特許 5653911 エモリエント組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5653911

(24)【登録日】2014年11月28日

(45)【発行日】2015年1月14日

(54)【発明の名称】エモリエント組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/01 20060101AFI20141218BHJP

   A61K 9/107 20060101ALI20141218BHJP

   A61K 47/12 20060101ALI20141218BHJP

   A61K 47/14 20060101ALI20141218BHJP

   A61K 47/34 20060101ALI20141218BHJP

   A61K 47/18 20060101ALI20141218BHJP

   A61P 17/16 20060101ALI20141218BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20141218BHJP

   A61P 17/04 20060101ALI20141218BHJP

   A61K 31/047 20060101ALI20141218BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/01

   A61K9/107

   A61K47/12

   A61K47/14

   A61K47/34

   A61K47/18

   A61P17/16

   A61P17/02

   A61P17/04

   A61K31/047

【請求項の数】13

【全頁数】14

(21)【出願番号】特願2011-508948(P2011-508948)

(86)(22)【出願日】2009年5月18日

(65)【公表番号】特表2011-520850(P2011-520850A)

(43)【公表日】2011年7月21日

(86)【国際出願番号】EP2009056021

(87)【国際公開番号】WO2009138517

(87)【国際公開日】20091119

【審査請求日】2012年4月27日

(31)【優先権主張番号】0853187

(32)【優先日】2008年5月16日

(33)【優先権主張国】FR

(73)【特許権者】

【識別番号】500166231

【氏名又は名称】ピエール、ファブレ、デルモ‐コスメティーク

【氏名又は名称原語表記】ＰＩＥＲＲＥ ＦＡＢＲＥ ＤＥＲＭＯ−ＣＯＳＭＥＴＩＱＵＥ

(74)【代理人】

【識別番号】100117787

【弁理士】

【氏名又は名称】勝沼 宏仁

(74)【代理人】

【識別番号】100091487

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 行孝

(74)【代理人】

【識別番号】100107342

【弁理士】

【氏名又は名称】横田 修孝

(74)【代理人】

【識別番号】100111730

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 武泰

(72)【発明者】

【氏名】ピエール、ファーブル

(72)【発明者】

【氏名】クリストフ、プシビルスキ

(72)【発明者】

【氏名】ジャン‐フランソワ、コルドリアニ

(72)【発明者】

【氏名】マリオン、コペック

【審査官】 光本 美奈子

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許第０５５１２２７８（ＵＳ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１９２７１５７（ＣＮ，Ａ）

【文献】 欧州特許出願公開第００１３３１５１（ＥＰ，Ａ１）

【文献】 仏国特許出願公開第０２０９１６６３（ＦＲ，Ａ１）

【文献】 中国特許出願公開第１５５２３０３（ＣＮ，Ａ）

【文献】 BMC Derm, vol.6 p.1-5 (2006)

【文献】 角化症，乾皮症，魚鱗癬治療剤，最近の皮膚外用剤，株式会社南山堂 鈴木 正二，１９９１年，第1版，p.108-113

【文献】 FRAGRANCE JOURNAL No.56，１９８２年，p.14-18

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／００〜３１／８０

Ａ６１Ｋ ９／００〜９／７２

Ａ６１Ｋ ４７／００〜４７／４８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

有効成分として、グリセロール、ワセリンおよび液体パラフィンの組合せを水中油型または油中水型エマルションの形態で含んでなる局所用組成物であって、前記ワセリンが、５１〜５７℃の滴点、１７５ １／１０ｍｍ〜１９５ １／１０ｍｍの稠度（２５℃におけるコーン貫入）、および１００℃における４ｃＳｔ〜５ｃＳｔの粘度を有する、局所用組成物。

【請求項2】

ワセリンが、１％テトラメチルシラン（ＴＭＳ）対照に対するその面積が４〜８である、２４．５５ｐｐｍのピークを含んでなる、炭素−１３の５００ＭＨｚ ＮＭＲ分光スペクトルを有する、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

ワセリンが５４℃の滴点を有する、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

ワセリンが１８５ １／１０ｍｍの稠度（２５℃におけるコーン貫入）を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項5】

ワセリンが、１００℃において４．８ｃＳｔの粘度を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項6】

１５％のグリセロール、８％のワセリンおよび２％の液体パラフィンを含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項7】

