特許 5647687 ヒト化抗ＣＤＣＰ１抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5647687

(24)【登録日】2014年11月14日

(45)【発行日】2015年1月7日

(54)【発明の名称】ヒト化抗ＣＤＣＰ１抗体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20141211BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20141211BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20141211BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20141211BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20141211BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20141211BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20141211BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20141211BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20141211BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20141211BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 A

   C07K16/28ZNA

   C07K16/46

   C12P21/08

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/00 101

   A61K39/395 N

   A61P35/00

【請求項の数】14

【全頁数】28

(21)【出願番号】特願2012-525932(P2012-525932)

(86)(22)【出願日】2010年8月26日

(65)【公表番号】特表2013-502904(P2013-502904A)

(43)【公表日】2013年1月31日

(86)【国際出願番号】EP2010005244

(87)【国際公開番号】WO2011023389

(87)【国際公開日】20110303

【審査請求日】2012年5月7日

(31)【優先権主張番号】09011046.1

(32)【優先日】2009年8月28日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】10000972.9

(32)【優先日】2010年2月1日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】512036384

【氏名又は名称】ロシュ グリクアート アーゲー

(74)【代理人】

【識別番号】100109726

【弁理士】

【氏名又は名称】園田 吉隆

(74)【代理人】

【識別番号】100101199

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 義教

(72)【発明者】

【氏名】アウアー， ヨハネス

(72)【発明者】

【氏名】ボッセンマイヤー， ビルギット

(72)【発明者】

【氏名】ジョルジュ， ギー

(72)【発明者】

【氏名】リフケ， アレクサンダー

(72)【発明者】

【氏名】メスナー， エッケハルト

(72)【発明者】

【氏名】ニーダーフェルナー， ゲルハルト

【審査官】 菅原 洋平

(56)【参考文献】

【文献】 欧州特許出願公開第０１３９６５０１（ＥＰ，Ａ１）

【文献】 特開２００７−１１２７３４（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

ＩＰＣ Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／０９

Ａ６１Ｋ ３９／００−３９／４４，

４９／００−５１／００

Ａ６１Ｐ １／００−４３／００

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＤＢ名 ＵｎｉＰｒｏｔ／ＰＤＢ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号：３の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、又は配列番号：２４の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むことを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体。

【請求項2】

重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号：３であり、
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号：１４である
ことを特徴とする請求項１に記載の抗体。

【請求項3】

重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号：３であり、
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号：１５である
ことを特徴とする請求項１に記載の抗体。

【請求項4】

重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号：３であり、
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号：２３である
ことを特徴とする請求項１に記載の抗体。

【請求項5】

上記抗体がヒトＩｇＧ１サブクラスのものであることを特徴とする請求項１から４の何れか一項に記載の抗体。

【請求項6】

上記抗体が、糖鎖内のフコースの量が６５％以下であるように、Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７において糖鎖でグリコシル化されることを特徴とする請求項１から５の何れか一項に記載の抗体。

【請求項7】

請求項１から６の何れか一項に記載の抗体を含有する薬学的組成物。

【請求項8】

癌の治療のための、請求項１から６の何れか一項に記載の抗体。

【請求項9】

癌の治療のための医薬の調製のための、請求項１から６の何れか一項に記載の抗体の使用。

【請求項10】

請求項１から６の何れか一項に記載の抗体をコードする核酸。

【請求項11】

原核生物又は真核生物宿主細胞中に上記核酸を発現可能な、請求項１０に記載の核酸を含む発現ベクター。

【請求項12】

請求項１１に記載のベクターを含む原核生物又は真核生物細胞。

【請求項13】

原核生物又は真核生物宿主細胞中に請求項１０に記載の核酸を発現させ、上記細胞又は細胞培養上清から上記抗体を回収することを特徴とする、請求項１から６の何れか一項に記載の抗体の製造方法。

【請求項14】

請求項１３に記載の方法によって得られる抗体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒトＣＤＣＰ１に対するヒト化抗体（抗ＣＤＣＰ１抗体）、その製造方法、上記抗体を含む薬学的組成物、及びその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒトＣＤＣＰ１（（ＣＵＢドメイン含有タンパク質１、Ｂ３４５、ＣＤ３１８、ＳＩＭＡ１３５、ＴＲＡＳＫ；配列番号：２９及び変異Ｒ５２５Ｑ（つまり、配列番号：２９のアミノ酸位置５２５におけるアルギニン（Ｒ）のグルタミン（Ｑ）との置換）及び／又は変異Ｇ７０９Ｄ（つまり、配列番号：２９のアミノ酸位置７０９におけるグリセリン（Ｇ）のアスパラギン酸（Ｄ）との置換)を含む変異体)は３つの細胞外ＣＵＢドメインを含む膜貫通タンパク質である。このタンパク質は乳癌、結腸癌及び肺癌において過剰発現することが見出されている。その発現レベルは癌細胞の転移能と相関している（Uekita, T.等, Am. J. Pathol. 172 (2008) 1729-1739）。それは癌細胞株においてチロシンリン酸化されることが示されている。（国際公開第２００２／００４５０８号；Scherl-Mostageer, M.等, Oncogene 20 (2001) 4402-8；Hooper, J., D.等, Oncogene 22 (2003) 1783-94；Perry, S., E.等 FEBS Lett. 581 (2007) 1137-42；Brown, T., A.等 J. Biol. Chem. 279 (2004) 14772-14783；Ota, T.等, Nat. Genet. 36 (2004) 40-45）。区別されるアイソフォームをコードする選択的スプライシング転写変異体が報告されている。

【0003】

国際公開第２００２／００４５０８号は腫瘍関連抗原Ｂ３４５としてＣＤＣＰ１に言及している。国際公開第２００４／０７４４８１号は転移性腫瘍細胞に発現された糖タンパク質抗原ＳＩＭＡ１３５としてのＣＤＣＰ１に関している。国際公開第２００５／０４２１０２号は卵巣癌に関与するタンパク質としてのＣＤＣＰ１に関している。国際公開第２００７／００５５０２号はＣＤＣＰ１を標的とする疾患の治療方法及び組成物に関している。

【0004】

米国特許出願公開第２００４／００５３３４３号（及びConze, T.等, Ann. N. Y. Acad. Sci. 996 (2003) 222-6及びBuehring, H.J.等, Stem Cells 22 (2004) 334-43）はある種の幹細胞集団を同定するためのＣＤＣＰ１抗体に関する。

【発明の概要】

【0005】

本発明の一態様は、ＣＵＢ４抗体（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）の配列番号：１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と配列番号：２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体において、ａ）ヒト化されており、ｂ）上記ＶＨ配列において、５７位にスレオニン（Ｔ）の代わりにリジン（Ｋ）を、６０位にプロリン（Ｐ）の代わりにバリン（Ｖ）を含むことを特徴とする抗体である（全ての位置はＫａｂａｔにより番号付けがなされている）。

【0006】

本発明の他の態様は、ＣＵＢ４抗体（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）の配列番号：１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と配列番号：２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体において、ａ）ヒト化されており、ｂ）上記ＶＬ配列において、３３位にバリン（Ｖ）の代わりにロイシン（Ｌ）を、４７位にトリプトファン（Ｗ）を含むことを特徴とする抗体である（全ての位置はＫａｂａｔにより番号付けがなされている）。

【0007】

本発明の他の態様は、ＣＵＢ４抗体（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）の配列番号：１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と配列番号：２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体において、ａ）ヒト化されており、ｂ）上記ＶＨ配列において、５７位にスレオニン（Ｔ）の代わりにリジン（Ｋ）を、６０位にプロリン（Ｐ）の代わりにバリン（Ｖ）を含み；
上記ＶＬ配列において、３３位にバリン（Ｖ）の代わりにロイシン（Ｌ）を、４７位にトリプトファン（Ｗ）を含む抗体である（全ての位置はＫａｂａｔにより番号付けがなされている）。

【0008】

好ましくは、本発明に係るヒト化抗体は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号：３であることを特徴とする。

【0009】

好ましくは、本発明に係るヒト化抗体は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、又は配列番号：１８であることを特徴とする。

【0010】

好ましくは、本発明に係るヒト化抗体は、
重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号：３であり、
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２３、又は配列番号：２４であることを特徴とする。

【0011】

好ましくは、本発明に係るヒト化抗体は、
重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号：３であり、
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、又は配列番号：１８であることを特徴とする。

【0012】

好ましくは、本発明に係るヒト化抗体は、上記抗体がヒトＩｇＧ１サブクラスであることを特徴とする。

【0013】

好ましくは、本発明に係るヒト化抗体は、上記抗体がＡｓｎ２９７において糖鎖でグリコシル化され、上記糖鎖内のフコースの量が６５％以下であることを特徴とする。

【0014】

本発明の更なる実施態様は、本発明に係るヒト化抗体を含有する薬学的組成物である。
本発明の更なる実施態様は、癌の治療のための本発明に係るヒト化抗体を含有する上記薬学的組成物である。

【0015】

本発明は癌の治療のための本発明に係るヒト化抗体を更に含む。
本発明は癌の治療のための医薬の調製のための本発明に係るヒト化抗体の使用を更に含む。
本発明は本発明に係るヒト化抗体をコードする核酸を提供する。本発明は、原核生物又は真核生物宿主細胞中に上記核酸を発現可能な本発明に係る核酸を含む発現ベクター、及び本発明に係る抗体の組換え生産のためにかかるベクターを含む宿主細胞を更に提供する。

