剤ＡＳＡ（７０ｍＭのＮａＣｌ）と一緒に配合されたＰＲＡＭＥ／ＣｐＧで免疫されたマウスの体液性応答を示しているグラフである。

【図8】実験２においてＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）、ＡＳＡ（ソルビトール）、又は液体製剤ＡＳＡと一緒に配合されたＰＲＡＭＥ／ＣｐＧで免疫されたマウスのＣＤ４＋応答を示しているグラフである。

【図9】実験２においてＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）、ＡＳＡ（ソルビトール）、又は液体製剤ＡＳＡと一緒に配合されたＰＲＡＭＥ／ＣｐＧで免疫されたマウスの腫瘍防御を示しているグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本発明は、水性アジュバント組成物中において、塩化ナトリウムのような塩である等張化剤を、非イオン性等張化剤で置換又は部分的に置換することを説明する。

【0010】

非経口投与のためには、溶液は、細胞の変形又は溶解を回避するために、生理的に等張であるべきである（すなわち、薬学的に許容可能な浸透圧重量モル濃度を有するべきである）ことは公知である。「等張化剤」とは、生理的に許容され、且つ、製剤（例えば本発明の免疫原性組成物）に対して適当な張性を付与して製剤と接触している細胞膜全体にわたる水の純流動を防止する化合物である。

【0011】

１００ｍＭの塩化ナトリウムか又はそれを超える、例えば国際公開第ＷＯ２００５／１１２９９１号及び第ＷＯ２００８／１４２１３３号で開示されているアジュバント系Ａ（ＡＳＡ）又は第ＷＯ２００７／０６８９０７号で開示されているリポソームアジュバントを含む水性アジュバント組成物は、公知である。国際公開第ＷＯ２００８／１４２１３３号に開示されているように、前記アジュバント組成物を希釈剤として使用して、抗原又は抗原性調製物を含む凍結乾燥組成物を、ワクチン接種の前に、再構成し得る。前記の再構成された組成物は、等張であること、すなわち、細胞の収縮又は膨張が注射によって引き起こされないように、身体の細胞及び血液において見出されるのと実質的に同じ塩濃度を含むことが重要である。一般的に、塩化ナトリウムは、等張化剤として使用される。本発明者は、特定の抗原が、溶液中に高濃度の塩を含む時に溶液中のタンパク質が凝集又は凝固するプロセスである「塩析」に対して特に敏感であることを見出した。

【0012】

タンパク質抗原が凝集する塩濃度は、タンパク質ごとに異なる。本発明者は、比較的低い塩濃度で、例えば約１００ｍＭ以下の塩化ナトリウム濃度で、凝集する一群の抗原を確認した。そのことは、特定の公知のアジュバント組成物は、凝集を起こすようなそれらの抗原を含む組成物を再構成するのに適していないか又は前記抗原を含む組成物と一緒に使用するのに適していない、ことを意味している。

【0013】

本発明は、そのような抗原、すなわち１００ｍＭ未満の塩化ナトリウムの塩濃度で凝集するそれらの抗原と一緒に使用し得る水性アジュバント組成物を提供する。本発明の水性アジュバント組成物は、リポソーム製剤中ＴＬＲ−４アゴニスト及びサポニン、及び非イオン性等張化剤を含み、そしてその場合、前記アジュバント組成物における塩化ナトリウムの濃度は、約１００ｍＭ未満であり、例えば９０ｍＭ未満、８０ｍＭ未満、７０ｍＭ未満、６０ｍＭ未満、５０ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、２０ｍＭ未満、又は１５ｍＭ未満である。特定の実施態様では、アジュバント組成物中の塩化ナトリウム濃度は、１０ｍＭ未満であるか、又は５ｍＭ以下である。更なる特定の実施態様では、アジュバント組成物は、実質的に、塩化ナトリウムを含有していない。実質的に含有していないとは、塩化ナトリウム濃度が、０ｍＭであるか、又は殆ど０ｍＭに近い（すなわち１ｍＭ、２ｍＭ、又は３ｍＭ）という意味である。

【0014】

当業者は、公知の技術及びキットを使用して、ナトリウムイオン（Ｎａ^＋）及び塩化物イオン（Ｃｌ⁻）の両方の濃度を容易に検査できる。例えば、ナトリウムは、Ｂｉｏｓｕｐｐｌｙから市販されているＳｏｄｉｕｍ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（カタログ番号：ＢＱ０１１ＥＡＥＬ）のようなキットを使用して測定できる。塩化物は、Ｂｉｏｓｕｐｐｌｙから市販されているＣｈｌｏｒｉｄｅ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（カタログ番号：ＢＱ０１１ＥＡＥＬ）のようなキットを使用して測定できる。

【0015】

更に、本発明は、リポソーム製剤中ＴＬＲ−４アゴニスト及びサポニン、及び非イオン性等張化剤を含む水性等張性アジュバント組成物を提供し、そしてその場合、イオン強度は、１００ｍＭ未満であり、例えば９０ｍＭ、８０ｍＭ未満、７０ｍＭ未満、６０ｍＭ未満、５０ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、２０ｍＭ未満、又は１５ｍＭ未満である。特定の実施態様では、アジュバント組成物中のイオン強度は、１０ｍＭ未満であるか、又は５ｍＭ以下である。更なる特定の実施態様では、アジュバント組成物は、０ｍＭであるか、又は殆ど０ｍＭに近いイオン強度を有する。

【0016】

本発明のアジュバント又は免疫原性組成物のイオン強度は、当業者に公知の技術を使用して、例えば導電率計を使用して、測定できる。

【0017】

抗原性組成物と組み合わされる本発明の水性アジュバント組成物で使用するための適当な非イオン性等張化剤は、ヒトでの使用に適している必要があり、且つ、抗原性組成物中の抗原と適合性である必要があり、そして更にアジュバント組成物の他の成分とも適合性である必要がある。

【0018】

特に、水性アジュバント組成物は、抗原性組成物中の抗原が、前記水性アジュバント組成物と組み合わされる時に、溶液のままであることができ且つそれらの免疫原性を保持できるような水性アジュバント組成物でなければならない。

【0019】

本発明の一つの実施態様では、好適な非イオン性等張化剤は、ポリオール、糖（特にスクロース、フルクトース、デキストロース、若しくはグルコース）、又はアミノ酸、例えばグリシンである。一つの実施態様では、ポリオールは、糖アルコールであり、特にＣ３〜Ｃ６糖アルコールである。糖アルコールの例としては、グリセリン、エリスリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、リビトール、ソルビトール、マンニトール、ズルシトール、及びイジトールが挙げられる。本実施態様の特定の実施例では、適当な非イオン性等張化剤は、ソルビトールである。本発明の特定の実施態様では、本発明組成物中の非イオン性等張化剤は、スクロース及び／又はソルビトールである。

【0020】

一つの実施態様では、水性アジュバント組成物中のポリオールの好適な濃度は、約３〜約１５％（ｗ／ｖ）、特に約３〜約１０％（ｗ／ｖ）、例えば約３〜約７％（ｗ／ｖ）、例えば約４〜約６％（ｗ／ｖ）である。本実施態様の特定の実施例では、ポリオールは、ソルビトールである。

【0021】

水性アジュバント組成物は、リポソーム製剤中Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）４アゴニスト、及びサポニンを含む。これは、サポニン及びＴＬＲ−４アゴニストが、リポソームと一緒に配合されることを意味する。

【0022】

用語「リポソーム」は、水性の内部を取り囲んでいる単層膜又は多重膜（特に、形成される脂質膜の数に応じて２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の層状構造）の脂質構造を一般的に指している。リポソーム及びリポソーム製剤は、当業において公知である。リポソームを形成できる脂質としては、脂肪特性又は脂肪様特性を有するすべての物質が挙げられる。リポソーム中の脂質を構成できる脂質は、グリセリド、グリセロリン脂質、グリセロホスフィノ脂質、グリセロホスホノ脂質、スルホリピド、スフィンゴ脂質、リン脂質、イソプレノリド（ｉｓｏｐｒｅｎｏｌｉｄｅ）、ステロイド、ステアリン、ステロール、アルケオ脂質（ａｒｃｈｅｏｌｉｐｉｄ）、合成カチオン脂質、及び炭水化物含有脂質から成る群より選択できる。

【0023】

一つの実施態様では、リポソームは、リン脂質を含む。適当なリン脂質としては（限定するものではないが）：ホスファチジルコリン合成の際の中間物であるホスホコリン（ＰＣ）；天然リン脂質誘導体：すなわち、卵ホスホコリン、卵ホスホコリン、大豆ホスホコリン、水素化大豆ホスホコリン、天然リン脂質としてスフィンゴミエリン；及び合成リン脂質誘導体：すなわち、ホスホコリン（ジデカノイル−Ｌ−α−ホスファチジルコリン［ＤＤＰＣ］、ジラウロリルフォスファチジルコリン［ＤＬＰＣ］、ジミリストイルホスファチジルコリン［ＤＭＰＣ］、ジパルミトイルホスファチジルコリン［ＤＰＰＣ］、ジステアロイルホスファチジルコリン［ＤＳＰＣ］、ジオレオイルホスファチジルコリン［ＤＯＰＣ］、１−パルミトイル、２−オレオイルホスファチジルコリン［ＰＯＰＣ］、ジエライドイルホスファチジルコリン［ＤＥＰＣ］）、ホスホグリセロール（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール［ＤＭＰＧ］、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール［ＤＰＰＧ］、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール［ＤＳＰＧ］、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール［ＰＯＰＧ］）、ホスファチジン酸（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジン酸［ＤＭＰＡ］、ジパルミトイルホスファチジン酸［ＤＰＰＡ］、ジステアロイル−ホスファチジン酸［ＤＳＰＡ］）、ホスホエタノールアミン（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン［ＤＭＰＥ］、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン［ＤＰＰＥ］、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン［ＤＳＰＥ］、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン［ＤＯＰＥ］）、ホスホセリン、ポリエチレングリコール［ＰＥＧ］リン脂質（ｍＰＥＧ−リン脂質、ポリグリセリン−リン脂質、機能性リン脂質、末端活性リン脂質）が挙げられる。一つの実施態様では、リポソームは、１−パルミトイル−２−オレオイル−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを含む。一つの実施態様では、高度に精製されたホスファチジルコリンを使用し、ホスファチジルコリン（ＥＧＧ）、水素化ホスファチジルコリン（ＥＧＧ）、ホスファチジルコリン（ＳＯＹ）、水素化ホスファチジルコリン（ＳＯＹ）を含む群より選択できる。更なる実施態様では、リポソームは、ホスファチジルエタノールアミン［ＰＯＰＥ］又はその誘導体を含む。

