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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5649224
(24)【登録日】2014年11月21日
(45)【発行日】2015年1月7日
(54)【発明の名称】グルクロン酸含有グルカン、その製造法および利用
(51)【国際特許分類】
C12P 19/04 20060101AFI20141211BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20141211BHJP
C08B 37/00 20060101ALI20141211BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20141211BHJP
A61K 47/48 20060101ALI20141211BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20141211BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20141211BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20141211BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20141211BHJP
C12N 9/12 20060101ALN20141211BHJP
【ＦＩ】
C12P19/04 ZZNA
C12N15/00 A
C08B37/00 Z
A61K47/36
A61K47/48
A61K9/51
A61K45/00
A61K49/00 A
A61K9/127
!C12N9/12
【請求項の数】28
【全頁数】70
(21)【出願番号】特願2011-512316(P2011-512316)
(86)(22)【出願日】2010年5月10日
(86)【国際出願番号】JP2010003182
(87)【国際公開番号】WO2010128601
(87)【国際公開日】20101111
【審査請求日】2013年4月3日
(31)【優先権主張番号】特願2009-113754(P2009-113754)
(32)【優先日】2009年5月8日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000000228
【氏名又は名称】江崎グリコ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100062409
【弁理士】
【氏名又は名称】安村 高明
(72)【発明者】
【氏名】門川 淳一
(72)【発明者】
【氏名】鷹羽 武史
(72)【発明者】
【氏名】久保 亜希子
(72)【発明者】
【氏名】柳瀬 美千代
(72)【発明者】
【氏名】細谷 佳代
【審査官】
櫛引 明佳
(56)【参考文献】
【文献】
特開２００５−０１５６８０（ＪＰ，Ａ）
【文献】
DEAN, Brian et al.，Identification of UGT2B9*2 and UGT2B33 isolated from female rhesus monkey liver，Archives of Biochemistry and Biophysics，２００４年，Vol.426，p.55-62
【文献】
NAWAJI Mutsuki et al.，Enzymatic α-glucosaminylation of maltooligosaccharides catalyzed by phosphorylase，Carbohydr Research，２００８年，Vol.343，p.2692-2696
【文献】
NAWAJI Mutsuki at al.，Enzymatic Synthesis of α-D-Xylosylated Malto-oligosaccharides by Phosphorylase-catalyzed Xylosylati，Journal of Carbohydrate Chemistry，２００８年，Vol.27，p.214-222
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｐ １９／００
Ｃ０８Ｂ ３７／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
グルカンの少なくとも１つの非還元末端にグルクロン酸残基が結合しているが、非還元末端以外の位置にはグルクロン酸残基が存在しないグルクロン酸含有グルカンであって、該グルカンが分岐状α−１，４グルカンまたは直鎖状α−１，４グルカンである、グルクロン酸含有グルカン。
【請求項2】
前記グルカンが分岐状α−１，４グルカンであり、該分岐状α−１，４グルカンの複数の非還元末端のうちの少なくとも１つの非還元末端にグルクロン酸残基が結合している請求項１に記載のグルクロン酸含有グルカン。
【請求項3】
前記分岐状α−１，４グルカンが分岐マルトオリゴ糖、デンプン、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、酵素合成分岐グルカン及び高度分岐環状デキストリンからなる群より選択される請求項２に記載のグルクロン酸含有グルカン。
【請求項4】
請求項１に記載のグルクロン酸含有グルカンの水酸基修飾物であって、該修飾が、前記グルカンのアルコール性水酸基の一部又は全てへの修飾であり、該修飾が、ヒドロキシアルキル化、アルキル化、アセチル化、カルボキシメチル化、硫酸化及びリン酸化からなる群より独立して選択される、水酸基修飾物。
【請求項5】
請求項１に記載のグルクロン酸含有グルカン又はその水酸基修飾物の還元末端修飾物。
【請求項6】
請求項１に記載のグルクロン酸含有グルカン、その水酸基修飾物又はそれらの還元末端修飾物のカルボキシル基修飾物であって、該修飾が、前記グルクロン酸残基のカルボキシル基の一部又は全てへの修飾であり、該修飾が該カルボキシル基とカルボキシル基修飾試薬との反応により得られたものであり、該カルボキシル基修飾試薬は、少なくとも１つのアミン基および少なくとも１つの別の官能基を有する、カルボキシル基修飾物。
【請求項7】
前記官能基が、カチオン性官能基またはアニオン性官能基である、請求項６に記載のカルボキシル基修飾物。
【請求項8】
前記官能基が、疎水性官能基である、請求項６に記載のカルボキシル基修飾物。
【請求項9】
前記官能基が、マレイミド基、チオール基及びアルデヒド基からなる群より選択される、請求項６に記載のカルボキシル基修飾物。
【請求項10】
前記カルボキシル基修飾試薬が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ,Ｎ−ジスクシンイミドカーボネート、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２,３−ジカルボキシイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、イソブチルクロロホルメートおよび４−ヒドロキシフェニルジメチルスルホニウム・メチルスルフェートからなる群より選択される、請求項６に記載のカルボキシル基修飾物。
【請求項11】
グルカンとグルクロン酸−１−リン酸を含む水溶液に、グルクロン酸−１−リン酸、グルカン、およびグルクロン酸残基をグルカンの非還元末端に転移する反応を触媒し得るα−グルカンホスホリラーゼを作用させることを特徴とするグルクロン酸含有グルカンの製造方法。
【請求項12】
α−グルカンホスホリラーゼが、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有しかつグルクロン酸をグルカンの非還元末端に転移する活性を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
請求項１に記載のグルクロン酸含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのカルボン酸基修飾物と、薬効成分とを含む、医薬品。
【請求項14】
前記薬効成分が、低分子量有機化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、受容体、受容体フラグメント、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびＲＮＡアプタマーからなる群より選択される、請求項１３に記載の医薬品。
【請求項15】
請求項１に記載のグルクロン酸含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのカルボン酸基修飾物と、薬効成分との結合体であって、該薬効成分は、前記グルクロン酸残基のカルボキシル基のうちの少なくとも１つと、直接共有結合しているか、又はスペーサーを介して結合している、結合体。
【請求項16】
請求項１に記載のグルクロン酸含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのカルボン酸基修飾物を含む、臨床診断用組成物。
【請求項17】
請求項１に記載のグルクロン酸含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのカルボン酸基修飾物を含む、医薬品ＤＤＳ用微小粒子状キャリア。
【請求項18】
前記医薬品ＤＤＳ用微小粒子状キャリアが、リポソーム、ウイルス粒子、高分子ミセルおよび疎水化高分子ナノゲルからなる群より選択される、請求項１７に記載のキャリア。
【請求項19】
請求項１に記載のグルクロン酸含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのカルボン酸基修飾物を含有する臨床診断用造影剤。
【請求項20】
式５からなる構造を有するグルクロン酸含有グルカン：
ここでｍは１以上の整数であり、Ｒ１は独立して、Ｈ、式Ａの構造を有するグルカン鎖または式Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、
式Ａにおいて、ｋは１以上の整数であり、Ｒ２は独立して、Ｈ、式Ａの構造を有するグルカン鎖または式Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、
式Ｂにおいて、ｓは１以上の整数であり、Ｒ３は独立して、Ｈ、式Ａの構造を有するグルカン鎖または式Ｂの構造を有するグルカン鎖である、グルクロン酸含有グルカン。
【化31】
ここでｍは１以上の整数であり、Ｒ１は独立して、Ｈ、式Ａの構造を有するグルカン鎖または式Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、
【化32】
式Ａにおいて、ｋは１以上の整数であり、Ｒ２は独立して、Ｈ、式Ａの構造を有するグルカン鎖または式Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、
【化33】
式Ｂにおいて、ｓは１以上の整数であり、Ｒ３は独立して、Ｈ、式Ａの構造を有するグルカン鎖または式Ｂの構造を有するグルカン鎖である、グルクロン酸含有グルカン。
【請求項21】
式６からなる構造を有する、グルクロン酸含有グルカン又はグルクロン酸含有グルカン水酸基修飾物：
ここでｍは１以上の整数であり、Ｒ１は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、
式６Ａにおいて、ｋは１以上の整数であり、Ｒ２は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、
式６Ｂにおいて、ｓは１以上の整数であり、Ｒ３は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、
式６、式６Ａおよび式６Ｂにおいて、Ｒ４は、水素、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基およびリン酸基からなる群から独立して選択される、グルクロン酸含有グルカンまたはグルクロン酸含有グルカン水酸基修飾物。
【化34】
ここでｍは１以上の整数であり、Ｒ１は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、
【化35】
式６Ａにおいて、ｋは１以上の整数であり、Ｒ２は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、
【化36】
式６Ｂにおいて、ｓは１以上の整数であり、Ｒ３は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、
式６、式６Ａおよび式６Ｂにおいて、Ｒ４は、水素、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基およびリン酸基からなる群から独立して選択される、グルクロン酸含有グルカンまたはグルクロン酸含有グルカン水酸基修飾物。
【請求項22】
式７からなる構造を有する、グルクロン酸含有グルカン、グルクロン酸含有グルカン水酸基修飾物又はそれらの還元末端修飾物：
ここでｍは１以上の整数であり、Ｒ１は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、
式６Ａにおいて、ｋは１以上の整数であり、Ｒ２は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、
式６Ｂにおいて、ｓは１以上の整数であり、Ｒ３は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、
式７、式６Ａおよび式６Ｂにおいて、Ｒ４は、水素、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基およびリン酸基からなる群から独立して選択され、
式７において、Ｘは、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体およびアミン基含有低分子量物質からなる群より独立して選択される、グルクロン酸含有グルカン、グルクロン酸含有グルカン水酸基修飾物又はそれらの還元末端修飾物。
【化37】
ここでｍは１以上の整数であり、Ｒ１は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、
【化38】
式６Ａにおいて、ｋは１以上の整数であり、Ｒ２は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、
【化39】
式６Ｂにおいて、ｓは１以上の整数であり、Ｒ３は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、
式７、式６Ａおよび式６Ｂにおいて、Ｒ４は、水素、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基およびリン酸基からなる群から独立して選択され、
式７において、Ｘは、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体およびアミン基含有低分子量物質からなる群より独立して選択される、グルクロン酸含有グルカン、グルクロン酸含有グルカン水酸基修飾物又はそれらの還元末端修飾物。
【請求項23】
Ｘが、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコン酸、ソルビトール、スクロース、トレハロース、シクロデキストリン、環状デキストリン、環状アミロース、デンプン、セルロース、キチン、キトサン、デキストラン、タンパク質、ペプチド、リン脂質、脂肪酸、界面活性剤、アスコルビン酸グルコシド、ハイドロキノングルコシド、ヘスペリジングルコシド、ルチングルコシド、パラニトロフェニルマルトペンタオース、ドデシルマルトース、フラボノイド配糖体類、テルペン配糖体類、フェノール配糖体類、カルコン配糖体類、ステロイド配糖体類、アミノ酸及びドデシルアミンからなる群より選択される、請求項２２に記載のグルクロン酸含有グルカン、グルクロン酸含有グルカン水酸基修飾物又はそれらの還元末端修飾物。
【請求項24】
式８からなる構造を有する、グルクロン酸含有グルカン、グルクロン酸含有グルカン水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのカルボキシル基修飾物：
ここでｍは１以上の整数であり、Ｒ１は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖、式８Ａの構造を有するグルカン鎖、または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、
式６Ａにおいて、ｋは１以上の整数であり、Ｒ２は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖、式８Ａの構造を有するグルカン鎖、または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、
式８Ａにおいて、ｐは１以上の整数であり、Ｒ５は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖、式８Ａの構造を有するグルカン鎖、または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、
式６Ｂにおいて、ｓは１以上の整数であり、Ｒ３は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖、式８Ａの構造を有するグルカン鎖、または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、
式８、式６Ａ、式８Ａ、および式６Ｂにおいて、Ｒ４は、水素、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基からなる群から独立して選択され、
式８において、Ｘは、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体およびアミン基含有低分子量物質からなる群より独立して選択され、
式８及び式８Ａにおいて、Ｙは、薬効成分との結合のために導入される置換基であり、Ｙは、カルボキシル基修飾試薬との反応により得られ、該カルボキシル基修飾試薬は、少なくとも１つのアミン基および少なくとも１つの別の官能基を有する、グルクロン酸含有グルカン、グルクロン酸含有グルカン水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのカルボキシル基修飾物。
【化40】
ここでｍは１以上の整数であり、Ｒ１は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖、式８Ａの構造を有するグルカン鎖、または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、
【化41】
式６Ａにおいて、ｋは１以上の整数であり、Ｒ２は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖、式８Ａの構造を有するグルカン鎖、または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、
【化42】
式８Ａにおいて、ｐは１以上の整数であり、Ｒ５は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖、式８Ａの構造を有するグルカン鎖、または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、
【化43】
式６Ｂにおいて、ｓは１以上の整数であり、Ｒ３は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖、式８Ａの構造を有するグルカン鎖、または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、
式８、式６Ａ、式８Ａ、および式６Ｂにおいて、Ｒ４は、水素、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基からなる群から独立して選択され、
式８において、Ｘは、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体およびアミン基含有低分子量物質からなる群より独立して選択され、
式８及び式８Ａにおいて、Ｙは、薬効成分との結合のために導入される置換基であり、Ｙは、カルボキシル基修飾試薬との反応により得られ、該カルボキシル基修飾試薬は、少なくとも１つのアミン基および少なくとも１つの別の官能基を有する、グルクロン酸含有グルカン、グルクロン酸含有グルカン水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのカルボキシル基修飾物。
【請求項25】
前記官能基が、カチオン性官能基またはアニオン性官能基である、請求項２４に記載のグルクロン酸含有グルカン、グルクロン酸含有グルカン水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのカルボキシル基修飾物。
【請求項26】
前記官能基が、疎水性官能基である、請求項２４に記載のグルクロン酸含有グルカン、グルクロン酸含有グルカン水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのカルボキシル基修飾物。
【請求項27】
前記官能基が、マレイミド基、チオール基及びアルデヒド基からなる群より選択される、請求項２４に記載のグルクロン酸含有グルカン、グルクロン酸含有グルカン水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのカルボキシル基修飾物。
【請求項28】
前記カルボキシル基修飾試薬が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ,Ｎ−ジスクシンイミドカーボネート、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２,３−ジカルボキシイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、イソブチルクロロホルメートおよび４−ヒドロキシフェニルジメチルスルホニウム・メチルスルフェートからなる群より選択される、請求項２４に記載のグルクロン酸含有グルカン、グルクロン酸含有グルカン水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのカルボキシル基修飾物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、非還元末端にウロン酸残基を有するグルカン、その修飾物及び結合体、ならびにそれらの製造方法および利用に関する。より詳細には、本発明は、非還元末端にグルクロン酸残基を有するグルカン、その修飾物及び結合体、ならびにそれらの製造方法および利用に関する。【背景技術】
【0002】
多糖は、古くから食品原料として使用されているが、近年では環境にやさしい高分子材料として、生体適合性を有する安全な素材として、さらには機能性材料として注目を浴びるようになってきている。多糖は、デンプン、セルロース、デキストリンなどに代表される中性多糖；アルギン酸、ヒアルロン酸などに代表される酸性多糖；キトサンに代表される塩基性多糖に分類することができる。酸性糖及び塩基性糖の有無及びそれらの存在比は多糖の物性及び機能に大きな影響を及ぼすことがわかっている。このなかでも特に酸性多糖は食品、化粧品、医薬品などに幅広く利用されており、新たな構造又は機能を有する酸性多糖が期待されていた。【0003】
新たな酸性多糖を見出すために従来用いられた方法は、自然界から新規酸性多糖を探し出す方法、あるいは既存の多糖に化学的手法でカルボキシル基又は硫酸基を結合させる方法であった。しかしながら自然界には非還元末端にウロン酸残基が結合しているウロン酸含有グルカンは見出されておらず、また化学的方法を用いても、非還元末端のみにウロン酸残基が結合しているウロン酸含有グルカンの合成は容易ではなく、非還元末端のみにウロン酸残基が結合しているウロン酸含有グルカンの化学合成は示唆も開示もされていなかった。【0004】
Ｎ−オキシル化合物の触媒存在下で多糖類の酸化反応を行い、水溶性のポリウロン酸を得る手法が公知である。この酸化方法は、多糖類の水分散系または溶解系で２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシラジカル（ＴＥＭＰＯ）などのＮ−オキシル化合物と次亜塩素酸ナトリウムなどの共酸化剤を用いて系内でオキソアンモニウム塩を順次生成しながら多糖類を酸化するというものである（特許文献１〜３）。上記方法は、デンプン、プルランなどの水溶性多糖類のほか、セルロースなどの難溶性多糖類にも適用されている。しかしながらこの方法では、多糖内部のグルコース残基がランダムに酸化されるため、非還元末端のみにグルクロン酸残基を含有する多糖を得ることはできない。【0005】
非還元末端にグルクロン酸残基を有する物質としては、グリチルリチンやバイカリンなどの天然に存在する各種配糖体、あるいは動物の体内における解毒作用として行われるグルクロン酸抱合により生ずる配糖体などが公知である。しかしながらこれらはアグリコンにグルクロン酸が結合したいわゆる配糖体であり、α−１，４−グルカンを含んでいない。【0006】
α−グルカンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．１）は、グルコース−１−リン酸（Ｇｌｃ−１−Ｐ）に作用し、グルコース残基を受容体グルカンの非還元末端に転移する反応（及びその逆反応）を触媒する酵素である。この反応を以下の式に示す；ここで、Ｇｌｕｃａｎ ｐｒｉｍｅｒは受容体グルカンであり、Ｇｌｕｃａｎ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅはα−グルカンホスホリラーゼである。１分子のグルコース残基が転移することによって得られたグルカンは再度受容体として作用することができ、転移反応が繰り返される。その結果、最終的に得られるグルカンは高分子量のグルカンとなり得る。【0007】
【化1】
【0008】
α−グルカンホスホリラーゼは、ほぼすべての生物に分布するユビキタスな酵素の一つであり、極めて多種類のα−グルカンホスホリラーゼが知られている。反応機構が最もよく研究されているα−グルカンホスホリラーゼは、馬鈴薯由来のα−グルカンホスホリラーゼである。【0009】
近年、馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼが、グルコース−１−リン酸（Ｇ−１−ＰまたはＧｌｃ−１−Ｐとも記載する）のアナログを基質としうることが報告された。非特許文献１は、馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼがキシロース−１−リン酸（Ｘｙｌ−１−Ｐ）を基質として利用して、キシロース残基をマルトオリゴ糖の非還元末端に転移できることを開示している。非特許文献２は、馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼがグルコサミン−１−リン酸（ＧｌｃＮ−１−Ｐ）を基質として利用して、グルコサミン残基をマルトオリゴ糖の非還元末端に転移できることを開示している。Ｇ−１−ＰおよびＧ−１−Ｐアナログを以下の化学式に示す：【0010】
【化2】
【0011】
一方、非特許文献３は、グルコース−１−リン酸の６位が酸化された物質であるグルクロン酸−１−リン酸（ＧｌｃＡ−１−Ｐ）が、ＴＥＭＰＯ触媒を用いたグルコース−１−リン酸の化学的酸化により合成可能であることを開示している。本発明者らは、グルクロン酸−１−リン酸にα−グルカンホスホリラーゼを作用させ、受容体グルカンの非還元末端に、グルクロン酸残基を転移することを意図して、馬鈴薯α−グルカンホスホリラーゼを含む数種のα−グルカンホスホリラーゼを試したが、期待するグルクロン酸含有グルカンを製造することは出来なかった。【0012】
