特許 5652310 顕微鏡装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5652310

(24)【登録日】2014年11月28日

(45)【発行日】2015年1月14日

(54)【発明の名称】顕微鏡装置

(51)【国際特許分類】

   G02B 21/06 20060101AFI20141218BHJP

【ＦＩ】

   G02B21/06

【請求項の数】5

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2011-94060(P2011-94060)

(22)【出願日】2011年4月20日

(65)【公開番号】特開2012-226145(P2012-226145A)

(43)【公開日】2012年11月15日

【審査請求日】2014年4月1日

(73)【特許権者】

【識別番号】000006507

【氏名又は名称】横河電機株式会社

(72)【発明者】

【氏名】山宮 広之

【審査官】 森内 正明

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０２Ｂ ２１／００ − ２１／３６

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料を励起させる励起光と前記試料の励起を抑制する抑制光とを同軸となるようにして射出する光源と、
前記試料に前記励起光を照射したときに蛍光した戻り光を検出する検出部と、
前記試料の焦点の範囲内の光を通過させるピンホールを複数配列したピンホールディスクと、
前記ピンホールと同じパターンで配列され、前記ピンホールに前記励起光および前記抑制光を集光させる複数のレンズを配列したレンズディスクと、
前記ピンホールディスクと前記レンズディスクとを一体的に回転させる回転部と、
前記レンズに形成され、前記抑制光の位相を調整する位相調整部と、
を備えたことを特徴とする顕微鏡装置。

【請求項2】

前記レンズの前記位相調整部に形成され、前記抑制光を透過させて前記励起光を透過させない抑制光透過フィルタと、
前記レンズの前記位相調整部以外の領域に形成され、前記励起光を透過させて前記抑制光を透過させない励起光透過フィルタと、
を備えたことを特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。

【請求項3】

前記位相調整部は、
位相を０から２πまで連続的または段階的に変化させる調整を行うリング状の第１の位相調整部と、
この第１の位相調整部の内側に形成され、中心の円形の領域と外側の領域との間の位相をπだけずらした第２の位相調整部と、
を備えたことを特徴とする請求項２記載の顕微鏡装置。

【請求項4】

前記第１の位相調整部はリング状に形成され、前記抑制光の位相を遅らせる位相物質の厚みを連続的または段階的に変化させ、
前記第２の位相調整部は、中心の円形の領域に一定の厚みを持たせた位相物質を形成したこと
を特徴とする請求項３記載の顕微鏡装置。

【請求項5】

前記レンズディスクの前記レンズのうち一部のレンズに前記位相調整部を形成し、他のレンズに前記励起光および前記抑制光の強度を弱化させる減光フィルタを形成したこと
を特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、試料に照明光を照射して、試料からの戻り光を検出して試料の画像を生成する顕微鏡装置に関するものである。

【背景技術】

【0002】

蛍光色素や蛍光タンパク等を導入した試料に対して照明光を照射して蛍光を発生させ、発生した蛍光に基づいて試料の観察を行う顕微鏡装置が従来から用いられている。この顕微鏡として、特許文献１に開示されるＳＴＥＤ顕微鏡がある。この文献に開示されるＳＴＥＤ顕微鏡は、励起光と抑制光（ＳＴＥＤ光）との２つの異なる波長のレーザ光を用いている。

【0003】

励起光は試料を励起させる波長を持つレーザ光であり、抑制光は試料の蛍光発生を抑制する波長を持つレーザ光である。試料の焦点において励起光の周囲にリング状に抑制光を近接させる。抑制光の領域は蛍光を発しないが、励起光の領域は蛍光する。これにより、蛍光はリング状の中心の回折限界を超えた狭小な領域とすることができる。この蛍光する領域を狭くすることで、分解能を高くして、試料の画像の高解像度化を図っている。