【0024】

リポソームサイズは、リン脂質組成物及びそれらの調製のために使用した方法に応じて、３０ｎｍ〜数μｍで変化し得る。本発明の特定の実施態様では、リポソームサイズは、５０ｎｍ〜５００ｎｍであり、更なる実施態様では５０ｎｍ〜２００ｎｍである。動的レーザー光散乱は、当業者に公知のリポソームのサイズを測定するために使用される方法である。

【0025】

リポソームは、好適には室温で非晶質である中性脂質、例えば、ホスファチジルコリン、例えば卵黄ホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、又はジラウリルホスファチジルコリンを好適に含む。特定の実施態様では、本発明のリポソームは、ＤＯＰＣを含む。リポソームは、飽和脂質から構成されるリポソームのためにリポソーム−サポニン構造の安定性を増加させる荷電脂質（ｃｈａｒｇｅｄ ｌｉｐｉｄ）も含み得る。これらの場合、荷電脂質の量は、好適には１〜２０％ｗ／ｗであり、好ましくは５〜１０％である。リン脂質に対するステロールの比率は、１〜５０％（モル／モル）、好適には２０〜２５％である。

【0026】

本発明で使用するための特に好適なサポニンは、Ｑｕｉｌ Ａ及びその誘導体である。Ｑｕｉｌ Ａは、南アフリカの木であるキラジャ・サポナリアモリナ（Ｑｕｉｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ）から分離されたサポニン調製物であり、最初にＤａｌｓｇａａｒｄらによって１９７４年にアジュバント活性を有することが記述された（“Ｓａｐｏｎｉｎ ａｄｊｕｖａｎｔｓ”， Ａｒｃｈｉｖ． ｆｕｅｒ ｄｉｅ ｇｅｓａｍｔｅ Ｖｉｒｕｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇ， Ｖｏｌ．４４， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｂｅｒｌｉｎ， ｐ２４３−２５４）。Ｑｕｉｌ Ａ、例えばＱＳ７及びＱＳ２１（ＱＡ７及びＱＡ２１としても公知である）と関連のある毒性を有していないアジュバント活性を保持しているＱｕｉｌ Ａの精製断片を、ＨＰＬＣで単離した（欧州特許第０ ３６２ ２７８号）。ＱＳ−２１は、Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの樹皮から誘導される天然サポニンであり、そしてそれは、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、Ｔｈ１細胞、及び優勢なＩｇＧ２ａ抗体応答を誘導する。ＱＳ２１は、本発明の文脈では、好適なサポニンである。

【0027】

本発明の適当な形態では、免疫原性組成物中のサポニンアジュバントは、ｓａｐｏｎａｒｉａ ｍｏｌｉｎａ ｑｕｉｌ Ａの誘導体であり、好ましくはＱｕｉｌ Ａ、例えばＱＳ−１７又はＱＳ−２１、好適にはＱＳ−２１の免疫学的に活性な断片である。

【0028】

特定の実施態様では、ＱＳ２１は、外因性ステロール、例えばコレステロールによってクエンチされる、より反応源性が低いＱＳ２１組成物として提供される。外因性コレステロールによってＱＳ２１がクエンチされる反応源性が更に低い組成物のいくつかの特定の形態が、存在する。サポニン／ステロールは、リポソーム製剤構造である（国際公開第ＷＯ９６／３３７３９号、実施例１）。

【0029】

好適なステロールとしては、β−シトステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロール、及びコレステロールが挙げられる。一つの特定の実施態様では、アジュバント組成物は、ステロールとしてコレステロールを含む。これらのステロールは、当業において公知であり、例えば、コレステロールは、動物脂肪中に見出される天然ステロールとしてＭｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ，第１１版，３４１頁に開示されている。

【0030】

活性サポニン断片がＱＳ２１である場合、ＱＳ２１対ステロールの比は：典型的には１：１００〜１：１（ｗ／ｗ）、好適には１：１０〜１：１（ｗ／ｗ）、そして好ましくは１：５〜１：１（ｗ／ｗ）のオーダーである。好適には過剰なステロールが存在し、Ｑ２１：ステロールの比は、少なくとも１：２（ｗ／ｗ）である。一つの実施態様では、ＱＳ２１：ステロールの比率は、１：５（ｗ／ｗ）である。ステロールは、好適には、コレステロールである。

【0031】

水性アジュバント組成物は、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ−４）アゴニストを含む。「ＴＬＲアゴニスト」とは、直接リガンドとして、又は内因性若しくは外因性リガンドの生成を介して間接的に、ＴＬＲシグナリング経路を介してシグナル応答を引き起こすことができる成分を意味している（Ｓａｂｒｏｅら、ＪＩ ２００３ ｐ１６３０−５）。ＴＬＲ−４アゴニストは、ＴＬＲ−４シグナリング経路を介してシグナル応答を引き起こすことができる。ＴＬＲ−４アゴニストの好適な例は、リポポリサッカライド、好適にはリピドＡの無毒性誘導体、特にモノホスホリルリピドＡ、又は更に特に３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）である。

【0032】

３Ｄ−ＭＰＬは、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｎ．Ａ．によりＭＰＬの名称で販売されており、本明細書ではＭＰＬ又は３Ｄ−ＭＰＬと称する。例えば、米国特許第４，４３６，７２７号、同第４，８７７，６１１号、同第４，８６６，０３４号、及び同第４，９１２，０９４号を参照されたい。３Ｄ−ＭＰＬは、主にＩＦＮ−ｇ（Ｔｈ１）表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞性応答を促進する。３Ｄ−ＭＰＬは、英国特許第ＧＢ２ ２２０ ２１１ Ａ号に開示された方法に従って製造できる。化学的には、それは、４、５又は６種のアシル化鎖を有する３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。本発明の組成物では、小粒子３Ｄ−ＭＰＬを使用して水性アジュバント組成物を調製し得る。小粒子３Ｄ−ＭＰＬは、０．２２μｍフィルターによって濾過滅菌し得るような粒径を有する。そのような調製物は、国際公開第ＷＯ９４／２１２９２号に記載されている。好ましくは、粉末状の３Ｄ−ＭＰＬを使用して、本発明の水性アジュバント組成物を調製する。

【0033】

使用できる他のＴＬＲ−４アゴニストは、アルキルグルコサミニドホスフェート（ＡＧＰ）、例えば国際公開第ＷＯ９８／５０３９９号又は米国特許第６，３０３，３４７号（ＡＧＰの調製法も開示されている）で開示されているＡＧＰ、好適にはＲＣ５２７又はＲＣ５２９又は米国特許第６，７６４，８４０号に開示されているＡＧＰの薬学的に許容可能な塩である。

【0034】

他の適当なＴＬＲ−４アゴニストは、国際公開第ＷＯ２００３／０１１２２３号及び国際公開第ＷＯ２００３／０９９１９５号に記載されており、例えば国際公開第ＷＯ２００３／０１１２２３号の４〜５ページ又は国際公開第ＷＯ２００３／０９９１９５号の３〜４ページに化合物Ｉ、化合物ＩＩ、及び化合物ＩＩＩとして開示されており、そして、特に、ＥＲ８０３０２２、ＥＲ８０３０５８、ＥＲ８０３７３２、ＥＲ８０４０５３、ＥＲ８０４０５７ｍ、ＥＲ８０４０５８、ＥＲ８０４０５９、ＥＲ８０４４４２、ＥＲ８０４６８０、及びＥＲ８０４７６４として国際公開第ＷＯ２００３／０１１２２３号で開示されている。例えば、一つの好適なＴＬＲ−４アゴニストは、ＥＲ８０４０５７である。

【0035】

本発明の水性アジュバント組成物は、サポニンとＴＬＲ−４アゴニストの両方を含む。特定の実施態様では、水性アジュバント組成物は、ＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬを含む。

【0036】

例えばリポポリサッカライド、例えば３Ｄ−ＭＰＬなどのようなＴＬＲ−４アゴニストは、アジュバント組成物のヒト１用量当たり１〜１００μｇの量で使用できる。３Ｄ−ＭＰＬは、約５０μｇのレベルで、例えば、４０〜６０μｇ、好適には４５〜５５μｇ、又は４９〜５１μｇ、又は５０μｇのレベルで使用し得る。更なる実施態様では、アジュバント組成物のヒト用量は、約２５μｇのレベルで、例えば２０〜３０μｇ、好適には２１〜２９μｇ、又は２２〜２８μｇ、又は２８〜２７μｇ、又は２４〜２６μｇ、又は２５μｇのレベルで、３Ｄ−ＭＰＬを含む。

【0037】

例えばＱＳ２１のようなサポニンは、アジュバント組成物のヒト１用量当たり１〜１００μｇの量で使用できる。ＱＳ２１は、約５０μｇのレベルで、例えば、４０〜６０μｇ、好適には４５〜５５μｇ、又は４９〜５１μｇ、又は５０μｇのレベルで使用し得る。更なる実施態様では、アジュバント組成物のヒト用量は、約２５μｇのレベルで、例えば２０〜３０μｇ、好適には２１〜２９μｇ、又は２２〜２８μｇ、又は２８〜２７μｇ、又は２４〜２６μｇ、又は２５μｇのレベルで、ＱＳ２１を含む。

【0038】

ＴＬＲ−４アゴニスト及びサポニンの両方がアジュバント組成物中に存在する場合、ＴＬＲ−４アゴニスト対サポニンの重量比は、好適には１：５〜５：１、好適には１：１である。例えば、３Ｄ−ＭＰＬが５０μｇ又は２５μｇの量で存在する場合、好適には、ＱＳ２１も、水性アジュバント組成物のヒト１用量当たりそれぞれ５０μｇ又は２５μｇの量で存在し得る。

【0039】

アジュバントを抗原性組成物の液体形態と組み合わせる時には、ヒト用量において、アジュバント組成物は、ヒト用量の意図される最終体積のほぼ半分である好適な体積である。例えば、１ｍｌの意図される最終ヒト用量ではアジュバントは５００μｌの体積であるか、又は０．５ｍｌの意図される最終ヒト用量では２５０μｌの体積である。アジュバント組成物を抗原性組成物と組み合わせてワクチンの最終ヒト用量を提供する場合、アジュバント組成物は希釈される。前記用量の最終体積は、もちろん、アジュバント組成物の初期体積と、アジュバント組成物に添加される抗原性組成物の体積に応じて変わる。別の実施形態においては、水性アジュバントを使用して、凍結乾燥させた抗原性組成物を再構成する。この実施形態では、アジュバント組成物のヒト用量に好適な体積は、ヒト用量の最終体積におおよそ等しい。液体アジュバント組成物を、凍結乾燥させた抗原性組成物を含むバイアルに加えて、凍結乾燥させた抗原性組成物を再構成する。