【0016】

本発明は本発明に係るベクターを含む原核生物又は真核生物宿主細胞を更に含む。

【0017】

本発明は、原核生物又は真核生物宿主細胞中に本発明に係る核酸を発現させ、上記細胞又は細胞培養上清から上記抗体を回収することを特徴とする、本発明に係る組換えヒト化抗体の製造方法を更に含む。本発明はかかる組換え方法によって得られる抗体を更に含む。

【0018】

本発明は、癌に罹患している患者を治療する方法であって、本発明に係る抗体の有効量をかかる疾患を有しており（従ってかかる治療法を必要としている）と診断された患者に投与することを含む方法を提供する。該抗体は好ましくは薬学的組成物で投与される。

【0019】

驚いたことに、本発明に係るＣＤＣＰ１抗体ＣＵＢ４の特定のヒト化型が従来技術において知られているヒト化由来の他のヒト化型と比較して改善されたＣＤＣＰ１結合特性を示すことが今見出された。これは、ＣＤＲＨ２、及び／又はＣＤＲＬ１及び軽鎖のフレームワークにおける特定のアミノ酸変化による。驚いたことに、本発明に係るＣＤＣＰ１抗体ＣＵＢ４の特定のヒト化型は、キメラ及びマウスＣＵＢ４抗体と比較して改善されたインビボ腫瘍増殖阻害を示す。

【発明を実施するための形態】

【0020】

（発明の詳細な説明）
ＣＵＢ４抗体は、配列番号：１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と配列番号：２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を有するＤＥ１０２４２１４６（ＥＰ１３９６５０１、ＵＳ７５４１０３０）からの寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１（ＤＳＭＺ）で寄託された抗体を意味する。上記ＣＵＢ４抗体はヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する。（番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１（ＤＳＭＺ）の寄託はEberhard-Karls-University Tuebingen, Univcrsitaetsklinikum Tuebingen, Geissweg 3 72076 Tuebingenによってなされた。）

【0021】

ここで使用される「ヒト化されている」なる用語は、配列番号：１のＶＨ及び配列番号：２のＶＬを有するマウスＣＵＢ４抗体に基づいて、ヒト定常領域でのキメラ化後に）上記ＶＨ及びＶＬが、ヒト抗体のフレームワーク領域中にマウスＣＤＲをグラフトさせることによってヒト化されている抗体を意味する（例えばRiechmann, L.等, Nature 332 (1988) 323-327；及びNeuberger, M., S.等, Nature 314 (1985) 268-270；Queen, C.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033；米国特許第５５３０１０１号；米国特許第５５８５０８９号；米国特許第５６９３７６１号；国際公開第９０／０７８６１号；及び米国特許第５２２５５３９号を参照）。重鎖及び軽鎖可変フレームワーク領域は同じ又は異なったヒト抗体配列由来でありうる。ヒト抗体配列天然に生じるヒト抗体の配列でありうる。ヒト重鎖及び軽鎖可変フレームワーク領域は例えばLefranc, M.P., Current Protocols in Immunology (2000) - Appendix 1P A.1P.1-A.1P.37に列挙され、IMGT，international ImMunoGeneTics information system(登録商標)(http://imgt.cines.fr)又はhttp://vbase.mrc-cpe.cam.ac.ukを介してアクセス可能である。

【0022】

本発明に係るヒト化抗体は、加えて、
ａ）ＶＨのＣＤＲＨ２中の特定の変異（変異Ｔ５７Ｋ及びＰ６０Ｖ）、及び／又は
ｂ）ＶＬのＣＤＲＬ１（変異Ｖ３３Ｌ）及びＶＬのフレームワーク領域に特定の変異（４７位ｂにおけるヒトＶＬフレームワークアミノ酸からマウスアミノ酸Ｗへの逆変異）を有している。

【0023】

驚いたことに、ヒト化ＣＵＢ４抗体におけるこのような変異は、（そのような修飾のないヒト化ＣＵＢ４抗体と比較して）改善された結合特性を生じる。更に、ＣＤＲ及び／又はフレームワークにおけるそのような修飾は、（キメラ及びマウス親抗体と比較して）改善されたインビボ増殖阻害を有する本発明に係るヒト化抗体を生じる。

【0024】

本発明の一態様は、ＣＵＢ４抗体（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）の配列番号：１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号：２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体において、
ヒト化されており、上記ＶＨ配列において、（ＣＤＲＨ２において）５７位にスレオニン（Ｔ）の代わりにリジン（Ｋ）を、（ＣＤＲＨ２において）６０位にプロリン（Ｐ）の代わりにバリン（Ｖ）を含む（全ての位置はＫａｂａｔに従って番号付けられている）ことを特徴とする抗体である。これは、配列番号：１がＶＨのＣＤＲＨ２に変異Ｔ５７Ｋ及びＰ６０Ｖを含むことを意味している。

【0025】

本発明の他の態様は、ＣＵＢ４抗体（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）の配列番号：１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号：２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体において、
ヒト化されており、上記ＶＬ配列において、（ＣＤＲＨ１において）３３位にバリン（Ｖ）の代わりにロイシン（Ｌ）を、４７位にトリプトファン（Ｗ）を（ヒトＶＬフレームワーク領域からのアミノ酸の代わりに）含む（全ての位置はＫａｂａｔに従って番号付けられている）ことを特徴とする抗体である。これは、配列番号：２がＣＤＲＬ１に変異Ｖ３３Ｌを、フレームワーク領域ＶＬ中において４７位においてヒトからマウスアミノ酸Ｗへの逆変異を含むことを意味する。

【0026】

本発明の他の態様は、ＣＵＢ４抗体（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）の配列番号：１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号：２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体において、
ヒト化されており、上記ＶＨ配列において、（ＣＤＲＨ２において）５７位にスレオニン（Ｔ）の代わりにリジン（Ｋ）を、（ＣＤＲＨ２において）６０位にプロリン（Ｐ）の代わりにバリン（Ｖ）を含み、
上記ＶＬ配列において、３３位にバリン（Ｖ）の代わりにロイシン（Ｌ）を、４７位にトリプトファン（Ｗ）を含む（全ての位置はＫａｂａｔに従って番号付けられている）ことを特徴とする抗体である。これは、配列番号：１がＶＨのＣＤＲＨ２に変異Ｔ５７Ｋ及びＰ６０Ｖを含み、配列番号：２がＣＤＲＬ１に変異Ｖ３３Ｌを、ＶＬのフレームワーク領域中において４７位においてヒトからマウスアミノ酸Ｗへの逆変異を含むことを意味する。

【0027】

本発明の他の態様は、ＣＵＢ４抗体（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）の配列番号：１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号：２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体において、
ヒト化されており、上記ＶＬ配列において、
（ＣＤＲＬ１において）３３位にバリン（Ｖ）の代わりにロイシン（Ｌ）を、
４７位にトリプトファン（Ｗ）を（ヒトＶＬフレームワーク領域からのアミノ酸の代わりに）含むことを特徴とし、更に上記ＶＬ配列において、
２１位にメチオニン（Ｍ）を（ヒトＶＬフレームワーク領域からのアミノ酸の代わりに）（更に）含む（全ての位置はＫａｂａｔに従って番号付けられている）ことを更に特徴とする。

【0028】

本発明の他の態様は、ＣＵＢ４抗体（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）の配列番号：１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号：２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体において、
ヒト化されており、
上記ＶＨ配列において、
（ＣＤＲＨ２において）５７位にスレオニン（Ｔ）の代わりにリジン（Ｋ）を、（ＣＤＲＨ２において）６０位にプロリン（Ｐ）の代わりにバリン（Ｖ）を含み；
上記ＶＬ配列において、
（ＣＤＲＨ２において）５７位にスレオニン（Ｔ）の代わりにリジン（Ｋ）を、（ＣＤＲＨ２において）６０位にプロリン（Ｐ）の代わりにバリン（Ｖ）を含み；
上記ＶＬ配列において、
３３位にバリン（Ｖ）の代わりにロイシン（Ｌ）を、（ヒトＶＬフレームワーク領域からのアミノ酸の代わりに）４７位にトリプトファン（Ｗ）を含み；
上記ＶＬ配列において、
２１位にメチオニン（Ｍ）を（ヒトＶＬフレームワーク領域からのアミノ酸の代わりに）（更に）含む（全ての位置はＫａｂａｔに従って番号付けられている）ことを更に特徴とする。

【0029】

本発明の他の態様は、ＣＵＢ４抗体（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）の配列番号：１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号：２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体において、
ヒト化されており、上記ＶＬ配列において、
（ＣＤＲＨ１において）３３位にバリン（Ｖ）の代わりにロイシン（Ｌ）を、（ヒトＶＬフレームワーク領域からのアミノ酸の代わりに）４７位にトリプトファン（Ｗ）を含み；
上記ＶＬ配列において、
（ヒトＶＬフレームワーク領域からのアミノ酸の代わりに）２１位にメチオニン（Ｍ）を；（ＣＤＲＬ１において）２４位にセリン（Ｓ）の代わりにグリシン（Ｇ）又はアルギニン（Ｒ）を、（ＣＤＲＬ１において）２５位にバリン（Ｖ）の代わりにアラニン（Ａ）を（更に）含む（全ての位置はＫａｂａｔに従って番号付けられている）ことを更に特徴とする。