ステアリン酸、モノステアリン酸グリセロール、ポリジメチルシクロシロキサン、ジメチコン、ポリエチレングリコール６００、トロラミン、パラヒドロキシ安息香酸プロピル、クロロクレゾール、ステアリン酸ＰＥＧ−４０、および蒸留水からなる群から選択される１種以上の賦形剤を含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

皮膚病の皮膚乾燥症状を処置するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

前記皮膚病が、アトピー性皮膚炎、魚鱗癬症状および乾癬である、請求項８に記載の組成物。

【請求項10】

軽度の表在性熱傷を処置するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項11】

アトピー性皮膚炎に罹患している患者に見られる湿疹発作を予防または治療する、および／またはその頻度および強度を軽減するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項12】

有効成分としてグリセロール、ワセリンおよび液体パラフィンの組合せを水中油型または油中水型エマルションの形態で含んでなる局所用組成物を製造するための、５１℃〜５７℃の滴点を有するワセリンの使用。

【請求項13】

有効成分としてグリセロール、ワセリンおよび液体パラフィンの組合せを水中油型または油中水型エマルションの形態で含んでなる局所用組成物を製造するための、１％テトラメチルシラン（ＴＭＳ）対照に対するその面積が４〜８である、２４．５５ｐｐｍのピークを含んでなる、炭素−１３の５００ＭＨｚ ＮＭＲ分光スペクトルを有するワセリンの使用。

【発明の詳細な説明】

【発明の背景】

【0001】

本発明は罹患した皮膚のバリア機能に関連する病態および症状の処置の分野に関する。

【0002】

表皮は、恒久的に更新される、外胚葉起源の層状上皮である。

【0003】

それは脱水、機械的応力およびある種の病原体の攻撃から身体を保護する。

【0004】

それは９０％を超えるケラチノサイト、また、ランゲルハンス細胞、メルケル細胞およびメラノサイト、のいくつかの細胞種からなる。

【0005】

内層から外層へ向かって、そのケラチノサイトが、表皮の自己再生を保証する極めて高い増殖能を有する細胞層である基底層、次に、基底上層（顆粒層、有棘層）、最後に角質層（ＳＣ）の、形態学的性質と細胞組成が異なるいくつかの層が区別可能である。

【0006】

皮膚の基本的機能の１つは、一方で環境からの真菌、細菌およびアレルゲンの表皮透過、他方で水分の喪失に対抗することにより、身体と外界の媒体の間のバリアを保証することである。

【0007】

バリア機能の質は、ヒトにおいては、不感性水分喪失と水和速度の測定によって、マウスにおいては、脱水による胎児致死、皮膚の色素透過性または体重の低下によって、in vivoで評価される。

【0008】

細胞外脂質セメントならびに角質層のあらゆる細胞要素、およびケラチノサイトの増殖と分化の間の平衡の健全性は、機能的な表皮バリア機能の維持に必須である。

【0009】

ｐＨ勾配は種々の酵素の活性を調節し、従って、バリアの平衡に寄与する。

【0010】

顆粒層のラメラ体の分泌を調節することにより、カルシウムイオン濃度は角質層の細胞外セメントの組成、従って、表皮バリアの平衡に影響を及ぼす(Lee et al., Calcium and potassium are important regulators of barrier homeostasis in murine epidermis, J. Clin Invest, 89, 530-538, 1992)。

【0011】

表皮の目に見える層の７０％から、ＳＣ下層の３０％、そして表皮の最も外側の細胞層の１５％までにわたる水勾配の存在(Warner et al., Electron probe analysis of human skin: determination of the water concentration profile, J. Invest Dermatol, 90, 218-224, 1988)は、顆粒層と角質層の間の接合部にいくらかの水が保持されていることを示唆する。

【0012】

角質層における水の機能の１つは、皮膚の柔軟性と正常な落屑に必要な酵素的加水分解反応を可能とすることである。ＳＣ内に存在する水分量が限界閾値を下回れば、酵素反応が乱れ、角質細胞の接着および皮膚表面における細胞の蓄積が起こる。これが乾燥の外観と皮膚のかゆみ産み出し、剥離し、剥がれ落ちる。

【0013】

循環血液からの経皮流による水の供給と皮膚のバリア機能を働かせる表皮水の保持、の２つの減少に基づく。しかしながら、水分喪失に関するバリアは絶対的なものではない。角質層の外部媒体と内部媒体の間の水交換の正常な動きは、ＴＥＷＬ(transepidermal water loss)（経表皮水分喪失量）と呼ばれ、不感性水分損失の一部を構成する。