医薬品の薬効成分は、化学合成された安定な低分子量化合物から、タンパク質、抗体、核酸などの血中で分解しやすい不安定な物質へと急激に変化している。そのため、これらの不安定な薬効成分を安定化して薬効成分の血中濃度を高く保つ必要が生じている。また薬物の副作用を低減させるために、薬物を効率よくターゲット組織に送達する必要が高まっている。このような背景の下、いわゆるドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）技術（すなわち、薬効成分を望ましいターゲットに、望ましい濃度で、望ましい時間送り込む技術）が本格的に利用されるようになってきている（非特許文献４〜７）。【0013】
医薬品のＤＤＳ技術においては、薬効成分の改質材料が重要である。本明細書中で用語「改質材料」とは、薬効成分と共有結合させることにより、あるいは非共有結合的な相互作用を介して、薬効成分を改質する材料をいう。改質材料を利用することにより、薬効成分の種々の特性（例えば、体内動態（例えば、吸収、分布、代謝および排泄）、薬理効果、安定性など）を改質することが出来る。従来薬効成分の改質材料として使用されている物質にはさまざまなものがあるが、最も汎用されているのが高分子材料である。たとえば合成高分子であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびその誘導体は医薬品の改質材料として広範囲に利用されている。ＰＥＧ鎖の末端に薬効成分結合用官能基を有する医薬品改質材料が多数開発されており、そのような改質材料は実際に医薬品として利用されている。具体的な応用例としてはＰＥＧ化インターフェロンα（製品名：ペガシス）が挙げられる。インターフェロンαは分子量が小さく、容易に尿に排泄されるため、血中半減期が短いことが問題であった。しかし、インターフェロンαを分子量４万のＰＥＧ鎖に共有結合させて高分子量のインターフェロンα結合体とすることにより、血中半減期を飛躍的に高めることに成功している。【0014】
薬効成分の改質材料は、薬効成分を直接改質するためだけでなく、リポソームなど他の医薬品ＤＤＳ用微小粒子状キャリアを改質するためにも利用できる。改質されていないリポソームは血中を循環する間に細網内皮系組織（ＲＥＳ）の貪食細胞により捕捉され、リポソームの血中濃度は速やかに低下する。しかしリポソームの表面にＰＥＧ鎖を結合させたＰＥＧ化リポソーム（ステルスリポソームともいう）は、ＲＥＳに取り込まれにくく、血中に長時間循環滞留する特性を有する。抗がん剤であるドキソルビシンを封入したステルスリポソーム製剤は、ＤＯＸＩＬ（登録商標）（ヨーロッパではＣＡＥＬＹＸ（登録商標））という商品名で販売されている。ＤＯＸＩＬ（登録商標）は７０〜１００ｎｍの粒径をもつリポソームであり、分散された水溶液の状態で供給されており、静脈内投与される。カポジ肉腫ＡＩＤＳ患者に、ＤＯＸＩＬ（登録商標）を投与したときの消失半減期は約４５時間と長く、投与後７２時間のカポジ肉腫中濃度は、ドキソルビシン単独の場合と比べて約５倍高いという結果が得られている。【0015】
このように、高分子材料による、薬効成分又はＤＤＳ用微小粒子状キャリアの改質には顕著な効果が認められている。しかし一方で問題点も指摘されている。例えば、生体内での分解性がなく、かつ腎臓糸球体濾過を受けない高分子量の合成高分子を血中に投与すると、その高分子が特定の臓器へ集積するリスク及びその集積に起因する副作用発生のリスクがある。これは、血中に存在する分子量数万以下の分子は、腎臓の糸球体濾過を受けてすみやかに尿中に排泄されるが、分子量数万以上の分子は、腎臓の糸球体濾過を受けず、尿への排泄が制限されるためである。そのため、安全に利用できる薬効成分の改質材料が期待されている。【先行技術文献】
【特許文献】
【0016】
【特許文献1】特開２００６−１２４５９８号公報
【特許文献2】特開２００５−１５６８０号公報
【特許文献3】特開平１０−２５１３０２号公報
【非特許文献】
【0017】
【非特許文献1】Ｎａｗａｊｉら、Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．２００８、２７、２１４−２２２
【非特許文献2】Ｎａｗａｊｉら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２００８、３４３、２６９２−２６９６
【非特許文献3】Ｈｅｅｒｅｓら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９９７、２９９、２２１−２２７
【非特許文献4】岡田弘晃、「機能性ＤＤＳキャリアの製剤設計」第１章 総論：機能性ＤＤＳキャリアを用いた製剤設計による創薬、シーエムシー出版、２００８、１−２３
【非特許文献5】横山昌幸、「薬物キャリアに用いられる高分子材料 特集 ＤＤＳに利用される高分子化学」、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ ２３−６，２００８：６１０−６１７
【非特許文献6】Ｍａｒｉａ Ｌａｕｒａ Ｉｍｍｏｒｄｉｎｏら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ２００６：１（３）２９７−３１５
【非特許文献7】Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ ＨａｒｒｉｓおよびＲｏｂｅｒｔ Ｂ．Ｃｈｅｓｓ，ＮＡＴＵＲＥ ＲＥＶＩＥＷＳ，ＤＲＵＧ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＶＯＬＵＭＥ ２，ＭＡＲＣＨ ２００３，２１４−２２１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0018】
本発明は、上記問題点の解決を意図するものである。【0019】
安全に利用可能な、理想的な薬効成分の改質材料は、以下のような特徴を有しているものと考えられる。【0020】
（１）薬効成分と結合又は相互作用できる官能基を備えている高分子材料であること；（２）生体内で分解され得る高分子材料であり、投与後は体内に通常存在する成分にまで分解されるか又は完全に体外へ排泄されて体内に蓄積しないこと；
（３）医薬品に使用できる程度に安定した品質を備えていること。すなわち、構造が特定でき、毎回同じ品質のものを製造できること。
【0021】
本発明者らは、薬効成分の改質材料として最も優れている高分子物質はグルカン（本明細書においてグルカンとは、α−１，４−グルカン、及びα−１，６−結合により分岐したα−１，４−グルカンをいう）であると考えた。動物及び植物が貯蔵用多糖として体内に蓄積するグリコーゲン又は澱粉はグルカンの一種であることから、ヒトの体内常在成分であり、生体適合性に優れている。さらに、グルカンは、体内のα−アミラーゼによる加水分解を受けて、体内常在成分であるグルコース又はマルトオリゴ糖になる。そのため、グルカンは、最も安全な高分子材料といえる。【0022】
グルカンはその構造の設計が容易であることも有利な点である。グルカンの構造を人為的に加工することも容易である。グルカンの分子量、分岐の程度、環状化などを制御する方法が公知である。グルコース残基がα−１，４−結合のみで結合している完全直鎖状のグルカン、一部のグルコース残基がα−１，６−結合により結合していることにより高頻度に分岐したグルカンなどが入手できる。分岐グルカンにおいては、α−１，６−結合がひとつ増えるたびに、新たな非還元末端がひとつ生ずることになる。このため、高頻度に分岐した分岐グルカン分子は、非常にたくさんの非還元末端を有する。α−１，６−結合の数はグルカン分子の合成の際に所望に応じて適切に調節することが可能である。このようにグルカンは構造がカスタマイズ可能である点も、薬効成分の改質材料として使用する上で有利に作用するものと考えられる。【0023】
一方、グルカンを薬効成分の改質材料として利用する上での最大の課題は、薬効成分と結合又は相互作用できる官能基を備えていない点である。グルカン中に多数存在する水酸基に対して、化学反応によりカチオン性又はアニオン性の官能基を導入することは可能である。しかし、このような手法を用いる場合、官能基の導入位置はランダムであり、同一品質のものを得ることが困難であり、医薬品への利用には好ましくない。さらに、化学的に置換基が導入されたグルカンはアミラーゼによる分解が抑制されること、分解によって生じる、置換を受けたグルコースは、通常体内に存在する成分ではなく、安全性への懸念が生じてしまうことなどの問題もある。【0024】
本発明者らは、グルクロン酸をグルカン鎖の非還元末端に導入することが、最も理想的なグルカンの改質方法であると考えた。グルクロン酸はカルボキシル基を有する単糖であり、体内に通常存在する成分であり、安全性への懸念がないからである。グルクロン酸のカルボキシル基は、薬効成分との結合又は相互作用に利用可能である。グルカンの非還元末端に、グルクロン酸を選択的に導入できれば、導入位置がランダムではないため、同一品質のものを再現性よく製造可能であり、医薬品への利用に適している。グルカンへのグルクロン酸残基の導入量を増やしたい場合には、分岐頻度の高いグルカンを使用することなどにより導入量の調整が可能である。さらに、導入位置が末端であるため、グルカンのα−アミラーゼでの分解性にも影響はないと考えられる。高度に分岐した分岐グルカンの場合、非還元末端はグルカン分子の最外層に分布しているので、導入されたグルクロン酸残基は、グルクロン酸残基導入後のグルカン分子の最外層に分布し、薬効成分との相互作用や結合に理想的となると考えられる。このように、非還元末端に選択的にグルクロン酸残基が結合したグルカンは、優れた薬効成分の改質材料になりうる可能性を有している。しかしながら、非還元末端にグルクロン酸残基が結合したグルカンを製造する方法は知られておらず、その機能を確認することも出来ていなかった。それゆえ、本発明者らは、グルカンの非還元末端に選択的に官能基を導入する技術を探索していた。【課題を解決するための手段】
【0025】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究したところ、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来のα−グルカンホスホリラーゼが、その本来の基質ではないグルクロン酸−１−リン酸に作用し、グルクロン酸残基を直鎖状グルカンの非還元末端に１分子のみ転移する反応を触媒できることを見出し、これに基づいて本発明を完成させた（例えば、図１参照）。さらに本発明者らは、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来のα−グルカンホスホリラーゼが、グルクロン酸−１−リン酸に作用し、グルクロン酸残基を分岐状グルカンの１つ以上の非還元末端に転移する反応を触媒できることを見出し、これに基づいて本発明を完成させた（例えば、図２参照）。【0026】
本発明は、新規なウロン酸含有グルカン、その修飾物およびそれらの結合体を開発することを目的とする。本発明のウロン酸含有グルカン、その修飾物およびそれらの結合体は、非還元末端のみにウロン酸残基が結合している。本発明のグルクロン酸含有グルカン、その修飾物およびそれらの結合体は、非還元末端のみにグルクロン酸残基が結合している。本発明においては、α−グルカンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．１）を用いてグルクロン酸残基の転移を行っている。このため、グルカンへのグルクロン酸残基の結合はα結合である。従来アグリコンへグルクロン酸を転移可能な酵素としては、ＥＣ２．４．１．１７に分類されるグルクロノシルトランスフェラーゼ（Ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＵＤＰ−ｇｌｕｃｕｒｏｎａｔｅ β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）がよく知られているが、グルクロノシルトランスフェラーゼはグルクロン酸残基をβ結合でアグリコンへ転移する酵素である。そのため、本発明の方法で使用するα−グルカンホスホリラーゼとは、グルクロン酸残基をアグリコンへ結合する際の立体配置が異なる。さらに、グルクロノシルトランスフェラーゼはマルトオリゴ糖などのグルカンを受容体にすることができない。そのため、グルクロノシルトランスフェラーゼを使用しても、グルクロン酸残基が結合したグルカンを得ることはできない。従って、α−グルカンホスホリラーゼを使用することによって初めてグルクロン酸含有グルカンを生成することができた。本発明のウロン酸含有グルカン、その修飾物およびそれらの結合体はウロン酸を末端に有するため、グルカン末端が負電荷を帯び、グルカンの物理化学的性質が変化する。本ウロン酸含有グルカン、その修飾物およびそれらの結合体は食品、化粧品、医薬品などに幅広く利用が期待される。【0027】
本発明により、例えば以下が提供される：（項目１） グルカンの少なくとも１つの非還元末端にグルクロン酸残基が結合しているが、非還元末端以外の位置にはグルクロン酸残基が存在しないグルクロン酸含有グルカンであって、該グルカンが分岐状α−１，４グルカンまたは直鎖状α−１，４グルカンである、グルクロン酸含有グルカン。
（項目２） 前記グルカンが分岐状α−１，４グルカンであり、該分岐状α−１，４グルカンの複数の非還元末端のうちの少なくとも１つの非還元末端にグルクロン酸残基が結合している項目１に記載のグルクロン酸含有グルカン。
（項目３） 前記分岐状α−１，４グルカンが分岐マルトオリゴ糖、デンプン、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、酵素合成分岐グルカン及び高度分岐環状デキストリンからなる群より選択される項目２に記載のグルクロン酸含有グルカン。
（項目４） 項目１〜３のいずれか１項に記載のグルクロン酸含有グルカンの水酸基修飾物であって、該修飾が、前記グルカンのアルコール性水酸基の一部又は全てへの修飾であり、該修飾が、ヒドロキシアルキル化、アルキル化、アセチル化、カルボキシメチル化、硫酸化及びリン酸化からなる群より独立して選択される、水酸基修飾物。
（項目５） 項目１〜３のいずれか１項に記載のグルクロン酸含有グルカン又はその水酸基修飾物の還元末端修飾物。
（項目６） 項目１〜３のいずれか１項に記載のグルクロン酸含有グルカン、その水酸基修飾物又はそれらの還元末端修飾物のカルボキシル基修飾物であって、該修飾が、前記グルクロン酸残基のカルボキシル基の一部又は全てへの修飾であり、該修飾が該カルボキシル基とカルボキシル基修飾試薬との反応により得られたものであり、該カルボキシル基修飾試薬は、少なくとも１つのアミン基および少なくとも１つの別の官能基を有する、カルボキシル基修飾物。
（項目７） 前記官能基が、カチオン性官能基またはアニオン性官能基である、項目６に記載のカルボキシル基修飾物。
（項目８） 前記官能基が、疎水性官能基である、項目６に記載のカルボキシル基修飾物。
（項目９） 前記官能基が、マレイミド基、チオール基及びアルデヒド基からなる群より選択される、項目６に記載のカルボキシル基修飾物。
（項目１０） 前記カルボキシル基修飾試薬が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ,Ｎ−ジスクシンイミドカーボネート、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２,３−ジカルボキシイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、イソブチルクロロホルメートおよび４−ヒドロキシフェニルジメチルスルホニウム・メチルスルフェートからなる群より選択される、項目６に記載のカルボキシル基修飾物。
（項目１１） グルカンとグルクロン酸−１−リン酸を含む水溶液にα−グルカンホスホリラーゼを作用させることを特徴とするグルクロン酸含有グルカンの製造方法。
（項目１２） α−グルカンホスホリラーゼが、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有しかつグルクロン酸をグルカンの非還元末端に転移する活性を有する、項目１１に記載の方法。
（項目１３） 項目１〜３のいずれか１項に記載のグルクロン酸含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのカルボン酸基修飾物と、薬効成分とを含む、医薬品。
（項目１４） 前記薬効成分が、低分子量有機化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、受容体、受容体フラグメント、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびＲＮＡアプタマーからなる群より選択される、項目１３に記載の医薬品。
（項目１５） 項目１〜３のいずれか１項に記載のグルクロン酸含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのカルボン酸基修飾物と、薬効成分との結合体であって、該薬効成分は、前記グルクロン酸残基のカルボキシル基のうちの少なくとも１つと、直接共有結合しているか、又はスペーサーを介して結合している、結合体。
（項目１６） 項目１〜３のいずれか１項に記載のグルクロン酸含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのカルボン酸基修飾物を含む、臨床診断用組成物。
（項目１７） 項目１〜３のいずれか１項に記載のグルクロン酸含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのカルボン酸基修飾物を含む、医薬品ＤＤＳ用微小粒子状キャリア。
（項目１８） 前記医薬品ＤＤＳ用微小粒子状キャリアが、リポソーム、ウイルス粒子、高分子ミセルおよび疎水化高分子ナノゲルからなる群より選択される、項目１７に記載のキャリア。
（項目１９） 項目１〜３のいずれか１項に記載のグルクロン酸含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのカルボン酸基修飾物を含有する臨床診断用造影剤。
（項目２０） 式５からなる構造を有するグルクロン酸含有グルカン：
【0028】
【化3】
【0029】
ここでｍは１以上の整数であり、Ｒ１は独立して、Ｈ、式Ａの構造を有するグルカン鎖または式Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、【0030】
【化4】
【0031】
式Ａにおいて、ｋは１以上の整数であり、Ｒ２は独立して、Ｈ、式Ａの構造を有するグルカン鎖または式Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、【0032】
【化5】
【0033】
式Ｂにおいて、ｓは１以上の整数であり、Ｒ３は独立して、Ｈ、式Ａの構造を有するグルカン鎖または式Ｂの構造を有するグルカン鎖である、グルクロン酸含有グルカン。（項目２１） 式６からなる構造を有する、グルクロン酸含有グルカン又はグルクロン酸含有グルカン水酸基修飾物：
【0034】
【化6】
【0035】
ここでｍは１以上の整数であり、Ｒ１は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、【0036】
【化7】
【0037】
式６Ａにおいて、ｋは１以上の整数であり、Ｒ２は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、【0038】
【化8】
【0039】
式６Ｂにおいて、ｓは１以上の整数であり、Ｒ３は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、式６、式６Ａおよび式６Ｂにおいて、Ｒ４は、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基およびリン酸基からなる群から独立して選択される、グルクロン酸含有グルカンまたはグルクロン酸含有グルカン水酸基修飾物。
（項目２２） 式７からなる構造を有する、グルクロン酸含有グルカン、グルクロン酸含有グルカン水酸基修飾物又はそれらの還元末端修飾物：
【0040】
【化9】
【0041】
ここでｍは１以上の整数であり、Ｒ１は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、【0042】
【化10】
【0043】
式６Ａにおいて、ｋは１以上の整数であり、Ｒ２は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、【0044】
【化11】
【0045】
式６Ｂにおいて、ｓは１以上の整数であり、Ｒ３は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、式７、式６Ａおよび式６Ｂにおいて、Ｒ４は、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基およびリン酸基からなる群から独立して選択され、
式７において、Ｘは、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体およびアミン基含有低分子量物質からなる群より独立して選択される、グルクロン酸含有グルカン、グルクロン酸含有グルカン水酸基修飾物又はそれらの還元末端修飾物。
（項目２３） Ｘが、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコン酸、ソルビトール、スクロース、トレハロース、シクロデキストリン、環状デキストリン、環状アミロース、デンプン、セルロース、キチン、キトサン、デキストラン、タンパク質、ペプチド、リン脂質、脂肪酸、界面活性剤、アスコルビン酸グルコシド、ハイドロキノングルコシド、ヘスペリジングルコシド、ルチングルコシド、パラニトロフェニルマルトペンタオース、ドデシルマルトース、フラボノイド配糖体類、テルペン配糖体類、フェノール配糖体類、カルコン配糖体類、ステロイド配糖体類、アミノ酸及びドデシルアミンからなる群より選択される、項目２２に記載のグルクロン酸含有グルカン、グルクロン酸含有グルカン水酸基修飾物又はそれらの還元末端修飾物。
（項目２４） 式８からなる構造を有する、グルクロン酸含有グルカン、グルクロン酸含有グルカン水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのカルボキシル基修飾物：
【0046】
【化12】
【0047】
ここでｍは１以上の整数であり、Ｒ１は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖、式８Ａの構造を有するグルカン鎖、または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、【0048】
【化13】
【0049】
式６Ａにおいて、ｋは１以上の整数であり、Ｒ２は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖、式８Ａの構造を有するグルカン鎖、または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、【0050】
【化14】
【0051】
式８Ａにおいて、ｐは１以上の整数であり、Ｒ５は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖、式８Ａの構造を有するグルカン鎖、または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、【0052】
【化15】
【0053】
式６Ｂにおいて、ｓは１以上の整数であり、Ｒ３は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖、式８Ａの構造を有するグルカン鎖、または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖であり、式８、式６Ａ、式８Ａ、および式６Ｂにおいて、Ｒ４は、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基およびリン酸基からなる群から独立して選択され、
式８において、Ｘは、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体およびアミン基含有低分子量物質からなる群より独立して選択され、
式８及び式８Ａにおいて、Ｙは、薬効成分との結合のために導入される置換基であり、Ｙは、カルボキシル基修飾試薬との反応により得られ、該カルボキシル基修飾試薬は、少なくとも１つのアミン基および少なくとも１つの別の官能基を有する、グルクロン酸含有グルカン、グルクロン酸含有グルカン水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのカルボキシル基修飾物。
（項目２５） 前記官能基が、カチオン性官能基またはアニオン性官能基である、項目２４に記載のグルクロン酸含有グルカン、グルクロン酸含有グルカン水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのカルボキシル基修飾物。
（項目２６） 前記官能基が、疎水性官能基である、項目２４に記載のグルクロン酸含有グルカン、グルクロン酸含有グルカン水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのカルボキシル基修飾物。
（項目２７） 前記官能基が、マレイミド基、チオール基及びアルデヒド基からなる群より選択される、項目２４に記載のグルクロン酸含有グルカン、グルクロン酸含有グルカン水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのカルボキシル基修飾物。
（項目２８） 前記カルボキシル基修飾試薬が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ,Ｎ−ジスクシンイミドカーボネート、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２,３−ジカルボキシイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、イソブチルクロロホルメートおよび４−ヒドロキシフェニルジメチルスルホニウム・メチルスルフェートからなる群より選択される、項目２４に記載のグルクロン酸含有グルカン、グルクロン酸含有グルカン水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのカルボキシル基修飾物。
【0054】
本発明により、例えば以下もまた提供される：（項目１）グルカンの非還元末端にウロン酸残基が結合しているウロン酸含有グルカン。（項目２）グルカンが直鎖状グルカンである項目１に記載のウロン酸含有グルカン。
（項目３）直鎖状グルカンがマルトオリゴ糖、アミロースおよび酵素合成アミロースからなる群より選択される項目２に記載のウロン酸含有グルカン。
（項目４）グルカンが分岐状グルカンであり、分岐状グルカンの複数の非還元末端の少なくともひとつの非還元末端にウロン酸残基が結合している項目１に記載のウロン酸含有グルカン。
（項目５）分岐状グルカンが分岐マルトオリゴ糖、デンプン、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、酵素合成分岐グルカンおよびアミロースがグラフトされたグルカンからなる群より選択される項目４に記載のウロン酸含有グルカン。
（項目６）非還元末端のウロン酸残基のカルボキシル基がさらに修飾されているウロン酸含有グルカン。
（項目７）ウロン酸残基がグルクロン酸残基である項目１〜６に記載のウロン酸含有グルカン。
（項目８）グルカンとグルクロン酸−１−リン酸を含む水溶液にα−グルカンホスホリラーゼを作用させることを特徴とするウロン酸含有グルカンの製造方法。
（項目９）α−グルカンホスホリラーゼが、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来のα−グルカンホスホリラーゼである、項目８に記載のウロン酸含有グルカンの製造方法。
（項目１０）項目１〜７のいずれか１項に記載のウロン酸含有グルカンの食品用途における利用。
（項目１１）項目１〜７のいずれか１項に記載のウロン酸含有グルカンの化粧品用途における利用。
（項目１２）項目１〜７のいずれか１項に記載のウロン酸含有グルカンの医薬品用途における利用。
（項目１３）項目１〜７のいずれか１項に記載のウロン酸含有グルカンの化学品用途における利用。
【発明の効果】
【0055】