【0030】

本発明の他の態様は、ＣＵＢ４抗体（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）の配列番号：１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号：２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体において、
ヒト化されており、
上記ＶＨ配列において、
（ＣＤＲＨ２において）５７位にスレオニン（Ｔ）の代わりにリジン（Ｋ）を、（ＣＤＲＨ２において）６０位にプロリン（Ｐ）の代わりにバリン（Ｖ）を含み；
上記ＶＬ配列において、
３３位にバリン（Ｖ）の代わりにロイシン（Ｌ）を、（ヒトＶＬフレームワーク領域からのアミノ酸の代わりに）４７位にトリプトファン（Ｗ）を含み；
上記ＶＬ配列において、
（ヒトＶＬフレームワーク領域からのアミノ酸の代わりに）２１位にメチオニン（Ｍ）を；（ＣＤＲＬ１において）２４位にセリン（Ｓ）の代わりにグリシン（Ｇ）又はアルギニン（Ｒ）を、（ＣＤＲＬ１において）２５位にバリン（Ｖ）の代わりにアラニン（Ａ）を（更に）含む（全ての位置はＫａｂａｔに従って番号付けられている）ことを更に特徴とする。

【0031】

本発明の他の態様は、ＣＵＢ４抗体（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）の配列番号：１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号：２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体において、
ヒト化されており、上記ＶＬ配列において、
３３位にバリン（Ｖ）の代わりにロイシン（Ｌ）を、（ヒトＶＬフレームワーク領域からのアミノ酸の代わりに）４７位にトリプトファン（Ｗ）を含み；
上記ＶＬ配列において、
（ＣＤＲＬ１において）２４位にセリン（Ｓ）の代わりにアルギニン（Ｒ）を、（ＣＤＲＬ１において）２５位にバリン（Ｖ）の代わりにアラニン（Ａ）を（更に）含む（全ての位置はＫａｂａｔに従って番号付けられている）ことを更に特徴とする。

【0032】

本発明の他の態様は、ＣＵＢ４抗体（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）の配列番号：１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号：２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体において、
ヒト化されており、
上記ＶＨ配列において、
（ＣＤＲＨ２において）５７位にスレオニン（Ｔ）の代わりにリジン（Ｋ）を、（ＣＤＲＨ２において）６０位にプロリン（Ｐ）の代わりにバリン（Ｖ）を含み、
上記ＶＬ配列において、
３３位にバリン（Ｖ）の代わりにロイシン（Ｌ）を、（ヒトＶＬフレームワーク領域からのアミノ酸の代わりに）４７位にトリプトファン（Ｗ）を含み；
（ＣＤＲＬ１において）２４位にセリン（Ｓ）の代わりにアルギニン（Ｒ）を、（ＣＤＲＬ１において）２５位にバリン（Ｖ）の代わりにアラニン（Ａ）を（更に）含む（全ての位置はＫａｂａｔに従って番号付けられている）ことを更に特徴とする。

【0033】

本発明の一実施態様では、本発明に係るヒト化抗体は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号：３であることを特徴とする。

【0034】

本発明の他の実施態様では、本発明に係るヒト化抗体は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、又は配列番号：１８であることを特徴とする。

【0035】

本発明の他の実施態様では、本発明に係るヒト化抗体は、
重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号：３であり、
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２３、又は配列番号：２４であることを特徴とする。

【0036】

本発明の他の実施態様では、本発明に係るヒト化抗体は、
重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号：３であり、
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、又は配列番号：１８であることを特徴とする。

【0037】

本発明の他の実施態様では、本発明に係るヒト化抗体は、
重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号：３であり、
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号：１４であることを特徴とする。

【0038】

本発明の他の実施態様では、本発明に係るヒト化抗体は、
重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号：３であり、
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号：１５であることを特徴とする。

【0039】

本発明の他の実施態様では、本発明に係るヒト化抗体は、
重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号：３であり、
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号：１６であることを特徴とする。

【0040】

本発明の他の実施態様では、本発明に係るヒト化抗体は、
重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号：３であり、
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号：１７であることを特徴とする。

【0041】

本発明の他の実施態様では、本発明に係るヒト化抗体は、
重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号：３であり、
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号：１８であることを特徴とする。

【0042】

本発明の他の実施態様では、本発明に係るヒト化抗体は、
重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号：３であり、
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号：２３であることを特徴とする。

【0043】

本発明の他の実施態様では、本発明に係るヒト化抗体は、上記抗体がヒトＩｇＧ１サブクラスのものであることを特徴とする。

【0044】

本発明の他の実施態様では、本発明に係るヒト化抗体は、上記抗体がＡｓｎ２９７において糖鎖でグリコシル化され、上記糖鎖内のフコースの量が６５％以下であることを特徴とする。

【0045】

本発明に係るヒト化抗体の好ましい実施態様は、表１に示されるように、ヒト化重鎖可変ドメインＶＨ及びヒト化軽鎖可変ドメインＶＬの次の組み合わせの一つによって特徴付けられる（次の実施例番号を参照のこと）。

よって、本発明の一実施態様は、配列番号：３の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むことを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体である。

【0046】

本発明の一実施態様は、
配列番号：３の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、又は配列番号：２４の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含むことを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体である。

【0047】

本発明の一実施態様は、
配列番号：３の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
配列番号：１４の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含むことを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体である。

【0048】

本発明の一実施態様は、
配列番号：３の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
配列番号：１５の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含むことを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体である。

【0049】

本発明の一実施態様は、
配列番号：３の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
配列番号：１６の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含むことを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体である。

【0050】

本発明の一実施態様は、
配列番号：３の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
配列番号：１７の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含むことを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体である。

【0051】

本発明の一実施態様は、
配列番号：３の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
配列番号：１８の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含むことを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体である。

【0052】

本発明の一実施態様は、
配列番号：３の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
配列番号：１９の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含むことを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体である。

【0053】

本発明の一実施態様は、
配列番号：３の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
配列番号：２０の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含むことを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体である。

【0054】

本発明の一実施態様は、
配列番号：３の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
配列番号：２１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含むことを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体である。

【0055】

本発明の一実施態様は、
配列番号：３の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
配列番号：２２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含むことを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体である。

【0056】

本発明の一実施態様は、
配列番号：３の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
配列番号：２３の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含むことを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体である。

【0057】

本発明の一実施態様は、
配列番号：３の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
配列番号：２４の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含むことを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体である。

【0058】

本発明に係るヒト化抗体の更に好ましい実施態様は、表２に示されるように、ヒト化重鎖可変ドメインＶＨ及びヒト化軽鎖可変ドメインＶＬの次の組み合わせの一つによって特徴付けられる。そのような組合せは表２に示されるように次の実施例番号のヒトを含む。

【0059】

よって、本発明の一実施態様は、
配列番号：３の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）
を含むことを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体である。

【0060】

本発明の一実施態様は、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、又は配列番号：１８の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むことを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体である。

【0061】

本発明の一実施態様は、
配列番号：３の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、又は配列番号：１８の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含むことを特徴とするヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する抗体である。

【0062】

「Ｋａｂａｔ番号付け」又は「Ｋａｂａｔによる番号付け」又は「ＥＵインデックス」なる用語は、別の記載がない限り、Kabat等（Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）におけるＥＵインデックスを使用する、例えばＩｇＧ抗体中における、残基の番号付けとして定義される。

【0063】

ここで使用される「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」なる用語は、単一のアミノ酸組成の抗体分子の調製物を意味する。

【0064】

「キメラ抗体」なる用語は、通常は組換えＤＮＡ技術によって調製される、マウス由来の可変領域、すなわち結合領域と、異なる供給源又は種由来の定常領域の少なくとも一部を含むモノクローナル抗体を意味する。マウス可変領域及びヒト定常領域を含むキメラ抗体が特に好ましい。そのようなマウス／ヒトキメラ抗体は、マウス免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメントと、ヒト免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントを含む発現された免疫グロブリン遺伝子の産物である。本発明によって包含される「キメラ抗体」の他の形態は、クラス又はサブクラスが元の抗体のものから改変され又は変化されたものである。そのような「キメラ」抗体はまた「クラススイッチ抗体」と称される。キメラ抗体を生産するための方法は、今は当該技術分野においてよく知られている一般的な組換えＤＮＡ及び遺伝子トランスフェクション技術を含む（例えば、Morrison, S.L.等, Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855；米国特許第５２０２２３８号及び第５２０４２４４号を参照のこと）。

【0065】

ヒトＣＤＣＰ１（（ＣＵＢドメイン含有タンパク質１、Ｂ３４５、ＣＤ３１８、ＳＩＭＡ１３５、ＴＲＡＳＫ；配列番号：２９及び変異Ｒ５２５Ｑ（つまり、配列番号：２９のアミノ酸位置５２５におけるアルギニン（Ｒ）のグルタミン（Ｑ）での置換）及び／又は変異Ｇ７０９Ｄ（つまり、配列番号：２９のアミノ酸位置７０９におけるグリセリン（Ｇ）のアスパラギン酸（Ｄ）での置換)を含む変異体)は３つの細胞外ＣＵＢドメインを含む膜貫通タンパク質である。このタンパク質は乳癌、結腸癌及び肺癌において過剰発現することが見出されている。その発現レベルは癌細胞の転移能と相関している（Uekita, T.等, Am. J. Pathol. 172 (2008) 1729-1739）。それは癌細胞株においてチロシンリン酸化されることが示されている。（国際公開第2002/004508号; Scherl-Mostageer, M.等, Oncogene 20 (2001) 4402-8; Hooper, J., D.等, Oncogene 22 (2003) 1783-94; Perry, S., E.等 FEBS Lett. 581 (2007) 1137-42; Brown, T., A.等 J. Biol. Chem. 279 (2004) 14772-14783; Ota, T.等, Nat. Genet. 36 (2004) 40-45）。区別されるアイソフォームをコードする選択的スプライシング転写変異体が報告されている。