【0040】

而して、本発明は、本明細書記載の少なくとも一種の抗原又は抗原性調製物を含む凍結乾燥組成物を、本明細書で定義するところの水性アジュバント組成物によって、再構成する工程を含む、免疫原性組成物を調製する方法を提供する。

【0041】

本発明の更なる実施態様では、（ｉ）抗原又は抗原性調製物を含む凍結乾燥組成物、及び（ｉｉ）本明細書記載の水性アジュバント組成物を含むキットを提供する。

【0042】

本発明の特定の実施態様では、（ｉ）本明細書記載の抗原又は抗原性調製物を含む凍結乾燥組成物、及び（ｉｉ）本明細書記載の水性アジュバント組成物を含むキットを提供する。

【0043】

一つの実施態様では、凍結乾燥組成物は、例えば国際公開第ＷＯ２００８／１４２１３３号に記載されているように、ＴＬＲ−９アゴニストを更に含む。

【0044】

代替実施態様では、ＣｐＧが抗原と一緒に共凍結乾燥されないキットを提供する。ＣｐＧは、水性アジュバント組成物と混合してもよいか、又は、水性形態若しくは凍結乾燥形態で別々のバイアルに入れておいてもよい。而して、別の実施態様では、（ｉ）本明細書記載の抗原を含む凍結乾燥組成物；（ｉｉ）水性アジュバント組成物；及び（ｉｉｉ）ＴＬＲ９アゴニスト（例えば免疫刺激性ＣｐＧオリゴヌクレオチド）を含むキットを提供する。

【0045】

本発明のキットで使用するためのＴＬＲ−９アゴニストは、免疫刺激性オリゴヌクレオチドであり、特に、非メチル化ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドである。前記オリゴヌクレオチドは、公知であり、例えば国際公開第ＷＯ９６／０２５５５号、国際公開第ＷＯ９９／３３４８８号及び米国特許第５，８６５、４６２号に記載されている。本明細書記載の免疫原性組成物で使用するための好適なＴＬＲ−９アゴニストは、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、少なくとも３つ、好適には少なくとも６つ以上のヌクレオチドによって分離された２つ以上のジヌクレオチドＣｐＧモチーフを任意に含む。ＣｐＧモチーフは、シトシンヌクレオチドと、それに続くグアニンヌクレオチドを含む。

【0046】

一実施形態においては、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド間結合は、ホスホロジチオエート、又はおそらくホスホロチオエート結合であるが、混合ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドなどの、ホスホジエステル及び他のヌクレオチド間結合を用いることもできる。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたはホスホロジチオエートを製造する方法は、米国特許第５，６６６，１５３号、第５，２７８，３０２号およびＷＯ９５／２６２０４に記載されている。様々なヌクレオチド間結合を含むオリゴヌクレオチド、例えば、混合ホスホロチオエートホスホジエステルが企図される。オリゴヌクレオチドを安定化する他のヌクレオチド間結合を使用してもよい。

【0047】

本明細書記載の免疫原性組成物に含有させるのに適するＣｐＧオリゴヌクレオチドの例は、次の配列を有する。一つの実施態様では、これらの配列は、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド間結合を含む。

【0048】

オリゴ１（配列番号１）：ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＡＣＧ ＴＴ （ＣｐＧ １８２６）
オリゴ２（配列番号２）：ＴＣＴ ＣＣＣ ＡＧＣ ＧＴＧ ＣＧＣ ＣＡＴ （ＣｐＧ １７５８）
オリゴ３（配列番号３）：ＡＣＣ ＧＡＴ ＧＡＣ ＧＴＣ ＧＣＣ ＧＧＴ ＧＡＣ ＧＧＣ ＡＣＣ ＡＣＧ
オリゴ４（配列番号４）：ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＴＴ ＴＧＴ ＣＧＴ ＴＴＴ ＧＴＣ ＧＴＴ （ＣｐＧ ２００６）
オリゴ５（配列番号５）：ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＡＴＧ ＣＴ （ＣｐＧ １６６８）
代替的なＣｐＧオリゴヌクレオチドは、それらがその中に重要でない欠失または付加を有する上記配列を含んでいてもよい。

【0049】

本発明は、更に、本明細書記載の抗原又は抗原性調製物と、水性アジュバント組成物とを含む免疫原性組成物も提供し、そしてその場合、前記免疫原性組成物は、約１００ｍＭ未満、例えば９０ｍＭ未満、８０ｍＭ未満、７０ｍＭ未満、６０ｍＭ未満、５０ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、２０ｍＭ未満、又は１５ｍＭ未満の塩化ナトリウム濃度を有する。特定の実施態様では、免疫原性組成物中の塩化ナトリウム濃度は、１０ｍＭ未満であるか、又は約５ｍＭ以下である。更なる特定の実施態様では、免疫原性組成物は、実質的には、塩化ナトリウムを含有していない。実質的に含有していないとは、塩化ナトリウムの濃度が、０ｍＭであるか、又は殆ど０ｍＭに近いという意味である。

【0050】

更に、本発明は、本明細書記載の抗原又は抗原性調製物と、水性アジュバント組成物とを含む免疫原性組成物も提供し、そしてその場合、前記免疫原性組成物のイオン強度は、１００ｍＭ未満であり、例えば９０ｍＭ未満、８０ｍＭ未満、７０ｍＭ未満、６０ｍＭ未満、５０ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、２０ｍＭ未満、又は１５ｍＭ未満である。特定の実施態様では、免疫原性組成物におけるイオン強度は、１０ｍＭ未満であるか、又は５ｍＭ以下である。更なる特定の実施態様では、免疫原性組成物は、０ｍＭか、又は殆ど０ｍＭに近いイオン強度を有する。

【0051】

免疫原性組成物を、ＴＬＲ−９アゴニストを含む凍結乾燥させた抗原性組成物を使用して調製した場合、免疫原性組成物はＴＬＲ−９アゴニストも含むことは明らかである。而して、一つの実施態様では、抗原又は抗原性調製物、ＴＬＲ−９アゴニスト、そしてリポソーム製剤中ＴＬＲ−４アゴニスト、サポニンを含む免疫原性組成物を提供し、そしてその場合、前記免疫原性組成物は、約１００ｍＭ未満、例えば９０ｍＭ未満、８０ｍＭ未満、７０ｍＭ未満、６０ｍＭ未満、５０ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、２０ｍＭ未満、又は１５ｍＭ未満の塩濃度を有する。本実施態様の特定の実施例では、免疫原性組成物中の塩化ナトリウム濃度は、１０ｍＭ未満であるか、又は約５ｍＭ以下である。

【0052】

更なる実施態様では、抗原又は抗原性調製物、ＴＬＲ−９アゴニスト、そしてリポソーム製剤中ＴＬＲ−４アゴニスト、サポニンを含む免疫原性組成物を提供し、その場合、イオン強度は、１００ｍＭ未満であり、例えば９０ｍＭ未満、８０ｍＭ未満、７０ｍＭ未満、６０ｍＭ未満、５０ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、２０ｍＭ未満、又は１５ｍＭ未満である。特定の実施態様では、免疫原性組成物におけるイオン強度は、１０ｍＭ未満であるか、又は５ｍＭ以下である。更なる特定の実施態様では、免疫原性組成物は、０ｍＭか、又は殆ど０ｍＭに近いイオン強度を有する。

【0053】

更なる実施態様では、抗原又は抗原性調製物、ＴＬＲ−９アゴニスト、そしてリポソーム製剤中３Ｄ−ＭＰＬとＱＳ２１を含む免疫原性組成物を提供し、そしてその場合、前記免疫原性組成物は、約１００ｍＭ未満、例えば９０ｍＭ未満、８０ｍＭ未満、７０ｍＭ未満、６０ｍＭ未満、５０ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、２０ｍＭ未満、又は１５ｍＭ未満の塩濃度を有する。本実施態様の特定の実施態様では、免疫原性組成物中の塩化ナトリウム濃度は、１０ｍＭ未満であるか、又は約５ｍＭ以下である。

【0054】

更なる実施態様では、抗原又は抗原性調製物、ＴＬＲ−９アゴニスト、そしてリポソーム製剤中３Ｄ−ＭＰＬとＱＳ２１を含む免疫原性組成物を提供し、そしてその場合、イオン強度は、１００ｍＭ未満であり、例えば９０ｍＭ、８０ｍＭ未満、７０ｍＭ未満、６０ｍＭ未満、５０ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、２０ｍＭ未満、又は１５ｍＭ未満である。特定の実施態様では、免疫原性組成物におけるイオン強度は、１０ｍＭ未満であるか、又は５ｍＭ以下である。更なる特定の実施態様では、免疫原性組成物は、０ｍＭか、又は殆ど０ｍＭに近いイオン強度を有する。

【0055】

更なる実施態様では、抗原又は抗原性調製物、リポソーム製剤中３Ｄ−ＭＰＬとＱＳ２１、そしてＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む免疫原性組成物を提供し、そしてその場合、前記免疫原性組成物は、約５０ｍＭ未満、例えば約４０ｍＭ未満、約３０ｍＭ未満、約２０ｍＭ未満、又は約１５ｍＭ未満の塩濃度を有する。本実施態様の特定の実施態様では、免疫原性組成物の塩化ナトリウムの濃度は、１０ｍＭ未満であるか、又は５ｍＭ以下である。

【0056】

一つの実施態様では、本発明の免疫原性組成物で使用される抗原又は抗原性調製物は、５０ｍＭ超、６０ｍＭ超、７０ｍＭ超、８０ｍＭ超、９０ｍＭ超、又は１００ｍＭを超える塩化ナトリウム濃度を含む溶液と一緒に混合した後且つ／又は溶解させた後に、沈殿、凝固、又は凝集する任意の抗原である。

【0057】

一つの実施態様では、本発明の免疫原性組成物で使用される抗原又は抗原性調製物は、イオン強度が１００ｍＭ未満であり、例えば９０ｍＭ、８０ｍＭ未満、７０ｍＭ未満、６０ｍＭ未満、５０ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、２０ｍＭ未満、１５ｍＭ未満、又は１０ｍＭ未満である溶液と一緒に混合した後且つ／又は溶解させた後に、沈殿、凝固、又は凝集する任意の抗原である。特定の実施態様では、本発明の抗原は、５ｍＭ以下のイオン強度を有する溶液において沈殿、凝固、又は凝集する。

