特許 5654078 新規２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5654078

(24)【登録日】2014年11月28日

(45)【発行日】2015年1月14日

(54)【発明の名称】新規２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素

(51)【国際特許分類】

   C12P 7/26 20060101AFI20141218BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20141218BHJP

【ＦＩ】

   C12P7/26ZNA

   !C12N15/00 A

【請求項の数】2

【全頁数】23

(21)【出願番号】特願2013-80207(P2013-80207)

(22)【出願日】2013年4月8日

(62)【分割の表示】特願2011-505898(P2011-505898)の分割

【原出願日】2010年3月26日

(65)【公開番号】特開2013-135697(P2013-135697A)

(43)【公開日】2013年7月11日

【審査請求日】2013年4月8日

(31)【優先権主張番号】特願2009-75802(P2009-75802)

(32)【優先日】2009年3月26日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2009-75803(P2009-75803)

(32)【優先日】2009年3月26日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2009-75804(P2009-75804)

(32)【優先日】2009年3月26日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2009-75805(P2009-75805)

(32)【優先日】2009年3月26日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2009-75806(P2009-75806)

(32)【優先日】2009年3月26日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2009-78713(P2009-78713)

(32)【優先日】2009年3月27日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】303046314

【氏名又は名称】旭化成ケミカルズ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000109

【氏名又は名称】特許業務法人特許事務所サイクス

(72)【発明者】

【氏名】小西 一誠

(72)【発明者】

【氏名】今津 晋一

【審査官】 西村 亜希子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００６／１０９４７９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 J. Antibiot.，１９９９年，Vol.52,No.6，pp.559-571

【文献】 J. Antibiot.，２００６年，Vol.59, No.6，pp.358-361

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ｃ１２Ｎ １／１５

Ｃ１２Ｎ １／１９

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ｃ１２Ｎ ９／００

Ｃ１２Ｐ ７／２６

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

塩化コバルト６水和物換算で０．１〜５０ｍｇ／Ｌの範囲で、コバルトイオンを含有する培地において２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素を発現可能な微生物を培養することを特徴とする、グルコース−６−リン酸から２−デオキシ−シロ−イノソースを製造する製造方法であって、２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が、下記の何れかのアミノ酸配列を有する２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素である、上記の方法。
（ａ）配列番号２、４、６又は８の何れかに記載のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の相同性を有し、かつ安定温度範囲が２０℃以上５０℃以下である高温安定性及び／又は安定ｐＨ範囲が６．０〜８．０である広範囲ｐＨ安定性を有するアミノ酸配列；

【請求項2】

グルコースを構成成分とする多糖類あるいはグルコースを含有する原料を用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、耐熱性２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素、２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素遺伝子、組み換えベクター、形質転換体、及び２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

現在、カテコールなどの芳香族化合物の多くは、石油を原料として生産されているが、石油資源の枯渇問題や二酸化炭素排出量の削減などの観点から、バイオマスを利用した環境調和型の新規製造プロセスの開発が求められている。

【0003】

一方、２−デオキシ−シロ−イノソース（以下、ＤＯＩ）が、産業上有用とされる芳香族化合物（カテコール等）へと変換できることが見出され（非特許文献１）、さらには、このＤＯＩを、バイオマスの構成要素の一つであるグルコースから合成できることが報告された（非特許文献１）。本ＤＯＩ製造プロセスで重要となるのがグルコース−６−リン酸からＤＯＩへと変換する２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素（以下、ＤＯＩ合成酵素）であり、ＤＯＩは上記芳香族化合物への変換のみならず各種有用化合物の中間体ともなり得ることから、ＤＯＩ合成酵素は非常に大きな注目を浴びている。

【0004】

ＤＯＩ合成酵素はブチロシン生産菌であるＢａｃｉｌｌｕｓ ｃirculans に属する微生物から１９９７年に単離精製（非特許文献２）され、続いて、その遺伝子配列も公開されている（特許文献１）。この他にもＳｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ ＪＣＭ３２６８株（非特許文献３）由来のＤＯＩ合成酵素などがこれまでに発見されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２０００−２３６８８１号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４１，１９３５−１９３８，２０００

【非特許文献2】Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ５０（５）, ４２４−４２８, １９９７

【非特許文献3】Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ５９（６）, ３５８−３６１, ２００６

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

しかしながら、前記ＤＯＩ合成酵素の安定性と比活性などの各種特性は、満足のいくものではなく、また、数千トン規模の工業化製法に向けた酵素の解析や機能向上に関する研究はほとんどなされてこなかった。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃirculans に属する微生物に由来するＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）は、安定性等に大きな問題があり、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ ＪＣＭ３２６８株由来のＤＯＩ合成酵素の比活性は著しく低く、工業的な利用は困難であった。本発明が解決しようとする課題は、従来の酵素に比べて、熱やｐＨに対する安定性などの特性が優れるＤＯＩ合成酵素の提供、及び、該酵素を用いたＤＯＩ製造方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

これらの課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、本発明者らは、従来の酵素に比べて熱及び／又はｐＨ安定性が向上したＤＯＩ合成酵素を発見し、本発明を完成するに至った。

【0009】

すなわち、本発明は、以下に示すＤＯＩ合成酵素、ＤＯＩ合成酵素遺伝子、組み換えベクター、形質転換体、及びＤＯＩ製造方法に関するものである。
［１］ 下記（１）、（２）、（４）、（６）及び（７）の特性を有し、かつ下記（３）及び／又は（５）の特性を有する２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素。
（１）作用：本酵素は、グルコース−６−リン酸を２−デオキシ−シロ−イノソースへと変換する機能を有する。
（２）至適ｐＨ範囲：７．０〜 ７．７
（３）安定ｐＨ範囲：６．０〜 ８．０
（４）至適温度範囲：５５ 〜 ７０℃
（５）安定温度範囲：２０〜４６℃
（６）補酵素：ＮＡＤ⁺を利用
（７）分子量：３９０００〜４２０００

【0010】

［２］ 下記（８）の特性を有する、［１］に記載の２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素。
（８）比活性：１．０μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ以上（反応温度６５℃）

【0011】

［３］ 下記（９）の特性を有する、［１］又は［２］に記載の２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素。
（９）補因子：Ｃｏ²⁺イオンの添加により活性向上

【0012】

［４］ 安定温度範囲が、２０〜６０℃である、［１］から［３］の何れか１項に記載の２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素。

