特許 5654468 細胞培養、ウイルスの増殖および精製のための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5654468

(24)【登録日】2014年11月28日

(45)【発行日】2015年1月14日

(54)【発明の名称】細胞培養、ウイルスの増殖および精製のための方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/00 20060101AFI20141218BHJP

   C12N 7/02 20060101ALI20141218BHJP

【ＦＩ】

   C12N7/00

   C12N7/02

【請求項の数】22

【全頁数】147

(21)【出願番号】特願2011-529207(P2011-529207)

(86)(22)【出願日】2009年9月24日

(65)【公表番号】特表2012-503486(P2012-503486A)

(43)【公表日】2012年2月9日

(86)【国際出願番号】US2009058157

(87)【国際公開番号】WO2010036760

(87)【国際公開日】20100401

【審査請求日】2012年8月27日

(31)【優先権主張番号】61/187,721

(32)【優先日】2009年6月17日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/099,749

(32)【優先日】2008年9月24日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/104,933

(32)【優先日】2008年10月13日

(33)【優先権主張国】US

【微生物の受託番号】ATCC  PTA-7909

【微生物の受託番号】ATCC  PTA-7910

(73)【特許権者】

【識別番号】504333972

【氏名又は名称】メディミューン，エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100091096

【弁理士】

【氏名又は名称】平木 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100118773

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 節

(74)【代理人】

【識別番号】100122389

【弁理士】

【氏名又は名称】新井 栄一

(74)【代理人】

【識別番号】100111741

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 夏夫

(72)【発明者】

【氏名】リウ，ジョナサン

(72)【発明者】

【氏名】トンプソン，マーク

(72)【発明者】

【氏名】マランガ，ルイス，ジェー．

(72)【発明者】

【氏名】カタニアグ，フローロ

(72)【発明者】

【氏名】スウ，サイモン，エス．

【審査官】 上條 肇

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００８／１０５９３１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００８−５２５０２５（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ７／００ − ７／０２

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞培養でインフルエンザウイルスを生産する方法であって、以下の工程、
（ａ）接着性ＭＤＣＫ細胞を微小担体上でMediV SFM 109またはMediV SFM 110の無血清培養培地で増殖させること；
（ｂ）培養培地を交換することなく、増殖されたＭＤＣＫ細胞にインフルエンザウイルスを感染させること；
（ｃ）感染した増殖ＭＤＣＫ細胞をインフルエンザウイルスの複製を可能とする条件下でインキュベートすること
を含み、
ここでMediV SFM 109およびMediV SFM 110は以下のように配合されるものであり、

ここでグルコースは少なくとも4.5 g/Lの終濃度で存在し、最大終濃度9.0 g/Lまで補給されてもよい、上記方法。

【請求項2】

微小担体の濃度が１〜３ｇ／Ｌの間である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ＭＤＣＫ細胞を微小担体に１０〜４０細胞／微小担体の間の密度で播種する、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

ＭＤＣＫ細胞を２〜５日の間増殖させる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

ＭＤＣＫ細胞がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７９０９またはＰＴＡ−７９１０として寄託された細胞系に由来する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

ＭＤＣＫ細胞を５×１０^５〜３×１０^６細胞／ｍＬの間の細胞密度まで増殖させる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

工程（ｂ）が０．０１×１０^３ＦＦＵ／ｍＬ〜０．０５ＦＦＵ／ｍＬの間のウイルス投入量を用いて行われる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

工程（ｂ）が０．００００１ＦＦＵ／細胞〜０．００００５ＦＦＵ／細胞の間のウイルス投入量を用いて行われる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

インフルエンザウイルスがインフルエンザ株ｃａ Ａ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０またはインフルエンザ株ｃａ Ｂ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／６６の１以上の遺伝子セグメントを含んでなる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

ＭＤＣＫ細胞を工程（ａ）において３３℃〜４２℃の間の温度でインキュベートする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

工程（ｃ）におけるインフルエンザウイルスの複製中、ＭＤＣＫ細胞を３３±２℃でインキュベートする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

ＭＤＣＫ細胞を１００〜２００ｒｐｍの間の攪拌速度でインキュベートする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

ＭＤＣＫ細胞を１５０ｒｐｍ〜２００ｒｐｍの間の攪拌速度でインキュベートする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

ＭＤＣＫ細胞を６．０〜７．８の間のｐＨでインキュベートする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

ＭＤＣＫ細胞を７．０〜７．８の間のｐＨでインキュベートする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

ＭＤＣＫ細胞を３５％〜１００％の間の溶存酸素（ＤＯ）レベルでインキュベートする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

工程（ｂ）における感染の前、感染時、または感染後にプロテアーゼを添加することをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

感染後４８時間〜７２時間の間に培養培地を回収する工程をさらに含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

接着性ＭＤＣＫ細胞をMediV SFM 109無血清培地で増殖させる、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

接着性ＭＤＣＫ細胞をMediV SFM 110無血清培地で増殖させる、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

無血清培地を含む細胞培養組成物、ここで該無血清培地は以下のとおり配合されるMediV SFM 109である

ここでグルコースは少なくとも4.5 g/Lの終濃度で存在し、最大終濃度9.0 g/Lまで補給されてもよい、上記組成物。

【請求項22】

無血清培地を含む細胞培養組成物、ここで該無血清培地は以下のとおり配合されるMediV SFM 110

ここでグルコースは少なくとも4.5 g/Lの終濃度で存在し、最大終濃度9.0 g/Lまで補給されてもよい、上記組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規な細胞培養培地および細胞、特に、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞を培養する方法に関する。本発明はさらに、細胞培養においてウイルス（例えば、インフルエンザ、ＲＳＶ）を生産する方法に関する。本発明はまた、ワクチンの開発のためにバイオリアクターで増殖される接着細胞から細胞随伴性ウイルスを精製する方法も提供する。

【背景技術】

【0002】

予防接種はウイルス感染により引き起こされる疾患を予防するために最も重要な公衆衛生手段である。ワクチンの有効な使用は、安定かつ培養の容易な供給源から大量のワクチン材料（例えば、ウイルス）を速やかに得ることができるかどうかにかかっている。ワクチンを迅速に開発し、それらを大量に利用できることは、多くのヒトおよび動物疾病に対抗する上で極めて重要である。ワクチン生産の遅れやそれらの量の不足は疾病の大発生に取り組む際に問題となる。例えば、最近の研究では、パンデミックインフルエンザに対するワクチンを生産するのに必要な長いリードタイムに関する懸念の理由があることを示唆している。例えばWood, J. M., 2001, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 356:1953参照。よって、ウイルスを生産するための最近の試みでは、細胞培養におけるワクチン用のウイルスの増殖に焦点が当てられている。

【0003】

３．１ インフルエンザウイルス
特に、メイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞が多くのグループにもって用いられている。例えば、米国特許第６，４５５，２９８号；米国特許出願第２００５／０１１８１４０号；米国特許出願第２００５／０１１８６９８号；米国特許第６，８２５，３０６号；ＷＯ２００５／１１３７５８；およびRadaeva, I. F., et al. Vopr. Virusol. (2005) 50: 43-6参照。しかしながら、既存のＭＤＣＫ細胞系統の多くは、腫瘍形成性、細胞培養に動物血清を必要とすること、およびワクチンにおける使用に好適なインフルエンザウイルスの収量が少ないことを含む、１以上の欠点がある。さらに、これらの細胞系統からワクチン材料を生産するために開発されている細胞培養プロセスの多くは、培地交換の工程や多量の接種用ウイルスの使用を含む多くの操作を必要とする場合が多い。さらに、違うインフルエンザ株が絶えず出現（または再出現）するために、シーズンごとに流行しているインフルエンザ株に基づいて新たなインフルエンザワクチンが作製される。残念なことに、インフルエンザワクチン株によっては高収量まで増殖させることが困難なものがある。細胞培養により得られる材料の各バッチの収量は生産能を規定するだけでなく、製品の製造コストにも影響するので、ウイルス収量（（すなわち、ピークウイルス力価）を向上させることが望ましい。

【0004】

最近、極めて高い力価までワクチン株を増殖させることができる新規な無血清培地および非腫瘍形成性細胞系統、ならびにディスポーザブルのバイオリアクターでウイルス材料を生産するプロセスが開発された（米国特許出願第２００６／０１８８９７７号；および２００７年９月１４日出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１１／８５５，７６９）。本発明はこの研究を拡張し、新規な細胞培養培地、ＭＤＣＫ細胞、特に、非腫瘍形成性細胞系統から、培地交換の必要なく、バイオリアクターで大量のワクチン材料を生産するための再現性の高い、効率的でスケーラブルなプロセス、および純度の高い生弱毒ウイルスを生産するためのロバストな下流精製プロセスを提供する。本発明により提供される方法は最小限の操作を必要とするだけのロバストなものであり、コスト効率が良い。

【0005】

３．２ 呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、乳児および小児における重篤な下気道感染（ＬＲＴＩ）の主因であり、相当な罹患率と死亡率の原因となっている。７大市場（米国、日本、フランス、ドイツ、イタリア、スペイン、ＵＫ）で、成人３００万人と未熟児ほぼ４００，０００人を含む年間合計１８００万人が感染している。米国だけでも年間７０，０００〜１２５，０００件の入院がＲＳＶ ＬＲＴＩに属すと推測される。ヒト集団では、抗原の異なる２つのＲＳＶサブグループＡとＢが存在する。ＲＳＶはまた、免疫不全成人および高齢者において重要な感染病原体として認識されている。自然感染により誘導されるＲＳＶ再感染に対する耐性が不完全なため、ＲＳＶは小児期そして生涯にわたって何回も感染する場合がある。ＲＳＶ免疫予防の目標は、ＲＳＶ感染に関連し得る重篤な疾病を回避するのに十分な耐性を誘導することである。ＲＳＶワクチンを開発するための現行の戦略は主として、精製ウイルス抗原の投与または鼻腔投与用の弱毒した生ＲＳＶの開発を行ったり来たりしている。しかしながら、これまでに認可されたワクチンすなわちＲＳＶ用のワクチンは無い。

【0006】

ウイルスゲノムＲＮＡは裸のＲＮＡとしては感染力は無い。ＲＳＶのＲＮＡゲノムは主要なヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質でしっかり封入され、リンタンパク質（Ｐ）およびラージ（Ｌ）ポリメラーゼサブユニットと会合している。これらのタンパク質は核タンパク質コアを形成しており、感染性の最小単位と認識されている(Brown et al., 1967, J. Virol. 1: 368-373)。

【0007】

何十年という研究にもかかわらず、ＲＳＶ感染に関連する重大な罹患率および死亡率の予防のために開発された商業的に入手可能で、安全かつ有効なＲＳＶワクチンは無い。ホルマリンで不活性化したウイルスワクチンはＲＳＶ感染からの保護を提供することができず、実際には、乳児において野生型ウイルスによるその後の感染の際に症状の増悪をもたらした(Kapikian et al., 1969, Am. J. Epidemiol. 89:405-21; Chin et al., 1969, Am. J. Epidemiol. 89:449-63)。以来、組換え法、化学的突然変異誘発および温度感受性突然変異体を得るための野生型ＲＳＶの低温継代培養により得られた生きた弱毒突然変異体の開発に努力が向けられてきた(Gharpure et al., 1969, J. Virol. 3: 414-21; Crowe et al., 1994, Vaccine 12: 691-9)。しかしながら、ＲＳＶ感染の効果的な予防的処置のための規制指針を満たす、それらの細胞随伴性タンパク質からの生弱毒ウイルスの精製は捕らえどころが無かった。

【0008】

インフルエンザウイルスと同様、ＲＳＶは、ウイルスが宿主細胞と緊密に随伴していて、感染性の最小単位を維持しつつ細胞随伴性タンパク質からのウイルスを精製することを困難にする安定な細胞系統で増殖される。この複雑性に加え、ＲＳＶは脆弱（例えば、剪断感受性）である。ウイルスが主として宿主細胞に随伴し、脆弱であるというこれらの要因は、宿主細胞抽出物（例えば、ＤＮＡおよびタンパク質）からウイルスを精製すること、ならびに生弱毒ウイルスを含んでなる臨床上許容される免疫原性組成物を得ることを困難にしてきた。なぜＲＳＶのワクチンが市販されていないかは、１つにはこうした理由である。よって、免疫原性組成物の作製および処方のためにＲＳＶおよび他の細胞随伴性ウイルスを精製するために使用可能な精製プロセスの必要がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】米国特許第６，４５５，２９８号

【特許文献2】米国特許出願第２００５／０１１８１４０号

【特許文献3】米国特許出願第２００５／０１１８６９８号

【特許文献4】米国特許第６，８２５，３０６号

【特許文献5】ＷＯ２００５／１１３７５８

【特許文献6】米国特許出願第２００６／０１８８９７７号

【特許文献7】Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１１／８５５，７６９（２００７年９月１４日出願）

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Wood, J. M., 2001, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 356:1953

【非特許文献2】Radaeva, I. F., et al. Vopr. Virusol. (2005) 50: 43-6

【非特許文献3】Brown et al., 1967, J. Virol. 1: 368-373

【非特許文献4】Kapikian et al., 1969, Am. J. Epidemiol. 89:405-21

【非特許文献5】Chin et al., 1969, Am. J. Epidemiol. 89:449-63

【非特許文献6】Gharpure et al., 1969, J. Virol. 3: 414-21

【非特許文献7】Crowe et al., 1994, Vaccine 12: 691-9

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明は、１回使用バイオリアクターおよび標準的な再利用バイオリアクター（例えば、ステンレス鋼およびガラス容器バイオリアクター）を含むバイオリアクターにおいて大量のワクチン材料を生産するための無血清細胞培養培地および再現性の高い、効率的でスケーラブルなプロセスを提供する。

【0012】

一態様において、本発明は、高い細胞密度までＭＤＣＫ細胞（例えば、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞）の増殖を助け、高いウイルス力価を得るための培地交換工程の必要を無くす富化無血清細胞培養培地を提供する。

【0013】

特に、本発明は、感染前に培地交換工程無く、ＭＤＣＫ細胞において高力価まで、例えば、少なくとも約７．４または少なくとも約７．６または少なくとも約７．８または少なくとも約８．０または少なくとも約９．０または少なくとも約１０．０のｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０／ｍＬおよび／またはｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬまでインフルエンザウイルス（例えば、低温適応および／または温度感受性および／または弱毒型）を複製する方法を提供する。

【0014】

別の態様において、本発明は、ビーズ間移動法を含む、微小担体上で非腫瘍形成性細胞を増殖させる改良法を提供する。別の態様において、本発明の富化無血清細胞培養培地は、最初の接種に用いた非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞の非腫瘍形成的特徴を維持する。他の態様において、本発明の富化無血清細胞培養培地は、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞系統を確立および維持するために用いられる。

【0015】

別の態様において、本発明は、少なくとも３０％の総ウイルス回収率が得られる、細胞培養（例えば、ＭＤＣＫ Ｖｅｒｏ細胞培養）で増殖された接着細胞から生細胞随伴性ウイルス（例えば、インフルエンザ、ＲＳＶ）を精製する方法を提供し、ここで、精製されたウイルスは、ウイルス７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ当たり、０．１ｎｇ未満のＨＣＤ、０．３μｇ未満のＨＣＰおよび０．００５０ｎｇ未満の非特異的ヌクレアーゼを含んでなる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】４×２Ｌバイオリアクターにおける培養０日目〜４日目の生細胞密度（ＶＣＤ）および細胞生存率（Ｖ％）をプロットしたものである。これらのバイオリアクターは、表７に詳細に示されたシードリアクター（ＳＲ）法の条件を用いて培養した。ＳＲ４の２ｄｐｓのデータは利用できない。

【図2】Ｂ２Ｂトリプシン処理中、実験１、３および４の３×２Ｌシードリアクター（ＳＲ）に関して、０〜４０分の間の中間サンプリング時間に撮影した写真（１０倍で撮影）を示す。トリプシン処理はビーズ間移動プロトコールによりバイオリアクター内で行った。

【図3】１２×２Ｌ最終生産リアクター（ＦＰＲ）における生細胞密度（ＶＣＤ）および細胞生存率（Ｖ％）をプロットしたものである。実験３のバイオリアクター（ＦＰＲ３．Ｘ．Ｘ）は５ｄｐｓ（〜１２０ｈｐｓ）において感染させ、他の実験のバイオリアクターは４ｄｐｓおいて感染させた。実施例４の感染後ＶＣＤと細胞生存率のデータは利用できない。

【図4】全ての実験に関して１２×２Ｌ最終生産リアクターで４ｄｐｓにおいて撮影した写真（１００倍で撮影）を示す。

【図5】全ての実験に関して９×２Ｌ最終生産リアクター（ＦＰＲ）で３ｄｐｉにおいて撮影した写真（１００倍で撮影）を示す。

【図6】全ての実験に関してまず４×２Ｌシードリアクターで増殖させ、次に１２×２Ｌ最終生産リアクター（ＦＰＲ）で培養し、その後、感染させた細胞について、ｃａ Ａ／ウルグアイ（Ａ／Ｕ）、ｃａ Ａ／サウスダコタ（Ａ／Ｓ）およびｃａ Ｂ／フロリダ（Ｂ／Ｆ）ウイルス力価を経時的にプロットしたものを示す。注：各データ点は３回繰り返したアッセイの平均を表す。検出限界（＜６．４ｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬまたは希釈された場合は＜２．４ｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬ）を下回るウイルス力価は記録されていない。

【図7A】６７％培地交換プロセス（６７％ＭＸ）と非培地交換プロセス（０％ＭＸ）を用いて生産した株の経時的ウイルス生産プロフィールを示す。ｃａ Ａ／ウィスコンシン／６７／０５株およびｃａ Ａ／ウルグアイ株のプロットを８Ａの、それぞれ左および右のパネルに示し、ｃａ Ａ／サウスダコタ株およびｃａ Ｂ／フロリダ株のプロットを８Ｂの、それぞれ左および右のパネルに示す。

【図7B】６７％培地交換プロセス（６７％ＭＸ）と非培地交換プロセス（０％ＭＸ）を用いて生産した株の経時的ウイルス生産プロフィールを示す。ｃａ Ａ／ウィスコンシン／６７／０５株およびｃａ Ａ／ウルグアイ株のプロットを８Ａの、それぞれ左および右のパネルに示し、ｃａ Ａ／サウスダコタ株およびｃａ Ｂ／フロリダ株のプロットを８Ｂの、それぞれ左および右のパネルに示す。

【図8A】ビーズ間移動プロセスのフローチャートを表す。パネルＡに示されたプロセスは、キレート剤（ＥＤＴＡ）および３０分以内に細胞の解離を果たすわずか０．０５倍の終濃度のプロテアーゼ（ＴｒｙｐＬＥ（商標））を含んでなる緩衝塩溶液（ＤＰＢＳ）をそれぞれ利用する２回の洗浄工程を用いる。パネルＢに示されたプロセスは、緩衝塩溶液（ＤＰＢＳ）を用いる２〜３回の洗浄工程の後に、プロテアーゼの不在下で６０分以内に細胞の解離を果たす〜０．５ｍＭの終濃度のキレート剤（ＥＤＴＡ）を伴うインキュベーションを用いる。

【図8B】ビーズ間移動プロセスのフローチャートを表す。パネルＡに示されたプロセスは、キレート剤（ＥＤＴＡ）および３０分以内に細胞の解離を果たすわずか０．０５倍の終濃度のプロテアーゼ（ＴｒｙｐＬＥ（商標））を含んでなる緩衝塩溶液（ＤＰＢＳ）をそれぞれ利用する２回の洗浄工程を用いる。パネルＢに示されたプロセスは、緩衝塩溶液（ＤＰＢＳ）を用いる２〜３回の洗浄工程の後に、プロテアーゼの不在下で６０分以内に細胞の解離を果たす〜０．５ｍＭの終濃度のキレート剤（ＥＤＴＡ）を伴うインキュベーションを用いる。

【図9A】ダイレクト・フロー・フィルトレーション（ＤＦＦ１）フィルターリグ（パネルＡ、上）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｎｉｆｌｕｘスキッド・チュービングリグ（パネルＡ、下）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＡＫＴＡプロセス・スキッド・チュービングリグ（パネルＢ、上）およびダイレクト・フロー・フィルトレーション２（ＤＩＦＦ２）フィルターリグ（パネルＢ、下）に用いるフィルターおよびチュービングリグの図を示す。

【図9B】ダイレクト・フロー・フィルトレーション（ＤＦＦ１）フィルターリグ（パネルＡ、上）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｎｉｆｌｕｘスキッド・チュービングリグ（パネルＡ、下）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＡＫＴＡプロセス・スキッド・チュービングリグ（パネルＢ、上）およびダイレクト・フロー・フィルトレーション２（ＤＩＦＦ２）フィルターリグ（パネルＢ、下）に用いるフィルターおよびチュービングリグの図を示す。

【図10A】パネルＡに最初の精製プロセス１ａのスキームを、改良型の精製プロセス１ｂと並行して示す。付加的改変をパネルＢに示すスキームに詳細に示す。

【図10B】パネルＡに最初の精製プロセス１ａのスキームを、改良型の精製プロセス１ｂと並行して示す。付加的改変をパネルＢに示すスキームに詳細に示す。

【図11】ＴＦＦ１実施番号８のフラックストレース曲線を示す。

【図12】ＢＰＧ １００およびＢＰＧ ２００ ＣＳカラム圧流特性を示す。

【図13】実施番号９のＣＳカラム溶出クロマトグラムを示す。

【図14】実施番号８ ＴＦＦ２ ８ＸＤＦプロセスのフラックストレース曲線を示す。

【図15】プロテアーゼの不在下で順次分割および増殖させた細胞（菱形および四角）、ＥＤＴＡ／プロテアーゼ混合物を用いて順次分割および増殖させた細胞（三角）、および標準的なプロテアーゼ法を用いて独立に分割および増殖させた細胞（丸）の、培養約４３２時間にわたる１ｍＬ当たりの生細胞（黒い記号／実線）および生存率％（白い記号／破線）をプロットしたものを示す。

【図16】プロテアーゼの不在下で順次分割および増殖させた細胞（菱形および四角）、ＥＤＴＡ／プロテアーゼ混合物を用いて順次分割および増殖させた細胞（三角）および標準的なプロテアーゼ法を用いて独立に分割および増殖させた細胞（白い四角）の各継代培養から得られたＡ／ウィスコンシン／６７／０７（上）、ｃａ Ｂ／マレーシア／２５０６／０４（下）の力価をプロットしたものを示す。これらのプロットは、プロテアーゼ無しおよびＥＤＴＡ／プロテアーゼプロセスにより分割および増殖された細胞を用いて少なくとも８．０ｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬの力価が得られることを示す。

【図17A】３種類の生産シミュレーション実験（パネルＡおよびパネルＢ、上）の１ｍＬ当たりの生細胞（黒い記号／実線）および生存率％（白い記号／破線）をプロットしたものを示す。各プロットにはシードリアクター、ＡＴＦを用いたシミュレーション生産リアクター実験およびＡＴＦを用いない対照生産実験が含まれる。また、パネルＢ（下）には、２種類の生産シミュレーション生産実験の際に得られたｃａ Ｂ／マレーシア／２５０６／０４の力価をプロットしたものが示され、これは、ＡＴＦを用いて行った実験の力価とＡＴＦを用いずに行った実験の力価が匹敵するものであることを示す。

【図17B】３種類の生産シミュレーション実験（パネルＡおよびパネルＢ、上）の１ｍＬ当たりの生細胞（黒い記号／実線）および生存率％（白い記号／破線）をプロットしたものを示す。各プロットにはシードリアクター、ＡＴＦを用いたシミュレーション生産リアクター実験およびＡＴＦを用いない対照生産実験が含まれる。また、パネルＢ（下）には、２種類の生産シミュレーション生産実験の際に得られたｃａ Ｂ／マレーシア／２５０６／０４の力価をプロットしたものが示され、これは、ＡＴＦを用いて行った実験の力価とＡＴＦを用いずに行った実験の力価が匹敵するものであることを示す。

【図18】ＡＴＦプロセスを用いたバイオリアクターから取り出した流体の写真を示し、それには微小担体が含まれていないことを示す。左のパネルは、微小担体滅菌の際にＡＴＦを用いて取り出した微小担体洗液を示し、右のパネルは、ＭＤＣＫ細胞培養の６６％培地交換工程の際にＡＴＦを用いて取り出した培地を示す。

【図19】１Ｍ ＮａＣｌ溶出を用いた試験樹脂Ａ〜Ｄカラム実験の溶出クロマトグラムを示す（それぞれパネルＡ〜Ｄ）。これらのクロマトグラムは、試験樹脂ＡおよびＢがより小さな、早いピークを有する分離した複数の溶出ピーク（パネルＢの矢印を参照）を示すものと思われ、一方、試験樹脂ＣおよびＤは、ピークの肩および不均質な特徴を有する単一のピークを示した（パネルＤの矢印を参照）。

【図20】２Ｍ ＮａＣｌ溶出を用いた試験樹脂ＣおよびＤカラム実験の溶出クロマトグラムを示し（それぞれパネルＡおよびＢ）、２Ｍ ＮａＣｌ溶出を用いると溶出ピークが鋭くなることを示している。

【図21】ｃａ Ａ／ウィスコンシン、ｃａ Ａ／ソロモン諸島およびｃａ Ｂ／マレーシアの試験樹脂Ｃカラム実験の溶出クロマトグラムを示し（それぞれパネルＡ、ＢおよびＣ）、ピークプロフィールが類似し、一貫していることを示している。

【図22】カラム実験の溶出クロマトグラムを示す。パネルＡおよびＢは、試験樹脂Ｄカラムに対する、それぞれｃａ Ａ／ウィスコンシンおよびｃａ Ｂ／マレーシアの溶出を示し、 ピークプロフィールが類似し、一貫していることを示している。パネルＣは、ＸＫ−５０カラムスケールで試験樹脂Ｄの溶出ピーククロマトグラムを示す。

【図23】Ａ）非処理細胞、ならびにＢ）０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、Ｃ）１ｍＭ ＥＤＴＡ、Ｄ）２ｍＭ ＥＤＴＡ、Ｅ）５ｍＭ ＥＤＴＡ、およびＦ）１０ｍＭ ＥＤＴＡで６０分処理した細胞からの細胞培養の画像を示す。

【図24】２ｍＭ ＥＤＴＡで前処理した後、０．０１２５倍ＴｒｙｐＬＥ（パネルＡおよびＤ）、０．０２５倍ＴｒｙｐＬＥ（パネルＢおよびＥ） ならびに０．０５倍ＴｒｙｐＬＥ（パネルＣおよびＦ）で処理した細胞からの細胞培養の画像を示す。写真はＴｒｙｐＬＥ添加後０分（パネルＡ、ＢおよびＣ）とＴｒｙｐＬＥ添加後６０分（パネルＤ、ＥおよびＦ）に再び撮影した。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本発明は、接着細胞（例えば、ＭＤＣＫ細胞、特に、非腫瘍形成性細胞系統またはＶｅｒｏ細胞）からバイオリアクターにおいて、予防的、診断的、免疫療法的または治療的使用のための大量のウイルス（例えば、インフルエンザウイルスまたはＲＳＶ）またはウイルス抗原を生産する、再現性が高く、効率的でスケーラブルなプロセスを提供する。特に本発明は、培地交換を必要とせず、低温適応および／または温度感受性および／または弱毒型インフルエンザまたは呼吸器合胞体ウイルスを高力価まで生産するロバストな方法を提供する。

【0018】

さらに本発明は、培地交換の必要なく高力価まで、ＭＤＣＫ細胞（例えば、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞）の培養を助け、また、限定されるものではないが、インフルエンザウイルス（例えば、低温適応および／または温度感受性および／または弱毒型インフルエンザウイルス）を含むウイルスの複製を助ける培養培地を提供する。

【0019】

さらに本発明はまた、ＭＤＣＫ細胞（例えば、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞）からワクチン材料（例えば、インフルエンザウイルス）を製造する方法およびＭＤＣＫ細胞において生産されたワクチン材料を用いてインフルエンザ感染を予防する方法も提供する。細胞随伴性ウイルス（例えば、インフルエンザおよびＲＳＶ）は、本明細書に記載されているプロセスにより精製され、かつ／または本明細書に記載されている免疫原性組成物に含まれ得る。本明細書において「細胞随伴性ウイルス」とは、当業者に知られた任意の技術によって決定した場合に、およそ６０％以上のウイルス力価がウイルスに感染した接着細胞に随伴して見られるウイルスを表す。本発明の方法は低温適応／温度感受性／弱毒型（ｃａ／ｔｓ／ａｔｔ）インフルエンザ株（例えば、ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）におけるもの）およびＲＳＶ（例えば、ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨ）の生産に特に有用である。

【0020】

非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞および／またはＶｅｒｏ細胞で増殖可能なウイルスとしては、限定されるものではないが、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、限定されるものではないが、インフルエンザ、ＲＳＶ、パラインフルエンザウイルス１、２および３、ならびにヒト メタニューモウイルス、ならびにＤＮＡウイルス、レトロウイルス、プラス鎖ＲＮＡウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、二本鎖ＲＮＡウイルス（限定されるものではないが、パポーバウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ワクシニアウイルス、コクサッキーウイルス、レオウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス、灰白脊髄炎(poliomyeltitis)ウイルス、麻疹ウイルス、狂犬病ウイルスおよびヘルペスウイルスを含む）を含む他のウイルスが挙げられる。

【0021】

６．１ 定義
本明細書において腫瘍形成性は、当業者がこの用語に帰属させている通常の意味を有する。腫瘍形成性は、一実施形態において、成体ヌードマウスモデルにより決定される（例えば、Stiles et al., 1976, Cancer Res, 36:1353および下記の実施例５）。腫瘍形成性はまた、例えば、ニワトリ胚への注射および／または漿尿膜への局所適用による、他のアッセイによっても試験することができる(Leighton et al., 1970, Cancer, 26:1024)。

【0022】

「組換え」とは、材料（例えば、核酸またはタンパク質）がヒトの介入によって人工的または合成的に（非天然的に）変更されていることを示す。これらの変更は、その天然の環境または状態内の材料またはそこから取り出された材料に対して行うことができる。特に、ウイルス、例えば、インフルエンザウイルスに関して、ウイルスは組換え核酸の発現により生産される場合にはそのウイルスは組換え型である。組換えウイルスはさらに、ゲノムに導入された１以上の突然変異を組み込んでいてもよい。組換えウイルスはまた、１を超える親ウイルス株に由来する成分を含んでなる場合には合併結合ウイルスであり得る。

【0023】

「合併結合」とは、ウイルスに関して、そのウイルスが１を超える親ウイルス株または供給源に由来する遺伝子成分および／またはポリペプチド成分を含むことを示す。例えば、７：１合併結合は、第一の親ウイルスに由来する７つのウイルスゲノムセグメント（または遺伝子セグメント）と、第二の親ウイルスに由来する、例えば血球凝集素またはノイラミダーゼをコードする１つの相補的ウイルスゲノムセグメントを含む。６：２合併結合は、第一の親ウイルスに由来する６つのゲノムセグメント、最も一般的には６つの内部遺伝子と、異なる親ウイルスに由来する２つの相補的セグメント、例えば、血球凝集素とノイラミダーゼを含む。

【0024】

本明細書において「約」とは、特に断りのない限り、１０％を超えるまたは下回らない値を表し、その値はこの用語により修飾されない。例えば、「約５μｇ／ｋｇ」とは、４．５μｇ／ｋｇ〜５．５μｇ／ｋｇの範囲を意味する。別の例としては、「約１時間」とは、５４分〜６６分の範囲を意味する。

【0025】

「温度感受性」、「低温適応型」および「弱毒型」とは、当技術分野で周知である。例えば、「温度感受性」（「ｔｓ」）とは、インフルエンザＡ株では、ウイルスが、低温、例えば、３３℃に比べて高温、例えば、３９℃で１００倍以上の力価の低下を示し、インフルエンザＢ株では、ウイルスが、低温、例えば、３３℃に比べて高温、例えば、３７℃で１００倍以上の力価の低下を示すことを示す。例えば、「低温適応型」（「ｃａ」）とは、ウイルスが、低温、例えば、２５℃で、高温、例えば、３３℃でのその増殖の１００倍以内で高い増殖率を示すことを示す。例えば、「弱毒型」（「ａｔｔ」）とは、ウイルスがフェレットの上気道で複製するが、肺組織では検出できず、その動物においてインフルエンザ様の病状を引き起こさないことを示す。中間の表現型を有するウイルス、すなわち、３９℃（ウイルスＡ株の場合）または３７℃（ウイルスＢ株の場合）で１００倍未満の力価減少を示す、３３℃でのその増殖よりも１００倍高い（例えば、２００倍、５００倍、１０００倍以内、１０，０００倍未満の）２５℃での増殖を示す、および／またはフェレットの上気道における増殖よりも低い肺での増殖（すなわち、部分的弱毒）および／または動物においてインフルエンザ様病状の軽減を示すウイルスもまた本発明により意図される有用なウイルスであると理解される。増殖は、力価、プラークサイズまたは形態学、粒子密度または当業者に知られている他の指標により示されるようなウイルス量を示す。