【0066】

ここで使用される場合、「ヒトＣＤＣＰ１に特異的に結合する」とは、ヒトＣＤＣＰ１抗原に特異的に結合する抗体を意味する。結合親和性は、１．０×１０^−８ｍｏｌ／ｌ以下（例えば１．０×１０^−８ｍｏｌ／ｌから１．０×１０^−１３ｍｏｌ／ｌ）のＫＤ値、好ましくは５．０×１０^−９ｍｏｌ／ｌ以下（例えば５．０×１０^−９ｍｏｌ／ｌから１．０×１０^−１３ｍｏｌ／ｌ）のＫＤ値である。結合親和性は、標準的な結合アッセイ、例えば表面プラズモン共鳴技術（Biacore(登録商標)）を用いて決定される。

【0067】

「エピトープ」なる用語は、抗体への特異的結合が可能であるヒトＣＤＣＰ１のタンパク質決定基を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸又は糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面グルーピングからなり、通常はエピトープは特異的な三次元構造特性、並びに特異的な電荷特性を有する。コンフォメーション及び非コンフォメーションエピトープは、後者ではなく前者への結合が変性溶媒の存在下で失われることで識別される。

【0068】

ここで使用される「可変ドメイン」（軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ））は、抗体を抗原に結合させることに直接関与する軽鎖及び重鎖の対のそれぞれを示す。可変軽鎖及び重鎖のドメインは、同じ一般構造を有し、各ドメインは、配列が広く保存され、３個の「高頻度可変領域」（又は相補性決定領域、ＣＤＲ）によって連結される、４個のフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域は、βシートコンフォメーションを採り、ＣＤＲは、βシート構造を連結するループを形成しうる。各鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域によって三次元構造に保持され、もう一方の鎖由来のＣＤＲと共に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明に係る抗体の結合特異性／親和性に特に重要な役割を果たし、よって本発明の更なる目的を提供する。

【0069】

「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、ここで定義された高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。従って、抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端までドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、Kabat等、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)の標準的な定義に従って決定され、及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基である。

【0070】

ここで使用される場合の「抗体の抗原結合部分」なる用語は、抗原結合が起因する抗体のアミノ酸残基を意味する。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。本発明の抗体の「抗原結合部分」なる用語は、抗原に対する結合部位の親和性に様々な度合いで寄与する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでいる。３つの重鎖可変ドメインＣＤＲｓ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）及び３つの軽鎖可変ドメインＣＤＲｓ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）が存在する。「ＣＤＲＨ１」なる用語は、Ｋａｂａｔによって計算される重鎖可変領域のＣＤＲ１領域を示す。ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、重鎖（Ｈ）又は軽鎖（Ｌ）からの各領域を意味する。ＣＤＲ及びフレームワーク領域（ＦＲｓ）の度合いは、その領域が上掲のＫａｂａｔ等に従って配列間の可変性に従って定義されているアミノ酸配列の編集されたデータベースとの比較によって決められる。

【0071】

「核酸」又は「核酸分子」なる用語は、ここで使用される場合、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖でありうるが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。

【0072】

この出願内で使用される「アミノ酸」なる用語は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシα−アミノ酸の群を意味する。

【0073】

本発明に係る抗体は、定常領域がヒト由来のものであり、好ましくはヒトＩｇＧ１サブクラスのものであることを特徴とする。定常領域は、抗体の重鎖及び軽鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、Ｎ末端からＣ末端方向に、抗体定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）、及び場合によってはサブクラスＩｇＥの抗体の場合、抗体重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）を含む。軽鎖定常領域は抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含む。抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）はκ（カッパ）又はλ（ラムダ）でありうる。そのような定常鎖は従来からよく知られており、例えばKabat, E.A.によって記載されている (例えばJohnson, G.及びWu, T., T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218を参照のこと)。例えば、ＩｇＧ１サブクラスの有用なヒト重鎖定常領域は、配列番号：２６のアミノ酸配列を含む。例えば、有用なヒト軽鎖定常領域は、配列番号：２７のκ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含み；他の有用なヒト軽鎖定常領域は配列番号：２８のλ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。

【0074】

抗体の「Ｆｃ部分」は、抗原への抗体の結合に直接的には関与していないが、様々なエフェクター機能を示す。「抗体のＦｃ部分」は当業者にはよく知られた用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて定義される。その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、抗体又は免疫グロブリンはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭというクラスに分類され、これらの幾つかはサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分類されうる。重鎖定常領域によれば、異なるクラスの免疫グロブリンは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。

【0075】

抗体のＦｃ部分は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合及びＦｃレセプター結合に基づいて、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介細胞傷害性）及びＣＤＣ（補体依存性細胞傷害性）に直接的に関与する。補体活性化（ＣＤＣ）は、殆どのＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ部分への補体因子Ｃ１ｑの結合によって開始される。補体系に対する抗体の影響はある種の条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃ部分において定義された結合部位によって引き起こされる。このような結合部位は従来から知られており、例えばBoakle, R.J.等, Nature 282 (1979) 742-743；Lukas, T.J.等, J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560；Brunhouse, R.及びCebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917；Burton, D.R.等, Nature 288 (1980) 338-344； Thommesen, J.E.等, Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004；Idusogie, E.E.等, J. Immunol.164 (2000) 4178-4184；Hezareh, M.等, J. Virology 75 (2001) 12161-12168；Morgan, A.等, Immunology 86 (1995) 319-324; EP0307434によって記載されている。このような結合部位は、例えばＬ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１及びＰ３２９（Kabat, E.A.のＥＵインデックスによる番号付け、以下を参照）である。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３の抗体は、通常、補体活性化及びＣ１ｑ及びＣ３結合を示す一方、ＩｇＧ４は補体系を活性化せず、Ｃ１ｑ及びＣ３に結合しない。

【0076】

本発明に係る抗体は、ヒト起源由来のＦｃ部分、好ましくはヒト定常領域の全ての他の部分を含む。ここで使用される場合、「ヒト起源由来のＦｃ部分」なる用語は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のヒト抗体のＦｃ部分、好ましくは、ヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃ部分、ヒトＩｇＧ１サブクラス由来の変異Ｆｃ部分（好ましくはＬ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａの変異を持つもの）、ヒトＩｇＧ４サブクラス由来のＦｃ部分又はヒトＩｇＧ４サブクラス由来の変異Ｆｃ部分（好ましくはＳ２２８Ｐの変異を持つもの）を示す。最も好ましいものは、配列番号：２６又は３１のヒトＩｇＧサブクラス、変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するヒトＩｇＧサブクラス、配列番号：３２のヒトＩｇＧサブクラス、又は変異Ｓ２２８Ｐを有するヒトＩｇＧ４サブクラスのヒト重鎖定常領域である。

【0077】

「抗体依存性細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）」なる用語は、エフェクター細胞の存在下での本発明に係る抗体によるヒト標的細胞の溶解を意味する。ＡＤＣＣは、好ましくは、新鮮に単離されたＰＢＭＣのようなエフェクター細胞又は単球もしくはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は永久に増殖するＮＫ細胞株のようなバフィコート由来の精製エフェクター細胞の存在下でＣＤＣＰ１発現細胞調製物を本発明に係る抗体で処理することによって測定される。

【0078】

「補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）」なる用語は、殆どのＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ部分への補体因子Ｃ１ｑの結合により開始されるプロセスを意味する。抗体へのＣ１ｑの結合は、いわゆる結合部位における定まったタンパク質間相互作用によって引き起こされる。このようなＦｃ部分結合部位は従来から知られている（上記を参照）。このようなＦｃ部分結合部位は、例えばアミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）によって特徴付けられる。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２，及びＩｇＧ３の抗体は、Ｃ１ｑ及びＣ３結合を含む補体活性化を通常示す一方、ＩｇＧ４は補体系を活性化させず、Ｃ１ｑ及び／又はＣ３に結合しない。

【0079】

モノクローナル抗体の細胞媒介性エフェクター機能は、例えば、Umana, P. 等, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180、及び米国特許第6602684号に記載されているように、それらのオリゴ糖成分を操作することにより亢進せしめることができる。ＩｇＧ１型抗体は、最も一般的に使用される治療用抗体であり、各ＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に保存されたＮ結合型グリコシル化部位を有する糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に結合する２つの二分複合オリゴ糖は、ＣＨ２ドメイン間に埋め込まれ、ポリペプチド骨格との広範な接触を形成し、それらの存在は、抗体が抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）等のエフェクター機能を媒介する上で必須である（Lifely, M.R.等, Glycobiology 5 (1995) 813-822；Jefferis, R. 等, Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76；Wright, A.及び Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32）。Umana, P. 等（Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180及び国際公開第99/54342号は、二分オリゴ糖の形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（「ＧｎＴＩＩＩ」）のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における過剰発現が、抗体のインビトロＡＤＣＣ活性を有意に増大させることを示している。Ａｓｎ２９７糖鎖の組成の改変又はその消失は、ＦｃγＲ及びＣ１ｑに対する結合にも影響を与える（Umana, P. 等, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180；Davies, J. 等, Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294；Mimura, Y. 等, J. Biol. Chem. 276 (2001) 45539-45547；Radaev, S. 等, J. Biol. Chem. 276 (2001) 16478-16483；Shields, R.L. 等, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604；Shields, R.L. 等, J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740；Simmons, L.C. 等, J. Immunol. Methods 263 (2002) 133-147）。