本発明のウロン酸含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、それらのカルボキシル基修飾物およびそれらの結合体は、グルカンの非還元末端のみにウロン酸残基が結合している。本ウロン酸含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、それらのカルボキシル基修飾物およびそれらの結合体はウロン酸を末端に有するため、グルカン末端が負電荷を帯び、グルカンの物理化学的性質が変化する。本ウロン酸含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、それらのカルボキシル基修飾物およびそれらの結合体は食品、化粧品、医薬品などに幅広く利用が期待される。【0056】
本発明のウロン酸含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、それらのカルボキシル基修飾物は、生体内で分解され、血中半減期が非修飾グルカンよりも長いため、薬効成分、臨床診断剤、造影剤およびＤＤＳ用微小粒子状キャリアの改質材料として有用である。本発明のウロン酸含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、それらのカルボキシル基修飾物は、酵素反応により構造を制御し得ることから、品質安定性にも優れている。【0057】
本発明のウロン酸含有グルカンおよびその修飾物は、グルカンの非還元末端のみにウロン酸残基が結合しているため、他の分子と相互作用する部位とアミラーゼにより分解を受ける部位とを構造的に分離できている。このためＤＤＳキャリアとして体内で利用しても体内の酵素によって分解されるため、体内に過度に長期間留まって残留性の問題を引き起こすことがない。【図面の簡単な説明】
【0058】
【図1】図１は、グルクロン酸残基を直鎖状グルカンの非還元末端に１分子のみ転移する反応の模式図である。Ａ：グルクロン酸１リン酸（ＧｌｃＡ−１−Ｐ）とマルトテトラオース（Ｍａｌｔｏｔｅｔｒａｏｓｅ）にα−グルカンホスホリラーゼ（図１中では「Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ」と示す）を作用させることにより、非還元末端にグルクロン酸が結合したマルトオリゴ糖（Ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌａｔｅｄ Ｍａｌｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）が生じる反応を示す。この模式図中では直鎖状グルカンの例としてマルトテトラオースを示す。この反応液中で起こる反応について、Ｂにおいてより詳細に説明する。Ｂ：Ａの反応において、ＧｌｃＡ−Ｇ４のみが生じず、ＧｌｃＡ−Ｇ３、ＧｌｃＡ−Ｇ５などが副生する理由を示す。式（１）はグルカンホスホリラーゼの主たる反応であり、本反応によりＧｌｃＡ−Ｇ４とＰｉが生ずる。式（２）は式（１）により生じたＰｉを用いてグルカンホスホリラーゼがＧ４を加リン酸分解し、Ｇ３とＧｌｃ−１−Ｐを生ずる反応を示す。式（３）は式（２）により生じたＧｌｃ−１−ＰとＧ４にグルカンホスホリラーゼが作用し、Ｇ５とＰｉを生ずる反応を示す。式（４）は式（２）により生じたＧ３とＧｌｃＡ−１−Ｐにグルカンホスホリラーゼが作用し、ＧｌｃＡ−Ｇ３とＰｉが生ずる反応を示す。式（５）は式（３）により生じたＧ５とＧｌｃＡ−１−Ｐにグルカンホスホリラーゼが作用し、ＧｌｃＡ−Ｇ５とＰｉが生ずる反応を示す。このような種々の反応が反応液中で生じるため、グルカン鎖の長さの不均化が起こり、その結果、出発物質として重合度４のマルトテトラオースを使用した場合、グルコース残基の重合度が３以上の種々のグルクロン酸含有マルトオリゴ糖が得られる。
【図2】図２は、グルクロン酸残基を分岐状グルカンの非還元末端に転移する反応の模式図である。図２においては、分岐状グルカンの例としてクラスターデキストリンを示す。星印で示した部分の構造を四角の枠内に示した。
【図3】図３は、グルクロン酸−１−リン酸とグルコース−１−リン酸を共存させた条件で酵素反応を行い、分岐グルカンの単位鎖の非還元末端へのグルコース残基の転移とグルクロン酸残基の転移が同時に起こる反応の模式図である。図３においては、分岐状グルカンの例としてクラスターデキストリンを示す。
【図6】図６は、馬鈴薯α−グルカンホスホリラーゼをグルクロン酸−１−リン酸とマルトテトラオースに作用させた産物の分析結果である。Ａは、標準物質のクロマトグラムである（Ｇｌｃ：グルコース、Ｍａｌ：マルトース、Ｇ４：マルトテトラオース、Ｇ７：マルトヘプタオース、ＧｌｃＡ：グルクロン酸、Ｇ１Ｐ：グルコース−１−リン酸、ＧｌｃＡ１Ｐ：グルクロン酸−１−リン酸）。Ｂは馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼをＧ４とＧｌｃＡ−１−Ｐに作用させて得られた酵素反応物の分析結果を示す。ＣはＢで分析した馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼを用いて得られた酵素反応物（Ｂ）をグルコアミラーゼ処理した場合の反応物の分析結果を示す。Ｃにおいては、Ｂで見られたすべてのピークが消失したため、馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼを用いて得られた酵素反応物には、グルクロン酸残基を含むグルカンを含まないこと、すなわち、馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼを用いた場合はグルクロン酸残基を含むグルカンが得られなかったことが分かる。
【図7】図７は、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼをグルクロン酸−１−リン酸とマルトテトラオースに作用させた酵素反応産物の分析結果である。Ａは、標準物質のクロマトグラムである（Ｇｌｃ：グルコース、Ｍａｌ：マルトース、Ｇ４：マルトテトラオース、Ｇ７：マルトヘプタオース、ＧｌｃＡ：グルクロン酸、Ｇ１Ｐ：グルコース−１−リン酸、ＧｌｃＡ１Ｐ：グルクロン酸−１−リン酸）。ＢはＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼをマルトテトラオース（Ｇ４）とＧｌｃＡ−１−Ｐに作用させることによって得られた酵素反応産物の分析結果を示す。ＣはＢと同じ酵素反応産物を、グルコアミラーゼ処理してから分析した結果である。Ｃの星印のピークが本発明のグルクロン酸含有グルカンを示す。本発明のグルクロン酸含有グルカンは、非還元末端にグルクロン酸残基が結合しているため、グルコアミラーゼに対し抵抗性を示す。図７Ｃの星印で示したピークのうち、左端の小さなピークはマルトースにグルクロン酸残基が結合したグルクロノシルマルトース（ＧｌｃＡ−Ｇ２）を示す。左から２番目の比較的大きなピークはグルクロノシルマルトトリオース（ＧｌｃＡ−Ｇ３）である。左から３番目以降は順に、右に行くほどＧｌｃＡ−Ｇ４、ＧｌｃＡ−Ｇ５と重合度がひとつずつ大きくなる。ＤはＢと同じ酵素反応産物をグルコアミラーゼとα−アミラーゼで処理してから分析した結果である。本発明のグルクロン酸含有グルカン（図７Ｃ星印のピーク）は、α−アミラーゼにより分解され新たな２つのピークが低分子量側に生じた。従って、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼを用いた場合はグルクロン酸残基を含むグルカンが得られることが分かる。
【図8】図８は、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼをグルクロン酸−１−リン酸とマルトヘプタオースに作用させた産物の分析結果である。Ａは、標準物質のクロマトグラムである（Ｇｌｃ：グルコース、Ｍａｌ：マルトース、Ｇ４：マルトテトラオース、Ｇ７：マルトヘプタオース、ＧｌｃＡ：グルクロン酸、Ｇ１Ｐ：グルコース−１−リン酸、ＧｌｃＡ１Ｐ：グルクロン酸−１−リン酸）。ＢはＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼをＧ７とＧｌｃＡ−１−Ｐに作用させることにより得られた酵素反応物の分析結果を示す。ＣはＢと同じ酵素反応産物を、グルコアミラーゼ処理してから分析した結果である。Ｃの星印のピークが本発明のグルクロン酸含有グルカンを示す。本発明のグルクロン酸含有グルカンは、非還元末端にグルクロン酸残基が結合しているため、グルコアミラーゼに対し抵抗性を示す。図８Ｃの星印で示したピークのうち、左端のピークはマルトトリオースにグルクロン酸残基が結合したグルクロノシルマルトトリオース（ＧｌｃＡ−Ｇ３）を示す。左から２番目のピークはグルクロノシルマルトテトラオース（ＧｌｃＡ−Ｇ４）を示す。左から３番目以降は順に、右に行くほどＧｌｃＡ−Ｇ５、ＧｌｃＡ−Ｇ６と重合度がひとつずつ大きくなる。ＤはＢと同じ酵素反応産物をグルコアミラーゼとα−アミラーゼで処理してから分析した結果である。本発明のグルクロン酸含有グルカン（図８Ｃ星印のピーク）は、α−アミラーゼにより分解され新たな２つのピークが低分子量側に生じた。従って、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼを用いた場合はグルクロン酸残基を含むグルカンが得られることが分かる。
【図9】図９は、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼをグルクロン酸−１−リン酸とマルトテトラオースに作用させた産物の分取を示した図である。図９Ａの矢印に示すピークを分取精製した。分取精製したピークをＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ装置で分析した結果を図９Ｂに示す。図９Ｂを見ると、目的のピークだけが精製されたことがわかる。図９Ｂで分析した精製後のサンプルをＴＯＦ−ＭＳ分析に用い、矢印のピークに含まれるグルカンが、グルクロン酸とマルトトリオースの結合物(図９Ｃ)であることが分かった。
【図10】図１０は、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼをグルクロン酸−１−リン酸と分岐グルカン（クラスターデキストリン）に作用させた産物の分析結果である。Ａは、標準物質のクロマトグラムである（Ｇｌｃ：グルコース、Ｍａｌ：マルトース、Ｇ４：マルトテトラオース、Ｇ７：マルトヘプタオース、ＧｌｃＡ：グルクロン酸、Ｇ１Ｐ：グルコース−１−リン酸、ＧｌｃＡ１Ｐ：グルクロン酸−１−リン酸）。Ｂは分岐グルカン（クラスターデキストリン）をイソアミラーゼで分解した後に分析した結果を示す。図１０ＢおよびＣ中のピーク上の数字は、そのピークで示されるグルカンの重合度を示す。４：マルトテトラオース；５：マルトペンタオース；６：マルトヘキサオース；７：マルトヘプタオース；８：マルトオクタオース；９：マルトノナオース；１０：マルトデカオース。図１０Ｃ中の「Ｇ１Ｐ＋５」は、Ｇ１Ｐのピークとマルトペンタオースのピークとが重なっていることを示す。ＣはＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼをグルクロン酸−１−リン酸と分岐グルカン（クラスターデキストリン）に作用させることにより得られた酵素反応産物をイソアミラーゼで分解した後の分析結果を示す。ＤはＣと同じ酵素反応産物をイソアミラーゼとグルコアミラーゼで処理してから分析した結果である。Ｄの矢印のピークが本発明のグルクロン酸含有グルカンを示す。本発明のグルクロン酸含有グルカンは、非還元末端にグルクロン酸残基が結合しているため、グルコアミラーゼに対し抵抗性を示す。図１０Ｄの矢印で示したピークのうち、左端のピークはマルトトリオースにグルクロン酸残基が結合したグルクロノシルマルトトリオース（ＧｌｃＡ−Ｇ３）を示す。左から２番目のピークはグルクロノシルマルトテトラオース（ＧｌｃＡ−Ｇ４）を示す。左から３番目以降は順に、右に行くほどＧｌｃＡ−Ｇ５、ＧｌｃＡ−Ｇ６と重合度がひとつずつ大きくなる。従って、図１０Ｄにおいてはグルクロン酸残基を含むグルカン（矢印）が得られたことが分かる。
【図11】図１１はグルクロン酸含有グルカンがタンパク質との複合体を形成することを示した図である。２０μｇのＦＧＦ−ｂａｓｉｃと０．５ｍｇのグルクロン酸含有グルカン（ＢＡ−２）を０．１ｍｌの溶液中で混合した後、この混合物をＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００ ＧＬカラム（サイズ分画用カラム、ＧＥ社製）を用いたＦＰＬＣ分析によって分析した。溶離液にはイオン交換水を用い、ＵＶ（２８０ｎｍ）検出した。グルクロン酸含有グルカンをＦＧＦ−ｂａｓｉｃに添加しなかった場合（＊１のピーク）と比較して、添加した場合（＊２のピーク）は溶出時間が早く、分子サイズが大きいことが分かる。したがって、グルクロン酸含有グルカンはタンパク質との複合体を形成できることを示している。
【図12】図１２はカチオン化グルクロン酸含有グルカンとＤＮＡとの複合体形成を示した図である。カチオン化グルクロン酸含有グルカン０．２μｇとラムダＤＮＡ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片０．５μｇを２０μｌのイオン交換水中に溶解し、５分間室温で静置した後、１％アガロースゲル電気泳動を行った。カチオン化グルクロン酸含有グルカンを添加しなかった場合（Ａ）と比較して、添加した場合（Ｂ）は著しくＤＮＡ断片の移動度が遅かった。したがって、カチオン化グルクロン酸含有グルカンはＤＮＡとの複合体を形成できることがわかる。
【発明を実施するための形態】
【0059】
以下、本発明を詳細に説明する。【0060】
本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。【0061】
（１．材料）（１．１）グルカンおよびグルカンの修飾物
「グルカン」とは、本明細書中で用いられる場合、Ｄ−グルコースを構成単位とする多糖である。本発明においては、グルカンとしてα−Ｄ−グルカンを使用することが好ましい。本明細書においては、特に断りのない限り、「グルカン」とは、「α−Ｄ−グルカン」をいう。α−Ｄ−グルカンは、主にα−１，４−グルコシド結合によって２以上のＤ−グルコース単位が連結されているグルカンである。本発明で使用される好ましいグルカンは、直鎖状グルカンおよび分岐状グルカンであり、より好ましくは直鎖状α−１，４−グルカン及びα−１，６−結合により分岐したα−１，４−グルカン（分岐状α−１，４グルカンともいう）である。本発明で使用されるグルカンは、α−１，３−結合を含まないことが好ましい。
【0062】
直鎖状α−Ｄ−１，４−グルカンとは、Ｄ−グルコース単位がα−１，４−グルコシド結合のみで２糖単位以上結合されている多糖をいう。本明細書中では、特に断りのない限り、直鎖状α−Ｄ−１，４−グルカンを直鎖状グルカン又は直鎖状α−１，４グルカンという。マルトオリゴ糖及びアミロースは、直鎖状グルカンおよびα−１，４−グルカンに分類される。直鎖状グルカンは、ひとつの非還元末端を有する。【0063】
本発明に好適に利用される直鎖状グルカンの例としては、マルトオリゴ糖およびアミロースが挙げられる。【0064】
本明細書中では、用語「マルトオリゴ糖」とは、約２個〜約１０個のＤ−グルコースが脱水縮合して生じた物質であって、Ｄ−グルコース単位がα−１，４結合によって連結された物質をいう。マルトオリゴ糖の重合度は、好ましくは約３以上であり、より好ましくは約４以上であり、さらに好ましくは約５以上である。マルトオリゴ糖の重合度は、例えば、約１０以下、約９以下、約８以下、約７以下などであってもよい。マルトオリゴ糖の例としては、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、マルトオクタオース、マルトノナオース、マルトデカオースなどのマルトオリゴ糖が挙げられる。【0065】
本明細書中では用語「アミロース」とは、α−１，４結合によって連結されたグルコース単位から構成される直鎖分子をいう。アミロースは、天然の澱粉中に含まれる。アミロースは、天然の澱粉から抽出した天然アミロースであってもよく、酵素反応によって合成したアミロース（本明細書中では「酵素合成アミロース」ともいう）であってもよい。天然アミロースは、分岐部分を含む場合があるが、酵素合成アミロースは分岐を含まない。さらに、天然アミロースは分散度が大きく分子量にばらつきがあるが、酵素合成アミロース（特に、国際公開第ＷＯ０２／０９７１０７号パンフレットに記載されるＳＰ−ＧＰ法によって合成した酵素合成アミロース）は分散度が小さく極めて均一な分子量を有する。そのため、本発明においては、酵素合成アミロースを使用することが好ましい。本発明において使用されるアミロースの重合度は、好ましくは約２以上であり、より好ましくは約３以上であり、さらに好ましくは約１０以上であり、最も好ましくは約３０以上である。本発明において使用されるアミロースの重合度は、好ましくは約２０００以下であり、より好ましくは約１０００以下であり、さらに好ましくは約７００以下であり、最も好ましくは約５００以下である。【0066】
本明細書中では用語「分岐状α−Ｄ−グルカン」とは、Ｄ−グルコースがα−１，４−グルコシド結合により連結した直鎖状グルカンが、α−１，４−グルコシド結合以外の結合により分岐しているグルカンをいう。本明細書中では、特に断りのない限り、分岐状α−Ｄ−グルカンを分岐状グルカンという。分岐結合は、α−１，６−グルコシド結合、α−１，３−グルコシド結合、またはα−１，２−グルコシド結合のいずれかであるが、最も好ましくはα−１，６−グルコシド結合である。本発明で使用する分岐状α−Ｄ−グルカンはα−１，３−グルコシド結合およびα−１，２−グルコシド結合を含まないことが好ましい。分岐状グルカンは、通常、分岐結合の数と同数の非還元末端を有する。α−１，６−グルコシド結合のみを選択的に分解する酵素（例えば、イソアミラーゼ、プルラナーゼなど）で分岐状グルカンを処理すると、直鎖状α−１，４−グルカンの混合物に分解できる。これらを分岐グルカンの単位鎖といい、その重合度を単位鎖長という。【0067】
本発明に好適に利用される分岐状グルカンの例としては、分岐マルトオリゴ糖、デンプン、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、酵素合成分岐グルカン及び高度分岐環状デキストリンなどが挙げられる。【0068】
本明細書中では用語「分岐マルトオリゴ糖」とは、約３個〜約１０個のＤ−グルコースが脱水縮合して生じた物質であって、Ｄ−グルコース単位が主にα−１，４結合によって連結されており、かつ１つ以上の分岐結合を含む物質をいう。分岐マルトオリゴ糖の重合度は、好ましくは約４以上であり、より好ましくは約５以上であり、さらに好ましくは約６以上である。分岐マルトオリゴ糖の重合度は、例えば、約１０以下、約９以下、約８以下、約７以下などであってもよい。【0069】
本明細書中では用語「デンプン」とは、アミロースとアミロペクチンとの混合物をいう。デンプンとしては、通常市販されているデンプンであればどのようなデンプンでも用いられ得る。デンプンに含まれるアミロースとアミロペクチンとの比率は、デンプンを産生する植物の種類によって異なる。モチゴメ、モチトウモロコシなどの有するデンプンのほとんどはアミロペクチンである。他方、アミロースのみからなり、かつアミロペクチンを含まないデンプンは、通常の植物からは得られない。デンプンは、天然のデンプン、デンプン分解物および化工デンプンに区分される。【0070】
天然のデンプンは、原料により、いも類デンプンおよび穀類デンプンに分けられる。いも類デンプンの例としては、馬鈴薯デンプン、タピオカデンプン、甘藷デンプン、くずデンプン、およびわらびデンプンなどが挙げられる。穀類デンプンの例としては、コーンスターチ、小麦デンプン、および米デンプンなどが挙げられる。天然のデンプンは、ハイアミロースデンプン（例えば、ハイアミロースコーンスターチ）またはワキシーデンプンであってもよい。デンプンはまた、可溶性デンプンであってもよい。可溶性デンプンとは、天然のデンプンに種々の処理を施すことにより得られる、水溶性のデンプンをいう。デンプンは、可溶性デンプン、ワキシーデンプンおよびハイアミロースデンプンからなる群から選択され得る。デンプンはまた、化工デンプンであってもよい。【0071】
本発明において使用されるデンプンの重合度は、好ましくは約１０００以上であり、より好ましくは約５０００以上であり、さらに好ましくは約１００００以上であり、最も好ましくは約２００００以上である。本発明において使用されるデンプンの重合度は、好ましくは約１×１０７以下であり、より好ましくは約３×１０６以下であり、さらに好ましくは約１×１０６以下であり、最も好ましくは約３×１０５以下である。【0072】
アミロペクチンとは、α−１，４結合によって連結されたグルコース単位に、α−１，６結合でグルコース単位が連結された、分岐状分子である。アミロペクチンは天然のデンプン中に含まれる。アミロペクチンとしては、例えば、アミロペクチン１００％からなるワキシーコーンスターチが用いられ得る。本発明において使用されるアミロペクチンの重合度は、好ましくは約１０００以上であり、より好ましくは約５０００以上であり、さらに好ましくは約１００００以上であり、最も好ましくは約２００００以上である。本発明において使用されるアミロペクチンの重合度は、好ましくは約１×１０７以下であり、より好ましくは約３×１０６以下であり、さらに好ましくは約１×１０６以下であり、最も好ましくは約３×１０５以下である。【0073】
グリコーゲンは、グルコースから構成されるグルカンの一種であり、高頻度の枝分かれを有するグルカンである。グリコーゲンは、動植物の貯蔵多糖としてほとんどあらゆる細胞に顆粒状態で広く分布している。グリコーゲンは、植物中では、例えば、トウモロコシの種子などに存在する。グリコーゲンは、代表的には、グルコースのα−１，４−結合の糖鎖に対して、グルコースおよそ３単位おきに１本程度の割合で、平均重合度１２〜１８のグルコースのα−１，４−結合の糖鎖がα−１，６−結合で結合している。また、α−１，６−結合で結合している分枝鎖にも同様にグルコースのα−１，４−結合の糖鎖がα−１，６−結合で結合している。そのため、グリコーゲンは網状構造を形成する。グリコーゲンは酵素合成することも可能である。本発明において使用されるグリコーゲンの重合度は、好ましくは約５００以上であり、より好ましくは約１０００以上であり、さらに好ましくは約２０００以上であり、最も好ましくは約３０００以上である。本発明において使用されるグリコーゲンの重合度は、好ましくは約１×１０７以下であり、より好ましくは約３×１０６以下であり、さらに好ましくは約１×１０６以下であり、最も好ましくは約３×１０５以下である。【0074】
デキストリンは、グルコースから構成されるグルカンの一種であり、デンプンとマルトースとの中間の複雑さをもつグルカンである。デキストリンは、デンプンを酸、アルカリまたは酵素によって部分的に分解することによって得られる。本発明において使用されるデキストリンの重合度は、好ましくは約１０以上であり、より好ましくは約２０以上であり、さらに好ましくは約３０以上であり、最も好ましくは約５０以上である。本発明において使用されるデキストリンの重合度は、好ましくは約１００００以下であり、より好ましくは約９０００以下であり、さらに好ましくは約７０００以下であり、最も好ましくは約５０００以下である。【0075】
酵素合成分岐グルカンとは、酵素を使用して合成された分岐グルカンをいう。ＳＰ−ＧＰ法でのアミロースの合成の際に反応液中にブランチングエンザイムを加えることにより、生成物を分岐させることができる。分岐の程度はブランチングエンザイムの添加量によって調節され得る。酵素合成分岐グルカンは、天然の分岐グルカンと比較して均一な構造を有しているため、製薬材料として使用する際に非常に有利である。例えば、本発明において使用される酵素合成分岐グルカンの重合度は、好ましくは約２０以上であり、より好ましくは約５０以上であり、さらに好ましくは約１００以上であり、最も好ましくは約２００以上である。本発明において使用される酵素合成分岐グルカンの重合度は、好ましくは約２×１０５以下であり、より好ましくは約１×１０５以下であり、さらに好ましくは約５×１０４以下であり、最も好ましくは約３×１０４以下である。【0076】
本明細書中では、用語「高度分岐環状グルカン」とは、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する、重合度が５０以上であるグルカンをいう。高度分岐環状グルカンは、分子全体として少なくとも１つの分岐を有すればよい。本発明で使用され得る高度分岐環状グルカンの分子全体としての重合度は、好ましくは約５０以上であり、より好ましくは約６０以上であり、さらに好ましくは約１００以上である。本発明で使用され得る高度分岐環状グルカンの分子全体としての重合度は、好ましくは約１０，０００以下であり、より好ましくは約７，０００以下であり、さらに好ましくは約５，０００以下である。【0077】
高度分岐環状グルカンに存在する、内分岐環状構造部分の重合度は、好ましくは約１０以上であり、より好ましくは約１５以上であり、さらに好ましくは約２０以上である。高度分岐環状グルカンに存在する、内分岐環状構造部分の重合度は、好ましくは約５００以下であり、より好ましくは約３００以下であり、さらに好ましくは約１００以下である。【0078】
高度分岐環状グルカンに存在する、外分岐構造部分の重合度は、好ましくは約４０以上であり、より好ましくは約１００以上であり、さらに好ましくは約３００以上であり、さらにより好ましくは約５００以上である。高度分岐環状グルカンに存在する、外分岐構造部分の重合度は、好ましくは約３０００以下であり、より好ましくは約１０００以下であり、さらに好ましくは約５００以下であり、さらにより好ましくは約３００以下である。【0079】
高度分岐環状グルカンに存在する、内分岐環状構造部分のα−１，６−グルコシド結合は少なくとも１個あればよく、例えば１個以上、５個以上、１０個以上などであり得る；内分岐環状構造部分のα−１，６−グルコシド結合は例えば約２００個以下、約５０個以下、約３０個以下、約１５個以下、約１０個以下などであり得る。【0080】
高度分岐環状グルカンは、１種類の重合度のものを単独で用いてもよいし、種々の重合度のものの混合物として用いてもよい。好ましくは、高度分岐環状グルカンの重合度は、最大の重合度のものと最小の重合度のものとの重合度の比が約１００以下、より好ましくは約５０以下、さらにより好ましくは約１０以下である。【0081】
高度分岐環状グルカンは、好ましくは、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する、重合度が５０から５０００の範囲にあるグルカンであって、ここで、内分岐環状構造部分とはα−１，４−グルコシド結合とα−１，６−グルコシド結合とで形成される環状構造部分であり、そして外分岐構造部分とは、該内分岐環状構造部分に結合した非環状構造部分である、グルカンである。この外分岐構造部分の各単位鎖の重合度は、平均で好ましくは約１０以上であり、好ましくは約２０個以下である。高度分岐環状グルカンおよびその製造方法は、特開平８−１３４１０４号（特許第３１０７３５８号）に詳細に記載されており、その記載に従って製造され得る。高度分岐環状グルカンは、例えば、江崎グリコ株式会社から「クラスターデキストリン」として市販されている。本発明において使用される高度分岐環状デキストリンの重合度は、好ましくは約５０以上であり、より好ましくは約７０以上であり、さらに好ましくは約１００以上であり、最も好ましくは約１５０以上である。本発明において使用される高度分岐環状デキストリンの重合度は、好ましくは約１００００以下であり、より好ましくは約７０００以下であり、さらに好ましくは約５０００以下であり、最も好ましくは約４０００以下である。【0082】