【0004】

分解能を向上させる顕微鏡装置としては、他に非特許文献１に開示されるＧＳＤ方式の顕微鏡がある。ＧＳＤ方式の顕微鏡はリング状の領域に強度の高いレーザ光を照射して蛍光分子の励起状態を枯渇させて、蛍光を抑制させる。これにより、リング状の領域の蛍光を抑制させて、中心の回折限界を超えた狭小な領域を蛍光させる。これにより、分解能を高くして、試料の画像の高解像度化を図っている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】米国特許第５，７３１，５８８号明細書

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Hell, S.W. and M.Kroug "Ground-state depletion fluorescence microscopy, a concept for breaking the diffraction resolution limit."(1995) Appl.Phys.B 60: 495-497

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

特許文献１のＳＴＥＤ顕微鏡および非特許文献１のＧＳＤ方式の顕微鏡は試料の１点に対して励起光および抑制光を照射して、蛍光を検出することで試料の画像生成を行っている。試料はＸＹ方向（水平面方向）およびＺ方向（垂直方向）に所定の領域を有しており、少なくともＸＹ方向には励起光および抑制光を走査して蛍光を検出する必要がある。

【0008】

このために、通常は反射角度を微小にコントロールできるガルバノミラーを用いる。ガルバノミラーを用いて励起光および抑制光の反射角度をコントロールすることで、励起光および抑制光を走査する。従って、ガルバノミラーをコントロールして励起光および抑制光の１つの焦点を所定範囲に走査しているため、１枚の試料の画像化を行うのに長時間を要するようになる。

【0009】

そこで、本発明は、高分解能且つ高速に試料の画像生成を行うことを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

以上の課題を解決するため、本発明の顕微鏡装置は、試料を励起させる励起光と前記試料の励起を抑制する抑制光とを同軸となるようにして射出する光源と、前記試料に前記励起光を照射したときに蛍光した戻り光を検出する検出部と、前記試料の焦点の範囲内の光を通過させるピンホールを複数配列したピンホールディスクと、前記ピンホールと同じパターンで配列され、前記ピンホールに前記励起光および前記抑制光を集光させる複数のレンズを配列したレンズディスクと、前記ピンホールディスクと前記レンズディスクとを一体的に回転させる回転部と、前記レンズに形成され、前記抑制光の位相を調整する位相調整部と、を備えたことを特徴とする。

【0011】

この顕微鏡装置によれば、レンズディスクとピンホールディスクとを回転させて走査していることで、高速な画像生成を行うことができる。レンズに位相調整部を形成することで、試料に照射される抑制光の領域の蛍光を抑制して、励起光の領域を限定することができる。これにより、高分解能の画像生成を行うことができる。

【0012】

また、前記レンズの前記位相調整部に形成され、前記抑制光を透過させて前記励起光を透過させない抑制光透過フィルタと、前記レンズの前記位相調整部以外の領域に形成され、前記励起光を透過させて前記抑制光を透過させない励起光透過フィルタと、を備えたことを特徴とする。

【0013】

レンズに抑制光透過フィルタと励起光透過フィルタとを形成することで、抑制光の透過領域と励起光の透過領域とを分けることができ、レンズを透過した後の光を励起光と抑制光とすることができる。

【0014】

また、前記位相調整部は、位相を０から２πまで連続的または段階的に変化させる調整を行うリング状の第１の位相調整部と、この第１の位相調整部の内側に形成され、中心の円形の領域と外側の領域との間の位相をπだけずらした第２の位相調整部と、を備えたことを特徴とする。

【0015】

第１の位相調整部によりＸＹ方向（水平面方向）の分解能を高くすることができ、第２の位相調整部によりＺ方向（垂直方向）の分解能を高くすることができる。これにより、３次元に高い解像度の画像生成を行うことができる。

【0016】

また、前記第１の位相調整部はリング状に形成され、前記抑制光の位相を遅らせる位相物質の厚みを連続的または段階的に変化させ、前記第２の位相調整部は、中心の円形の領域に一定の厚みを持たせた位相物質を形成したことを特徴とする。

【0017】

第１の位相調整部としては位相物質の厚みを変化させ、第２の位相調整部としては中心の領域に厚みを持たせた位相物質を形成することで、３次元に高い解像度を得ることができるようになる。