【0080】

モノクローナル抗体の細胞媒介性エフェクター機能を亢進せしめる方法は、例えば国際公開第２００５／０４４８５９号、国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００７／０３１８７５号、Umana, P.等, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180、国際公開第９９／１５４３４２号、国際公開第２００５／０１８５７２号、国際公開第２００６／１１６２６０号、国際公開第２００６／１１４７００号、国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００５／０１１７３５号、国際公開第２００５／０２７９６６号、国際公開第１９９７／０２８２６７号、米国特許出願公開第２００６／０１３４７０９号、米国特許出願公開第２００５／００５４０４８号、米国特許出願公開第２００５／０１５２８９４号、国際公開第２００３／０３５８３５号及び国際公開第２０００／０６１７３９号又は例えばNiwa, R.等, J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160；Shinkawa, T.等, J. Biol. Chem. 278 (2003) 3466-3473；国際公開第０３／０５５９９３号及び米国特許出願公開第２００５／０２４９７２２号に報告されている。

【0081】

よって、本発明の一実施態様では、本発明に係る抗体は、（もしそれがＩｇＧ１又はＩｇＧ３サブクラスのＦｃ部分を含むならば）Ａｓｎ２９７での糖鎖で（Ｋａｂａｔによる番号付け）上記糖鎖内のフコースの量が６５％以下であるようにグリコシル化されている。他の実施態様では、上記糖鎖内のフコースの量は５％〜６５％、好ましくは２０％〜４０％である。別の実施態様では、フコースの量はＡｓｎ２９７におけるＦｃ領域のオリゴ糖の０％である。本発明において「Ａｓｎ２９７」は、Ｆｃ領域のおよそ２９７位に位置するアミノ酸アスパラギンを意味する。抗体の軽微な配列変異に基づいて、Ａｓｎ２９７は、幾つかのアミノ酸（通常は、±３アミノ酸以下）を隔てて２９７位の上流又は下流に、つまり、２９４位と３００位の間に位置する場合がある。一実施態様では、本発明に係るグリコシル化抗体において、ＩｇＧサブクラスは、ヒトＩｇＧ１サブクラス、又はＩｇＧ３サブクラスのものである。更なる実施態様では、上記糖類内において、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）量は１％以下、及び／又はＮ末端α−１，３−ガラクトースの量は１％以下である。糖鎖は、好ましくはＣＨＯ細胞で組換的に発現される抗体のＡｓｎ２９７に結合したＮ結合型グリカンの特徴を示す。

【0082】

「ＣＨＯ細胞で組換的に発現される抗体のＡｓｎ２９７に結合したＮ結合型グリカンの特徴を示す」という用語は、本発明に係る抗体のＡｓｎ２９７における糖鎖が、フコース残基を除き、例えば国際公開第２００６／１０３１００号に報告されたもののように、未修飾ＣＨＯ細胞に発現された同じ抗体のものとオース残基を除いて同じ構造及び糖残基を有していることを示している。

【0083】

この出願中に使用される「ＮＧＮＡ」なる用語は、糖残基Ｎ−グリコリルノイラミン酸を意味する。

【0084】

コアがフコシル化された二分岐複合オリゴ糖グリコシル化が２個までのＧａｌ残基で終端するので、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３のグリコシル化はＡｓｎ２９７で生じる。ＩｇＧ１又はＩｇＧ３サブクラスのヒト重鎖定常領域は、上掲のKabat, E.A.等、及び Bruggemann, M. 等, J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361；Love, T.W.等, Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527に詳細に報告されている。これらの構造は、末端Ｇａｌ残基の量に依存して、Ｇ０、Ｇ１（α−１，６−又はα−１，３−）、又はＧ２グリカン残基と命名される（Raju, T.S., Bioprocess Int. 1 (2003) 44-53）。抗体Ｆｃ部分のＣＨＯ型のグリコシル化は、例えばRoutier, F.H., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207に記載されている。非糖修飾ＣＨＯ宿主細胞に組換的に発現される抗体は、通常、Ａｓｎ２９７において、少なくとも８５％の量でフコシル化されている。抗体の修飾オリゴ糖はハイブリッド又は複合でありうる。好ましくは、二分岐の還元／非フコシル化オリゴ糖はハイブリッドである。他の実施態様では、二分岐の還元／非フコシル化オリゴ糖は複合である。

【0085】

本発明によれば、「フコースの量」とは、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量分析法によって測定され、平均値として算出されるＡｓｎ２９７に結合した全ての糖構造（例えば、複合、ハイブリッド及び高マンノース構造)の合計に関連した、Ａｓｎ２９７での糖鎖内の前記糖の量を意味する（例えば国際公開第２００８／０７７５４６号を参照）。フコースの相対量は、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦによる、Ｎ−グリコシダーゼＦで処理したサンプル中で同定された全ての糖鎖構造（例えば、複合、ハイブリッド及び高マンノース構造それぞれ）に対するフコース含有構造の割合である。

【0086】

本発明に係る抗体は好ましくは組換え手段によって生産される。このような方法は従来から広く知られており、原核及び真核細胞におけるタンパク質の発現と続く抗体ポリペプチドの単離及び通常は薬物学的に許容可能な純度までの精製を含む。タンパク質の発現のためには、軽鎖及び重鎖をコードする核酸又はその断片が標準的な方法によって発現ベクター中に挿入される。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母、又は大腸菌細胞等の適切な原核又は真核宿主細胞において実施され、抗体は細胞（上清又は溶解後の細胞）から回収される。

【0087】

抗体の組換え生産は従来からよく知られており、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S.等, Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880という概説論文に記載されている。

【0088】

抗体は、全細胞中に、細胞可溶化物中に、又は部分的に精製され又は実質的な純粋な形態で存在しうる。精製は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌ分染法、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動法、及び当該技術分野でよく知られた他のものを含む標準的な技術によって、他の細胞性成分又は他の汚染物質、例えば他の細胞性核酸又はタンパク質を除去するために実施される（Ausubel, F.等.(編), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照）。

【0089】

ＮＳ０細胞における発現は、例えばBarnes, L.M.等, Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M.等, Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270によって記載されている。一過性発現は、例えばDurocher, Y.等, Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9によって記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289;及びNorderhaug, L.等, J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87によって記載されている。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ２９３）は、Schlaeger, E.J.,及びChristensen, K., Cytotechnology 30 (1999) 71-83及びSchlaeger, E.J., J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199によって記載されている。

【0090】

原核生物に適した制御配列には、例えば、プロモーター、場合によってはオペレーター配列、及びリボソーム結合部位が含まれる。真核生物細胞は、プロモーター、エンハンサー及びポリアデニル化シグナルを使用することが知られている。

【0091】

核酸は、別の核酸配列と機能的関係で配されている場合、「作用可能に連結」されている。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに作用可能に連結されており；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作用可能に連結されており；又は、リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置されている場合、コード配列に作用可能に連結されている。一般に、「作用可能に連結される」とは、連結されるＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合は、近接し、かつ読み枠にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは近接していなくてもよい。連結は、簡便な制限部位におけるライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが、一般的な手法に従って使用される。

【0092】

モノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィー等、一般的な免疫グロブリン精製手順により、培養培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、一般的な手順を使用し、容易に単離し配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡ及びＲＮＡの供給源となりうる。ひとたび単離されると、ＤＮＡは発現ベクター内に挿入され得、これがついで宿主細胞、例えばそうでないと免疫グロブリンタンパク質を生産しないＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、又は骨髄腫細胞に形質移入され、宿主細胞において組換えモノクローナル抗体の合成が達成される。

【0093】

ここで使用される場合、「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養」という表現は相互に交換可能に用いられ、全てのそのような標記は子孫を含む。従って、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という語句は、初代対象細胞及び何度培養が継代されたかに関わらず初代のものから誘導された培養を含む。また、全ての子孫が、意図的な変異あるいは意図しない変異の影響で、ＤＮＡ含有物において正確に同一であるわけではないことも理解される。元々の形質転換細胞についてスクリーニングしたものと同じ機能又は生物活性を有する変異体子孫が含まれる。区別される標記が意図される場合は、文脈から明らかであろう。

【0094】

ここで使用される「形質転換」なる用語は、宿主細胞中へのベクター／核酸のトランスファープロセスを意味する。恐るべき細胞壁障壁のない細胞が宿主細胞として使用される場合、形質移入は、例えばGraham, F., L.,及びvan der Eb, Virology 52 (1973) 456-467により記載されるようなリン酸カルシウム沈殿法により実施される。しかしながら、核注入又はプロトプラスト融合等による細胞中へのＤＮＡの導入のための他の方法がまた使用されうる。原核生物細胞又は実質的な細胞壁構成を含む細胞が使用される場合、例えば一つの形質移入法は、Cohen, S.N.等, PNAS 69 (1972) 2110-2114により記載される塩化カルシウムを使用するカルシウム処理である。

【0095】

ここで使用される場合、「発現」とは、核酸がｍＲＮＡに転写されるプロセス、及び／又は転写されたｍＲＮＡ（また、転写物とも称される）がその後ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に翻訳されるプロセスを意味する。転写物及びコードされたポリペプチドは、集合的には、遺伝子産物と称される。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、真核生物細胞における発現は、ｍＲＮＡのスプライシングを含みうる。

【0096】

「ベクター」とは、挿入される核酸分子を、宿主細胞中及び／又は宿主細胞間にトランスファーする核酸分子、特に自己複製する核酸分子である。該用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡの細胞中への挿入（例えば、染色体組込み）のために主に機能するベクター、ＤＮＡ又はＲＮＡの複製のために主に機能するベクターの複製、及びＤＮＡ又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳のために機能する発現ベクターを含む。一を越える記載された機能を提供するベクターもまた含まれる。

【0097】

「発現ベクター」とは、適切な宿主細胞中に導入されると、転写され、ポリペプチドに翻訳され得るポリヌクレオチドである。「発現系」とは、所望される発現産物を生じせしめるように機能しうる発現ベクターから構成される適切な宿主細胞を通常意味する。