特定の実施形態では、分岐状グルカンは、粒子状となりうる。直径約４ｎｍ以下の粒子は腎臓から排出され、直径約４ｎｍ〜約２００ｎｍの粒子は血中を長時間循環し、直径約２００ｎｍ〜約７μｍの粒子は細網内皮系に捕捉され、直径約７μｍ以上の粒子は毛細血管を閉塞させることが公知である。細網内皮系は肝臓および脾臓に分布する。そのため、分岐グルカンの粒径を制御することにより、本発明のグルクロン酸含有グルカン及びその修飾物及びそれらの結合体の体内での動態を制御することができる。血中に長時間循環させることを意図する場合、粒子状分岐グルカンの粒径は、好ましくは直径約４ｎｍ以上であり、より好ましくは約１０ｎｍ以上であり、好ましくは約２００ｎｍ以下であり、より好ましくは約１００ｎｍ以下である。このような粒径の粒子状分岐グルカンの分子量は、好ましくは約５×１０５以上であり、より好ましくは約１×１０６以上であり、好ましくは約５×１０７以下であり、より好ましくは約２×１０７以下である。例えば、直径２０〜５０ｎｍの粒子はがん細胞に蓄積することが公知であるので、がん細胞に蓄積させることを意図する場合、粒子状分岐グルカンの粒径は、好ましくは直径約１０ｎｍ以上であり、より好ましくは約１５ｎｍ以上であり、好ましくは約１００ｎｍ以下であり、より好ましくは約５０ｎｍ以下である。このような粒径の粒子状分岐グルカンの分子量は、好ましくは約５×１０５以上であり、より好ましくは約１×１０６以上であり、好ましくは約２×１０７以下であり、より好ましくは約５×１０６以下である。【0083】
α−グルカンの分岐の数（すなわち、α−１，６−グルコシド結合の数）は、好ましくは約１個以上であり、より好ましくは約１０個以上であり、さらに好ましくは約３０個以上である。α−グルカンの分岐の数（すなわち、α−１，６−グルコシド結合の数）は、好ましくは約５０００個以下であり、より好ましくは約２０００個以下であり、さらに好ましくは約１０００個以下である。【0084】
本発明で使用される分岐状α−グルカンにおいては、α−１，６−グルコシド結合の数に対するα−１，４−グルコシド結合の数の比（「α−１，６−グルコシド結合の数」：「α−１，４−グルコシド結合の数」）は、好ましくは１：１〜１：１００００であり、より好ましくは１：１０〜１：５０００であり、さらに好ましくは１：５０〜１：１０００であり、さらに好ましくは１：１００〜１：５００である。【0085】
α−１，６−グルコシド結合は、α−グルカン中に無秩序に分布していてもよいし、均質に分布していてもよい。α−グルカン中に糖単位で５個以上の直鎖状部分ができる程度の分布であることが好ましい。【0086】
本発明においては、グルカンの代わりにグルカンの修飾物を使用してもよい。グルカンの修飾物の例としては、化工デンプンおよび上記で説明したグルカンのエステル化物などが挙げられる。グルカンの修飾物はまた、水酸基修飾物または還元末端修飾物であってもよい。また、後述するように、グルカンの少なくとも１つの非還元末端にグルクロン酸残基を結合させた後にグルカン部分を修飾してもよい。【0087】
化工デンプンは、天然のデンプンに加水分解、エステル化、またはα化などの処理を施して、より利用しやすい性質を持たせたデンプンである。糊化開始温度、糊の粘度、糊の透明度、老化安定性などを様々な組み合わせで有する幅広い種類の化工デンプンが入手可能である。化工デンプンの種類には種々ある。このようなデンプンの例は、デンプンの糊化温度以下においてデンプン粒子を酸に浸漬することにより、デンプン分子は切断するが、デンプン粒子は破壊していないデンプンである。【0088】
化工デンプン以外のグルカンの修飾物の例としては、非修飾グルカンのアルコール性水酸基のうちの少なくとも１つが修飾されたもの（以下、本明細書中では「グルカンの水酸基修飾物」という)、グルカンの非還元末端のうちの一部が修飾されたもの（以下、本明細書中では「グルカンの非還元末端修飾物」という）およびグルカンの還元末端が修飾されたもの（以下、本明細書中では「グルカンの還元末端修飾物」という）が挙げられる。【0089】
水酸基での修飾の例としては、ヒドロキシアルキル化、アルキル化、アシル化、カルボキシメチル化、硫酸化及びリン酸化が挙げられる。水酸基での修飾は、体内の酵素によって除去され得る修飾であることが好ましい。グルカンの水酸基修飾物は、好ましくはアシル化グルカンであり、さらに好ましくはアセチル化グルカンである。アルコール性水酸基への修飾基の導入頻度は、グルカンの修飾反応の際に任意に設定することができる。アルコール性水酸基への修飾基の導入頻度はＤＳとして表し、ＤＳ１はグルコース残基あたりひとつの修飾基が導入されている状態を意味する。ＤＳは、ＤＳ＝（修飾基数）／（グルコース残基数）によって計算され得る。非修飾グルコース残基には２位、３位および６位にＯＨ基があるため、理論上、グルコース残基１個あたり最大３個の修飾基を導入し得る。そのため、ＤＳの上限値は通常３である。アルコール性水酸基への修飾基の導入頻度は、約ＤＳ０．０１以上であり、より好ましくは約ＤＳ０．０３以上であり、さらに好ましくは約ＤＳ０．０５以上であり、特に好ましくは約ＤＳ０．０７以上であり、最も好ましくは約ＤＳ０．１以上である。修飾基の導入頻度は、好ましくは約ＤＳ１．５以下であり、より好ましくは約ＤＳ１．３以下であり、さらに好ましくは約ＤＳ１．１以下であり、特に好ましくは約ＤＳ１．０以下であり、最も好ましくは約ＤＳ０．９以下である。グルカンを修飾することにより血液内あるいは体内でのグルカンの分解が抑制される。【0090】
非還元末端での修飾の例としては、マンノース残基、ガラクトース残基などの標的製分子との結合が挙げられる。非還元末端での修飾については、以下の２．７および３において詳細に説明する。非還元末端修飾物は、好ましくはマンノース残基との結合物又はガラクトース残基との結合物である。【0091】
還元末端での修飾の例としては、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体及びアミン基含有低分子量物質との結合が挙げられる。非還元末端での修飾については、以下の２．７および３において詳細に説明する。【0092】
（１．２）ウロン酸ウロン酸は、単糖を酸化して得られる誘導体のうち、主鎖の末端のヒドロキシメチル基がカルボキシル基に変わったカルボン酸の総称である。ウロン酸はまた、単糖類のカルボニル基から最も離れている第一アルコール基（−ＣＨ２ＯＨ）をカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）に酸化して得られる酸であってもよい。ウロン酸は、単糖をグリコシドへと誘導したのちに６位を酸化することにより、又はアルダル酸を還元することにより合成され得る。
【0093】
代表的なウロン酸の例としては、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸などが挙げられる。グルクロン酸はグルコースの酸化物であり、ガラクツロン酸はガラクトースの酸化物であり、マンヌロン酸はマンノースの酸化物である。本発明におけるウロン酸としてはグルクロン酸が最も好ましい。【0094】
本発明の方法においては、ウロン酸−１−リン酸が使用される。ウロン酸−１−リン酸は、市販のものであってよく、化学的方法、酵素的方法または醗酵などの生物学的方法により合成してもよい。ウロン酸は、ウロン酸−１−リン酸を合成するために使用されてもよい。【0095】
（２．ウロン酸含有グルカンの製造法）（２．１）グルクロン酸−１−リン酸
本発明において利用されるグルクロン酸−１−リン酸としては、化学的な方法、酵素的な方法、醗酵などの生物学的方法により合成されたものが使用できる。特にグルコース−１−リン酸の化学的酸化反応により合成されたグルクロン酸−１−リン酸が好ましい。グルコース−１−リン酸の化学的酸化反応によりグルクロン酸−１−リン酸を合成する方法は、Ｈｅｅｒｅｓら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９９７、２９９、２２１−２２７に開示されている。
【0096】
グルクロン酸−１−リン酸としては、非塩形態のグルクロン酸−１−リン酸および塩の形態のグルクロン酸−１−リン酸のいずれをも使用し得る。例えば、グルクロン酸−１−リン酸の金属塩を使用することができ、グルクロン酸−１−リン酸のアルカリ金属塩（例えば、グルクロン酸−１−リン酸二ナトリウムおよびグルクロン酸−１−リン酸二カリウム）を使用することができる。【0097】
（２．２）α−グルカンホスホリラーゼ本明細書において「α−グルカンホスホリラーゼ」および「ＧＰ」は、特に示さない限り互換可能に用いられる。本明細書において用語「α−グルカンホスホリラーゼ」は、α−グルカンホスホリラーゼ活性を有する酵素を意味する。α−グルカンホスホリラーゼは、ＥＣ２．４．１．１に分類される。α−グルカンホスホリラーゼ活性とは、無機リン酸とα−１，４−グルカンとから、グルコース−１−リン酸およびα−１，４−グルカンの部分分解物を作る反応またはその逆反応を触媒する活性をいう。α−グルカンホスホリラーゼは、ホスホリラーゼ、スターチホスホリラーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼなどと呼ばれる場合もある。α−グルカンホスホリラーゼは、加リン酸分解の逆反応であるα−１，４−グルカン合成反応をも触媒し得る。反応がどちらの方向に進むかは、基質の量に依存する。生体内では、無機リン酸の量が多いので、α−グルカンホスホリラーゼは加リン酸分解の方向に反応が進む。無機リン酸の量が少ないと、α−１，４−グルカンの合成の方向に反応が進む。
【0098】
全ての既知のα−グルカンホスホリラーゼは、活性のためにピリドキサール５’−リン酸を必要とし、そして類似した触媒機構を共有するようである。異なった起源に由来する酵素は、基質の優先性および調節形態が異なっているが、全てのα−グルカンホスホリラーゼは、多数のα−グルカンホスホリラーゼを含む大きなグループに属する。この大きなグループは、細菌、酵母および動物由来のグリコーゲンホスホリラーゼ、植物由来のデンプンホスホリラーゼ、ならびに細菌由来のマルトデキストリンホスホリラーゼを含む。α−グルカンホスホリラーゼは、デンプンまたはグリコーゲンを貯蔵し得る種々の植物、動物および微生物中に普遍的に存在すると考えられる。【0099】
植物のα−グルカンホスホリラーゼは、グリコーゲンへの親和性によって、タイプＬとタイプＨとに分けられる。タイプＬα−グルカンホスホリラーゼとは、グリコーゲンへの親和性が低いα−グルカンホスホリラーゼをいう。【0100】
一般に、タイプＬのα−グルカンホスホリラーゼは、基質として、グリコーゲンよりも、マルトデキストリン、アミロースおよびアミロペクチンを好む（Ｈｉｒｏｙｕｋｉ Ｍｏｒｉら著、「Ａ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ α−Ｇｌｕｃａｎ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｔｙｐｅ Ｌ ａｎｄ Ｈ Ｉｓｏｚｙｍｅｓ」、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９３、ｖｏｌ．２６８，Ｎｏ．８，ｐｐ．５５７４−５５８１）。タイプＨ α−グルカンホスホリラーゼとは、グリコーゲンへの親和性が高いα−グルカンホスホリラーゼをいう。【0101】
一般に、タイプＨ α−グルカンホスホリラーゼは、グリコーゲンを含め、種々のグルカンについての極めて高い親和性を有する。植物のα−グルカンホスホリラーゼのタイプＬとタイプＨは植物細胞内での局在性にも違いがある。タイプＨは、細胞質に局在しており、タイプＬはプラスチドに局在している。【0102】
α−グルカンホスホリラーゼのグルカン合成反応のための最小のプライマー分子はマルトテトラオースであることが報告されている。グルカン分解反応のために有効な最小の基質はマルトペンタオースであることも報告されている。一般に、これらは、α−グルカンホスホリラーゼに共通の特徴であると考えられていた。【0103】
しかし、近年、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−グルカンホスホリラーゼおよびＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のα−グルカンホスホリラーゼは、他のα−グルカンホスホリラーゼとは異なる基質特異性を有すると報告されている。これらのα−グルカンホスホリラーゼについては、グルカン合成についての最小のプライマーがマルトトリオースであり、グルカン分解についての最小の基質がマルトテトラオースである。また、近年、種々の細菌のゲノム解析が行なわれ、種々の細菌由来α−グルカンホスホリラーゼの塩基配列及びアミノ酸配列が報告されている。Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ由来のα−グルカンホスホリラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来のα−グルカンホスホリラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ由来のマルトデキストリンホスホリラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ由来のα−グルカンホスホリラーゼなどのアミノ酸配列及び遺伝子配列が報告されている。【0104】
本発明で使用するα−グルカンホスホリラーゼは、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼであることが好ましい。【0105】
Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼの塩基配列を配列番号１に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号２の１位〜６９２位に示す。Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列は、植物のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して約２１％〜約２４％の配列同一性を有し、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して約３４％の配列同一性を有し、そしてＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して約３８％の配列同一性を有する。Ｔｈｅｒｍｏｔｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して約３８％の配列同一性を有し、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ由来のマルトデキストリンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して約３８％の配列同一性を有し、そしてＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓに対して約３３％の配列同一性を有する。【0106】
本明細書中では、酵素がある生物に「由来する」とは、その生物から直接単離したことのみを意味するのではなく、その生物を何らかの形で利用することによりその酵素が得られることをいう。例えば、その生物から入手したその酵素をコードする遺伝子を大腸菌に導入して、その大腸菌から酵素を単離する場合も、その酵素はその生物に「由来する」という。【0107】
本明細書において配列（例えば、アミノ酸配列、塩基配列など）の「同一性」とは、２つの配列の間で同一のアミノ酸（塩基配列を比較する場合は塩基）の出現する程度をいう。一般に、２つのアミノ酸または塩基の配列を比較して、付加または欠失を含み得る最適な様式で整列されたこれら２つの配列を比較することによって決定され得る。【0108】
本明細書では配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ Ｖｅｒ．４．０（株式会社ゼネティックス）のマキシマムマッチングを用いて算出される。このプログラムは、解析対象となる配列データに対して、比較対象となる配列データを置き換えおよび欠損を考慮しながら、配列間で一致するアミノ酸対が最大になるように並べ替え、その際、一致（Ｍａｔｃｈｅｓ）、不一致（Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ）、ギャップ（Ｇａｐｓ）についてそれぞれ得点を与え合計を算出して最小となるアライメントを出力しその際の同一性を算出する（参考文献：Ｔａｋａｓｈｉ，Ｋ．，およびＧｏｔｏｈ，Ｏ．１９８４．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ａｍｏｎｇ Ｖａｒｉｏｕｓ ４．５ Ｓ ＲＮＡ Ｓｐａｃｉｅｓ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９２：１１７３−１１７７）。【0109】
例えば、本発明で使用されるα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列は、配列番号２と同一、すなわち、１００％同一であってよい。別の実施形態では、グルクロン酸をグルカンの非還元末端に転移する活性を有する限り、このアミノ酸配列は、対照アミノ酸配列と比較してある一定の数までアミノ酸が変化していてもよい。このような変化は、少なくとも１個のアミノ酸の欠失、置換（保存および非保存置換を含む）または挿入からなる群より選択され得る。このような変化は配列番号２のアミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端の位置で生じてもよく、またはこれら末端以外のどの位置で生じてもよい。アミノ酸残基の変化は、１残基ずつ点在していてもよく、数残基連続していてもよい。例えば、本発明で使用されるα−グルカンホスホリラーゼは、酵素の精製を容易にするため、安定性を高めるためなどの理由で配列番号２のアミノ酸配列のいずれかの末端に（好ましくは約２０残基以下、より好ましくは約１０残基以下、さらに好ましくは約５残基以下の）アミノ酸残基を付加したものであってもよい。【0110】
本発明で使用されるα−グルカンホスホリラーゼは、配列番号２のアミノ酸配列に対して好ましくは約５０％以上、より好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、なおいっそう好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルクロン酸をグルカンの非還元末端に転移する活性を有する。本発明で使用されるα−グルカンホスホリラーゼは、配列番号２のアミノ酸配列に対して約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。【0111】
反応開始時の溶液中に含まれるα−グルカンホスホリラーゼの量は、好ましくは約０．０１Ｕ／ｍｌ以上であり、より好ましくは約０．１Ｕ／ｍｌ以上であり、特に好ましくは約０．５Ｕ／ｍｌ以上であり、最も好ましくは約１Ｕ／ｍｌ以上である。反応開始時の溶液中に含まれるα−グルカンホスホリラーゼの量は、好ましくは約１０００Ｕ／ｍｌ以下であり、より好ましくは約１００Ｕ／ｍｌ以下であり、特に好ましくは約５０Ｕ／ｍｌ以下であり、最も好ましくは約２０Ｕ／ｍｌ以下である。α−グルカンホスホリラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。なお、α−グルカンホスホリラーゼの単位量は、以下のとおりに定義される：α−グルカンホスホリラーゼの単位量は、１分間に１μｍｏｌの無機リン酸（Ｐｉ）を生成するα−グルカンホスホリラーゼ活性を１単位（Ｕ又はＵｎｉｔ）とする。このα−グルカンホスホリラーゼ活性の測定は、Ｇ−１−Ｐから生じた遊離の無機リン酸（Ｐｉ）を定量する。２００μｌの反応液（１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中、１２．５ｍＭ Ｇ−１−Ｐ、１％デキストリンおよび酵素液を含む）を５０℃に１５分間インキュベートした後、８００μｌのモリブデン試薬（１５ｍＭモリブデン酸アンモニウム、１００ｍＭ酢酸亜鉛）を加え、攪拌し反応を停止する。２００μｌの５６８ｍＭのアスコルビン酸（ｐＨ５．８）を加え、混合し、３０℃に１５分間インキュベートした後、分光光度計を用いて８５０ｎｍの吸光度を測定する。濃度既知の無機リン酸を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成し、この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中の無機リン酸を求める。無機リン酸は、リン酸イオンとして定量される。グルコース−１−リン酸の量は定量されない。
【0112】
α−グルカンホスホリラーゼは、精製されていても未精製であってもよい。精製されたα−グルカンホスホリラーゼが好ましい。α−グルカンホスホリラーゼは、固定化されていても固定化されていなくともよい。α−グルカンホスホリラーゼは、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。α−グルカンホスホリラーゼは、担体上に固定化されていることが好ましい。【0113】
（２．３）α−グルカンホスホリラーゼの製造本発明で用いられるα−グルカンホスホリラーゼは、上記のような自然界に存在する、α−グルカンホスホリラーゼを産生する生物から直接単離され得る。あるいは、本発明で用いられるα−グルカンホスホリラーゼは、上記の生物から単離したα−グルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【0114】
好ましい実施形態では、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼは、配列番号１の遺伝子断片を化学合成し、この遺伝子断片を含む発現ベクターを構築し、この発現ベクターを微生物へ導入して組換え微生物を作製し、この組換え微生物を培養してα−グルカンホスホリラーゼを生産させ、そして生産されたα−グルカンホスホリラーゼを回収することにより生産される。遺伝子組換えによる酵素生産方法は、当業者に周知である。本願発明に用いられる宿主微生物には、原核生物および真核生物が含まれ、中温菌が好ましい。特に好ましい微生物としては、例えば大腸菌などが挙げられるが、これに限定されない。【0115】
本発明の方法で用いられるα−グルカンホスホリラーゼは、例えば、以下のようにして調製され得る。まず、α−グルカンホスホリラーゼを産生する微生物（例えば、細菌、真菌など）を培養する。この微生物は、α−グルカンホスホリラーゼを直接生産する微生物であってもよい。また、α−グルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子をクローン化し、得られた遺伝子でα−グルカンホスホリラーゼ発現に有利な微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えして組換えされた微生物を得、得られた微生物からα−グルカンホスホリラーゼを得てもよい。【0116】
α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子での遺伝子組換えに用いられる微生物は、α−グルカンホスホリラーゼの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。α−グルカンホスホリラーゼは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。α−グルカンホスホリラーゼの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生されるα−グルカンホスホリラーゼは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。【0117】
クローン化した遺伝子での微生物（例えば、細菌、真菌など）の遺伝子組換えは、当業者に周知の方法に従って行われ得る。クローン化した遺伝子を用いる場合、この遺伝子を、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターに作動可能に連結することが好ましい。「作動可能に連結する」とは、プロモーターと遺伝子とが、そのプロモーターによって遺伝子の発現が調節されるように連結されることをいう。誘導性プロモーターを用いる場合、培養を、誘導条件下で行うことが好ましい。種々の誘導性プロモーターは当業者に公知である。【0118】
発現ベクターとは、目的の遺伝子が転写および翻訳されるように目的の遺伝子に作動可能に連結されており、さらに必要に応じて微生物内での複製および組換え体の選択に必要な因子を備えた媒体をいう。また、発現産物（α−グルカンホスホリラーゼ）の分泌生産が意図される場合は、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列が、目的のタンパク質をコードするＤＮＡの上流に正しいリーディングフレームで結合される。シグナルペプチドをコードする塩基配列は当業者に公知である。発現ベクターの種類が使用する微生物宿主に応じて代わり得ることは、当業者に周知である。【0119】
好ましい発現ベクターとしては、大腸菌中でも発現可能なｐＴＲＣ９９Ａ（ファルマシア製）などが挙げられる。上記発現ベクター内の転写および翻訳に必要な因子に作動可能に連結するために、目的のα−グルカンホスホリラーゼ遺伝子を加工しなければならない場合がある。これらは例えばプロモーターとコード領域との間が長すぎて転写効率の低下が予想される場合、またはリボゾーム結合部位と翻訳開始コドンとの間隔が適切でない場合などである。加工の手段としては、制限酵素による消化、Ｂａｌ３１、ＥｘｏＩＩＩなどのエキソヌクレアーゼによる消化、あるいはＭ１３などの一本鎖ＤＮＡまたはＰＣＲを使用した部位特異的突然変異の導入が挙げられる。【0120】
本発明で使用されるα−グルカンホスホリラーゼをコードする塩基配列は、発現のために導入される生物におけるコドンの使用頻度にあわせて変更され得る。コドン使用頻度は、その生物において高度に発現される遺伝子での使用頻度を反映する。例えば、大腸菌において発現させることを意図する場合、公開されたコドン使用頻度表（例えば、Ｓｈａｒｐら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６ 第１７号，８２０７頁（１９８８））に従って大腸菌での発現のために最適にすることができる。【0121】
発現ベクターを導入してα−グルカンホスホリラーゼ生産能力を獲得した形質転換株によって目的遺伝子を生産するために、使用する宿主微生物および発現ベクター内の発現を調節する因子の種類、ならびに発現される物質に応じて適切な条件が選択される。例えば、通常の振とう培養方法が用いられ得る。【0122】
用いる培地は、使用される宿主微生物が生育するものであれば特に限定されない。培地には炭素源、窒素源の他、無機塩、例えば、リン酸、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｎａ＋、Ｋ＋等の塩が必要に応じて、適宜混合して、または単独で用いられ得る。また、必要に応じて形質転換体の生育、酵素の生産に必要な各種無機物、有機物が添加され得る。【0123】
培養の温度は用いる形質転換体の生育に適した温度を選択し得る。通常約１５℃〜約６０℃である。本願発明の好ましい実施態様において中温菌を使用する場合、約２５℃〜約４０℃での培養が好ましい。また、形質転換株の培養は、α−グルカンホスホリラーゼの生産のために十分な時間続行されるが、本願発明の好ましい実施態様では、培養時間は約２４時間程度である。【0124】
誘導性のプロモーターを有する発現ベクターを使用する場合は、誘導物質の添加、培養温度の変更、培地成分の調整などにより発現が制御され得る。例えば、ラクトース誘導性プロモーターを有する発現ベクターを使用する場合は、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより発現が誘導され得る。【0125】