【0013】

［５］ 下記の何れかのアミノ酸配列を有する２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０又は１２の何れかに記載のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０又は１２の何れかに記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有し、かつ高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性を有するアミノ酸配列；又は
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０又は１２の何れかに記載のアミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を含み、かつ高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性を有するアミノ酸配列

【0014】

［６］ 下記の何れかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素遺伝子。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０又は１２の何れかに記載のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０又は１２の何れかに記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有し、かつ高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性を有するアミノ酸配列；又は
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０又は１２の何れかに記載のアミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を含み、かつ高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性を有するアミノ酸配列

【0015】

［７］ 下記の何れかの塩基配列を有する２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素遺伝子。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９又は１１の何れかに記載の塩基配列；
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９又は１１の何れかに記載の塩基配列に対して８０％以上の相同性を有し、かつ高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性を有する２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素をコードする塩基配列；又は
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９又は１１の何れかに記載の塩基配列に対して１個又は複数個の塩基の欠失、付加、及び／又は置換を含み、かつ高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性を有する２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素をコードする塩基配列：

【0016】

［８］ ［６］又は［７］に記載の２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素遺伝子を含む、組み換えベクター。

【0017】

［９］ ［６］又は［７］に記載の２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素遺伝子又は［８］に記載の組み換えベクターを宿主に導入することにより得られる形質転換体。

【0018】

［１０］ ［９］に記載の形質転換体を培養することにより得られる２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素。

【0019】

［１１］ ［１］から［５］又は［１０］の何れか１項に記載の２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素を用いることを特徴とする、２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法。

【0020】

［１２］ ［６］又は［７］に記載の２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素遺伝子、又は［９］に記載の形質転換体を利用することを特徴とする、グルコース、グルコースを構成成分とする多糖類及び／又はグルコース−６−リン酸を原料とした２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法。

【0021】

［１３］ コバルトイオンを含有する培地において２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素を発現可能な微生物を培養することを特徴とする、グルコース−６−リン酸から２−デオキシ−シロ−イノソースを製造する製造方法。

【0022】

［１４］ グルコースを構成成分とする多糖類あるいはグルコースを含有する原料を用いることを特徴とする、［１３］に記載の方法。

【0023】

［１５］ ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が、［１］から［５］の何れかに記載の２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素である、［１３］又は［１４］に記載の方法。

【発明の効果】

【0024】

本発明のＤＯＩ合成酵素を用いると、ＤＯＩの製造において、高温条件での酵素利用が可能となる。さらに、製造条件によっては、製造時の厳密な温度管理などが不要となる。また、ＤＯＩが安定なｐＨ領域である酸性条件下でのＤＯＩ製造が可能となる。さらに、製造条件によっては、製造時の厳密なｐＨ管理などが不要となる。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】図１は、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の至適ｐＨ範囲を示す（実施例３）。

【図2】図２は、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の安定ｐＨ範囲を示す（実施例３）。

【図3】図３は、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の至適温度範囲を示す（実施例３）。

【図4】図４は、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の安定温度範囲を示す（実施例３）。

【図5】図５は、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の安定温度範囲を示す（実施例３）。

【図6】図６は、精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）の安定温度範囲を示す（比較例１）。

【図7】図７は、精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）の安定ｐＨ範囲を示す（比較例１）。

【発明を実施するための形態】

【0026】

以下、本発明について具体的に説明する。
[ＤＯＩ合成酵素]
本発明を実施するための形態（以下、本実施の形態という）のＤＯＩ合成酵素は、下記の特性を有し、
（１）作用：本酵素は、グルコース−６−リン酸をＤＯＩへと変換する機能を有する。
（２）安定性：高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性を示す。

【0027】

好ましくは、本発明におけるＤＯＩ合成酵素は、下記（１）、（２）、（４）、（６）及び（７）の特性を有し、かつ下記（３）及び／又は（５）の特性を有する。
（１）作用：本酵素は、グルコース−６−リン酸を２−デオキシ−シロ−イノソースへと変換する機能を有する。
（２）至適ｐＨ範囲：７．０〜 ７．７
（３）安定ｐＨ範囲：６．０〜 ８．０
（４）至適温度範囲：５５ 〜 ７０ ℃
（５）安定温度範囲：２０〜４６℃（好ましくは、２０〜６０℃）
（６）補酵素：ＮＡＤ⁺を利用
（７）分子量：３９０００〜４２０００

【0028】

さらに好ましくは、本発明におけるＤＯＩ合成酵素は、上記の特性に加えて、下記（８）及び／又は（９）の特性を有する。
（８）比活性：１．０μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ以上（反応温度６５℃）
（９）補因子：Ｃｏ²⁺イオンの添加により活性向上

【0029】

本発明のＤＯＩ合成酵素のアミノ酸配列の具体例を、配列番号２、４、６、８、１０、及び１２に示す。配列番号２、４、６、８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列を有するＤＯＩ合成酵素は、高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性の特性を有していることが好ましい。配列番号２、４、６、８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列を有するＤＯＩ合成酵素は、本実施の形態において優れた高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性の特性を有することが好ましい。

【0030】

本実施の形態においてＤＯＩ合成酵素は、配列番号２、４、６、８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸配列と好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するたんぱく質でもよい。

【0031】

また、本実施の形態においてＤＯＩ合成酵素は、配列番号２、４、６、８、１０又は１２に記載のアミノ酸配列からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸配列において１個又は複数個のアミノ酸に欠失、置換及び／又は付加を含んでも良い。欠失、置換及び／又は付加されるアミノ酸の数は好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個である。

【0032】

配列番号２、４、６、８、１０、１２に記載のアミノ酸配列からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、優れた高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性の特性を有し、かつＤＯＩ合成酵素活性を有する酵素は、本発明に含まれる。

【0033】

配列番号２、４、６、８、１０、１２に記載のアミノ酸配列からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸に欠失、置換及び／又は付加を含むアミノ酸配列を有し、優れた高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性の特性を有し、かつＤＯＩ合成酵素活性を有する酵素は、本発明に含まれる。

【0034】

ＤＯＩ合成酵素中のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異を生じさせる方法としては、ＰＣＲ法、エラープローンＰＣＲ法、ＤＮＡシャッフリング法やキメラ酵素を作製する手法等の公知の方法が利用できる。

【0035】

ＤＯＩ合成酵素中のアミノ酸配列の相同性は、例えば、ＵＷＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅが供給するＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２， ｐ３８７−３９５）や、ＰＩＬＥＵＰやＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０−３００； Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−１０）などの配列分析用ツールを用いて算出し得る。