【0058】

当業者は、前記溶液中に抗原を混合することによって、抗原が、この定義を満たすかどうかを、確認できる。この定義を満たさない抗原は、なお溶液状態のままである。すなわち、溶解されてから２４時間後でも、沈殿は無く、依然として明澄である。溶液中に混合した後且つ／又は溶解させた後に、沈殿、凝固、又は凝集する抗原は、溶液の曇りにより、沈殿していることを外観検査によって確認できる。更に、視覚的に確認できない凝集は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣを含むが、これに限定されない、当業者に公知の方法を使用して、観察し得る。

【0059】

更なる実施態様では、抗原又は抗原性調製物は、ＨＩＶ、髄膜炎菌から誘導されるか、又は、腫瘍関連抗原である。特定の実施態様では、腫瘍関連抗原は、ＰＲＡＭＥ又はＮＹＥＳＯ−１又はその断片又は誘導体から選択する。

【0060】

ＰＲＡＭＥ（ＤＡＧＥとしても公知である）は、本発明の腫瘍関連抗原として使用し得る抗原である。前記抗原およびその調製は、米国特許第５，８３０，７５３号に記載されている。ＰＲＡＭＥは、アクセッション番号：Ｕ６５０１１．１， ＢＣ０２２００８．１， ＡＫ１２９７８３．１， ＢＣ０１４９７４．２， ＣＲ６０８３３４．１， ＡＦ０２５４４０．１， ＣＲ５９１７５５．１， ＢＣ０３９７３１．１， ＣＲ６２３０１０．１， ＣＲ６１１３２１．１， ＣＲ６１８５０１．１， ＣＲ６０４７７２．１， ＣＲ４５６５４９．１，及び ＣＲ６２０２７２．１で、Ａｎｎｏｔａｔｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｈ−ＩｎｖＤＢにおいて見出される。

【0061】

ＰＲＡＭＥ抗原を含む融合タンパク質も使用し得る。ＰＲＡＭＥ、又はその断片若しくは誘導体は、任意に異種融合パートナーとの融合タンパク質の形態で、使用し得る。特に、ＰＲＡＭＥ抗原は、Ｂ型インフルエンザ菌に由来するＤタンパク質又はその一部分又はその誘導体との融合タンパク質の形態で、好適に使用し得る。好適に使用され得るＤタンパク質の一部分は、分泌配列又はシグナル配列を含んでいない。好適には、前記融合パートナータンパク質は、融合タンパク質配列のＮ末端基に又は末端基内にアミノ酸Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｒｏを含み、そして、前記融合パートナータンパク質は、Ｄタンパク質の分泌配列又はシグナル配列を含んでいない。例えば、融合パートナータンパク質は、おおよそ又は正確には、１７〜１２７アミノ酸、１８〜１２７アミノ酸、１９〜１２７アミノ酸、又は２０〜１２７アミノ酸のＤタンパク質を含み得るか又はから成り得る。タンパク質Ｄを有する融合タンパク質を主成分とする好適なＰＲＡＭＥ抗原は、その内容が参照により本明細書に完全に組み込まれる国際公開第ＷＯ２００８／０８７１０２号に記載されている。

【0062】

ＮＹ−ＥＳＯ−１は、本発明の腫瘍関連抗原として使用し得る別の抗原である。ＮＹ−ＥＳＯ−１又はその断片若しくは誘導体は、任意に異種融合パートナーとの融合タンパク質の形態で、使用し得る。ＮＹ−ＥＳＯ−１は、その内容が参照により本明細書に完全に組み込まれる米国特許第５８０４３８１号に記載されている。タンパク質ＮＹ−ＥＳＯ−１は、長さは約１８０個のアミノ酸であり、次の３つの領域から構成されていると説明できる：（ａ）約１〜７０アミノ酸のＮ末端領域、（ｂ）約７１〜１３４アミノ酸の中央領域、及び（ｃ）約１３５〜１８０アミノ酸のＣ末端領域。ＮＹ−ＥＳＯ−１は、融合タンパク質として、例えば、更なるＣＴ抗原であるＬＡＧＥ−１又はその断片との融合タンパク質として使用し得る。参照により本明細書にその内容が完全に組み込まれる国際公開第ＷＯ２００８／０８９０７４号を参照されたい。ＮＹ−ＥＳＯ−１の断片を使用する場合、これらは、好適には、１個又は複数個のＭＨＣクラス１エピトープ又はＭＨＣクラス２エピトープを、例えばＡ３１、ＤＲ１、ＤＲ２、ＤＲ４、ＤＲ７、ＤＰ４、Ｂ３５、Ｂ５１、Ｃｗ３、Ｃｗ６、及びＡ２として公知の前記エピトープを含む（国際公開第ＷＯ２００８／０８９０７４号を参照されたい）。

【0063】

ＮａＣｌそれ自体に対しては敏感ではないが、本発明に従って使用し得る更なる抗原は、ＭＡＧＥ抗原又はその断片若しくは誘導体であり、例えばＭＡＧＥ−Ａ３のようなＭＡＧＥ−３ファミリーの断片若しくは誘導体である。ＭＡＧＥ−３抗原は、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１と組み合わせて配合するのに適していると記載されてきた。参照により本明細書にその内容が完全に組み込まれる国際公開第ＷＯ２００５／１０５１３９号を参照されたい。

【0064】

ＭＡＧＥ−Ａ３のようなＭＡＧＥ抗原は、そのままで、又は誘導体の形態で、例えば、化学的に修飾された誘導体の形態で且つ／又は異種融合パートナーとの融合タンパク質の形態で使用し得る。例えば、ＭＡＧＥ抗原は、例えばカルボキサミド基又はカルボキシメチル基によって誘導体化されてきた遊離チオールを生成するジスルフィド架橋を低減させた状態で含み得る。参照により本明細書にその内容が完全に組み込まれる国際公開第ＷＯ９９／４０１８８号を参照されたい。特に、ＭＡＧＥ抗原は、Ｂ型インフルエンザ菌に由来するＤタンパク質又はその一部分又はその誘導体との融合タンパク質の形態で、好適に使用され得る。例えば、タンパク質Ｄの約１／３又はタンパク質ＤのＮ末端１００〜１１０個のアミノ酸を、融合パートナーとして使用し得る。国際公開第ＷＯ９９／４０１８８を参照されたい。

【0065】

更なる実施態様では、抗原又は抗原性組成物は、本明細書記載の抗原のいずれかの誘導体であり得る。本明細書で使用される用語「誘導体」とは、その天然形態と比較して修飾された抗原を指す。本発明の誘導体は、天然抗原と十分に類似しており、抗原特性を保持し、天然抗原に対して引き起こされる免疫応答を可能にする能力を維持している。所与の誘導体が生じるかどうかに関わらず、そのような免疫応答は、ＥＬＩＳＡ又はフローサイトメトリーなどの好適な免疫学的アッセイにより測定できる。

【0066】

本明細書で使用される用語「断片」とは、少なくとも１個のエピトープ、例えば、ＣＴＬエピトープ、典型的には、少なくとも８アミノ酸のペプチドを含む腫瘍関連抗原の断片又は前記抗原の誘導体を指している。少なくとも８、例えば、８〜１０アミノ酸長または最大で２０、５０、６０、７０、１００、１５０若しくは２００のアミノ酸長の断片は、その断片が抗原性を示す限り、すなわち、主要なエピトープ（例えば、ＣＴＬエピトープ）が前記断片により保持され、そして前記断片が天然の腫瘍関連抗原と交差反応する免疫応答を誘導できる限り、本発明の範囲内にあると考えられる。断片の例は、長さ８〜１０、１０〜２０、２０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００アミノ酸の残基であってよい（これらの範囲内の任意の値を含む）。

【0067】

本発明は、医学で使用するために、特に疾患の治療及び／又は予防で使用するために、本明細書記載の免疫原性組成物を提供する。本発明は、更に、癌の免疫療法治療で使用するために、本明細書記載の免疫原性組成物を提供する。

【0068】

この実施態様の具体例では、本発明は、前立腺、胸部、結腸直腸、肺、膵臓、腎臓、卵巣、又は黒色腫の癌から成る群より選択される１種以上の癌の免疫療法治療で使用するために、本明細書記載の免疫原性組成物を提供する。

【0069】

本発明は、更に、本明細書記載の免疫原性組成物の有効量を個人に提供する工程を含む、癌の治療法又は予防法を必要な個人に提供する。

【0070】

この実施態様の具体例では、本発明は、前立腺、胸部、結腸直腸、肺、膵臓、腎臓、卵巣、又は黒色腫の癌から成る群より選択される癌の治療法又は予防法を提供する。

【0071】

本発明を、以下の非限定的な実施例を参照することにより更に説明する。

【実施例】

【0072】

実施例１：アジュバント組成物ＡＳＡ（ソルビトール）の調製
リポソーム製剤の形態で３−脱アシル化ＭＰＬとＱＳ２１とを含むアジュバント組成物を調製した。それは以下のようにして調製した：すなわち、
Ａ．リポソームの調製法：
有機溶媒中、脂質（例えば、合成ホスファチジルコリン）、コレステロール、及び３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬの混合物を、真空下で乾燥させた。次いで、水溶液（例えば、リン酸塩緩衝生理食塩水［１００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのリン酸塩 ｐＨ６．１］）を添加し、すべての脂質が懸濁液になるまで、容器を撹拌した。次いで、その懸濁液を、高剪断ミキサーでプレホモジナイズし、そして、ＤＬＳで測定した場合にリポソームサイズがおおよそ９０ｎｍ＋／−１０ｎｍに低下するまで、高圧ホモジナイズした。次いで、リポソームを濾過滅菌した。

【0073】

Ｂ．ＡＳＡ製剤：
工程１：濃縮リポソームの希釈
Ｎａ_２／Ｋリン酸塩バッファ１００ｍＭ ｐＨ６．１を、注射用水に加えて１０倍に希釈し、リン酸塩バッファ濃度を最終製剤において１０ｍＭにした。次いで、注射用水（ＷＦＩ）中３０％（ｗ／ｖ）ソルビトール溶液を加えて、最終製剤において４．７％の濃度にし、そしてそれを、室温で、１５〜４５分間撹拌した。

【0074】

次いで、濃縮リポソーム（それぞれ４０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、及び２ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＣ、コレステロール、及びＭＰＬで作られている）を混合物に加えて、最終製剤におけるＭＰＬの濃度を１００μｇ／ｍｌにした。

【0075】

続いて、その混合物を、室温で、１５〜４５分間、撹拌した。

【0076】

工程２：ＱＳ２１の添加
臑動ポンプを使用して、ＱＳ２１バルク貯蔵品（２００ｍｌを、室温で２４時間又は４℃で２日で解凍した）を、２００ｍｌ／分の速度で、撹拌しながら、希釈リポソームに加えて、最終製剤における濃度を１００μｇ／ｍｌにした。その混合物を、１５〜４５分間、撹拌した。