【0018】

また、前記レンズディスクの前記レンズのうち一部のレンズに前記位相調整部を形成し、他のレンズに前記励起光および前記抑制光の強度を弱化させる減光フィルタを形成したことを特徴とする。

【0019】

レンズディスクのレンズから強い強度の抑制光および励起光を試料に照射して蛍光分子の基底状態を枯渇させて蛍光を抑制して、減光フィルタを通過した弱い強度の抑制光および励起光を試料に照射して蛍光の検出を行っている。これにより、単一の光源を用いて高い分解能の画像を得ることができるようになる。

【発明の効果】

【0020】

本発明は、レンズディスクとピンホールディスクとを回転させて走査していることで、高速な画像生成を行うことができる。レンズに位相調整部を形成することで、試料に照射される抑制光の領域の蛍光を抑制して、励起光の領域を限定しているため、高分解能の画像生成を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】実施形態の顕微鏡装置の構成図である。

【図2】光源の構成を示す図である。

【図3】図１の顕微鏡装置の概念図である。

【図4】レンズおよび位相調整部を説明する図である。

【図5】位相調整部が与える位相を説明する図である。

【図6】変形例１のレンズおよび位相調整部を説明する図である。

【図7】変形例１の位相調整部が与える位相を説明する図である。

【図8】変形例２のレンズディスクの構成を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0022】

以下、図面を参照して、本発明の実施形態について説明する。図１は本発明の顕微鏡装置１を示している。この顕微鏡装置１は光源２とスキャナユニット３と顕微鏡４とステージ５とカメラ６とファイバ７とを備えている。光源２は、図２に示すように、励起用レーザ光源１１と抑制用レーザ光源１２と第１のダイクロイックミラー１３と光源レンズ１４とを備えて構成している。

【0023】

励起用レーザ光源１１は励起用のレーザ光（励起光ＥＬ）を発振する。励起光ＥＬはステージ５に搭載されている試料Ｓに導入されている蛍光色素や蛍光タンパク等の蛍光物質を蛍光させる波長を有している。抑制用レーザ光源１２は抑制用のレーザ光（抑制光ＲＬ）を発振する。抑制光ＲＬは励起光ＥＬよりも長い波長のレーザ光であり、試料Ｓに照射したときに蛍光の発生が抑制されるような波長を有している。

【0024】

第１のダイクロイックミラー１３は励起光ＥＬの波長の光を反射させ、抑制光の波長の光を透過させる特性を有する光学素子である。第１のダイクロイックミラー１３で励起光ＥＬが反射し、抑制光ＲＬが透過することで、励起光ＥＬと抑制光ＲＬとの光軸が同軸になる。以下、励起光ＥＬと抑制光ＲＬとは同一の光路を辿るため、これらの光を照明光Ｌとする。

【0025】

第１のダイクロイックミラー１３により光軸が同軸になった励起光ＥＬおよび抑制光ＲＬは照明光Ｌとして光源レンズ１４に入射する。光源レンズ１４は入射した照明光Ｌをファイバ７に入射させる。ファイバ７は光源２とスキャナユニット３との間を接続しており、照明光Ｌはスキャナユニット３に導光される。

【0026】

図１に示すように、スキャナユニット３はコリメートレンズ２１とレンズディスク２２とピンホールディスク２３と連結ドラム２４とモータ２５とダイクロイックミラー２６とカメラレンズ２７とを備えて構成している。コリメートレンズ２１はファイバ７により導光された照明光Ｌを平行光にする。

【0027】

レンズディスク２２は、図３に示すように、複数のレンズ（小型のレンズ：マイクロレンズ）３０を配列して構成している。各レンズ３０は球面レンズであり、励起光ＥＬおよび抑制光ＲＬを集光させるレンズ機能を有している。ピンホールディスク２３は、同図に示すように、複数のピンホール３１を配列して構成している。ピンホール３１は照明光Ｌおよび後述する戻り光ＢＬが通過する微小開口部であり、試料Ｓの焦点の範囲内の光のみが通過するようになっている。これにより、分解能が高い共焦点顕微鏡として顕微鏡装置１を用いることができる。