【0098】

本発明の一態様は、本発明に係る抗体を含有する薬学的組成物である。本発明の他の態様は、薬学的組成物の製造のための本発明に係る抗体の使用である。本発明の更なる態様は、本発明に係る抗体を含有する薬学的組成物の製造方法である。他の態様では、本発明は、薬学的担体と共に処方されて本発明に係る抗体を含む組成物、例えば薬学的組成物を提供する。

【0099】

更に、ＣＤＣＰ１抗体ＣＵＢのそのような特定のヒト化型は、例えば他の抗ＣＤＣＰ１抗体と比較して癌の治療のために特に有用であることが分かった。

【0100】

従って、本発明の一態様は、癌の治療のための上記薬学的組成物である。
本発明の他の態様は、癌の治療のための本発明に係るヒト化抗体である。
本発明の他の態様は、癌の治療のための医薬の製造のための本発明に係るヒト化抗体の使用である。

【0101】

本発明の他の態様は、癌に罹患している患者を、かかる治療を必要とする上記患者に本発明に係るヒト化抗体を投与することにより治療する方法である。

【0102】

ここで使用される場合、「薬学的な担体」は、生理学的に適合性のある任意の全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延化剤等を含む。好ましくは、担体は静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は上皮投与（例えば注射又は注入による）に適している。

【0103】

本発明の組成物は当該技術分野において知られている様々な方法によって投与することができる。当業者に理解されるように、投与の経路及び／又は態様は所望される結果に応じて変わる。ある投与経路によって本発明の化合物を投与するためには、その不活性化を防止するための材料で化合物を被覆し、又はそれと共に化合物を同時投与することが必要である場合がある。例えば、化合物はリポソーム又は希釈剤等の適切な担体で被験者に投与されうる。薬物学的に許容可能な希釈剤は、生理食塩水及び緩衝水溶液を含む。薬物学的な担体は、滅菌水溶液又は分散体、及び滅菌注射用溶液又は分散体の即時調製のための滅菌パウダーを含む。薬物学的に活性な物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用は当該技術分野で知られている。

【0104】

ここで使用される「非経口投与」及び「非経口的に投与される」なる語句は、通常は注射による、経腸と局所投与以外の投与態様を意味し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、クモ膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、髄腔内、硬膜外、胸骨内への注射及び注入を含む。

【0105】

ここで使用される「癌」なる用語は、例えば、肺癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌、細気管支肺胞細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部もしくは頚部の癌、皮膚もしくは眼内メラノーマ、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌（stomach cancer、gastric cancer）、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜の癌腫、子宮頚部の癌腫、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓もしくは尿道の癌、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹膠腫、多形膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄腹腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、リンパ腫、リンパ性白血病、例えば上記癌の何れかの難治性型、又は上記癌の一又は複数の組み合わせでありうる。好ましくは、そのような癌は、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌又は前立腺癌であり、より好ましくは肺癌である。好ましくは、そのような癌は、ＣＤＣＰ１発現又は過剰発現によって、より好ましくはＣＤＣＰ１過剰発現によって更に特徴付けられる。

【0106】

これらの組成物は、アジュバント、例えば保存料、湿潤剤、乳化剤及び分散剤をまた含みうる。上記の滅菌手順と、様々な抗菌剤や抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等の添加の双方によって、微生物の存在を確実に防止できる。また、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウム等を組成物中に含めることが望ましい場合がある。加えて、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含有せしめることにより、注射可能な薬学的形態の長期吸収がもたらされうる。

【0107】

選択される投与経路にかかわらず、適切な水和形態で使用されてもよい本発明の化合物、及び／又は本発明の薬学的組成物は、当業者に知られた一般的な方法により、薬学的に許容可能な投薬形態に製剤化される。

【0108】

本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の投薬量レベルは、患者に対して毒性とならないで、特定の患者、組成物、投与態様に対して、所望の治療応答を達成するのに効果的な活性成分量が得られるように変化させうる。選択される投薬量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物、投与経路、投与時間、用いられる特定化合物の排出率、治療期間、他の薬剤、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される化合物及び／又は材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康及び先の医療歴、及び医学分野でよく知られた類似の要因を含む様々な薬物動態学的因子に依存するであろう。

【0109】

組成物は、無菌で、組成物がシリンジにより送達可能な程度に流動的でなければならない。水に加えて、担体は、好ましくは等張緩衝生理食塩水である。

【0110】

適切な流動性が、例えば、レシチンのようなコーティングを使用することによって、分散体の場合は要求される粒子サイズを維持することにより、また界面活性剤を使用することにより維持されうる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマニトール又はソルビトール、及び塩化ナトリウムを含めることが好ましい。

【0111】

次の実施例、配列表及び図面は本発明の理解を助けるために提供されるもので、発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の精神を逸脱しないで記載された手順に変更をなすことができることが理解される。

【0112】

配列表のアミノ酸配列の説明
配列番号：１ ＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）の重鎖可変ドメインＶＨ
配列番号：２ ＣＵＢ４（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２５５１）の軽鎖可変ドメインＶＬ
配列番号：３ ｈＨＣ４−Ｈ − ＣＵＢ４のヒト化ＶＨ
配列番号：４ ｈＨＣ４−ｃ − ＣＵＢ４のヒト化ＶＨ
配列番号：５ ｈＨＣ４−ａ − ＣＵＢ４のヒト化ＶＨ
配列番号：６ ｈＨＣ４−ｄ − ＣＵＢ４のヒト化ＶＨ
配列番号：７ ｈＨＣ４−０４ − ＣＵＢ４のヒト化ＶＨ
配列番号：８ ｈＨＣ４−Ｋ − ＣＵＢ４のヒト化ＶＨ
配列番号：９ ｈＨＣ４−Ｋ２ − ＣＵＢ４のヒト化ＶＨ
配列番号：１０ ｈＨＣ４−Ｉ − ＣＵＢ４のヒト化ＶＨ
配列番号：１１ ｈＨＣ４−０７ − ＣＵＢ４のヒト化ＶＨ
配列番号：１２ ｈＨＣ４−０３ − ＣＵＢ４のヒト化ＶＨ
配列番号：１３ ｈＨＣ４−ｂ − ＣＵＢ４のヒト化ＶＨ
配列番号：１４ ｈＬＣ４−Ｍ − ＣＵＢ４のヒト化ＶＬ
配列番号：１５ ｈＬＣ４−Ｌ２ − ＣＵＢ４のヒト化ＶＬ
配列番号：１６ ｈＬＣ４−Ｋ − ＣＵＢ４のヒト化ＶＬ
配列番号：１７ ｈＬＣ４−Ｌ − ＣＵＢ４のヒト化ＶＬ
配列番号：１８ ｈＬＣ４−Ｊ − ＣＵＢ４のヒト化ＶＬ
配列番号：１９ ｈＬＣ４−ｂ − ＣＵＢ４のヒト化ＶＬ
配列番号：２０ ｈＬＣ４−ｃ − ＣＵＢ４のヒト化ＶＬ
配列番号：２１ ｈＬＣ４−ａ − ＣＵＢ４のヒト化ＶＬ
配列番号：２２ ｈＬＣ４−ｄ − ＣＵＢ４のヒト化ＶＬ
配列番号：２３ ｈＬＣ４−ｅ − ＣＵＢ４のヒト化ＶＬ
配列番号：２４ ｈＬＣ４−ｆ − ＣＵＢ４のヒト化ＶＬ
配列番号：２５ ｈＬＣ４−Ｉ − ＣＵＢ４のヒト化ＶＬ
配列番号：２６ ヒト由来（白人アロタイプ）のＩｇＧ１定常重鎖領域
配列番号：２７ ヒト由来のκ定常軽鎖領域
配列番号：２８ ヒト由来のλ定常軽鎖領域
配列番号：２９ ヒトＣＤＣＰ１
配列番号：３０ ヒトＣＤＣＰ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）含有断片
配列番号：３１ ヒト由来（アフリカ系アメリカ人アロタイプ）のＩｇＧ１定常重鎖領域
配列番号：３２ ヒト由来のＩｇＧ４定常重鎖領域

【図面の簡単な説明】

【0113】

【図1】マウス（ｍＶＨ−ＣＵＢ４）抗体のＶＨドメインアミノ酸配列（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３をマーク−太字）及び異なったヒト化ＣＵＢ４抗ＣＤＣＰ１抗体（本発明に係る特定の修飾をマーク−太字）のＶＨドメインアミノ酸配列。

【図2】マウス（ｍＶＬ−ＣＵＢ４）抗体のＶＬドメインアミノ酸配列（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３をマーク−太字）及び異なったヒト化ＣＵＢ４抗ＣＤＣＰ１抗体（本発明に係る特定の修飾をマーク−太字）のＶＬドメインアミノ酸配列。

【図3】異なったヒト化抗ＣＤＣＰ１抗体ＣＵＢ４の相対的結合比。キメラＣＵＢ４（（ｃｈＨＣ４＝ヒトＩｇＧ１定常領域を有するマウスＶＨ及びＶＬ）抗体に対する異なったヒト化ＶＨ及びＶＬドメインの組合せのの結合比が示される。

【図4】キメラ糖鎖操作（ＧＥ）ＣＵＢ４及び野生型（ｗｔ＝非糖鎖操作キメラＣＵＢ４抗体及び負のヒトＩｇＧコントロールと比較して６５％以下のフコースの量の糖鎖操作（ＧＥ）ヒト化ＣＵＢ４抗体番号６９ＧＥのインビトロＡＤＣＣ。