【0036】

また、上記の手法により得られたＤＯＩ合成酵素を、熱処理後に活性測定を行うことにより、高温安定性を保持する酵素を選別することが可能である。

【0037】

[ＤＯＩ合成酵素遺伝子]
本実施の形態のＤＯＩ合成酵素遺伝子は、メタゲノムや微生物から単離・抽出した天然のものでも良く、また、その塩基配列に従ってＰＣＲ法、人工合成法等の公知の方法によって合成したものでも良い。また、新規ＤＯＩ酵素キメラ遺伝子の作製には、既知ＤＯＩ合成酵素遺伝子を組み合わせてもよく、例えば、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＢＲＣ１３１５７株、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ ＪＣＭ３２６８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅ ＮＢＲＣ１２７７３株などに由来するＤＯＩ合成酵素遺伝子が挙げられる。

【0038】

本実施の形態におけるＤＯＩ合成酵素遺伝子の塩基配列の具体例を、配列番号１、３、５、７、９又はは１１に示す。

【0039】

配列番号１、３、５、７、９又は１１に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも1つの遺伝子配列を有するＤＯＩ合成酵素遺伝子を含む組み換えベクターと宿主から形質転換体を得、得られた形質転換体を培養してＤＯＩ合成酵素を得ることができる。

【0040】

配列番号１、３、５、７、９又は１１に記載の塩基配列を有するＤＯＩ合成酵素遺伝子から得られるＤＯＩ合成酵素は、高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性の特性を有していることが好ましい。

【0041】

本実施の形態においてＤＯＩ合成酵素遺伝子は、配列番号１、３、５、７、９又は１１に記載の塩基配列を有するＤＯＩ合成酵素遺伝子と好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有する塩基配列を有していてもよい。配列番号１、３、５、７、９又は１１に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも1つの塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列を有し、優れた高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性の特性を有し、かつＤＯＩ合成酵素活性を有する酵素をコードするＤＯＩ合成酵素遺伝子は、本発明に含まれる。

【0042】

本実施の形態においてＤＯＩ合成酵素遺伝子は、配列番号１、３、５、７、９又は１１の何れかに記載の塩基配列に対して１個又は複数個の塩基の欠失、付加、及び／又は置換を含んでもよい。配列番号１、３、５、７、９又は１１の何れかに記載の塩基配列に対して１個又は複数個の塩基の欠失、付加、及び／又は置換を含み、かつ高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性を有するＤＯＩ合成酵素をコードする塩基配列を有するＤＯＩ合成酵素遺伝子は本発明に含まれる。欠失、付加及び／又は置換される塩基の数は好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個である。

【0043】

本実施の形態においては、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＯＩ合成酵素遺伝子を用いてもよい。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０又は１２の何れかに記載のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０又は１２の何れかに記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有し、かつ高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性を有するアミノ酸配列；又は
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０又は１２の何れかに記載のアミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を含み、かつ高温安定性及び／又は広範囲ｐＨ安定性を有するアミノ酸配列

【0044】

[組換えベクター及び形質転換体]
本実施の形態の組換えベクターは、プラスミド等の公知のベクターに本実施の形態の遺伝子を連結（挿入）して得ることができる。前記ベクターは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。

【0045】

前記プラスミドDNAとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば pBR322, pBR325, pUC18, pUC119, pTrcHis, pBlueBacHis 等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば pUB110, pTP5 等）、酵母由来のプラスミド（例えば YEp13, YEp24, YCp50, pYE52 等）などが、ファージ DNAとしてはλファージ等が挙げられる。

【0046】

前記ベクターへの本実施の形態の遺伝子の挿入は、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、ベクターDNAの適当な制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法が採用される。

【0047】

宿主内で外来遺伝子を発現させるためには、構造遺伝子の前に、適当なプロモーターを配置させる必要がある。前記プロモーターは特に限定されず、宿主内で機能することが知られている任意のものを用いることができる。なおプロモーターについては、後述する形質転換体において、宿主ごとに詳述する。また、必要であればエンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、リボソーム結合配列（SD配列）、ターミネーター配列等を配置させてもよい。

【0048】

本実施の形態の形質転換体は、本実施の形態の組換えベクターを、目的遺伝子が発現しうるように宿主中に導入することによって得ることができる。ここで宿主としては、本実施の形態のDNAを発現できるものであれば特に限定されず、例えば、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロテイ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属に属する細菌、またサッカロミセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等の酵母、その他COS細胞、CHO細胞等の動物細胞、あるいはSf19、Sf21等の昆虫細胞を挙げることができる。

【0049】

また、本実施の形態の形質転換体として利用する宿主は、グルコース−6−リン酸をグルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロースなどの単糖類から合成する機能を有するものが好ましい。また、必要に応じて、二つ以上の単糖が連結した多糖類を分解する機能を有することも好ましい。

【0050】

大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、ＤＯＩ合成酵素を効率的に発現させるという観点から、本実施の形態の組換えベクターが各細菌中で自律複製可能であるとともにプロモーター、リボゾーム結合配列、本実施の形態の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが望ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていても良い。大腸菌としてはエッシェリヒア・コリ（E. coli）K12、DH1、DH10B（Invitrogen社）、BL21-CodonPlus(DE3)-RIL（ストラタジーン社）、TOP10F等が挙げられ、枯草菌としてはバチルス・ズブチリス（B. subtilis）MI114、207-21 等が挙げられる。

【0051】

プロモーターとしては大腸菌等の宿主で機能するものであれば特に限定されず、例えばgapAプロモーター、gadAプロモーター、trpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーター等の大腸菌由来のプロモーターや、T7プロモーター等のファージ由来のプロモーターを用いることができる。

【0052】

細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にDNAを導入できる方法であれば特に限定されないが、例えばカルシウムイオンを用いる方法（Cohen, SN et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69 : 2110 (1972)）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。

【0053】

酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セルビシエ（S. cerevisiae）、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）等が用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母で発現しうるもの、例えばgal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα 1プロモーター、PHO5プロモーター、AOXプロモーター等を挙げることができる。

【0054】

酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法（Becker, D.M. et al. : Methods. Enzymol., 194 : 180 (1990)）、スフェロプラスト法（Hinnen, A. et al. : Proc Natl. Acad. Sci. USA, 75 : 1929 (1978)）、酢酸リチウム法（Itoh, H. : J. Bacteriol., 153 : 163 (1983)）等を挙げることができる。