【0014】

皮膚のバリア機能は、集団中に最も広がっているほとんどの皮膚病において影響を受けており、炎症成分が伴っていることが多い（乾癬、アトピー性皮膚炎、魚鱗癬(ichtyoses)、皮膚乾燥症など）。皮膚のバリア機能はまた、時間（皮膚の老化）や環境の作用（紫外線、湿度レベル、公害、火傷）に応答した多くの病状でも影響を受ける。

【0015】

慢性的または急性的なバリア機能の乱れは、身体を外界からの攻撃または脱水に対してより敏感にする。それは落屑の乱れや過剰増殖に結びつけることができる(Jackson et al., Pathobiology of the stratum corneum, West J. Med, 158, 279-285, 1993)。

【0016】

特許出願ＦＲ２８４７４６７は、皮膚バリアの適切な機能に影響を及ぼす皮膚および／または粘膜の予防および／または治療を目的とした化粧用組成物を製造するための、オキシステロール７α−ヒドロキラーゼの活性の少なくとも１つのモジュレーターの使用に関するものである。

【0017】

特許出願ＦＲ２８３１４４３は、皮膚のバリア機能の改善を目的とした組成物を製造するための、イチョウ(Gingko biloba)またはオリーブ(Olea europaea)の少なくとも１つの抽出物の使用に関するものである。

【0018】

特許出願ＦＲ２９０５８５７は、皮膚乾燥を水和する、かつ／または皮膚乾燥から保護するためのイナゴマメ(carob pulp)の抽出物を含んでなる組成物の使用に関連する。

【0019】

影響を受けた皮膚のバリア機能に関連する病態および症状の処置の必要がある。

【発明の開示】

【0020】

驚くべき、予期されない方法において、本発明者らは、水中油型または油中水型エマルションの形態の、グリセロール、ワセリンおよび液体パラフィンの組合せが乾燥性の皮膚症状を処置し得ることに着目した。

【0021】

発明者らは、この組合せが皮膚バリアを保護的機能的状態に回復させることを実証した。本発明者らは、誘導性皮膚脱水のex vivo皮膚モデルを用いることにより、この組合せの水和活性およびその後の皮膚バリア機能の改善を評価した。さらに、本発明者らは、定量的ＰＣＲおよび免疫組織化学により、表皮バリア機能の恒常性に関与する可能性のある分子表皮マーカーの発現を調べた。

【0022】

本発明者らはまた、in situザイモグラフィーによりセリンプロテアーゼ活性を、また、蛍光プローブを用いて皮膚バリアの機能性を追跡した。これらの結果は、水中油型または油中水型エマルションの形態の、グリセロール、ワセリンおよび液体パラフィンの組合せがセリンプロテアーゼ活性を回復させ、ストレス誘導性の炎症を抑制することを示す。

【0023】

本発明者らはまた、この組合せにおいて特定のワセリンを選択することが上の結果を達成するのに有利であることを実証した。密封剤(occlusive agent)およびエモリエントとしてのワセリンは、この組成物に特に重要なものである。ワセリンは、実際に皮膚上に保護フィルムを形成することにより、影響を受けたバリア機能の欠陥を埋め合わせる助けをする。
皮膚上に形成されるフィルムの量は、製造において用いるワセリンの流体学的特性に極めて強く依存する。

【0024】

よって、本発明は、水中油型または油中水型エマルションの形態の、グリセロール、ワセリンおよび液体パラフィンの組合せを有効成分として含んでなる局所用組成物を目的とする。

【0025】

本発明において「有効な組合せ」とは、水中油型または油中水型エマルションの形態の、グリセロール、ワセリンおよび液体パラフィンの組合せを意味する。

【0026】

有利には、このグリセロール、ワセリンおよび液体パラフィンは「欧州薬局方」第６版により記載され、管理された基準を有する。

【0027】

有利には、この有効な組合せのワセリンは、３５〜７０℃、好ましくは５１〜５７℃、特に好ましい様式では約５４℃の滴点を有する。滴点は、「欧州薬局方」第６版に記載されている２．２．１７法に従って測定される。