例えば、発現されたα−グルカンホスホリラーゼが形質転換細胞内に蓄積する場合、形質転換細胞を適切な条件下で培養した後、培養物を遠心分離または濾過することによって細胞を回収し、次いで適切な緩衝液に懸濁する。次いで超音波処理などにより細胞を破砕した後、遠心分離もしくは濾過することによってα−グルカンホスホリラーゼを含む上清を得る。あるいは、発現されたα−グルカンホスホリラーゼが形質転換細胞外に分泌される場合、形質転換細胞を適切な条件下で培養した後、培養物を遠心分離または濾過することによって形質転換細胞を除去してα−グルカンホスホリラーゼを含む上清を得る。α−グルカンホスホリラーゼが形質転換細胞内に蓄積する場合も、形質転換細胞外に分泌される場合も、このようにして得られたα−グルカンホスホリラーゼ含有上清を通常の手段（例えば、塩析法、溶媒沈澱、または限外濾過）を用いて濃縮し、α−グルカンホスホリラーゼを含む画分を得る。この画分を濾過、あるいは遠心分離、脱塩処理などの処理を行い粗酵素液を得る。さらにこの粗酵素液を、凍結乾燥、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、晶出などの通常の酵素の精製手段を適宜組み合わせることによって、比活性の向上した粗酵素あるいは精製酵素が得られる。α−アミラーゼ等のα−グルカンを分解する酵素、およびホスファターゼ等のグルコース−１−リン酸を分解する酵素が含まれていなければ、その粗酵素がそのまま以後の反応に用いられ得る。【0126】
Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼは耐熱性であるので、このα−グルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子を大腸菌などの中温菌で発現させた場合、発現されたα−グルカンホスホリラーゼは簡便に精製され得る。簡単に述べると、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼを含む酵素画分を６０℃で加熱処理することにより、夾雑酵素が不溶化する。この不溶化物を遠心分離などで除去して透析処理を行うことにより、精製された酵素液が得られる。【0127】
（２．４）ウロン酸含有グルカンの製造本発明のウロン酸含有グルカンは、グルクロン酸−１−リン酸、グルカン、およびグルクロン酸残基をグルカンの非還元末端に転移する反応を触媒し得るα−グルカンホスホリラーゼ（例えば、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ）を含む反応溶液を反応させる工程を含む方法により製造され得る。この方法においてグルカンの代わりにグルカン修飾物を使用することによりウロン酸含有グルカンの修飾物を製造することができる。以下においては、例示として、グルカンを用いる方法について説明する。
【0128】
図１に、直鎖状グルカンの非還元末端にグルクロン酸残基を含むウロン酸含有グルカンの製造方法の概略の一例を示す。図１に示す反応においては、直鎖状グルカンを受容体として使用すると、直鎖状グルカンの非還元末端にグルクロン酸を１分子のみ転移する。図２に、分岐状グルカンの非還元末端にグルクロン酸残基を含むウロン酸含有グルカンの製造方法の概略の一例を示す。【0129】
まず、反応溶液を調製する。反応溶液は、例えば、適切な溶媒に、グルクロン酸−１−リン酸、グルカン、およびα−グルカンホスホリラーゼを添加することにより調製され得る。この反応溶液には、酵素反応を阻害しない限り、必要に応じて、ｐＨを調整する目的で任意の緩衝剤、及び無機塩類を加えてもよい。この反応溶液には、必要に応じてα−グルカンホスホリラーゼの本来の基質である、グルコース−１−リン酸を添加してもよい。グルクロン酸−１−リン酸とグルコース−１−リン酸を共存させた反応の場合、受容体グルカンの非還元末端にグルコース残基を結合させる反応と、グルクロン酸残基を結合させる反応が同時に行われることになる（例えば、図３参照）。グルカンの非還元末端にグルクロン酸残基が結合すると、α−グルカンホスホリラーゼはグルクロン酸残基の非還元末端にさらに分子を転移させることができない。しかし、グルカンの非還元末端にグルコース残基が結合すると、α−グルカンホスホリラーゼは得られる分子の非還元末端にさらにグルコース残基またはグルクロン酸残基を転移することができる。そのため、グルコース−１−リン酸が共存するとグルカンの鎖長を伸ばすことができる。従って、最終的に得られるウロン酸含有グルカンの構造は、グルクロン酸−１−リン酸とグルコース−１−リン酸の添加比率により制御されることになる。この反応溶液には、必要に応じて、枝切り酵素、ブランチングエンザイム、４−α−グルカノトランスフェラーゼおよびグリコーゲンデブランチングエンザイムからなる群より選択される酵素を添加してもよい。【0130】
次いで、反応溶液を、当該分野で公知の方法によって必要に応じて加熱することにより、反応させる。反応温度は、本発明の効果が得られる限り、任意の温度であり得る。反応温度は代表的には、約３０℃〜約９０℃の温度であり得る。この反応工程における溶液の温度は、所定の反応時間後に反応前のこの溶液に含まれるα−グルカンホスホリラーゼの活性の約５０％以上、より好ましくは約８０％以上の活性が残る温度であることが好ましい。反応温度は好ましくは約３５℃〜約８０℃であり、より好ましくは約３５℃〜約７０℃、さらにより好ましくは約３５℃〜約６５℃である。Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来のα−グルカンホスホリラーゼは耐熱性酵素であり、その反応至適温度は約８０〜９０℃である。反応速度の面からは、反応温度がある程度高いことが好ましい。一方、酵素の反応至適温度の面からは約８０〜９０℃での反応が可能である。しかし、得られる生成物の安定性、グルクロン酸−１−リン酸やグルコース−１−リン酸の安定性などの観点から、反応温度はＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来のα−グルカンホスホリラーゼの反応至適温度よりも少し低いことが好ましい。反応温度は、好ましくは約３０℃以上であり、より好ましくは約３５℃以上であり、さらに好ましくは約４０℃以上である。特定の実施形態では、反応温度は約４５℃以上または約５０℃以上であってもよい。反応温度は、好ましくは約９０℃以下であり、より好ましくは約８０℃以下であり、さらに好ましくは約７０℃以下である。特定の実施形態では、反応温度は約６５℃以下または約６０℃以下であってもよい。【0131】
反応時間は、反応温度、酵素の残存活性を考慮して、任意の時間で設定され得る。反応時間は、代表的には約１時間〜約１００時間、より好ましくは約１時間〜約７２時間、さらにより好ましくは約２時間〜約３６時間、最も好ましくは約２時間〜約２４時間である。特定の実施形態では、反応時間は、例えば、約１時間以上、約２時間以上、約５時間以上、約１０時間以上、約１２時間以上、約２４時間以上であってもよい。特定の実施形態では、反応時間は、例えば、約１００時間以下、約７２時間以下、約６０時間以下、約４８時間以下、約３６時間以下、約２４時間以下であってもよい。【0132】
加熱は、どのような手段を用いて行ってもよいが、溶液全体に均質に熱が伝わるように、攪拌を行いながら加熱することが好ましい。溶液は、例えば、温水ジャケットと攪拌装置を備えたステンレス製反応タンクの中に入れられて攪拌される。【0133】
本発明の方法ではまた、反応がある程度進んだ段階で、グルクロン酸−１−リン酸、グルカン、およびα−グルカンホスホリラーゼのうちの少なくとも１つを反応溶液に追加してもよい。【0134】
このようにして、ウロン酸含有グルカンを含有する溶液が生産される。【0135】
反応終了後、反応溶液は、必要に応じて例えば、１００℃にて１０分間加熱することによって反応溶液中の酵素を失活させ得る。あるいは、酵素を失活させる処理を行うことなく後の工程を行ってもよい。反応溶液は、そのまま保存されてもよいし、生産されたウロン酸含有グルカンを単離するために処理されてもよい。【0136】
反応終了後、ウロン酸含有グルカンを精製してから、またはウロン酸含有グルカンの精製前に、得られたウロン酸含有グルカンのグルカン部分のアルコール性水酸基のうちの少なくとも１つを修飾することによりウロン酸含有グルカンの水酸基修飾物を製造してもよい。ウロン酸含有グルカンを精製してから修飾を行うことが好ましい。修飾は、当該分野で公知の方法に従って行われ得る。修飾の例としては、ヒドロキシアルキル化、アルキル化、アシル化、カルボキシメチル化、硫酸化およびリン酸化が挙げられる。アシル化が好ましく、アセチル化がより好ましい。ウロン酸含有グルカン又はウロン酸含有グルカン水酸基修飾物を製造した後に、グルカンの還元末端を修飾することによりウロン酸含有グルカン又はウロン酸含有グルカン水酸基修飾物の還元末端修飾物を製造してもよい。さらに、これらのグルカン部分のウロン酸が結合していない非還元末端を修飾してもよい。グルカンに対するウロン酸残基の結合、水酸基の修飾、還元末端の修飾及び非還元末端の一部へのウロン酸残基以外の修飾基での修飾は、任意の順序で行われ得る。【0137】
（２．５）ウロン酸含有グルカンの精製＜精製方法＞
生産されたウロン酸含有グルカン（又はその修飾物）は、必要に応じて精製され得る。精製することにより除去される不純物の例は、無機リン酸、グルクロン酸−１−リン酸、無機塩類などである。グルカンの精製法の例としては、有機溶媒を用いる方法（Ｔ．Ｊ．Ｓｃｈｏｃｈら、Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，６４，２９５７（１９４２））および有機溶媒を用いない方法がある。
【0138】
有機溶媒を用いる精製に使用され得る有機溶媒の例としては、アセトン、ｎ−アミルアルコール、ペンタゾール、ｎ−プロピルアルコール、ｎ−ヘキシルアルコール、２−エチル−１−ブタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール、ｎ−ブチルアルコール、３−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、ｄ，ｌ−ボルネオール、α−テルピネオール、イソブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、２−メチル−１−ブタノール、イソアミルアルコール、ｔｅｒｔ−アミルアルコール、メントール、メタノール、エタノールおよびエーテルが挙げられる。【0139】
有機溶媒を用いない精製方法の例としては、ウロン酸含有グルカン生産反応後、水に溶解しているウロン酸含有グルカンを沈澱させずに、限外ろ過膜を用いた膜分画もしくはクロマトグラフィーに供して無機リン酸、グルクロン酸−１−リン酸、無機塩類を除去する方法がある。【0140】
精製に使用され得る限外濾過膜の例としては、分画分子量約１，０００〜約１００，０００、好ましくは約５，０００〜約５０，０００、より好ましくは約１０，０００〜約３０，０００の限外濾過膜（ダイセル製ＵＦ膜ユニット）が挙げられる。【0141】
クロマトグラフィーに使用され得る担体の例としては、ゲル濾過クロマトグラフィー用担体、配位子交換クロマトグラフィー用担体、イオン交換クロマトグラフィー用担体および疎水クロマトグラフィー用担体が挙げられる。【0142】
（２．６）α−グルカンホスホリラーゼを利用した糖質合成についての概略酵素を触媒とする糖鎖伸長反応は無保護の基質を用いて穏和な条件下で進行し、位置・立体選択性の制御が容易であることから構造明確なオリゴ糖鎖の合成に有用である。ホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．１）はα−Ｄ−グルコース−１−リン酸（Ｇｌｃ−１−Ｐ）を基質として認識し、α−１，４−グルカンを生成する糖鎖伸長反応を触媒することが知られている。ホスホリラーゼが、より多くの糖リン酸エステルを基質として認識することができれば、新しい糖鎖合成につながると考えられる。このような観点から、我々はすでにホスホリラーゼがα−Ｄ−キシロース−１−リン酸を基質として認識し、マルトオリゴ糖の酵素的キシロシル化反応を触媒することを報告している（文献１（Ｍ．Ｎａｗａｊｉ，Ｈ．Ｉｚａｗａ，Ｙ．Ｋａｎｅｋｏ，Ｊ．Ｋａｄｏｋａｗａ，Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．，２００８，２７，２１４））。本研究では、α−Ｄ−グルコサミン−１−リン酸（ＧｌｃＮ−１−Ｐ）（文献２（Ｍ．Ｎａｗａｊｉ，Ｈ．Ｉｚａｗａ，Ｙ．Ｋａｎｅｋｏ，Ｊ．Ｋａｄｏｋａｗａ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２００８，３４３，２６９２））とその誘導体（Ｎ−ホルミルグルコサミン−１−リン酸（ＧｌｃＮＦ−１−Ｐ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸（ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ））及びグルクロン酸−１−リン酸（ＧｌｃＡ−１−Ｐ）を新しい基質として取り上げ、ホスホリラーゼによるマルトオリゴ糖への酵素的糖鎖伸長化反応を検討した（図４）。
【0143】
ＧｌｃＮ−１−Ｐを基質に用いるマルトオリゴ糖への糖鎖伸長反応は、酢酸緩衝液（２００ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ６．５）中にプライマー（マルトテトラオース，Ｇｌｃ４）、ＧｌｃＮ−１−Ｐ及びホスホリラーゼ（６０Ｕ）を加えて４０℃で４８時間撹拌することにより行った（図５）。反応終了後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる解析を容易にするために粗生成物のＮ−アセチル化を行った。得られたアセチル化物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ測定を行ったところ、マルトオリゴ糖の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基を有するＮ−アセチル−α−グルコサミニル１，４−マルトオリゴ糖（ＧｌｃＮＡｃ−Ｇｌｃｎ）の存在が確認され、マルトオリゴ糖へのグルコサミニル化反応の進行が示唆された。【0144】
さらに、グルコ−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．３）を用いて残存しているマルトオリゴ糖の加水分解反応を行い、主生成物をＨＰＬＣによって単離した。この構造を１Ｈ ＮＭＲ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルより確認したところ、Ｎ−アセチル−α−グルコサミニル１，４−マルトテトラオースであることがわかった。また、ＧｌｃＮＦ−１−Ｐ、ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ及び、ＧｌｃＡ−１−Ｐを基質に用いて反応を行ったところ、ＧｌｃＮＦ−１−ＰとＧｌｃＡ−１−Ｐはホスホリラーゼに基質として認識されて、対応する単糖ユニットが非還元末端に転移したオリゴ糖が得られることが明らかになった。【0145】
（２．７）ウロン酸含有グルカン及びその修飾物及び結合体本発明のウロン酸含有グルカン及びその修飾物をさらに、ウロン酸残基のカルボキシル残基において薬効成分と結合させることにより、結合体を得ることができる。ウロン酸含有グルカンと薬効成分とが結合したものを「ウロン酸含有グルカン−薬効成分結合体」といい、ウロン酸含有グルカンの修飾物と薬効成分とが結合したものを「ウロン酸含有グルカン修飾物−薬効成分結合体」という。同様に、ウロン酸がグルクロン酸の場合、グルクロン酸含有グルカンと薬効成分とが結合したものを「グルクロン酸含有グルカン−薬効成分結合体」といい、グルクロン酸含有グルカンの修飾物と薬効成分とが結合したものを「グルクロン酸含有グルカン修飾物−薬効成分結合体」という。
【0146】
ウロン酸含有グルカン修飾物は、水酸基修飾物、非還元末端修飾物または還元末端修飾物であり得る。【0147】
水酸基修飾物については上記のとおりである。【0148】
非還元末端修飾物について説明する。ウロン酸含有グルカン又はその修飾物のグルカン部分が分岐状α−１，４−グルカンであってウロン酸残基が結合していない非還元末端が存在する場合、ウロン酸残基が結合していない非還元末端において他の物質と結合させることができる。好ましい実施形態では、ウロン酸残基が結合していない非還元末端に標的性分子を結合させる。本明細書中では、用語「標的性分子」とは、組織ターゲット機能を有する分子をいう。標的性分子の例としては、マンノース、ガラクトース、グルコサミン、キシロース、フコース、ガラクトサミン、抗体、抗体フラグメント、受容体、受容体フラグメント及び受容体リガンドが挙げられる。特にガラクトースは肝実質細胞表面に存在するアシアロ糖タンパクレセプターに認識されるため、有効である。またマンノースはクッパー細胞をはじめとする種々のマクロファージや肝臓の類洞血管内皮細胞上に発現しているマンノースレセプターに認識されるため有効である。マンノースおよびガラクトースは、例えば、マンノース１−リン酸又はガラクトース１−リン酸を基質にα−グルカンホスホリラーゼを作用させることによりウロン酸含有グルカン又はその修飾物の非還元末端に結合され得る。酵素反応により結合させる場合、マンノースおよびガラクトースはウロン酸残基が結合していない非還元末端グルコース残基の４位において結合する。【0149】
還元末端修飾物について説明する。「グルクロン酸含有グルカンの還元末端修飾物」とは、本発明のグルクロン酸含有グルカンに存在する還元末端に別の物質を結合させたものをいう。好ましい実施形態では、還元末端において他の物質と結合させる方法は以下の２通りがある。第一は、公知の酵素的、あるいは公知の化学的手法により、他の物質に重合度２以上、より好ましくは重合度３以上、さらに好ましくは重合度４以上のマルトオリゴ糖の還元末端を結合させ、その後本発明の方法を用いてグルクロン酸をマルトオリゴ糖の非還元末端に結合させる方法である。第二の方法は、本発明のグルクロン酸含有グルカンの還元末端を、公知の酵素的手法により、他の物質に結合させる方法である。【0150】
第一の方法における酵素的に他の物質にマルトオリゴ糖を結合する方法は、例えば、特開平５−２７６８８３号公報、特開平０７−２４１１８１号公報及び国際公開番号ＷＯ０１／０７３１０６に開示されている。【0151】
第一の方法における酵素的に他の物質にマルトオリゴ糖を結合する方法は、アミン基を有する物質に対して用いることが出来る。例えばマルトペンタオースとアミン基を有する物質の化学的結合方法には、以下の三種がある：（Ａ）マルトペンタオースの還元末端アルデヒドとアミン基を有する物質を還元アミノ化により結合する方法；
（Ｂ）マルトペンタオースの還元末端アルデヒドを酸化してマルトテトラオシルグルコン酸としたのち、アミン基を有する物質と縮合剤により脱水縮合する方法；および
（Ｃ）マルトペンタオースの還元末端アルデヒドを酸化してマルトテトラオシルグルコン酸としたのち脱水してマルトテトラオシルグルコノラクトンを調製し、これを、アミン基を有する物質と無水溶媒条件で加熱して結合させる方法。（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）の３種の方法は、特願２００８−１２１６９３に詳細に記載されている。
【0152】
第二の本発明のグルクロン酸含有グルカンの還元末端を、酵素的手法により、他の物質に結合させる方法に利用可能な酵素は、糖質及び配糖体にのみ適用可能である。酵素には、ブランチングエンザイム、ＣＧＴａｓｅ、Ｄ酵素、アミロマルターゼなどのいわゆるグルカン鎖転移酵素を用いる。これら酵素はグルクロン酸含有グルカン中のα−１，４結合を切断し、その非還元末端側のフラグメント（グルクロン酸含有フラグメント）を受容体分子（ここでは糖質もしくは配糖体）に転移する。【0153】
結合させる物質の例としては、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体、アミン基含有低分子量物質が挙げられる。【0154】
単糖類の例としては、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコン酸などの官能基を有する単糖類が挙げられる。非還元性糖質類の例としては、ソルビトール、スクロース、トレハロース、シクロデキストリン、環状デキストリン、及び環状アミロースが挙げられる。生体適合性高分子の例としては、デンプン、セルロース、キチン、キトサン、デキストラン、タンパク質、及びペプチドが挙げられる。リポソーム構成成分の例としては、リン脂質、脂肪酸、及び界面活性剤が挙げられる。配糖体の例としては、アスコルビン酸グルコシド、ハイドロキノングルコシド、ヘスペリジングルコシド、ルチングルコシド、パラニトロフェニルマルトペンタオース、ドデシルマルトース、フラボノイド配糖体類、テルペン配糖体類、フェノール配糖体類、カルコン配糖体類、及びステロイド配糖体類が挙げられる。アミン基含有低分子物質の例としては、各種アミノ酸、ドデシルアミン、などが挙げられる。【0155】
ウロン酸含有グルカン又はその修飾物のウロン酸残基のカルボキシル残基に別の物質を結合させる実施形態については以下の「３」に詳述する。【0156】
（３．ウロン酸含有グルカン及びその修飾物の利用）本発明のウロン酸含有グルカン及びその修飾物は、非還元末端にウロン酸残基が結合しているため、非還元末端にカルボキシル基を有しており、その結果、グルカンを負に帯電させることができる。たとえば分岐グルカンの非還元末端に多数のウロン酸が結合している本発明のウロン酸含有分岐グルカン及びその修飾物は、溶媒のｐＨを変化させることにより、非還元末端のウロン酸のカルボキシル基が解離した状態と、非解離の状態とを作り出すことが出来る。非還元末端のウロン酸残基のカルボキシル基が解離した状態では、静電反発により、ウロン酸含有分岐グルカン、その修飾物及びそれらの結合体は伸びきった構造となり、非解離の状態ではウロン酸含有分岐グルカン及びその修飾物は収縮した状態となると考えられる。このようなｐＨ依存的な分岐多糖ミクロゲルのコンホメーション変化は、医薬品デリバリーへの利用が可能である。
【0157】
本発明のウロン酸含有グルカン及びその修飾物は、非還元末端にカルボキシル基を有しており、このカルボキシル基に対して陽イオンをキレートすることが出来る。本発明のウロン酸含有グルカン又はその修飾物を含む溶液にさらにカルシウムなどの２価陽イオンを添加した場合には、カルシウムを介した架橋形成が起こり、ウロン酸含有グルカン及びその修飾物のミクロゲルやマクロゲルを得ることできる。このようなウロン酸含有グルカン及びその修飾物のミクロゲルやマクロゲルは化粧品、医薬品、食品、日用品などの広い産業分野で利用できる。【0158】
本発明のウロン酸含有グルカン及びその修飾物は、非還元末端に反応性基であるカルボキシル基を有する。このためこのカルボキシル基を介して、別の物質（例えば、薬効成分）にグルカン鎖を直接的または適切なスペーサーを介して間接的に結合させることが出来る。その結果、当該物質の物性を改変したり、当該物質に対して機能を付与したりすることが可能である。ここで言う別の物質とは、低分子量有機化合物、高分子有機化合物、医薬品ＤＤＳ用微小粒子状キャリア（高分子ミセル、ウイルス粒子、リポソームなど）、無機物質（例えば、磁性微粒子）のいずれでもかまわない。別の物質は好ましくは薬効成分である。たとえば本発明のウロン酸含有グルカン及びその修飾物は、カルボジイミドなどの適当な縮合剤の存在下、アミノ基を有する物質と反応させることにより、アミノ基を有する物質に容易に結合させることが出来る。アミノ基を有する物質がペプチド、タンパク質などのアミノ基を含有する薬効成分の場合、得られる化合物は、ウロン酸含有グルカン又はその修飾物と薬効成分とが直接的に結合した結合体である。あるいは、薬効成分をウロン酸含有グルカン又はその修飾物にスペーサーを介して結合させることができる。この場合、ウロン酸含有グルカン又はその修飾物のカルボキシル基に、アミン基及び薬効成分との結合に利用可能な官能基を有する化合物を結合させることができる。薬効成分などとの結合のためにカルボキシル基に別の化合物を結合させることを「カルボキシル基の修飾」という。グルカン鎖の付与による物性の改変効果としては、水溶性の改善、水和層形成による生体親和性の付与などが期待できる。【0159】
カルボキシル基の修飾には、アミノ基（すなわち、一級アミン基）または二級アミン基と別の官能基とを有する修飾試薬を使用することができる。本明細書中では、グルクロン酸含有グルカン及びグルクロン酸含有グルカン修飾物のカルボキシル基の修飾に使用されるアミン基を有する物質を「カルボキシル基修飾試薬」ともいう。カルボキシル基修飾試薬は、少なくとも１つのアミン基および少なくとも１つの別の官能基を有する。この官能基の例としては、カチオン性官能基、アニオン性官能基、疎水性基、マレイミド基、チオール基及びアルデヒド基が挙げられる。カチオン性官能基の例としては、アミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、トリメチルアミノ基、アンモニウム基、ピリジニウム基が挙げられる。カチオン性官能基を有する修飾試薬の例としては、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、ジメチルアミノエチルアミン、ジエチルアミノエチルアミン、Ｎ,Ｎ−ジメチル−4−アミノピリジンが挙げられる。アニオン性官能基の例としては、リン酸基、スルホン酸基、硫酸基が挙げられる。アニオン性官能基を有する修飾試薬の例としては、４−アミノ−３,５−ジクロロ安息香酸、Ｏ−フォスフォエタノールアミン、アミノエチルスルホン酸が挙げられる。疎水性基の例としては、ステアリル基、パルミチル基、メチル基、プロピル基、ブチル基等のアルキル基、フェニル基、ベンジル基、トリル基等のアリール基が挙げられる。疎水性基を有する修飾試薬の例としては、ステアリルアミン、メチルアミン、ベンジルアミン、イソブチルアミン、２,４,６−トリメチルアニリンが挙げられる。マレイミド基を有する修飾試薬の例としては、Ｎ−（４−アミノフェニル）マレイミドが挙げられる。チオール基は、メルカプト基とも呼ばれる。チオール基を有する修飾試薬の例としては、メルカプトアミン、メルカプトエチルアミンが挙げられる。アルデヒド基の例としては、飽和非環式アルデヒド基、不飽和非環式アルデヒド基、飽和脂環式アルデヒド基、芳香族アルデヒド基が挙げられる。アルデヒド基を有する修飾試薬の例としては、２−アミノ−３,５−ジブロモベンズアルデヒド、4-ジメチルアミノベンズアルデヒドが挙げられる。カルボキシル基修飾試薬はまた、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ,Ｎ−ジスクシンイミドカーボネート、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２,３−ジカルボキシイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、イソブチルクロロホルメートおよび４−ヒドロキシフェニルジメチルスルホニウム・メチルスルフェートからなる群より選択され得る。これらの試薬を使用した場合、カルボキシル基とカルボキシル基修飾試薬との間でスクシンイミジルエステルが形成される。このようにしてカルボキシル基を修飾することにより、本発明のウロン酸含有グルカン及びその修飾物を他の分子に結合させるためのスペーサー部分を形成することができる。【0160】
例えばアミノ基を有する物質がキトサンの場合には、キトサンの主鎖に対し、本発明のウロン酸含有グルカンを多数グラフト化する（すなわち、結合させる）ことが可能となり、キトサンの物性を大きく変化させることが出来る。この場合、ウロン酸含有グルカン又はその修飾物とキトサンとの結合体が形成される。この結合体においては、ウロン酸含有グルカン又はその修飾物とキトサンとが直接結合している。【0161】
また、アミノ基を有する物質がリン脂質の場合には、本発明のウロン酸含有グルカン又はその修飾物が結合したリン脂質を得ることが出来る。このようなリン脂質を、ウロン酸含有グルカン又はその修飾物とリン脂質との結合体ともいう。この結合体においては、ウロン酸含有グルカン又はその修飾物とリン脂質とが直接結合している。このようなグルカン結合リン脂質を用いてリポソームを製造することにより、医薬品のデリバリーに利用可能なグルカン鎖結合リポソームを容易に得ることが出来る。【0162】
アミノ基を有する物質がタンパク質又はペプチドなどのタンパク質性薬効成分の場合には、グルカン鎖が結合したタンパク質又はペプチドなどのタンパク質性薬効成分を得ることが出来る。このようなタンパク質又はペプチドを、ウロン酸含有グルカン又はその修飾物とタンパク質又はペプチドとの結合体ともいう。この結合体においては、ウロン酸含有グルカン又はその修飾物とタンパク質又はペプチドとが直接結合している。この技術はタンパク性薬効成分（医薬品）の体内動態の改良に利用することが出来る。【0163】