【0055】

[ＤＯＩ合成酵素の生産]
本実施の形態の酵素は、本実施の形態の形質転換体を適当な培地で培養し、その培養物から該酵素活性を有するタンパク質を採取することによって得ることができる。本実施の形態の形質転換体を培養する方法は、宿主に応じて決定すればよい。例えば、大腸菌や酵母等の微生物を宿主とする形質転換体の場合は、微生物が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体を効率的に培養しうる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いても良い。

【0056】

培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加しても良い。プロモーターとして誘導性のものを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加しても良い。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（IPTG）等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、インドールアクリル酸（IAA）等を培地に添加しても良い。

【0057】

培養後、本実施の形態の酵素タンパク質が菌体内または細胞内に生産される場合は、細胞を破砕する。一方、本実施の形態のタンパク質が菌体外または細胞外に分泌される場合は、培養液をそのまま用いるか、遠心分離等によって回収する。

【0058】

タンパク質の単離・精製には、例えば硫安沈澱、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独であるいは適宜組み合わせて用いればよい。

【0059】

また、活性とはグルコース−６−リン酸をＤＯＩへと変換することを示す。活性値の測定方法は以下に示すとおりである。
本実施の形態のＤＯＩ合成酵素活性は、基質となり得る適当なグルコース−６−リン酸を含む反応液に該酵素を添加し、生成するＤＯＩを検出する方法によって確認することができる。生成するＤＯＩの確認は、非特許文献（Journal of Biotechnology 129, 502-509 (2007)）に記載の方法などを用いることができる。

【0060】

ＤＯＩ合成酵素活性を測定する方法としては、１０００ｍＭグルコース−６−リン酸溶液２０μＬ、１００ｍＭＮＡＤ⁺溶液５０μＬ、１００ｍＭ塩化コバルト六水和物溶液５０μＬを含むｐＨ７．０の１５０ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液９００μＬに適当な濃度のＤＯＩ合成酵素液１００μＬを混合し、５〜６０分間程度反応させた後、酵素を失活させ、ＤＯＩを定量する方法を使用する。

【0061】

精製されたＤＯＩ合成酵素の精製度の確認や分子量の測定は、電気泳動やゲル濾過クロマトグラフィー等によって行うことができる。また、酵素の至適温度範囲あるいは至適ｐＨ範囲は、反応温度あるいは反応ｐＨを変化させて酵素活性を測定すればよい。さらにＤＯＩ合成酵素を種々のｐＨ条件下又は温度条件下に一定時間さらした後に酵素活性を測定することにより、安定ｐＨ範囲及び安定温度範囲を調べることができる。例えば、各ｐH条件におけるＤＯＩ合成酵素の評価には、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ５．５〜８．０）およびＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４〜８．０）を用いることができる。

【0062】

至適ｐＨ範囲とは、ｐＨを変化させて測定した際に最も高活性を示した活性値を１００とし、活性値が７０以上であるｐＨ範囲である。

【0063】

安定ｐＨ範囲とはｐＨを変化させて測定した際に最も高活性を示した活性値を１００とし、活性値が７０以上のｐＨ範囲である。

【0064】

至適温度範囲とは、温度を変化させて測定した際に最も高活性を示した活性値を１００とし、活性値が５０以上である温度範囲である。

【0065】

安定温度範囲は温度を変化させて測定した際に最も高活性を示した活性値を１００とし、活性値が５０以上の温度範囲である。

【0066】

本実施の形態におけるＤＯＩ合成酵素の高温安定性とは、安定温度範囲の上限が４６℃、より好ましくは５０℃、さらに好ましくは６０℃、さらに好ましくは７０℃、さらに好ましくは８０℃、さらに好ましくは９０℃、特に好ましくは９５℃であることである。下限は特に限定しないが、通常の操作から安定な温度範囲の下限は例えば２０℃、好ましくは１０℃、好ましくは５℃、更に好ましくは１℃であればよい。

【0067】

本実施の形態の高温安定性を有する２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素としては、例えば、５０℃で１時間インキュベートした後の残存酵素活性が５０以上である酵素を選抜することができる。残存酵素活性とは、最も高活性を示した活性値を１００とする相対活性を示す。

【0068】

通常、工業的な酵素反応においては、酵素が高活性を有する温度範囲内に制御する必要があるため、温度の制御が非常に重要な因子である。
ＤＯＩ合成において、従来菌の活性の観点から３７℃以下に温度制御する厳密な温度管理が必要であった。高温安定性を持つＤＯＩ合成酵素を用いると、高温の範囲においても高活性を保つことが可能であるため、厳密な温度管理を行うことなく、ＤＯＩの製造が可能である。

【0069】

本実施の形態における広範囲ｐＨ安定性を持つＤＯＩ合成酵素は、安定ｐＨ範囲が好ましくはｐＨ６．０〜７．０、より好ましくはｐＨ６．０〜７．４、より好ましくはｐＨ６．０〜７．７、より好ましくはｐＨ６．０〜８．０、特により好ましくはｐＨ４．０〜９．０である特性を有する。

【0070】

ＤＯＩ合成において、従来、菌の高活性の観点からｐＨをｐＨ６．０〜７．０に制御する厳密なｐＨ管理が必要であった。広範囲ｐＨ安定性を持つＤＯＩ合成酵素を用いると、広範囲のｐＨ範囲においても高活性を保つことが可能であるため、厳密なｐＨ管理を行うことなく、ＤＯＩの製造が可能である。

【0071】

本実施の形態の酵素は作用を阻害されないかぎり、純度が高いことを要しない。そのため、精製は必須ではなく、その他の酵素等を含んでも良い。

【0072】

[ＤＯＩの生産]
本実施の形態のＤＯＩは、本実施の形態の形質転換体を培養して得られる培養物からＤＯＩを採取する発酵生産法により得ることができる。

【0073】

前記培養の栄養源としては、炭素源、窒素源、無機塩類、その他有機栄養源を含む培地を使用することができる。培養温度はその菌の生育可能な温度であれば良い。培養時間には特に制限はないが、１日から７日程度でよい。その後、得られた培養菌体又は培養上清液からＤＯＩを回収すればよい。