【0077】

最終的なＡＳＡ製剤は、１ｍｌ当たりＭＰＬを１００μｇ及びＱＳ２１を１００μｇ含んでいた。

【0078】

工程３：ｐＨを６．１＋／−０．３であるようにチェックした。

【0079】

工程４：濾過滅菌
濾過滅菌法は、ＰＡＬＬ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されているポリエーテルスルフォン（ＰＥＳ）フィルターによって、４００ｍｌ／分の一定速度で行った。

【0080】

工程５：＋２℃〜＋８℃での貯蔵
リポソーム製剤の形態で３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ及びＱＳ２１を含み、且つソルビトール（ＡＳＡ（ソルビトール）と呼ぶ）を含有するアジュバント組成物を得た。次いで、それを４℃で貯蔵した。

【0081】

実施例２：アジュバント組成物ＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）の調製
Ａ．リポソームの調製法：
有機溶媒中脂質（例えば、合成ホスファチジルコリン）、コレステロール、及び３−脱アシル化ＭＰＬ（３Ｄ−ＭＰＬ）の混合物を、真空下で乾燥させた。次いで、リン酸緩衝生理食塩水を加え、全ての脂質が懸濁液になるまで、容器を撹拌した。次いで、その懸濁液を、高剪断ミキサーでプレホモジナイズし、そして、ＤＬＳで測定した場合にリポソームサイズがおおよそ９０ｎｍ＋／−１０ｎｍに低下するまで、高圧ホモジナイズした。次いで、リポソームを、０．２２μｍのＰＥＳ膜で濾過滅菌した。

【0082】

Ｂ．ＡＳＡ製剤：
工程１：濃縮リポソームの希釈
Ｎａ_２／Ｋリン酸塩バッファ１００ｍＭ ｐＨ６．４５を、注射用水に加えて１０倍に希釈し、最終製剤においてリン酸塩バッファ濃度を１０ｍＭ及びＮａＣｌ濃度を１５０ｍＭにした。この混合物を、室温で５分間、攪拌した。次いで、濃縮リポソーム（それぞれ４０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、及び２ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＣ、コレステロール、及びＭＰＬで作られている）を混合物に加えて、最終製剤におけるＭＰＬの濃度を１００μｇ／ｍｌにした。続いて、その混合物を、室温で、５〜１５分間、撹拌した。

【0083】

工程２：ＱＳ２１の添加
ＱＳ２１バルク貯蔵品（２００ｍｌを、室温で２４時間又は４℃で２日で解凍した）を、磁気撹拌しながら、希釈リポソームに加えて、最終製剤における濃度を１００μｇ／ｍｌにした。その混合物は、室温で撹拌した。

【0084】

工程３：ｐＨを６．１＋／−０．１であるようにチェックした。

【0085】

工程４：濾過滅菌
濾過滅菌法は、ＰＡＬＬ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されているポリエーテルスルフォン（ＰＥＳ）フィルターによって行った。

【0086】

工程５：＋２℃〜＋８℃での貯蔵
ＡＳＡの最終組成物は、１ｍｌ当たり、２ｍｇのＤＯＰＣ、５００μｇのコレステロール、１００μｇの３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ、１００μｇのＱＳ２１であった。

【0087】

実施例３．ＱＳ２１の溶解活性
ＱＳ２１は、赤血球（ＲＢＣ）を溶解することが知られている。１５０ｍＭのＮａＣｌを含む等価なアジュバント組成物（ＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ））に関して認められるのと同じ方法で確実にＱＳ２１溶解活性をクエンチするために、実施例１で調製したＡＳＡ（ソルビトール）アジュバント組成物を試験した。

【0088】

ＱＳ２１溶解活性は、ニワトリ赤血球（ＲＢＣ）を使用する溶血作用分析で測定した。ＲＢＣを、４℃、５５０ｇで遠心分離した。上澄みは、廃棄した。ペレットを注意深くＰＢＳ緩衝液中に再懸濁させて、初期の体積にした。同じ操作を、上澄みが赤くならなくなるまで繰り返した（一般的に３回）。直ちに使用しない場合、ペレットは、４℃で最大３〜４日間貯蔵した（使用する日に再び洗浄した）。又は、同じ日に使用する場合は、緩衝液で約１０倍に希釈した。

【0089】

ＱＳ２１用量範囲曲線を、ＡＳＡバッファで（試験したＡＳＡサンプルの後には塩バッファで又はソルビトールバッファで）用事作成し、そして、アジュバントサンプル（５００μｌ又は９００μｌのＡＳＡを意味する５０μｇ又は９０μｇ当量のＱＳ２１を含む）を調製した。最終体積は、（試験されるサンプルのバッファの役割としてソルビトールを含む又は含まない）十分なバッファによって、標準とサンプルを９００μｌに調整した。その蛋白光に起因して、ＡＳＡは、光学密度（ＯＤ）に干渉する。而して、ＡＳＡ「ブランク」を調製し、そしてそれらのＯＤを、ＡＳＡ試験サンプルのＯＤから減じた。それらのブランクは、サンプルにおいて試験される体積と同じＡＳＡ体積と一致するが、バッファで１ｍｌに調整した。ＲＢＣは、これらのブランクには加えなかった。次いで、標準及びサンプルを、室温で、３０分間、ＲＢＣ（９００μｌの標準及びサンプルに１００μｌの希釈ＲＢＣを加えた）と一緒にインキュベートした。次いで、サンプルを、９００ｇで５分間、遠心分離した。５４０ｎｍにおける光学密度を、遠心分離後に測定した。

【0090】

溶解活性の測定は、限度試験によって実施した。

【0091】

１． 検出限界（ＬＯＤ）は、ＯＤを導くＱＳ２１の最低濃度と定義した：
− ベースレベル（ＯＤ＞０．１）に比べて高い
− ＯＤのバッファ（「０μｇ」ＱＳ２１）に比べて約３倍高い
− 曲線の上昇部分において
− 各試験について測定した。

【0092】

２．アジュバントサンプルに関するＯＤがＯＤＬＯＤに比べて大きい場合、ＱＳ２１溶解活性は、アジュバントサンプルにおいて陽性であるように保たれた。

【0093】

ＱＳ２１曲線の例：

【表1】

【0094】

＊５０μｇ当量のＱＳ２１を試験した。１５０ｍＭの塩化ナトリウムバッファ。

【0095】

このアッセイにおける検出限界は、０．９μｇ ＱＳ２１であり、０．１２のＯＤである。

【0096】

１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含むアジュバント組成物におけるＱＳ２１のクエンチングは、試験された５０μｇ当量のＱＳ２１に関して９８．２％を超えていると評価された。試験された９０μｇ当量の場合、判定は、９９％を超えている。

【0097】

次いで、ＱＳ２１クエンチングを、ソルビトールと、わずか５ｍＭの塩化ナトリウムとを含む等価なアジュバント組成物と比較した。データは、４℃でＡＳＡを貯蔵した後又は安定性を促進させた後に（３７℃で７日）、得た。ソルビトール中ＡＳＡに関しては、ＱＳ２１標準曲線を、ソルビトール含有バッファにおいて得た。

【表2】

【0098】

＊９０μｇ当量のＱＳ２１を試験した以外は、５０μｇ当量のＱＳ２１を試験した。

【0099】

ＱＳ２１は、低い塩化ナトリウムバッファで十分にクエンチされた。

【0100】

実施例４：ＭＰＬ同族体
化学的には、３Ｄ−ＭＰＬは、４、５又は６位がアシル化された鎖を有する３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。各異なる３Ｄ−ＭＰＬ分子は、同族体と呼ばれている。同族体の組成は、一定のままであり、同族体割合間のシフトはないことが重要である。使用されるいかなるバッファも、アジュバント組成物を作るために使用される濃縮リポソーム中における組成と同族体組成を同じにできることも重要でもある。

【0101】

図２に示してあるように、同族体組成を、３Ｄ−ＭＰＬ濃縮リポソーム（濃縮リポソームＬＩＰ０７−２１７、図２の第１カラム）、１５０ｍＭのＮａＣｌバッファ中３Ｄ−ＭＰＬリポソームとＱＳ２１とを含むアジュバント組成物（アジュバント１５０ｍＭのＮａＣｌ、又はＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）、第２カラム）、及びソルビトールと５ｍＭのＮａＣｌバッファ中３Ｄ−ＭＰＬリポソームとＱＳ２１とを含むアジュバント組成物（アジュバントソルビトール、又はＡＳＡ（ソルビトール）、カラム３〜７）において、検討した。

【0102】

調製後０日のＡＳＡ（ソルビトール）アジュバントと、時間の経過に伴う漸進的な変化が起こらないことを保証するために調製してから３７℃に維持した７日後のＡＳＡ（ソルビトール）アジュバントとの２つのロットにおいても、同族体組成を検討した（図２の最後の４つのカラムを参照されたい）。

【0103】

濃縮リポソーム又はＡＳＡ（ソルビトール）サンプルにおけるＭＰＬのテトラ−、ペンタ−、及びヘキサ−アシル化同族体の相対的な分配を、ＩＰ−ＨＰＬＣ−Ｆｌｕｏ検出（ＡＲＤ）で測定した。標準及びサンプルの両方を、ダンシルヒドラジンによって誘導体化し、二糖骨格上にＦｌｕｏ活性発色団を導く。誘導体化したサンプルを、イオン対試薬としてテトラブチルアンモニウム水酸化物（ＴＢＡＯＨ）を使用しているＣ１８逆相カラムで分析した。同数の脂肪族アシル基を含む同族体を、異なる基（テトラアシル、ペンタアシル、及びヘキサアシル）で溶出させた。同族体の分配は、各基のピーク面積を、すべてのＭＰＬ同族体の総ピーク面積と比較することによって、推論される。

【0104】

図２は、各同族体のパーセントを示している。同族体組成の有意差は、アジュバントバッファ間ではなんら見出せず、そして同族体組成は、ソルビトールバッファでは、時間が経過しても一定であった。

【0105】

実施例５：実施例６及び７で使用する組成物の調製
５．１ ＣｐＧ（ＣｐＧ ２００６を、すべての実施例で使用する）を有するＰＲＡＭＥの調製
５．１．１ 実施例６及び実施例７、実験１及び実験２において使用する、ＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）と一緒にＣｐＧを有するＰＲＡＭＥの調製
３０％（ｗ／ｖ）のスクロース溶液（注射用水中で調製した）を、注射用水に加え、５％のスクロース濃度にした。次いで、トリス−ＨＣｌバッファ１００ｍＭ ｐＨ９．５を加えて、トリスバッファ濃度を７５ｍＭにした。次いで、ホウ酸塩バッファ１００ｍＭ ｐＨ９．８を加えて、ホウ酸塩バッファ濃度を５ｍＭにした。１０％（ｗ／ｖ）のＰｏｌｏｘａｍｅｒ１８８ 溶液（注射用水中で調製した）を注射用水に加えて、０．３１３％の濃度にした。