【0028】

レンズディスク２２のレンズ３０の配置パターンとピンホールディスク２３のピンホール３１の配置パターンとは同一にしている。つまり、１つのレンズ３０に１つのピンホール３１が対応した関係になる。よって、各レンズ３０により照明光Ｌは異なる光線に分割されて、分割された各照明光Ｌに対応するピンホール３１に集光する。図２ではレンズ３０およびピンホール３１は４条の螺旋状のパターンになっているが、多条のパターンとしてもよい。

【0029】

レンズディスク２２とピンホールディスク２３とは円盤状の回転ディスクであり、両者の外形を同一形状とすることができる。レンズディスク２２とピンホールディスク２３とは連結ドラム２４により連結されており、連結ドラム２４はモータ２５により回転力が付与される。よって、モータ２５の回転力により連結ドラム２４が回転することで、レンズディスク２２とピンホールディスク２３とは一体的に回転を行う。

【0030】

レンズ３０とピンホール３１との間には第２のダイクロイックミラー２６が配置されている。ダイクロイックミラー２６は照明光Ｌ（励起光ＥＬおよび抑制光ＲＬ）の波長の光を透過させ、試料Ｓからの蛍光（戻り光ＢＬ）の波長の光を反射させる特性を持つ光学部品である。従って、照明光Ｌはダイクロイックミラー２６を透過して、試料Ｓからの戻り光ＢＬは反射する。

【0031】

ダイクロイックミラー２６を透過した照明光Ｌはピンホール３１に集光されて、試料Ｓの焦点近傍の光のみが通過する。通過した照明光Ｌは顕微鏡４に入射される。顕微鏡４は結像レンズ４１と対物レンズ４２とを有して構成される。ピンホール３１を通過した照明光Ｌは結像レンズ４１によって所定傾きの平行光に変換される。この平行光が対物レンズ４２に入射する。対物レンズ４２は平行光となった照明光Ｌを入射すると、その傾きに応じて試料Ｓの焦点に結像する。照明光Ｌが試料Ｓで焦点を結ぶことにより、試料Ｓが励起されて蛍光が発生して戻り光ＢＬが発生する。なお、図１では照明光Ｌの光路が２つ示されているが、このうち１つは光軸中心の照明光Ｌであり、もう１つは光軸中心からずれた照明光Ｌを示している。

【0032】

ステージ５は試料Ｓを搭載しており、照明光Ｌが照射される。照明光Ｌは励起光ＥＬと抑制光ＲＬとを有しており、このうち励起光ＥＬにより試料Ｓに導入された蛍光色素や蛍光タンパク等が蛍光する。このときの蛍光が戻り光ＢＬとなる。発生した戻り光ＢＬは対物レンズ４２、結像レンズ４１を介してピンホール３１を通過する。これにより、試料Ｓの焦点近傍で発生した蛍光のみがピンホール３１を通過する。ピンホール３１を通過した戻り光ＢＬはダイクロイックミラー２６に入射する。そして、ダイクロイックミラー２６で反射して、カメラレンズ２７に入射する。

【0033】

カメラレンズ２７は戻り光ＢＬを検出部としてのカメラ６に結像させる。カメラ６は結像された戻り光ＢＬの光量に基づいて、図示しないコンピュータ等で試料Ｓの画像を生成する。戻り光ＢＬはピンホール３１を通過した光のみになるため、生成される画像は共焦点画像となる。なお、戻り光ＢＬの光路においてカメラ６の前段側に蛍光成分のみを透過させる図示しない蛍光フィルタを配置することが望ましい。

【0034】

次に、レンズ３０について説明する。図４に示すように、レンズ３０には位相調整部５１が形成されている。位相調整部５１は１つのレンズ３０に対応して１つが設けられており、ここではレンズ３０のピンホール３１の対向する面（裏面とする）に位相調整部５１を形成している。