【0028】

有利には、この有効な組合せのワセリンは、１７５ １／１０ｍｍ〜１９５ １／１０ｍｍ、好ましくは約１８５ １／１０ｍｍの稠度（２５℃におけるコーン貫入）を有する。

【0029】

有利には、この有効な組合せのワセリンは、１００℃において４ｃＳｔ〜５ｃＳｔ、好ましくは、１００℃において約４．８ｃＳｔの粘度を有する。

【0030】

有利には、この有効な組合せのワセリンは、１％テトラメチルシラン（ＴＭＳ）対照に対するその面積が４〜８である、２４．５５ｐｐｍのピークを含んでなる、炭素−１３（^１３Ｃ）の５００ＭＨｚ ＮＭＲ分光スペクトルを有する。

【0031】

本発明の組成物では、この有効な組合せは、組成物の総重量に対して１０〜５０重量％、優先的には２０〜３０重量％の割合で存在し；グリセロール濃度は組成物の総重量に対して５〜３０重量％、優先的には１０〜２０重量％、特に好ましい様式では約１５重量％であり、ワセリン濃度は組成物の総重量に対して３〜２０重量％、優先的には５〜１０重量％であり、特に好ましい様式では約８重量％であり、液体パラフィン濃度は組成物の総重量に対して０．５〜５重量％、優先的には１〜３重量％、特に好ましい様式では約２重量％である。

【0032】

水相において、水は組成物の総重量に対して３０〜８０重量％である。

【0033】

有利には、本発明の組成物は、組成物の総重量に対して約１５重量％のグリセロール、約８重量％のワセリンおよび約２重量％の液体パラフィンからなる。

【0034】

本発明による皮膚科組成物は典型的な皮膚科適合性形剤をさらに含んでなる。

【0035】

本発明による皮膚科組成物は、油中水型（Ｗ／Ｏ）または水中油型（Ｏ／Ｗ）エマルションとして、例えば水中水中油型（Ｗ／Ｏ／Ｗ）エマルションもしくは油中水中油型（Ｏ／Ｗ／Ｏ）などのエマルション多相エマルションの形態で、または水分散液もしくは脂肪分散液、ゲルもしくはエアゾールの形態で製造することができる。

【0036】

皮膚科的に適合する賦形剤は、クリーム、ローション、ゲル、ポマード、エマルション、マイクロエマルジョン、スプレーなどの形態で局所適用用の組成物を得るのに当業者に公知のもののうちいずれの賦形剤であってもよい。

【0037】

本発明の組成物は特に、乳化剤、増粘剤、ゲル化剤、水固定剤(water fixing agents)、展着剤、安定剤、色素、香料および保存剤などの添加剤および製剤補助剤を含み得る。