【0026】

６．２ 細胞
本明細書に記載されている細胞随伴性ウイルスは、ウイルスをそのウイルスの使用を可能とする力価まで増殖させる任意の接着細胞で増殖させることができる。一実施形態では、接着細胞は、細胞随伴性ウイルスを対応する野生型ウイルスに関して求められたものに匹敵する力価まで増殖させる。特定の実施形態では、本明細書に記載されている細胞随伴性ウイルスは、そのウイルスによる感染に感受性のある細胞内で増殖される。

【0027】

一実施形態において、本明細書に記載されている細胞随伴性ウイルスは哺乳類細胞において増殖される。本明細書に記載されている細胞随伴性ウイルスが増殖可能な代表的な哺乳類細胞としては、限定されるものではないが、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｈｅｐ−２細胞、ＭＢＣＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＨｅＬａ細胞およびＬＬＣ−ＭＫ２細胞が挙げられる。特定の実施形態では、呼吸器合胞体ウイルスを含め本明細書に記載されている細胞随伴性ウイルスはＶｅｒｏ細胞で増殖される。別の特定の実施形態では、インフルエンザウイルスを含む細胞随伴性ウイルスはＭＤＣＫ細胞で増殖される。

【0028】

６．２．１ ＭＤＣＫ細胞
ＭＤＣＫ細胞は、限定されるものではないが、種々のウイルス（限定されるものではないが、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルスおよびフラボウイルスを含む）を含む多くのウイルスの単離および複製を助けることが知られている。特に、ＭＤＣＫ細胞はインフルエンザウイルスの生産のために広く用いられている。しかしながら、上記のように、ＭＤＣＫ細胞系統のいくつかは腫瘍形成性である。腫瘍形成性が規制上の問題であれば、本発明は非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞を増殖させ、それをインフルエンザウイルスの生産に用いる方法を提供する。よって、一実施形態では、本発明の方法は非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞を用いる。別の実施形態では、本発明の方法は腫瘍形成性にかかわらずＭＤＣＫ細胞を用いる。

【0029】

本発明の方法において使用可能な非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞系統としては、限定されるものではないが、２００５年１月５日アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209)に寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−６５００およびＰＴＡ−６５０３（それぞれＭＤＣＫ−ＳおよびＭＤＣＫ−ＳＦ１０３と呼ばれる）を割り当てられたもの；２００６年１０月５日に寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７９０９およびＰＴＡ−７９１０（それぞれサブクローン１−Ａおよび１−Ｂと呼ばれる）を割り当てられたものが挙げられる。

【0030】

使用可能な他のＭＤＣＫ細胞としては、限定されるものではないが、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−６５０１およびＰＴＡ−６５０２（それぞれＭＤＣＫ−ＳＦ１０１およびＭＤＣＫ−ＳＦ１０２と呼ばれる）を割り当てられたもの；ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１２０４２（ＭＤＣＫ．５Ｆ１と呼ばれる）を割り当てられたもの；ＡＴＣＣ寄託番号ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４を割り当てられたもの；ＣＲＬ−２２８６；およびＣＲＬ−２２８５が挙げられる。

【0031】

特定の実施形態では、本発明の方法において用いられる非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞は、成体ヌードマウスモデルにおいて非腫瘍形成性である（Stiles et al.参照）。別の特定の実施形態では、本発明の方法において用いられる非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞は、ニワトリ胚に注射および／または漿尿膜に局所適用される場合に非腫瘍形成性である（Leighton et al., Id参照）。さらに別の実施形態では、本発明の方法において用いられる非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞は成体ヌードマウスモデルにおいては非腫瘍形成性であるが、ニワトリ胚に注射および／または漿尿膜に局所適用される場合にはそうではない。なお別の実施形態では、本発明の方法において用いられる非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞は、成体ヌードマウスモデルにおいても、ニワトリ胚に注射および／または漿尿膜に局所適用される場合にも非腫瘍形成性である。さらに別の実施形態では、本発明の方法において用いられる非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞は、少なくとも２０継代後または少なくとも３０継代後または少なくとも４０継代後または少なくとも５０継代後または少なくとも６０継代後または少なくとも７０継代後または少なくとも８０継代後または少なくとも９０継代後または少なくとも１００継代後にも非腫瘍形成性である。さらに他の実施形態では、本発明の方法において用いられる非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞は、本発明の無血清培地（例えば、ＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １０５＋ＴＥ、ＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １０９、およびＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １１０）中で少なくとも２０継代後または少なくとも３０継代後または少なくとも４０継代後または少なくとも５０継代後または少なくとも６０継代後または少なくとも７０継代後または少なくとも８０継代後または少なくとも９０継代後または少なくとも１００継代後も非腫瘍形成性である。

【0032】

腫瘍形成性は当業者に知られている多くの方法で定量することができる。一般に用いられる１つの方法は、被験動物の５０％に腫瘍を誘導するのに必要な細胞の数として定義される「ＴＤ_５０」値を求めることである（例えば、Hill R. The TD50 assay for tumor cells. In: Potten C, Hendry J, editors. Cell clones. London: Churchill Livingstone; 1985. p. 223参照）。一実施形態では、本発明の方法において用いられる非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞は、約１０^１０〜約１０^１の間、または約１０^８〜約１０^３の間、または約１０^７〜約１０^４の間のＴＤ_５０値を有する。特定の実施形態では、本発明の方法において用いられる非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞は、約１０^１０を超えるまたは約１０^９を超えるまたは約１０^８を超えるまたは約１０^７を超えるまたは約１０^６を超えるまたは約１０^５を超えるまたは約１０^４を超えるまたは約１０^３を超えるまたは約１０^２を超えるまたは約１０^１を超えるＴＤ_５０値を有する。特定の実施形態では、本発明の方法において用いられる非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞は１０^７以上のＴＤ_５０値を有する。

【0033】

さらに、本発明の方法において用いられる非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞はまた非発癌性であると考えられる。細胞が発癌性であるかどうかを決定する方法は一般に、新生齧歯類種に細胞溶解液および／またはＤＮＡを接種し、腫瘍形成を経時的に評価することを含む（例えば、Nowinski and Hays, 1978, J. Virol., 27: 13-8; Peeper, et al., 2002, Nat Cell Biol., 4:148-53; Code of Federal Regulation (CFR), “Oncogenicity”, Title 40, Vol. 8, Chapter 1, section 798.330, pp. 160-164参照）。例えば、少なくとも１０^７細胞当量からの細胞溶解液および／またはＤＮＡを、一般に４日齢未満の新生齧歯類（例えば、ハムスター、ヌードマウス、ラット）に注射し、その後これを最大５か月以上モニタリングする。発癌性アッセイは商業的試験会社によって通常行われている（例えば、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ、プロトコール＃００１０３１および＃００１０３０参照）。一実施形態では、少なくとも１０^５または少なくとも１０^６または少なくとも１０^７の、本発明の方法において用いられる非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞からの細胞溶解液および／またはＤＮＡは、新生齧歯類種に注射される場合、２か月または３か月または４か月または５か月または６か月またはそれ以上腫瘍形成を誘導しない。別の実施形態では、０．０１ｍｇまたは０．０２ｍｇまたは０．０３ｍｇまたは０．０４ｍｇまたは０．０５ｍｇまたは０．０６ｍｇまたは０．０７ｍｇまたは０．０８ｍｇまたは０．０９ｍｇまたは０．１０ｍｇまたはそれを超える、本発明の方法において用いられる非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞からのＤＮＡは、新生齧歯類種に注射される場合、２か月または３か月または４か月または５か月または６か月またはそれ以上腫瘍形成を誘導しない。

【0034】

本発明の方法において用いられるＭＤＣＫ細胞（例えば、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞）は、限定されるものではないが、オルトミクソウイルス（インフルエンザＡおよび／またはＢ株を含む）、パラミクソウイルス（ＲＳＶ Ａおよび／またはＢ、ヒトメタニューモウイルスならびにパラインフルエンザ１、２および／または３を含む）、ラブドウイルスおよびフラボウイルスを含むウイルスの複製を助けると考えられる。

【0035】

特定の実施形態では、本発明の方法において用いられるＭＤＣＫ細胞（例えば、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞）は、例えば、ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）(Belshe et al., 1998, N Engl J Med 338:1405; Nichol et al., 1999, JAMA 282:137; Jackson et al., 1999, Vaccine, 17:1905)および／またはこれらのウイルスの骨格（例えば、残りの遺伝子セグメント）を含んでなるか、または以下の特徴：低温適応、弱毒および温度感受性の１以上を有するインフルエンザウイルスの骨格（または１以上のｖＲＮＡセグメント）を含んでなる合併結合ウイルスに見られるものなどの低温適応、温度感受性、弱毒型インフルエンザウイルスの複製を助ける。

【0036】

ウイルス複製を助ける細胞の能力の１つの指標が、感染細胞培養から得られた感染性ウイルスの収量である。ウイルス収量は、ウイルス感染および／または増殖を測定するために設計された多くのアッセイによって求めることができる。例えば、ウイルス収量は、感染性ビリオンを測定する５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ_５０）アッセイ、細胞培養単層の感染細胞内でウイルス抗原を検出する蛍光フォーカスアッセイ（ＦＦＡ）（例えば、米国特許第７，２６２，０４５号）に従ってサンプル中に存在するウイルスの濃度を測定することにより定量することができる。ＴＣＩＤ_５０値はｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０／ｍＬとして報告される場合が多く、ＦＦＡ値はｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬ（蛍光フォーカス単位／ｍＬ）として報告される場合が多い。インフルエンザウイルスの生産に有用な方法としては、限定されるものではないが、特許公報ＷＯ０８／１０５９３１（特に、実施例１２参照）に開示されているものが挙げられる。

【0037】

特定の実施形態では、本発明の方法において用いられるＭＤＣＫ細胞（例えば、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞）は、インフルエンザウイルス（（例えば、ｃａ／ｔｓ株）の複製を少なくとも約７．６、少なくとも約７．８、少なくとも約８．０、少なくとも約８．２、少なくとも約８．４、少なくとも約８．６、少なくとも約８．８、少なくとも約９．０、少なくとも約９．２、少なくとも約９．４、少なくとも約９．６、少なくとも約９．８、少なくとも約１０．０のｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０／ｍＬおよび／またはｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬまで助ける。別の特定の実施形態では、本発明の方法において用いられるＭＤＣＫ細胞は、インフルエンザウイルス（（例えば、ｃａ／ｔｓ株）の複製を少なくとも約７．６、少なくとも７．８、少なくとも８．０、少なくとも８．２、少なくとも８．４、少なくとも８．６、少なくとも８．８、少なくとも９．０、少なくとも９．２、少なくとも９．４、少なくとも９．６、少なくとも９．８、少なくとも１０．０のｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０／ｍＬおよび／またはｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬまで助ける。ある特定の実施形態では、本発明の方法において用いられるＭＤＣＫ細胞は非腫瘍形成性である。

【0038】

流行インフルエンザに対する毎年の予防接種用のワクチン株の製造に用いられる野生型インフルエンザウイルスは毎年ワクチンならびに関連の生物製剤に関する諮問委員会(Vaccines and Related Biological Products Advisory Committee)により、生物製剤評価研究センター(Centers for Biologics Evaluation and Research)（ＣＢＥＲ）または世界保健機関(World Health Organization)（ＷＨＯ）および欧州医薬品庁(European Medicines Evaluation Agency)（ＥＭＥＡ）に対して推奨され、ＦＤＡまたは疾病予防管理センター(Centers for Disease Control and Prevention)（ＣＤＣ）により生産者に提供される。これらの株は次に、一般に野生型ウイルスのＮＡおよび／またはＨＡ遺伝子と特定の望ましい特徴を有するドナーウイルス（しばしばマスタードナーウイルスまたはＭＤＶと呼ばれる）に由来する残りの遺伝子セグメントを組み合わせる合併結合ワクチン株の生産に使用することができる。例えば、ＭＤＶ株は低温適応および／または温度感受性および／または弱毒型であり得、かつ／または高い増殖率を有する。すぐ次に続く実施形態は、低温適応および／または温度感受性および／または弱毒型の異なるインフルエンザ株（例えば、１以上の保健機関により推奨された野生型株）に関する。このような低温適応および／または温度感受性および／または弱毒型インフルエンザウイルスは、目的株に由来するＨＡおよびＮＡ遺伝子セグメントと好適な低温適応および／または温度感受性および／または弱毒型インフルエンザ株に由来する残りの遺伝子セグメント（本明細書では「低温適応、温度感受性、弱毒骨格」とも呼ぶ）を含んでなる組換えおよび／または合併結合インフルエンザウイルス、例えば、ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）に見られる低温適応、温度感受性、弱毒型インフルエンザウイルス（ｃａ Ａ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０およびｃａ Ｂ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／６６）を得ることにより作出することができる。本明細書において、野生型インフルエンザウイルス株に由来するＨＡおよびＮＡ遺伝子セグメントと低温適応および／
または温度感受性および／または弱毒型インフルエンザであるウイルスに由来する残りの遺伝子セグメントを含んでなる組換えおよび／または合併結合ウイルス。合併結合および／または組換えウイルスはまた「ｃａ」、「ａｔｔ」、「ｔｓ」の１以上の識別子で始まる野生型株表記によっても呼ばれ、例えば、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９に由来するＨＡおよびＮＡ遺伝子セグメントと低温適応、温度感受性、弱毒型インフルエンザウイルス（例えば、Ａ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０）に由来する残りのセグメントを含んでなる組換えおよび／または合併結合ウイルスは簡単に「ｃａ Ａ／ニューカレドニア／２０／９９」と呼ぶことができる。

【0039】

ある実施形態では、本発明の方法において用いられるＭＤＣＫ細胞（例えば、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞）は、限定されるものではないが、ＣＢＥＲ、ＷＨＯ、ＥＭＥＡ、ＦＤＡおよびＣＤＣを含む１以上の保健機関によって毎年推奨および／または提供される少なくとも１つのインフルエンザ株（例えば、インフルエンザＡ株、インフルエンザＢ株）の低温適応および／または温度感受性および／または弱毒型（例えば、合併結合）の複製を、少なくとも約７．６、少なくとも約７．８、少なくとも約８．０、少なくとも約８．２、少なくとも約８．４、少なくとも約８．６、少なくとも約８．８、少なくとも約９．０、少なくとも約９．２、少なくとも約９．４、少なくとも約９．６、少なくとも約９．８、少なくとも約１０．０のｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０／ｍＬおよび／またはｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬまで助ける。別の特定の実施形態では、本発明の方法において用いられるＭＤＣＫ細胞（例えば、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞）は、限定されるものではないが、ＣＢＥＲ、ＷＨＯ、ＥＭＥＡ、ＦＤＡおよびＣＤＣを含む１以上の保健機関により毎年推奨および／または提供される少なくとも１つのインフルエンザ株（例えば、インフルエンザＡ株、インフルエンザＢ株）の低温適応および／または温度感受性および／または弱毒型（例えば、合併結合）の複製を、少なくとも約７．６、少なくとも７．８、少なくとも８．０、少なくとも８．２、少なくとも８．４、少なくとも８．６、少なくとも８．８、少なくとも９．０、少なくとも９．２、少なくとも９．４、少なくとも９．６、少なくとも９．８、少なくとも１０．０のｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０／ｍＬおよび／またはｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬまで助ける。ある特定の実施形態では、本発明の方法において用いられるＭＤＣＫ細胞は非腫瘍形成性である。

【0040】

ある特定の他の実施形態では、本発明の方法において用いられるＭＤＣＫ細胞（例えば、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞）は、少なくとも１つのインフルエンザＡ株の低温適応および／または温度感受性および／または弱毒型の複製を助ける。インフルエンザＡ株はいずれのサブタイプ（例えば、Ｈ_１Ｎ_１、Ｈ_３Ｎ_２、Ｈ_７Ｎ_７、Ｈ_５Ｎ_１、Ｈ_９Ｎ_２、Ｈ_１Ｎ_２、Ｈ_２Ｎ_２）のものであってもよいと考えられる。現在、インフルエンザＡウイルスにおいて、少なくとも１６の異なるＨＡと９つの異なるＮＡサブタイプが同定されている。よって、インフルエンザＡ株は、これまでに知られているまたは今後同定されるＨＡサブタイプとＮＡサブタイプの組合せのいずれを含んでもよく、かつ／または合併結合であってもよい。ある特定の実施形態では、本発明の方法において用いられるＭＤＣＫ細胞は非腫瘍形成性である。

【0041】

ある特定の他の実施形態では、本発明の方法において用いられるＭＤＣＫ細胞（例えば、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞）は、少なくとも１つのインフルエンザＢ株の低温適応および／または温度感受性および／または弱毒型の複製を助ける。インフルエンザＢウイルスは現在のところそれらの血球凝集素およびノイラミダーゼタンパク質に基づいたサブタイプに分けられておらず、むしろそれらは系統により分類されている。現在、インフルエンザＢウイルス株は、Ｂ／山形系統とＢ／ビクトリア系統という２つの系統に分けられ、多くのサブ系統が存在する。よって、インフルエンザＢ株はこれまでに知られているまたは今後同定されるいずれの系統および／またはサブ系統に由来してもよく、かつ／または合併結合であってもよい。ある特定の実施形態では、本発明の方法において用いられるＭＤＣＫ細胞は非腫瘍形成性である。

【0042】

６．３ 細胞培養培地および方法
本発明は、１回使用バイオリアクター、標準的な再利用バイオリアクター（例えば、ステンレス鋼、ガラス容器バイオリアクター）を含むバイオリアクターで大量のワクチン材料を生産するための無血清細胞培養培地および再現性が高く、効率的でスケーラブルなプロセスを提供する。特に、本発明は、インフルエンザウイルス（例えば、低温適応および／または温度感受性および／または弱毒型）を高力価、例えば、少なくとも約７．４または少なくとも約７．６または少なくとも約７．８または少なくとも約８．０または少なくとも約９．０または少なくとも約１０．０のｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０／ｍＬおよび／またはｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬまで複製する方法を提供する。一態様において、本発明は、ＭＤＣＫ細胞（例えば、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞）の増殖を高い細胞密度まで助け、高いウイルス力価を得るための培地交換工程の必要を無くす富化無血清細胞培養培地を提供する。培地交換工程の排除は、プロセス時間および培地の使用の軽減などのいくつかの利点を与える。さらに、製造中に必要とされる操作数が減り、これによって汚染の機会も減る。別の態様において、本発明は、ビーズ間移動法を含む微小担体上での非腫瘍形成性細胞の増殖のための改良法を提供する。別の態様において、本発明の富化無血清細胞培養培地は非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞の非腫瘍形成的特徴を維持する。

【0043】

６．３．１ 富化無血清
当業者ならば 細胞を増殖させるのに用いられる細胞培養培地が、限定されるものではないが、非腫瘍形成性であること、非発癌性であること、接着細胞として増殖すること、非接着細胞として増殖すること、上皮様形態を有すること、培養した際に種々のウイルスの複製を助けること、および本明細書に記載されているようにインフルエンザウイルスの複製を高力価まで助けることを含む１以上の細胞の特徴に影響を及ぼし得ることが分かるであろう。外来病原体（例えば、マイコプラズマ、ウイルスおよびプリオン）による汚染のリスクを軽減するため、治療（例えば、ワクチン）材料の生産のための組織培養適用における血清または動物抽出物の使用は最小限にするか、またはさらには無くすべきである。さらに、細胞培養プロセス中に必要とされる操作の数を最小化することも汚染の機会を著しく軽減することができる。よって、本発明は、バッチ培養法を用いるＭＤＣＫ細胞（例えば、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞）の増殖およびワクチン材料の生産に有用な富化無血清培養培地を提供する。特に、本発明の富化無血清培養培地（「本発明の無血清培地」および「本発明の培地」とも呼ばれる）は、培地交換または補給を用いないバッチ培養法で使用可能である。よって、本発明の無血清培地の開発および使用は、ワクチン材料（例えば、インフルエンザウイルス）の、細胞培養に基づく生産において最も興味深い操作上の問題の１つである培地交換／補給の必要性を克服する。

【0044】

一実施形態では、本発明の無血清培地は、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞の増殖を助け、この場合、その細胞は該培地での増殖後（すなわち、継代培養後）も非腫瘍形成性を維持する。特定の実施形態では、ＭＤＣＫ細胞は、本発明の無血清培地中で、少なくとも２０継代後または少なくとも３０継代後または少なくとも４０継代後または少なくとも５０継代後または少なくとも６０継代後または少なくとも７０継代後または少なくとも８０継代後または少なくとも９０継代後または少なくとも１００継代後も非腫瘍形成性である。

【0045】

別の実施形態では、本発明の無血清培地はＭＤＣＫ細胞（例えば、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞）の増殖を高密度まで助ける。特定の実施形態では、本発明の無血清培地は、ＭＤＣＫ細胞の増殖を少なくとも５×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも６×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも７×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも８×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも９×１０^５細胞／ｍＬ、少なくとも１×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも１．２×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも１．４×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも１．６×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも１．８×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも２．０×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも２．５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも７．５×１０^６細胞／ｍＬまたは少なくとも１×１０^７の密度まで助ける。別の特定の実施形態では、本発明の無血清培地は非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞の増殖を助ける。

【0046】

さらに別の実施形態では、本発明の無血清培地は、培地交換工程を必要とせずに、ＭＤＣＫ細胞（例えば、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞）の増殖を高密度まで助け、その後のインフルエンザウイルスの複製を高力価まで助ける。特定の実施形態では、本発明の無血清培地は、培地交換工程を必要とせずに、ＭＤＣＫ細胞の増殖を高密度まで助け、その後のインフルエンザウイルス（例えば、ｃａ／ｔｓ株）の複製を少なくとも６．０または少なくとも６．２または少なくとも６．４または少なくとも６．６または少なくとも６．８または少なくとも７．０または少なくとも７．２または少なくとも７．４または少なくとも７．６または少なくとも７．８または少なくとも８．０または少なくとも８．２または少なくとも８．４または少なくとも８．６または少なくとも８．８または少なくとも９．０ または少なくとも９．２または少なくとも９．４または少なくとも９．６または少なくとも９．８または少なくとも１０．０のｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０／ｍＬおよび／またはｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬまで助ける。他の特定の実施形態では、本発明の無血清培地は、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞の増殖を高密度まで助け、その後の、限定されるものではないが前記のインフルエンザウイルスを含むインフルエンザウイルスの複製を助ける。

【0047】

一実施形態では、本発明の無血清培地は植物加水分解物を含んでなる。植物加水分解物としては、限定されるものではないが、以下のもの：トウモロコシ、綿実、エンドウ、ダイズ、麦芽、ジャガイモおよびコムギの１以上からの加水分解物が挙げられる。植物加水分解物は酵素的加水分解により生産可能であり、一般にペプチド、遊離アミノ酸および増殖因子の混合物を含む。植物加水分解物は、例えば、Ｍａｒｃｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、ＨｙＣｌｏｎｅおよびＯｒｇａｎｏ Ｔｅｃｈｎｉｅを含むいくつかの商業ソースから容易に得られる。また、植物加水分解物の代わりに、または植物加水分解物と組み合わせて酵母加水分解物も使用可能であると考えられる。酵母加水分解物は、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＢ Ｃｏｒｐ、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬおよびその他を含むいくつかの商業ソースから容易に得られる。ある実施形態では、植物または酵母加水分解物に加えて、または植物または酵母加水分解物の代わりに合成加水分解物を使用することができる。ある実施形態では、本発明の無血清培地は、約０．１ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌの間、または約０．５ｇ／Ｌ〜約４．５ｇ／Ｌの間、または約１．０ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌの間、または約１．５ｇ／Ｌ〜約３．５ｇ／Ｌの間、または約２．０ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌの間の終濃度で植物加水分解物を含んでなる。特定の実施形態では、本発明の無血清培地は、終濃度２．５ｇ／Ｌの植物加水分解物を含んでなる。別の特定の実施形態では、本発明の無血清培地は、終濃度２．５ｇ／Ｌの加水分解物を含んでなる。

【0048】

別の実施形態では、本発明の無血清培地は、脂質補給物を含んでなる。培養培地の補給に使用可能な脂質としてが、限定されるものではないが、化学的に定義された動物および植物由来脂質補給物ならびに合成により誘導された脂質が挙げられる。脂質補給物中に存在し得る脂質としては、限定されるものではないが、コレステロール、飽和および／または不飽和脂肪酸（例えば、アラキドン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸およびステアリン酸）が挙げられる。コレステロールは脂質補給物の１００倍保存液中に０．１０ｍｇ／ｍｌ〜０．４０ｍｇ／ｍｌの間の濃度で存在し得る。脂肪酸は脂質補給物の１００倍保存液中に１μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌの間の濃度で存在し得る。培地処方に好適な脂質は、例えば、ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬおよびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈを含むいくつかの商業ソースから容易に得られる。ある実施形態では、本発明の無血清培地は、化学的に定義された脂質濃縮物を約０．１倍〜約２倍の間、または約０．２倍〜約１．８倍の間、または約０．３倍〜約１．７倍の間、または約０．４倍〜約１．６倍の間、または約０．５倍〜約１．５倍の間、または約０．６倍〜約１．４倍の間、または約０．７倍〜約１．３倍の間、または約０．８倍〜約１．２倍の間の終濃度で含んでなる。特定の実施形態では、本発明の無血清培地は、化学的に定義された脂質濃縮物（ＣＤＣＬ）溶液を終濃度１倍で含んでなる。別の特定の実施形態では、本発明の無血清培地は、化学的に定義された脂質濃縮物（ＣＤＣＬ）溶液（表５）を終濃度１倍で含んでなる。

【0049】

別の実施形態では、本発明の無血清培地は微量元素を含んでなる。使用可能な微量元素としては、限定されるものではないが、ＣｕＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、Ｓｅｌｅｎｉｔｅ・２Ｎａ、クエン酸鉄、ＭｎＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ、Ｎａ_２ＳｉＯ_３・９Ｈ_２Ｏ、モリブデン酸−アンモニウム塩、ＮＨ_４ＶＯ_３、ＮｉＳＯ_４・６Ｈ_２Ｏ、ＳｎＣｌ_２ （無水）、ＡｌＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ、ＡｇＮＯ_３、Ｂａ（Ｃ_２Ｈ_３Ｏ_２）_２、ＫＢｒ、ＣｄＣｌ_２、ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、ＣｒＣｌ_３（無水）、ＮａＦ、ＧｅＯ_２、ＫＩ、ＲｂＣｌ、ＺｒＯＣｌ_２・８Ｈ_２Ｏが挙げられる。微量元素の濃縮保存溶液は、例えば、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗを含むいくつかの商業ソースから容易に得られる（カタログ番号９９−１８２、９９−１７５および９９−１７６参照）。ある実施形態では、本発明の無血清培地は、微量元素溶液Ａ、ＢおよびＣ（表４）を約０．１倍〜約２倍の間、または約０．２倍〜約１．８倍の間、または約０．３倍〜約１．７倍の間、または約０．４倍〜約１．６倍の間、または約０．５倍〜約１．５倍の間、または約０．６倍〜約１．４倍の間、または約０．７倍〜約１．３倍の間、または約０．８倍〜約１．２倍の間の終濃度で含んでなる。特定の実施形態では、本発明の無血清培地は、微量元素溶液Ａ、ＢおよびＣ（表４）を終濃度１倍で含んでなる。

【0050】

別の実施形態では、本発明の無血清培地は、１以上のホルモン、増殖因子および／または他の生体分子を含んでなる。ホルモンとしては、限定されるものではないが、トリヨードチロニン、インスリンおよびヒドロコルチゾンが挙げられる。増殖因子としては、限定されるものではないが、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）および繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）が挙げられる。特定の実施形態では、本発明の無血清培地は上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）を含んでなる。他の生体分子としては、サイトカイン（例えば、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン、インターロイキン、ＴＮＦ）、ケモカイン（例えば、Ｒａｎｔｅｓ、エオタキシン、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ））およびプロスタグランジン（例えば、プロスタグランジンＥ１およびＥ２）が挙げられる。一実施形態では、本発明の無血清培地は、増殖因子を約０．０００１〜約０．０５ｍｇ／Ｌの間、または約０．０００５〜約０．０２５ｍｇ／Ｌの間、または約０．００１〜約０．０１ｍｇ／Ｌの間、または約０．００２〜約０．００８ｍｇ／Ｌの間、または約０．００３ｍｇ／Ｌ〜約０．００６ｍｇ／Ｌの間の終濃度で含んでなる。特定の実施形態では、本発明の無血清培地は、ＥＧＦを終濃度０．００５ｍｇ／Ｌで含んでなる。一実施形態では、本発明の無血清培地は、トリヨードチロニンを約１×１０^−１２Ｍ〜約１０×１０^−１２Ｍの間、または約２×１０^−１２Ｍ〜約９×１０^−１２Ｍの間、または約３×１０^−１２Ｍ〜約７×１０^−１２Ｍの間、または約４×１０^−１２Ｍ〜約６×１０^−１２Ｍの間の終濃度で含んでなる。特定の実施形態では、本発明の無血清培地は、トリヨードチロニンを終濃度５×１０^−１２Ｍで含んでなる。一実施形態では、本発明の無血清培地は、インスリンを約１ｍｇ／Ｌ〜約１０ｍｇ／Ｌの間、または約２．０〜約８．０ｍｇ／Ｌの間、または約３ｍｇ／Ｌ〜約６ｍｇ／Ｌの間の終濃度で含んでなる。特定の実施形態では、本発明の無血清培地は、インスリンを終濃度５ｍｇ／Ｌで含んでなる。ある実施形態では、本発明の無血清培地は、プロスタグランジンを約０．００１ｍｇ／Ｌ〜約０．０５ｍｇ／Ｌの間、または約０．００５ｍｇ／Ｌ〜約０．０４５ｍｇ／Ｌの間、または約０．０１ｍｇ／Ｌ〜約０．０４ｍｇ／Ｌの間、または約０．０１５ｍｇ／Ｌ〜約０．０３５ｍｇ／Ｌの間、または約０．０２ｍｇ／Ｌ〜約０．０３ｍｇ／Ｌの間の終濃度で含んでなる。特定の実施形態では、本発明の無血清培地は、プロスタグランジンを終濃度０．０２５ｍｇ／Ｌで含んでなる。別の特定の実施形態では、本発明の無血清培地は、プロスタグランジンＥ１を終濃度０．０２５ｍｇ／Ｌで含んでなる。

【0051】

さらに別の実施形態では、本発明の無血清培地は、プトレッシン、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸およびヌクレオシドからなる群から選択される１以上の培地成分で強化される。特定の実施形態では、本発明の無血清培地は、成分の濃度が例えばダルベッコの改変イーグル培地／ハムのＦ１２ 培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）などの増殖細胞用に通常用いられている培地に一般に見られるものよりも約１倍または約２倍または約３倍または約４倍または約５倍またはそれを超える高さになるように、１以上の培地成分で強化される。参考のため、ＤＭＥＭ／Ｆ１２の標準的な組成を下記表１に示す。特定の実施形態では、本発明の無血清培地はプトレッシンで強化される。別の特定の実施形態では、本発明の無血清培地はプトレッシンで、プトレッシン濃度がＤＭＥＭ／Ｆ１２に一般にみられるものよりも約５倍またはそれを超える高さになるように強化される。

【0052】

強化可能な脂肪酸としては、限定されるものではないが、リノール酸およびα−リノレン酸（必須脂肪酸とも呼ばれる）ならびにミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルシン酸、ドコサヘキサン酸を含む不飽和脂肪酸；限定されるものではないが、ブタン酸、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ドデカン酸、テトラデカン酸、ヘキサデカン酸、オクタデカン酸、エイコサン酸、ドコサン酸、テトラコサン酸および硫黄含有脂肪酸（リポ酸を含む）を含む飽和脂肪酸が挙げられる。ある実施形態では、本発明の無血清培地は、上記のような脂質補給物により提供されるものに加え、付加的脂肪酸で強化される。特定の実施形態では、本発明の無血清培地はリノール酸およびリノレン酸で強化される。別の特定の実施形態では、本発明の無血清培地はリノール酸およびリノレン酸で、リノール酸およびリノレン酸の濃度がＤＭＥＭ／Ｆ１２に一般に見られるものよりも約５倍またはそれを超える高さになるように強化される。

【0053】

強化可能なアミノ酸としては、１２の標準アミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン）ならびにシスチンおよび非標準アミノ酸が挙げられる。ある実施形態では、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞によっては合成されない、一般に「必須アミノ酸」と呼ばれる１以上のアミノ酸が強化される。例えば、一般に、８つのアミノ酸、すなわち、フェニルアラニン、バリン、トレオニン、トリプトファン、イソロイシン、メチオニン、ロイシンおよびリシンがヒトに必須であると考えられる。特定の実施形態では、本発明の無血清培地は、シスチンおよび、グルタミン以外の全ての標準アミノ酸（ＤＭＥＭ／Ｆ１２はグルタミン無しで処方され、グルタミンは別途加える場合が多い）で、シスチンおよび標準アミノ酸の濃度がＤＭＥＭ／Ｆ１２に一般に見られるものよりも約５倍またはそれを超える高さになるように強化される。ある特定の実施形態では、本発明の無血清培地は、グルタミンを約１４６ｍｇ／Ｌ〜約１０２２ｍｇ／Ｌの間、または約２９２ｍｇ／Ｌ〜約８７６ｍｇ／の間Ｌまたは約４３８ｍｇ／Ｌ〜約７３０ｍｇ／Ｌの間の濃度で含んでなる。別の特定の実施形態では、本発明の無血清培地は、グルタミンを５８４ｍｇ／ｍＬの濃度で含んでなる。