【0106】

その混合物を、室温で５分間、磁気撹拌した（１５０回転／分）。次いで、約２０ｍｇ／ｍｌ濃度の（注射用水中）ＣｐＧ溶液を加えて、最終製剤において、１０５０μｇ／ｍｌの濃度にした。その混合物を、室温で５分間、磁気撹拌した（１５０回転／分）。次いで、ＰＲＡＭＥ抗原を加えて、タンパク質濃度を１２５０μｇ／ｍｌにした。その混合物を、室温で１５分間、磁気撹拌した（１５０回転／分）。ｐＨをチェックした（９．５１）。得られた混合物を、３ｍｌのガラスバイアルの中に０．５ｍｌだけ入れ、次いで、凍結乾燥させた。

【0107】

図３は、ＰＲＡＭＥに関して使用した凍結乾燥サイクルを例示している（所要時間＝４０時間）。

【0108】

実施例２で調製した１５０ｍＭのＮａＣｌを含む水性アジュバント組成物６２５μｌによって、得られた凍結乾燥ケーキを再構成した。その凍結乾燥ケーキは、１６ｍＭのトリス、４ｍＭのホウ酸塩、４％のスクロース、０．２４％のＰｏｌｏｘａｍｅｒ １８８、８４０μｇ／ｍｌのＣｐＧ、及び１０００μｇ／ｍｌのＰＲＡＭＥから成る最終組成物による再構成の後、適正な抗原／アジュバント比を有する、１．２５倍過剰の抗原用量を含んでいた。

【0109】

５．１．２ 実施例７の実験１での「液体製剤」（７０ｍＭのＮａＣｌ）のための、ＣｐＧを有するＰＲＡＭＥの調製
濃縮アジュバント調製物
１０倍濃縮されたｐＨ６．１のＰＢＳ ｍｏｄを、注射用水に加えて１０倍に希釈し、最終製剤において１倍濃縮バッファにした。リポソームと、４００μｇ／ｍｌに予備希釈されたＱＳ２１から作られる予備混合溶液を、別々に調製した。そのプレミックスを、室温で、１５分間、磁気混合した。プレミックスで使用した濃縮リポソームは、４０ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＣ、１０ｍｇ／ｍｌのコレステロール、及び２ｍｇ／ｍｌの３ー脱アシル化ＭＰＬで作られている。そのプレミックスを、ＰＢＳに加えて、最終製剤において、ＭＰＬ濃度を２００μｇ／ｍｌ及びＱＳ２１濃度を２００μｇ／ｍｌにした。続いて、その混合物を、室温で、１５〜３０分間、磁気撹拌した。次いで、約２３ｍｇ／ｍｌでＣｐＧを加えて、最終濃度を１６８０μｇ／ｍｌにした。続いて、その混合物を、室温で、１５〜３０分間、磁気撹拌した。６．１＋／−０．１であるようにｐＨをチェックした。ＡＳを、０．２２μｍのＰＥＳフィルターで濾過し、使用するまで４℃で貯蔵した。

【0110】

最終製剤
２５％のスクロース、２５ｍＭ ｐＨ９．８のホウ酸塩、及び１０％のＬｕｔｒｏｌを、ＷＦＩに加えて、それぞれ、最終製剤において、９．２５％、５ｍＭ、及び０．２４％とした。２倍濃縮ＡＳ＋ＣｐＧ調製物を加えて、最終製剤では１倍濃縮にした。この混合物を、室温で５分間、攪拌した。スクロース３．１５％とホウ酸塩５ｍＭ中ＰＲＡＭＥ抗原を加え、そしてその混合物を室温で５分間撹拌した。

【0111】

５．１．３ 実施例７の実験２での「液体製剤」のための、ＣｐＧを有するＰＲＡＭＥの調製
濃縮アジュバント調製物
液体製剤のためのＡＳＡを、次のようにして調製した。リン酸塩バッファ１Ｍ（ｐＨ６．１、１００倍希釈する場合）を、磁気撹拌しながら、ＷＦＩに加えて、濃縮リポソームにおける５０ｍＭのリン酸塩濃度を考慮しながら、最終濃度を４５ｍＭにした。次いで、ソルビトール３５％を、最終的には２１．１５％の濃度にした。その混合物に対して、４０ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＣ、１０ｍｇ／ｍｌのコレステロール、及び２ｍｇ／ｍｌの３−脱アシル化ＭＰＬで作られた濃縮リポソームを加えて、最終ＭＰＬ濃度を４５０μｇ／ｍｌにした。ＱＳ２１バルク（５０００μｇ／ｍｌ程度で）を加えて、ＱＳ２１の最終濃度を４５０μｇ／ｍｌにした。その混合物を室温で１５分間撹拌する。ｐＨをチェックし、ｐＨ６．１＋／−０．１に調整した。このＡＳＡの最終濃度は、それぞれ、ＭＰＬが４５０μｇ／ｍｌ、ＱＳ２１が４５０μｇ／ｍｌ、リン酸塩が４５ｍＭ、ＮａＣｌが２２．５ｍＭ、ソルビトールが２１．１５％であった。

【0112】

最終製剤
３０％（ｗ／ｖ）のスクロース溶液（注射用水中で調製した）を、注射用水に加えて、最終製剤におけるスクロース濃度を４％にした。次いで、トリス−ＨＣｌバッファ１Ｍ ｐＨ９．０を加えて、最終製剤におけるトリスバッファ濃度を１６ｍＭにした。次いで、ホウ酸塩バッファ１００ｍＭ ｐＨ９．８を加えて、最終製剤におけるホウ酸塩バッファ濃度を４ｍＭにした。次いで、１０％（ｗ／ｖ）のＰｏｌｏｘａｍｅｒ１８８ 溶液（注射用水中で調製した）を加えて、最終製剤における濃度を０．２４％にした。その混合物を、室温で５分間、磁気撹拌した（１５０回転／分）。次いで、約２０ｍｇ／ｍｌ濃度の（注射用水中）ＣｐＧ溶液を加えて、最終製剤における濃度を８４０μｇ／ｍｌにした。その混合物を、室温で５分間、磁気撹拌した（１５０回転／分）。次いで、ＰＲＡＭＥ抗原バッファ（ホウ酸塩５ｍＭ − スクロース３．１５％ ｐＨ ９．８）を加えて、ＰＲＡＭＥ抗原濃度を１０００μｇ／ｍｌに調整した。次いで、ＰＲＡＭＥ抗原を加えて、最終製剤においてタンパク質濃度を８μｇ／ｍｌにした。その混合物を、室温で１５分間、磁気撹拌した（１５０回転／分）。ソルビトール中４．５倍濃縮ＡＳを加えて、ＭＰＬ及びＱＳ２１の最終濃度を１００μｇ／ｍｌにした。ｐＨをチェックした（＋／−８．０）。

【0113】

５．１．４ 実施例７の実験１でのＡＳＡ（ソルビトール）及びＡＳＡ（スクロース）のための、ＣｐＧを有するＰＲＡＭＥの調製
３０％（ｗ／ｖ）のスクロース溶液（注射用水中で調製した）を、注射用水に加え、製剤におけるスクロース濃度を５％にし、次いで、ホウ酸塩バッファ１００ｍＭ ｐＨ９．８を加えて、この製剤におけるホウ酸塩バッファ濃度を５ｍＭにし、次いで、トリス−ＨＣｌバッファ１００ｍＭ ｐＨ９．０を加えて、２０倍に希釈して、この製剤におけるトリスバッファ濃度を５ｍＭにした。次いで、１０％（ｗ／ｖ）のＰｏｌｏｘａｍｅｒ１８８ 溶液（注射用水中で調製した）を加えて、最終製剤における濃度を０．３％にした。その混合物を、室温で５分間、磁気撹拌した（１５０回転／分）。次いで、約２０ｍｇ／ｍｌ濃度の（注射用水中）ＣｐＧ溶液を加えて、製剤における濃度を１０５０μｇ／ｍｌにした。その混合物を、室温で５分間、磁気撹拌した（１５０回転／分）。次いで、ＰＲＡＭＥ抗原を加えて、最終製剤においてタンパク質濃度を１２５０μｇ／ｍｌにした。その混合物を、室温で１５分間、磁気撹拌した（１５０回転／分）。ｐＨを９．４に調整した。得られた混合物を、３ｍｌのガラスバイアルの中に０．５ｍｌだけ入れ、次いで、凍結乾燥させた。

【0114】

ＡＳＡ（ソルビトール）を、実施例１に記載したようにして調製したが、以下の点がわずかに異なる：すなわち、ソルビトール濃度は４．６％であり、また、ＱＳ２１を、希釈した濃縮リポソームに添加する前に、４００μｇ／ｍｌに予備希釈した。

【0115】

ＡＳＡ（スクロース）を、実施例１に記載したようにして調製したが、以下の点がわずかに異なる：すなわち、ソルビトールの代わりにスクロースを使用し（３０％ｗ／ｖスクロース溶液の原液を使用し、そして最終的なスクロース濃度は８．３％である）、また、ＱＳ２１を、希釈された濃縮リポソームに添加する前に、４００μｇ／ｍｌに予備希釈した。

【0116】

その得られた凍結乾燥ケーキを、６２５μｌの水性アジュバント組成物で再構成した。最終組成物は、４ｍＭのトリス、４ｍＭのホウ酸塩、４％のスクロース、０．２４％のＰｏｌｏｘａｍｅｒ １８８、８４０μｇ／ｍｌのＣｐＧ、及び１０００μｇ／ｍｌのＰＲＡＭＥを含んでいた。