【0038】

好適な乳化剤としては、ステアリン酸、トロラミンおよびステアリン酸ＰＥＧ−４０が挙げられる。

【0039】

好ましくは、本発明の組成物は、組成物の総重量に対して約５重量％の乳化剤を含む。

【0040】

有利には、本発明の組成物は、組成物の総重量に対して１〜５重量％の、好ましくは約３重量％のステアリン酸を含む。

【0041】

有利には、本発明の組成物は、組成物の総重量に対して０〜２重量％の、好ましくは約０．５重量％のトロラミンを含む。

【0042】

有利には、本発明の組成物は、組成物の総重量に対して０〜２重量％の、好ましくは約０．５重量％のステアリン酸ＰＥＧ−４０を含む。

【0043】

好適な増粘剤としては、モノステアリン酸グリセロールおよびＰＥＧ６００が挙げられる。

【0044】

好ましくは、本発明の組成物は、組成物の総重量に対して約５重量％の増粘剤を含む。

【0045】

有利には、本発明の組成物は、組成物の総重量に対して２〜１０重量％の、好ましくは約５重量％のモノステアリン酸グリセロールを含む。

【0046】

有利には、本発明の組成物は、組成物の総重量に対して２〜１０重量％の、好ましくは約５重量％のＰＥＧ６００を含む。

【0047】

好適な保存剤としては、パラヒドロキシ安息香酸プロピル、クロロクレゾールが挙げられる。

【0048】

好ましくは、本発明の組成物は、組成物の総重量に対して約０．１％の保存剤の含む。

【0049】

有利には、本発明の組成物は、組成物の総重量に対して０．０５〜１重量％の、好ましくは約０．１％のパラヒドロキシ安息香酸プロピルを含む。

【0050】

好適な展着剤としては、ジメチコンおよびポリジメチルシクロシロキサンが挙げられる。

【0051】

好ましくは、本発明の組成物は、組成物の総重量に対して約２重量％の展着剤を含む。

【0052】

有利には、本発明の組成物は、組成物の総重量に対して０．２〜２重量％の、好ましくは約０．５重量％のジメチコンを含む。

【0053】

有利には、本発明の組成物は、組成物の総重量に対して１〜３重量％の、好ましくは約２．５重量％のポリジメチルシクロシロキサンを含む。

【0054】

好適な水固定剤としては、ポリエチレングリコール、好ましくはポリエチレングリコール６００が挙げられる。

【0055】

好ましくは、本発明の組成物は、組成物の総重量に対して約８重量％の水固定剤を含む。

【0056】

有利には、本発明の組成物は、組成物の総重量に対して２〜１０重量％の、好ましくは約５重量％のポリエチレングリコールを含む。

【0057】

本エマルションの水相に用いられる水は、蒸留水または皮膚化粧特性を有する湯であり得る。

【0058】

有利には、本発明による組成物は、
約１５％のグリセロール、
約８％のワセリン、
約２％の液体パラフィン、および賦形剤として
約１〜５％のステアリン酸、
約２〜１０％のモノステアリン酸グリセロール、
約１〜３％のポリジメチルシクロシロキサン、
約０．２％〜２％のジメチコン、
約２〜１０％のポリエチレングリコール６００、
約０〜２％のトロラミン、
約０．０５〜１％のパラヒドロキシ安息香酸プロピル、
１００％までの水
からなる。

【0059】

本発明はまた、アトピー性皮膚炎、魚鱗癬症状および乾癬などのある種の皮膚病に伴う乾燥性の皮膚症状を処置するための薬剤の製造のための、本発明による組成物の使用を目的とする。

【0060】

本発明はまた、軽度の表在性熱傷を処置するための薬剤の製造のための、本発明による組成物の使用を目的とする。

【0061】

本発明はまた、アトピー性皮膚炎に罹患している患者に見られる湿疹発作を予防および／または治療する、および／またはその頻度および強度を軽減するための薬剤の製造のための、本発明による組成物の使用を目的とする。

【0062】

以下の実施例により本発明を説明する。

【実施例】

【0063】

実施例１：調剤
組成物Ａ
１５ｇのグリセロール、
８ｇのワセリン、
２ｇの液体パラフィン、
０．５ｇのトロラミン、
および賦形剤として、ステアリン酸、モノステアリン酸グリセロール、ポリジメチルシクロシロキサン、ジメチコン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６００、パラヒドロキシ安息香酸プロピル、
１００ｇまでの水。

【0064】

組成物Ａ’
１５ｇのグリセロール、
８ｇのワセリン、
２ｇの液体パラフィン、
１．５ｇのステアリン酸、
５ｇのモノステアリン酸グリセロール、
１．５ｇのポリジメチルシクロシロキサン(polydimethylycyclosiloxane)、
０．５ｇのジメチコン、
５ｇのポリエチレングリコール６００、
０．１５ｇのトロラミン、
０．１ｇのパラヒドロキシル安息香酸プロピル
１００ｇまでの水。

【0065】

組成物Ｂ
１５ｇのグリセロール、
８ｇのワセリン、
２ｇの液体パラフィン、
０．５ｇのステアリン酸ＰＥＧ−４０、
および賦形剤として、ステアリン酸、モノステアリン酸グリセロール、ポリジメチルシクロシロキサン(polydimethylycyclosiloxane)、ジメチコン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６００、クロロクレゾール、
１００ｇまでの水。

【0066】

組成物Ｂ’
１５ｇのグリセロール、
８ｇのワセリン、
２ｇの液体パラフィン、
３ｇのステアリン酸、
５ｇのモノステアリン酸グリセロール、
２ｇのポリジメチルシクロシロキサン、
０．５ｇのジメチコン、
０．１ｇのトロラミン、
３ｇのポリエチレングリコール６００、
０．５ｇのステアリン酸ＰＥＧ−４０
０．０７５ｇのクロロクレゾール、
１００ｇまでの水。

【0067】

実施例２：誘発性皮膚脱水の調節の分析
本発明者らは、ここで、誘導性皮膚脱水のex vivo皮膚モデルを使用することにより、組成物Ａの水和活性と、その後の皮膚のバリア機能の改善を評価する。