【0054】

強化可能なビタミンとしては、限定されるものではないが、アスコルビン酸（ｖｉｔ Ａ）、ｄ−ビオチン（ｖｉｔ Ｂ_７およびｖｉｔ Ｈ）、Ｄ−カルシウムパントテン酸、コレカルシフェロール（ｖｉｔ Ｄ_３）、塩化コリン、シアノコバラミン（ｖｉｔ Ｂ_１２）、エルゴカルシフェロール（ｖｉｔ Ｄ_２）、葉酸（ｖｉｔ Ｂ_９）、メナキノン（ｖｉｔ Ｋ_２）、ミオイノシトール、ナイアシンアミド（ｖｉｔ Ｂ_３）、ｐ−アミノ安息香酸、パントテン酸（ｖｉｔ Ｂ_５）、フィロキノン（ｖｉｔ Ｋ_１）、ピリドキシン（ｖｉｔ Ｂ_６）、レチノール（ｖｉｔ Ａ）、リボフラビン（ｖｉｔ Ｂ_２）、α−トコフェロール（ｖｉｔ Ｅ）およびチアミン（ｖｉｔ Ｂ_１）が挙げられる。特定の実施形態では、本発明の無血清培地は、ａｒｅ で強化される ｄ−ビオチン、Ｄ−カルシウム、パントテン酸、塩化コリン、シアノコバラミン、葉酸、ミオイノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビンおよびチアミンで、示されたビタミンの濃度がＤＭＥＭ／Ｆ１２に一般に見られるものよりも約５倍またはそれを超える高さになるように強化される。

【0055】

強化可能なヌクレオシドとしては、限定されるものではないが、シチジン、ウリジン、アデノシン、グアノシン、チミジン、イノシンおよびヒポキサンチンが挙げられる。特定の実施形態では、本発明の無血清培地は、ヒポキサンチンおよびチミジンで、ヒポキサンチンおよびチミジンの濃度がＤＭＥＭ／Ｆ１２に一般に見られるものよりも約５倍またはそれを超える高さになるように強化される。

【0056】

細胞培養培地に添加可能なさらなる成分としては、限定されるものではないが、重炭酸ナトリウム、炭素源（例えば、グルコース）および鉄結合剤が挙げられる。一実施形態では、本発明の無血清培地は重炭酸ナトリウムを約１２００ｍｇ／Ｌ〜約７２００ｍｇ／Ｌの間、または約２４００ｍｇ／Ｌおよび約６０００ｍｇ／ｍＬの間、または約３６００ｍｇ／ｍＬおよび約４８００ｍｇ／ｍＬの間の終濃度で含んでなる。特定の実施形態では、本発明の無血清培地は重炭酸ナトリウムを終濃度４４００ｍｇ／ｍＬで含んでなる。一実施形態では、本発明の無血清培地は炭素源としてグルコースを含んでなる。別の実施形態では、本発明の無血清培地はグルコースを、約１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌまたは約２ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌまたは約３ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌまたは約４ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌまたは約４．５ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌの間の終濃度で含んでなる。特定の実施形態では、本発明の無血清培地はグルコースを終濃度４．５ｇ／Ｌで含んでなる。特に、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞を高密度まで増殖させ、その後、インフルエンザウイルスの複製するために用いる本発明の無血清培地には、炭素源の枯渇を避けるためにグルコースを追加することができると考えられる。よって、ある実施形態では、本発明の無血清培地は、約５．５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌの間の最終グルコース濃度となるように１〜５ｇ／Ｌのグルコース追加を含んでなる。

【0057】

使用可能な鉄結合剤としては、トランスフェリンなどのタンパク質およびトロポロンなどの化学化合物（例えば、米国特許第５，０４５，４５４号、同第５，１１８，５１３号、同第６，５９３，１４０号およびＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ０１／１６２９４号参照）が挙げられる。一実施形態では、本発明の無血清培地は、トランスフェリンの代わりにトロポロン（２−ヒドロキシ−２，４，６−シクロヘパトリエン−１）および鉄源（例えば、クエン酸アンモニウム鉄、硫酸アンモニウム鉄）を含んでなる。例えば、トロポロンまたはトロポロン誘導体は、培地中に存在する鉄よりも過剰なモル濃度で、約５対１〜約１対１の間のモル比で存在する。ある実施形態では、本発明の無血清培地は、トロポロンまたはトロポロン誘導体を、培地中に存在する鉄よりも過剰なモル濃度で、約５対１または約３対１または約２対１または約１．７５対１または約１．５対１または約１．２５対１のモル比で含んでなる。特定の実施形態では、本発明の無血清培地は終濃度０．２５ｍｇ／Ｌのトロポロンおよび終濃度０．２０ｍｇ／Ｌのクエン酸アンモニウム鉄（ＦＡＣ）を含んでなる（表３参照）。

【0058】

培地処方物への前記のような成分の添加は浸透圧を変化させ得る。よって、ある実施形態では、所望の浸透圧を維持するためにＤＭＥＭ／Ｆ１２に一般に見られる１以上の成分の量を低減する。一実施形態では、本発明の無血清培地において塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の濃度を低減する。別の実施形態では、本発明の無血清培地中のＮａＣｌ濃度は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２に一般に見られるものの約１０％〜約９０％または約２０％〜約８０％または約３０％〜約７０％または約４０％〜約６０％の間である。特定の実施形態では、本発明の無血清培地中のＮａＣｌ終濃度はＤＭＥＭ／Ｆ１２に一般に見られるものの５０％である。別の特定の実施形態では、本発明の無血清培地中のＮａＣｌ濃度は３５００ｍｇ／Ｌである。

【0059】

ある実施形態では、本発明の無血清培地中に存在する動物由来成分の数は最小限にするか、またはさらには無くす。例えば、非動物源由来のインスリンおよびトランスフェリンなどの市販の組換えタンパク質（例えば、それぞれＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓカタログ番号０１−８１８−１およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号９７０１）を動物源由来のタンパク質の代わりに使用することができる。特定の実施形態では、化学的に定義された脂質混合物の一成分であり得るコレステロール以外の全ての動物由来成分を非動物由来製品に置き換える。一般に動物由来製品に関連するリスクを最小化するためには、コレステロールを限定されるものではないがプリオンを含む外来病原体に関連しない領域にあるヒツジの毛から得ることができる。

【0060】

特定の実施形態では、本発明の無血清培地は、表３に挙げられているＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １１０培地の全ての成分を示されている終濃度で含んでなる。別の特定の実施形態では、本発明の無血清培地は表３に挙げられている、示された濃度のＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １１０培地の全ての成分から本質的になる。さらに別の特定の実施形態では、表３に挙げられている成分からなるＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １１０培地は本発明の無血清培地である。

【表1】

【0061】

６．３．２ ビーズ間移動
一実施形態では、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞は、それらが接着している表面上で接着細胞として培養される。組織培養細胞が増殖可能な接着表面としては、限定されるものではないが、表面改質ポリスチレンプラスチック、タンパク質コーティング表面（例えば、フィブロネクチン および／またはコラーゲンコーティングガラス／プラスチック）ならびに多種の市販微小担体（例えば、Ｄｏｒｍａｃｅｌｌ、Ｐｆｅｉｆｅｒ ＆ ＬａｎｇｅｎなどのＤＥＡＥ−デキストラン微小担体ビーズ；Ｓｕｐｅｒｂｅａｄ、Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｈｉｌｌｅｘ、ＳｏｌｏＨｉｌｌ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒなどのスチレンコポリマー−トリ−メチルアミンビーズ；ＣｙｔｏｄｅｘおよびＣｙｔｏｄｅｘ３（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）が挙げられる。微小担体ビーズは、細胞培養容量当たりに接着細胞増殖のための大きな表面積を与える小球（直径１００〜２００ミクロンの範囲）である。例えば、１リットルの培地は、８０００平方センチメートルを超える増殖表面を提供する２０００万を超える微小担体ビーズを含み得る。接着表面の選択は非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞の培養に用いる方法によって決定される。

【0062】

一実施形態では、微小担体は約１〜約４ｇ／Ｌの間の濃度で用いられる。別の実施形態では、微小担体は約２〜約３ｇ／Ｌの間の濃度で用いられる。ある実施形態では、培養容器（例えば、バイオリアクター）に被培養ＭＤＣＫ細胞を約０．５〜約２×１０^５細胞／ｍＬの播種密度で播種する。特定の実施形態では、播種密度は約０．７〜約１．８×１０^５細胞／ｍＬの間、または約０．８〜約１．６×１０^５細胞／ｍＬの間、または約０．９〜約１．４×１０^５細胞／ｍＬの間、または約１．０〜約１．２×１０^５細胞／ｍＬの間である。あるいは、播種密度は微小担体当たりで計算することもできる。よって、ある実施形態では、培養容器（例えば、バイオリアクター）に被培養ＭＤＣＫ細胞を約１０〜約４０細胞／微小担体、約１２〜約３８細胞／微小担体、または約１４〜約３６細胞／微小担体、または約１６〜約３４細胞／微小担体、または約１８〜約３２細胞／微小担体、または約２０〜約３０細胞／微小担体の播種密度で播種する。

【0063】

接着細胞を継代培養する（すなわち、細胞を増殖させる、細胞培養を拡張する）過程では、細胞を密集した支持体表面（例えば、フラスコ表面、微小担体など）から新しい支持体表面へ移動させなければならない。このような細胞移動を行うためにはいくつかの方法を使用することができる。例えば、トリプシン、ＴｒｙｐＬＥおよびコラゲナーゼを含むプロテアーゼを用いて細胞をフラスコまたは微小担体から取り出し、次にこれらの細胞を所望により洗浄し、拡張のためにより大きなフラスコまたはより大容量の微小担体含有培地へ希釈することができる。このプロセスは一般に培養物を「分割する」と言われ、元の培養物と最終培養物の比として定量することができる。例えば、分割比１：８は１部の元の（例えば、１０ｍＬ）培養物を７部の新鮮培養培地（例えば、７０ｍＬ）に加えて８０ｍＬにすることを示す。あるいは、元の培養物中の細胞数を求め、所望の播種密度と最終培養物の容量に基づき希釈率を計算する。このような適用にはＴｒｙｐＬＥ(Invitrogen, Carlsbad, CA)などの非動物由来プロテアーゼを使用するのが好ましい。あるいは、微小担体培養においては、細胞を解離させた後に新鮮な培地および／または微小担体ビーズを培養物に加えればよい。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ処理培養物を、新鮮な培地および／または微小担体の添加前、添加中または添加後に、より大きな培養容器に移す。

【0064】

特定の実施形態では、微小担体上で接着細胞として増殖するＭＤＣＫ細胞（例えば、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞）の細胞培養物をプロテアーゼ（例えば、ＴｒｙｐＬＥ）で処理する。このプロテアーゼを必要に応じて不活性化（例えば、ライマメトリプシン阻害剤などのプロテアーゼ阻害剤の添加による）することができ、その後、新鮮な培地および／または微小担体ビーズをその培養物に加えることができる。いくつかの実施形態では、このプロテアーゼ処理培養物を、新鮮な培地および／または微小担体の添加前、添加中または添加後に、より大きな培養容器に移す。

【0065】

このビーズ間移動法におけるプロテアーゼの使用により、細胞の拡散が不十分となり、細胞総数が少なくなる場合がある。よって、本発明はまた、限定されるものではないが、第８．３節の実施例に示されている（第８．１節の実施例にも用いられている）方法を含む、ビーズ間移動を助長するのに必要なプロテアーゼの量を最小限にする、またはさらには無くすビーズ間移動を行う方法も提供する。特に、本発明者らは細胞を微小担体から遊離させるのに必要なプロテアーゼの量がキレート剤での前処理により、特に、細胞の増殖に用いるものよりも高いｐＨでの前処理により、少なくとも２０倍低減可能であると確定した。

【0066】

いくつかの実施形態では、ビーズ間移動は、プロテアーゼ（例えば、ＴｒｙｐＬＥ）の添加前に細胞をキレート剤で前処理することにより助長される。他の実施形態では、ビーズ間移動は、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）を添加すること、および細胞増殖に用いるものよりも高いｐＨでインキュベートすることにより助長される。特定の実施形態では、微小担体上で接着細胞として増殖する非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞の細胞培養を、プロテアーゼの添加前に、細胞増殖の際に用いるものよりも高いｐＨで、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）で処理する。ある実施形態では、微小担体基質からの細胞の解離を助長するため、必要に応じてｐＨをモニタリングし、調整する。細胞が解離された後、その培養物に新鮮な培地および／または微小担体ビーズを加えることができる。いくつかの実施形態では、元の微小担体を含む、または含まない培養物を、新鮮な培地および／または微小担体の添加前、添加中または添加後に、より大きな培養容器に移す。

【0067】

ある実施形態では、これらの細胞を、解離する前に洗浄培地（例えば、緩衝塩溶液）で洗浄する。細胞の洗浄に有用な媒体としては、限定されるものではないが、Ｈｅｐｅｓ緩衝溶液、リン酸緩衝生理食塩水、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、ハンクスの平衡塩溶液、アールの平衡塩溶液が挙げられる。細胞洗浄プロセスは、培地（増殖および／または洗浄培地）の一部または全部を新鮮な洗浄培地（すなわち、緩衝塩溶液）に置き換えることを含む。このプロセスは複数回繰り返すことができる。一般に、微小担体ビーズを一定時間（例えば、１０〜４０分）沈降させ、増殖培地を容器から除去する。所望により、細胞培養物からの培地の除去は、交互低剪断型タンジェントフローデバイスを用いて行うことができる（例えば、米国特許第６，５４４，４２４号参照）。ある実施形態では、洗浄工程の際に約５０％〜約９０％の間の培地（増殖および／または洗浄培地）を除去する。ある実施形態では、培地を、除去された培地の容量よりも少ない、同じまたは多い容量の洗浄培地（すなわち、緩衝塩溶液）に置き換える。一実施形態では、洗浄培地は、細胞培養容量が元の細胞培養作業容量の約２５％〜約１００％の間となるように加える。特定の実施形態では、洗浄培地は、元の細胞培養作業容量の約４０％〜約６０％となるように加える。別の特定の実施形態では、洗浄培地は、元の細胞培養作業容量の約９０％〜約１００％となるように加える。ある実施形態では、細胞を２回以上洗浄する。

【0068】

ある実施形態では、洗浄培地はキレート剤を含んでなる。使用可能なキレート剤としては、限定されるものではないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンビス（オキシエチレン−トリニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）が挙げられる。特定の実施形態では、キレート剤はＥＤＴＡである。ある実施形態では、洗浄培地はキレート剤を約０．２５ｍＭ〜約０．７５ｍＭの間の濃度で含んでなる。ある特定の他の実施形態では、洗浄培地はキレート剤を約０．４ｍＭ〜約０．６ｍＭの間の濃度で含んでなる。特定の実施形態では、洗浄培地はキレート剤を約０．５ｍＭの濃度で含んでなる。

【0069】

一実施形態では、キレート剤を含んでなる洗浄培地のｐＨは約７．６および約８．４の間である。特定の実施形態では、キレート剤を含んでなる洗浄培地のｐＨは約７．８および約８．２の間である。別の特定の実施形態では、キレート剤を含んでなる洗浄培地のｐＨは約７．９および約８．１の間である。細胞培養物にキレート剤を含んでなる洗浄培地を添加すると、結果としての洗浄培地中の細胞培養物のｐＨが変更される場合がある。よって、ある実施形態では、キレート剤を含んでなる洗浄培地で洗浄される細胞培養のｐＨを、細胞培養物に洗浄培地を添加した後に必要に応じて約７．６および約８．４の間に調整する。特定の実施形態では、キレート剤を含んでなる洗浄培地で洗浄される細胞培養のｐＨを、細胞培養物に洗浄培地を添加した後に必要に応じて約７．８および約８．２の間に調整する。別の特定の実施形態では、キレート剤を含んでなる洗浄培地で洗浄される細胞培養のｐＨを、細胞培養物に洗浄培地を添加した後に必要に応じて約７．９および約８．１の間に調整する。

【0070】

ある実施形態では、細胞培養物を、キレート剤を含んでなる洗浄培地の添加後、および付加的な洗浄工程および／またはプロテアーゼ添加の前に攪拌する(agitated)。培養物の攪拌(agitation)は、限定されるものではないが、攪拌(stirring)、振盪、回転などを含む当技術分野で周知の手段と用いて行うことができる。攪拌の速度および時間は培養物の容量、洗浄培地の成分および細胞培養物中の細胞のタイプによって決定される。ある実施形態では、細胞培養物は、細胞増殖に用いるものと同様の速度で攪拌する。他の実施形態では、細胞培養物は、細胞増殖に用いるものよりも速い速度で攪拌する。より速い攪拌速度を用いる場合には、その速度を約１０％〜約９０％の間、または約２０％〜約８０％の間、または約３０％〜約７０％の間、または約４０％〜約６５％の間に引き上げる。特定の実施形態では、用いる攪拌速度は約４０％〜約６５％の間である。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、プロテアーゼの添加前に、大部分の微小担体が培養容器の底に沈降しないように十分攪拌しながらキレート剤とともにインキュベートする。ある実施形態では、細胞培養物を約５分〜約６０分の間攪拌する。特定の実施形態では、細胞培養物を約２０〜約４０分間攪拌する。

【0071】

ある実施形態では、プロテアーゼ（例えば、セリンプロテアーゼ）は、洗浄中、攪拌を行った後に細胞培養物に添加する。特定の実施形態では、細胞を２回以上洗浄し、プロテアーゼを最後の洗浄中、攪拌を行った後に添加する。プロテアーゼは、本発明のある態様では、セリンプロテアーゼまたはシステインプロテアーゼまたはアスパラギンプロテアーゼである。特定の実施形態では、プロテアーゼはセリンプロテアーゼ（例えば、トリプシン、ＴｒｙｐＬＥなど）である。別の実施形態では、米国特許出願第１１／４５５，８１８号に記載されているストレプトミセス・グリセウス(Streptomyces griseus)由来のプロテアーゼが用いられる。トリプシンは動物供給源からのものであってよく、あるいはより好ましくは組換え供給源からのものである。これらの条件下で解離を行うために添加されるプロテアーゼの量は、それらの細胞がキレート剤で前処理されなかった場合に必要とされるものの少なくとも５倍少ないものであり、培養物の容量およびプロテアーゼの濃度によって決定される。例として、１０倍保存液として提供される市販のＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓは一般に、ＭＤＣＫ細胞などの接着性の高い細胞を解離するために約１倍の終濃度で用いられる（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ＴｒＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｅｗｓ参照）。本明細書に示されているように（第８．３節参照）、微小担体から細胞を解離させるのに必要なＴｒｙｐＬＥ（商標）の終濃度は、２０分の１減の０．０５倍である。よって、ある実施形態では、細胞培養物に添加されるプロテアーゼの終濃度は、約０．１倍〜約０．０１２５倍の間、または約０．１倍〜約０．０１２５倍の間、または約０．１倍〜約０．０２５倍の間、または約０．１倍〜約０．０５倍の間、または約０．１倍〜約０．０７５倍の間、または約０．０７５倍〜約０．０１２５倍の間、または約０．０５倍〜約０．０１２５倍の間、または約０．０２５倍〜約０．０１２５倍の間、または約０．０７５倍〜約０．０２５倍の間、または約０．５倍、または約０．１倍、または約０．０９倍、または約０．０８倍、または約０．０７倍、または約０．０６倍、または約０．０５倍、または約０．０４倍、または約０．０２倍（ここで、１倍は、同じ解離条件下、キレート剤で前処理しなかった細胞を解離させるのに必要なプロテアーゼの終濃度を表す）である。また、１倍はプロテアーゼの濃保存液（例えば、１０倍保存液として供給されるプロテアーゼ）の希釈後の最終作業濃度を表すこと、およびこの作業保存液は１倍未満の濃度を得るためにさらに希釈可能であると理解される。

【0072】

大規模製造における再現性あるビーズ間移動では一般に、例えば、プロテアーゼ前処理細胞培養物が含むプロテアーゼ阻害剤を確実に最小限とするように、または上記のようにプロテアーゼの必要性を最小限とする、かつ／または無くすように、複数回の洗浄工程を用いる。しかしながら、大規模な市販プロセスでは、これらの洗浄手順は実施にコストがかかりかねず、生産運転の支障、製造工程の非ロバスト性および生産性の低下の一因となる汚染を招くことがある。よって、本発明は、ビーズ間移動の際に細胞培養物洗浄工程を無くすことによってこれらの欠点を克服する新規な方法を提供する。

【0073】

洗浄手順の必要性を軽減する、またはさらには無くすビーズ間移動達成法としては、限定されるものではないが、第８．５節の実施例に示されている方法が挙げられる。特に、本発明者らは、プロテアーゼ処理前にキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）で前処理することで、増殖培地を除去して細胞を洗浄する必要性を無くすことができるものと確定した。さらに、新鮮培地に付加的な培地成分（例えば、二価陽イオンおよび／または微量元素）を補給することにより、プロテアーゼ処理後に細胞を洗浄する必要が無くなる。

【0074】

いくつかの実施形態では、ビーズ間移動は、プロテアーゼ（例えば、ＴｒｙｐＬＥ）を添加する前に細胞培養に直接（すなわち、細胞を洗浄することなく）キレート剤を添加することにより助長される。本発明において使用可能なキレート剤は上記されている。一実施形態では、キレート剤は二価陽イオン（例えば、Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋）をキレートすることができる。特定の実施形態では、キレート剤はＥＤＴＡである。いくつかの実施形態では、キレート剤は細胞培養に、０．５ｍＭ〜５ｍＭの間、または約０．５ｍＭ〜約４ｍＭの間、または約０．５ｍＭ〜約３ｍＭの間、または約０．５ｍＭ〜約２ｍＭの間、または約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭの間、または約０．５ｍＭ〜約１ｍＭの間、または約１ｍＭ〜約５ｍＭの間、または約１．５ｍＭ〜約５ｍＭの間、または約２．０ｍＭ〜約５ｍＭの間、または約３．０ｍＭ〜約５ｍＭの間、または約４．０ｍＭ〜約５ｍＭの間、または約１ｍＭ〜約２ｍＭの間の終濃度で添加する。特定の実施形態では、キレート剤は、細胞培養に終濃度約２ｍＭで添加する。キレート剤を添加した後に、細胞培養物をプロテアーゼの添加前に一定時間インキュベートすることができる。いくつかの実施形態では、細胞培養物を、プロテアーゼの添加前に約０分〜約１２０分の間、または約０分〜約９０分の間、または約０分〜約６０分の間、または約０分〜約３０分の間、または約３０分〜約１２０分の間、または約６０分〜約１２０分の間、または約９０分〜約１２０分の間、または約３０分〜約９０分の間、または約６０分間キレート剤とともにインキュベートする。ある実施形態では、細胞培養物はキレート剤の添加後、プロテアーゼの添加前に攪拌する。攪拌の手段、速度および時間は上記されており、当業者ならば過度な実験をしなくても至適化することができる。特定の実施形態では、細胞培養物は、プロテアーゼの添加前に、大部分の微小担体が培養容器の底に沈降しないように十分攪拌しながらキレート剤とともにインキュベートする。

【0075】

プロテアーゼの添加前に、キレートされた細胞培養物のｐＨを、例えばプロテアーゼの至適ｐＨに調整することができる。特定の実施形態では、ｐＨを約７．８〜約８．２の間に調整する。キレート剤での前処理後に使用可能なプロテアーゼは上記に詳説されている。いくつかの実施形態では、キレート剤での前処理後に細胞培養物に添加するプロテアーゼの終濃度は約０．１倍〜約０．０１２５倍の間、または約０．１倍〜約０．０１２５倍の間、または約０．１倍〜約０．０２５倍の間、または約０．１倍〜約０．０５倍の間、または約０．１倍〜約０．０７５倍の間、または約０．０７５倍〜約０．０１２５倍の間、または約０．０５倍〜約０．０１２５倍の間、または約０．０２５倍〜約０．０１２５倍の間、または約０．０７５倍〜約０．０２５倍の間である。他の実施形態では、キレート剤での前処理後に細胞培養物に添加するプロテアーゼの終濃度は約０．０９倍、または約０．０８倍、または約０．０７倍、または約０．０６倍、または約０．０５倍または、約０．０４倍、または約０．０２倍（ここで、１倍は、プロテアーゼの濃保存液（例えば、１０倍保存液として供給されるプロテアーゼ）の希釈後の最終作業濃度を表す）である。プロテアーゼ処理の時間は、細胞の解離をモニタリングすることにより決定することができ、用いるプロテアーゼの濃度によって異なり得る。細胞解離のモニタリング方法は当技術分野で公知であり、細胞培養物の顕微鏡観察が含まれる。細胞が解離したところで、必要に応じてプロテアーゼを不活性化し（例えば、ライマメトリプシン阻害剤などのプロテアーゼ阻害剤の添加による）、その後、培養物に新鮮な培地および／または微小担体ビーズを添加することができる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ処理培養物を、新鮮な培地および／または微小担体の添加前、添加中または添加後により大きな培養容器に移す。

【0076】

プロテアーゼ処理後に再接着および細胞増殖を助長するために、細胞培養物に添加する新鮮培地に、限定されるものではないが、ＣａＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２、ＭｇＳＯ_４、微量元素Ａ、ＢおよびＣを含む１以上の培地成分を補給する。また、さらなる微小担体ビーズも培養物に添加する。９０％以上の細胞が微小担体に再接着するＣａＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２およびＭｇＳＯ_４の濃度例を表２５に示す。播種４日後に細胞総数が少なくとも１．０Ｅ６細胞／ｍＬとなったＣａＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２、ＭｇＳＯ_４、微量元素Ａ、ＢおよびＣの濃度例を表２６に示す。ある実施形態では、培地に約１．２５ｍＭ〜約１．５ｍＭの間のＣａＣｌ_２、約０．１ｍＭ〜約０．２ｍＭの間のＭｇＣｌ_２、および約０．１〜約０．８ｍＭの間のＭｇＳＯ_４を補給する。他の実施形態では、培地にさらに約２倍の微量元素Ａ、ＢおよびＣを補給する。いくつかの実施形態では、元の微小担体を含む、または含まない培養物を、新鮮な補給培地および／または微小担体の添加前、添加中または添加後に、より大きな培養容器に移す。

【0077】

一実施形態では、ＭＤＣＫ細胞は培養系で接着細胞として培養する。ＭＤＣＫ細胞を培養するのに使用可能な培養系としては、例えば、バッチ培養系、および増殖を高細胞密度まで促進するために出発培地から栄養素が消耗されるにつれさらなる栄養素（例えば、炭素源、アミノ酸など）を追加する流加培養系が挙げられる。あるいは、または任意選択で、培地交換および／または消耗された栄養素の補給を助けるために灌流培養系（例えば、遠心分離、濾過、スピンフィルターなどの細胞保持系を使用）を使用してもよい。特定の実施形態では、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞は、本発明の無血清培地（例えば、ＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １１０）を用い、培地交換／補給（例えば、摂食または灌流）を行わずにバッチ培養系で接着細胞として培養される。ＭＤＣＫ細胞（例えば、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞）の接着細胞としての培養に関するさらなる指針は、例えば、米国特許出願公開第２００３／０１０８８６０号；同第２００５／０１１８１４０号；およびＰＣＴ国際公開公開第ＷＯ２００８／１０５９３１号に見出せる。ＭＤＣＫ細胞の培養に有用な慣用の培養系としては、攪拌容器バイオリアクターが挙げられる。

【0078】

６．３．３ インフルエンザウイルス培養条件
本発明は、上記で示されたような無血清培地処方物でＭＤＣＫ細胞（例えば、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞）および他の動物細胞を培養する方法を提供する。特に、さらなる培養条件も、非腫瘍形成性であること、非発癌性であること、接着細胞として増殖すること、非接着細胞として増殖すること、上皮様形態を有すること、種々のウイルスの複製を助けること、およびインフルエンザウイルス（例えば、低温適応および／または温度感受性および／または弱毒型）の増殖を高力価、例えば、少なくとも約７．８または少なくとも約８．０または少なくとも約９．０のｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０／ｍＬおよび／またはｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬまで助けることを含むＭＤＣＫ細胞の特性の維持に役割を果たし得ると考えられる。これらの培養条件としては、限定されるものではないが、接着表面の選択、細胞密度、温度、ＣＯ_２濃度、培養方法、攪拌速度、溶存酸素含量およびｐＨが挙げられる。

【0079】

特に、培養条件はＭＤＣＫ細胞（例えば、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞）の増殖を至適化するためにいくつかの方法で適合可能であると考えられる。このような適合はまた、例えば、米国特許出願公開第２００５／０１１８６９８号に記載されているように、ウイルス材料（例えば、ウイルス）の生産にも増大をもたらし得る。あるいは、培養条件は、細胞の増殖に関わらず、ＭＤＣＫ細胞からのワクチン材料の生産を至適化するように適合させることができる。これらの培養条件としては、限定されるものではないが、接着表面、細胞密度、温度、ＣＯ_２濃度、培養方法、溶存酸素含量およびｐＨが挙げられる。

【0080】

一実施形態では、ＭＤＣＫ細胞（例えば、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞）は、少なくとも１％、または少なくとも２％、または少なくとも３％、または少なくとも４％、または少なくとも５％、または少なくとも６％、または少なくとも７％、または少なくとも８％、または少なくとも９％、または少なくとも１０％、または少なくとも２０％のＣＯ_２濃度で培養する。

【0081】

一実施形態では、溶存酸素（ＤＯ）濃度（ｐＯ_２値）は有利にはＭＤＣＫの培養中に調節され、５％〜１００％（空気飽和に基づく）または１０％〜６０％の間の範囲である。特定の実施形態では、溶存酸素（ＤＯ）濃度（ｐＯ_２値）は少なくとも１０％または少なくとも２０％または少なくとも３０％または少なくとも５０％または少なくとも６０％である。特定の実施形態では、ＤＯ濃度は５０％に維持される。特定の実施形態では、ＤＯは５０％に落ちた後、そのレベルで維持される。ＤＯレベルを維持する方法としては、例えば、純粋な酸素の散布が挙げられる。

【0082】

ある実施形態では、一般には細胞培養の攪拌、特に散布は発泡を招くことがあるので、発泡を軽減するために細胞培養物に消泡剤を添加する。哺乳類細胞培養物に有用な消泡剤は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｓｉｇｍａおよびその他を含む、いくつかの商業ソースから容易に得られる。特定の消泡剤としては、限定されるものではないが、Ａｎｔｉｆｏａｍ ＣエマルションおよびＦｏａｍＡｗａｙ（商標）が挙げられる。特定の実施形態では、Ａｎｔｉｆｏａｍ Ｃエマルションは約１０ｐｐｍ〜約１０００ｐｐｍの間、または約２５ｐｐｍ〜約７５０ｐｐｍの間、または約５０ｐｐｍ〜約５００ｐｐｍの間、または約７５ｐｐｍ〜約２５０ｐｐｍの間、または約５０ｐｐｍ〜約１５０ｐｐｍの間で培養物に添加する。ある実施形態では、消泡剤は１日２回または１日１回または隔日に細胞培養物に加える。他の実施形態では、消泡剤はＭＤＣＫ細胞の添加前に培養培地に加える。

【0083】

別の実施形態では、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞の培養に用いる培養培地のｐＨは培養中に調節され、ｐＨ６．４〜ｐＨ８．０の範囲またはｐＨ６．８〜ｐＨ７．４の範囲である。特定の実施形態では、培養培地のｐＨは約６．４または約６．６または約６．８または約７．０または約７．２または約７．４または約７．６または約７．８または少なくとも８．０である。特定の実施形態では、培養培地のｐＨは約７．４である。

【0084】

さらなる実施形態では、ＭＤＣＫ細胞は本発明の無血清培地中、２５℃〜３９℃の温度で培養する。特に、培養温度は所望のプロセスによって異なり得ると考えられる。例えば、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞は細胞増殖のためには３７±２℃で、そしてワクチン材料（例えばウイルス）の生産のためにはより低い温度（例えば、２５℃〜３５℃）で増殖させることができる。別の実施形態では、ワクチン材料の生産のために、細胞を３０℃未満または３１℃未満または３２℃未満または３３℃未満または３４℃未満の温度で培養する。別の実施形態では、ワクチン材料の生産のために、細胞を３０℃または３１℃または３２℃または３３℃または３４℃の温度で培養する。特定の実施形態では、ワクチン材料の生産のために、細胞を３３±２℃の温度で培養する。

【0085】

ある実施形態では、ＭＤＣＫ細胞は攪拌容器バイオリアクター（例えば、プラスチック１回使用、ガラスまたはステンレス鋼再利用バイオリアクター）にて本発明の無血清培地中で培養し、温度、攪拌速度、ｐＨ、溶存酸素（ＤＯ）、Ｏ_２およびＣＯ_２流速からなる群から選択される１以上のパラメーターをモニタリングし、かつ／または制御する。一実施形態では、温度は約３０℃〜約４２℃の間、または約３３℃〜約３９℃の間、または約３５℃〜約３８℃の間に維持する。特定の実施形態では、温度は約３６℃〜約３８℃の間に維持する。一実施形態では、攪拌速度は約１００〜２００ｒｐｍの間に維持する。特定の実施形態では、１回使用バイオリアクターを用い、攪拌速度を約８０〜約１２０ｒｐｍの間、または約９０〜約１００ｒｐｍの間に維持する。別の特定の実施形態では、再利用バイオリアクターを用い、攪拌速度を約１５０〜約２００ｒｐｍの間、または約１６０〜約１８０ｒｐｍの間に維持する。攪拌速度は当技術分野で周知の手段によって制御する。使用するバイオリアクターのタイプおよび大きさならびに使用する回転翼のタイプおよび数は細胞増殖を最大限とし、かつ／または細胞損傷を最小限とするために攪拌速度を調整するのに必要であり得る。