【0035】

図５に示すように、位相調整部５１はリング状の形状をしており、レンズ３０の裏面に位相物質を形成している。位相物質は主に所定厚みのガラス素材であり、位相調整部５１はリング状の所定位置を基準として、連続的或いは段階的に透過する光に与える位相を変化させている。ここでは、ある位置の位相を０（ゼロ）としたときに、連続的或いは段階的に与える位相が増加し、リング状を１周したときに与える位相が２π（つまり、位相がゼロになる）になるように設定する。従って、与える位相をゼロから２πまで変化させるために、位相物質の厚みを連続的或いは段階的に変化させている。

【0036】

位相調整部５１はレンズ３０に位相物質を接合するものであってもよいし、レンズ３０と一体的に射出成形するものであってもよい。この位相調整部５１には抑制光ＲＬの波長域の光を透過し、励起光ＥＬの波長域の光を透過させない抑制光透過フィルタ５２が形成されている。

【0037】

ここでは、位相調整部５１のピンホール３１に対向する面に抑制光透過フィルタ５２を形成しているが、位相調整部５１の任意の位置に抑制光透過フィルタ５２を形成してもよい。また、抑制光透過フィルタ５２はフィルタを貼付するものであってもよいが、薄膜を蒸着させるものとする。

【0038】

一方、リング状の位相調整部５１の内側の領域は励起光透過領域５３となっている。励起光透過領域５３は位相物質を格別に形成しているものではなく、レンズ３０の裏面のままになっている。ただし、励起光透過領域５３には励起光透過フィルタ５４を形成している。励起光透過フィルタ５４は励起光ＥＬの波長域の光を透過し、抑制光ＲＬの波長域の光を透過させないフィルタである。励起光透過フィルタ５４もフィルタを貼付するものであってもよいが、薄膜を蒸着して形成している。

【0039】

従って、レンズ３０により位相調整部５１から位相が調整されたリング状の抑制光ＲＬがピンホール３１に集光する。また、リング状の中心の励起光透過領域５３を透過した励起光ＥＬもピンホール３１に集光する。そして、顕微鏡４の対物レンズ４２により試料Ｓで焦点を結ぶ。

【0040】

このときに、リング状の位相調整部５１を透過した抑制光ＲＬが相互に干渉して、試料Ｓの焦点においてはリング状の焦点形状となる。また、励起光透過領域５３を透過した励起光ＥＬはリング状の焦点に接するような内側の円形の領域となる。これにより、試料Ｓの焦点においては、リング状の内側の限定された領域のみに励起光ＥＬを照射することができ、狭小な領域を蛍光させることができる。

【0041】

且つ、蛍光した領域の外周側の領域は抑制光ＲＬが焦点を結ぶ領域であり、蛍光を発生することがない。これにより、限定的な狭小な領域のみを蛍光させることができるため、高い分解能で励起光ＥＬを照射することができる。このときに、励起光ＥＬにより蛍光した光が戻り光ＢＬとなって、顕微鏡４に入射される。そして、最終的にカメラ６に結像される。

【0042】

従って、高分解能で励起光ＥＬを照射して、その戻り光ＢＬを検出することで、高解像度の画像を得ることができる。また、レンズディスク２２とピンホールディスク２３とをモータ２５により一体的に回転させており、照明光Ｌが透過する位置を回転により高速に変化させている。これにより、試料Ｓにおける焦点位置が高速に変化し、走査速度を著しく高速にすることができる。従って、画像生成の速度を飛躍的に高速にすることができる。

【0043】

次に、変形例１について説明する。本変形例１の位相調整部は、第１の位相調整部６１と第２の位相調整部６２とを備えている。第１の位相調整部６１はリング状の形状をしており、与える位相差が０から２πまで変化するものである。つまり、前述した位相調整部５１と同じものである。

【0044】

第２の位相調整部６２は第１の位相調整部６１の内側の円形の領域に設けられている。この円形のうち中心の円形の領域には一定の厚みを有する位相物質６３が円筒状に形成している。一方、第２の位相調整部６２の内側であり位相物質６３の外側の領域はリング状のレンズ領域６４となっている。レンズ領域６４は位相物質等が形成されておらず、レンズ３０の裏面側の領域となっている。