【0068】

本発明者らは、定量的ＰＣＲおよび免疫組織化学により、示差的分子表皮マーカーの発現を観察する。

【0069】

本発明者らはまた、in situザイモグラフィーによりセリンプロテアーゼ酵素の活性を、また、ウエスタンブロット法により角質デスモソームタンパク質の分解を追跡する。

【0070】

皮膚バリアの機能性を、蛍光プローブを使用することにより分析する。

【0071】

材料および方法
Ｉ．組織モデル
１．皮膚外植片の処理
実験室は、形成手術（乳房縮小術）の処置廃棄物から皮膚サンプルを回収する。これらのサンプルの使用は、フランス文部省に対して出された「ピエール・ファーブルグループの研究プログラムの要件を満たすヒト身体要素の保存および処理のための活動に関する声明」の範囲内にある。

【0072】

これらのサンプルをＰＢＳ浴で１０回洗浄した後、パンチで２ｃｍ系のディスクに切り取る。これらの皮膚外植片をペトリ皿のグリッドに拡げ、処置領域の範囲を定めるためにその皮膚に１ｃｍ径のリングを埋める。

【0073】

２．モデルの速度論
この誘導性脱水モデルでは、皮膚は、細胞培養フード下、蓋のない皿の中で２時間乾燥させた後、有効な組合せ有り、または無しの局所処置のためにインキュベーター内に２時間置く。脱水ストレスの陰性対照は、蓋をしたペトリ皿にて同じ速度で行う。

【0074】

３．分析用サンプル
処置後、ＲＮＡの発現を分析するために６ｍｍ径の生検を２つ採取し、組織学のために４ｍｍ径の生検を１つ、Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ（登録商標）(Sakura Finetek)に封入する。タンパク質分析のため、真皮から表皮を分離するために、皮膚を６０℃の湯浴中で５分間、次いで４℃浴で２時間熱ショックに曝す。

【0075】

これらの生検および表皮を液体窒素中で凍結させ、−８０℃で分析まで保存する。

【0076】

ＩＩ．定量的ＰＣＲによるトランスクリプトーム分析
皮膚生検を、予め液体窒素で予冷した乳鉢で摩砕し、供給者の奨励に従い、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）(QIAGEN)の手段により、ＲＮＡを抽出する。次に、このＲＮＡをＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏ ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）にてＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（登録商標）(Agilent Technologies)で分析する。ｃＤＮＡは１μｇのＲＮＡから、オリゴｄＴプライマーとともにＡｃｃｅｓｓ ＲＴ−ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）キット(Promega)を用いて行った逆転写酵素反応によって得る。遺伝子発現レベルは、９５℃での変性（１５秒）および６０℃での伸長（１ｍｍ）を含んでなる４０サイクルのプロトコールに従い、ＰＣＲ ｉＱ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｓｕｐｅｒ Ｇｒｅｅｎ Ｍｉｘキット(Biorad)を用いるＩＣｌｙｃｌｅｒ ｉＱ（登録商標）(Biorad)蛍光サーモサイクラーでの定量的ＰＣＲによって分析する。蛍光発光（インターカレーションするＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ）と比例するＰＣＲ産物の蓄積をｉＣｙｃｌｅｒソフトウエアを用いて、サイクルが終わるたびに可視化する。

【0077】

ｉＣｌｙｃｌｅｒバージョン３．１分析ソフトウエアにより、Ｃ_Ｔ（サイクル閾値）、すなわち、ｃＤＮＡ増幅を始めるサイクルの生値が得られる。数種の参照遺伝子の発現を、あるサンプルから他のものまで、最も安定な参照遺伝子の選択を可能とするＧｅｎｏｒｍプログラムバージョン３．４を用いて、並行して分析する。次に、この遺伝子を参照として用い、ΔＣ_Ｔ＝（着目するＣ_Ｔ遺伝子）−（Ｃ_Ｔ参照遺伝子）を算出することによって結果をノーマライズする。

【0078】

次に、誘導倍率（ＩＦ）を、処置ごとに、対応する対照条件に対して算出する。ＩＦ＝２^{−ΔΔＣＴ}（ここで、ΔΔＣＴ＝（処置ΔＣＴ）−（対照ΔＣＴ））。ｍＲＮＡ発現は５人の異なる個体からの５回の実験で２回ずつ評価する。対照に対する誘導倍率が２より大きい場合には、その遺伝子の発現が誘導されているとみなされ、０．５より小さい場合には、その発現は抑制されているとみなされる。このモデルで引き起こされたストレスに対する応答に対する有効成分の効果は、下式：
ストレス応答阻害率％＝１００×（（（ストレス有りのＩＦ）−（ストレス無しの対照ＩＦ））−（（処置有りのＩＦ）−（ストレス無しの対照ＩＦ）））／（（ストレス有りのＩＦ）−（ストレス無しのＩＦ））
を用いて算出された阻害率％によって評価する。