【0117】

５．１．５ 実施例７の実験２でのＡＳＡ（ソルビトール）のための、ＣｐＧを有するＰＲＡＭＥの調製
３０％（ｗ／ｖ）のスクロース溶液（注射用水中で調製した）を、注射用水に加え、製剤においてスクロース濃度を５％にした。次いで、トリス−ＨＣｌバッファ１Ｍ ｐＨ９．０を加えて、５０倍に希釈して、この製剤におけるトリスバッファ濃度を２０ｍＭにし、次いで、ホウ酸塩バッファ１００ｍＭ ｐＨ９．８を加えて、２０倍に希釈して、この製剤におけるホウ酸塩バッファ濃度を５ｍＭにした。次いで、１０％（ｗ／ｖ）のＰｏｌｏｘａｍｅｒ１８８ 溶液（注射用水中で調製した）を加えて、最終製剤における濃度を０．３％にした。その混合物を、室温で５分間、磁気撹拌した（１５０回転／分）。次いで、約２０ｍｇ／ｍｌ濃度の（注射用水中）ＣｐＧ溶液を加えて、製剤における濃度を１０５０μｇ／ｍｌにした。その混合物を、室温で５分間、磁気撹拌した（１５０回転／分）。次いで、ＰＲＡＭＥ抗原を加えて、最終製剤においてタンパク質濃度を１２５０μｇ／ｍｌにした。その混合物を、室温で１５分間、磁気撹拌した（１５０回転／分）。ｐＨを９．１に調整した。得られた混合物を、３ｍｌのガラスバイアルの中に０．５ｍｌだけ入れ、次いで、凍結乾燥させた。

【0118】

ＡＳＡソルビトールを、実施例１記載のように調製した。その得られた凍結乾燥ケーキを、６２５μｌの水性アジュバント組成物で再構成した。最終組成物は、１６ｍＭのトリス、４ｍＭのホウ酸塩、４％のスクロース、０．２４％のＰｏｌｏｘａｍｅｒ １８８、８４０μｇ／ｍｌのＣｐＧ、及び１０００μｇ／ｍｌのＰＲＡＭＥを含んでいた。

【0119】

５．２ ＣｐＧを有するＮＹ−ＥＳＯ１の調製
５．２．１ 実施例６における、ＣｐＧを有するＮＹ−ＥＳ０１の調製
Ｎａ／Ｋ_２リン酸塩バッファ２００ｍＭ ｐＨ ６．３を、磁気撹拌しながら、注射用水に加えて２０倍に希釈し、最終製剤において１２．５ｍＭにした。次いで、その混合物に対して、以下の賦形剤を、以下の順序で加えた：すなわち、最終的に０．３１２５％に達するまで１０％ｗ／ｖのモノチオグリセロールを、０．０６２５％に達するまで５％ｗ／ｖのＰｏｌｏｘａｍｅｒ１８８を、最終的に５％に達するまで２５％のスクロースを、そして６．２５ｍＭに達するまで２８７ｍＭのＬ−アルギニンベース（Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ ｂａｓｅ）を加えた。次いで、その混合物に対して約２０ｍｇ／ｍｌのＣｐＧバルクを加えて、最終製剤において１０５０μｇ／ｍｌの濃度にした。その混合物を、室温で、磁気撹拌（約１５０回転／分）しながら、１０分間保持した。ｐＨは、７．１＋／−０．３であるようにチェックした。磁気撹拌を増加させ渦巻かせた。次いで、ＮＹ−ＥＳＯ１を加えて、最終濃度を７５０μｇ／ｍｌにした。次いで、磁気撹拌を約１５０回転／分まで低下させ、混合物を室温で５分間撹拌した。アリコートを採取して、最終的なｐＨ（それは、７．０２でなければならない）をチェックした。次いで、最終バルクを凍結乾燥させた。

【0120】

得られた凍結乾燥ケーキを、６２５μｌのＡＳＡバッファ（１５０ｍＭのＮａＣｌ及びソルビトール）で、再構成した。

【0121】

実施例６．バッファとしてソルビトールを含むアジュバント組成物における「塩析」の防止
図４は、塩濃度を５ｍＭに低減し且つアジュバント組成物中にソルビトールを含有させると、（それぞれ実施例５．１．１及び５．２．１で調製された）免疫原性組成物におけるＰＲＡＭＥ及びＮＹ−ＥＳＯ−１の両方の「塩析」が防止されることを示している。図４において：
１．ＡＳＡ １５０ｍＭ ＮａＣｌバッファにおいて再構成されたＰＲＡＭＥ抗原。

【0122】

２．ＡＳＡソルビトールバッファにおいて再構成されたＰＲＡＭＥ抗原。

【0123】

３．ＡＳＡ １５０ｍＭ ＮａＣｌバッファにおいて再構成されたＮＹＥＳＯ−１抗原。
４．ＡＳＡソルビトールバッファにおいて再構成されたＮＹＥＳＯ−１抗原。

【0124】

図４は、ＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）及びＡＳＡ（ソルビトール）中で再構成されたＰＲＡＭＥとＮＹＥＳＯ−１の画像による比較である。以上のように、ＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）において再構成されたＰＲＡＭＥは、ＡＳＡ（ソルビトール）において再構成されたＰＲＡＭＥと比較して、濁っているように見える。同様に、ＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）において再構成されたＮＹ−ＥＳＯは、ＡＳＡ（ソルビトール）において再構成されたＮＹ−ＥＳＯ抗原と比較して、濁っているように見える。

【0125】

実施例７.ｉｎ ｖｉｖｏマウスモデル
実験１：
６〜８週齢の２０匹の雌のＣＢ６Ｆ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＢａｌｂ／Ｃマウスとの雑種）から成る７つの群を、ヒト用量の１／１０に相当するＡＳＡ＋ＣｐＧの一定用量（５μｇのＭＰＬ、５μｇのＱＳ２１、及び４２μｇのＣｐＧ７９０９を含む５０μＬ）中に配合したＰＲＡＭＥタンパク質の筋注（二週間ごとに、左右の腓腹筋中に交互に注射）で２回免疫した。下記のように、最後の免疫化から１４日後に、マウスの４つの群（各群ｎ＝８）に対して、１０^＋５個のＣＴ２６−ＰＲＡＭＥ腫瘍細胞を皮下に接種した。マウスの７つの群は：
− 第１群：バッファ
− 第２群：ＰＲＡＭＥタンパク質が沈殿する「典型的な」ＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）中に再懸濁させた共凍結乾燥されたＰＲＡＭＥ ＋ ＣｐＧ
− 第３群：ＡＳＡ（スクロース）中に再懸濁させた共凍結乾燥されたＰＲＡＭＥ＋ＣｐＧ
− 第４群：ＡＳＡ（スクロース − ２５℃で４８時間インキュベーション）中に再懸濁させた共凍結乾燥されたＰＲＡＭＥ＋ＣｐＧ
− 第５群：ＡＳＡ（ソルビトール）中に再懸濁させた共凍結乾燥されたＰＲＡＭＥ＋ＣｐＧ
− 第６群：ＰＲＡＭＥ＋ＡＳＡ − ７０ｍＭのＮａＣｌ＋ＣｐＧを含む「液体」製剤
− 第７群：ＰＲＡＭＥ＋ＡＳＡ − ７０ｍＭのＮａＣｌ＋ＣｐＧ（＋ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）を含む「液体」製剤、であった。

【0126】

最後の免疫化から７日後に、サイトカインを分泌するＴ細胞の能力による細胞性応答を分析した（３匹のマウスから成るｎ＝４群）。

【0127】

すべてのマウスは、ＡＳＡ＋ＣｐＧアジュバント系（５μｇのＭＰＬ、５μｇのＱＳ２１、及び４２μｇのＣｐＧ）のヒト用量の１／１０中０．４μｇのＰＲＡＭＥを受容した。

【0128】

結果：
腫瘍成長
１群当たりの、表面（ｍｍ^２）（＋ＳＤ）によって測定された時間経過に対する平均腫瘍成長が、図６に示してある。ＰＲＡＭＥを配合したＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）＋ＣｐＧ、及びＡＳＡ液体製剤中ＰＲＡＭＥは、ＰＲＡＭＥ ＡＳＡ（ソルビトール）＋ＣｐＧに比べて、腫瘍防御がより低い（腫瘍成長がより大きい）。

【0129】

細胞性応答（２回目の免疫化の７日後 − １群処理当たり３匹のマウスから成るｎ＝４群）：
ＰＲＡＭＥ ＡＳＡ−ＣｐＧ腫瘍抗原によるマウスの免疫化の後にＩＦＮγ及びＴＮＦαのようなサイトカインを産生できるＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の頻度を使用して、機能的な細胞性応答を誘導する異なる製剤の能力を示す。第二免疫化の７日後に、サイトカイン（ＩＦＮγ及びＴＮＦα）を産生するＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞のパーセンテージを、免疫マウスの脾臓細胞を細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）することによって測定した。

【0130】

図５には、ＩＦＮγ及びＴＮＦαを産生するＣＤ４の％（平均＋／−標準偏差）が示してある。

【0131】

この実験では、測定可能なＣＤ８反応は、認められなかった。

【0132】

ＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）＋ＣｐＧに配合されたＰＲＡＭＥタンパク質は、沈殿することが示され、また、ＡＳＡ（ソルビトール）＋ＣｐＧ中に配合されたＰＲＡＭＥと比較して、より低い特異的なＴ細胞応答を誘導する。同様に良好なＰＲＡＭＥ特異的ＣＤ４応答は、ＰＲＡＭＥタンパク質を、ＡＳＡ（ソルビトール）＋ＣｐＧ中に、また、及びＡＳＡ「液体」製剤（７０ｍＭのＮａＣｌ）＋ＣｐＧ中に配合する時に得られた（統計的に差はない）。体液性免疫応答も試験したが、２つの注射後のデータは解釈できなかった。

【0133】

実験２
６〜８週齢の２４匹の雌のＣＢ６Ｆ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＢａｌｂ／Ｃマウスとの雑種）から成る４つの群を、ヒト用量の１／１０に相当するＡＳＡ＋ＣｐＧの一定用量（５μｇのＭＰＬ、５μｇのＱＳ２１、及び４２μｇのＣｐＧ７９０９を含む５０μＬ）中に配合したＰＲＡＭＥタンパク質の筋注（二週間ごとに、左右の腓腹筋中に交互に注射）で４回免疫した。

【0134】

下記のように、最後の免疫化から１４日後に、マウスの４つの群（各群ｎ＝１２）に対して、１０^＋５個のＣＴ２６−ＰＲＡＭＥ腫瘍細胞を皮下に接種した。マウスの４つの群は：
− 第１群：バッファ
− 第２群：ＰＲＡＭＥタンパク質が沈殿する「典型的な」ＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）中に再懸濁させた共凍結乾燥させたＰＲＡＭＥ ＋ ＣｐＧ
− 第３群：ＡＳＡ（ソルビトール）中に再懸濁させた共凍結乾燥させたＰＲＡＭＥ＋ＣｐＧ
− 第４群：ＰＲＡＭＥ＋ＡＳＡ − 「液体」製剤＋ＣｐＧ（＋ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）であった。