【0086】

別の実施形態では、ＭＤＣＫ細胞培養物のｐＨは約６．４〜ｐＨ８．０の間に維持される。特定の実施形態では、出発培養物のｐＨは約６．８〜約７．６の間であり、培養物のｐＨは培養プロセス中、約７．０〜約７．５に維持される。最初のｐＨは所望の範囲よりも低くても高くてもよく、そのｐＨを所望のレベル（例えば、７．４）まで引き上げるか、または引き下げ、それを維持すればよい。特定の実施形態では、ｐＨは約７．４に維持される。ｐＨはＣＯ_２を散布することにより、かつ／または必要に応じて酸（例えば、ＨＣｌ）または塩基（例えば、ＮａＯＨ、ＮａＨＣＯ_３、Ｎａ_２ＣＯ_３）を添加することにより制御することができる。

【0087】

さらに別の実施形態では、ＤＯの許容範囲は約１００〜約３５％の間である。特定の実施形態では、ＭＤＣＫ細胞培養物のＤＯは約３５％〜約５０％または約５０％の間に維持される。別の特定の実施形態では、ＤＯは、約３５％未満に落とすべきである。ある実施形態では、最初のＤＯは１００％であってもよく、ＤＯは所定のレベル（例えば、５０％）まで引き下げ、それを維持する。ＤＯは例えばＯ_２を散布することによって維持される。ある実施形態では、Ｏ_２流速は約２．０Ｌ／分未満に維持する。ある実施形態では、ＣＯ_２流速は約０．４Ｌ／分未満に維持する。さらに他の実施形態では、一定の全流速を維持し（例えば、４０ｍＬ／分）、流速を維持するためにＮ_２ガスを供給する。よって、Ｎ_２ガスの供給はＤＯおよびｐＨを維持するために用いられるＯ_２ガスとＣＯ_２ガスから算出することができる。

【0088】

グルコース、グルタミン、乳酸、その他の培地成分の含量、ならびに培地のｐＨおよびｐＯ_２値および攪拌などの他のパラメーターは、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞の培養中に細胞密度および／またはウイルス生産が至適化されるように容易に維持することができる。

【0089】

６．３．４ 呼吸器合胞体ウイルス培養条件
特定の実施形態では、本明細書に記載されている細胞随伴性ウイルスに感染させる前に、一定の生細胞総数に到達するよう細胞を培養する。例えば、Ｖｅｒｏ細胞は、４ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１％ＣＤＬＣを添加したＶＰ−ＳＦＭ中、およそ３７℃で培養し、生細胞総数および細胞生存率を測定する。特定の実施形態では、細胞が一定の平均生細胞数に達した際に細胞随伴性ウイルスに感染させる。細胞をＲＳＶなど本明細書に記載されている細胞随伴性ウイルスに感染させる前に、例えば、およそ１．５×１０^８細胞／組織培養容器以上の平均生細胞数に到達させることができる。一実施形態では、細胞を本明細書に記載されている細胞随伴性ウイルスに感染させる前に、例えばＶｉ−ｃｅｌｌカウンターを用いて測定されるように、平均生細胞数およそ１×１０^６細胞／組織培養容器〜およそ１×１０^１４細胞／組織培養容器に到達させる。別の実施形態では、細胞を本明細書に記載されている細胞随伴性ウイルスに感染させる前に、例えばＶｉ−セルカウンターを用いて測定されるように、およそ１×１０^６細胞／組織培養容器、およそ５×１０^６細胞／組織培養容器、およそ１×１０^７細胞／組織培養容器またはおよそ５×１０^７細胞／組織培養容器の平均生細胞数に到達させる。別の実施形態では、細胞を本明細書に記載されている細胞随伴性ウイルスに感染させる前に、例えばＶｉ−セルカウンターを用いて測定されるように、およそ１×１０^８細胞／組織培養容器、およそ５×１０^８細胞／組織培養容器、およそ１×１０^９細胞／組織培養容器、およそ５×１０^９細胞／組織培養容器またはおよそ１×１０^１０細胞／組織培養容器の平均生細胞数に到達させる。

【0090】

選択された細胞に最適であると確定された多重感染度（ＭＯＩ）を細胞の感染に用いる。特定の実施形態では、本明細書に記載されている細胞を感染させるのに、およそ０．０００１〜およそ１、またはおよそ０．０００５〜０．００５のＭＯＩを用いる。別の実施形態では、本明細書に記載されている細胞を感染させるのに、およそ０．０００１、およそ０．０００５またはおよそ０．０００７５のＭＯＩを用いる。別の実施形態では、本明細書に記載されている細胞を感染させるのに、およそ０．００１、およそ０．００５、およそ０．００７５またはおよそ０．０１のＭＯＩを用いる。なお別の実施形態では、本明細書に記載されている細胞を感染させるのに、およそ０．０５、およそ０．０７５、およそ０．１またはおよそ０．５のＭＯＩを用いる。特定の実施形態では、Ｖｅｒｏ細胞を感染させるのに、およそ０．０１のｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨのＭＯＩを用いる。

【0091】

細胞随伴性ウイルス感染細胞は、選択された細胞系統に適当な培地および条件（例えば、温度、ＣＯ_２条件およびｐＨ）下で一定時間インキュベートすると、至適収量のウイルス力価が得られる。例えば、ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨなどのＲＳＶに感染したＶｅｒｏ細胞を、４ｍＭ Ｌ−グルタミンを添加したＳＦ４ＭｅｇａＶｉｒ培地(Invitrogen Corp., Carlsbad CA)でインキュベートし、ウイルスを回収する前におよそ３０℃でおよそ１０日間インキュベートすればよい。いくつかの実施形態では、ＲＳＶ感染細胞（例えば、ＲＳＶ感染Ｖｅｒｏ細胞）を、ウイルスを回収する前におよそ８〜１４日間インキュベートする。特定の実施形態では、ＲＳＶ感染細胞を、ウイルスを回収する前におよそ８日、好ましくは、およそ９日、およそ１０日、およそ１１日またはおよそ１２日間インキュベートする。

【0092】

本明細書に記載されている細胞随伴性ウイルス感染細胞は、当業者に知られている任意の組織培養容器で培養することができる。いくつかの実施形態では、細胞随伴性ウイルス感染細胞はＴ−７５フラスコまたはＴ−２２５フラスコで培養する。他の実施形態では、細胞随伴性ウイルス感染細胞は１リットル、２リットル、３リットル、４リットルまたは５リットル組織培養容器で培養する。特定の実施形態では、細胞随伴性ウイルス感染細胞は、作業容量５００ｍｌの回転瓶少なくとも４０本で培養する。特定の実施形態では、細胞随伴性ウイルス感染細胞を、回転瓶などの４リットルの組織培養容器で培養する。他の実施形態では、細胞随伴性ウイルス感染細胞を、１０リットル、１５リットル、２０リットルまたは２５リットルの組織培養容器で培養する。他の実施形態では、細胞随伴性ウイルス感染細胞を５０リットル、７５リットルまたは１００リットルの組織培養容器で培養する。他の実施形態では、細胞随伴性ウイルス感染細胞を２５０リットル、５００リットルまたは１０００リットルの組織培養容器で培養する。使用可能な組織培養容器としては、フラスコ、回転瓶、バイオリアクターおよび当業者に知られている他のいずれかの組織培養容器が含まれる。

【0093】

６．４ ワクチン材料の生産
本発明は、細胞培養物中でウイルスを生産するロバストな方法を提供し、ここで、ウイルスの生産にはＭＤＣＫ細胞（例えば、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞）が用いられる。特に、本発明は、培地交換または補給を行わずに、インフルエンザウイルスを高力価まで生産する方法を提供する。

【0094】

一実施形態において、インフルエンザウイルスを生産する方法は、以下の工程：
（ａ）ＭＤＣＫ細胞を無血清培養培地中で、約１００および２００ｒｐｍの間の攪拌速度、約６．０〜約７．８の間のｐＨ、約３３℃および約４２℃の間の温度、および約３５％〜約１００％の間の溶存酸素（ＤＯ）からなる群から選択される１以上の培養条件を維持しながら増殖させる工程；
（ｂ）増殖させたＭＤＣＫ細胞を、培養培地を交換することなくインフルエンザウイルスに感染させる工程；および
（ｃ）感染させた増殖ＭＤＣＫ細胞をインフルエンザウイルスの複製を可能とする条件下でインキュベートする工程
を含んでなる。

【0095】

本発明の方法により生産され得るインフルエンザウイルスは本明細書に記載されており（例えば、第６．２節および６．７節参照）、限定されるものではないが、弱毒、温度感受性、低温適応型（ｃａ／ｔｓ／ａｔｔ）マスタードナーウイルスに関して、選択された血球凝集素および／またはノイラミダーゼ抗原を組み込んだ合併結合ウイルスが挙げられる。例えば、ウイルスは、例えば、温度感受性（ｔｓ）、低温適応（ｃａ）、または弱毒型（ａｔｔ）（例えば、Ａ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０、Ｂ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／６６、ＰＲ８、Ｂ／レニングラード／１４／１７／５５、Ｂ／１４／５／１、Ｂ／ＵＳＳＲ／６０／６９、Ｂ／レニングラード／１７９／８６、Ｂ／レニングラード／１４／５５、Ｂ／イングランド／２６０８／７６など）の１以上であるマスタードナーウイルスの骨格（または１以上のｖＲＮＡセグメント）を含んでなる。卵または細胞系統のいずれかで合併結合インフルエンザワクチン株を生産する方法としては、例えば、 Kilbourne, E.D. in Vaccines (第２版), Plotkin and Mortimer編, WB Saunders Co. (1988)に開示されているものならびにＰＣＴ出願ＰＣＴ特許公報ＷＯ０５／０６２８２０およびＷＯ０３／０９１４０１、および米国特許第６，９５１，７５４号、同第６，８８７，６９９号、同第６，６４９，３７２号、同第６，５４４，７８５号、同第６，００１，６３４号、同第５，８５４，０３７号、同第５，８２４，５３６号、同第５，８４０，５２０号、同第５，８２０，８７１号、同第５，７８６，１９９号および同第５，１６６，０５７号および米国特許出願公開第２００６００１９３５０号、同第２００５０１５８３４２号、同第２００５００３７４８７号、同第２００５０２６６０２６号、同第２００５０１８６５６３号、同第２００５０２２１４８９号、同第２００５００３２０４３号、同第２００４０１４２００３号、同第２００３００３５８１４号および同第２００２０１６４７７０号に開示されているものが挙げられる。本発明の方法により生産可能な他のインフルエンザウイルスとしては、異種遺伝子産物を発現し得る組換えインフルエンザウイルスが挙げられる（例えば、米国特許公開第２００４／０２４１１３９号および同第２００４／０２５３２７３号参照）。ある実施形態では、この方法は低温適応および／または温度感受性および／または弱毒型インフルエンザウイルスを生産するために用いられる。

【0096】

特定の実施形態では、インフルエンザウイルスは、少なくとも約８．０のピークウイルス力価ｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０／ｍＬおよび／またはｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬまで生産される。他の実施形態では、インフルエンザウイルスは、少なくとも約８．１、または少なくとも８．２、または少なくとも８．３、または少なくとも８．４、または少なくとも８．５、または少なくとも８．６、または少なくとも８．７、または少なくとも８．８、または少なくとも８．９、または少なくとも９．０のピークウイルス力価ｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０／ｍＬおよび／またはｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬまで生産される。

【0097】

ある実施形態では、ＭＤＣＫ細胞は接着細胞として増殖される。特定の実施形態では、ＭＤＣＫ細胞は非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞であり、接着細胞として増殖される。別の特定の実施形態では、ＭＤＣＫ細胞はＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−６５００、ＰＴＡ−６５０１、ＰＴＡ−６５０２、ＰＴＡ−６５０３、ＰＴＡ−７９０９およびＰＴＡ−７９１０からなる群から選択され、接着細胞として増殖される。接着細胞の増殖に有用なバイオリアクターおよび方法は前記に記載されている（第６．３．２節および６．３．３節参照）。他の実施形態では、ＭＤＣＫ細胞は非接着細胞として増殖される。非接着ＭＤＣＫ細胞を増殖させる方法は当技術分野で公知である（例えば、米国特許第６，４５５，２９８号参照）。例えば、温度、攪拌速度、ｐＨ、ｐＯ_２、ＣＯ_２濃度および細胞播種密度などのさらなる培養条件は前記に詳説されている（第６．３．２節および６．３．３節参照）。

【0098】

特定の実施形態では、ＭＤＣＫ細胞は、攪拌容器バイオリアクターにて接着細胞として増殖される。この方法のある実施形態では、細胞を培養するための温度、攪拌速度、ｐＨ、ｐＯ_２値、ＣＯ_２濃度および培養培地の他のパラメーターは培養中に前記のように（第６．３．２節および６．３．３節参照）調節される。ある実施形態では、ＭＤＣＫ細胞は５×１０^５〜約３×１０^６の間の細胞密度まで増殖される。あるいは、または所望により、ＭＤＣＫ細胞は、設定された時間増殖される。最初の播種密度、倍加時間および所望の最終細胞密度は増殖時間を決定する。このような実施形態では、細胞は、例えば、１〜１０日間、または２〜８日間、または３〜７日間増殖させることができる。いくつかの実施形態では、ＭＤＣＫ細胞は約３〜約５日間増殖される。

【0099】

ある実施形態では、無血清培地は本明細書に記載されているような富化無血清培地である（第６．３．１節参照）。一実施形態では、無血清培地は植物加水分解物、脂質補給物、微量元素を含んでなり、プトレッシン、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸およびヌクレオシドからなる群から選択される１以上の培地成分で強化される。別の実施形態では、無血清培地は表３に挙げられているＭｅｄｉＶ ＳＦＭ１１０培地の全成分を含んでなる。特定の実施形態では、無血清培地は表３に挙げられているＭｅｄｉＶ ＳＦＭ１１０培地の全成分から本質的になる。別の特定の実施形態では、無血清培地は、示されている終濃度で表３に挙げられている成分からなる。ある実施形態では、無血清培地は終濃度約４．５ｇ／Ｌのグルコースを含んでなる。他の実施形態では、無血清培地は終濃度約９．０ｇ／Ｌのグルコースを含んでなる。

【0100】

細胞を感染させるのに使用可能なインフルエンザウイルス（工程（ｂ））としては、限定されるものではないが、本明細書に記載されているものが挙げられる（例えば、第６．２節および６．７節参照）。細胞を感染させるために添加するウイルスの量（本明細書では「ウイルス投入量」と呼ばれる）は、細胞当たりに添加されるウイルスの数（一般に、多重感染度またはＭＯＩとも呼ばれる）として計ることができる。いくつかの実施形態では、細胞のウイルス感染は、約０．００００１ＦＦＵ／細胞〜約１０ＦＦＵ／細胞または約０．００００１ＦＦＵ／細胞〜約１ＦＦＵ／細胞または約０．００００１ＦＦＵ／細胞〜約０．１ＦＦＵ／細胞または約０．００００１ＦＦＵ／細胞〜約０．００１ＦＦＵ／細胞のウイルス投入量を用いて行う。一実施形態では、細胞のウイルス感染は、約０．００００１ＦＦＵ／細胞〜約０．０００１ＦＦＵ／細胞または約０．００００２ＦＦＵ／細胞〜約０．０００２ＦＦＵ／細胞のウイルス投入量を用いて行う。特定の実施形態では、細胞のウイルス感染は０．００００１ＦＦＵ／細胞〜０．００００５ＦＦＵ／細胞の間のウイルス投入量を用いて行う。別の特定の実施形態では、細胞のウイルス感染は、０．０００１ＦＦＵ／細胞〜０．０００５ＦＦＵ／細胞の間のウイルス投入量を用いて行う。下式を用いてウイルスの添加量を求めることができる。

【0101】

ウイルス量（μＬ）＝全細胞×ウイルス投入量（ＦＦＵ／細胞）／１０^{Virus FFA Titer}（ＦＦＵ／ｍＬ）×１０００
あるいは、細胞の感染に用いるウイルス量（すなわち、ウイルス投入量）は、培養物中のウイルスの終濃度により決定される。例えば、ウイルスは約１×１０^３ＦＦＵ／ｍＬ〜約０．００１×１０^３ＦＦＵ／ｍＬまたは約０．１×１０^３ＦＦＵ／ｍＬ〜約０．０１×１０^３ＦＦＵ／ｍＬの終濃度で添加することができる。下式を用いて、所望の終濃度を達成するために添加するウイルスの量を求めることができる。

【0102】

ウイルス量（μＬ）＝培養容量（ｍＬ）×終濃度（ＦＦＵ／ｍＬ）／１０^{Virus FFA Titer}（ＦＦＵ／ｍＬ）×１０００
所望により、血球凝集素の前駆体タンパク質［ＨＡ_０］の切断、従って細胞へのウイルスの吸着を行うプロテアーゼを加えることもできる。プロテアーゼの添加は本発明に従い、細胞のインフルエンザウイルス感染のすぐ前、同時またはすぐ後に行うことができる。添加を感染と同時に行う場合には、プロテアーゼは感染させる細胞培養物に直接加えることができるか、またはウイルス接種物とともに濃縮物として加えることができる。プロテアーゼは、本発明のある態様では、セリンプロテアーゼまたはシステインプロテアーゼまたはアスパラギンプロテアーゼである。一実施形態では、トリプシンを用いる。特定の実施形態では、ＴＰＣＫ処理トリプシンを用いる。一実施形態では、トリプシンは細胞培養物に１〜５０００ｍＵ／ｍｌまたは５〜１０００ｍＵ／ｍｌまたは１００〜５００ｍＵ／ｍｌの終濃度まで加える。別の実施形態では、トリプシンは細胞培養物に培養培地中、１〜２００μｇ／ｍｌまたは５〜５０μｇ／ｍｌまたは５〜３０μｇ／ｍｌの終濃度まで加える。

【0103】

プロテアーゼは動物供給源に由来してもよく、またはより好ましくは、組換え供給源に由来する。使用に好適な組換えプロテアーゼは、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＴｒｙｐＬＥ（商標））およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ＴｒｙｐＺｅａｎ（商標））を含むいくつかの商業ソースから保存溶液（例えば１Ｘ−１００Ｘ）として容易に得られる。ある実施形態では、組換えプロテアーゼは約０．０１倍〜約１倍の間、または約０．０２倍〜約０．８倍の間、または約０．０３倍〜約０．７倍の間、または約０．０４倍〜約０．６倍の間、または約０．０５倍〜約０．５倍の間、または約０．０６倍〜約０．４倍の間、または約０．０７倍〜約０．３倍の間、または約０．８倍〜および約０．２倍の間の終濃度で用いる。特定の実施形態では、組換えプロテアーゼは約０．０２倍〜約０．０６倍の間の終濃度で用いる。別の実施形態では、プロテアーゼは、限定されるものではないが、ＴｒｙｐＬＥ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む組換えトリプシン様プロテアーゼである。さらに別の実施形態では、プロテアーゼは、米国特許出願第１１／４５５，８１８号に記載されているようなストレプトミセス・グリセウス(Streptomyces griseus)由来のものである。

【0104】

感染後、感染細胞培養物は、特に、最大細胞変性効果または最大量のウイルスまたは抗原が検出できるまで、さらに培養してウイルスを複製させる。一実施形態では、感染後、細胞を３０℃〜３７℃の間の温度で培養する。ある実施形態では、ウイルス感染後、細胞を３９℃未満または３８℃未満または３７℃未満または３６℃未満または３５℃未満また３４℃未満または３３℃未満または３２℃未満または３１℃未満または３０℃未満の温度で培養する。感染細胞を３３℃未満の温度、特に、示された温度範囲で培養すると、例えばＢ株（例えば、米国特許公開２００６／０１５３８７２参照）などのある特定のインフルエンザウイルスのより高い収量生産がもたらされる。さらに、温度感受性、低温適応型（ｔｓ／ｃａ）インフルエンザウイルスの生産のためには、感染細胞を３５℃未満の温度で培養することが意図される。ｔｓ／ｃａウイルスは弱毒（ａｔｔ）でもあり得ると考えられる。別の実施形態では、ｔｓ／ｃａインフルエンザ株の生産のために、細胞を３０℃未満または３１℃未満または３２℃未満または３３℃未満または３４℃未満の温度で培養する。特定の実施形態では、インフルエンザウイルスＢ株の生産のために、細胞を３１℃の温度で培養する。さらに別の実施形態では、感染後、細胞を３１±２℃の温度で培養する。

【0105】

ある実施形態では、細胞のインキュベーション（工程（ｃ））は、感染後２〜１０日または所望により３〜７日など、好適なウイルス収量を生産するのに十分な期間行う。この方法の一実施形態では、細胞のインキュベーション（工程（ｃ））は、感染後２日間または３日間または４日間または５日間または６日間または７日間行う。他の実施形態では、細胞のインキュベーション（工程（ｃ））は感染後４０〜９６時間行う。特定の実施形態では、細胞のインキュベーション（工程（ｃ））は感染後約４８〜約７２時間行う。

【0106】

この方法のある実施形態では、ウイルス感染（工程（ｂ））後、細胞を例えば攪拌速度、ｐＨ、ｐＯ_２値、ＣＯ_２濃度および他のパラメーターが前記（第６．３．２節および６．３．３節）のように維持されるようにインキュベートする。

【0107】

ある実施形態では、この方法は工程（ｃ）の後に、複製ウイルス含有培養培地（すなわち、感染細胞が増殖された培養培地）を回収する工程をさらに含んでなる。この回収された複製ウイルス含有培養培地はまた本明細書において「ウイルス回収物」とも呼ばれる。

【0108】

一実施形態では、ＭＤＣＫ細胞の増殖に用いた微小担体は、複製ウイルス含有培養培地を回収する前に沈降させる。所望により、またはあるいは、複製ウイルス含有培養培地は交互低剪断型タンジェントフロー（ＡＴＦ）デバイス（例えば米国特許第６，５４４，４２４号参照）を用いて回収することができる。ＡＴＦデバイスを用いることで、回収前に微小担体を沈降させるのに必要な時間を短縮されるか、またはさらには無くなる。別の実施形態では、ウイルス回収物は好適なバッファーで安定化させる。

【0109】

特定の実施形態では、ウイルス回収物は、限定されるものではないが、スクロースリン酸（ＳＰ）バッファー（安定化されるウイルス回収物中、約２１８ｍＭスクロース、１１ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０〜７．４の終濃度が得られるように加えればよい）を含む濃バッファーを加えることによって安定化させる。

【0110】

別の特定の実施形態では、複製ウイルス含有培養培地を回収する工程を複製ウイルスの精製と組み合わせる。例えば、交互タンジェントフロー（ＡＴＦ）を用いて複製ウイルス含有培養培地を回収してもよく、回収された材料に対して直接、以下に詳説される１以上の精製工程を行ってもよい。

【0111】

６．５ ワクチン材料の精製
本発明は、ウイルス、特に、細胞培養で複製された臨床用の生ウイルスの精製のためのロバストな方法を提供する。本発明の精製方法は、限定されるものではないが、ヒト二倍体肺繊維芽細胞系統（例えば、ＭＲＣ−５およびＷＩ−３８）、ヒト網膜芽細胞腫細胞系統、ヒト腎臓細胞系統（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６および２９３）、アカゲザル胎児肺細胞系統（例えば、ＦＲｈＬ２）、アフリカミドリザル腎臓細胞系統（例えば、Ｖｅｒｏ）およびイヌ腎臓細胞系統（例えば、ＭＤＣＫ）を含む哺乳類細胞の培養物からウイルスを精製するために使用可能である。本発明の精製方法はウイルス、特に、生ウイルスの高い総回収率を与え、規制機関により要求される明細を下回る宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣＤ）、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）および非特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、ベンゾナーゼ）レベルが得られる。

【0112】

ウイルス調製物からＨＣＤ量を低減することは、動物（ヒトを含む）における臨床使用が意図されるウイルスには特に重要である。さらに、発癌の可能性を軽減するためには、残留ＨＣＤのサイズは癌遺伝子の平均サイズ（１，９２５塩基対）よりも小さくなければならないと考えられる。よって、一態様において本発明は、残留ＨＣＤの量およびサイズを注射用ワクチンに許容されるレベル（ＷＨＯの推奨は非経口投与ワクチンでは１用量当たり１０ｎｇである；Griffiths, 1999, Dev Biol Stand. Basel, Karger, vol 98, pp 153-157）を下回るレベルにまで低減するインフルエンザウイルスまたはＲＳＶの精製方法を提供する。

【0113】

ある実施形態では、含まれる精製ウイルスは、約１０ｎｇＨＣＤ／用量未満、または約９ｎｇＨＣＤ／用量未満、または約８ｎｇＨＣＤ／用量未満、または約７ｎｇＨＣＤ／用量未満、または約６ｎｇＨＣＤ／用量未満、または約５ｎｇＨＣＤ／用量未満、または約４ｎｇＨＣＤ／用量未満、または約３ｎｇＨＣＤ／用量未満、または約２ｎｇＨＣＤ／用量未満、または約１ｎｇＨＣＤ／用量未満、または約０．８ｎｇＨＣＤ／用量未満、または約０．６ｎｇＨＣＤ／用量未満、または約０．４ｎｇＨＣＤ／用量未満、または約０．２ｎｇＨＣＤ／用量未満を含んでなる。特定の実施形態では、精製ウイルスは、約１ｎｇＨＣＤ／用量未満、または約０．８ｎｇＨＣＤ／用量未満、または約０．６ｎｇＨＣＤ／用量未満、または約０．４ｎｇＨＣＤ／用量未満、または約０．２ｎｇＨＣＤ／用量を含んでなる。

【0114】

他の実施形態では、含まれる精製ウイルスはインフルエンザウイルスであり、約１０ｎｇＨＣＤ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約９ｎｇＨＣＤ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約８ｎｇＨＣＤ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約７ｎｇＨＣＤ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約６ｎｇＨＣＤ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約５ｎｇＨＣＤ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約４ｎｇＨＣＤ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約３ｎｇＨＣＤ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約２ｎｇＨＣＤ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約１ｎｇＨＣＤ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約０．８ｎｇＨＣＤ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約０．６ｎｇＨＣＤ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約０．４ｎｇＨＣＤ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約０．２ｎｇＨＣＤ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満を含んでなる。特定の実施形態では、精製ウイルスは約１ｎｇＨＣＤ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約０．８ｎｇＨＣＤ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約０．６ｎｇＨＣＤ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約０．４ｎｇＨＣＤ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約０．２ｎｇＨＣＤ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満を含んでなる。

【0115】

一実施形態では、ＨＣＤの量はＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイを用いて測定する。別の実施形態では、ＨＣＤの量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｒｔＰＣＲ）を用いて測定する。これらのアッセイは第８．６節に示される実施例に例示されている方法を用いて行えばよい。

【0116】

ある実施形態では、精製ウイルス中に存在するＨＣＤの少なくとも約５０％または少なくとも約６０％または少なくとも約７０％または少なくとも約８０％が約１０００塩基対（ｂｐ）未満の長さである。特定の実施形態では、精製ウイルス中に存在する少なくとも約８０％のＨＣＤが約１０００ｂｐ未満の長さである。別の特定の実施形態では、精製ウイルス中に存在する約９０％のＨＣＤが約１０００ｂｐ未満の長さである。他の実施形態では、精製ウイルス中に存在するＨＣＤの少なくとも約４０％または少なくとも約５０％または少なくとも約６０％または少なくとも約７０％または少なくとも約８０％が約５００ｂｐ未満の長さである。特定の実施形態では、精製ウイルス中に存在するＨＣＤの少なくとも約６０％が約５００ｂｐ未満の長さである。

【0117】

いくつかの実施形態では、精製ウイルスは、約１０μｇＨＣＰ／用量未満、または約９μｇＨＣＰ／用量未満、または約８μｇＨＣＰ／用量未満、または約７μｇＨＣＰ／用量未満、または約６μｇＨＣＰ／用量未満、または約５μｇＨＣＰ／用量未満、または約４μｇＨＣＰ／用量未満、または約３μｇＨＣＰ／用量未満、または約２μｇＨＣＰ／用量未満、または約１μｇＨＣＰ／用量未満、または約０．８μｇＨＣＰ／用量未満、または約０．６μｇＨＣＰ／用量未満、または約０．４μｇＨＣＰ／用量未満、または約０．２μｇＨＣＰ／用量未満を含んでなる。特定の実施形態では、精製ウイルスは、約１ｎｇＨＣＰ／用量未満、または約０．８μｇＨＣＰ／用量未満、または約０．６μｇＨＣＰ／用量未満、または約０．４μｇＨＣＰ／用量未満、または約０．２μｇＨＣＰ／用量未満を含んでなる。

【0118】

他の実施形態では、精製ウイルスはインフルエンザウイルスであり、約１０μｇＨＣＰ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約９μｇＨＣＰ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約８μｇＨＣＰ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約７μｇＨＣＰ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約６μｇＨＣＰ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約５μｇＨＣＰ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約４μｇＨＣＰ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約３μｇＨＣＰ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約２μｇＨＣＰ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約１μｇＨＣＰ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約０．８μｇＨＣＰ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約０．６μｇＨＣＰ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約０．４μｇＨＣＰ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約０．２μｇＨＣＰ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満を含んでなる。特定の実施形態では、精製ウイルスは約１ｎｇＨＣＰ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約０．８μｇＨＣＰ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約０．６μｇＨＣＰ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約０．４μｇＨＣＰ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満、または約０．２μｇＨＣＰ／７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満を含んでなる。

【0119】

一実施形態では、ＨＣＰの量は、検出のためのＨＣＰに対する抗体を用い、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定する。このアッセイは第８．６節に示される実施例に例示されている方法を用いて行えばよい。

【0120】

ワクチン組成物用の不活性／非統合型ウイルス粒子の調製方法は当業者に周知であり、４０年以上用いられている。しかしながら、これらの方法にはホルムアルデヒド洗剤による処理などの過酷な工程が組み込まれており、一般に完全なウイルス粒子、特に生きている弱毒ウイルスの調製には使用できない。よって、本発明は、ウイルス回収物からＨＣＤおよびＨＣＰを十分分離する膜および条件を用いて完全な生ウイルス（例えば、インフルエンザウイルスまたはＲＳＶ）を精製する方法を提供する。本発明の方法は生ウイルスの高い総回収率を与える。一実施形態では、精製ウイルスの総回収率は少なくとも１５％または少なくとも２０％または少なくとも２５％または少なくとも３０％または少なくとも４０％または少なくとも５０％または少なくとも６０％または少なくとも７０％である。精製生ウイルスの回収率をモニタリングする方法としては、ウイルス感染および／または増殖を測定すべく設計されたアッセイが含まれる。精製生インフルエンザウイルスの回収率をモニタリングするために、例えば、フォーカル蛍光アッセイおよび５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ_５０）アッセイを使用することができる。ある実施形態では、本発明のウイルス精製方法は少なくとも３０％の総ウイルス回収率を与え、精製ウイルスは、ウイルス７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ当たり０．１ｎｇ未満のＨＣＤ、０．３μｇ未満のＨＣＰおよび０．００５０ｎｇ未満の非特異的ヌクレアーゼを含んでなる。

【0121】

ウイルス回収物の精製には複数の工程が含まれ、ウイルスおよび精製条件に応じて至適化することができる。ある実施形態では、精製プロセスは、ａ）ウイルス回収物の清澄化；ｂ）濃縮および／またはバッファー交換；ｃ）クロマトグラフィーによる精製、およびｄ）無菌濾過のいずれかを単独でまたは組み合わせて含んでなり得る。これらの工程は非特異的エンドヌクレアーゼによる処理およびウイルス回収率またはウイルス量の安定化などのさらなる工程を含んでなってもよい。これらの工程は精製プロセスにおいて複数回、上記のようにＨＣＰおよびＨＣＤを十分除去しつつウイルス回収率を最大にする順序で行うことができる。

【0122】

ウイルス回収物の清澄化に有用な方法としては、限定されるものではないが、遠心分離、透析および膜濾過（限定されるものではないが、シングルパス、デッドエンド、濾過媒体に直接液体が流れるダイレクトフロー濾過（ＤＦＦ）、および膜表面の接線に（沿って）液体が流れるクロスフローまたはタンジェントフロー濾過（ＴＦＦ）などの方法が含まれる）が挙げられる。ＴＦＦ系は、一定の濾液流速（しばしば単に「フラックス」と呼ばれ、時間当たりの、膜１平方メートル当たりの透過液のリットル（ＬＭＨ）として測定することができる）を維持するよう、または一定の膜間差圧（「ＴＭＰ」と略され、１平方インチ当たりのポンド（ｐｓｉ）として測定することができる）を維持するように行うことができる。しかしながら、膜の汚損を防ぐためには、一定のフラックスおよびＴＭＰのいずれかを調節すればよい。濾過適用に用いる膜は商業ソースから入手可能である。