【0045】

位相物質６３は所定の厚みを有しており、位相物質６３を透過した光とレンズ領域６４を透過した光との間には位相差を生じる。ここでは、πの位相差を与えるものとする。このために、レンズ領域６４は位相がゼロであり、位相物質６３は位相がπとなっている。

【0046】

第１の位相調整部６１および第２の位相調整部６２は抑制光ＲＬが透過する領域となる。このために、第１の位相調整部６１および第２の位相調整部６２に前述した抑制光透過フィルタ５２を形成する。よって、第１の位相調整部６１および第２の位相調整部６２からは位相が調整された抑制光ＲＬが透過する。

【0047】

一方、第１の位相調整部６１の外側の領域はリング状の励起光透過領域６５が形成されている。この励起光透過領域６５には前述した励起光透過フィルタ５４が形成されている。よって、励起光透過領域６５から励起光ＥＬが透過する。このため、レンズ３０を透過する照明光Ｌは中心が円形の抑制光ＲＬとなり、その外周にリング状の励起光ＥＬが形成されている。

【0048】

第１の位相調整部６１は前述した位相調整部５１と同様の作用を及ぼし、抑制光ＲＬは試料Ｓにおいてリング状の焦点を結ぶ。そして、対物レンズ４２のレンズ効果により、励起光透過領域６５を透過した励起光ＥＬは、試料Ｓにおいて抑制光ＲＬの内側の領域に焦点を結ぶ。これにより、回折限界を超えた狭小な領域に励起光ＥＬの焦点を結ばせて蛍光させることができる。

【0049】

この第１の位相調整部６１の作用により励起光ＥＬの分解能が高くなるが、これは試料Ｓにおける水平面方向（ＸＹ方向）における分解能を向上させる。そして、第２の位相調整部６２は位相物質６３とレンズ領域６４との間に生じる位相差がπになるため、試料Ｓにおける垂直方向（Ｚ方向）においては、２つの焦点を構築することができる。

【0050】

従って、抑制光ＲＬはＺ方向において２つの焦点を結ぶため、これら２つの焦点の間の領域は励起光ＥＬが焦点を結ぶ領域となる。これにより、Ｚ方向においても回折限界を超えた狭小な領域に励起光ＥＬの焦点を結ばせて蛍光させることができる。つまり、第１の位相調整部６１によりＸＹ方向の分解能を向上させ、第２の位相調整部６２によりＺ方向の分解能を向上させているため、３次元に分解能が高い高解像度の画像生成を行うことができる。且つ、レンズディスク２２には多数のレンズ３０を配列して回転させて走査していることで、高速に画像生成を行うことができる。

【0051】

次に、変形例２について説明する。図８に示すレンズディスク２２は多条のレンズ３０を配置して構成している。なお、ピンホールディスク２３におけるピンホール３１の配置も同様に多条の配置構成となっている。多条配置のレンズ３０のうち、半分の条の複数のレンズ３０を第１のレンズ群７１とし、残りの半分の条の複数のレンズ３０を第２のレンズ群７２とする。

【0052】

そして、第１のレンズ群７１の各レンズ３０に図６で示した第２の位相調整部６２を形成している。つまり、レンズ３０の裏面の中心に円形の位相物質６３を形成し、その周囲のリング状の領域をレンズ領域６４としている。これにより、試料ＳにおいてはＺ方向に２つの焦点が構築され、励起光ＥＬの焦点を狭小化できる。従って、Ｚ方向における分解能を高くしている。一方、第２のレンズ群７２の各レンズ３０の裏面には減光（ＮＤ）フィルタを形成している。これにより、第２のレンズ群７２のレンズ３０を透過する光の強度は弱化する。

【0053】

本変形例２の光源２は、図１に示したように２つの光源（励起用レーザ光源１１および抑制用レーザ光源１２）を用いずに、単一の波長のレーザ光を発振する。つまり、抑制光ＲＬは用いずに励起光ＥＬだけを用い、光源２は励起光ＥＬだけを発振するようにする。そして、光源２は試料Ｓの蛍光分子の基底状態を枯渇させて蛍光を抑制するような強い強度を持つ励起光ＥＬを発振させる。