【図5a】ヒト化ＣＵＢ４抗体番号６９及び１３５、キメラＣＵＢ４抗体及びマウスＣＵＢ４抗体のヒト肺癌Ｈ３２２Ｍ異種移植片におけるインビボ腫瘍増殖阻害。

【図5b】ヒト化ＣＵＢ４抗体番号６９及び１３５、キメラＣＵＢ４抗体及びマウスＣＵＢ４抗体のヒト肺癌Ｈ３２２Ｍ異種移植片におけるインビボ腫瘍増殖阻害。

【実施例】

【0114】

実施例１
アンチジーン特異的ＥＬＩＳＡ
ストレプトアビジン結合タンパク質（ＳＢＰ）に融合させた可溶型ＣＤＣＰ１細胞外ドメイン（ＣＤＣＰ１−ＥＣＤ）（配列番号：３０）をストレプトアビジンプレートに捕捉させた。ＳＢＰ−ＣＤＣＰ１−ＥＣＤに対する抗体の最適な結合を定めるために、MicroCoat, Bernried, Germany (ID-No.1734776-001)によって届けられた３８４ウェルのポリスチレンプレート（ＮＵＮＣ，ストレプトアビジン被覆）を純粋な及び段階希釈されたＨＥＫ２９３上清（ＢＳＡ／ＩＭＤＭバッファー：イスコフ改変ダルベッコ培地に溶解した１００ｍｇ／ｍｌのＢＳＡフラクションＶ，Ｒｏｃｈｅ １０７３５０７８００１）で被覆した。マウスＣＵＢ４抗体の較正曲線を使用して、マイクロタイタープレートのストレプトアビジン結合能に対するＨＥＫ２９３上清の最適な希釈係数を特定した。標準的なコーティングに対しては、ＳＢＰ−ＣＤＣＰ１−ＥＣＤ含有ＨＥＫ２９３上清を希釈し（１：１５及び１：４０の間）、２−８℃で一晩インキュベートした（ウェル当たり２５μｌ）。マイクロタイタープレートの集中的な洗浄が残りの未結合のＳＢＰ−ＣＤＣＰ１−ＥＣＤを除去するために必要である。

【0115】

ヒト化ＣＵＢ４抗体及び／又は参照抗体（ヒト定常領域及び配列番号：１及び２のマウスＶＨ及びＶＬを含むキメラ（ｃｈＨＣ４）ＣＵＢ４抗体）を、未希釈で又は１２の段階希釈を使用して試験した。ウェル当たり１２．５μｌの各試料を室温で９０分間、インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ中の０．１％のＴｗｅｅｎ２０）を使用する集中的な洗浄後に、ヒト抗体のために２５μｌのＨＲＰに結合させた何れかのヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch, コード番号：１０９−０３６−０９８，希釈１：１００００）を加え、１時間インキュベートした。集中的な洗浄後、抗体の結合をＡＢＴＳ錠（Roche Diagnostics GmbH,カタログ番号：１１１２４２２）を用いて検出した。４０５ｎｍ／４９２ｎｍでの吸光度を、標準的な光度計を使用して測定した。

【0116】

図３には、キメラ（ｃｈＨＣ４）ＣＵＢ４抗体に対するヒト化ＶＨ及びＶＬの異なった組合せの結合比が示される。結果は、
ａ）ＶＨのＣＤＲＨ２中の特定の変異（変異Ｔ５７Ｋ及びＰ６０Ｖ）（ＶＨドメイン：ｈＨＣ４−Ｈ（配列番号：３）を参照、
及び／又は
ｂ）ＶＬのＣＤＲＬ１中の特定の変異（変異Ｖ３３Ｌ）及びＶＬフレームワーク領域における４７位でのヒトからマウスアミノ酸Ｗへの変異；（ＶＬドメイン：ｈＬＣ４−Ｍ（配列番号：１４）、ｈＬＣ４−Ｌ２（配列番号：１５）、ｈＬＣ４−Ｋ（配列番号：１６）、ｈＬＣ４−Ｌ（配列番号：１７）、ｈＬＣ４−Ｊ（配列番号：１８）を参照）
を持つ特定の修飾されたヒト化抗体が、驚いたことに、そのような特定の修飾のないヒト化ＣＵＢ４抗体と比較して明らかに改善された結合特性を生じることを示している。

【0117】

実施例２
（ヒトＣＤＣＰ１の細胞外ドメインＥＣＤを含む）配列番号：３０のヒトＣＤＣＰ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）含有断片に対する抗ＣＤＣＰ１抗体の結合の特徴付け：
親和性の測定のために、３０μｇ／ｍｌの抗マウスＦｃγ抗体（ヤギ由来，Jackson Immuno Research JIR115-005-071)を、ＳＰＲ機器（Biacore T100）での標準的なアミンカップリング及びブロッキングケミストリーによってＣＭ−５センサーチップの表面にカップリングさせた。コンジュゲーション後、異なった抗ＣＤＣＰ１抗体を５μＬ／分の流量で２５℃で注入した後、一連の希釈（０ｎＭから１０００ｎＭ）のＣＤＣＰ１ ＥＣＤを３０μＬ／分で続けた。結合実験に対する流通バッファーとしてＰＢＳ／０．１％ＢＳＡを使用した。ついで、チップを６０ｓパルスの１０ｍＭのグリセリン−ＨＣｌ，ｐＨ２．０の溶液で再生した。

【0118】

ラングミュアー１：１結合モデルを使用して、熱力学的パラメータ（Ｋ_Ｄ，結合定数）及び動態パラメータ（ｋ_ｏｎ速度，ｋ_ｏｆｆ速度）を計算した。

【0119】

実施例３
糖鎖操作ヒト化ＣＵＢ４抗体（ヒト化ＣＵＢ４抗体ＧＥ）の調製
アミノ酸配列の配列番号：３及び配列番号：１５に対応する完全抗体重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列（抗体６９）を、ＭＰＳＶプロモーターの制御下で合成ポリＡ部位の上流において哺乳動物発現ベクター（軽鎖のものと重鎖のもの）中にサブクローニングした（各ベクターはＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を有する）。

【0120】

抗体は、リン酸カルシウム形質移入アプローチ法を使用して、哺乳動物抗体の重鎖及び軽鎖発現ベクターをＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に同時導入することによって産生させた。対数増殖ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞にリン酸カルシウム法によって形質移入した。未修飾抗体の生産に対しては、細胞を１：１の比の抗体重鎖及び軽鎖発現ベクターだけで形質移入した。糖鎖操作抗体の生産に対しては、細胞に４つのプラスミド、つまり抗体発現のために２つ、融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現のために一つ（ＧｎＴ−ＩＩＩ発現ベクター）、及びマンノシダーゼＩＩ発現のために一つ（ゴルジマンノシダーゼＩＩ発現ベクター）をそれぞれ４：４：１：１の比で同時導入した。細胞を、１０％のＦＣＳを補填したＤＭＥＭ培養培地を使用してＴフラスコ中で付着単層培養として増殖させ、それらが５０及び８０％集密になったときに形質移入した。Ｔ１５０フラスコの形質移入では、ＦＣＳ（最終１０％Ｖ／Ｖで）を補填した２５ｍｌのＤＭＥＭ培養培地に形質移入の２４時間前に１５百万細胞を播種し、細胞を５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーターに３７℃で一晩配した。形質移入される各Ｔ１５０フラスコに対して、ＤＮＡ、ＣａＣｌ２及び水の溶液を、軽鎖及び重鎖発現ベクター間に等しく分配された９４μｇの全プラスミドベクターＤＮＡ、４６９μｌの最終容量までの水及び４６９μｌの１ＭのＣａＣｌ２溶液を混合することによって調製した。この溶液に、９３８μｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４溶液（ｐＨ７．０５）を加え、直ぐに１０秒間混合し、室温で２０秒間静置した。懸濁液を、２％のＦＣＳを補填した１０ｍｌのＤＭＥＭで希釈し、既存の培地の代わりにＴ１５０に加えた。ついで、更なる１３ｍｌの形質移入培地を加えた。細胞を約１７から２０時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、ついで培地を２５ｍｌのＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳに置換した。条件培養培地を２１０×ｇでの１５分の遠心分離によって形質移入から７日後に収集し、溶液を滅菌濾過（０．２２μｍフィルター）し、０．０１％ｗ／ｖの最終濃度のアジ化ナトリウムを加え、４℃に維持した。

【0121】

分泌された抗体の糖鎖操作ヒト化ＣＵＢ４抗体番号６９（ヒト化ＣＵＢ４抗体番号６９ＧＥ）をプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーと、続くカチオン交換クロマトグラフィー及びＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（Amersham Pharmacia）での最終の分子ふるいクロマトグラフィー工程により、バッファーを２５ｍＭのリン酸カリウム、１２５ｍＭの塩化ナトリウム、１００ｍＭのグリシン溶液（ｐＨ６．７）に交換し、純粋な単量体ＩｇＧ１抗体を収集することによって精製した。抗体濃度を２８０ｎｍでの吸光度から分光光度計を使用して推定した。抗体のＦｃ領域に結合したオリゴ糖をＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ（例えば国際公開第２００８／０７７５４６号に記載された）によって分析した。オリゴ糖は、ＰＮＧａｓｅＦ消化により抗体から酵素的に放出され、抗体はＰＶＤＦ膜に固定されるか又は溶液中である。得られた放出オリゴ糖を含む消化液はＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ分析のために直接調製されるか、又はＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ分析のための試料調製の前にＥｎｄｏＨグリコシダーゼで更に消化された。

【0122】

更なる実験では、糖鎖操作ヒト化ＣＵＢ４抗体（ヒト化ＣＵＢ４抗体ＧＥ）抗体６９及び１３５を、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞の代わりにＣＨＯ細胞において、４つのプラスミド、つまり抗体発現のために２つ、融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現のために一つ（ＧｎＴ−ＩＩＩ発現ベクター）、及びマンノシダーゼＩＩ発現のために一つ（ゴルジマンノシダーゼＩＩ発現ベクター）をそれぞれ４：４：１：１の比で同時導入することによって調製した。Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの分析量は５０−１０％であった。