【0079】

本試験モデルと比較した際、「ストレス無しの対照」条件は、乾燥していない対照に相当し、「ストレス有り」の条件は、２時間乾燥させ、対照条件下（すなわち、局所処置無し）でさらに２時間経過した皮膚生検に相当し、最後に「処置有り」の条件は、２時間の乾燥を施した後にエモリエントで２時間局所処置を施した皮膚である。

【0080】

ＩＩＩ．ウエスタンブロット法によるタンパク質発現分析
処置済みの表皮を、液体窒素で冷却した乳鉢で摩砕し、ＲＯＰＡ溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００；１％ Ｎａ＋デスオキシコレート；０．１％ＳＤＳ；５ｍＭ ＥＤＴＡ；１００ｍＭ ＤＴＴ；プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐ８３４０、SIGMA）にてタンパク質を抽出する。

【0081】

次に、これらのタンパク質をＤＣ−ＤＣタンパク質アッセイ(Biorad)法によってアッセイし、ウエスタンブロット法によって分析する。各条件につき、２５〜４０μｇの全タンパク質を、７．５％ポリアクリルアミドＴｒｉｓ−グリシンゲルにのせる。このタンパク質混合物を、Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＩシステム(Biorad)を用いた電気泳動によって分離し、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ、Amersham）に転写する。着目するタンパク質を、特異的抗体およびＥＣＬ＋キット(Amersham)によって現像する。タンパク量および分解型の割合を、β−アクチン（参照タンパク質）に対してノーマライズした後にＩｍａｇｅ Ｍａｓｔｅｒ ＴｏｔａｌＬａｂバージョン１．１１ソフトウエア(Amersham)を用いて算出する。

【0082】

ＩＶ．組織学的技術
皮膚生検をＣｒｙｏｔｏｍｅ（Ｌｅｉｃａ ＣＭ ３０５０ｓ）で厚さ５μｍの切片とし、観察用スライド（Ｓｔａｒｆｒｏｓｔ（登録商標））にのせる。

【0083】

１．免疫組織化学
凍結切片を２０℃のアセトン中で１０分固定した後、ＰＢＳで再水和させ、その後、免疫化学標識により分析する。固定および再水和の後、皮膚切片を３％ＢＳＡ溶液で飽和させ、着目するタンパク質に対する一次抗体とともに１時間インキュベートする。次に、それらを、Ａｌｅｘａ−４８８またはＡｌｅｘａ−５５５蛍光色素と結合させた二次抗体とともに１時間インキュベートし、最後に、核を染色するためのＤＡＰＩを含有するＭｏｗｉｏｌ中に包埋する。

【0084】

２．in situザイモグラフィー
−２０℃のアセトン中で１０分固定した後、切片を洗浄溶液（水中１％のＴｗｅｅｎ ２０）中ですすぎ、蛍光団（二次）と結合させた、着目する酵素の特異的基質を含有する溶液とともに３７℃で２時間インキュベートする。酵素が活性化されると蛍光団が切断され、蛍光シグナルを発し、これを顕微鏡で観察することができる。その後、標識されたスライドを、エピ蛍光を備えた顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ５０ｉ）またはＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ １００倒立共焦顕微鏡下で観察する。

【0085】

３．蛍光プローブ
脱水処置の後、皮膚外植片をさらに１時間、３７℃のインキュベーターにて、ＨＢＳＳバッファー中１ｍＭのルシファー・イエローカルボキシヒドラジドリチウム塩蛍光プローブ(Invitrogen)とともにインキュベートする。次に、皮膚をＨＢＳＳ浴中で１分間すすいだ後、４ｍｍ径の生検を採取し、Ｔｉｓｓｕｅ ＴｅｋＲ（登録商標）樹脂(Sakura Finetek)(Matsuki et al., 1998)に包埋する。その後、皮膚を切片にし、核をＤＡＰＩで染色し、それらのスライドを上記のように、蛍光顕微鏡下、４５０ｎｍの波長で観察する。