【0074】

培養に用いる炭素源としては、形質転換体が資化できるものであればグルコースを構成成分とする多糖類を直接用いてもよく、より好ましくは、単糖類もしくはでんぷんや米ぬかや廃糖蜜などの多糖類を含む原料に由来する単糖類が挙げられ、具体的にはＤ−グルコースなどが挙げられる。また、プロモーターの発現が誘導型である場合には、適時誘導物質を添加すればよい。

【0075】

炭素源としては、Ｄ−グルコース、ガラクトース、マルトース、サッカロース、トレハロース等の糖類や油脂類や脂肪酸類さらにはｎ−パラフィン等を用いることができる。油脂としては、例えば、ナタネ油、ヤシ油、パーム油、パーム核油などがあげられる。脂肪酸としてはヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸などの飽和・不飽和脂肪酸、あるいはこれら脂肪酸のエステルや塩など脂肪酸誘導体などがあげられる。

【0076】

有機栄養源としては、アミノ酸類、例えば、アデニン、ヒスチジン、ロイシン、ウラシル、トリプトファンなどが挙げられる。

【0077】

窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどのアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなどが挙げられる。無機塩類としては、例えば、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。

【0078】

本発明においては、コバルトイオンを含有する培地においてＤＯＩ合成酵素を発現可能な微生物を培養することによって、グルコース−６−リン酸からＤＯＩを製造することができる。

【0079】

本実施の形態におけるＤＯＩ生産法では、コバルトイオンは二価のコバルトイオンの塩として用いることが好ましい。具体的には、塩化コバルト、硫酸コバルト、酢酸コバルトなどが挙げられる。

【0080】

培養液中にコバルトイオンを添加すると、ＤＯＩ生産性は、コバルトイオンを添加しない培養に比べて向上する。コバルトイオンが過剰に培養液に添加された場合、微生物の生育阻害を引き起こすことがある。従って、培養中のコバルト濃度は該酵素が活性を有するに十分であり、かつ微生物に生育阻害を及ぼさない範囲がよい。宿主によるが、例えば大腸菌を用いた場合、培養開始直後のコバルト濃度は、好ましくは塩化コバルト６水和物換算で０．１〜２００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．１〜１００ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは０．１〜５０ｍｇ／Ｌの範囲内に維持することが好ましい。培養開始直後とは、本培養開始から菌液ＯＤが５に到達するまでの範囲を示す。菌液ＯＤとは培養液の光学密度を言い、本実施の形態においては、６００ｎｍの光に対する培養液の吸収強度を示す。

【0081】

高密度培養を適用した場合、培養液中の菌体濃度の上昇に伴い、微生物菌体中のタンパク質や核酸、脂質、ビタミン等の構成成分の原料であり、かつ、微生物の生育に必要なエネルギー源となるグルコース等の炭素源が不足する。こういった場合、炭素源を連続的に、あるいは断続的に培養液に供給する。本実施の形態では、さらに、コバルトイオンを添加し、該酵素の活性発現に必要なコバルトイオンを連続的に、あるいは断続的に適量供給することが好ましい。

【0082】

本実施の形態のＤＯＩ生産法においては、添加コバルト値を０．０００３〜７０に制御することが好ましく、より好ましくは０．００１〜１５、さらに好ましくは０．０１〜５である。添加コバルト値は、以下の式により算出した。
添加コバルト値＝[培養液中への塩化コバルト６水和物総添加量（ｍｇ）]／培養液量（Ｌ）／菌液ＯＤ
塩化コバルト６水和物以外のコバルト塩を用いた場合は、塩化コバルト６水和物換算で添加コバルト値を算出し、コバルトイオンの量が適切な値となるようにコバルト塩を添加してもよい。

【0083】

ＤＯＩを培養液から回収する方法としては，次のような方法が挙げられる。

【0084】

培養終了後、培養液から遠心分離器や濾過装置などで菌体を除き、培養上清液を得る。この培養上清液に対してさらに濾過処理を行い、菌体等の固形物を除き、その濾液にイオン交換樹脂を添加し、蒸留水で溶出を行う。ＩＣＰ発光分析、ｐＨなどを測定しながら不純物を含まないフラクションを分取して、その水溶液の溶媒を取り除くことでＤＯＩを回収することができる。
得られたＤＯＩの分析は、例えば、高速液体クロマトグラフィーや核磁気共鳴法などにより行う。

【0085】

また、前記発酵生産法以外の方法としては、グルコキナーゼなどによりグルコースから変換されるグルコース−６−リン酸を利用する方法が挙げられ、本実施の形態のＤＯＩ合成酵素あるいは形質転換体によりグルコース−６−リン酸からＤＯＩを得ることができる。

【0086】

本実施の形態のＤＯＩ合成酵素及び／又は形質転換体を用いてＤＯＩを製造する際の反応温度は、反応速度や酵素の安定性の点から、好ましくは１０〜９５℃、より好ましくは２０〜７０℃であり、さらに好ましくは３０〜６０℃である。
反応ｐＨは広範囲で調整可能であり、酵素の安定性の点から、好ましくはｐＨ２．０〜１０．０、より好ましくはｐＨ４．０〜８．０、さらに好ましくは６．０〜８．０である。

【0087】

反応時間は酵素の使用量によっても異なるが、工業的利用を考慮した際、好ましくは通常２０分〜２００時間、より好ましくは、６〜８０時間である。形質転換体をＤＯＩ合成触媒として利用する際には、事前に、凍結処理や各種破砕処理を行っても良い。
しかしながら、本実施の形態は以上の反応条件や反応形態に限定されるものではなく、適宜選択することができる。

【0088】

以下、実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。

【実施例】

【0089】

［実施例１］
（１）染色体ＤＮＡの調製
常法に従ってＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＢＲＣ１３１５７株の染色体ＤＮＡを調製した。
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＢＲＣ１３１５７株をＮＲ寒天プレート（１％ Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、１％ エルリッヒカツオエキス、１．５％ Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒ、ｐＨ７．０）で、３０℃、１日間培養してコロニーを形成させた。その１白金耳を、ＮＲ培地（１％ Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、１％ エルリッヒカツオエキス、ｐＨ７．０）３０ｍＬを１５０ｍＬ三角フラスコに分注したものに接種して、３０℃、１８０ｒｐｍで１日間培養した。この培養液を、４℃で、１２，０００ｇ、１分間遠心分離して上清を除去し、菌体を回収した。