【0135】

最後の免疫化の１４日後に、免疫応答を、以下の通りに異なる読み出しを使用して分析した：
− 体液性応答（ｎ＝１２）
− サイトカインを分泌するＴ細胞の能力による細胞性応答（３匹のマウスから成るｎ＝４群）
− 腫瘍接種に対する防御効果（ｎ＝１２）
すべてのマウスは、ＡＳＡ＋ＣｐＧアジュバント系（５μｇのＭＰＬ、５μｇのＱＳ２１、及び４２μｇのＣｐＧ）のヒト用量の１／１０中０．４μｇのＰＲＡＭＥを受容した。

【0136】

結果：
腫瘍成長
１群当たりの、表面（ｍｍ^２）（＋ＳＤ）によって測定された時間経過に対する平均腫瘍成長が、図９に示してある。ＰＲＡＭＥ配合ＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）＋ＣｐＧは、ＰＲＡＭＥ ＡＳＡ（ソルビトール）＋ＣｐＧに比べて、より低い腫瘍防御（より大きい腫瘍成長）を誘導する。同様な防御は、ＰＲＡＭＥ ＡＳＡ（ソルビトール）＋ＣｐＧと、ＡＳＡ液体製剤＋ＣｐＧ中ＰＲＡＭＥとに関しても観察された。

【0137】

サンプル分析：体液性応答：
後述するように、マウス血清（ｎ＝１２）を、４回の免疫化の最後から１４日後に、ＰＲＡＭＥ特異的抗体の存在に関して、ＥＬＩＳＡによって試験した。抗体応答（総Ｉｇ）を、被覆抗原として精製組換えＰＲＡＭＥタンパク質を使用するＥＬＩＳＡによって、評価した。免疫動物からの血清を、ＰＲＡＭＥ特異的抗体の存在に関して分析した。４回の免疫化後に得られた標準力価の幾何平均（ｎ＝１２匹のマウス）＋／−９５％信頼区間が、図７に示してある。典型的なＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）を含むＰＲＡＭＥ／ＡＳＡ＋ＣｐＧは、非常に小さい抗体応答を誘導し、一方、ＡＳＡ（ソルビトール）を含むＰＲＡＭＥ／ＡＳＡ＋ＣｐＧは、非常に高い抗体価を誘導する。この応答は、液体製剤ＡＳＡによって誘導される応答と同様である。

【0138】

細胞性応答（４回目の免疫化から１４日後 − １群処理当たり３匹のマウスから成るｎ＝４群）：
ＰＲＡＭＥ ＡＳＡ−ＣｐＧ腫瘍抗原によるマウスの免疫化の後にＩＦＮγ及びＴＮＦαのようなサイトカインを産生できるＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の頻度を使用して、機能的な細胞性応答を誘導する異なる製剤の能力を示す。４回目の免疫化の１４日後に、サイトカイン（ＩＦＮγ及びＴＮＦα）を産生するＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞のパーセンテージを、免疫マウスの脾臓細胞を細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）することによって測定した。

【0139】

図８には、ＩＦＮγ及びＴＮＦαを産生するＣＤ４の％（平均＋／−標準偏差）が示してある。ｐ値は、０．０５より大幅に低く、第２群と、第３群、及び第４群との間の有意差を証明している。

【0140】

この実験では、測定可能なＣＤ８反応は、見出されなかった。

【0141】

ＡＳＡ（１５０ｍＭのＮａＣｌ）＋ＣｐＧに配合されたＰＲＡＭＥタンパク質は、沈殿することが示され、また、ＡＳＡ（ソルビトール）＋ＣｐＧに配合されたＰＲＡＭＥと比較して、統計的により低い特異的なＴ細胞応答を誘導する。対照的に、同様に良好なＰＲＡＭＥ特異的ＣＤ４応答は、ＰＲＡＭＥタンパク質を、ＡＳＡ（ソルビトール）＋ＣｐＧ中に、及びＡＳＡ「液体」製剤＋ＣｐＧ中に配合する時に得られた（統計的に差はない）。

【0142】

方法
ＣＴ２６−ＰＲＡＭＥ腫瘍モデル及び腫瘍成長
ＣＴ２６−ＰＲＡＭＥ細胞系は、ＰＲＡＭＥのｃＤＮＡをコードする哺乳類細胞発現プラスミドｐＣＤＮＡ３（カリフォルニア州カールズバッドにあるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をＣＴ２６結腸癌細胞系に形質移入することによって、発生させた。Ｇ４１８（２００μｇ／ｍｌ）による選択と、限界希釈クローニングとにより、定量的リアルタイムＰＣＲによって測定されるＰＲＡＭＥ（ＣＴ２６−ＰＲＡＭＥ）を発現するクローンを得た。（１０^−３ ＰＲＡＭＥ ｍＲＮＡコピー／ヒト腫瘍によるＰＲＡＭＥ発現レベルの範囲内にあるマウスβアクチンのコピー）。

【0143】

ＣＴ２６ ＰＲＡＭＥ細胞は、１０％ウシ胎児血清、１％Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン−ステプトマイシン、１％非必須アミノ酸、１％ピルビン酸ナトリウム、及び０．１％β−メルカプトエタノールを有するＲＰＭＩ培地において、５％ＣＯ_２の存在下、３７℃で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した。細胞を、トリプシン処理し、無血清培地で２度洗浄し、そして、２００μｌのＲＰＭＩ培養液の中に入れて注射剤とし、上記したようにＰＲＡＭＥで最後に免疫した１４日後に、４つの群のＣＢ６Ｆ１マウスの右側腹部の皮下に注入した。個々の腫瘍成長は、週に２回測定した。各腫瘍の２つの主直径の積を時間の経過とともに記録し、そのデータを、動物の各群における平均腫瘍表面（ｍｍ^２）として示す。

【0144】

サンプル分析：体液性応答
血清を添加する前に、イムノプレートを、４℃で一晩、ＰＲＡＭＥ抗原で被覆した。３７℃で９０分間、血清と反応させた後、マウス免疫グロブリンに対するビオチン化ウサギ完全抗体を、３７℃で９０分間、加えた。抗原抗体複合体を、３７℃で３０分間、ストレプトアビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体と一緒にインキュベートすることによって、可視化した。次いで、この複合体を、室温で１０分間、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加することによって、可視化し、そして、その反応を０．２ＭのＨ_２ＳＯ_４で停止させた。光学密度は、４５０ｎｍで記録した。

【0145】

サンプル分析法：細胞性応答（ＩＦＮｇ／ＴＮＦａ産生）
ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞によるＩＦＮｇ及びＴＮＦａ産生は、ＰＲＡＭＥタンパク質配列全体をカバーするオーバーラップしている１５ｍｅｒペプチドのプールで２時間刺激した後、免疫マウス（４つの群、１群当たり３匹のマウスから成る）の脾臓細胞に関して細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を使用してフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから入手されるＬＳＲ２）で測定した。

【0146】

Ｔ細胞の刺激：
− ＰＲＡＭＥ配列全体をカバーする、１１アミノ酸だけオーバーラップしている１２３種の１５ｍｅｒペプチドのプールによって、免疫動物の脾臓細胞を再刺激した。９６穴プレート（Ｕ）において、ペプチド（１μｇ／ｍｌ／ペプチド）を、２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４９ｄと２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８とを含む最終体積２００μｌのＲＰＭＩ ５％ＦＣＳ中で、３７℃で２時間、１０^＋６個のＴ細胞（脾臓細胞）と混合する。

【0147】

− インキュベーションの後、５０μｌのブレフェルジン（１／１０００）を、ＲＰＭＩ ５％ＦＣＳ中に加えた。

【0148】

細胞内染色：
・ＣＤ４／ＣＤ８染色：
− 細胞を９６穴プレート（円錐形ウェル）に移した。

【0149】

− ４℃で５分間、１０００回転／分で遠心分離
− ２５０μｌのＦＡＣＳバッファ（ＰＢＳ１％ＦＣＳ）で洗浄
− 細胞のペレットを、４℃で１０分間、５０μｌのＦＡＣＳバッファ中２．４Ｇ２ １／５０を使用してインキュベートした。

【0150】

− ５０μｌのＦＡＣＳバッファ中Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ ＣＤ４−ＰＥ（希釈Ｍａｂ：１／２００）とＣＤ８ＰｅｒＣＰ（希釈 Ｍａｂ：１／２００）を、４℃で３０分間にわたって添加した。

【0151】

− ＦＡＣＳバッファ中で洗浄（１２００回転／分、１０分間）
・細胞の透過処理：
− ４℃で２０分間にわたって、２００μｌのｃｙｔｏＦｉｘ−ｃｙｔｏＰｅｒｍ溶液を使用して、ペレットをインキュベートした。

【0152】

− ｐｅｒｍＷＡＳＨ１ｘで洗浄し（１２００回転／分、１０分間）そのｐｅｒｍＷＡＳＨ溶液を１０倍に濃縮し、滅菌水で希釈する。

【0153】

・ＩＦＮγ及びＴＮＦα細胞内染色：
− ５０μｌのｐｅｒｍＷＡＳＨ１ｘ溶液中Ｍｉｘ ＩＦＮγ ＡＰＣ（希釈Ｍａｂ：１／５０）及びＴＮＦα ＦＩＴＣ（希釈Ｍａｂ：１／５０）を使用して、４℃で２時間、ペレットをインキュベートした。

【0154】

− ｐｅｒｍＷＡＳＨ１Ｘ （１２００回転／分、１０分間）で洗浄した。

【0155】

− ペレットを、ＦＡＣＳバッファ中に再懸濁させた。

【0156】

− ＦＡＣＳ分析
Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ （Ｇｏｌｏｇｉ Ｐｌｕｇ）： ＢＤ カタログ番号５５５０２９
Ｃｙｔｏｆｉｘ／ｃｙｔｏｐｅｒｍ： Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ （ＢＤ） カタログ番号 ５５４７２２
Ｐｅｒｍ／ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ： Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（ＢＤ） カタログ番号 ５５４７２３
Ｒａｔ ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＣＤ４９ｄ 精製ＮＡ ＬＥ： ＢＤ カタログ番号 ５５３１５４
Ｒａｔ ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＣＤ２８ 精製ＮＡ ＬＥ： ＢＤ カタログ番号 ５５３２９５
Ｒａｔ ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＣＤ８ａ ｐｅｒＣｐ： ＢＤ カタログ番号５５３０３６
Ｒａｔ ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＣＤ４ ＰＥ： ＢＤ カタログ番号５５６６１６
Ｒａｔ ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮγ ＡＰＣ： ＢＤ カタログ番号５５４４１３
Ｒａｔ ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＴＮＦα ＦＩＴＣ： ＢＤ カタログ番号５５４４１８
Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＣＤ１６／ＣＤ３２ （２．４Ｇ２） Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ カタログ番号５５３１４２（０．５ｍｇ／ｍｌ）

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]