【0086】

結果
Ｉ．誘導性の乾燥によるバリア機能破壊モデル
１．蛍光プローブによる皮膚の透過性の測定
最初の分析は、皮膚バリア機能の基本的機能パラメーター、すなわち、表皮の上層の透過性を調べることからなった。乾燥実験の後に皮膚を蛍光プローブ（ルシファー・イエロー）とともにインキュベートすると、皮膚透過性の調節の同定が可能であった。対照条件においては、標識は極めて弱く、表面的なものであり、プローブは角質層をあまり透過せず、すすぎの間に除去される。２時間乾燥させた後、標識は角質層のより深層に見られる。乾燥は皮膚の透過性を増し、そのバリア機能を低下させる。２時間乾燥させた後に組成物Ａで局所処置すると、プローブに対するＳＣの不透性が回復し、対照条件下と同様に、標識はこの場合も弱く、表面的なものとなる。従って、水和処置は、乾燥した皮膚に、また、この組織モデルで観察可能な皮膚のバリア機能に修復効果を持つと結論付けることができる。

【0087】

２．トランスクリプトームおよびプロテオームの調節に対する効果
表皮バリア機能の恒常性に関与する可能性ある種々の遺伝子の発現を、乾燥モデルの種々のストレスまたは処置条件下、定量的ＰＣＲにより測定した。免疫組織化学による分析により、例えば密接に結合しているなど、位置に関する特定のタンパク質の発現の再編成が示された。角質デスモソームタンパク質の分解をウエスタンブロット法により分析した。

【0088】

これらの種々のアプローチを用いて調べた標的をそれらの生理学的役割によって分類した（表１参照）。この研究の目標は、観察可能なストレスに対する応答の観察および組成物Ａの局所適用によるストレス作用の矯正である。

【0089】

実施された研究によれば、特定の標的の種々の調節レベルも示した。従って、本発明者らは、落屑酵素は転写レベルでは、より詳しくはそれらの活性レベルでは調節されなかったと言える（結果３参照）。

【0090】

【表1】

【0091】

３．落屑に関連する酵素活性の測定
セリンプロテアーゼ活性を脱水モデルにてin situザイモグラフィーにより評価し、乾燥２時間後の対照条件下と、乾燥２時間の後に組成物Ａとともに２時間インキュベートした後に共焦顕微鏡下で観察した。標識は対照条件下でより強く、正常な強い活性に相当する。乾燥２時間後、この標識は低下し、角質層に沿っては無視できるほどになるが、組成物Ａとともに２時間インキュベートした後には、その強度は増し、活性の局在が認められる。乾燥の作用は酵素活性を低下させ、乱すことである。これらの結果は、乾燥で本発明者らが観察した角質デスモソームタンパク質の分解の低下と一致し、開発されたモデルで見られた落屑の減少に対する乾燥の影響が確認される。組成物Ａは脱水した皮膚の酵素活性を回復させることができ、落屑の恒常性の回復に対する本組成物の効果が確認される。

【0092】

これらの結果は、分子標的の発現レベルの回復を可能とし、その発現が誘発される皮膚脱水のストレスにより増すことを示している。組成物Ａはセリンプロテアーゼ活性を回復させる。さらに、組成物Ａの局所適用により、ストレスにより誘発される炎症の抑制が少なくなる。

【0093】

これらの結果は全体として、組成物Ａの局所適用が皮膚のバリア機能を回復させ、？？？を限定することを示唆する。

【0094】

実施例３：Ｓｙｎｔａｄｅｘ ＡワセリンのＮＭＲによる特性決定
炭素−１３の５００ＭＨｚ ＮＭＲによる測定のために５ｇのサンプルを変性クロロホルムに溶解させる。

【0095】

Ｓｙｎｔａｄｅｘ Ａワセリン(Syntheal)は、特に、１％テトラメチルシラン（ＴＭＳ）対照に対するその面積が４〜８である、２４．５５ｐｐｍのピークを含んでなる、特徴的な炭素−１３の５００ＭＨｚ ＮＭＲ分光スペクトルを示す。

【0096】

この同じピークが組成物Ａに見られた。

【図面の簡単な説明】

【0097】

【図1】Ｓｙｎｔａｄｅｘ Ａワセリン(Syntheal)および組成物Ａの５ｇサンプルの、炭素−１３の５００ＭＨｚ ＮＭＲスペクトルを示す。

【図1】