【0090】

得られた菌体をＬｙｓｉｓバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ グルコース）に懸濁し、よく洗浄した。遠心分離して菌体を回収した後、Ｌｙｓｉｓバッファーに再懸濁し、これにリゾチームを加え３７℃で４５分間インキュベートした。次いでＳＤＳとＲＮａｓｅを添加し、３７℃で４５分間インキュベートした。その後Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを添加し、５０℃で６０分間穏やかに振盪した。ここで得られた溶液をフェノール−クロロホルム、クロロホルムで処理後、エタノール沈殿し、析出した核酸をガラスピペットに巻きつけて回収した。この核酸を７０％エタノールで洗浄後、乾燥し、ＴＥに再溶解した。この操作により、約１００μｇの染色体ＤＮＡを調製した。

【0091】

（２）ＤＯＩ合成酵素遺伝子の単離
上記（１）において調製した染色体ＤＮＡからＤＯＩ合成酵素遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマーとして、センスプライマーは配列番号１５の配列を有するオリゴＤＮＡを、アンチセンスプライマーは配列番号１６の配列を有するオリゴＤＮＡをそれぞれ合成した。
ここで得られたＰＣＲプライマーを用い、上記（１）において調製した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によるＤＯＩ合成酵素遺伝子の増幅を行い、１１０７塩基対からなるＰＣＲ産物を取得した。
ここで得られたＰＣＲ産物の遺伝子配列をＤＮＡシークエンサーで解析することで確認し、配列番号１３の塩基配列を有する既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）遺伝子を得た。本遺伝子に対応するアミノ酸配列を配列番号１４（ＢｔｒＣ）に示した。

【0092】

（３）ＤＯＩ合成酵素遺伝子の発現プラスミドベクターの構築及び形質転換
上記（２）で取得したＰＣＲ産物の平滑末端化、リン酸化を行い、ｐＵＣ１９に大腸菌由来のｇａｐＡプロモーター、ＳＤ配列、ターミネーターを連結したプラスミドにライゲーションした。このプラスミドベクターには大腸菌中で外来遺伝子として連結された遺伝子を効率的に転写できるｇａｐＡプロモーターが導入されており、グルコースを含む培地で組換え微生物を培養した場合においてもＤＯＩ合成酵素遺伝子を効率的に発現・製造させることができる。
ここで得られたプラスミドベクターを、塩化カルシウム法で調製した大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルにヒートショック法で形質転換し、組換え微生物を作製した。

【0093】

（４）新規ＤＯＩ合成酵素遺伝子の取得
上記（３）で取得したプラスミドベクターに対し、常法による変異導入を行うことで、配列番号１（ＤＯＩＳ−１）、配列番号３（ＤＯＩＳ−２）、配列番号５（ＤＯＩＳ−３）、配列番号７（ＤＯＩＳ−４）、配列番号９（ＤＯＩＳ−５）および配列番号１１（ＤＯＩＳ−６）に記載の塩基配列を有する耐熱性ＤＯＩ合成酵素遺伝子を得ることができる。ここで取得したＤＯＩ合成酵素遺伝子についても（３）と同様に形質転換体の取得を行った。また、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９および配列番号１１の塩基配列に対応するアミノ酸配列を、配列番号２（ＤＯＩＳ−１）、配列番号４（ＤＯＩＳ−２）、配列番号６（ＤＯＩＳ−３）、配列番号８（ＤＯＩＳ−４）、配列番号１０（ＤＯＩＳ−５）および配列番号１２（ＤＯＩＳ−６）に示した。

【0094】

新規ＤＯＩ合成酵素の選抜は、常法により作成した様々なＤＯＩ合成酵素を熱処理あるいは各種ｐＨ処理後に活性測定を行うなどして実施可能である。

【0095】

［実施例２］
［精製酵素の取得］
実施例１で作製したＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の形質転換体を１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢプレートで、３７℃、一日間培養して、コロニーを形成させた。
次いで１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地３０ｍＬを１５０ｍＬ容の三角フラスコに入れ、上記プレートからコロニーを白金耳で植菌し、３７℃で、３〜８時間、ＯＤ（６００ｎｍ）が０．５程度になるまで１８０ｒｐｍで回転振盪培養を行い、これを本培養の前培養液とした。

【0096】

５００ｍＬ容の三角フラスコ３６本に、２ｇ／Ｌのグルコースと１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地を１００ｍＬずつ入れ、それぞれの三角フラスコに０．５ｍLの前培養液を添加し、３７℃で、１６時間、１８０ｒｐｍで回転振盪培養を行った。
次いでこの培養液を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して上清を除去し、０．２ｍｇ／Ｌ塩化コバルト六水和物を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で数回洗浄しながら菌体を回収した。回収した菌体は、−８０℃で凍結保存した。

【0097】

この凍結保存菌体を０．２ｍｇ／Ｌ塩化コバルト六水和物を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で懸濁し、リゾチーム（Ｓｉｇｍａ社製 卵白由来）を１８０ｍｇとデオキシリボヌクレアーゼＩ（ＷａＫｏ社製 ウシ由来 組換え体溶液）を６０μＬ添加して、３７℃で、５時間、１２０ｒｐｍで振盪し、菌体破砕を行った。
菌体破砕後の溶液を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して菌体残渣を除去し、上清を回収した。

【0098】

この上清に硫酸アンモニウムを加えて３０％飽和とし、４℃でしばらく攪拌した後に、生じた沈殿を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して除去し、上清を回収した。
この上清にさらに硫酸アンモニウムを加えて４０．０％飽和とし、４℃でしばらく攪拌した後に、生じた沈殿を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して上清を除去し、沈殿を回収した。次いでこの沈殿を０．２ｍｇ／Ｌ塩化コバルト六水和物を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）に溶解させた。

【0099】

この溶解液を４℃で、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、０．２ｍｇ／Ｌ塩化コバルト六水和物を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）を加え、再度、濃縮するという脱塩操作を２〜３回繰り返した。
上記で得られた酵素溶液を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で平衡化した「ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ」（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社）に吸着させた後、０〜０．４Ｍの塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）の濃度勾配法によって酵素を溶出させた。

【0100】

上記で溶出した酵素のＤＯＩ合成酵素の活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、１０重量％の硫酸アンモニウムを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で懸濁し、１０重量％の硫酸アンモニウムを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で平衡化した「ＨｉＴｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＦＦ （ｈｉｇｈ ｓｕｂ）」（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社）に吸着させた後、１０〜０重量％の硫酸アンモニウムを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）の濃度勾配法によって酵素を溶出させた。
上記で溶出した活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で平衡化した「ＭｏｎｏＱ ５／５０ ＧＬ」（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社）に吸着させた後、０〜０．２Ｍの塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）の濃度勾配法によって酵素を溶出させた。