【0123】

実施例４
ヒト化ＣＵＢ４抗体のインビトロＡＤＣＣ
標的細胞ＰＣ−３（ＤＳＭＺ＃ＡＣＣ４６５，前立腺腺癌，ハムＦ１２栄養分混合物＋２ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン＋１０％のＦＣＳで培養）及びＨ３２２Ｍ（非小細胞肺癌，ＲＰＭＩ１６４０＋２ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン＋１０％のＦＣＳで培養）を対数増殖期においてトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ＃２５３００−０５４）で集めた。洗浄工程と細胞数及び生存率をチェックした後、必要とされるアリコートを、カルセイン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃Ｃ３１００ＭＰ；１バイアルを５０μｌのＤＭＳＯに再懸濁させ、５ｍｌの培地中５Ｍｉｏ細胞とした）を用いて細胞インキュベーター中で３７℃で３０分間、標識した。その後、細胞をＡＩＭ−Ｖ培地で３回洗浄し、細胞数と生存率をチェックし、細胞数を０．３Ｍｉｏ／ｍｌに調整した。

【0124】

一方、エフェクター細胞としてＰＢＭＣを、製造者のプロトコル（洗浄工程１×４００ｇ及び２×３５０ｇ、それぞれ１０分）に従って密度勾配遠心法（Histopaque-1077, Sigma # H8889）によって調製した。細胞数と生存率をチェックし、細胞数を１５Ｍｉｏ／ｍｌに調整した。

【0125】

１００μｌのカルセイン染色標的細胞を丸底の９６ウェルプレートに播種し、５０μｌの希釈抗体と５０μｌのエフェクター細胞を添加した。幾つかの実験では、標的細胞を、１０ｍｇ／ｍｌのＲｅｄｉｍｕｎｅ濃度でＲｅｄｉｍｕｎｅ（登録商標）ＮＦ液（ZLB Behring）と混合した。

【0126】

標的及びエフェクター細胞を抗体なしで同時培養し、標的細胞だけの１％のトリトンＸ−１００溶解によって定量した、最大溶解によって決定される自発的溶解がコントロールとされた。プレートは加湿細胞インキュベーターにおいて３７℃で４時間、インキュベートした。

【0127】

標的細胞の死滅は、製造者の指示に従って細胞毒性検出キット（ＬＤＨ検出キット，Roche #1644793）を使用して損傷細胞からのＬＤＨ放出を測定することによって評価した。簡単に言えば、各ウェルからの１００μｌの上清を、透明な平底の９６ウェルプレート中においてキットからの１００μｌの基質と混合した。基質の色反応のＶｍａｘ値を少なくとも１０分間、４９０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダーで定量した。特定の抗体媒介死滅の割合を次のようにして計算した：（（Ａ−ＳＲ）／（ＭＲ−ＳＲ）×１００、ここでＡは特定の抗体濃度におけるＶｍａｘの平均、ＳＲは自発的放出のＶｍａｘの平均、ＭＲは最大放出のＶｍａｘの平均である。
更なる読み取りとして、インタクトな標的細胞のカルセイン保持を、ボレートバッファー（５ｍＭのホウ酸ナトリウム＋０．１％のトリトン）に残りの標的細胞を可溶化し、蛍光プレートリーダーでカルセイン蛍光を測定することによって評価した。

【0128】

図４は、キメラ糖鎖操作（ＧＥ）ＣＵＢ４及び野生型（ｗｔ＝非糖鎖操作キメラＣＵＢ４抗体及び負のヒトＩｇＧコントロールのＡＤＣＣと比較した、６５％以下のフコース量の糖鎖操作（ＧＥ）ヒト化ＣＵＢ４抗体番号６９ＧＥのインビトロＡＤＣＣを示している。

【0129】

実施例５
ＤＵ−１４５細胞におけるＣＤＣＰ１リン酸化の刺激
６ウェル当たり２×１０^５のＤｕ−１４５細胞をＤＭＥＭ（Ｐａａカタログ番号Ｅ１５−００１１）２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｇ７５１３、２ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０％のＦＣＳ（ＰＡＡカタログ番号Ｅ１５−００１１）中で一晩培養した。細胞を２０μｇ／ｍｌの異なったヒト化ＣＵＢ４抗体と共に１０分間インキュベートした。細胞を、新鮮に調製した氷冷ＲＩＰＡ溶解バッファー（ＲＩＰＡ−Ｐｕｆｆｅｒ １％のＮＰ４０、１％のＤＯＣ、０．１％のＳＤＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭｍのＴｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ７．４、エタノール中１ｍＭのＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍＬアプロチニン、０．４ｍＭのバナジン酸塩）で溶解した。氷上で１０分後、細胞可溶化物を１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。可溶化物を標準的なプロトコルによってＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウェスタンブロット法によってニトロセルロースに移した。ウェスタンブロットは抗ホスホチロシン抗体（４Ｇ１０）又は抗ホスホＣＤＣＰ１抗体によって検出した。リン酸化ＣＤＣＰ１の強度を濃度測定スキャニング（Biorad GS 800 濃度計）によって決定した。

全てのヒト化ＣＵＢ４抗体番号８０、番号６９、４７及び１３５はＤＵ−１４５細胞においてＣＤＣＰ１リン酸化の刺激を示した。

【0130】

実施例６
ヒト化ＣＵＢ４抗体のインビトロ腫瘍阻害
Ａ）研究名：ＣＤＣＰ１＿ＰＺ＿Ｈ３２２Ｍ＿００７
本インビボ研究は、ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ非小細胞肺癌モデルにおけるＣＵＢ４抗体のヒト化型とのキメラ抗ＣＤＣＰ１抗体ＣＵＢ４の効能を比較するために実施した。
Ｈ３２２Ｍ非小細胞肺癌細胞はＮＣＩコレクションから取得した。腫瘍細胞株は５％ＣＯ２の水飽和雰囲気下３７℃で、１０％の仔ウシ血清及び２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で常套的に培養した。継代４を細胞移植に使用した。
ヒト非小細胞肺癌細胞株Ｈ３２２Ｍをマウスの右側腹部中にマトリゲルと共に皮下的に接種した（５×１０^６細胞）。
動物処置は細胞移植から１９日後のランダム化の日に開始した。抗体は、２５ｍｇ／ｋｇの示された投薬量で実験１９、２６、３３、４０、及び４７日目に腹腔内でｑ７ｄで投与した。また対応するビヒクルを同じ日に投与した。投与体積は１０ｍｌ／ｋｇであった。
ヒト化ＣＵＢ４抗体番号６９は、配列番号：３及び配列番号：１５のＶＨ及びＶＬに基づく。
ヒト化ＣＵＢ４抗体番号１３５は、配列番号：３及び配列番号：２３のＶＨ及びＶＬに基づく。

【0131】

群：
処置群１：ビヒクル
処置群２：キメラＣＵＢ４（２５ｍｇ／ｋｇ腹腔内）；
処置群３：ヒト化ＣＵＢ４抗体番号６９（２５ｍｇ／ｋｇ腹腔内）；
処置群４：ヒト化ＣＵＢ４抗体番号１３５（２５ｍｇ／ｋｇ腹腔内）；
図５ａにおいて、ヒト化ＣＵＢ４抗体番号６９及び番号１３５及びキメラＣＵＢ４抗体のヒト肺癌Ｈ３２２Ｍ異種移植片におけるインビボ腫瘍増殖阻害は、キメラＣＵＢ４抗体と比較してヒト化ＣＵＢ４抗体番号６９及び番号１３５の双方のインビボ腫瘍増殖阻害の明らかな改善を示した。

【0132】

Ｂ）研究名：ＣＤＣＰ１＿ＰＺ＿Ｈ３２２Ｍ＿００４
本インビボ研究は、ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ非小細胞肺癌モデルにおけるキメラ抗ＣＤＣＰ１抗体ＣＵＢ４（ヒトＩｇＧ１定常領域を有するマウスＶＨ及びＶＬ）とのマウス抗ＣＤＣＰ１抗体ＣＵＢ４の効能を比較するために実施した。
Ｈ３２２Ｍ非小細胞肺癌細胞はＮＣＩコレクションから取得した。腫瘍細胞株は５％ＣＯ２の水飽和雰囲気下３７℃で、１０％の仔ウシ血清及び２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で常套的に培養した。継代４を細胞移植に使用した。
ヒト非小細胞肺癌細胞株Ｈ３２２Ｍをマウスの右側腹部中にマトリゲルと共に皮下的に接種した（５×１０^６細胞）。
動物処置は細胞移植から１７日後のランダム化の日に開始した。抗体は、１０ｍｇ／ｋｇの示された投薬量で５９日目の実験終了まで腹腔内でｑ７ｄで投与した。また対応するビヒクルを同じ日に投与した。投与体積は１０ｍｌ／ｋｇであった。

【0133】

群：
処置群１：ビヒクル
処置群４：マウスＣＵＢ４（１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）
処置群５：キメラＣＵＢ４（１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）
図５ｂにおいて、マウスＣＵＢ４抗体及びキメラＣＵＢ４抗体のヒト肺癌Ｈ３２２Ｍ異種移植片におけるインビボ腫瘍増殖阻害は、マウスＣＵＢ４抗体と比較してキメラＣＵＢ４抗体のインビボ腫瘍増殖阻害の改善が示される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5a】

【図5b】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]