アミノ基を有する物質が磁性微粒子である場合には、グルカン鎖が結合した磁性微粒子を得ることが出来、これは臨床診断用造影剤として利用できる。この場合、ウロン酸含有グルカン又はその修飾物と磁性微粒子との結合体が形成される。この結合体においては、ウロン酸含有グルカン又はその修飾物と磁性微粒子とが直接結合している。【0164】
アミノ基を有する物質が金属配位子（キレート剤）である場合には、グルカン鎖が結合した金属配位子を得ることが出来、これは放射性金属元素を配位することにより、臨床診断用造影剤として利用できる。この場合、ウロン酸含有グルカン又はその修飾物と金属配位子との結合体が形成される。この結合体においては、ウロン酸含有グルカン又はその修飾物と金属配位子とが直接結合している。【0165】
本発明のグルクロン酸含有グルカンは、非還元末端に反応性基であるカルボキシル基を有する。カルボキシル基は中性条件下、負電荷を帯びる。一方、このカルボキシル基を化学的に修飾することにより、カチオン性官能基又は疎水性基を、グルカンの末端に導入することが出来る。一方、本発明のグルカン部分には様々な構造や分子量のグルカンが利用できる。これら技術を組み合わせると、例えば、タンパク質を包み込むことが出来る程度の分子量の分岐グルカンの末端に、アニオン性官能基、カチオン性官能基、疎水性基などをコントロールして導入することが出来る。このような修飾グルカンの末端はフレキシブルに移動することが可能で、タンパク質表面に存在する電荷を帯びた部分と静電的相互作用を、疎水性領域と、疎水性相互作用を行い、結果として本発明のグルカンは、タンパク質と非共有結合によるコンプレックスを形成する。従って、本発明のウロン酸含有グルカン又はその修飾物とタンパク質、ペプチドなどとを溶液中で混合することにより、本発明のウロン酸含有グルカン又はその修飾物とタンパク質、ペプチドなどとのコンプレックスを形成することができる。同様に、核酸、リポソーム、ウイルス粒子、高分子ミセル、低分子量化合物と効果的に非共有結合的なコンプレックス形成ができるグルカンの末端構造を設計することも出来る。このように、本発明のグルカン及びその末端誘導体は、タンパク質、核酸、低分子量化合物、又は医薬品ＤＤＳ用微小粒子状キャリア（例えば、リポソーム、高分子ミセル、ウイルス粒子）と効果的にコンプレックスを形成し、これらの安定化、物性、吸収性、体内動態（例えば、臓器集積性、組織ターゲティング特性、血中滞留性）などに影響を与えることが出来る。このように本発明のグルカンは、医薬品の薬効成分のＤＤＳキャリアとして、また医薬品ＤＤＳ用微小粒子状キャリアの改質剤として有効に利用できる。【0166】
本発明のウロン酸含有グルカンを、医薬品の薬効成分の改質材料として利用する場合には、体内での改質材料の分解を制御する必要がある。グルカンが直鎖状α−１，４−グルカンである場合、α−アミラーゼによりすみやかな分解を受け、体内での存在時間が短くなりすぎる場合がある。このような場合、改質材料としての目的を果たすことが出来ない可能性がある。そこで、グルカンを構成するグルコースの水酸基の一部又はすべてを修飾することにより、分解に要する時間をコントロールすることが出来る。このようなウロン酸含有グルカンの水酸基修飾物は本発明において好ましい。修飾は、エーテル化又はエステル化である。エーテル化は好ましくはハロゲン化アルキルまたはアルコールとのエーテル化である。エーテル化に使用されるハロゲン化アルキルまたはアルコールの炭素数は好ましくは１〜１０であり、より好ましくは１〜５であり、さらに好ましくは１〜３である。ハロゲン基は好ましくはフルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードであり得る。エステル化は好ましくはカルボン酸またはハロゲン化アシルとのエステル化である。エステル化に使用されるカルボン酸またはハロゲン化アシルの炭素数は好ましくは１〜１０であり、より好ましくは１〜５である。修飾は望ましくはエステル化である。エステル化はより好ましくはアシル化であり、さらに好ましくはアセチル化である。【0167】
このように本発明のウロン酸含有グルカン及びその修飾物及びそれらの結合体（好ましくはグルクロン酸含有グルカン及びその修飾物及びそれらの結合体）は、グルカンの構造とその非還元末端の構造が自在に設計でき、これを利用することにより、医薬品の薬効成分の体内動態を自在にコントロールできる。体内で完全に分解可能な構造であり、蓄積による毒性を懸念することなく、安全に利用できる医薬品の薬効成分の改質材料である。【0168】
従って、本発明によれば、本発明のウロン酸含有グルカン又はその修飾物（好ましくはグルクロン酸含有グルカン及びその修飾物）と、薬効成分とを含む、医薬品が提供される。本発明の医薬品においては、薬効成分は、好ましくは、低分子量有機化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、受容体、受容体フラグメント、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびＲＮＡアプタマーからなる群より選択される。【0169】
本発明の特定の実施形態によれば、本発明のグルクロン酸含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのカルボン酸基修飾物と、薬効成分との結合体であって、該薬効成分は、前記グルクロン酸残基のカルボキシル基のうちの少なくとも１つと、直接共有結合しているか、又はスペーサーを介して結合している、結合体が提供される。該薬効成分は好ましくは、低分子量有機化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、受容体、受容体フラグメント、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびＲＮＡアプタマーからなる群より選択される。【0170】
特定の実施形態によれば、本発明によれば、本発明のウロン酸含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのカルボン酸基修飾物（好ましくはグルクロン酸含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのカルボン酸基修飾物）を含む、臨床診断用組成物が提供される。【0171】
特定の実施形態によれば、本発明によれば、本発明のウロン酸含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのカルボン酸基修飾物（好ましくはグルクロン酸含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのカルボン酸基修飾物）を含む、医薬品ＤＤＳ用微小粒子状キャリアが提供される。この医薬品ＤＤＳ用微小粒子状キャリアは、好ましくは、リポソーム、ウイルス粒子、高分子ミセルおよび疎水化高分子ナノゲルからなる群より選択される。【0172】
特定の実施形態によれば、本発明によれば、本発明のウロン酸含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのカルボン酸基修飾物（好ましくはグルクロン酸含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのカルボン酸基修飾物）を含む、医薬品ＤＤＳ用微小粒子状キャリアが提供される。【0173】
（４．本発明のウロン酸含有グルカン及びその修飾物及びそれらの結合体）本発明のウロン酸含有グルカンは、好ましくはグルクロン酸含有グルカンである。本明細書中では、グルカンの少なくとも１つの非還元末端にウロン酸残基が結合しているが非還元末端以外の位置にはウロン酸残基が存在しないグルカンを「ウロン酸含有グルカン」という。本明細書中では、グルカンの少なくとも１つの非還元末端にグルクロン酸残基が結合しているが非還元末端以外の位置にはグルクロン酸残基が存在しないグルカンを「ウロン酸含有グルカン」という。
【0174】
本発明のグルクロン酸含有グルカンは、グルカンの少なくとも１つの非還元末端にグルクロン酸残基が結合しているが、非還元末端以外の位置にはグルクロン酸残基が存在しないグルクロン酸含有グルカンであって、該グルカンが分岐状α−１，４グルカンまたは直鎖状α−１，４グルカンである。【0175】
グルクロン酸含有グルカンのグルカン部分が直鎖状グルカンの場合、非還元末端は１つなので、その非還元末端に１つのグルクロン酸残基が結合している。グルクロン酸含有グルカンのうちのグルカン部分が分岐状グルカンの場合、非還元末端は２つ以上あるので、そのうちの１つ以上の非還元末端にグルクロン酸残基が結合している。本発明のグルクロン酸含有グルカンにおいては、非還元末端以外の位置にはグルクロン酸残基が存在しない。非還元末端以外の位置にグルクロン酸残基が存在しないことは、例えば、グルクロン酸含有グルカンをα−アミラーゼとイソアミラーゼで処理することにより確認することができる。α−アミラーゼはα−１，４グルカンに作用してマルトースとグルコースを生じるが、グルクロン酸化されたα−１，４グルカン鎖はα−アミラーゼに抵抗性を示す。非還元末端のみにグルクロン酸残基を含むグルカンはα−アミラーゼとイソアミラーゼで処理することにより、グルクロノシルマルトース、マルトース、グルコースを生じる。一方、非還元末端以外にもグルクロン酸残基を含むグルカンはα―アミラーゼとイソアミラーゼで処理することにより、グルクロノシルマルトース、マルトース、グルコース以外の糖を生じる。この方法により、非還元末端以外の位置にグルクロン酸残基が結合していないことを確認することができる。【0176】
（４．１）グルクロン酸残基が結合した分岐状グルカン、その修飾物及びそれらの結合体本発明のグルクロン酸含有グルカンに含まれるグルカン部分が分岐状α−１，４グルカンである場合、グルクロン酸含有グルカンは、この分岐状α−１，４グルカンが有する複数の非還元末端のうちの少なくとも１つにグルクロン酸残基が結合している。本発明によれば、グルクロン酸残基が結合した分岐状グルカンの修飾物もまた提供される。本発明によれば、グルクロン酸残基が結合した分岐状グルカン又はその修飾物の結合体もまた提供される。修飾物の修飾については上記に詳述したとおりである。結合体で結合する物質についても上記に詳述したとおりである。
【0177】
本発明のグルクロン酸含有分岐状グルカン、その修飾物及びそれらの結合体に含まれる分岐状グルカン部分は、好ましくは分岐マルトオリゴ糖、デンプン、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、酵素合成分岐グルカン及び高度分岐環状デキストリン、からなる群より選択される。これらの分岐状グルカン部分の好適な範囲については、「（１．１）グルカンおよびグルカンの修飾物」において説明したとおりである。【0178】
本発明のグルクロン酸含有分岐状グルカンの分子量は、好ましくは約１０００以上であり、より好ましくは約３０００以上であり、さらに好ましくは約５０００以上である。本発明のグルクロン酸含有分岐状グルカンの分子量は、好ましくは約１×１０９以下であり、より好ましくは約３×１０８以下であり、さらに好ましくは約１×１０８以下である。【0179】
本発明のグルクロン酸含有分岐状グルカンの修飾物の分子量は、好ましくは約１０００以上であり、より好ましくは約３０００以上であり、さらに好ましくは約５０００以上である。本発明のグルクロン酸含有分岐状グルカンの修飾物の分子量は、好ましくは約１×１０９以下であり、より好ましくは約３×１０８以下であり、さらに好ましくは約１×１０８以下である。【0180】
本発明の結合体においては、上記のような好適な分子量のグルクロン酸含有分岐状グルカンに対して他の物質（例えば、標的性分子、薬効成分など）が結合していることが好ましい。【0181】
本発明においては、グルクロン酸含有分岐状グルカン修飾物が好ましい。修飾はアシル化またはエーテル化であることが好ましく、アセチル化がより好ましい。アシル化度は、好ましくは約０．１以上であり、さらに好ましくは約０．２以上であり、特に好ましくは約０．３以上である。アシル化度は、アルカリ条件下での加熱により遊離する酢酸の定量によって計算される。エーテル化度は、好ましくは約０．１以上であり、さらに好ましくは約０．２以上であり、特に好ましくは約０．３以上である。エーテル化度は、ＮＭＲによって計算される。【0182】
本発明のグルクロン酸含有分岐状グルカン、その修飾物及びそれらの結合体に結合しているグルクロン酸残基の数は、１分子あたり、好ましくは１個以上であり、より好ましくは２個以上であり、さらに好ましくは３個以上である。本発明のグルクロン酸含有分岐状グルカン又はその修飾物に結合しているグルクロン酸残基の数は、これらに限定されず、例えば、１分子あたり、５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、５０個以上、１００個以上などであってもよい。目的により適切に調整され得る。本発明のグルクロン酸含有分岐状グルカン又はその修飾物に結合しているグルクロン酸残基の数の上限は、分岐状グルカン部分の非還元末端の数である。本発明のグルクロン酸含有分岐状グルカン又はその修飾物に結合しているグルクロン酸残基の数は、例えば、１分子あたり、約１０００個以下、約８００個以下、約７００個以下、約６００個以下、約５００個以下、約４００個以下、約３００個以下、約２００個以下、約１００個以下、約５０個以下などであり得る。【0183】
特定の実施形態では、本発明のグルクロン酸含有分岐状グルカン、その修飾物及びそれらの結合体に結合しているグルクロン酸残基の数は、分岐状グルカン部分が有する非還元末端の数の好ましくは約１０％以上であり、より好ましくは約２０％以上であり、特に好ましくは約３０％以上であり、例えば、約４０％以上、約５０％以上または約６０％以上であり得る。特定の実施形態では、本発明のグルクロン酸含有分岐状グルカン、その修飾物及びそれらの結合体に結合しているグルクロン酸残基の数は、分岐状グルカン部分が有する非還元末端の数の好ましくは約１００％以下であり、より好ましくは約９０％以下であり、特に好ましくは約８０％以下であり、例えば、約７０％以下、約６０％以下または約５０％以下であり得る。【0184】
（４．２）グルクロン酸残基が結合した直鎖状グルカン、その修飾物及びそれらの結合体本発明のグルクロン酸含有直鎖状グルカンは、直鎖状グルカン部分の非還元末端にグルクロン酸残基が結合している。直鎖状グルカンは非還元末端を１つしか有さないので、本発明のグルクロン酸含有直鎖状グルカンは、グルクロン酸残基を１つしか含まない。本発明によれば、グルクロン酸残基が結合した直鎖状グルカンの修飾物もまた提供される。本発明によれば、グルクロン酸残基が結合した直鎖状グルカン又はその修飾物の結合体もまた提供される。修飾物の修飾については上記に詳述したとおりである。結合体で結合する物質についても上記に詳述したとおりである。
【0185】
本発明のグルクロン酸含有直鎖状グルカン又はその修飾物に含まれる直鎖状グルカン部分は、好ましくはマルトオリゴ糖、アミロース（例えば、天然のアミロースまたは酵素合成アミロース）及びそれらの誘導体からなる群より選択される。これらの直鎖状グルカン部分の好適な範囲については、「（１．１）グルカンおよびグルカンの修飾物」において説明したとおりである。【0186】
本発明のグルクロン酸含有直鎖状グルカンの分子量は、好ましくは約４５０以上であり、より好ましくは約６００以上であり、さらに好ましくは約１０００以上である。本発明のグルクロン酸含有直鎖状グルカンの分子量は、好ましくは約２０００００以下であり、より好ましくは約１５００００以下であり、さらに好ましくは約１０００００以下である。【0187】
本発明のグルクロン酸含有直鎖状グルカンの修飾物の分子量は、好ましくは約４５０以上であり、より好ましくは約６００以上であり、さらに好ましくは約１０００以上である。本発明のグルクロン酸含有直鎖状グルカンの修飾物の分子量は、好ましくは約２０００００以下であり、より好ましくは約１５００００以下であり、さらに好ましくは約１０００００以下である。【0188】
本発明の結合体においては、上記のような好適な分子量のグルクロン酸含有直鎖状グルカンに対して他の物質（例えば、標的性分子、薬効成分など）が結合していることが好ましい。【0189】
本発明においては、グルクロン酸含有直鎖状グルカンの修飾物が好ましい。修飾は、アシル化またはエーテル化であることが好ましく、アセチル化がより好ましい。アシル化度は、好ましくは約０．１以上であり、さらに好ましくは約０．２以上であり、特に好ましくは約０．３以上である。アシル化度は、アルカリ条件下での加熱により遊離する酢酸の定量によって計算される。エーテル化度は、好ましくは約０．１以上であり、さらに好ましくは約０．２以上であり、特に好ましくは約０．３以上である。エーテル化度は、ＮＭＲによって計算される。【0190】
本発明のグルクロン酸含有直鎖状グルカンは、例えば以下の式１によって示され得る：【0191】
【化16】
【0192】
ここでｎは１以上の整数である。ｎは好ましくは約１以上であり、より好ましくは約２以上であり、さらに好ましくは約３以上である。ｎは好ましくは約１２００以下であり、より好ましくは約９００以下であり、さらに好ましくは約６００以下である。【0193】
本発明のグルクロン酸含有直鎖状グルカンおよびその還元末端修飾物は、例えば以下の式２によって示され得る：【0194】
【化17】
【0195】
ここでｎは１以上の整数である。ｎは好ましくは約１以上であり、より好ましくは約２以上であり、さらに好ましくは約３以上である。ｎは好ましくは約１２００以下であり、より好ましくは約９００以下であり、さらに好ましくは約６００以下である。Ｘは、水素、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体およびアミン基含有低分子量物質からなる群より選択される。Ｘは、好ましくは、水素、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコン酸、ソルビトール、スクロース、トレハロース、シクロデキストリン、環状デキストリン、環状アミロース、デンプン、セルロース、キチン、キトサン、デキストラン、タンパク質、ペプチド、リン脂質、脂肪酸、界面活性剤、アスコルビン酸グルコシド、ハイドロキノングルコシド、ヘスペリジングルコシド、ルチングルコシド、パラニトロフェニルマルトペンタオース、ドデシルマルトース、フラボノイド配糖体類、テルペン配糖体類、フェノール配糖体類、カルコン配糖体類、ステロイド配糖体類、アミノ酸及びドデシルアミンからなる群より選択される。Ｘが水素の場合、この分子はグルクロン酸含有直鎖状グルカンであり、Ｘが水素以外の物質である場合、この分子はグルクロン酸含有直鎖状グルカン還元末端修飾物である。【0196】
本発明のグルクロン酸含有直鎖状グルカン、グルクロン酸含有直鎖状グルカン水酸基修飾物およびその還元末端修飾物は、例えば以下の式３によって示され得る：【0197】
【化18】
【0198】
ここでｎは１以上の整数である。ｎは好ましくは約１以上であり、より好ましくは約２以上であり、さらに好ましくは約３以上である。ｎは好ましくは約１２００以下であり、より好ましくは約９００以下であり、さらに好ましくは約６００以下である。Ｘは、好ましくは、水素、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体およびアミン基含有低分子量物質からなる群より選択される。Ｘは、より好ましくは、水素、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコン酸、ソルビトール、スクロース、トレハロース、シクロデキストリン、環状デキストリン、環状アミロース、デンプン、セルロース、キチン、キトサン、デキストラン、タンパク質、ペプチド、リン脂質、脂肪酸、界面活性剤、アスコルビン酸グルコシド、ハイドロキノングルコシド、ヘスペリジングルコシド、ルチングルコシド、パラニトロフェニルマルトペンタオース、ドデシルマルトース、フラボノイド配糖体類、テルペン配糖体類、フェノール配糖体類、カルコン配糖体類、ステロイド配糖体類、アミノ酸及びドデシルアミンからなる群より選択される。ここで、Ｒは、好ましくは、水素、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基およびリン酸基からなる群より独立して選択される。Ｘおよび全てのＲが水素の場合、この分子はグルクロン酸含有直鎖状グルカンであり；Ｘが水素であってＲがそれぞれ独立して水素または他の基であるがただし少なくとも１つのＲが水素以外の基である場合、この分子はグルクロン酸含有直鎖状グルカンの水酸基修飾物であり；Ｘが水素以外の物質であって全てのＲが水素である場合、この分子はグルクロン酸含有直鎖状グルカン還元末端修飾物であり；Ｘが水素以外の物質であってＲがそれぞれ独立して水素または他の基であるがただし少なくとも１つのＲが水素以外の基である場合、この分子はグルクロン酸含有直鎖状グルカン水酸基修飾物の還元末端修飾物である。【0199】
本発明のグルクロン酸含有直鎖状グルカン、グルクロン酸含有直鎖状グルカン水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物およびそれらのカルボキシル基修飾物は、例えば以下の式４によって示され得る：【0200】
【化19】
【0201】
ここでｎは１以上の整数である。ｎは好ましくは約１以上であり、より好ましくは約２以上であり、さらに好ましくは約３以上である。ｎは好ましくは約１２００以下であり、より好ましくは約９００以下であり、さらに好ましくは約６００以下である。Ｘは、水素、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体およびアミン基含有低分子量物質からなる群より選択される。Ｘは、好ましくは、水素、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコン酸、ソルビトール、スクロース、トレハロース、シクロデキストリン、環状デキストリン、環状アミロース、デンプン、セルロース、キチン、キトサン、デキストラン、タンパク質、ペプチド、リン脂質、脂肪酸、界面活性剤、アスコルビン酸グルコシド、ハイドロキノングルコシド、ヘスペリジングルコシド、ルチングルコシド、パラニトロフェニルマルトペンタオース、ドデシルマルトース、フラボノイド配糖体類、テルペン配糖体類、フェノール配糖体類、カルコン配糖体類、ステロイド配糖体類、アミノ酸及びドデシルアミンからなる群より選択される。ここで、Ｒは、好ましくは、水素、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基およびリン酸基からなる群より独立して選択される。ここで、Ｙは、好ましくは、水酸基、カチオン性置換基、疎水性置換基、マレイミド基含有置換基およびスクシンイミド基からなる群より選択される。Ｘおよび全てのＲが水素であってＹが水酸基である場合、この分子はグルクロン酸含有直鎖状グルカンであり；Ｘおよび全てのＲが水素であってＹが水酸基以外の基である場合、この分子はグルクロン酸含有直鎖状グルカンのカルボキシル基修飾物であり；Ｘが水素であってＲがそれぞれ独立して水素または他の基であるがただし少なくとも１つのＲが水素以外の基であってＹが水酸基である場合、この分子はグルクロン酸含有直鎖状グルカンの水酸基修飾物であり；Ｘが水素であってＲがそれぞれ独立して水素または他の基であるがただし少なくとも１つのＲが水素以外の基であってＹが水酸基以外の基である場合、この分子はグルクロン酸含有直鎖状グルカンの修飾物の水酸基修飾物のカルボキシル基修飾物であり；Ｘが水素以外の物質であって全てのＲが水素であってＹが水酸基である場合、この分子はグルクロン酸含有直鎖状グルカン還元末端修飾物であり；Ｘが水素以外の物質であって全てのＲが水素であってＹが水酸基以外の基である場合、この分子はグルクロン酸含有直鎖状グルカンカルボキシル基修飾物の還元末端修飾物であり；Ｘが水素以外の物質であってＲがそれぞれ独立して水素または他の基であるがただし少なくとも１つのＲが水素以外の基であってＹが水酸基である場合、この分子はグルクロン酸含有直鎖状グルカン水酸基修飾物の還元末端修飾物であり；Ｘが水素以外の物質であってＲが独立して水素または他の基であるがただし少なくとも１つのＲが水素以外の基であってＹが水酸基以外の基である場合、この分子はグルクロン酸含有直鎖状グルカン水酸基修飾物のカルボキシル基修飾物である。【0202】
本発明のグルクロン酸含有グルカンは、例えば以下の式５によって示され得る：【0203】
【化20】
【0204】
ここでｍは１以上の整数である。ｍは好ましくは約１以上であり、より好ましくは約２以上であり、さらに好ましくは約３以上であり、ｍは好ましくは約１２００以下であり、より好ましくは約９００以下であり、さらに好ましくは約６００以下である。Ｒ１は独立して、Ｈ、式Ａの構造を有するグルカン鎖または式Ｂの構造を有するグルカン鎖である。全てのＲ１がＨの場合、式５に示されるグルカンは直鎖状グルカンである。少なくとも１つのＲ１が式Ａまたは式Ｂの構造を有する場合、式５に示されるグルカンは分岐状グルカンである。【0205】
【化21】
【0206】
式Ａにおいて、ｋは１以上の整数である。ｋは好ましくは約１以上であり、より好ましくは約２以上であり、さらに好ましくは約３以上であり、ｋは好ましくは約１００以下であり、より好ましくは約２５以下であり、さらに好ましくは約２０以下である。式Ａにおいて、Ｒ２はそれぞれ独立して、Ｈ、式Ａの構造を有するグルカン鎖または式Ｂの構造を有するグルカン鎖である。【0207】
【化22】
【0208】
式Ｂにおいて、ｓは１以上の整数である。ｓは好ましくは約１以上であり、より好ましくは約２以上であり、さらに好ましくは約３以上であり、ｓは好ましくは約１００以下であり、より好ましくは約２５以下であり、さらに好ましくは約２０以下である。式Ｂにおいて、Ｒ３は独立して、Ｈ、式Ａの構造を有するグルカン鎖または式Ｂの構造を有するグルカン鎖である。【0209】
上記で説明したように、式５において、Ｒ１は、式Ａの構造を有する基のＲ２または式Ｂの構造を有する基のＲ３の位置において何度か式Ａの構造を有する基または式Ｂの構造を有する基によって置換された構造を有し得る。式Ａと式Ｂで置換された回数の合計は、式５で表された分岐グルカン分子の単位鎖数に等しい。分岐グルカン分子の単位鎖数は、好ましくは約１以上であり、より好ましくは約１０以上であり、さらに好ましくは約３０以上である。分岐グルカン分子の単位鎖数は、好ましくは約５０００以下であり、より好ましくは約２０００以下であり、さらに好ましくは約１０００以下である。【0210】
本発明のグルクロン酸含有グルカン又はグルクロン酸含有グルカン水酸基修飾物は、例えば以下の式６によって示され得る：【0211】
【化23】
【0212】
ここでｍは１以上の整数である。ｍは好ましくは約１以上であり、より好ましくは約２以上であり、さらに好ましくは約３以上であり、ｍは好ましくは約１２００以下であり、より好ましくは約９００以下であり、さらに好ましくは約６００以下である。Ｒ１は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖である。【0213】
【化24】
【0214】
式６Ａにおいて、ｋは１以上の整数である。ｋは好ましくは約１以上であり、より好ましくは約２以上であり、さらに好ましくは約３以上であり、ｋは好ましくは約１００以下であり、より好ましくは約２５以下であり、さらに好ましくは約２０以下である。式６Ａにおいて、Ｒ２はそれぞれ独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖である。【0215】
【化25】
【0216】
式６Ｂにおいて、ｓは１以上の整数である。ｓは好ましくは約１以上であり、より好ましくは約２以上であり、さらに好ましくは約３以上であり、ｓは好ましくは約１００以下であり、より好ましくは約２５以下であり、さらに好ましくは約２０以下である。式６Ｂにおいて、Ｒ３は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基およびリン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖である。【0217】
式６、式６Ａおよび式６Ｂにおいて、Ｒ４は、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基からなる群から独立して選択される。本発明のグルクロン酸含有グルカン、グルクロン酸含有グルカン水酸基修飾物およびそれらの還元末端修飾物は、例えば以下の式７によって示され得る：