【0054】

これにより、強い強度を持つ励起光ＥＬがレンズディスク２２に入射する。第１のレンズ群７１は第２の位相調整部６２により位相が調整されて、強い強度の励起光ＥＬが透過して、試料Ｓに入射する。第２の位相調整部６２の作用により、励起光ＥＬはＺ方向において２箇所に焦点を結ぶ。励起光ＥＬは蛍光分子の基底状態を枯渇させて蛍光を抑制する光になるため、抑制光ＲＬと同じ機能を果たす。

【0055】

一方、第２のレンズ群７２のレンズ３０を透過した励起光ＥＬは減光フィルタにより強度が弱化される。このときに、減光フィルタは励起光ＥＬが試料Ｓの蛍光分子の基底状態を枯渇させない程度にまで弱化させるようにする。これにより、第２のレンズ群７２のレンズ３０を透過した励起光ＥＬが試料Ｓに焦点を結んだときに、試料Ｓは蛍光が抑制されない。つまり、減光フィルタを透過した励起光ＥＬはそのまま試料Ｓを励起させる機能を果たす。

【0056】

レンズディスク２２は回転するため、第１のレンズ群７１のレンズ３０を透過した励起光ＥＬによりＺ方向に試料Ｓの蛍光が抑制されて、第２のレンズ群７２のレンズ３０を透過した励起光ＥＬにより試料Ｓを蛍光させることができる。そして、蛍光した戻り光ＢＬを検出することで、試料Ｓの画像を生成している。

【0057】

従って、単一の波長を持つレーザ光を用いて、Ｚ方向における分解能を高くすることができる。つまり、レーザ光源の個数を２つ（励起用レーザ光源１１および抑制用レーザ光源１２）にすることなく、１つだけを用いればよいため、レーザ光源の個数を少なくすることができる。これにより、顕微鏡装置１の全体の構成が単純化する。

【0058】

また、レンズディスク２２の第１のレンズ群７１のレンズ３０が抑制光ＲＬの機能を果たし、第２のレンズ群７２のレンズ３０が励起光ＥＬの機能を果たし、レンズディスク２２を回転させている。これにより、試料Ｓにおける高速な走査を実現することができる。

【0059】

なお、本変形例２では、レンズディスク２２の第１のレンズ群７１と第２のレンズ群７２とでレンズ３０の個数を同数にし、交互に出現させるようにしたが、レンズディスク２２の複数のレンズ３０のうち一部に第２の位相調整部６２を形成し、残りのレンズ３０に減光フィルタを形成するようにしてもよい。これによっても、一部の強い励起光ＥＬにより試料Ｓの蛍光を抑制し、残りの弱化した励起光ＥＬにより試料Ｓを蛍光させることができる。これにより、高速に且つ高分解能に試料Ｓの画像生成を行うことができる。

【符号の説明】

【0060】

１ 顕微鏡装置
２ 光源
３ スキャナユニット
４ 顕微鏡
５ ステージ
６ カメラ
７ ファイバ
１１ 励起用レーザ光源
１２ 抑制用レーザ光源
１３ ダイクロイックミラー
１４ 光源レンズ
２１ コリメートレンズ
２２ レンズディスク
２３ ピンホールディスク
２４ 連結ドラム
２５ モータ
２６ ダイクロイックミラー
２７ カメラレンズ
３０ レンズ
３１ ピンホール
４１ 結像レンズ
４２ 対物レンズ
５１ 位相調整部
５２ 抑制光透過フィルタ
５３ 励起光透過領域
５４ 励起光透過フィルタ
６１ 第１の位相調整部
６２ 第２の位相調整部
６３ 位相物質
６４ レンズ領域
６５ 励起光透過領域
７１ レンズ群
７２ レンズ群
ＢＬ 戻り光
ＥＬ 励起光
ＲＬ 抑制光
Ｓ 試料

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】