【0101】

上記で溶出した活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、０．２ｍｇ／Ｌ塩化コバルト六水和物と０．１ＭＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で平衡化した「ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００」（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社）に充填した後、同様の緩衝液で溶出を行った。
上記で溶出した活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて濃縮し、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）を得た。

【0102】

上記、一連の精製酵素取得実験と同様にして、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−２）、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−３）、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−４）、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−５）、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−６）および精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）を取得した。

【0103】

［実施例３］
［新規ＤＯＩ合成酵素の評価］
実施例２で得られた精製ＤＯＩ合成酵素を用いて、その作用に関する実験を行った。

【0104】

（１）至適ｐＨ範囲
各ｐＨにおける活性測定では、反応液に精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）を適量添加し、グルコース−６−リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭ、各種緩衝液が１００ｍＭとなるようにして反応液を調整した。緩衝液としては、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．０〜７．７）およびＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４〜８．０） を使用した。反応温度は３０℃とし、生成するＤＯＩを定量することで活性を測定した。最も高活性を示した活性値を１００とした相対活性を求め、この結果を図１に示す。本発明酵素における至適ｐＨ範囲は、ｐＨ７．０〜 ７．７であった。

【0105】

（２）安定ｐＨ範囲
ｐＨ５．５〜８．０の範囲の１００ｍＭの緩衝液を用いて、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）を各ｐＨで３０℃、６０分間インキュベートし、その残存酵素活性を測定した。インキュベートに用いた緩衝液としては、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ５．５〜８．０）およびＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４〜８．０）を使用した。
残存酵素活性測定は、グルコース−６−リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、反応温度３０℃で実施した。最も高活性を示した活性値を１００とした相対活性を求め、この結果を図２に示した。本酵素の安定ｐＨ範囲は、ｐＨ６．０〜 ８．０であり、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−２）および精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−３）も同様の結果を示した。これらの広範囲ｐＨ安定性は、既存酵素にはない新規特性であった。

【0106】

（３）至適温度範囲
反応温度１０〜７０℃の各反応温度条件において、グルコース−６−リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の酵素活性測定を実施した。最も高活性を示した活性値を１００とした相対活性を求め、この結果を図３に示す。至適温度範囲は５５〜７０℃であり、反応温度６５℃における比活性は１．８μｍｏｌ（ＤＯＩ）／ｍｉｎ／ｍｇ（酵素）と非常に高い値を示した。

【0107】

（４）安定温度範囲
精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）を添加して且つ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなるように調整した１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を、温度範囲２５〜６０℃の各温度で１時間インキュベートした後、それぞれの残存酵素活性を測定した。
残存酵素活性測定は、グルコース−６−リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、反応温度３０℃で実施した。最も高活性を示した活性値を１００とした相対活性を求め、この結果を図４に示した。精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の安定温度範囲は５０℃以下であり、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−２）および精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−３）も同様の結果を示した。これらの高温安定性は、既知酵素にはない新規特性であった。

【0108】

また、安定化剤として作用することが知られているＮＡＤ＋およびコバルトイオン非存在化でインキュベートした安定温度範囲試験を実施したところ、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）のインキュベート温度４６℃における相対活性は３８、インキュベート温度４２℃における相対活性は８９、インキュベート温度３７℃における相対活性は１００であった。

【0109】

（５）分子量
分離ゲル濃度が１０％の「レディーゲルＪ」（日本バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社）を用いるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、分子量を求めたところ、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の分子量は約４０，０００であり、アミノ酸配列から推定される分子量４０，６５６とほぼ一致した。

【0110】

［実施例４］
［新規ＤＯＩ合成酵素の評価］
実施例２で得られた精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−４）を用いて、その作用に関する実験を行った。

【0111】

（温度安定性の評価）
精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−４）を添加して且つ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなるように調整した１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を、２５℃および４２℃の各温度で１時間インキュベートした後、それぞれの残存酵素活性を測定した。

【0112】

残存酵素活性測定は、グルコース−６−リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、反応温度３０℃で実施した。２５℃でインキュベートした際の残存活性を１００とすると、４２℃インキュベートの活性値は７４という非常に高い値を示した。

【0113】

（比活性の測定）
また、反応温度６０℃における比活性は１．２μｍｏｌ（ＤＯＩ）／ｍｉｎ／ｍｇ（酵素）と非常に高い値を示した。
[実施例５]
［新規ＤＯＩ合成酵素の評価］
実施例２で得られた精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−５）を用いて、その作用に関する実験を行った。

【0114】

（ｐＨ安定性の評価）
ｐＨ５．５〜８．０の範囲の１００ｍＭの緩衝液を用いて、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−５）を各ｐＨで３０℃、６０分間インキュベートし、その残存酵素活性を測定した。インキュベートに用いた緩衝液としては、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ５．５〜８．０）およびＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４〜８．０） を使用した。
残存酵素活性測定は、グルコース−６−リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、反応温度３０℃で実施した。最大活性を１００とする相対活性を求め、この結果を図５に示した。図５に示すとおり、本酵素は非常に幅広いｐＨ領域で高い安定性を示した。この高い安定性は、既存酵素にはない新規特性であった。

【0115】

[実施例６]
［新規ＤＯＩ合成酵素の評価］
実施例２で得られた精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−６）を用いて、その作用に関する実験を行った。

【0116】

（ｐＨ安定性の評価）
ｐＨ５．５〜８．０の範囲の１００ｍＭの緩衝液を用いて、精製ＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−６）を各ｐＨで３０℃、６０分間インキュベートし、その残存酵素活性を測定した。インキュベートに用いた緩衝液としては、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ５．５〜８．０）を使用した。
残存酵素活性測定は、グルコース−６−リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、反応温度３０℃で実施した。最大活性を示したｐＨ８．０の残存活性を１００とすると、ｐＨ６．５〜８．０の範囲では活性値は７０以上であり、ｐＨ６．０の残存活性は５３という非常に高い値を示した。この高いｐＨ安定性は、既存酵素にはない新規特性であった。