【0218】
【化26】
【0219】
ここでｍは１以上の整数である。ｍは好ましくは約１以上であり、より好ましくは約２以上であり、さらに好ましくは約３以上であり、ｍは好ましくは約１２００以下であり、より好ましくは約９００以下であり、さらに好ましくは約６００以下である。Ｒ１は独立して、Ｈ、式６Ａの構造を有するグルカン鎖または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖である。式６Ａおよび式６Ｂについては、上記式６についての定義と同様である。【0220】
式７、式６Ａおよび式６Ｂにおいて、Ｒ４は、水素、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基およびリン酸基からなる群から独立して選択され、式７において、Ｘは、好ましくは、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体およびアミン基含有低分子量物質からなる群より独立して選択される。Ｘは、より好ましくは、水素、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコン酸、ソルビトール、スクロース、トレハロース、シクロデキストリン、環状デキストリン、環状アミロース、デンプン、セルロース、キチン、キトサン、デキストラン、タンパク質、ペプチド、リン脂質、脂肪酸、界面活性剤、アスコルビン酸グルコシド、ハイドロキノングルコシド、ヘスペリジングルコシド、ルチングルコシド、パラニトロフェニルマルトペンタオース、ドデシルマルトース、フラボノイド配糖体類、テルペン配糖体類、フェノール配糖体類、カルコン配糖体類、ステロイド配糖体類、アミノ酸及びドデシルアミンからなる群より選択される。
【0221】
本発明のグルクロン酸含有グルカン、グルクロン酸含有グルカン水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのカルボキシル基修飾物は、例えば以下の式８によって示され得る：【0222】
【化27】
【0223】
ここでｍは１以上の整数である。ｍは好ましくは約１以上であり、より好ましくは約２以上であり、さらに好ましくは約３以上であり、ｍは好ましくは約１２００以下であり、より好ましくは約９００以下であり、さらに好ましくは約６００以下である。Ｒ１は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖、式８Ａの構造を有するグルカン鎖、または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖である。【0224】
【化28】
【0225】
式６Ａにおいて、ｋは１以上の整数である。ｋは好ましくは約１以上であり、より好ましくは約２以上であり、さらに好ましくは約３以上であり、ｋは好ましくは約１００以下であり、より好ましくは約２５以下であり、さらに好ましくは約２０以下である。式６Ａにおいて、Ｒ２はそれぞれ独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖、式８Ａの構造を有するグルカン鎖、または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖である。【0226】
【化29】
【0227】
式８Ａにおいて、ｐは１以上の整数である。ｐは好ましくは約１以上であり、より好ましくは約２以上であり、さらに好ましくは約３以上であり、ｐは好ましくは約１００以下であり、より好ましくは約２５以下であり、さらに好ましくは約２０以下である。式８Ａにおいて、Ｒ５は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖、式８Ａの構造を有するグルカン鎖、または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖である。【0228】
【化30】
【0229】
式６Ｂにおいて、ｓは１以上の整数である。ｓは好ましくは約１以上であり、より好ましくは約２以上であり、さらに好ましくは約３以上であり、ｓは好ましくは約１００以下であり、より好ましくは約２５以下であり、さらに好ましくは約２０以下である。式６Ｂにおいて、Ｒ３はそれぞれ独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖、式８Ａの構造を有するグルカン鎖、または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖である。【0230】
式８、式６Ａ、式８Ａ、および式６Ｂにおいて、Ｒ４は、水素、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基およびリン酸基からなる群から独立して選択され、式８において、Ｘは、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体およびアミン基含有低分子量物質からなる群より独立して選択され、
式８及び式８Ａにおいて、Ｙは、薬効成分との結合のために導入される置換基であり、Ｙは、カルボキシル基修飾試薬との反応により得られ、該カルボキシル基修飾試薬は、少なくとも１つのアミン基および少なくとも１つの別の官能基を有する。
【0231】
本発明のグルクロン酸含有グルカンの修飾例と修飾の目的を以下の表１にまとめる。表中の構造は一例である。【0232】
【表1】
【実施例】
【0233】
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明は、実施例に限定されるものではない。実施例において使用したＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼは、以下の製造例１によって調製したＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼである。【0234】
（製造例１：Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼの調製）（Ａ）Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子の作製
Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子のアミノ酸配列（配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列；米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ； Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎＢａｎｋ塩基配列データベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号ＡＥ０００６５７の４９１３８０−４９３４５８番目までの塩基配列を翻訳して得られるアミノ酸配列）をコードする塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ塩基配列データベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号ＡＥ０００６５７の４９１３８０−４９３４５８番目までの塩基配列）を有する核酸（「α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子」ともいう）を、当業者に周知の方法により、化学的に合成した。なお、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子の塩基配列は、本願が優先権を主張する基礎となる出願の出願日の時点ではＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号ＡＥ０００７０４の８６〜２１６４番目として登録されていたが、２０１０年３月９日にＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号およびその位置が変更された。このα−グルカンホスホリラーゼ遺伝子の翻訳開始コドン上流にはＮｄｅＩサイトを設けた。また、翻訳停止コドン下流にはＢａｍＨＩサイトを設け、この合成遺伝子をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩであらかじめ切断したプラスミドｐＥＴ１１ｃ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入し、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子をもったプラスミドｐＥＴ−ＡｑＧＰを作製した。
【0235】
（Ｂ）Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子の大腸菌における発現このプラスミドｐＥＴ−ＡｑＧＰで、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を常法に従って形質転換し、形質転換体を得た。形質転換体を含む液体を、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン、Ｄｉｆｃｏ製トリプトン１％、Ｄｉｆｃｏ製酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ０．５％、寒天１．５％、ｐＨ７．３）に独立したコロニーが得られるように希釈して塗布し、３７℃で一晩培養した。このアンピシリン含有ＬＢ寒天培地で増殖した大腸菌は、導入したプラスミドを保有し、かつ発現することができる形質転換体である。このようにしてα−グルカンホスホリラーゼ遺伝子を発現する大腸菌を作製できた。
【0236】
（Ｃ）Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ酵素の調製上記（Ｂ）で作製した、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子を発現する大腸菌を、ＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン、Ｄｉｆｃｏ製トリプトン１％、Ｄｉｆｃｏ製酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ、０．５％、ｐＨ ７．３）に植菌し、３７℃で５時間培養した。次いで、最終濃度が０．１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）および１ｍＭ塩酸ピリドキシンとなるようにこの培養液にＩＰＴＧおよび塩酸ピリドキシンを加え、さらに３７℃で２４時間培養した。次いで、培養液を遠心分離することにより菌体を回収し、２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）で培地成分を洗浄し、除去した。洗浄後の菌体を２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）に懸濁し、超音波破砕機によって菌体を破砕し、遠心分離し、その上清を菌体抽出液とした。得られた菌体抽出液を、６０℃３０分間加熱した。次いで、この菌体抽出液を予め平衡化されたＱ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦカラムにロードし、２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ ６．７）中、０．１Ｍから０．３ＭのＮａＣｌの濃度勾配で溶出し、ＧＰ精製酵素含有活性画分を回収した。
【0237】
得られた精製酵素含有活性画分を約１μｇ使用して、ネイティブＰＡＧＥ（Ｎａｔｉｖｅ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行った。その結果、α−グルカンホスホリラーゼを発現する大腸菌から得られた画分では、分子量約１５０ｋＤａの位置に単一のバンドが認められ、他の場所にはバンドが見られなかった。Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼの分子量は、アミノ酸配列から計算して約７５ｋＤａであると推定されるので、このネイティブＰＡＧＥの結果、このα−グルカンホスホリラーゼは、ダイマー構造をとっていると考えられる。このようにして、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼが均質に精製されたことが示された。【0238】
（製造例２：組換え馬鈴薯α−グルカンホスホリラーゼの組換え生産）特表２００４−５２６４６３に示された下記の方法によりタイプＬ馬鈴薯α−グルカンホスホリラーゼを組換え生産した。
【0239】
馬鈴薯グルカンホスホリラーゼ遺伝子（Ｎａｋａｎｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｔｏｋｙｏ）１０６（１９８９）６９１）のＮ末端およびＣ末端にＢａｍＨＩサイトを設け、この遺伝子をＢａｍＨＩで切断し、ＢａｍＨＩであらかじめ切断したｐＥＴ３ｄ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に組み込み、プラスミドｐＥＴ−ＰＧＰ１１３を得た。このプラスミドでは、グルカンホスホリラーゼ遺伝子を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモーターの制御下に作動可能に連結した。このプラスミドを、大腸菌ＴＧ−１（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に、コンピテントセル法により導入した。この大腸菌を、抗生物質アンピシリンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス（ともにＤｉｆｃｏ社製）、１％塩化ナトリウム、１．５％寒天））を含むプレートにプレーティングして、３７℃で一晩培養した。このプレート上で増殖した大腸菌を選択することにより、馬鈴薯由来グルカンホスホリラーゼ遺伝子が導入された大腸菌を得た。得られた大腸菌がグルカンホスホリラーゼ遺伝子を含むことを、導入された遺伝子の配列を解析することによって確認した。また、得られた大腸菌がグルカンホスホリラーゼを発現していることを、活性測定によって確認した。【0240】
この大腸菌を、抗生物質アンピシリンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス（ともにＤｉｆｃｏ社製）、１％塩化ナトリウム）１リットルに接種し、１２０ｒｐｍで振盪させながら３７℃で３時間振盪培養した。その後、ＩＰＴＧを０．１ｍＭ、ピリドキシンを１ｍＭになるようにそれぞれこの培地に添加し、２２℃でさらに２０時間振盪培養した。次いで、この培養液を５，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離して、大腸菌の菌体を収集した。得られた菌体を、５０ｍｌの０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に懸濁し、次いで超音波処理により破砕し、菌体破砕液５０ｍｌを得た。この破砕液中には、４．７Ｕ／ｍｇのグルカンホスホリラーゼが含まれていた。【0241】
この菌体破砕液を、５５℃で３０分間加熱する。加熱後、８，５００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、不溶性のタンパク質などを除去して上清を得る。得られた上清を、あらかじめ平衡化しておいた陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに流してグルカンホスホリラーゼを樹脂に吸着させた。樹脂を、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液で洗浄して不純物を除去した。続いて、タンパク質を３００ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液で溶出させ、組換え馬鈴薯グルカンホスホリラーゼ酵素溶液とした。【0242】
（製造例３：３種の微生物由来α−グルカンホスホリラーゼの調製）Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子の代わりに、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＭＳＢ８由来α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ塩基配列データベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号ＡＪ００１０８８に記載される７６〜５４４番目までの塩基配列）を有する核酸、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ ＡＮ１由来α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ塩基配列データベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号ＡＪ３１８４９９に記載される1〜２１５１番目までの塩基配列）を有する核酸、またはＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ ＡＴＣＣ３３２２３由来α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ塩基配列データベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号ＣＰ０００９２４に記載される1〜１６２６番目までの塩基配列）を有する核酸を使用して製造例１と同様にしてそれぞれのα−グルカンホスホリラーゼ液を得た。
【0243】
（比較例１：馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼを使用した酵素反応）５０ｍＭグルクロン酸−１−リン酸、１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）、１０ｍＭマルトテトラオース及び製造例２で作製した精製馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼ（タイプＬ、１２Ｕｎｉｔ／ｍｌ）を含む反応液を３７℃で４０時間保温後反応液の糖組成を、そのまま、あるいはグルコアミラーゼ消化した後、ＤＩＯＮＥＸ社製ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ装置（送液システム：ＤＸ３００、検出器：ＰＡＤ−２、分析カラム：ＣａｒｂｏＰａｃＰＡ１００）により分析した。溶出は、流速：１ｍｌ／分、ＮａＯＨ濃度：１５０ｍＭ、酢酸ナトリウム濃度：０分−５０ｍＭ、２分−５０ｍＭ、２３分−３５０ｍＭ（Ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｕｒｖｅ Ｎｏ．３）、２８分−８５０ｍＭ（Ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｕｒｖｅ Ｎｏ．７）、３０分−８５０ｍＭの条件で行った。結果を図６にしめす。図６Ａは標準サンプルとして、１００ｍＭグルコース（Ｇｌｃ）、１００ｍＭマルトース（Ｍａｌ）、１００ｍＭグルコース１リン酸（Ｇ１Ｐ）、２００ｍＭグルクロン酸（ＧｌｃＡ）、２００ｍＭグルクロン酸１リン酸（ＧｌｃＡ１Ｐ）を混合したものに、マルトオリゴ糖の標準サンプルとして１００ｍＭマルトトリオース（Ｇ４）、１００ｍＭマルトヘプタオース（Ｇ７）を加えたサンプルを用い、溶出位置を確認したものである。図６Ｂに示すように、馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼを用いた酵素反応産物を分析した結果、マルトオリゴ糖を含む複数のピークが確認された。グルコアミラーゼはマルトオリゴ糖を非還元末端から分解する酵素であるが、非還元末端にグルクロン酸が結合している場合は消化することができない。このグルコアミラーゼ（０．１ｍｇ／ｍｌ）を用いて図６Ｂの産物を消化したところ、図６Ｃで示すように、すべてのピークが消失し、グルクロン酸残基が結合したグルカンは検出されず、馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼではグルクロン酸残基が結合したグルカンは合成できないことがわかった。
【0244】
（比較例２〜４：他の微生物由来α−グルカンホスホリラーゼを使用した酵素反応）５０ｍＭグルクロン酸−１−リン酸、１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）、１０ｍＭマルトテトラオース及び製造例３で作製したＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来α−グルカンホスホリラーゼ（３Ｕｎｉｔ／ｍｌ）を含む反応液を３７℃で４０時間反応した糖組成を、そのまま、あるいはグルコアミラーゼ消化した後、ＤＩＯＮＥＸ社製ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ装置で分析した。この分析条件は比較例１と同条件である。グルクロン酸残基が結合したグルカンは検出されず、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来α−グルカンホスホリラーゼではグルクロン酸残基が結合したグルカンは合成できないことがわかった。Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来α−グルカンホスホリラーゼのかわりにＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ由来α−グルカンホスホリラーゼ（４３Ｕｎｉｔ／ｍｌ）またはＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ由来α−グルカンホスホリラーゼ（１９Ｕｎｉｔ／ｍｌ）を用いて同様の酵素反応を行ったが、グルクロン酸残基が結合したグルカンは合成できなかった。
【0245】
（実施例１：マルトテトラオースを原料として使用したグルクロン酸含有グルカンの製造）５０ｍＭグルクロン酸−１−リン酸、１００ｍＭ クエン酸緩衝液、１０ｍＭマルトテトラオース及びＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ（３７．５Ｕｎｉｔ／ｍｌ）を含む反応液を３７℃で４０時間保温後反応液の糖組成を、そのまま、あるいはグルコアミラーゼ消化した後、ＤＩＯＮＥＸ社製ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ装置で分析した。この分析条件は比較例１と同条件である。結果を図７に示す。図７Ａは標準サンプルの溶出位置を確認した図である。図７Ｂに示すように、Ａｑｕｉｆｅｘ由来α−グルカンホスホリラーゼを用いた酵素反応産物を分析した結果、マルトオリゴ糖を含む複数のピークが確認できた。グルコアミラーゼ（０．１ｍｇ／ｍｌ）を用いて図７ＢのＡｑｕｉｆｅｘ由来α−グルカンホスホリラーゼ産物を消化した結果、図７Ｃで示すように、星印で示すピークは分解されなかったことから、これらの星印で示すピークは非還元末端にグルクロン酸残基を含むグルカン化合物であることがわかった。さらに、α−１，４グルコシル結合をマルトース単位でランダムに分解する酵素であるα−アミラーゼを用いてこの産物を消化したところ、図７Ｄで示すようにすべてのピークが印で示す２ピークにシフトしたことから、グルクロン酸残基を含むグルカンがα−１，４グルカンであることが確認できた。マルトオリゴ糖の非還元末端に、グルクロン酸残基が１分子結合したグルカンが得られた。この結果、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼを使用することにより、グルクロン酸含有グルカン（図７Ｃ星印）を製造できることが確認された。
【0246】
（実施例２：マルトヘプタオースを原料として使用したグルクロン酸含有グルカンの製造）５０ｍＭグルクロン酸−１−リン酸、１００ｍＭ クエン酸緩衝液、１０ｍＭマルトヘプタオース及びＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ（３７．５Ｕｎｉｔ／ｍｌ）を含む反応液を３７℃で４０時間保温後反応液の糖組成を、そのまま、あるいはグルコアミラーゼ消化した後、ＤＩＯＮＥＸ社製ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ装置で分析した。この分析条件は比較例１と同条件である。結果を図８に示す。図８Ａは標準サンプルの溶出位置を確認した図である。図８Ｂに示すように、Ａｑｕｉｆｅｘ由来α−グルカンホスホリラーゼを用いた酵素反応産物を分析した結果、マルトオリゴ糖を含む複数のピークが確認できた。マルトテトラオースを用いた時より産物の平均重合度は大きかった。グルコアミラーゼ（０．１ｍｇ／ｍｌ）を用いて図８ＢのＡｑｕｉｆｅｘ由来α−グルカンホスホリラーゼ産物を消化したところ、図８Ｃで示すように、星印で示すピークは分解されなかったことから、これらは非還元末端にグルクロン酸残基を含むグルカン化合物であることがわかった。さらに、α−アミラーゼを用いてこの産物を消化したところ、図８Ｄで示すようにすべてのピークが印で示す２ピークにシフトしたことから、グルクロン酸残基を含むグルカンが確かにα−１，４グルカンであることが確認できた。マルトテトラオースを用いた時より分子サイズの大きい、マルトオリゴ糖の非還元末端にグルクロン酸が１分子付加されたグルカン（図８Ｃ星印）が得られた。
【0247】
（実施例３：グルクロン酸含有グルカンの分子量測定および構造同定）実施例１で得られたグルクロン酸含有グルカンの構造を決定するため、図９Ａ（図７Ｃと同じ図である）のクロマトグラムの矢印で示したピークを分取した。分取は、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ装置のカラムと検出器の間のチューブに分岐を設け、目的ピークの溶出時に分取側への流路切り替えを行うことで行った。分取後のサンプルをＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ装置で分析した結果を図９Ｂにしめす。これらの分析条件は比較例１と同条件である。このサンプルをＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１０カラム（容量２０ｍｌ）を用い脱塩、凍結乾燥した後、ＴＯＦ−ＭＳ（島津製Ｖｏｙａｇｅｒ Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ Ｖｅｒ．５．１）により分子量を求めたところ、７０３．２２という値となった。この分子量はグルクロン酸を末端に有するマルトトリオースの理論値と一致した。図９Ｂの物質（図９Ａ矢印の物質と同じ）の構造を図９Ｃに示す。
【0248】