【0123】

当技術分野では、担体液から除去する材料のサイズによって定義される膜のカテゴリーとして４つのものが一般に認知されている。それらには最小孔径から最大孔径まで、逆浸透圧膜、ナノフィルトレーション膜、限外濾過膜および精密濾過膜がある。上述の膜による濾過は、特定の孔径を有する膜を用いることで分子をそれらの分子量に従って分離する。例えば、０．００１マイクロメートル未満の孔径を有する逆浸透圧膜を用いた分離は、２００ダルトン未満の分子量を有する分子を分離するために意図される。０．００１〜０．００８マイクロメートルの孔径を有するナノフィルトレーション膜を用いた濾過は、２００ダルトン〜１５キロダルトン（ｋＤａ）（含む）の分子量を有する分子を分離するために意図される。０．００５〜０．１マイクロメートル（含む）の孔径を有する限外濾過膜を用いた濾過は、５ｋＤａ〜３００ｋＤａ（含む）の分子量を有する分子を分離するために意図される。０．０５〜３．０マイクロメートル（含む）の孔径を有する精密濾過膜を用いた濾過は、１００ｋＤａ〜３０００ｋＤａ、またそれを超える分子量を有する分子を分離するために意図される。よって、膜濾過は、膜の孔径により決定される特定の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する膜を使用することによるサイズ排除に基づいて目的の分子（例えばウイルス）を他の細胞成分から分離することができる。ＭＷＣＯ（公称分子量限界（ＮＭＷＬ）または公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）とも呼ばれる）は、膜による濾過に関するキロダルトンサイズ表示である。ＭＷＣＯは膜によって９０％保持される分子の分子量として定義される。例えば、同じ分子量の分子でも形状が著しく異なる場合があるので、ＭＷＣＯは厳密な尺度ではないが、やはり有用な尺度であり、フィルター生産業者によって一般に用いられている。膜はフラットシートとして用いてもよいし、またはらせん状に巻いた形で用いてもよい。また、濾過方法のタイプに応じて中空繊維を用いてもよい。限定されるものではないが、再生セルロース、ポリエーテルスルホン（その固有の疎水性を変えるために修飾されていてもされていなくてもよい）、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）およびセラミックと金属酸化物の凝集物、ならびにポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレンおよびＰＴＦＥ（テフロン（登録商標））を含む、可能性のあるいくつの膜材料を用いてもよい。分離において濾過方法と膜のタイプの組合せを用いてもよく、分離膜を含んでなるフィルター、カラムなどの能力は処理する材料の容量および／または濃度に応じて調整されると考えられる。

【0124】

濃縮および／またはバッファー交換に有用な方法としては、限定されるものではないが、透析、限外濾過（ＵＦ）およびダイアフィルトレーション（ＤＦ）が挙げられる。ＴＦＦには、濃縮に使用可能なＵＦとバッファー交換に使用可能なＤＦの双方を組み込むことができる。さらに、ＵＦおよび／またはＤＦを使用することで、膜を通して、夾雑物であり得るより小さな分子を洗浄し、保持液中により大きな目的分子を残す分画プロセスによるさらなる精製が得られる。よって、ＵＦおよび／またはＤＦを組み込んだＴＦＦは、濃縮および／またはバッファー交換および／または精製に使用可能である。濾過適用に用いる膜の選択は上記されている。本発明によれば、ＤＦは不連続または連続ＤＦのいずれであってもよい。不連続ＤＦでは、溶液が濃縮され、失われた容量が新しいバッファーに置き換わる。連続ＤＦでは、古いバッファー溶液が除去されるととともに新しいバッファー溶液が流入することで溶液量が維持される。

【0125】

ある実施形態では、清澄化されたウイルスは約２倍または約３倍または約４倍または約５倍または約６倍または約７倍または約８倍または約９倍または約１０倍またはそれを超えて濃縮される（ここで、「倍」は操作に加えられた総出発容量／最終保持液容量に相当する）。特定の実施形態では、清澄化されたウイルスは約３倍〜約５倍の間に濃縮される。別の特定の実施形態では、清澄化されたウイルスは約４倍に濃縮される（ここで、「倍」は操作に加えられた総出発容量／最終保持液容量に相当する）。ある実施形態では、清澄化されたウイルスは、その後の全ての精製工程の付加量を増すために約１０倍以上濃縮される。ある実施形態では、濃縮後に約１ダイアボリュームまたは約２ダイアボリュームまたは約３ダイアボリュームまたは約４ダイアボリュームまたは約５ダイアボリュームまたは約６ダイアボリュームまたは約７ダイアボリュームまたは約８ダイアボリュームまたは約９ダイアボリュームまたは約１０ダイアボリュームまたはそれを超えるダイアボリュームのバッファーがＤＦにより交換される（ここで、ダイアボリュームは、ＤＦ中に操作に導入された総バッファー容量／保持液容量である）。特定の実施形態では、約４ダイアボリューム〜約６ダイアボリュームの間のバッファーが交換される（ここで、ダイアボリュームは、ＤＦ中に操作に導入された総バッファー容量／保持液容量である）。別の特定の実施形態では、約５ダイアボリュームのバッファーが交換される（ここで、ダイアボリュームは、ＤＦ中に操作に導入された総バッファー容量／保持液容量である）。

【0126】

ある実施形態では、ウイルス（例えば、インフルエンザ、ＲＳＶ）を含んでなる保持液は、所望の容量のバッファーが交換された後に収集される。保持液の収集後、いくらかのウイルスが膜に弱く結合したままとなる場合がある。よって、いくつかの実施形態では、収集された保持液にさらなる交換バッファーを加えて膜をすすぐ。収集された保持液はまた、本発明において「馴化ウイルス負荷(conditioned viral load)」または「＃ＸＵＦ＃ＸＤＦ」（ここで、「＃」は、それぞれＵＦプロセスおよびＤＦプロセスに関する濃縮倍率または交換されたバッファーのダイアボリューム数を示す）とも呼ばれる。特定の実施形態では、５００ｋＤａのＭＷＣＯを有する膜を濃縮およびバッファー交換に用いる。いくつかの実施形態では、プロセスの後に膜を洗浄して再利用することができる。他の実施形態では、清澄化ウイルスのバッチごとに新しい膜を用いる。別の特定の実施形態では、清澄化された回収物を、第８．６節および８．６．３節に示される実施例に例示されているように濃縮およびバッファー交換する。

【0127】

ウイルス（例えば、インフルエンザまたはＲＳＶ）の精製に有用なクロマトグラフィーのタイプとしては、限定されるものではないが、アフィニティークロマトグラフィーならびにイオン交換クロマトグラフィーおよび／またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが挙げられる。ある実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーを用いる。一実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いる。別の実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィーを高ｐＨで行う。一実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いる。特定の実施形態では、強力な第四級アンモニウム（Ｑ）陰イオン交換体を用いる（例えば、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｑ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。別の実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィーを低ｐＨで行う。イオン交換クロマトグラフィーに有用な陰イオン媒体としては、限定されるものではないが、陰イオン膜吸収体（例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ１５、Ｄ１５）および陽イオン膜吸収体（例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｓ１５およびＣ１５）が挙げられる。別の実施形態では、不純物が陰イオンまたは陽イオン交換により結合され、その後、ウイルスが宿主細胞タンパク質および／または核酸などの不純物から分離または精製されるネガティブクロマトグラフィーを用いる。クロマトグラフィーはバッチプロセスで行うこともできるし、あるいはカラムプロセスを用いて行うこともできると考えられる。ある実施形態では、馴化ウイルス負荷はカラムクロマトグラフィーにより精製される。

【0128】

夾雑ＨＣＤの効率的除去に有用な方法は、精製プロセスの他の工程とともに、非特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、ベンゾナーゼ（登録商標））による処理を含む。しかしながら、動物（ヒトを含む）における臨床使用を意図するウイルスでは、最終精製ウイルス中の非特異的エンドヌクレアーゼの量が最小であることが望ましい。よって、別の態様において、本発明は、本方法で用いられる残留非特異的エンドヌクレアーゼの量を注射用ワクチンに許容されるレベルを下回るレベルに低減するウイルス精製方法を提供する。

【0129】

一実施形態では、精製ウイルスは、１用量当たり約０．００６０ｎｇ未満、または約０．００５５ｎｇ未満、または約０．００５０ｎｇ未満、または約０．００４５ｎｇ未満、または約０．００４０ｎｇ未満、または約０．００３５ｎｇ未満、または約０．００３０ｎｇ未満、または約０．００２５ｎｇ未満、または約０．００２０ｎｇ未満、または約０．００１５ｎｇ未満、または約０．００１０ｎｇ未満の非特異的エンドヌクレアーゼを含んでなる。特定の実施形態では、精製ウイルスは、１用量当たり約０．００４０ｎｇ未満、または約０．００３５ｎｇ未満、または約０．００３０ｎｇ未満、または約０．００２５ｎｇ未満の非特異的エンドヌクレアーゼを含んでなる。

【0130】

他の実施形態では、精製ウイルスはインフルエンザウイルスまたはＲＳＶであり、７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ当たり約０．００６０ｎｇ未満、または約０．００５５ｎｇ未満、または約０．００５０ｎｇ未満、または約０．００４５ｎｇ未満、または約０．００４０ｎｇ未満、または約０．００３５ｎｇ未満、または約０．００３０ｎｇ未満、または約０．００２５ｎｇ未満、または約０．００２０ｎｇ未満、または約０．００１５ｎｇ未満、または約０．００１０ｎｇ未満の非特異的エンドヌクレアーゼを含んでなる。特定の実施形態では、精製ウイルスはインフルエンザウイルスまたはＲＳＶであり、７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ当たり約０．００４０ｎｇ未満、または約０．００３５ｎｇ未満、または約０．００３０ｎｇ未満、または約０．００２５ｎｇ未満の非特異的エンドヌクレアーゼを含んでなる。別の特定の実施形態では、精製ウイルスはＲＳＶであり、５．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ当たり約０．００４０ｎｇ未満、または約０．００３５ｎｇ未満、または約０．００３０ｎｇ未満、または約０．００２５ｎｇ未満の非特異的エンドヌクレアーゼを含んでなる。さらに別の特定の実施形態では、非特異的エンドヌクレアーゼはベンゾナーゼ（登録商標）である。

【0131】

無菌性は、動物（ヒトを含む）における臨床使用を意図するウイルスおよび／またはウイルス成分では特に重要である。よって、本発明のウイルス（例えば、インフルエンザまたはＲＳＶ）精製方法には、最終濾過工程として行うことができる（例えば、ＲＳＶ）、または既知の除菌を用いた（例えば、インフルエンザウイルス）、除菌が組み込まれている。ワクチン成分（例えばウイルス、送達デバイスなど）の除菌に有用な方法としては、限定されるものではないが、照射、濾過、化学処理および他の好適な手順が含まれる。一実施形態では、処方されたウイルスバルクは濾過により除菌される。除菌に有用な濾過方法としては、限定されるものではないが、上記されているシングルパス、デッドエンド、ダイレクトフロー濾過（ＤＦＦ）およびタンジェントフロー濾過（ＴＦＦ）が挙げられる。しかしながら、ＲＳＶは脆弱であるため、このウイルスは除菌グレードのフィルターを用いて除菌することができない。従って、一実施形態では、ＲＳＶは本明細書に記載されている精製プロセスの最終濾過工程の一部として除菌される。

【0132】

本明細書では、ワクチン処方物用のＨインフルエンザウイルスおよびＲＳＶを精製するための特定の方法を提供する。

【0133】

６．５．１インフルエンザウイルスの精製
ある実施形態では、精製されるウイルスはインフルエンザウイルス（例えば、低温適応および／または温度感受性および／または弱毒型）である。

【0134】

一実施形態において、細胞培養物からウイルスを精製する方法は以下の工程：
（ａ）ウイルス回収物の清澄化；
（ｂ）工程（ａ）後の濃度および／またはバッファー交換；
（ｃ）工程（ｂ）後のクロマトグラフィーによる精製；
（ｄ）工程（ｃ）後の濃縮および／またはバッファー交換；
（ｅ）工程（ｄ）後の除菌
を含んでなる。

【0135】

一実施形態では、ウイルスはインフルエンザウイルスである。特定の実施形態では、インフルエンザウイルスは低温適応および／または温度感受性および／または弱毒型インフルエンザウイルスである。

【0136】

特定の実施形態では、工程（ａ）、（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）は膜濾過により行う。別の特定の実施形態では、工程（ｂ）および（ｄ）はタンジェントフロー濾過により行う。さらに別の特定の実施形態では、工程（ａ）および（ｅ）はダイレクトフロー濾過により行う。さらに別の特定の実施形態では、工程（ｂ）は限外濾過による濃縮およびダイアフィルトレーションによるバッファー交換の双方を含む。さらに別の特定の実施形態では、工程（ｄ）は濃縮のみを含む。ウイルス精製方法のさらなる実施形態は以下に詳説する。

【0137】

特定の一実施形態では、工程（ｃ）はアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより行う。別の特定の実施形態では、工程（ｃ）にはさらに非特異的ヌクレアーゼによる処理が組み込まれる。

【0138】

上記のように、細胞培養物から得られたウイルスは、回収後に安定化させることができる（例えば、スクロースリン酸（ＳＰ）の添加による）。よって、本発明の精製方法は安定化されたウイルス回収物の清澄化を包含する。あるいは、回収および清澄化工程を組み合わせることができる。例えば、ＡＴＦを用いれば、ウイルスが複製された細胞培養物を回収し、ウイルスの清澄化に用いる媒体および／またはデバイスに直接ウイルス回収物を送り込むことができる。

【0139】

例えば、まず、感染培養物からの未精製培地を、例えば１０００〜２０００ｘｇで、細胞残渣および他の大きな粒子物質を除去するのに十分な時間、例えば、１０〜３０分の間遠心分離することにより清澄化することができる。あるいは、培地を、完全な細胞および他の大きな粒子物質を保持しつつウイルスを通すのに十分な大きなの所定の孔径範囲の半透膜で濾過する。

【0140】

一実施形態では、ウイルス回収物は、ウイルスを通すのに十分大きく、完全な細胞および細胞残渣を保持するのに十分小さい孔径を有するＭＦ膜を用いたＤＦＦおよび／またはＴＦＦにより清澄化される。一実施形態では、ウイルス回収物は、約１．２マイクロメートル以下の孔径を有する少なくとも１つの膜を通過させるＤＦＦおよび／またはＴＦＦにより清澄化される。特定の実施形態では、ウイルス回収物は、約１．２マイクロメートル〜約０．４５マイクロメートルの間の孔径を有する少なくとも１つの膜を通過させるＤＦＦにより清澄化される。別の特定の実施形態では、ウイルス回収物は、１．２マイクロメートルの孔径を有する第一の膜と０．４５マイクロメートルの孔径を有する第二の膜を通過させるＤＦＦにより清澄化される。ある実施形態では、ポリプロピレンおよび／またはＰＶＤＦ膜を用いる。さらに別の特定の実施形態では、ウイルス回収物は、第８．６節に示される実施例に例示されているＤＦＦにより清澄化される。さらに別の特定の実施形態では、ウイルスが複製された細胞培養物の回収をＤＦＦ工程と組み合わせる。例えば、ウイルスが複製された細胞培養物を回収し、ＤＦＦに用いる媒体およびデバイスに直接適用する。回収工程と清澄化工程を組み合わせることで、操作数が減り、回収タンクの必要が無くなり、総プロセス時間が短縮される。

【0141】

一実施形態では、清澄化された回収物を濃縮し、かつ／またはバッファー交換を行う。一実施形態では、濃縮および／またはバッファー交換はＵＦおよびＤＦにより行う。別の実施形態では、ＵＦおよびＤＦの双方にＴＦＦを用いる。なお別の実施形態では、ウイルスが複製された細胞培養物の回収は、ＴＦＦ工程と組み合わせたＤＦＦ工程と組み合わせる。回収、清澄化および濃縮／バッファー交換工程を組み合わせることで、操作数が減り、総プロセス時間が短縮される。ある実施形態では、一定の濾液流速を維持するためにＴＦＦを行う。他の実施形態では、一定のＴＭＰを維持するためにＴＦＦを行う。ある実施形態では、清澄化されたウイルスはまずＵＦにより濃縮し、その後、ＤＦによりバッファー交換を行う。ある実施形態では、清澄化されたウイルスは、約２倍または約３倍または約４倍または約５倍または約６倍または約７倍または約８倍または約９倍または約１０倍またはそれを超えて濃縮される（ここで、「倍」は、操作に加えられた総出発容量／最終保持液容量に相当する）。特定の実施形態では、清澄化されたウイルスは約３倍〜約５倍の間に濃縮される。別の特定の実施形態では、清澄化されたウイルスは約４倍に濃縮される（ここで、「倍」は、操作に加えられた総出発容量／最終保持液容量に相当する）。ある実施形態では、清澄化されたウイルスは、その後の全ての精製工程の付加量を増すために約１０倍以上濃縮される。ある実施形態では、濃縮後に、約１ダイアボリュームまたは約２ダイアボリュームまたは約３ダイアボリュームまたは約４ダイアボリュームまたは約５ダイアボリュームまたは約６ダイアボリュームまたは約７ダイアボリュームまたは約８ダイアボリュームまたは約９ダイアボリュームまたは約１０ダイアボリュームまたはそれを超えるダイアボリュームのバッファーがＤＦにより交換される（ここで、ダイアボリュームは、ＤＦ中に操作に導入された総バッファー容量／保持液容量である）。特定の実施形態では、約４ダイアボリューム〜約６ダイアボリュームの間のバッファーが交換される（ここで、ダイアボリュームは、ＤＦ中に操作に導入された総バッファー容量／保持液容量である）。別の特定の実施形態では、約５ダイアボリュームのバッファーが交換される（ここで、ダイアボリュームは、ＤＦ中に操作に導入された総バッファー容量／保持液容量である）。交換バッファーはウイルス回収物中に存在するものと同じであっても異なっていてもよいと考えられる。一実施形態では、交換バッファーは中性ｐＨのＳＰバッファーである。特定の実施形態では、交換バッファーは、（１以上の成分について１０％の変動の範囲内で）２１８ｍＭスクロース、１１ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０〜７．４を含んでなる。別の特定の実施形態では、交換バッファーは（１以上の成分について１０％の変動の範囲内で）２１８ｍＭスクロース、１１ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０〜７．４からなる。ある実施形態では、ウイルス（例えば、インフルエンザ）を含んでなる保持液は、所望の容量のバッファーが交換された後に収集される。保持液の収集物後、いくらかのウイルスが膜に弱く結合したままとなる場合がある。よって、いくつかの実施形態では、収集された保持液にさらなる交換バッファーを加えて膜をすすぐ。収集された保持液はまた、本発明において「馴化ウイルス負荷」または「＃ＸＵＦ＃ＸＤＦ」（ここで、「＃」は、それぞれＵＦプロセスおよびＤＦプロセスに関する濃縮倍率または交換されたバッファーのダイアボリューム数を示す）とも呼ばれる。特定の実施形態では、５００ｋＤａのＭＷＣＯを有する膜を濃縮およびバッファー交換に用いる。いくつかの実施形態では、プロセスの後に膜を洗浄して再利用することができる。他の実施形態では、清澄化ウイルスのバッチごとに新しい膜を用いる。別の特定の実施形態では、清澄化された回収物を、第８．６節および８．６．３節に示される実施例に例示されているように濃縮およびバッファー交換する。

【0142】

ある実施形態では、馴化ウイルス負荷をクロマトグラフィーにより精製する。ある実施形態では、馴化ウイルス負荷をカラムクロマトグラフィーにより精製する。いくつかの実施形態では、馴化ウイルス負荷をアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。類似の分離特性を有する種々のアフィニティークロマトグラフィー媒体が利用可能であり、例えば、いくつかのウイルスおよびウイルスタンパク質の濃縮および精製のために、限定されるものではないが、Ｎ（ｐ−アミノフェニル）オキサム酸アガロース、セルファイン（商標）サルフェイトを含む多くのアフィニティークロマトグラフィー媒体が利用可能である。親和性リガンドの性能の評価に有用な方法は、実施例８．７に例示されている。特定の実施形態では、セルファイン（商標）サルフェイト（Ｃｈｉｓｓｏ Ｃｏｒｐ．）アフィニティー媒体をアフィニティークロマトグラフィーに用いる。別の実施形態では、ＦｌｕＳｅｌｅｃｔ（商標）をアフィニティークロマトグラフィーに用いる。さらに別の実施形態では、アフィニティー媒体の結合リガンドは硫酸部分を含んでなる。ある実施形態では、馴化ウイルス負荷をアフィニティー媒体上に直接付加する。ある実施形態では、さらなるウイルスの結合を促進するために、結合していない材料をアフィニティー媒体に通してもよい。

【0143】

一実施形態では、アフィニティー媒体１ｍｌ当たり約１０^９．０〜約１０^１１の間、または約１０^９．２〜約１０^９．８の間、または約１０^９．４〜約１０^９．６の間のウイルス粒子が付加される。別の実施形態では、アフィニティー媒体１ｍｌ当たり少なくとも約１０^９．０、または少なくとも約１０^９．１、または少なくとも約１０^９．２、または少なくとも約１０^９．３、または少なくとも約１０^９．４、または少なくとも約１０^９．５、または少なくとも約１０^９．６、または少なくとも約１０^９．７、または少なくとも約１０^９．８、または少なくとも約１０^９．９、または少なくとも約１０^１０、または少なくとも約１０^１０．２、または少なくとも約１０^１０．４、または少なくとも約１０^１０．６、または少なくとも約１０^１０．８、または少なくとも約１０^１１のウイルス粒子が付加される。ある実施形態では、ウイルス粒子は生ウイルスである。サンプル中の生ウイルス数を求める方法は本明細書に記載されている。

【0144】

別の実施形態では、アフィニティー媒体１ｍｌ当たり約９．０ｌｏｇ_１０ＦＦＵ〜約１１ｌｏｇ_１０ＦＦＵの間、または約９．２ｌｏｇ_１０ＦＦＵ〜約９．８ｌｏｇ_１０ＦＦＵの間、または約９．４ｌｏｇ_１０ＦＦＵ〜約９．６ｌｏｇ_１０ＦＦＵの間のウイルスが付加される。別の実施形態では、アフィニティー媒体１ｍｌ当たり少なくとも約９．０ｌｏｇ_１０ＦＦＵ、または少なくとも約９．１ｌｏｇ_１０ＦＦＵ、または少なくとも約９．２ｌｏｇ_１０ＦＦＵ、または少なくとも約９．３ｌｏｇ_１０ＦＦＵ、または少なくとも約９．４ｌｏｇ_１０ＦＦＵ、または少なくとも約９．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ、または少なくとも約９．６ｌｏｇ_１０ＦＦＵ、または少なくとも約９．７ｌｏｇ_１０ＦＦＵ、または少なくとも約９．８ｌｏｇ_１０ＦＦＵ、または少なくとも約９．９ｌｏｇ_１０ＦＦＵ、または少なくとも約１０ｌｏｇ_１０ＦＦＵ、または少なくとも約１０．１ｌｏｇ_１０ＦＦＵ、または少なくとも約１０．２ｌｏｇ_１０ＦＦＵ、または少なくとも約１０．３ｌｏｇ_１０ＦＦＵ、または少なくとも約１０．４ｌｏｇ_１０ＦＦＵ、または少なくとも約１０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ、または少なくとも約１０．６ｌｏｇ_１０ＦＦＵ、または少なくとも約１０．７ｌｏｇ_１０ＦＦＵ、または少なくとも約１０．８ｌｏｇ_１０ＦＦＵ、または少なくとも約１０．９ｌｏｇ_１０ＦＦＵ、または少なくとも約１１ｌｏｇ_１０ＦＦＵのウイルスが付加される。特定の実施形態では、セルファイン（商標）サルフェイト（Ｃｈｉｓｓｏ Ｃｏｒｐ．）アフィニティー媒体が用いられ、セルファイン（商標）サルフェイト１ｍＬ当たり９．２ｌｏｇ_１０ＦＦＵ〜９．８ｌｏｇ_１０ＦＦＵの間のウイルスが付加される。別の特定の実施形態では、セルファイン（商標）サルフェイト（Ｃｈｉｓｓｏ Ｃｏｒｐ．）アフィニティー媒体が用いられ、セルファイン（商標）サルフェイト１ｍＬ当たり９．４ｌｏｇ_１０ＦＦＵ〜９．６ｌｏｇ_１０ＦＦＵの間のウイルスが付加される。さらに別の特定の実施形態では、セルファイン（商標）サルフェイト（Ｃｈｉｓｓｏ Ｃｏｒｐ．）アフィニティー媒体が用いられ、セルファイン（商標）サルフェイト１ｍＬ当たり少なくとも約９．４ｌｏｇ_１０ＦＦＵ、または少なくとも約９．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ、または少なくとも約９．６ｌｏｇ_１０ＦＦＵ、または少なくとも約９．７ｌｏｇ_１０ＦＦＵのウイルスが付加される。

【0145】

一実施形態では、アフィニティー媒体を、ウイルスがアフィニティー媒体に結合したままとなる十分な容量のバッファー（例えば、ＳＰバッファー）で洗浄して、結合していない、また結合の弱い夾雑物をアフィニティー媒体から除去する。ある実施形態では、洗浄バッファーは（１以上の成分について１０％の変動の範囲内で）２１８ｍＭスクロース、１１ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０〜７．４を含んでなる。別の特定の実施形態では、洗浄バッファーは（１以上の成分について１０％の変動の範囲内で）２１８ｍＭスクロース、１１ｍＭリン酸バッファー ｐＨ７．０〜７．４からなる。ある実施形態では、洗浄後に、ウイルスがアフィニティー樹脂に結合しない十分な容量のバッファーを用いてアフィニティーから溶出させ、カラムに結合している夾雑物を遊離させずにウイルスを溶出させ、収集する。ある実施形態では、溶出バッファーは塩を含んでなる。ウイルス（例えば、インフルエンザ）をアフィニティーカラムから溶出させるのに有用な塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、塩化マグネシウムおよび塩化カルシウムが挙げられる。一般に、溶出バッファーは、０〜１．０Ｍの濃度範囲で勾配としてまたは段階的に樹脂に適用される。溶出バッファー中で塩として用いられる陽イオンおよび陰イオンの有効性はホフマイスターシリーズ(Hofmeister series)と相関し、慣用陽イオンの脱離順序はＣａ^２＋＞Ｍｇ^２＋＞Ｎａ^＋＞Ｋ^＋＞ＮＨ_４^＋であり、慣用陰イオンの脱離有効性の順序はＰＯ_４^３−＞ＳＯ_４^２−＞ＣＯＯ⁻＞Ｃｌ⁻である。一実施形態では、溶出バッファーは（１０％の変動の範囲内で）塩化ナトリウムを終濃度１Ｍで含んでなる。別の実施形態では、溶出バッファーは（１以上の成分について１０％の変動の範囲内で）１Ｍ塩化ナトリウム、２１８ｍＭスクロース、および１１ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０〜７．４を含んでなる。収集された溶出ウイルスはまた、本明細書において「精製ウイルス溶出液」とも呼ばれる。ウイルスの溶出は、紫外線（ＵＶ）吸光度をモニタリングすること、特に、２８０ナノメートルでの吸光度をモニタリングすることによりモニタリングすることができる。いくつかの実施形態では、馴化ウイルス負荷はカラムクロマトグラフィーにより精製し、ウイルスの溶出をモニタリングし、ウイルスを含んでなる特定の画分を収集する。このようなアプローチは、溶出されたウイルスの容量を最小限とすることが望ましい場合に有用であり得る。別の特定の実施形態では、馴化ウイルス負荷は、第８．６節に示される実施例に例示されているようにクロマトグラフィーにより精製する。

【0146】

ある実施形態では、ウイルス（例えば、インフルエンザ）の精製方法は、非特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、ベンゾナーゼ（登録商標））による処理を含む。ある実施形態では、非特異的エンドヌクレアーゼ処理はウイルス精製の初期に行う。一実施形態では、非特異的エンドヌクレアーゼ処理は工程（ａ）の後、工程（ｂ）の前に行う。別の実施形態では、非特異的エンドヌクレアーゼ処理は工程（ｂ）の後、工程（ｃ）の前に行う。あるいは、工程（ｃ）の際に、ウイルスを非特異的エンドヌクレアーゼで処理する。このアプローチの利点は、第８．６節に示される実施例に例示されている。特定の実施形態では、馴化ウイルス負荷をアフィニティー媒体に結合させ、その後、非特異的エンドヌクレアーゼを含んでなるバッファーに曝す。いくつかの実施形態では、非特異的エンドヌクレアーゼはバッファー中に約１０Ｕ／ｍＬ〜約１００Ｕ／ｍＬの間の濃度で存在する。他の実施形態では、非特異的エンドヌクレアーゼは、バッファー中に約４０Ｕ／ｍＬ〜約６０Ｕ／ｍＬの間の濃度で存在する。一実施形態では、非特異的エンドヌクレアーゼはスクロースを含んでなるバッファー中に存在する。特定の実施形態では、非特異的エンドヌクレアーゼは、２１８ｍＭスクロース、１１ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０〜７．４を含んでなるバッファー中に存在する。別の特定の実施形態では、特定のエンドヌクレアーゼが、（１以上の成分について１０％の変動の範囲内で）２１８ｍＭスクロース、１１ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０〜７．４からなるバッファー中に約４０Ｕ／ｍＬ〜約６０Ｕ／ｍＬの間の終濃度で存在する。ある実施形態では、付加および洗浄条件を、結合したウイルスが約１０分〜約１２０分の間非特異的エンドヌクレアーゼに確実に曝されるように調整する。一実施形態では、付加および洗浄条件を、結合したウイルスが約４０分〜約８０分の間非特異的エンドヌクレアーゼに確実に曝されるように調整する。さらに他の実施形態では、付加および洗浄条件を、結合したウイルスが少なくとも１０分、または少なくとも２０分、または少なくとも３０分、または少なくとも４０分、または少なくとも５０分、または少なくとも６０分、または少なくとも７０分、または少なくとも８０分、または少なくとも９０分、または少なくとも１００分、または少なくとも分、または少なくとも１１０分、または少なくとも１２０分、非特異的エンドヌクレアーゼに確実に曝されるように調整する。本発明のある態様では、非特異的エンドヌクレアーゼへの曝露時間、非特異的エンドヌクレアーゼの濃度および非特異的エンドヌクレアーゼ含有バッファーの容量は調整可能である。例えば、ＤＮＡ夾雑物を切断するのに必要な時間を最短にするためには、非特異的エンドヌクレアーゼの濃度を高めればよく；あるいは、非特異的エンドヌクレアーゼの使用量を最小とするためには、曝露時間を長くすればよい。非特異的エンドヌクレアーゼ処理の後、ウイルスがアフィニティー媒体に結合したままとなる十分な容量のバッファー（例えば、ＳＰバッファー）でアフィニティー媒体を洗浄して、消化されたＤＮＡ夾雑物の残渣を除去することが望ましい場合がある。よって、ある実施形態では、アフィニティー樹脂を、非特異的エンドヌクレアーゼ処理の前および／または後に前記のように洗浄する。別の特定の実施形態では、非特異的エンドヌクレアーゼはベンゾナーゼ（登録商標）である。さらに別の特定の実施形態では、馴化ウイルス負荷は、第８．６節に示される実施例に例示されているように、アフィニティークロマトグラフィーによる精製と同時にベンゾナーゼ（登録商標）で処理する。