【0117】

［実施例７］
「ＤＯＩの生産方法」
実施例１で作製したＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の形質転換体を１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢプレートで、３７℃、一日間培養して、コロニーを形成させた。
次いで１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地３０ｍＬを１５０ｍＬ容の三角フラスコに入れ、上記プレートからコロニーを白金耳で植菌し、３７℃で、３〜８時間、ＯＤ（６００ｎｍ）が０．５程度になるまで１８０ｒｐｍで回転振盪培養を行い、これを本培養の前培養液とした。

【0118】

５００ｍＬ容の三角フラスコ３６本に、２ｇ／Ｌのグルコースと１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地を１００ｍＬずつ入れ、それぞれの三角フラスコに０．５ｍLの前培養液を添加し、３７℃で、１６時間、１８０ｒｐｍで回転振盪培養を行った。
次いでこの培養液を、４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して上清を除去し、０．２ｍｇ／Ｌ塩化コバルト六水和物を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で数回洗浄しながら菌体を回収した。回収した菌体は、−８０℃で凍結保存した。

【0119】

ＤＯＩの合成には、ＤＯＩ合成触媒として、上記の凍結菌体を０．２ｍｇ／Ｌ塩化コバルト六水和物を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で懸濁した液を使用した。ＤＯＩ合成反応の反応液組成は、グルコース−６−リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が８５ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が０．１ｍＭ、塩化コバルト六水和物が１ｍＭ、菌体ＯＤが３０として、ＤＯＩの合成反応を開始した。反応開始時のｐＨは７．７に調整し、反応温度４６℃で２．５時間合成反応を行うことで、１重量%のＤＯＩが生成した。反応終了後は、塩酸を添加し、ｐＨを６以下まで低下させた。次いでこの反応溶液を４℃で、１０，０００ｇ×３０分間遠心分離して上清を回収し、フィルターろ過をして菌体残渣を除去した。

【0120】

上記で合成したＤＯＩ溶液は、アンバーライトＩＲ１２０ＢＮａ(オルガノ社製)をＨ⁺型に再生した陽イオン交換樹脂およびアンバーライトＩＲＡ９６ＳＢ(オルガノ社製)をＯＨ^-型に再生した陰イオン交換樹脂を用いて精製処理を行った。本精製処理においては、カラム処理およびバッチ処理を併用し、ＩＣＰ発光分析法によりＰ、Ｃｏ、Ｎａが未検出で且つＤＯＩ溶液を含んだ画分を回収した。

【0121】

次いで、上記で得られたＤＯＩ溶液に、溶液中のＤＯＩ１ｇに対して０．５ｇの活性炭カルボラフィン（日本エンバイロケミカルズ社製）を添加し、１時間室温で攪拌して微量不純物を活性炭に吸着させた。1時間後、ろ過操作により活性炭を除去し、ＤＯＩ溶液を回収した。本ＤＯＩ溶液を減圧濃縮することで、ＤＯＩを濃縮し、凍結乾燥によりＤＯＩの粉末を得た。

【0122】

[実施例８]
実施例１で作製したＤＯＩ合成酵素（ＤＯＩＳ−１）の形質転換体を１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢプレートで、３７℃、一日間培養して、コロニーを形成させた。
次いで１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地３０ｍＬを１５０ｍＬ容の三角フラスコに入れ、上記プレートからコロニーを白金耳で植菌し、３７℃で、３〜８時間、ＯＤが０．５程度になるまで１８０ｒｐｍで回転振盪培養を行い、これを本培養の前培養液とした。

【0123】

表１に示す異なる濃度の塩化コバルト６水和物を含んだ培地Ａ１００ｍＬを５００ｍＬ容の三角フラスコにそれぞれ入れ、さらに０．５ｍLの前培養液を添加し、３７℃で、１８時間、１８０ｒｐｍで回転振盪培養を行った。培養１８時間後の各培地条件の菌液ＯＤ、添加コバルト値およびコバルトイオン無添加培地の上清ＤＯＩ濃度を１００としたときの相対値（ＤＯＩ生産性）を表２に示した。

【0124】

【表1】

【0125】

【表2】

【0126】

比較例１
［既知ＤＯＩ合成酵素の評価］
配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）に関して、実施例３−（４）安定温度範囲と同様にして以下実験を行った。
精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）を添加して且つ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなるように調整した１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を、温度範囲２５〜６０℃の各温度で１時間インキュベートした後、それぞれの残存酵素活性を測定した。

【0127】

残存酵素活性測定は、グルコース−６−リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、反応温度３０℃で実施した。最大活性を１００とする相対活性を求め、この結果を図６に示した。精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）の安定温度範囲は４２℃以下であり、４６℃での相対活性は２３、５０℃での相対活性は０と著しく低い熱安定性を示した。

【0128】

また、安定化剤として作用することが知られているＮＡＤ＋およびコバルトイオン非存在化でインキュベートした安定温度範囲試験を実施したところ、精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）のインキュベート温度４２℃および４６℃における相対活性は０、インキュベート温度３７℃における相対活性は１４であった。本実験からも既存酵素が著しく低い熱安定性を有することが示された。

【0129】

配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）に関して、実施例３−（２）安定ｐＨ範囲と同様にして以下実験を行った。
精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）を各ｐＨで３０℃、６０分間インキュベートし、その残存酵素活性を測定した。インキュベートに用いた緩衝液としては、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ５．５〜７．０）およびＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４〜８．０） を使用した。

【0130】

残存酵素活性測定は、グルコース−６−リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、反応温度３０℃で実施した。最大活性を１００とする相対活性を求め、この結果を図５に示した。図７に示すとおり、ｐH６における相対活性は２７と非常に低い値であり、ｐH５．５ではほぼ完全に失活していた。

【0131】

［比較例２］
［既知ＤＯＩ合成酵素の評価］
配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）に関して、実施例３と同様にして以下実験を行った。
精製既知ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）を添加して且つ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなるように調整した１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を、２５℃および４２℃の各温度で１時間インキュベートした後、それぞれの残存酵素活性を測定した。

【0132】

残存酵素活性測定は、グルコース−６−リン酸二ナトリウム塩（オリエンタル酵母製）が２０ｍＭ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母製）が５ｍＭ、塩化コバルト六水和物が５ｍＭとなる１００ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、反応温度３０℃で実施した。２５℃でインキュベートした際の残存活性を１００として、４２℃インキュベートの活性値は０となり、著しく低い熱安定性を示した。

【産業上の利用可能性】

【0133】

本発明により、産業上有用とされる芳香族化合物（カテコール等）の前駆体として利用価値の高いＤＯＩを効率的な製造プロセスで生産することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]