（実施例４：分岐デキストリンを原料として使用したグルクロン酸含有グルカンの製造）５０ｍＭグルクロン酸−１−リン酸、１００ｍＭ クエン酸緩衝液、２％分岐デキストリン（商品名：クラスターデキストリン；分子量１９０ＫＤａ：江崎グリコ株式会社製）及びＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来グルカンホスホリラーゼ（３７．５Ｕｎｉｔ／ｍｌ）を含む反応液を３７℃で１８時間保温し、酵素反応させた。クラスターデキストリンはトウモロコシ由来ワキシーコーンスターチにブランチングエンザイムを作用させることにより低分子量化したデキストリンであり、α−１，６結合によって結合した分岐鎖を含む高分子量分岐デキストリンである。酵素反応産物の構造をＤＩＯＮＥＸ社製ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ装置で分析した結果を図１０にしめす。この分析条件は比較例１と同条件である。図１０Ａは標準サンプルの溶出位置を確認した図である。図１０Ｂは酵素反応前のクラスターデキストリンの分岐部分をイソアミラーゼで消化した後ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ装置により分析したものであり、クラスターデキストリン分子のグルカン直鎖部分の長さの分布を示したものである。図１０ＣはＡｑｕｉｆｅｘ由来α−グルカンホスホリラーゼを用いた酵素反応産物をイソアミラーゼにより消化し分析した結果である。マルトオリゴ糖を含む複数のピークが確認でき、特に９分以降に矢印で示す部分に大きなピーク群が見られた。グルコアミラーゼ（０．１ｍｇ／ｍｌ）を用いて図１０Ｃのイソアミラーゼ消化物を消化したところ、図１０Ｄで示すように、矢印で示すピーク群はグルコアミラーゼによって分解されず、これらは非還元末端にグルクロン酸残基を含むグルカン化合物であることがわかった。これらの結果から、多数の非還元末端にグルクロン酸残基がそれぞれ１分子残基した高分子量分岐デキストリンが得られたことを確認した。非還元末端へのグルクロン酸導入率を求めたところ、非還元末端の約７０％に、グルクロン酸残基が導入できていることを確認した。このようにして、多数の非還元末端にグルクロン酸残基が結合した構造を有する、本発明のグルクロン酸含有グルカン（図２に示す）が製造できた。
【0249】
（製造例４：構造の異なる各種グルカンの製造）（製造例４−１：分岐グルカン（Ｂ）の製造）
５０ｇのワキシーコーンスターチ（三和澱粉工業（株）製）を１０００ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、約１００℃に加熱することにより糊化させた。約７０℃まで冷却した糊液に特開２０００−３１６５８１の実施例１に記載された方法に従って調製した高度耐熱性ブランチングエンザイムを２００，０００単位添加して反応液を調製した後、７０℃で１６時間反応させた。反応液を１００℃で２０分間加熱した後、６，５００ｒｐｍで１０分間遠心後の上清を孔径０．８μｍの膜でろ過した。次に、濾液をゲルろ過クロマトグラフィー（ＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｅｒ）システム（カラム：ＧＥヘルスケア製 ＨｉＰｒｅｐＴＭ ２６／１０ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ）を用い脱塩し、低分子量多糖を除去した。約１０００ｍｌの濾液を７．５ｍｌのアリコートに分けてゲルろ過クロマトグラフィーシステムにアプライし、それぞれ流速１０ｍｌ／分の２．７分から３．７分までの溶出画分を分取した。１０００ｍｌの濾液から得られた溶出画分を合わせて孔径０．２μｍの膜でろ過した後凍結乾燥することにより、分岐グルカン（Ｂ）の粉末約３５ｇを得た。分岐グルカン（Ｂ）の重量平均分子量は多角度レーザー光散乱光度計（ワイアットテクノロジー社製、ＤＡＷＮ ＤＳＰ）と示差屈折計（昭和電工（株）製、Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ−７１）を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム（カラム：昭和電工（株）製、ＯＨＰＡＫ ＳＢ−８０６ＭＨＱ）を用いて調べた。分岐グルカン（Ｂ）の粉末２０ｍｇを１０ｍｌの１００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液に溶解し、孔径０．４５μｍの膜でろ過して濾液を得た。得られた濾液のうちの１００μｌを上記ＨＰＬＣシステムに注入した。分岐グルカン（Ｂ）の重量平均分子量は約１１０Ｋ（重合度にして約６７０）であることが示された。
【0250】
上述の分岐グルカン（Ｂ）にイソアミラーゼを作用させ、還元力を改変パークジョンソン法（Ｈｉｚｕｋｕｒｉら、Ｓｔａｒｃｈ，Ｖｏｌ．，３５，ｐｐ．３４８−３５０， （１９８３））により調べたところ、分岐の平均単位鎖長は約１７、分岐数は約４０であることが示された。【0251】
（製造例４−２：分岐グルカン（Ｐ）の製造）砂糖水溶液（砂糖１５０ｇを１０００ｍｌの蒸留水に溶かし孔径０．２μｍの膜でろ過することにより調製した）８００ｍｌ、５％分岐グルカン（Ｂ）水溶液（上述の分岐グルカン製造例４−１で製造した分岐グルカン（Ｂ）５％水溶液を孔径０．２μｍの膜でろ過することにより調製した）２０ｍｌ、１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）４ｍｌ、国際公開第ＷＯ０２／０９７１０７号パンフレットの実施例２．５に記載されたとおりの方法で調製した組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓスクロースホスホリラーゼ１，８００Ｕ、本願製造例１で製造したグルカンホスホリラーゼ１，２００Ｕ、製造例４−１で使用した特開２０００−３１６５８１に記載されたブランチングエンザイム６００，０００Ｕを混合し、蒸留水で液量を１０００ｍｌに調整した後、５５℃で２４時間反応させた。反応液を１００℃で２０分間加熱した後、６，５００ｒｐｍで２０分間遠心後その上清を孔径０．８μｍの膜でろ過した。さらに、得られた濾液をゲルろ過クロマトグラフィー（ＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｅｒ）システム（カラム：ＧＥヘルスケア製 ＨｉＰｒｅｐＴＭ ２６／１０ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ）を用いて脱塩し、低分子量多糖を除去した。約１０００ｍｌの濾液を７．５ｍｌのアリコートに分けてゲルろ過クロマトグラフィーシステムにアプライし、それぞれ流速１０ｍｌ／分で２．７分から３．７分までの溶出画分を分取した。１０００ｍｌの濾液から得られた溶出画分を合わせて溶出画分を孔径０．２μｍの膜でろ過した後凍結乾燥することにより、分岐グルカン（Ｐ）約４０ｇを得た。分岐グルカンの製造例４−１と同様にグルカンの重量平均分子量を調べたところ、分岐グルカン（Ｐ）の重量平均分子量は約４，０００Ｋ（重合度にして約２５，０００）であることが示された。また、分岐の平均単位鎖長は約１５、分岐数は約１，６００であることが示された。さらに分岐グルカン（Ｐ）の平均粒径を濃厚系粒径アナライザー（大塚電子製、ＦＰＡＲ−１０００）で測定したところ、平均粒径約３７μｍであった。
【0252】
（実施例５：グルクロン酸転移率の異なる各種グルクロン酸含有分岐グルカンの製造）製造法４−１で製造した分岐グルカン（Ｂ）、グルクロン酸−１−リン酸、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を含む反応液に製造例１で調製したＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ（１４Ｕｎｉｔ／ｍｌ）を５０℃で１８時間作用させ、グルクロン酸転移率の異なる３種のグルクロン酸含有分岐グルカン（ＢＡ１、ＢＡ２及びＢＡ３）を製造した。各種グルクロン酸含有分岐グルカンの反応条件（分岐グルカン（Ｂ）濃度、グルクロン酸−１−リン酸濃度、分岐グルカン（Ｂ）とグルクロン酸−１−リン酸の添加割合）、および得られたグルクロン酸含有分岐グルカンのグルクロン酸転移率を表３に示した。
【0253】
分岐グルカン（Ｂ）へのグルクロン酸転移率は、反応液の反応液中の遊離の無機リン酸量を定量し、以下の式を用いて算出した：（反応液中に生じた無機リン酸数／反応液中の平均単位鎖数）×１００（％）
無機リン酸量は、無機リン酸を含む水溶液（２００μｌ）に対し、８００μｌのモリブデン試薬（１５ｍＭ モリブデン酸アンモニウム、１００ｍＭ 酢酸亜鉛）を混合し、続いて２００μｌの５６８ｍＭアスコルビン酸水溶液（ｐＨ５．０）を加えて攪拌し、反応系を得る。この反応系を、３０℃で２０分間保持した後、分光光度計を用いて８５０ｎｍでの吸光度を測定した。濃度既知の無機リン酸を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中の無機リン酸を求めた。
【0254】
表３に示したように分岐グルカン（Ｂ）に対するグルクロン酸−１−リン酸の添加割合（「分岐グルカン（Ｂ）の濃度」：「グルクロン酸−１−リン酸濃度」（モル比））を１：０．５、１：１、または１：２と変えることで、分岐グルカンの非還元末端へのグルクロン酸転移率をそれぞれ２５％、５０％、７０％と調節することができた。このようにしてグルクロン酸含有分岐グルカン（ＢＡ１、ＢＡ２、およびＢＡ３）が製造された。【0255】
【表3】
【0256】
（実施例６：単位鎖長の異なる分岐グルカンを用いたグルクロン酸含有分岐グルカン製造）製造法４−１で製造した分岐グルカン（Ｂ）、グルコース１−リン酸、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を含む反応液にＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ（１Ｕｎｉｔ／ｍｌ）を５０℃で１８時間作用させ、単位鎖を伸長し、単位鎖長の異なる２種の分岐グルカン（Ｂ２及びＢ３）を合成した。分岐グルカン（Ｂ２及びＢ３）の単位鎖長は、反応液中の無機リン酸量を定量し算出した。反応液中の無機リン酸量は伸長されたグルコース量に相当し、そのグルコース量と分岐グルカンの非還元末端数(４０)から分岐グルカンの非還元末端に伸長されたグルコース数（平均単位鎖長）を求めた。分岐グルカンＢ２及びＢ３の非還元末端に伸長されたグルコース数は、それぞれ２０及び４０であり、分岐グルカンＢ２及びＢ３の平均単位鎖長は反応前の分岐グルカン（Ｂ）の単位鎖長１７と伸長されたグルコース数との合計であるので、単位鎖長はそれぞれ３７、５７であった。
【0257】
分岐グルカン（Ｂ２及びＢ３）の伸長反応条件（分岐グルカン（Ｂ）の濃度およびグルコース１−リン酸の濃度）、非還元末端に伸長されたグルコース数、分岐グルカン（Ｂ２及びＢ３）の単位鎖長を表４に示した。【0258】
【表4】
【0259】
次に、この分岐グルカン（Ｂ２及びＢ３）の合成反応液を１００℃で１０分間加熱し１２，０００ｒｐｍで遠心後反応液の上清を回収し、ＰＤ−１０カラムを用いて、脱塩し、低分子量分子を除去し、単位鎖の異なる分岐グルカン（Ｂ２及びＢ３）を製造した。【0260】
分岐グルカンＢ、Ｂ２又はＢ３と、グルクロン酸１−リン酸、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）にＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ（１４Ｕｎｉｔ／ｍｌ）を５０℃で２０時間作用させ、グルクロン酸含有分岐グルカン（ＢＡ４〜ＢＡ９）を製造した。ＢＡ４〜ＢＡ９のグルクロン酸転移率を実施例５の方法で求め、表５に示した。【0261】
【表5】
【0262】
（実施例７：グルクロン酸含有分岐グルカンの単位鎖伸長）実施例５で得られたグルクロン酸含有分岐グルカン（ＢＡ１又はＢＡ３）、グルコース１−リン酸及び１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を含む反応液にＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ（５Ｕｎｉｔ／ｍｌ）を５０℃で１８時間作用させ、単位鎖長の異なる各種グルクロン酸含有分岐グルカン（ＢＡ１０〜ＢＡ１７）を合成した。その反応条件を表６に示した。
【0263】
【表6】
【0264】
グルクロン酸含有分岐グルカン（ＢＡ１０〜ＢＡ１７）の平均単位鎖長を、反応液中の無機リン酸量を定量し実施例６と同じ方法で求めた。さらに単位鎖長から分岐グルカンの単位鎖の平均分子量を求めた。こうして表７に示すグルクロン酸含有分岐グルカン（ＢＡ１０〜ＢＡ１７）を製造した。【0265】
【表7】
【0266】
それぞれのグルクロン酸含有分岐グルカン（ＢＡ１０〜ＢＡ１７）を実施例４と同じ方法でイソアミラーゼ消化した後、さらにグルコアミラーゼ消化し、グルクロン酸残基を含むグルカンであることを確認した。【0267】
また、これらグルクロン酸含有分岐グルカン（ＢＡ１０〜ＢＡ１７）反応液１０μｌをそれぞれ０．０５ｍｏｌのヨウ素液１ｍｌに加えヨウ素染色を行い、ヨウ素の包接能力を比較した。ヨウ素の包接能力は分光光度計を用いて６６０nmの吸光度を測定した。結果を表８に示した。吸光度の値が大きくなるほどヨウ素の包接能力が高いことを示す。水の吸光度の値は０．０１であり、分岐グルカン（Ｂ）の吸光度の値は０．０４であり、これらの分子には包接能力がないことを示している。一方、単位鎖長が長いほど吸光度の値は大きく、包接能力の高いことが示された。グルクロン酸含有分岐グルカンのグルクロン酸が結合していない単位鎖を伸長することにより、本発明のグルカンに包接能力を付与することが出来た。【0268】
【表8】
【0269】
また、平均単位鎖長１５，０００の分岐グルカン伸長物（グルクロン酸付加無しの対照物）とＢＡ１７のグルクロン酸含有分岐グルカンを凍結保存後室温解凍するといずれも老化沈殿したが、ＢＡ１７のグルクロン酸含有分岐グルカンは加熱により簡単に溶解した。一方、平均単位鎖長１５，０００の分岐グルカン伸長物は溶解できなかった。非還元末端にグルクロン酸を結合させることにより分岐グルカン伸長物の溶解性を高めることができた。【0270】
（実施例８：グルクロン酸含有分岐グルカン（ＢＡ１）を用いたマンノース含有分岐グルカンの製造）実施例５で得られたグルクロン酸含有分岐グルカン（１０ｍＭ ＢＡ１）、１０ｍＭマンノース１−リン酸、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を含む反応液にＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ（１４Ｕｎｉｔ／ｍｌ）を５０℃で１８時間作用させ、マンノース含有分岐グルカンを合成した。分岐グルカン中のマンノース転移率は実施例５と同じ方法で求めた。こうしてグルクロン酸含有率２５％、マンノース転移率４４％の分岐グルカンを製造した。さらに本実施例のマンノース含有分岐グルカンは、グルクロン酸残基を含むグルカン、マンノース残基を含むグルカンを有することを、実施例４同様にイソアミラーゼ消化した分岐グルカンをグルコアミラーゼ消化したあとのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ装置による分析で確認した。
【0271】
（実施例９：グルクロン酸含有分岐グルカン（ＢＡ１）を用いたガラクトース含有分岐グルカンの製造）実施例５で得られたグルクロン酸含有分岐グルカン（１０ｍＭ ＢＡ１）、１０ｍＭガラクトース１−リン酸、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を含む反応液にＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ（１４Ｕｎｉｔ／ｍｌ）を５０℃で１８時間作用させ、ガラクトース含有分岐グルカンを合成した。分岐グルカン中のガラクトース転移率は実施例５と同じ方法で求めた。こうしてグルクロン酸含有率２５％、ガラクトース転移率３９％の分岐グルカンを製造した。さらに本実施例のガラクトース含有分岐グルカンは、グルクロン酸残基を含むグルカン、ガラクトース残基を含むグルカンを有することを、実施例４同様にイソアミラーゼ消化した分岐グルカンをグルコアミラーゼ消化したあとのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ装置による分析で確認した。
【0272】
（実施例１０：グルクロン酸転移率の異なる各種グルクロン酸含有分岐グルカン（ＰＡ１、ＰＡ２およびＰＡ３）の製造）製造法４−２で製造した分岐グルカン（Ｐ）、グルクロン酸１−リン酸、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を含む反応液にＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ（１４Ｕｎｉｔ／ｍｌ）を５０℃で１８時間作用させ、グルクロン酸転移率の異なる３種のグルクロン酸含有分岐グルカン（ＰＡ１、ＰＡ２およびＰＡ３）を製造した。各種グルクロン酸含有分岐グルカンの反応条件（（分岐グルカン（Ｐ）、グルクロン酸１−リン酸濃度、（分岐グルカン（Ｐ）とグルクロン酸１−リン酸の添加割合）、および得られたグルクロン酸含有分岐グルカンのグルクロン酸転移率を表９に示した。
【0273】
分岐グルカン（Ｐ）へのグルクロン酸転移率は、実施例５の方法で算出した。表９に示したように（分岐グルカン（Ｐ）に対するグルクロン酸−１−リン酸の添加割合をそれぞれ１：０．５、１：１、１：３と変えることで、分岐グルカンの非還元末端へのグルクロン酸含有率をそれぞれ３０％、４０％、７０％に調節したグルクロン酸含有分岐グルカン（ＰＡ１、ＰＡ２およびＰＡ３）が製造できた。【0274】
【表9】
【0275】
（実施例１１：グルクロン酸含有グルカンのカチオン化（ＢＣ））実施例５で得られたグルクロン酸含有グルカン(ＢＡ２)を用いて２ｗｔ％水溶液を調製した。調製した水溶液１ｍｌと１Ｎの塩酸２μｌを試験管に加え、１０℃で撹拌し、ｐＨ５の水溶液とした。この水溶液にＮ，Ｎ−ジエチルエチレンジアミンを２μｌ加えて撹拌し、さらに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）２ｍｇを加え、１０℃で３時間撹拌を続けた。３時間後、反応液をゲルろ過カラム（ＰＤ−１０）に１ｍｌのせ、１．５ｍｌの超純水で通液し、その後２ｍｌを超純水で回収しグルクロン酸含有グルカンのカチオン化物（ＢＣ）を得た。
【0276】
（実施例１２：用途例１：タンパク質の高分子化（ＢＡとインスリンを脱水縮合））２ｍｇのアルブミン（ウシ血清由来）と実施例５のグルクロン酸含有グルカン（ＢＡ２）２ｍｇを７００μｌの０．１Ｍ ２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（２−［Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ］ｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ；ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ ５．０）に溶解した。１ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を添加し、２時間室温で反応させた後、反応液を水で４分の１に希釈した後ＰＤ−１０カラム（ＧＥ社製）を用いて脱塩した。得られた溶液をＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００ ＧＬカラム（サイズ分画用カラム、ＧＥ社製）を用いたＦＰＬＣ分析によって分析した。溶離液（５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム）を用い、０．５ｍｌ／分で溶出し、生成物をＵＶ（２８０ｎｍ）で検出した。グルクロン酸含有グルカンとアルブミンを縮合反応したサンプルの生成物は溶出時間が早く、分子サイズが大きいことが示された。したがって、グルクロン酸含有グルカンとタンパク質を脱水縮合し高分子化できることが示された。
【0277】
（実施例１３：用途例２：タンパク質の安定化及び複合体形成（ＢＡ））塩基性タンパク質であるＦＧＦ−ｂａｓｉｃ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ Ｅｃ，Ｉｎｃ．製）２０μｇと実施例５のグルクロン酸含有グルカン（ＢＡ２）０．５ｍｇを０．１ｍｌのイオン交換水中で混合した後、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００ ＧＬカラム（サイズ分画用カラム、ＧＥ社製）を用いたＦＰＬＣ分析によって分析した。イオン交換水を溶離液とし、０．５ｍｌ／分で溶出し、生成物をＵＶ（２８０ｎｍ）で検出した。グルクロン酸含有をＦＧＦ−ｂａｓｉｃ溶液に添加しなかった場合と比較して、添加した場合は生成物の溶出時間が早く、分子サイズが大きいことが示された。したがって、グルクロン酸含有グルカンは塩基性タンパク質との複合体を形成できることが示された。結果を図１１に示す。
【0278】
（実施例１４：用途例３：核酸の安定化及び複合体形成（ＢＣ））実施例１１で得られたカチオン化グルカン（ＢＣ）０．２μｇとラムダＤＮＡ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（タカラバイオ製）０．５μｇを２０μｌのイオン交換水中に溶解し、５分間室温で静置した後、１％アガロースゲル電気泳動を行った。カチオン化グルカンを添加しなかった場合と比較して、添加した場合は著しくＤＮＡ断片の移動度が遅かった。したがって、カチオン化グルカンはＤＮＡとの複合体を形成できる。結果を図１２に示す。
【0279】
（実施例１５：各種グルカン（Ｂ及びＰ）のアセチル化（ＡｃＢ及びＡｃＰ））製造例４で得られたグルカン（ＢおよびＰ）をそれぞれＤＭＳＯに溶解し、表１０の仕込みで混合し、２５℃で１時間撹拌を行った。得られた溶液を超純水で２倍に希釈し、ゲルろ過カラム（ＰＤ−１０）に１ｍｌのせ、１．５ｍｌの超純水で通液し、その後２ｍｌを超純水で回収し精製した。精製後のサンプル３００μｌに５Ｎ 水酸化ナトリウム水溶液 ２００μｌを加え、５５℃で３０分の加熱を行い、脱アセチル化反応を行った。この反応液に１Ｎ トリスバッファー（ｐＨ７）を３００μｌ加え、さらに５Ｎ塩酸を２００μｌ加え中和をした。中和後の溶液をフェノール硫酸法でグルコース定量し、また、遊離酢酸定量キットにて遊離酢酸の定量を行い、アセチル化度を求めたところ、アセチル化度が０．１〜１．３のアセチル化グルカン（ＡｃＢ１〜ＡｃＢ５およびＡｃＰ１〜ＡｃＰ５）が得られた（表１１）。各サンプル水溶液を凍結乾燥してアセチル化グルカンの粉末を得た。
【0280】
【表10】
【0281】
【表11】
【0282】
（実施例１６：各種アセチル化グルカンのアミラーゼ分解性）実施例１５で得られたアセチル化度の異なるアセチル化グルカン（ＡｃＢ１、ＡｃＢ２、ＡｃＢ３、ＡｃＢ４およびＡｃＰ１、ＡｃＰ３、ＡｃＰ４、ＡｃＰ５）の粉末をそれぞれ使用して０．２ｗｔ％水溶液を調製した。これらの水溶液２００μｌにそれぞれ１Ｍ酢酸バッファー４μｌを加え、さらに９４ｕｎｉｔ／ｍｌに調整した豚膵臓由来のα−アミラーゼを２μｌ加え、α−アミラーゼによる分解性を確認した。結果を図１３に示す。図１３の黒丸はＡｃＢ、黒三角はＡｃＰを示す。図１３に示すように、アセチル化度０．５以上のアセチル化グルカンはα−アミラーゼによる分解が抑制されることがわかった。
【0283】
（実施例１７：各種アセチル化グルカンの血清アセチラーゼ分解性）人の全血を１時間室温で静置し、５，０００ｒｐｍで１５分間遠心を行った。上清を血清として回収し、得られた血清２００μｌと実施例１５で得られたアセチル化グルカン（ＡｃＢ２、ＡｃＢ３、ＡｃＢ４およびＡｃＰ１、ＡｃＰ３、ＡｃＰ５）の０．２ｗｔ％調整水溶液２００μｌを混合した。３７℃で２、４及び６時間目に８０μｌずつサンプリングを行い、遊離酢酸定量キットにて遊離酢酸の定量を行った。サンプリング６時間目の結果を図１４に示す。どのアセチル化グルカンにおいても血清中のアセチラーゼによりアセチルが遊離したことがわかった。
【0284】
（実施例１８：各種アセチル化グルカンへのグルクロン酸付加（ＡｃＢＡ））実施例１５で得られたアセチル化グルカン（ＡｃＢ２）１６０ｍｇを含む、３０ｍＭグルクロン酸−１−リン酸、５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）及びＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来グルカンホスホリラーゼ（１８Ｕｎｉｔ／ｍｌ）を含む反応液を６０度で１６時間保温し、酵素反応させた。実施例５に記載の方法で無機リン酸含量を測定したところ、アセチル化グルカンの非還元末端の４１．７％にグルクロン酸が導入されたことが分かった。
【0285】
（実施例１９：グルクロン酸含有グルカンの蛍光ラベル化（Ｆ−Ｂ、Ｆ−ＡｃＢＡ））製造例４−１で得られたＢおよび実施例１８で得られたＡｃＢＡ２の各グルカンを２ｗｔ％のＤＭＳＯ溶液に調製した。各グルカンＤＭＳＯ溶液２ｍｌを試験管に入れ、９０℃で撹拌した。これに１．２５Ｍに調整したフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）のＤＭＳＯ溶液を２０μｌ加え、ピリジン１滴、ジラウリン酸ジ−ｎ−ブチルすず１滴を滴下し９０℃で２時間撹拌を行った。反応終了後、反応液にエタノールを５ｍｌ加え、１０，０００ｒｐｍで５分遠心を行い、沈殿を回収した。さらにエタノールを加え洗浄を行い、これを超純水１ｍｌで溶解し、ゲルろ過カラム（ＰＤ−１０）に１ｍｌのせ、１．５ｍｌの超純水で通液し、その後２ｍｌを超純水で回収し精製を行った。得られたサンプルを凍結乾燥し、グルクロン酸含有グルカンの蛍光ラベル化物（Ｆ−Ｂ、Ｆ−ＡｃＢＡ）を得た。得られたサンプルの一部は４９０ｎｍにおけるＵＶ吸収を測定した。ウラニンを標準物質とし、各ＦＩＴＣ導入量を求めたところ、表１２に示すＦＩＴＣの導入が確認できた。
【0286】
【表12】
【0287】
（実施例２０：用途例３：グルクロン酸含有アセチル化グルカンの体内動態試験（Ｆ−Ｂ、Ｆ−ＡｃＢＡ））実施例１９で得られたＦＩＴＣラベル化グルカン（Ｆ−Ｂ、Ｆ−ＡｃＢＡ）を２．６ｗｔ％となるように生理食塩水で調製した。頚静脈にカニューレを施した体重３５０ｇ程度のラット（ＳＤ，１０週齢，♂）のカテーテル部分より、調整したサンプル水溶液を４００μｌ注入し、その後さらに生理食塩水１００μｌを注入しカテーテルを洗浄した。サンプル投与を０時間として、１、１０、２０、３０及び４０分後にカニューレより採血を行った。血液は１２，０００ｒｐｍで１分間遠心を行い、上清の血清を得た。得られた血清１００μｌに３０％のトリクロロ酢酸を１０μｌ加え混合した。１０，０００ｒｐｍ、５分間の遠心を行い、上清５０μｌを回収した。この上清をｐＨ７の１Ｍリン酸バッファーと５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で中和した。中和後の各サンプルは、ゲルろ過を用いた蛍光分析を行い、Ｅｘ＝４９０ｎｍ，Ｅｍ＝５１８ｎｍにて蛍光強度を測定した。結果を図１５に示す。黒三角はＦ−Ｂ、黒四角はＦ−ＡｃＢＡを示す。血液中に存在するグルカン量の経時変化を示した図１５から、グルクロン酸含有アセチル化グルカン（Ｆ−ＡｃＢＡ）は未修飾グルカン（Ｆ−Ｂ）に比べ、血中滞留時間が大幅に延長されることが分かった。
【0288】
（実施例２１：グルクロン酸含有グルカンの還元末端修飾物（３種）の製造）（Ａ）還元末端修飾マルトオリゴ糖（マルトトリオシルαシクロデキストリン、パラニトロフェニルマルトペンタオシド又はマルトシルスクロース）、（Ｂ）グルクロン酸１−リン酸、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を含む反応液に製造例１で調製したＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ（１４Ｕｎｉｔ／ｍｌ）を５０℃１８時間作用させ、グルクロン酸含有グルカンの還元末端修飾物（３種）を製造した。反応条件を表１３に示した。
【0289】
３種の還元末端修飾マルトオリゴ糖へのグルクロン酸転移率は、実施例５と同様の方法で求めた。結果を表１３に示す。表１３に示したようにグルクロン酸含有グルカンの還元末端修飾物が製造された。【0290】
【表13】
【0291】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。【産業上の利用可能性】
【0292】
本発明の新規なウロン酸含有グルカンは、非還元末端のみにウロン酸残基が結合している。本ウロン酸含有グルカンはウロン酸を末端に有するため、グルカン末端が負電荷を帯び、グルカンの物理化学的性質が変化する。本ウロン酸含有グルカンは食品、化粧品、医薬品などに幅広く利用できる。【配列表フリーテキスト】
【0293】
配列番号１：Ａｑｕｉｆｅｘ Ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼの塩基配列。配列番号２：Ａｑｕｉｆｅｘ Ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列。
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]