【0147】

一実施形態では、精製インフルエンザウイルスは、７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ当たり約０．００６０ｎｇ未満、または約０．００５５ｎｇ未満、または約０．００５０ｎｇ未満、または約０．００４５ｎｇ未満、または約０．００４０ｎｇ未満、または約０．００３５ｎｇ未満、または約０．００３０ｎｇ未満、または約０．００２５ｎｇ未満、または約０．００２０ｎｇ未満、または約０．００１５ｎｇ未満、または約０．００１０ｎｇ未満の非特異的エンドヌクレアーゼを含んでなる。特定の実施形態では、精製インフルエンザウイルスは、７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ当たり約０．００４０ｎｇ未満、または約０．００３５ｎｇ未満、または約０．００３０ｎｇ未満、または約０．００２５ｎｇ未満の非特異的エンドヌクレアーゼを含んでなる。別の特定の実施形態では、非特異的エンドヌクレアーゼはベンゾナーゼ（登録商標）である。本発明のある態様では、クロマトグラフィーによる精製後に、精製ウイルス溶出液を濃縮し、かつ／またはバッファーを交換する。濃縮および／またはバッファー交換に有用な方法は上記されている。ある実施形態では、精製ウイルス溶出液のバッファーを、ＤＦを用いて交換する。一実施形態では、約５ダイアボリュームを超えるバッファーがＤＦにより交換される（ここで、ダイアボリュームは、ＤＦ中に操作に導入された総バッファー容量／保持液容量である）。約５ダイアボリュームを超える交換の利点は、第８．６節に示される実施例に詳説されている。別の実施形態では、約６ダイアボリューム、または約７ダイアボリューム、または約８ダイアボリューム、または約９ダイアボリューム、または約１０ダイアボリューム、またはそれを超えるダイアボリュームのバッファーがＤＦにより交換される（ここで、ダイアボリュームは、ＤＦ中に操作に導入された総バッファー容量／保持液容量である）。特定の実施形態では、約８ダイアボリュームまたは以上のダイアボリュームのバッファーがＤＦにより交換される（ここで、ダイアボリュームは、ＤＦ中に操作に導入された総バッファー容量／保持液容量である）。特定の実施形態では、交換バッファーは（１以上の成分について１０％の変動の範囲内で）２００ｍＭスクロース、１００ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０〜７．４を含んでなる。別の特定の実施形態では、交換バッファーは（１以上の成分について１０％の変動の範囲内で）２００ｍＭスクロース、１００ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０〜７．４からなる。ある実施形態では、ウイルスを含んでなる保持液は、所望の容量のバッファーが交換された後に収集される。保持液の収集後、いくらかのウイルスが膜に弱く結合したままとなる場合がある。よって、いくつかの実施形態では、収集された保持液にさらなる交換バッファーを加えて膜をすすぐ。収集された保持液はまた、本発明において「馴化ウイルスバルク(conditioned viral bulk)」または「＃ＸＵＦ」（ここで、「＃」は、ＤＦプロセス中に交換されたバッファーのダイアボリューム数を示す）とも呼ばれる。特定の実施形態では、５００ｋＤａのＭＷＣＯを有する膜を濃縮および／またはバッファー交換に用いる。いくつかの実施形態では、プロセスの後に膜を洗浄して再利用することができる。他の実施形態では、清澄化ウイルス溶出液のバッチごとに新しい膜を用いる。別の特定の実施形態では、精製ウイルス溶出液のバッファーを、第８．６節に示される実施例に例示されているように交換する。さらに他の実施形態では、前記のように、清澄化されたウイルスをＵＦにより濃縮し、バッファーをＤＦにより交換する。ＵＦ工程を組み込むことで、結果として得られる処方ウイルスバルクの容量が低減される。ある実施形態では、ウイルス溶出液は約２倍または約３倍または約４倍または約５倍またはそれを超えて濃縮される（ここで、「倍」は操作に加えられた総出発容量／最終保持液容量に相当する）。他の実施形態では、ウイルス溶出液は２倍〜４倍の間に濃縮される。特定の実施形態では、ウイルス溶出液は約２倍に濃縮され、その後、バッファーが前記のようにＤＦにより交換される。特定の実施形態では、精製ウイルス溶出液のバッファーは、第８．６．３節に示される実施例に例示されているように濃縮され、バッファー交換される。

【0148】

一実施形態では、処方ウイルスバルクはＤＦＦおよび／またはＴＦＦにより除菌される。別の実施形態では、処方ウイルスバルクは、ウイルスを通すのに十分大きく、他の夾雑物を保持するのに十分小さい孔径を有するＭＦ膜を用いて除菌される。一実施形態では、処方ウイルスバルクは、約０．４５マイクロメートルの孔径を有する少なくとも１つの膜を通過させるＤＦＦおよび／またはＴＦＦにより除菌される。ある実施形態では、ポリプロピレンおよび／またはＰＶＤＦ膜が用いられる。一実施形態では、除菌前の処方ウイルスバルクに付加的成分を加える。ある実施形態では、除菌前の処方ウイルスバルクに、アミノ酸賦形剤（例えば、グルタミン酸、アルギニン）、タンパク質加水分解物（例えば、コラーゲン、ゼラチン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）および保存剤からなる群から選択される少なくとも１つの成分を加える。特定の実施形態では、除菌前の処方ウイルスバルクにグルタミン酸、アルギニンおよびゼラチンを加える。別の特定の実施形態では、精製ウイルスバルクにｃＧＡＧ（２００ｍＭスクロース、１００ｍＭリン酸、１２．１％ｗ／ｖアルギニン、１０％ゼラチンおよび５４ｍＭまたは０．９％グルタミン酸）を１：９ｖ／ｖの比率で加える。別の特定の実施形態では、除菌前の処方ウイルスバルクにグルタミン酸一ナトリウム、アルギニンおよびゼラチンをそれぞれ（１０％の変動の範囲内で）５．４ｍＭまたは０．０９％、１．２１％ｗ／ｖおよび１．％ｗ／ｖの終濃度で加える。さらに別の特定の実施形態では、処方ウイルスバルクは、第８．６．３節に示される実施例に例示されているようにＤＦＦにより除菌される。

【0149】

特定の実施形態では、細胞培養物からインフルエンザウイルスを精製する方法は、以下の工程：
（ａ）約１．２マイクロメートル〜約０．４５マイクロメートルの間の孔径を有する少なくとも１つの膜を通過させるダイレクトフロー濾過（ＤＦＦ）によるウイルス回収物の清澄化；
（ｂ）工程（ａ）後の、５００ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する膜を用いた、タンジェントフロー限外濾過（ＵＦ）による濃縮およびダイアフィルトレーション（ＤＦ）によるバッファー交換；
（ｃ）工程（ｂ）後のアフィニティーカラムクロマトグラフィーによる精製；
（ｄ）工程（ｃ）後の、５００ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する膜を用いＤＦによるバッファー交換；および
（ｅ）工程（ｄ）後の、約０．４５マイクロメートル〜約０．２２マイクロメートルの間の孔径を有する少なくとも１つの膜を通過させるＤＦＦによる除菌
（ここで、精製ウイルスの総回収率は少なくとも３０％であり、精製ウイルスは、７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵのウイルス当たり０．１ｎｇ未満のＨＣＤ、０．３μｇ未満のＨＣＰを含んでなる）
を含む。

【0150】

ある実施形態では、工程（ｃ）には、さらに非特異的ヌクレアーゼにより処理が組み込まれている。

【0151】

細胞培養からウイルス、特に、インフルエンザウイルスを精製する方法に組み込むことができるさらなるパラメーターは、第８．６節に示される実施例に例示されている。

【0152】

６．５．２ ＲＳＶの精製
特定の実施形態では、精製されるウイルスは呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）（例えば、ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨ）である。

【0153】

一実施形態において、細胞培養物からウイルスを精製する方法は以下の工程：
（ａ）ウイルス回収物の清澄化；
（ｂ）工程（ａ）後の安定化および／またはバッファー交換；
（ｃ）工程（ｂ）後の濃縮および／またはバッファー交換；
（ｄ）工程（ｃ）後のクロマトグラフィーによる精製；および
（ｅ）工程（ｄ）後の最終濾過
を含む。

【0154】

特定の実施形態では、工程（ａ）は複数の濾過工程を含む。別の特定の実施形態では、工程（ａ）には非特異的ヌクレアーゼによる処理がさらに組み込まれている。別の特定の実施形態では、工程（ａ）および（ｃ）はダイレクトフロー濾過により行う。別の特定の実施形態では、工程（ｃ）はタンジェントフロー濾過により行う。さらに別の特定の実施形態では、工程（ｃ）はタンジェントフロー濾過による濃縮およびダイアフィルトレーションによるバッファー交換の双方を含む。特定の一実施形態では、工程（ｄ）はイオン交換クロマトグラフィー（例えば、陽イオン交換）により行う。さらに別の実施形態では、工程（ｃ）は濃縮のみを含む。ウイルス（例えば、ＲＳＶ）を精製する方法のさらなる実施形態は以下に詳説される。

【0155】

本発明の精製方法は、ウイルス回収物の清澄化を包含する。まず、感染培養物からの未精製培地を、例えば１０００〜２０００ｘｇで、細胞残渣および他の大きな粒子物質を除去するのに十分な時間、例えば、１０〜３０分の間遠心分離することにより清澄化することができる。あるいは、ウイルスを含有する上清を、完全な細胞および他の大きな粒子物質を保持しつつウイルスを通すのに十分な大きなの定義された孔径範囲の、一連の半透膜で濾過する。精製プロセスのこの清澄化工程は、細胞宿主ＤＮＡを分解するための非特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、ベンゾナーゼ）による処理を含んでもよく、ここで、ウイルス回収物は、ａ）ダイレクトフロー濾過（ＤＦＦ）により濾過され；ｂ）非特異的エンドヌクレアーゼで処理され；ｃ）再びＤＦＦにより濾過される。

【0156】

一実施形態では、ウイルス回収物は、ウイルスを通すのに十分大きく、完全な細胞および細胞残渣を保持するのに十分小さい孔径を有するＭＦ膜を用い、ＤＦＦおよび／またはＴＦＦにより清澄化される。ある実施形態では、ウイルス回収物は非特異的エンドヌクレアーゼの処理と組み合わせてＤＦＦにより清澄化される。特定の実施形態では、ウイルス回収物は、約１０マイクロメートル以下の孔径を有する少なくとも１つの膜で濾過した後、非特異的エンドヌクレアーゼで処理し、その後、約３．０マイクロメートル以下の孔径を有する少なくとも１つの膜で再び濾過する。特定の実施形態では、清澄化プロセスにおける第一のフィルター工程は、約５．０マイクロメートル〜約１．０マイクロメートルの間の孔径を有する少なくとも１つの膜による。特定の実施形態では、清澄化プロセスにおける第二のフィルター工程は、約３．０マイクロメートル〜約０．４５マイクロメートルの間の孔径を有する少なくとも１つの膜による。ある実施形態では、第一または第二のフィルター工程は、単独または組み合わせて、より小さい孔径のフィルターの目詰まりを防ぐためにサイズの異なる２つのフィルターを積層した二重膜フィルターを用いる。一実施形態では、この二重フィルターは約３／０．８マイクロメートルのサイズであり、３マイクロメートルのフィルターは大きな細胞残渣を除去するためのプレフィルターとして働く。別の特定の実施形態では、ウイルス回収物は、約３．０マイクロメートルの孔径を有する第一の膜と約３／０．８または約０．６５マイクロメートルの孔径を有する第二の膜を通過させるＤＦＦにより清澄化される。

【0157】

ある実施形態では、ウイルス（例えば、ＲＳＶ）を精製する方法は、宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣＤ）を分解するための非特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、ベンゾナーゼ（登録商標））による処理を含む。ある実施形態では、非特異的エンドヌクレアーゼ処理はウイルス精製の初期に行う。一実施形態では、ウイルスは工程（ａ）の間に非特異的エンドヌクレアーゼで処理される。特定の実施形態では、濾過されたウイルス回収物は、非特異的エンドヌクレアーゼを含んでなるバッファーと混合される。いくつかの実施形態では、非特異的エンドヌクレアーゼはバッファー中に約５Ｕ／ｍＬ〜約１００Ｕ／ｍＬの間の濃度で存在する。他の実施形態では、非特異的エンドヌクレアーゼは、バッファー中に約４０Ｕ／ｍＬ〜約６０Ｕ／ｍＬの間の濃度で存在する。特定の実施形態では、非特異的エンドヌクレアーゼは約５０Ｕ／ｍｌで存在する。一実施形態では、非特異的エンドヌクレアーゼは、約１．０ｍＭ〜約１０ｍＭのＭｇＣｌを含んでなるバッファー中に存在する。特定の実施形態では、バッファーは５０Ｕ／ｍｌの非特異的エンドヌクレアーゼと５ｍＭのＭｇＣｌを含んでなる。別の特定の実施形態では、ＭｇＣｌは２ｍＭで存在する。

【0158】

清澄化プロセスにおける第一のフィルター工程の後、非特異的エンドヌクレアーゼは、濾過されたウイルス回収物とともに約１時間〜約４時間インキュベートされる。特定の実施形態では、非特異的エンドヌクレアーゼは、ウイルス回収物とともに約３時間インキュベートされる。さらに他の実施形態では、非特異的エンドヌクレアーゼは、ウイルスが特異的エンドヌクレアーゼに少なくとも１０分間、または少なくとも２０分間、または少なくとも３０分間、または少なくとも４０分間、または少なくとも５０分間、または少なくとも６０分間、または少なくとも７０分間、または少なくとも８０分間、または少なくとも９０分間、または少なくとも１００分間、または少なくとも 分間、または少なくとも１１０分間、または少なくとも１２０分間、または少なくとも１５０分間、または少なくとも１８０分間、または少なくとも２１０分間、または少なくとも２４０分間確実に曝されるように調整された条件下でインキュベートされる。本発明のある態様では、非特異的エンドヌクレアーゼへの曝露時間、非特異的エンドヌクレアーゼの濃度および非特異的エンドヌクレアーゼ含有バッファーの容量は調整可能である。例えば、ＤＮＡ夾雑物を切断するのに必要な時間を最短にするためには、非特異的エンドヌクレアーゼの濃度を高めればよく；あるいは、非特異的エンドヌクレアーゼの使用量を最小とするためには、曝露時間を長くすればよい。特定の実施形態では、非特異的エンドヌクレアーゼはベンゾナーゼ（登録商標）である。非特異的エンドヌクレアーゼ処理の後、処理された濾過ウイルス回収物を、ＤＮＡ夾雑物が消化された残渣および残留する宿主細胞残渣を除去するために再び濾過する。

【0159】

ある実施形態では、ベンゾナーゼ処理された清澄化ウイルス回収物を、スクロースリン酸（ＳＰ）、トリススクロース（ＴＳ）またはスクロースリン酸グルタミン酸（ＳＰＧ）バッファーの添加により安定化させる。これらのバッファーはさらに塩化ナトリウムまたは塩化カリウムなどの塩を含んでもよい。一実施形態では、ＴＳバッファーは約２．５ｍＭ〜約７５ｍＭのｐＨ７．２ ＴｒｉｓＣｌと約２５０ｍＭ〜約１５０ｍＭのスクロースを含有する。特定の実施形態では、安定化バッファーは５０ｍＭのｐＨ７．２ ＴｒｉｓＣｌおよび２１８ｍＭのスクロースを含有する。ＴＳバッファーはさらに、単独または組み合わせて、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４またはＫ_２ＨＰＯ_４を含有する。一実施形態では、ＮａＣｌまたはＫＣｌの濃度は約１２５ｍＭ〜約１７５ｍＭである。特定の実施形態では、安定化バッファーは５ｍＭのｐＨ７．２ ＴｒｉｓＣｌ、１７５ｍＭのスクロースおよび１５０ｍＭのＮａＣｌまたは１５０ｍＭのＫＣｌを含有する。別の特定の実施形態では、安定化バッファーは３６ｍＭのｐＨ７．２ ＴｒｉｓＣｌ、２１４ｍＭのスクロースおよび１５０ｍＭのＮａＣｌまたはＫＣｌを含有する。一実施形態では、ＫＨ_２ＰＯ_４またはＫ_２ＨＰＯ_４が約１０ｍＭ〜約２．５ｍＭで存在する。特定の実施形態では、安定化バッファーは５ｍＭのｐＨ７．２ ＴｒｉｓＣｌ、１７５ｍＭのスクロース、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４を含有する。別の実施形態では、安定化バッファーはＳＰＧであり、バッファーは２１８ｍＭのスクロース、３．８ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、７．２ｍＭのＫ_２ＨＰＯ_４および５ｍＭのグルタミン酸ナトリウムを含有する。当業者ならば、安定化バッファーの濃度がウイルス、ウイルス回収物および最大収量の安定化されたウイルス回収物を得るための精製条件に応じて変更可能であることが分かるであろう。

【0160】

ある実施形態では、清澄化された回収物を濃縮し、かつ／またはバッファー交換を行う。一実施形態では、濃度および／またはバッファー交換はＵＦおよびＤＦにより行う。別の実施形態では、ＵＦおよびＤＦの双方のためにＴＦＦを用いる。ある実施形態では、一定の濾液流速を維持するためにＴＦＦを行う。他の実施形態では、一致のＴＭＰを維持するためにＴＦＦを行う。特定の実施形態では、ＵＦ工程は５００ｋＤａの中空繊維カートリッジ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行い、ウイルス回収物は操作ＴＭＰ１５ｐｓｉおよび剪断速度１２０００／秒を用いて５倍濃縮される。これらのパラメーターは、ウイルスおよび最終ワクチン処方物の最終ウイルス収量を最大にするための精製条件に応じて変更可能である。

【0161】

ある実施形態では、清澄化されたウイルスをまずＵＦにより濃縮し、次に、ＤＦによりバッファーを交換する。交換バッファーはウイルス回収物中に存在するものと同じであっても異なっていてもよいと考えられる。さらに、交換バッファーは、付加的バッファー交換工程に応じて最終処方バッファーと同じであっても異なっていてもよい。一実施形態では、交換バッファーは中性ｐＨのＳＰ、ＴＳまたはスクロースクエン酸バッファーである。特定の実施形態では、交換バッファーは約７〜２５％ｗ／ｖのスクロースを含んでなり、従って、約１００ｍＭ〜約８００ｍＭの低スクロースから高スクロースの範囲を提供する。一実施形態では、交換バッファーはＮａＣｌまたはＫＣｌを約１ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度で含んでなる。別の実施形態では、交換バッファーはＴｒｉｓＣｌを約２．５ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度で含んでなる。なお別の実施形態では、交換バッファーはクエン酸ナトリウムまたはカリウムを約５．０ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度で含んでなる。一実施形態では、交換バッファーはリン酸カリウムを約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度で含んでなる。特定の交換バッファーの例としては、限定されるものではないが、５ｍＭのＴｒｉｓＣｌ；７〜２５％ｗ／ｖのスクロース；１ｍＭ〜１５０ｍＭのＮａＣｌ；２０ｍＭのクエン酸ナトリウムまたはカリウム、７〜２５％ｗ／ｖのスクロース、１５０ｍＭのＮａＣｌまたはＫＣｌ；および１００ｍＭのリン酸カリウム、７〜２５％ｗ／ｖのスクロース、１５０ｍＭのＫＣｌを含有する。特定の実施形態では、交換バッファーは２５％ｗ／ｖのスクロース、約１００ｍＭのリン酸カリウムバッファーおよび約１５０ｍＭのＫＣｌｐＨ７．２を含んでなる。別の特定の実施形態では、交換バッファーは２５％ｗ／ｖのスクロース、約５ｍＭのＴｒｉｓＣｌおよび約１５０ｍＭのＮａＣｌｐＨ７．２を含んでなる。交換バッファー成分は、ウイルスおよびクロマトグラフィー工程および最終濾過工程のウイルス収量を最大にするための精製条件に応じて改変することができる。

【0162】

ある実施形態では、安定化されたウイルス回収物は前記のようにクロマトグラフィーによりさらに精製される。いくつかの実施形態では、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオンまたは陽イオン）を用いる。特定の実施形態では、処理された清澄化ウイルス回収物のＵＦによる容量減およびダイアフィルトレーションによるバッファー交換の後、ウイルスはイオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製される。このクロマトグラフィー工程または仕上げ工程は、一実施形態では、ネガティブクロマトグラフィーを用いて行われる。この実施形態において、表面（例えば、ポリマービーズ）は、ウイルス粒子の結合を排除しつつＨＣＤまたはＨＣＰと結合し、従って、ウイルスその表面を素通りさせるように誘導体化される。この概念はまた、ウイルス粒子を含んでなるバッファーが誘導体化された表面を通り越すまたは素通りすることができるように他の表面にも適用することができる。完全なクロマトグラフィープロセスは添加物を含まず、ワクチン処方のためのウイルスの大規模生産に用いるために容易に拡大縮小ができる。クロマトグラフィーはバッチプロセスで、あるいはまたカラムプロセスを用いて行うことができると考えられる。ある実施形態では、馴化ウイルス負荷はカラムクロマトグラフィーにより精製される。

【0163】

行われる場合、クロマトグラフィー工程またはバッファー交換のいずれかの後、濃縮されたウイルス回収物に対して除菌工程を行う。一実施形態では、除菌工程は最終濾過工程である。一実施形態では、最終濾過は３マイクロメートル以下の孔径を有する少なくとも１つの膜によるＤＦＦである。特定の実施形態では、フィルターは二重３／０．８マイクロメートル膜である。別の特定の実施形態では、フィルターは約１ｍＭ以下である。一態様では、フィルターは０．８、０．６５または０．４５マイクロメートルである。

【0164】

特定の実施形態では、ウイルス感染細胞から呼吸器合胞体ウイルスを精製する方法は以下の工程：
ａ．
ｉ．約１０マイクロメートル〜約３マイクロメートルの間の孔径を有する少なくとも１つの清澄化フィルターを介したダイレクトフロー濾過（ＤＦＦ）によりウイルス回収物を濾過すること；
ｉｉ．ウイルス回収物を非特異的エンドヌクレアーゼで処理すること；
ｉｉｉ．ウイルス回収物を約３マイクロメートル〜約０．４５マイクロメートルの間の孔径を有する少なくとも１つの清澄化フィルターを介したＤＦＦにより濾過すること；
を含んでなるウイルス回収物の清澄化；
ｂ．清澄化されたウイルス回収物をスクロース、リン酸、または塩（ＮａＣｌまたはＫＣｌ）を含むＴｒｉｓバッファーで安定化させること；
ｃ．５００ｋＤａ〜０．１μｍの間の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する中空繊維カートリッジを用い、安定化されたウイルス回収物をタンジェントフロー濾過（ＴＦＦ）により濃縮し、かつ、ダイアフィルトレーション（ＤＦ）によりバッファー交換を行うこと；
ｄ．濃縮されたウイルス回収物を、約０．８マイクロメートル〜約０．４５マイクロメートルの間の孔径を有する少なくとも１つの清澄化フィルターを介したＤＦＦにより濾過すること
を含み、それにより、呼吸器合胞体ウイルスがウイルス感染細胞から精製され、最終的なウイルス感染性力価が少なくとも５．７ｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬである。

【0165】

別の特定の実施形態では、この精製方法はウイルス回収物の濃縮およびバッファー交換後に陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製工程を含む。

【0166】

６．６ ワクチン組成物および使用方法
本発明はさらに、本発明の方法によって得ることができるウイルス（例えば、インフルエンザまたはＲＳＶ）に関する。これらのウイルスは、ヒトまたは動物へ投与するためのワクチンを提供するための既知の方法によって処方することができる。ウイルスは完全なウイルス粒子（例えば、生弱毒ウイルス）または不活性／非統合型ウイルス（例えば、ホルムアルデヒドの洗剤で処理）として存在することができる。所望により、定義されたウイルス成分（例えば、タンパク質）を当業者に既知の方法によりウイルスから単離し、ワクチンの製造に用いてもよい。ワクチン組成物用の不活性／非統合型ウイルス粒子の作製および処方の方法は当技術分野で周知であり、４０年以上用いられている。

【0167】

６．６．１ インフルエンザウイルスワクチン
完全なウイルス粒子（例えば、生弱毒ウイルス）の処方物は、バッファー、アミノ酸賦形剤（例えば、グルタミン酸、アルギニン）、タンパク質加水分解物（例えば、コラーゲン、ゼラチン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）および保存剤を含み得る。このような処方物に有用なバッファーはｐＨ７．０〜７．４の２００ｍＭスクロースおよびリン酸またはヒスチジンバッファーを含み得る。ある実施形態では、完全なウイルス粒子の処方物はグルタミン酸およびアルギニンなどのアミノ酸賦形剤を含んでなる。ある特定の他の実施形態では、完全なウイルス粒子の処方物は、コラーゲンまたはゼラチン（例えば、ブタ、魚類、鳥類ゼラチン）などの安定化されたタンパク質加水分解物を含んでなる。いくつかの実施形態では、完全なウイルス粒子の処方物は、インフルエンザ予防接種シーズン（例えば、北半球では一般にほぼ９月〜月）中、「現場で」（例えば、２〜８℃、４℃、５℃などで冷蔵した場合に販売および流通中）貯蔵を可能とするに十分な期間、液体形態で安定である生ウイルスを含んでなる。よって、ウイルス／ワクチン組成物は貯蔵期間中、それらの効力を保持するか、またはそれらの効力を許容される速度で失うことが望ましい。他の実施形態では、このような溶液／ワクチンは約２℃〜約８℃、例えば、冷蔵温度にて、液体形態で安定である。例えば、冷蔵で安定な弱毒インフルエンザワクチンを処方するための方法および組成物はＰＣＴ特許公報第ＷＯ／２００６／０４１８１９号に記載されている（また、ＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ／２００５／０１４８６２号も参照）。

【0168】

よって、ある実施形態では、本発明は、最終処方物中に以下（１以上の成分について１０％の変動の範囲内で）：１〜５％アルギニン；１〜４％ゼラチン；５〜１０％スクロース（所望により、リン酸バッファー中）；０．０１〜０．１％グルタミン酸（一ナトリウム、一水和物）；１０〜１５０ｍＭリン酸カリウムおよび８０〜１５０ｍＭヒスチジンの１以上を含んでなる冷蔵で安定なワクチン処方物を提供する。

【0169】

特定の一実施形態では、ワクチン処方物は、以下（１以上の成分について１０％の変動の範囲内で）；１〜２％アルギニン；２％ゼラチン；７〜１０％スクロース（所望により、リン酸バッファー中）；および１００ｍＭヒスチジンの１以上を含んでなる。別の特定の実施形態では、ワクチン処方物は、以下（１以上の成分について１０％の変動の範囲内で）：リン酸バッファー中、０．０１〜０．１％グルタミン酸（一ナトリウム、一水和物）；１〜２％アルギニン；１％ゼラチン；および７〜１０％スクロースの１以上を含んでなる。

【0170】

ある特定の他の実施形態では、本発明は、最終処方物中に以下：スクロース６〜８％重量／容量（ｗ／ｖ）；アルギニン一塩酸塩１〜２％ｗ／ｖ；グルタミン酸、一ナトリウム一水和物０．０５〜０．１％ｗ／ｖ；ゼラチン加水分解物、ブタＡ型（または魚類もしくは鳥類などの他の供給源）０．５〜２％ｗ／ｖ；リン酸二カリウム１〜２％；およびリン酸一カリウム０．２５〜１％ ｗ／ｖの１以上を含んでなる冷蔵で安定なワクチン処方物を提供する。

【0171】

特定の一実施形態では、ワクチン処方物は、以下：スクロース６．８４％重量／容量（ｗ／ｖ）； アルギニン一塩酸塩１．２１％ｗ／ｖ；グルタミン酸、一ナトリウム一水和物０．０９４ｗ／ｖ； ゼラチン加水分解物、ブタＡ型（または他の供給源）１％ｗ／ｖ；リン酸二カリウム１．１３％；およびリン酸一カリウム０．４８％ｗ／ｖの１以上を含んでなる。別の特定の実施形態では、ワクチン処方物は、以下：スクロース６．８４％重量／容量（ｗ／ｖ）；アルギニン一塩酸塩１．２１％ｗ／ｖ；グルタミン酸、一ナトリウム一水和物０．０９４％ｗ／ｖ；ゼラチン加水分解物、ブタＡ型（または他の供給源）１％ｗ／ｖ；リン酸二カリウム１．１３％；およびリン酸一カリウム０．４８％ｗ／ｖの全てを含んでなる。

【0172】

別の特定の実施形態では、ワクチン処方物は、以下（１以上の成分について１０％の変動の範囲内で）：スクロース６．８４％重量／容量（ｗ／ｖ）；アルギニン一塩酸塩１．２１％ｗ／ｖ； グルタミン酸、一ナトリウム一水和物０．０９４％ｗ／ｖ；ゼラチン加水分解物、ブタＡ型（または他の供給源）１％ｗ／ｖ；リン酸二カリウム１．１３％；およびリン酸一カリウム０．４８％ｗ／ｖの全てを含んでなる。別の特定の実施形態では、ワクチン処方物は、以下（１以上の成分について１０％の変動の範囲内で）：スクロース６．８４％重量／容量（ｗ／ｖ）；アルギニン一塩酸塩１．２１％ｗ／ｖ；ゼラチン加水分解物、ブタＡ型（または他の供給源）１％ｗ／ｖの全てを含んでなる。このような実施形態では、処方物はバッファー（例えば、リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０〜７．２））中である。別の特定の実施形態では、ワクチン処方物は、以下（１以上の成分について２０％の変動の範囲内で）：スクロース６．８４％重量／容量（ｗ／ｖ）；アルギニン一塩酸塩１．２１％ｗ／ｖ；グルタミン酸、一ナトリウム一水和物０．０９４％ ｗ／ｖ；ゼラチン加水分解物、ブタＡ型（または他の供給源）１％ｗ／ｖ；リン酸二カリウム１．１３％；およびリン酸一カリウム０．４８％ｗ／ｖの全てを含んでなる。

【0173】

さらに別の特定の実施形態では、ワクチン処方物は、以下（１以上の成分について３０％の変動の範囲内で）：スクロース６．８４％重量／容量（ｗ／ｖ）；アルギニン一塩酸塩１．２１％ｗ／ｖ；グルタミン酸、一ナトリウム一水和物０．０９４％ｗ／ｖ；ゼラチン加水分解物、ブタＡ型（または他の供給源）１％ｗ／ｖ；リン酸二カリウム１．１３％；およびリン酸一カリウム０．４８％ｗ／ｖの全てを含んでなる。さらに別の特定の実施形態では、ワクチン処方物は、以下（１以上の成分について４０％の変動の範囲内で）：スクロース６．８４％重量／容量（ｗ／ｖ）；アルギニン一塩酸塩１．２１％ｗ／ｖ；グルタミン酸、一ナトリウム一水和物０．０９４％ｗ／ｖ；ゼラチン加水分解物、ブタＡ型（または他の供給源）１％ｗ／ｖ；リン酸二カリウム１．１３％；およびリン酸一カリウム０．４８％ｗ／ｖの全てを含んでなる。

【0174】

別の特定の実施形態では、ワクチン処方物は、以下（１以上の成分について１％の変動の範囲内で）：スクロース６．８４％重量／容量（ｗ／ｖ）；アルギニン一塩酸塩１．２１％ｗ／ｖ；グルタミン酸、一ナトリウム一水和物０．０９４％ｗ／ｖ；ゼラチン加水分解物、ブタＡ型（または他の供給源）１％ｗ／ｖ；リン酸二カリウム１．１３％；およびリン酸一カリウム０．４８％ｗ／ｖの全てを含んでなる。別の特定の実施形態では、ワクチン処方物は、以下（１以上の成分について３％の変動の範囲内で）：スクロース６．８４％重量／容量（ｗ／ｖ）；アルギニン一塩酸塩１．２１％ｗ／ｖ；グルタミン酸、一ナトリウム一水和物０．０９４％ｗ／ｖ；ゼラチン 加水分解物、ブタＡ型（または他の供給源）１％ｗ／ｖ；リン酸二カリウム１．１３％；およびリン酸一カリウム０．４８％ｗ／ｖの全てを含んでなる。特定の実施形態では、ワクチン処方物は、例えば、バッファーとしてリン酸カリウム（例えば、少なくとも５０ｍＭまたは少なくとも１００ｍＭまたは少なくとも２００ｍＭまたは少なくとも２５０ｍＭ）、あるいはまたヒスチジン（例えば、少なくとも５０ｍＭまたは少なくとも１００ｍＭまたは少なくとも２００ｍＭまたは少なくとも２５０ｍＭ）を含み得る。

【0175】

所望により、ワクチン処方物の貯蔵期間を延長するために、処方物液体供給流を乾燥加熱ガス流下で微細な液滴へと噴霧化する急速乾燥プロセスである噴霧乾燥を用いてもよい。この微細な液滴の蒸発により、溶解していた溶質からなる乾燥粉末が得られる（例えば、米国特許公開第２００４／００４２９７２号参照）。

【0176】

一般に、ウイルスまたはウイルス成分は、１以上のウイルス株に特異的な免疫応答を刺激するために、適当な担体または賦形剤中で予防的に投与することができる。一般に、担体または賦形剤は、無菌水、生理食塩水溶液、緩衝生理食塩水溶液、デキストロース水溶液、グリセロール水溶液、エタノールまたはその組合せなどの製薬上許容される担体または賦形剤である。無菌性、ｐＨ、等張性および安定性を保証するこのような溶液の調製は当技術分野で確立されているプロトコールに従って行われる。一般に、担体または賦形剤は、アレルギーおよびその他の望ましくない作用を最小とし、例えば、皮下、筋肉内、鼻腔内などの特定の投与経路に適するように選択される。

【0177】

所望により、ウイルスまたはその成分の予防的投与用の処方物はまた、インフルエンザ抗原に対する免疫応答を増強するための１以上のアジュバントも含む。好適なアジュバントとしては、サポニン、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリ陰イオン、ペプチド、オイルまたは炭化水素エマルション、カルメット・ゲラン桿菌(Bacille Calmette-Guerin)（ＢＣＧ）、コリネバクテリウム・パルブム(Corynebacterium parvum)、および合成アジュバントＱＳ−２１およびＭＦ５９が挙げられる。

【0178】

一般に、ワクチン処方物は１以上のインフルエンザウイルス株に特異的な免疫応答を刺激するのに十分な量で投与する。好ましくは、ウイルスの投与は防御免疫応答を惹起する。１以上のウイルス株に対して防御免疫応答を惹起するための用量および方法は当業者に知られている。例えば、不活性化インフルエンザウイルスを投与用量当たり約１〜１０００ＨＩＤ_５０（ヒト感染量）、すなわち、約１０^５〜１０^８ｐｆｕ（プラーク形成単位）の範囲で与える。あるいは、アジュバント無しで約１０〜５０μｇ、例えば、約１５μｇのＨＡを投与する（アジュバントを用いる場合にはより少量を投与する）。一般に、用量は、例えば、年齢、健康状態、体重、性別、食生活、投与時間および他の臨床因子に基づいてこの範囲で調整する。予防用ワクチン処方物は、ニードルおよびシリンジまたは無針注射デバイスを用い、例えば、皮下または筋肉内注射により全身投与する。あるいは、ワクチン処方物は、液滴、大粒子エアゾール（約１０ミクロンを超える）のいずれかにより鼻腔内に、または上気道へのスプレーにより投与される。上記の送達経路はいずれも防御的全身免疫応答をもたらすが、鼻腔内投与はインフルエンザウイルスの侵入部位の粘膜免疫性を惹起するという付加的利益を与える。鼻腔内投与には、多くの場合、生弱毒ウイルスワクチンが好ましく、例えば、弱毒、低温適応および／または温度感受性組換えまたは合併結合インフルエンザウイルスがある。単回用量での防御免疫応答の刺激が好ましいが、所望の予防効果を達成するためにさらなる用量を同じまたは異なる経路で投与することができる。これらの方法は、限定されるものではないが、オルトミクソウイルス（インフルエンザＡおよびＢ株を含む）、パラミクソウイルス（ＲＳＶ、ヒトメタニューモウイルスおよびパラインフルエンザを含む）、ラブドウイルスおよびフラボウイルスを含むいずれのウイルスにも適合可能である。

【0179】

６．６．２ ＲＳＶワクチン
本発明では、一実施形態において、それを必要とする対象に、生弱毒精製ウイルス（例えば、ＲＳＶ）を含んでなる本明細書に記載されている有効量の免疫原性組成物を投与することを含む、対象において免疫応答を惹起する方法が提供される。いくつかの実施形態では、弱毒ウイルスはキメラウイルスである。

【0180】

本発明では、特定の実施形態において、それを必要とする哺乳類に、弱毒ＲＳＶを含んでなる本明細書に記載されている有効量の免疫原性組成物を投与することを含む、哺乳類（例えば、ヒト）において免疫応答を惹起する方法が提供される。特定の実施形態では、弱毒ＲＳＶはｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨである。

【0181】

生弱毒精製ウイルスを含んでなる本明細書に記載されている免疫原性組成物は対象の能動免疫であり得る。本発明では、一実施形態において、対象に生弱毒精製ウイルスを含んでなる有効量の本明細書に記載されている免疫原性組成物、すなわちワクチンを投与することを含む、ウイルス感染を予防する方法が提供される。いくつかの実施形態では、生弱毒ウイルスはキメラウイルスである。

【0182】

本発明では、特定の実施形態において、哺乳類（例えば、ヒト）に、生弱毒精製ＲＳＶを含んでなる有効量の本明細書に記載されている免疫原性組成物、すなわちワクチンを投与することを含む、ＲＳＶ感染を予防する方法が提供される。特定の実施形態では、生弱毒ＲＳＶはｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨである。

【0183】

生弱毒精製ウイルスを含んでなる本明細書に記載されている免疫原性組成物はウイルス感染の阻害に使用可能である。本発明では、一実施形態において、それを必要とする対象に、生弱毒精製ウイルスを含んでなる有効量の本明細書に記載されている免疫原性組成物を投与することを含む、ウイルス感染を阻害する方法が提供される。いくつかの実施形態では、弱毒ウイルスはキメラウイルスである。本発明では、特定の実施形態において、哺乳類（例えば、ヒト）に、生弱毒精製ＲＳＶを含んでなる有効量の本明細書に記載されている免疫原性組成物を投与することを含む、ＲＳＶ感染を阻害する方法が提供される。特定の実施形態では、弱毒ＲＳＶはｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨである。

【0184】

生弱毒精製ウイルスを含んでなる本明細書に記載されている免疫原性組成物は、対象においてウイルス力価の低減をもたらす免疫応答を誘導するために使用可能である。本発明では、一実施形態において、生弱毒細胞随伴性ウイルスを含んでなる本明細書に記載されている免疫原性組成物を投与することを含む、対象においてウイルス力価を低減する方法が提供される。いくつかの実施形態では、弱毒ウイルスはキメラである。本発明では、特定の実施形態において、哺乳類（例えば、ヒト）に、生弱毒ＲＳＶを含んでなる有効量の本明細書に記載されている免疫原性組成物を投与することを含む、ＲＳＶ力価を低減する方法が提供される。特定の実施形態では、弱毒ＲＳＶはｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨである。

【0185】

いくつかの実施形態では、有効量の本明細書に記載されている免疫原性組成物は、ウイルスを投与した対象において、非処理対象に比べ、およそ２倍、好ましくはおよそ５倍以上、およそ１０倍以上またはおよそ２０倍以上ウイルス力価を低減する。ある実施形態では、有効量の本明細書に記載されている免疫原性組成物は、その後細胞随伴性ウイルスに感染した対象において、非処理対象に比べ、細胞随伴性ウイルス感染に関連する１以上の症状の持続期間ｓおよび／または重篤度を軽減する。いくつかの実施形態では、有効量の本明細書に記載されている免疫原性組成物は、非処理対象に比べ、その後精製ウイルスに感染した対象の生存率を高める。

【0186】

生弱毒精製ウイルスを含んでなる本明細書に記載されている免疫原性組成物は、ナイーブ対象、すなわち、着目するウイルスに感染したことがなく、その時点でも感染していない対象に投与することができる。一実施形態では、生弱毒細胞随伴性ウイルスを含んでなる本明細書に記載されている免疫原性組成物は、ウイルス感染を起こすリスクのあるナイーブ対象に投与することができる。特定の実施形態では、生弱毒ＲＳＶを含んでなる本明細書に記載されている免疫原性組成物は、ＲＳＶ感染を起こすリスクのあるナイーブ対象に投与することができる。特定の実施形態では、弱毒ＲＳＶはｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨである。

【0187】

生弱毒精製ウイルスを含んでなる本明細書に記載されている免疫原性組成物は、着目するウイルスの異なるグループ、サブグループまたは株に過去に感染したことがある対象に投与することができる。一実施形態では、免疫原性組成物を、着目するウイルス以外の異なるグループ、サブグループまたは株のウイルスに過去に感染したことがあり、着目するウイルスに感染を起こすリスクのある対象に投与する。

【0188】

一実施形態では、生弱毒ＲＳＶ（例えば、ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨ）を含んでなる本明細書に記載されている免疫原性組成物をヒト小児またはヒト未熟児に投与する。別の実施形態では、生弱毒ＲＳＶ（例えば、ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨ）を含んでなる本明細書に記載されている免疫原性組成物を、嚢胞性繊維症、気管支肺異形成症、先天性心疾患、先天性免疫不全症または後天性免疫不全を有するヒトに投与する。別の実施形態では、生弱毒ＲＳＶ（例えば、ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨ）を含んでなる本明細書に記載されている免疫原性組成物をヒト幼児に投与する。別の実施形態では、生弱毒ＲＳＶ（例えば、ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨ）を含んでなる本明細書に記載されている免疫原性組成物をヒト小児に投与する。別の実施形態では、生弱毒ＲＳＶ（例えば、ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨ）を含んでなる本明細書に記載されている免疫原性組成物をヒト学童に投与する。

【0189】

特定の実施形態では、生弱毒ＲＳＶ（例えば、ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨ）を含んでなる本明細書に記載されている免疫原性組成物を１〜２４か月齢のヒトに投与する。別の実施形態では、生弱毒ＲＳＶ（例えば、ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨ）を含んでなる本明細書に記載されている免疫原性組成物を１〜３か月齢のヒトに投与する。別の実施形態では、生弱毒ＲＳＶ（例えば、ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨ）を含んでなる本明細書に記載されている免疫原性組成物を６〜２４か月齢のヒトに投与する。

【0190】

別の実施形態では、生弱毒ＲＳＶ（例えば、ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨ）を含んでなる本明細書に記載されている免疫原性組成物を、骨髄移植を受けたヒトに投与する。別の実施形態では、生弱毒ＲＳＶ（例えば、ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨ）を含んでなる本明細書に記載されている免疫原性組成物をヒト高齢者に投与する。別の実施形態では、生弱毒ＲＳＶ（例えば、ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨ）を含んでなる本明細書に記載されている免疫原性組成物を老人ホームのヒトに投与する。別の実施形態では、生弱毒ＲＳＶ（例えば、ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨ）を含んでなる本明細書に記載されている免疫原性組成物をグループホーム（すなわち、１５人以上のヒト対象が居住しているホーム）に居住しているヒトに投与する。

【0191】

特定の実施形態では、生弱毒ＲＳＶ（例えば、ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨ）を含んでなる免疫原性組成物を、ＲＳＶシーズン、一般に北半球では１１月から４月、の前にヒト対象（特定の実施形態では、ヒト対象はヒト小児、ヒト未熟児またはヒト幼児である）に投与する。別の実施形態では、生弱毒ＲＳＶ（例えば、ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨ）を含んでなる免疫原性組成物を、ＲＳＶシーズン中、一般に北半球では１１月から４月にヒト対象（特定の実施形態では、ヒト対象はヒト小児、ヒト未熟児またはヒト幼児である）に投与する。別の実施形態では、生弱毒ＲＳＶ（例えば、ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨ）を含んでなる免疫原性組成物を、ＲＳＶシーズン、一般に北半球では１１月から４月の前と期間中に、ヒト対象（特定の実施形態では、ヒト対象はヒト小児、ヒト未熟児またはヒト幼児である）に投与する。

【0192】

ある実施形態では、生弱毒精製ウイルスを含んでなる本明細書に記載されている免疫原性組成物は、ウイルス感染からの完全な保護をもたらさず、ウイルスを投与した際に非処理対象に比べて低いウイルス力価をもたらす。ある実施形態では、生弱毒精製ウイルスを含んでなる本明細書に記載されている免疫原性組成物の投与は、ウイルスを投与した際に非処理対象に比べて、ウイルス力価に０．５倍、１倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１５倍、２５倍、５０倍またはそれを超える低減をもたらす。いくつかの実施形態では、生弱毒ウイルスを含んでなる本明細書に記載されている免疫原性組成物の投与は、ウイルスを投与した際に非処理対象に比べて、ウイルス力価に１０％、好ましくは、２５％、５０％、７５％またはそれを超える低減をもたらす。ウイルス力価の低減の利益としては、限定されるものではないが、ウイルス感染の症状の重篤度の軽減、ウイルス感染の症状の減少およびウイルス感染の長さの短縮が含まれる。

【0193】

生弱毒キメラ細胞随伴性ウイルスを含んでなる本明細書に記載されている免疫原性組成物は、非ウイルス抗原に対する免疫応答を誘導するために使用することができる。生弱毒キメラ細胞随伴性ウイルスを含んでなる本明細書に記載されている免疫原性組成物は、疾患を予防および／または治療するために対象に着目するタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを送達するために使用することができる。

【0194】

本明細書に記載されている免疫原性組成物、例えば、ワクチン処方物を導入するためには多くの方法が使用可能であり、これらには、限定されるものではないが、鼻腔内、気管内、経口、肺、皮内、腹腔内および非経口（例えば、筋肉内、静脈内および皮下）経路が含まれる。いくつかの実施形態では、生弱毒細胞随伴性ウイルスを含んでなる本明細書に記載されている免疫原性組成物は、ウイルスの本来の感染経路を介して投与される。特定の実施形態では、生弱毒ＲＳＶ（例えば、ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨ）を含んでなる免疫原性組成物は鼻腔内投与される。

【0195】

免疫手順では、免疫原性組成物の使用量および免疫計画は当技術分野の熟練医師により決定され、対象の免疫応答および抗体力価を参考に投与される。特定の実施形態では、ヒト小児、ヒト未熟児またはヒト幼児に、生弱毒ＲＳＶ（例えば、ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨ）を含んでなる、一定用量の免疫原性組成物を投与し、この免疫原性組成物用量はおよそ１２５〜２００ＦＦＵの弱毒ＲＳＶを含んでなる。別の実施形態では、ヒト小児、ヒト未熟児またはヒト 幼児に生弱毒ＲＳＶ（例えば、ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨ）を含んでなる、一定用量の免疫原性組成物を投与し、この免疫原性組成物用量はおよそ１２５ＦＦＵ、およそ１５０ＦＦＵ、およそ１７５ＦＦＵまたはおよそ２００ＦＦＵの弱毒ＲＳＶを含んでなる。

【0196】

いくつかの実施形態では、およそ１２５〜２００ＦＦＵの生弱毒ＲＳＶ（例えば、ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨ）を含んでなる免疫原性組成物２〜６用量をヒト小児、ヒト未熟児またはヒト幼児に投与する。いくつかの実施形態では、この用量の免疫原性組成物を１〜６か月おいてまたは２〜１２か月おいて投与する。特定の実施形態では、およそ１２５〜２００ＦＦＵの生弱毒ＲＳＶ（例えば、ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨ）を含んでなる免疫原性組成物３用量を２か月おいてヒト小児、ヒト未熟児またはヒト幼児に投与する。例えば、１５０ＦＦＵの生弱毒ＲＳＶ（例えば、ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨ）を含んでなる免疫原性組成物の１回目の用量を１か月齢未満の小児に投与し、１５０ＦＦＵの生弱毒ＲＳＶ（例えば、ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨ）を含んでなる免疫原性組成物の２回目の用量をおよそ２か月齢のヒト小児に投与し、１５０ＦＦＵの生弱毒ＲＳＶ（例えば、ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨ）を含んでなる免疫原性組成物の３回目の用量をおよそ４か月齢のヒト小児に投与する。

【0197】

６．７ ウイルス
細胞随伴性ウイルスは天然ウイルス、突然変異誘発ウイルス（例えば、ＵＶ照射、突然変異誘発物質曝露および／または継代培養により変異誘発されたウイルス）、合併結合（セグメント化されたゲノムを有する細胞随伴性ウイルスの場合）、および／または遺伝子操作ウイルスであり得る。細胞随伴性ＲＮＡウイルスの限定されない例としては、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト泡沫状ウイルス、レトロウイルス（ＨＴＬＶなど）、レンチウイルス（ＨＩＶおよびＳＩＶなど）およびレオウイルスが挙げられる。あるいは、細胞随伴性ウイルスはヘルペスウイルスなどのＤＮＡウイルスである。細胞随伴性ＤＮＡウイルスの限定されない例としては、ヘルペスウイルス、ＥＢＶ、ＣＭＶおよびマレック病ウイルスが挙げられる。ある実施形態では、本明細書に記載されているプロセスにより精製され、かつ／または本明細書に記載されている免疫原性組成物中に含有される細胞随伴性ウイルスは複製欠陥型である。特定の実施形態では、複製欠陥細胞随伴性ウイルスにおいて、ウイルスゲノム複製および／または合成に必須の１以上の機能が欠損している。別の実施形態では、複製欠陥細胞随伴性ウイルスにおいて、ウイルス粒子の組み立てに必須の１以上の機能が欠損している。別の実施形態では、複製欠陥細胞随伴性ウイルスにおいて、ウイルスゲノム複製または合成およびウイルス粒子の組み立てに必須の１以上の機能が欠損している。

【0198】

特定の実施形態では、ある実施形態では、本明細書に記載されているプロセスにより精製され、かつ／または本明細書に記載されている免疫原性組成物中に含有される細胞随伴性ウイルスは弱毒ウイルスである。特定の実施形態では、細胞随伴性ウイルスは生弱毒ウイルスである。弱毒細胞随伴性ウイルスは、野生型細胞随伴性ウイルスに比べて、例えば、ウイルスゲノム複製能の低下、意図される宿主内での複製能の低下、感染性ウイルス粒子を組み立てる能力の低下、および／または宿主細胞感染能の低下を示し得る。細胞随伴性ウイルスの弱毒化は当業者に既知の任意の方法によって試験することができる。例えば、２００４年４月２日付けの米国特許出願第１０／８３１，７８０号（２００５年１月２７日に米国特許出願公開第２００５／００１９８９１号として公開）、特に「組換えウイルスの弱毒化」と題された第５．７節を参照。いくつかの実施形態では、弱毒ウイルスは、ウイルスの低温継代培養またはＵＶ照射および／または突然変異誘発物質曝露などの周知の突然変異誘発技術を用いて作出される。他の実施形態では、弱毒ウイルスは遺伝子操作される。

【0199】

細胞随伴性ウイルスはキメラウイルスであり得る。特定の実施形態では、キメラウイルスは複製欠陥ウイルスである。特定の実施形態では、キメラウイルスは弱毒ウイルスである。

【0200】

６．７．１ インフルエンザウイルス
本明細書において培養培地、方法、プロセスおよび組成物はワクチン用のインフルエンザウイルスの生産および精製に特に有用である。インフルエンザウイルスはセグメント化された一本鎖ＲＮＡゲノムを含む内部リボ核タンパク質と基質タンパク質により裏打ちされた外部リポタンパク質エンベロープから構成される。インフルエンザＡおよびインフルエンザＢウイルスはそれぞれ一本鎖ネガティブセンスＲＮＡの８つのセグメントを含む。インフルエンザＡゲノムは１１のポリペプチドをコードする。セグメント１〜３は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを構成している３つのポリペプチドをコードする。セグメント１は、ポリメラーゼ複合体タンパク質ＰＢ２をコードする。残りのポリメラーゼタンパク質ＰＢ１およびＰＡは、それぞれセグメント２およびセグメント３によりコードされる。さらに、いくつかのインフルエンザ株のセグメント１は、ＰＢ１コード領域内の選択的リーディングフレームから産生される小型のタンパク質ＰＢ１−Ｆ２をコードする。セグメント４は、感染の際の細胞接着および侵入に関与する血球凝集素（ＨＡ）表面糖タンパク質をコードする。セグメント５は、ウイルスＲＮＡに関連する主要な構造成分であるヌクレオキャプシド核タンパク質（ＮＰ）ポリペプチドをコードする。セグメント６は、ノイラミダーゼ（ＮＡ）エンベロープ糖タンパク質をコードする。セグメント７は、スプライシングの異なるｍＲＮＡから翻訳される、Ｍ１およびＭ２と呼ばれる２つの基質タンパク質をコードする。セグメント８は、選択的にスプライシングされるｍＲＮＡ変異体から翻訳される２つの非構造タンパク質ＮＳ１およびＮＳ２をコードする。

【0201】

インフルエンザＢの８つのゲノムセグメントは１１のタンパク質をコードする。最も大きな３つの遺伝子は、ＲＮＡポリメラーゼの成分ＰＢ１、ＰＢ２およびＰＡをコードする。セグメント４は、ＨＡタンパク質をコードする。セグメント５は、ＮＰをコードする。セグメント６は、ＮＡタンパク質とＮＢタンパク質をコードする。ＮＢおよびＮＡの両タンパク質は、二シストロン性ｍＲＮＡの重複するリーディングフレームから翻訳される。インフルエンザＢのセグメント７もＭ１およびＭ２の２つのタンパク質をコードする。最も小さなセグメントは、全長ＲＮＡから翻訳されるＮＳ１と、スプライシングされたｍＲＮＡ変異体から翻訳されるＮＳ２の２つの産物をコードする。

【0202】

合併結合ウイルスは、マスタードナーウイルス（ＭＤＶ）とも呼ばれる認可されたマスター株に関して、臨床単離物から選択された血球凝集素および／またはノイラミダーゼ抗原を組み込むように作出される。例えば、ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）は、認可された低温適応、弱毒、温度感受性ＭＤＶ株（例えば、ｃａ Ａ／ＡｎｎＡｒｂｏｒ／６／６０およびｃａ Ｂ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／６６）を用いている。マスタードナーウイルスとして使用可能な他の株としては、限定されるものではないが、ｃａ Ａ／ＡｎｎＡｒｂｏｒ／６／６０、ｃａ Ｂ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／６６、ｃａ Ａ／レニングラード／１３４／１７／５７、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（ＰＲ８）、ｃａ Ｂ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／９４、Ｂ／レニングラード／１４／１７／５５、Ｂ／ＵＳＳＲ／６０／６９、およびＢ／レニングラード／１７９／８６が挙げられる。

【0203】

合併結合ウイルスの作出には、卵に基づく方法およびより最近では細胞培養物法を含むいくつかの方法が有用である。例えば、ＰＣＴ国際公開公報ＷＯ０３／０９１４０１；ＷＯ０５／０６２８２０および米国特許第６，５４４，７８５号、同第６，６４９，３７２号；同第６，９５１，７５号、および米国特許出願第１１／４５５，８１８号、同第１１／４５５，７３４号、および同第１１／５０１，０６７号参照。本発明の培地および方法は、限定されるものではないが、本明細書に開示されているインフルエンザ株および合併結合ウイルスマスタードナーウイルスの遺伝子を含んでなる（例えば、ｃａ Ａ／ＡｎｎＡｒｂｏｒ／６／６０、ｃａ Ｂ／ＡｎｎＡｒｂｏｒ／１／６６、ＰＲ８など）を含むインフルエンザウイルスの生産に有用であると考えられる。さらに、本発明の培地および方法は、以下の表現型：温度感受性、低温適応、弱毒型の１以上を有する合併結合ウイルスを含むインフルエンザウイルスの生産に有用であると考えられる。合併結合は、例えば、同時感染法または所望によりプラスミドレスキュー技術などの従来の合併結合技術によって作出することができる（例えば、ＰＣＴ国際公開公報ＷＯ０３／０９１４０１およびＷＯ０５／０６２８２０；米国特許第６，５４４，７８５号、同第６，６４９，３７２号、同第６，９５１，７５４号、同第６，８８７，６９９号、同第６，００１，６３４号、同第５，８５４，０３７号、同第５，８２４，５３６号、同第５，８４０，５２０号、同第５，８２０，８７１号、同第５，７８６，１９９号および同第５，１６６，０５７号；米国特許出願公開第２００６００１９３５０号、同第２００５０１５８３４２号、同第２００５００３７４８７号、同第２００５０２６６０２６号、同第２００５０１８６５６３号、同第２００５０２２１４８９号、同第２００５００３２０４３号、同第２００４０１４２００３号、同第２００３００３５８１４号および同第２００２０１６４７７０号；ならびにNeumann et al. (1999) Generation of influenza A virus entirely from cloned cDNAs. Proc Natl Acad Sci USA 96:9345-9350; Fodor et al. (1999) Rescue of influenza A virus from recombinant DNA. J. Virol 73:9679-9682; Hoffmann et al. (2000) A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids Proc Natl Acad Sci USA 97:6108-6113; ＷＯ０１／８３７９４; Hoffmann and Webster (2000), Unidirectional RNA polymerase I-polymerase II transcription system for the generation of influenza A virus from eight plasmids, 81:2843-2847; and Hoffmann et al. (2002), Rescue of influenza B viruses from 8 plasmids, 99(17): 11411-11416参照）。最近、合併結合はＭＤＣＫ細胞においてプラスミドレスキューにより作出された（例えば、ＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ２００７／１２４３２７号；Wang and Duke; 2007 Oct 23, J. Virol., 4:102参照）。

【0204】

６．７．２ 呼吸器合胞体ウイルス
本明細書における方法、プロセスおよび組成物は、ワクチン用のＲＳＶの生産および精製に特に有用である。ＲＳＶのグループ、サブグループまたは株（例えば、グループＡまたはグループＢ）は、本明細書に記載されているプロセスにより精製し、かつ／または本明細書に記載されている免疫原性組成物に含有することができる。ＲＳＶのグループおよびサブグループに関する考察は、例えば、Sato et al., 2005, Journal of Clinical Microbiology 43: 36-40を参照）。一実施形態では、ＲＳＶはグループＡに属す。別の実施形態では、ＲＳＶはグループＢに属す。

【0205】

本明細書に記載されているプロセスにより精製され、かつ／または本明細書に記載されている免疫原性組成物中に含有されるＲＳＶは、天然ＲＳＶ株、突然変異誘発ＲＳＶ（例えば、ＵＶ照射、突然変異誘発物質曝露および／または継代培養により変異誘発されたウイルス）、および／または遺伝子操作ＲＳＶであり得る。一実施形態では、ＲＳＶゲノムは、Ｆ、Ｇ、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｍ１（オープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）１）、Ｍ２（ＯＲＦ２）、ＳＨ２、Ｎ、ＰまたはＬ遺伝子などの１以上のウイルス遺伝子に１以上の突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態では、置換、欠失および／または挿入の組合せがＲＳＶゲノムに導入される。いくつかの実施形態では、ＲＳＶゲノムは、Ｆ、Ｇ、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｍ１（ＯＲＦ１）、Ｍ２（ＯＲＦ２）、ＳＨ２、Ｎ、ＰまたはＬ遺伝子などの１以上のウイルス遺伝子に１以上のミスセンス突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態では、ＲＳＶゲノムは、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｍ１（ＯＲＦ１）、Ｍ２（ＯＲＦ２）、ＳＨ２、Ｎ、ＰまたはＬ遺伝子などの１以上のウイルス遺伝子に１以上の全欠失または部分的欠失を含んでなる。

【0206】

一実施形態では、本明細書に記載されているプロセスにより精製され、かつ／または本明細書に記載されている免疫原性組成物中に含有され得るＲＳＶは複製欠陥型である。特定の実施形態では、本明細書に記載されているプロセスにより精製され、かつ／または本明細書に記載されている免疫原性組成物中に含有され得るＲＳＶは弱毒型である。ウイルスを弱毒するためにＲＳＶゲノムに導入可能な突然変異の限定されない例としては、例えば、２００４年４月２日付けの米国特許出願第１０／８３１，７８０号（２００５年１月２７日に米国特許出願公開第２００５／００１９８９１号として公開）および２００６年３月２４日出願の米国特許出願第１１／３８９，６１８号（２００６年６月２０日に米国特許出願公開第２００６／０１６０１３０号として公開）を参照。弱毒ＲＳＶとしては、限定されるものではないが、低温継代培養（ｃｐ）変異株（例えば、参照により本明細書にそのまま組み込まれるKim et al., 1971, Pediatrics 48: 745-755に記載されているｃｐＲＳＶなど）、温度感受性（ｔｓ）変異株（例えば、Crowe et al., 1993, Vaccine 11:1395-1404; Crowe et al., 1995, Vaccine 13:847-855; Mills et al., 1971, J Immunol. 107:123-130; and Pringle et al., Vaccine 1993 11:473-478に記載されているＲＳＶ ｔｓ−１、ＲＳＶ ｔｓ−２、ｔｓ１Ａ、ｔｓ１９Ａ、およびｔｓ１Ｃなど）、低温継代培養温度感受性（ｃｐｔｓ）変異株（例えば、ｃｐｔｓ２４８／４０４、ｃｐｔｓ２４８／２５５、ｃｐｔｓ２４８／９５５およびｃｐｔｓ５３０／１００９；例えば、Karron et al., 1997, J Infect Dis. 176:1428-1436参照）、および遺伝子操作変異株（例えば、Karron et al., J. of Infect. Diseases 191: 1093-1140; Whitehead et al., 1999, J. Virol. 73: 3438-3442; and Collins et al., 2005, Proc. Am. Thorac. Soc. 2: 166-173に記載されているｒＡ２ｃｐ２４８／４０４ΔＳＨ、ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨ、ｒΔＮＳ１、ｒΔＭ２−２、およびｒ２４８ΔＮＳ２など）が挙げられる。

【0207】

特定の実施形態では、本明細書に記載されているプロセスにより精製され、かつ／または本明細書に記載されている免疫原性組成物中に含有され得るＲＳＶはｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨである。この弱毒ＲＳＶは、（ｉ）低温継代培養ＲＳＶを弱毒するＮ、ＦおよびＬタンパク質における５つのミスセンス突然変異のセット；（ｉｉ）制限温度を低くし、温度感受性表現型を付与し、ウイルスを弱毒するＬタンパク質における独立したミスセンス突然変異である２４８および１０３０修飾；（ｉｉｉ）ともにさらなる温度感受性を付与するＭ２遺伝子の遺伝子開始転写シグナルにおけるヌクレオチド置換とＬタンパク質におけるミスセンス突然変異の組合せである；および（ｉｖ）弱毒表現型を付与するＳＨ遺伝子全体の欠失であるΔＳＨを含め、その温度感受性と弱毒特性を担う、複数の弱毒遺伝エレメントを含む。ＲＳＶゲノムに導入されたアミノ酸置換の位置については下表２を参照。

【表2】

【0208】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているプロセスにより精製され、かつ／または本明細書に記載されている免疫原性組成物中に含有され得るＲＳＶは、１以上の異種配列を発現するように操作されている（すなわち、ＲＳＶはキメラウイルスである）。異種配列は、例えば、Ｆ、Ｇ、ＮＳ１、ＮＳ１、Ｍ１（ＯＲＦ１）、Ｍ２（ＯＲＦ２）、Ｎ、Ｐ、ＳＨ２および／またはＬコード配列に導入することができる。ＲＳＶが発現するように操作され得る異種配列の限定されない例としては、抗原（例えば、ウイルス抗原、細菌抗原、腫瘍抗原（Robbins and Kawakawi, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8: 628-636に記載されているものなど）、真菌抗原および寄生虫抗原）、マーカーまたはタグ（例えば、ｆｌａｇタグおよびＨｉｓタグ）、キメラタンパク質（例えば、２つの異なるＲＳＶ株に由来するＲＳＶ Ｇタンパク質のハイブリッド）、および所望の生物学的特性または活性を有するタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド（例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５およびＩＬ−２２などのサイトカイン）が挙げられる。特定の実施形態では、キメラＲＳＶは弱毒型である。キメラＲＳＶの限定されない例としては、例えば、２００４年４月２３日付けの米国特許出願第１０／８３１，７８０号（２００５年１月２７日に米国特許出願公開第２００５／００１９８９１号として公開）および２００６年３月２日出願の米国特許出願第１１／３８９，６１８号（２００６年７月２０日に米国特許出願公開第２００６／０１６０１３０号として公開）を参照。

【0209】

一実施形態では、ＲＳＶは、ＲＳＶベクターとは異なるグループ、サブグループまたは株のＲＳＶに属すウイルスに由来する１以上のウイルス抗原を発現するように操作される。例えば、限定されるものではないが、ＲＳＶベクターはグループＢ ＲＳＶに由来してもよく、異種配列はグループＡ ＲＳＶに由来してもよい。

【0210】

別の実施形態では、ＲＳＶはＲＳＶ以外のウイルスから得られる、または由来する１以上のウイルス抗原を発現するように操作される。ウイルス抗原の限定されない例としては、アデノウイルス科（例えば、マストアデノウイルスおよびアビアデノウイルス）、ヘルペスウイルス科（例えば、単純ヘルペスウイルス１、単純ヘルペスウイルス２、単純ヘルペスウイルス５、単純ヘルペスウイルス６、エプスタイン−バーウイルス、ＨＨＶ６−ＨＨＶ８およびサイトメガロウイルス）、レビウイルス科（例えば、レビウイルス、ＭＳ２期エンテロバクター、アロレウイルス）、ポックスウイルス科（例えば、コードポックスウイルス亜科、パラポックスウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルス、モルシポックスウイルスおよびエントモポックスウイルス亜科）、パポバウイルス科（例えば、ポリオーマウイルスおよび乳頭腫ウイルス）、パラミクソウイルス科（例えば、パラミクソウイルス、パラインフルエンザウイルス１、モビリウイルス（例えば、麻疹ウイルス）、ルブラウイルス（例えば、流行性耳下腺炎ウイルス）、ニューモウイルス亜科（例えば、ニューモウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス）、ヒト呼吸器合胞体ウイルスおよびメタニューモウイルス（例えば、鳥類ニューモウイルスおよびヒトメタニューモウイルス））、ピコルナウイルス科（例えば、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパトウイルス（例えば、ヒトＡ型肝炎ウイルス）、カルジオウイルス、およびアプトウイルス）、レオウイルス科（例えば、オルトレオウイルス、オルビウイルス、ロタウイルス、シポウイルス、フィジウイルス、フィトレオウイルス、およびオリザウイルス）、レトロウイルス科（例えば、哺乳類Ｂ型レトロウイルス、哺乳類Ｃ型レトロウイルス、鳥類Ｃ型レトロウイルス、Ｄ型レトロウイルスグループ、ＢＬＶ−ＨＴＬＶレトロウイルス、レンチウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス１およびヒト免疫不全ウイルス２（例えば、ＨＩＶ ｇｐ１６０）、スプーマウイルス）、フラビウイルス科（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルス、西ナイルウイルス）、ヘパドナウイルス科（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、トガウイルス科（例えば、αウイルス（例えば、シンドビスウイルス）およびルビウイルス（例えば、風疹ウイルス））、ラブドウイルス科（例えば、ベシクロウイルス、リッサウイルス、エフェメロウイルス、シトラブドウイルス、およびネクレオラブドウイルス）、アレナウイルス科（例えば、アレナウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、イッピーウイルス、およびラッサ熱ウイルス）、およびコロナウイルス科（例えば、コロナウイルスおよびトロウイルス）由来の抗原が挙げられる。特定の実施形態では、ウイルス抗原は、インフルエンザ抗原（例えば、血球凝集素Ｈ５およびＨ７）、メタニューモウイルス抗原、パラインフルエンザウイルス抗原、ニューカッスル病ウイルス抗原、センダイウイルス抗原、および伝染性喉頭気管炎ウイルス抗原（ＩＬＶ）などの呼吸器疾患をもたらすウイルスに由来する。ある実施形態では、ウイルス抗原は、ヒト１型パラインフルエンザウイルス、ヒト２型パラインフルエンザウイルス、ヒト３型パラインフルエンザウイルスまたはセンダイウイルスに由来する。別の実施形態では、ウイルス抗原は、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ ｎｅｆ、インフルエンザウイルスノイラミダーゼ、インフルエンザウイルス血球凝集素、ＨＴＬＶ ｔａｘ、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（例えば、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤおよびｇＥ）またはＢ型肝炎表面抗原、Ｃ型肝炎ウイルスＥタンパク質またはコロナウイルススパイクタンパク質である。

【0211】

別の実施形態では、ＲＳＶは、１以上の細菌抗原（例えば、細菌コートタンパク質または細菌に関連する保護抗原）を発現するように操作される。細菌抗原の限定されない例としては、アクワスピリルム科(Aquaspirillum family)、アゾスピリルム科(Azospirillum family)、アゾトバクター科(Azotobacteraceae family)、バクテロイデス科(Bacteroidaceae family)、バルトネラ種(Bartonella species)、デロビブリオ科(Bdellovibrio family)、カンピロバクター種(Campylobacter species)、クラミジア種(Chlamydia species)（例えば、肺炎クラミジア(Chlamydia pneumoniae)）、腸内細菌科(Enterobacteriaceae family)（例えば、シトロバクター種(Citrobacter species)、エドワードシエラ(Edwardsiella)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エルウィニア種(Erwinia species)、大腸菌(Escherichia coli)、ハフニア種(Hafnia species)、クレブシエラ種(Klebsiella species)、モーガネラ種(Morganella species)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、プロビデンシア(Providencia)、サルモネラ菌種(Salmonella species)、レイ菌(Serratia marcescens)、および赤痢菌(Shigella flexneri）、ガードネレラ科(Gardinella family)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、ハロバクテリウム科(Halobacteriaceae family)、ヘリコバクター科(Helicobacter family)、レジオネラ科(Legionallaceae family)、リステリア種(Listeria species)、メチロコッカス科(Methylococcaceae family)、マイコバクテリア(mycobacteria)（例えば、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、ナイセリア科(Neisseriaceae family)、海洋らせん菌科(Oceanospirillum family)、パスツレラ科(Pasteurellaceae family)、肺炎球菌種(Pneumococcus species)、シュードモナス種(Pseudomonas species)、リゾビウム科(Rhizobiaceae family)、スピリルム科(Spirillum family)、スピロソマ科(Spirosomaceae family)、ブドウ状球菌(Staphylococcus)（例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)およびスタフィロコッカス・ピロゲネス(Staphylococcus pyrogenes)）、連鎖球菌(Streptococcus)（例えば、腸炎連鎖球菌(Streptococcus enteritidis)、糞便連鎖球菌(Streptococcus fasciae)、および肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)）、バムピロビブル・ヘリコバクター科(Vampirovibr Helicobacter family)、エルシニア科(Yersinia family)、炭疽菌(Bacillus antracis)およびバンピロビブリオ科(Vampirovibrio family)に由来する抗原が挙げられる。特定の実施形態では、細菌抗原は、 肺炎球菌種(Pneumococcus species)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、連鎖球菌(Streptococcus)および肺炎クラミジア(Chlamydia pneumoniae)などの呼吸器系疾患を引き起こすか、または関連する細菌に由来する。

【0212】

別の実施形態では、ＲＳＶは、病原真菌から得られる、または由来する１以上の真菌抗原を発現するように操作される。真菌抗原の限定されない例としては、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)；ブラストミセス・デルマティティディス(Blastomyces dermatitidis)；アイェロミセス・デルマティティジス(Aiellomyces dermatitidis)；ヒストプラズマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum)；コクシジオイデス・イミチス(Coccidioides immitis)；Ｃ．アルビカンス(C. albicans)、Ｃ．トロピカリス(C. tropicalis)、Ｃ．パラプシロシス(C. parapsilosis)、Ｃ．ギリエルモンディ(C. guilliermondii)およびＣ．クルセイ(C. krusei)を含むカンジダ種(Candida species)；煙色コウジ菌(A. fumigatus)、黄色コウジ菌(A. flavus)および黒色コウジ菌(A. niger)を含むアスペルギルス種(Aspergillus species)、クモノスカビ種(Rhizopus species)；リゾムコール種(Rhizomucor species)；カニングハメラ種(Cunninghammella species)；Ａ．サクセナエ(A. saksenaea)、Ａ．ムコール(A. mucor)およびＡ．アブシディア(A. absidia)を含むアポフィソミセス種(Apophysomyces species)；スポロトリックス・シェンキー(Sporothrix schenckii)、パラコクシジオイデス・ブラシリエンシス(Paracoccidioides brasiliensis)；シュードアレシェリア・ボイディー(Pseudallescheria boydii)、トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)；トリコフィトン種(Trichophyton species)、小胞子菌種( Microsporum species)および皮膚糸状菌種(Dermatophyres species)に由来する抗原が挙げられる。特定の実施形態では、真菌抗原は呼吸器系疾患を引き起こすか、または関連する細菌に由来する病原真菌に由来する。

【0213】

別の実施形態では、ＲＳＶは１以上の寄生虫抗原を発現するように操作される。寄生虫抗原の限定されない例としては、アピコンプレクサ門のメンバー、例えば、バベシア(Babesia)、トキソプラズマ(Toxoplasma)、プラスモジウム(Plasmodium)、アイメリア(Eimeria)、イソスポラ(Isospora)、アトキソプラズマ(Atoxoplasma)、シストイソスポラ(Cystoisospora)、ハモンジア(Hammondia)、ベスニオチア(Besniotia)、サルコシスチス(Sarcocystis)、ブレンケリア(Frenkelia)、ヘモプロテウス(Haemoproteus)、ロイコシトゾーン(Leucocytozoon)、タイレリア(Theileria)、パーキンサス(Perkinsus)およびグレガリナ種(Gregarina spp.)など；ニューモシスチス・カリニイ(Pneumocystis carinii)；微胞子虫亜門のメンバー、例えば、ノセマ(Nosema)、エンテロシトゾーン(Enterocytozoon)、エンセファリトゾーン(Encephalitozoon)、セプタタ(Septata)、ムラゼキア(Mrazekia)、アンブリオスポラ(Amblyospora)、アメゾン(Ameson)、グルゲア(Glugea)、プレイストフォラ(Pleistophora)およびミクロスポリジウム種(Microsporidium spp)など；およびアスセトスポラ門のメンバー、例えば、ハプロスロピジウム種(Haplosporidium spp.)、ならびに熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、三日熱マラリア原虫(P. vivax)、卵形マラリア原虫(P. ovale)、四日熱マラリア原虫(P. malaria)を含む種など；トキソプラズマ(Toxoplasma gondii)；メキシコリーシュマニア(Leishmania mexicana)、熱帯リーシュマニア(L. tropica)、大型リーシュマニア(L. major)、エチオピアリーシュマニア(L. aethiopica)、ドノバンリーシュマニア(L. donovani)、クルーズトリパノソーマ(Trypanosoma cruzi)、ブルーストリパノソーマ(T. brucei)、マンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)、ビルハルツ住血吸虫(S. haematobium)、日本住血吸虫(S. japonium)；旋毛虫(Trichinella spiralis)；バンクロフト糸状虫(Wuchereria bancrofti)；マレー糸状虫(Brugia malayli)；赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)；蟯虫(Enterobius vermiculoarus)；有鉤条虫(Taenia solium)、無鉤条虫(T. saginata)、腟トリコモナス(Trichomonas vaginatis)、腸トリコモナス(T. hominis)、口腔トリコモナス(T. tenax)； ランブル鞭毛虫(Giardia lamblia)；クリプトスポリジウム・パルヴム(Cryptosporidium parvum)； ニューモシティス・カリニイ(Pneumocytis carinii)、バベシア・ボビス(Babesia bovis)、Ｂ．ダイバージェンス(B. divergens)、Ｂ．ミクロティ(B. microti)、イソスポラ・ベリ(Isospora belli)、Ｌ．ホミニス(L hominis)；二核アメーバ(Dientamoeba fragilis)；回旋糸状虫(Onchocerca volvulus)；回虫(Ascaris lumbricoides)；アメリカ鉤虫(Necator americanis)；十二指腸鉤虫(Ancylostoma duodenale)；糞線虫(Strongyloides stercoralis)；フィリピン毛頭虫(Capillaria philippinensis)；広東住血線虫(Angiostrongylus cantonensis)；矮小条虫(Hymenolepis nana)；広節裂頭条虫(Diphyllobothrium latum)；単包条虫(Echinococcus granulosus)、多包条虫(E. multilocularis)；ヴェステルマン肺吸虫(Paragonimus westermani)、Ｐ．カリエンシス(P. caliensis)；クロノルキス・シネンシス(Chlonorchis sinensis)；オピストルキス・フェリネウス(Opisthorchis felineas)、Ｇ．ビベリニ(G. Viverini)、肝蛭(Fasciola hepatica)、疥癬虫(Sarcoptes scabiei)、ヒトジラミ(Pediculus humanus)；ケジラミ(Phthirlus pubis)；およびヒトヒフバエ(Dermatobia hominis)に由来する抗原が挙げられる。

【0214】

７． 特定の実施形態
１．細胞培養でインフルエンザウイルスを少なくとも約８．０のｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬおよび／または少なくとも約８．０のｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬまで生産する方法であって、
（ａ）ＭＤＣＫ細胞を無血清培養培地で、約１００〜２００ｒｐｍの間の攪拌速度；約６．０〜約７．８の間のｐＨ；約３３℃〜約４２℃の間の温度；および約３５％〜約１００％の間の溶存酸素（ＤＯ）からなる群から選択される１以上の培養条件を維持しつつ増殖させること；
（ｂ）培養培地を交換することなく、増殖されたＭＤＣＫ細胞をインフルエンザウイルスに感染させること；
（ｃ）感染した増殖ＭＤＣＫ細胞をインフルエンザウイルスの複製を可能とする条件下でインキュベートすること
を含む方法。

【0215】

２．培養培地がＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １１０である、実施形態１に記載の方法。

【0216】

３．ＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １１０が９ｇ／Ｌのグルコースを含んでなる、実施形態１または２に記載の方法。

【0217】

４．ＭＤＣＫ細胞が微小担体上で接着細胞として増殖される、実施形態１〜のいずれか一項に記載の方法。

【0218】

５．微小担体の濃度が１〜３ｇ／Ｌの間である、実施形態４記載の方法。

【0219】

６．ＭＤＣＫ細胞が微小担体に１０〜４０細胞／微小担体の間の密度で播種され、２〜５日の間増殖される、実施形態４または５に記載の方法。

【0220】

７．攪拌速度が約１００〜２００ｒｐｍの間に維持され；ｐＨが約６．０〜約７．８の間に維持され；温度が約３３℃〜約４２℃の間に維持され；および溶存酸素（ＤＯ）が約３５％〜約１００％の間に維持される、実施形態１〜６のいずれか一項に記載の方法。

【0221】

８．ＭＤＣＫ細胞が１５０ｒｐｍ〜２００ｒｐｍの間の攪拌速度で増殖される、実施形態１〜７のいずれか一項に記載の方法。

【0222】

９．ＭＤＣＫ細胞が７．０〜７．８の間のｐＨで増殖される、実施形態１〜８のいずれか一項に記載の方法。

【0223】

１０．ｐＨが７．４±０．２である、実施形態９に記載の方法。

【0224】

１１．ＭＤＣＫ細胞が３７±２℃の温度で増殖される、実施形態１〜１０のいずれか一項に記載の方法。

【0225】

１２．ＭＤＣＫ細胞がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７９０９またはＰＴＡ−７９１０として寄託された細胞である、実施形態１〜１１のいずれか一項に記載の方法。

【0226】

１３．ＭＤＣＫ細胞が５×１０^５〜３×１０^６細胞／ｍＬの間の細胞密度で増殖される、実施形態１〜１２のいずれか一項に記載の方法。

【0227】

１４．工程（ｂ）が０．０１×１０^３ＦＦＵ／ｍＬ〜０．１×１０^３ＦＦＵ／ｍＬの間のウイルス投入量を用いて行われる、実施形態１〜１３のいずれか一項に記載の方法。

【0228】

１５．工程（ｂ）が０．０１×１０^３ＦＦＵ／ｍＬ〜０．０５ＦＦＵ／ｍＬの間のウイルス投入量を用いて行われる、実施形態１４に記載の方法。

【0229】

１６．工程（ｂ）が０．００００１ＦＦＵ／細胞〜０．０００１ＦＦＵ／細胞の間のウイルス投入量を用いて行われる、実施形態１〜１５のいずれか一項に記載の方法。

【0230】

１７．工程（ｂ）が０．００００１ＦＦＵ／細胞〜０．００００５ＦＦＵ／細胞の間のウイルス投入量を用いて行われる、実施形態１６に記載の方法。

【0231】

１８．インフルエンザウイルスが低温適応型である、実施形態１〜１７のいずれか一項に記載の方法。

【0232】

１９．インフルエンザウイルスがまた弱毒型かつ温度感受性である、実施形態１８に記載の方法。

【0233】

２０．インフルエンザウイルスがインフルエンザＡウイルスである、実施形態１〜１９のいずれか一項に記載の方法。

【0234】

２１．インフルエンザウイルスがインフルエンザＢウイルスである、実施形態１〜２０のいずれか一項に記載の方法。

【0235】

２２．インフルエンザＡウイルスがインフルエンザ株ｃａ Ａ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０の１以上の遺伝子セグメントを含んでなる、実施形態２０に記載の方法。

【0236】

２３．インフルエンザＢウイルスがインフルエンザ株ｃａ Ｂ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／６６の１以上の遺伝子セグメントを含んでなる、実施形態２１に記載の方法。

【0237】

２４．工程（ｃ）におけるインフルエンザウイルスの複製中、ＭＤＣＫ細胞が３０℃〜３５℃の間でインキュベートされる、実施形態１〜２３のいずれか一項に記載の方法。

【0238】

２５．工程（ｃ）におけるインフルエンザウイルスの複製中、ＭＤＣＫ細胞が３３±２℃でインキュベートされる、実施形態２４に記載の方法。

【0239】

２６．工程（ｃ）におけるインフルエンザウイルスの複製中、ＭＤＣＫ細胞が１５０ｒｐｍ〜２００ｒｐｍの間の攪拌速度でインキュベートされる、実施形態１〜２５のいずれか一項に記載の方法。

【0240】

２７．工程（ｃ）におけるインフルエンザウイルスの複製中、ＭＤＣＫ細胞が約７．０〜約７．８の間のｐＨでインキュベートされる、実施形態１〜２６のいずれか一項に記載の方法。

【0241】

２８．ｐＨが７．４±０．２である、実施形態２７に記載の方法。

【0242】

２９．工程（ｃ）中、プロテアーゼが存在する、実施形態１〜２８のいずれか一項に記載の方法。

【0243】

３０．プロテアーゼがセリンプロテアーゼである、実施形態２９に記載の方法。

【0244】

３１．プロテアーゼが組換え動物不含プロテアーゼである、実施形態２９または３０に記載の方法。

【0245】

３２．プロテアーゼが０．０３倍の終濃度で存在する、実施形態３１に記載の方法。

【0246】

３３．感染後に培養培地を回収する工程をさらに含む、実施形態１〜３２のいずれか一項に記載の方法。

【0247】

３４．感染後４８時間〜７２時間の間に培養培地が回収される、実施形態３３に記載の方法。

【0248】

３５．微小担体上で増殖させた細胞培養物中の細胞のビーズ間移動を行う方法であって、
（ａ）増殖培地の全部または一部を、キレート剤を含んでなる洗浄培地に置き換える、第一の洗浄工程；
（ｂ）攪拌を伴う、または伴わない、洗浄培地中での細胞培養物のインキュベーション；
（ｃ）洗浄培地中の細胞培養物へのプロテアーゼの添加；
（ｄ）攪拌を伴う、または伴わない、細胞培養物とプロテアーゼのインキュベーション；および
（ｅ）新たな増殖容器への移行
を含む方法。

【0249】

３６．工程（ｂ）と（ｃ）の間に、キレート剤を含んでなる洗浄培地による第二の洗浄をさらに含む、実施形態３５に記載の方法。

【0250】

３７．工程（ｄ）の後に新鮮増殖培地および／またはさらなる微小担体が添加される、実施形態３５または３６に記載の方法。

【0251】

３８．工程（ｅ）の前、工程（ｅ）中、工程（ｅ）の後に新鮮増殖培地および／またはさらなる微小担体が添加される、実施形態３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。

【0252】

３９．キレート剤の濃度が０．４ｍＭ〜０．６ｍＭの間である、実施形態３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。

【0253】

４０．洗浄培地のｐＨが７．８〜８．２の間である、実施形態３５〜３９のいずれか一項に記載の方法。

【0254】

４１．プロテアーゼが組換え動物不含プロテアーゼである、実施形態３５〜４０のいずれか一項に記載に記載の方法。

【0255】

４２．プロテアーゼが０．０４倍〜０．０６倍の間の終濃度まで添加される、実施形態４１に記載の方法。

【0256】

４３．工程（ｂ）中、細胞培養物が攪拌される、実施形態３５〜４２のいずれか一項に記載の方法。

【0257】

４４．工程（ｄ）中、細胞培養物が攪拌される、実施形態３５〜４３のいずれか一項に記載の方法。

【0258】

４５．細胞培養物が１７５ｒｐｍ〜２７５ｒｐｍの間で攪拌される、実施形態４３または４４に記載の方法。

【0259】

４６．細胞培養物が２３０±２５ｒｐｍで攪拌される、実施形態４５に記載の方法。

【0260】

４７．工程（ｂ）および（ｄ）において細胞培養物が１５〜６０分間インキュベートされる、実施形態３５〜４６のいずれか一項に記載の方法。

【0261】

４８．工程（ｄ）の後にプロテアーゼ阻害剤が添加される、実施形態３５〜４７のいずれか一項に記載の方法。

【0262】

４９．微小担体上で増殖させた細胞培養物中の細胞のビーズ間移動を行う方法であって、
（ａ）細胞を洗浄せずに、細胞培養物にキレート剤を添加すること；
（ｂ）細胞培養物をキレート剤の存在下で、攪拌を伴って、または伴わずにインキュベートすること；
（ｃ）キレート剤の存在下、細胞培養物にプロテアーゼを添加すること；
（ｄ）細胞培養物をプロテアーゼとともに、攪拌を伴って、または伴わずにインキュベートすること；および
（ｅ）さらなる新鮮培地を添加し、細胞培養物に１以上の培地成分を補給すること
を含む方法。

【0263】

５０．１以上の培地成分がＣａＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２、ＭｇＳＯ_４、微量元素Ａ、微量元素Ｂおよび微量元素Ｃからなる群から選択される、実施形態４９に記載の方法。

【0264】

５１．１以上の培地成分が１．２５ｍＭ〜１．５ｍＭの間のＣａＣｌ_２、０．１ｍＭ〜０．２ｍＭの間のＭｇＣｌ_２、および０．１〜０．８ｍＭの間のＭｇＳＯ_４、２倍微量元素Ａ、２倍微量元素Ｂおよび２倍微量元素Ｃである、実施形態４９または５０に記載の方法。

【0265】

５２．工程（ｅ）の前、工程（ｅ）中、工程（ｅ）の後に細胞培養物が新たな増殖容器に移される、実施形態４９〜５１のいずれか一項に記載の方法。

【0266】

５３．キレート剤の濃度が０．５ｍＭ〜５ｍＭの間である、実施形態４９〜５２のいずれか一項に記載の方法。

【0267】

５４．キレート剤の濃度が約２ｍＭである、実施形態５３に記載の方法。

【0268】

５５．工程（ｃ）の前または工程（ｃ）中に、細胞培養物のｐＨが必要に応じて７．８〜８．２の間となるように調整される、実施形態４９〜５４のいずれか一項に記載の方法。

【0269】

５６．プロテアーゼが組換え動物不含プロテアーゼである、実施形態４９〜５５のいずれか一項に記載の方法。

【0270】

５７．プロテアーゼが０．０４倍〜０．０６倍の間の終濃度まで添加される、実施形態４９〜５６のいずれか一項に記載の方法。

【0271】

５８．工程（ｂ）中、細胞培養物が攪拌される、実施形態４９〜５７のいずれか一項に記載の方法。

【0272】

５９．工程（ｄ）中、細胞培養物が攪拌される、実施形態４９〜５８のいずれか一項に記載の方法。

【0273】

６０．細胞培養物が１７５ｒｐｍ〜２７５ｒｐｍの間で攪拌される、実施形態５８または５９に記載の方法。

【0274】

６１．工程（ｂ）および（ｄ）において細胞培養物が１５〜９０分間インキュベートされる、実施形態４９〜６０のいずれか一項に記載の方法。

【0275】

６２．工程（ｄ）の後にプロテアーゼ阻害剤が添加される、実施形態４９〜６１のいずれか一項に記載の方法。

【0276】

６３．細胞培養物からインフルエンザウイルスを精製する方法であって、
（ａ）約１．２マイクロメートル〜約０．４５マイクロメートルの間の孔径を有する少なくとも１つの膜を通過させるダイレクトフロー濾過（ＤＦＦ）によるウイルス回収物の清澄化；
（ｂ）工程（ａ）の後の、５００ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する膜を用いたタンジェントフロー限外濾過（ＵＦ）による濃縮およびダイアフィルトレーション（ＤＦ）によるバッファー交換；
（ｃ）工程（ｂ）の後の、アフィニティーカラムクロマトグラフィーによる精製；
（ｄ）工程（ｃ）の後の、５００ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する膜を用いたＵＦによる濃縮および／またはＤＦによるバッファー交換；および
（ｅ）工程（ｄ）の後の、約０．４５マイクロメートル〜約０．２２マイクロメートルの間の孔径を有する少なくとも１つの膜を通過させるＤＦＦによる除菌
を含み、精製ウイルスの総回収率が少なくとも３０％であり、精製ウイルスがウイルス７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ当たり０．１ｎｇ未満のＨＣＤおよび０．３μｇ未満のＨＣＰを含んでなる、方法。

【0277】

６４．工程（ａ）の前に、ウイルス回収物にスクロースおよびリン酸バッファーが、１０％の変動の範囲内で、２１８ｍＭスクロース、１１ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０〜７．４の終濃度まで添加される、実施形態６３に記載の方法。

【0278】

６５．工程（ａ）と（ｂ）が組み合わせられる、実施形態６３または６４に記載の方法。

【0279】

６６．工程（ｂ）が約１０ｐｓｉ〜約２０ｐｓｉの間の膜間差圧（ＴＭＰ）で行われる、実施形態６３〜６５のいずれか一項に記載の方法。

【0280】

６７．工程（ｂ）が約３５リットル／メートル／時間（ＬＭＨ）〜約５０ＬＭＨの間の流速で行われる、実施形態６３〜６６のいずれか一項に記載の方法。

【0281】

６８．工程（ｂ）が約１２，０００／秒〜約１６，０００／秒の間の剪断速度で行われる、実施形態６３〜６７のいずれか一項に記載の方法。

【0282】

６９．工程（ｂ）の結果として５倍濃縮が起こり、５ダイアボリュームのバッファーが交換される、実施形態６３〜６８のいずれか一項に記載の方法。

【0283】

７０．工程（ｂ）の交換バッファーが、１０％の変動の範囲内で、２１８ｍＭスクロース、１１ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０〜７．４を含んでなる、実施形態６３〜６９のいずれか一項に記載の方法。

【0284】

７１．工程（ｄ）においてＤＦによるバッファー交換が起こる、実施形態６３〜７０のいずれか一項に記載の方法。

【0285】

７２．工程（ｄ）においてＵＦによる濃縮およびＤＦによるバッファー交換が起こる、実施形態６３〜７０のいずれか一項に記載の方法。

【0286】

７３．工程（ｄ）の結果として少なくとも２倍の濃縮が起こる、実施形態６３〜７０または７２のいずれか一項に記載の方法。

【0287】

７４．工程（ｄ）において少なくとも８ダイアボリュームのバッファーが交換される、実施形態６３〜７３のいずれか一項に記載の方法。

【0288】

７５．工程（ｄ）の交換バッファーが、１０％の変動の範囲内で、２００ｍＭスクロース、１００ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０〜７．４を含んでなる、実施形態６３〜７４のいずれか一項に記載の方法。

【0289】

７６．８．０ｌｏｇ_１０ＦＦＵ〜１１ｌｏｇ_１０ＦＦＵの間のインフルエンザウイルスがアフィニティー媒体１ｍｌ当たりに付加される、実施形態６３〜７５のいずれか一項に記載の方法。

【0290】

７７．９．０ｌｏｇ_１０ＦＦＵ〜１０．０ｌｏｇ_１０ＦＦＵの間のインフルエンザウイルスがアフィニティー媒体１ｍｌ当たりに付加される、実施形態７６に記載の方法。

【0291】

７８．９．２ｌｏｇ_１０ＦＦＵ〜９．８ｌｏｇ_１０ＦＦＵの間のインフルエンザウイルスがアフィニティー媒体１ｍｌ当たりに付加される、実施形態７６に記載の方法。

【0292】

７９．ウイルスが付加された後、アフィニティー媒体が、１０％の変動の範囲内で、２１８ｍＭスクロース、１１ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０〜７．４を含んでなるバッファーで洗浄される、実施形態６３〜７８のいずれか一項に記載の方法。

【0293】

８０．工程（ｃ）に非特異的エンドヌクレアーゼを含んでなるバッファーへの曝露がさらに組み込まれている、実施形態６３〜７９のいずれか一項に記載の方法。

【0294】

８１．非特異的ヌクレアーゼを含んでなるバッファーへの曝露の長さが３０〜９０分間である、実施形態８０に記載の方法。

【0295】

８２．非特異的エンドヌクレアーゼを含んでなるバッファーへの曝露の長さが５０±１０分である、実施形態８１に記載の方法。

【0296】

８３．非特異的エンドヌクレアーゼがベンゾナーゼ（商標）である、実施形態８０〜８２のいずれか一項に記載の方法。

【0297】

８４．非特異的エンドヌクレアーゼを含んでなるバッファーが、１０％の変動の範囲内で、２１８ｍＭスクロース、１１ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０〜７．４、および４０Ｕ／ｍＬ〜６０Ｕ／ｍＬの間終濃度の非特異的エンドヌクレアーゼを含んでなる、実施形態８０〜８３のいずれか一項に記載の方法。

【0298】

８５．非特異的エンドヌクレアーゼを含んでなるバッファーによる処理の後、アフィニティー媒体が、１０％の変動の範囲内で、２１８ｍＭスクロース、１１ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０〜７．４を含んでなるバッファーで洗浄される、実施形態８０〜８４のいずれか一項に記載の方法。

【0299】

８６．精製ウイルスがウイルス７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ当たり０．００５０ｎｇ未満の非特異的エンドヌクレアーゼを含んでなる、実施形態８０〜８５のいずれか一項に記載の方法。

【0300】

８７．アフィニティー媒体がセルファイン（商標）サルフェイトおよびＦｌｕＳｅｌｅｃｔ（商標）からなる群から選択される、実施形態６３〜８６のいずれか一項に記載の方法。

【0301】

８８．インフルエンザウイルスがアフィニティー媒体から、１０％の変動の範囲内で、１Ｍ塩化ナトリウム、２１８ｍＭスクロースおよび１１ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０〜７．４を含んでなるバッファーで溶出される、実施形態６３〜８７のいずれか一項に記載の方法。

【0302】

８９．実施形態１〜３４または６３〜８８のいずれか一項に記載の方法により生産されたインフルエンザウイルス。

【0303】

９０．ウイルス７．０±０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ当たり０．１ｎｇ未満のＨＣＤおよび０．３μｇ未満のＨＣＰを含んでなる精製されたインフルエンザウイルス（このインフルエンザウイルスは哺乳類細胞の培養物から精製されたものである）。

【0304】

９１．哺乳類細胞がヒト二倍体肺繊維芽細胞、ヒト網膜芽細胞腫細胞、ヒト腎臓細胞、胎児アカゲザル肺細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞およびイヌ腎臓細胞からなる群から選択される、実施形態９０に記載の精製されたインフルエンザウイルス。

【0305】

９２．哺乳類細胞がＭＤＣＫ細胞である、実施形態９０に記載の精製されたインフルエンザウイルス。

【0306】

９３．哺乳類細胞培養物がＶＥＲＯ細胞培養物である(wherein the mammalian cells are culture is a VERO cell culture)、実施形態９０に記載の精製されたインフルエンザウイルス。

【0307】

９４．実施形態８９〜９３のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルスのポリペプチドを含んでなる免疫原性組成物。

【実施例】

【0308】

８．実施例
以下、本発明を下記の実施例を参照して説明する。これらの実施例は単に例示のための提供されるものであり、本発明はこれらの実施例に何ら限定されず、本明細書に提供される教示の結果として明白となるいずれの、またあらゆる変形を包含するものと解釈されるべきである。当然のことながら、用いられる特定の器具および試薬、サイズ、製造業者などの具体的な列挙または記載は、特に断りのない限り、本発明に対する限定とみなされないと考えられる。さらに、類似の性能を有する他の器具および試薬は容易に置き換えが可能であると考えられる。

【0309】

８．１ 培地および細胞培養プロセス
ＭＤＣＫ細胞、特に、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞を高密度まで増殖させるのに有用な無血清培地処方物（例えば、ＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １０７、ＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １０５）はすでに記載されている（例えば、ＦＬ４１０ＵＳおよびＧ−ＦＬ４１４ＵＳ参照）。しかしながら、これらの無血清培地処方物を、無血清培地に順応させた非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７９０９またはＰＴＡ−７９１０）とともに用いた研究では、培地交換を行わなくても合併結合インフルエンザウイルスの妥当なピークウイルス力価（一般にｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬとして評価される）を得ることができたが、それらのピーク力価は、培地交換（細胞増殖後と感染前（または同時に）増殖培地の一部（例えば、〜６７％）を除去して感染培地に置き換える）を行った場合に得られたものよりもなお低かったことが明らかになった。さらに、これらのピーク力価を得るには、さらなるプロテアーゼ（ＴｒｙｐＬＥ）が必要であった。培地交換の必要および／またはさらなるプロテアーゼの必要を克服するために、強化培地ＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １１０を開発した。ＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １１０は５倍濃度のビタミン、リノール酸、リポ酸、ヌクレオシド、プトレッシンおよび従前に記載されている培地に存在するほとんど全てのアミノ酸を含んでなる（表３参照）。ＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １１０を用いても、ＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １０５ ＋ＴＥで得られるもの以上には細胞密度は向上されなかった（データは示されていない）。しかしながら、ＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １１０を用いると、０％と６７％の培地交換が同等のウイルス力価を示した。

【0310】

非培地交換（ＭＸ）プロセスと、４台のシードリアクターからビーズ間移動（以下の第８．２節に示されている実施例参照）により調製され、ＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １１０培地で増殖された細胞を用いた１２回の実施の性能を以下に記載する。野生型株Ａ／ウルグアイ由来のＨＡおよびＮＡを含んでなる３つの低温適応（ｃａ）、温度感受性（ｔｓ）、弱毒（ａｔｔ）型合併結合インフルエンザウイルス株（識別子「ｃａ」で始まる野生型株の表記で表される）を２Ｌ規模で生産したところ、３つ全ての株が少なくとも８．４ｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬの力価でウイルスを生産した。１×ＤＰＢＳ洗浄を用いたビーズ間移動およびＴｒｙｐＬＥ ｓｅｌｅｃｔおよびＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を用いたトリプシン処理の後には、シードリアクター中での細胞の適切な解離と最終生産リアクター（ＦＰＲ）中での細胞の接着が見られた。感染の際、最適な回収時間を決定するためにこれらの細胞を定期的にサンプリングした。ピークウイルス力価は全てのウイルス種で感染３日後（ｄｐｉ）に見られることが分かった。これらの各株について４回の実験を行って結果の再現性を確認し、これらのデータは互いに一致した。ｃａ Ａ／ウルグアイ／７１６／２００７は感染３日後（ｄｐｉ）に８．７±０．０５ｌｏｇ_１０ＦＦＵの最大力価をもたらし、ｃａ Ａ／サウスダコタ／６／２００７およびｃａ Ｂ／フロリダ／４／２００６のピーク力価は３ｄｐｉにおいてそれぞれ８．８±０．０ｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬおよび８．４５±０．２５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬであった。

【0311】

これらの実験からのデータの再現性は、非培地交換プロセスがロバストなプロセスであることを示す。よって、強化培地は培地または成分の交換または添加のいずれを行わなくても生産性を維持した。従って、強化培地の開発および使用により、培地交換／補給の必要という、細胞培養に基づくインフルエンザワクチンの生産における最も興味深い操作上の問題の１つが克服された。

【0312】

８．１．１ 材料および方法
材料、試薬および器具： 類似の性能を有する他の材料、器具および試薬は容易に置き換えが可能である。

【0313】

１．ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｈａｍ Ｆ１２(Gibco, Grand Island, NY, カタログ番号ME080012)
２．ＭｉｌｌｉＱまたはＷＦＩ Ｗａｔｅｒ
３．ＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １１０塩基粉末(Gibco, Grand Island, NY, カタログ番号ME080045)
４．グルコース(Invitrogen, Carlsbad, California, カタログ番号15023-021)
５．亜セレン酸ナトリウム(Sigma, St. Louis, MO, カタログ番号6607-31) ？
６．Ｌ−グルタミン(Gibco, Grand Island, NY, カタログ番号25030-081)
７．ＣＤ脂質（１００Ｘ）(Gibco, Grand Island, NY, カタログ番号11905-031)
８．コムギペプトン(Organotechnie, SAS, La Courneuve, France, カタログ番号19559)
９．インスリン(Serological, Norcross, GA, カタログ番号 4506)
１０．Ｔ３(Sigma, St. Louis, MO, カタログ番号T5516)
１１．ヒドロコルチゾン(Mallinckrodt, Phillipsburg, NY, カタログ番号8830(-05))
１２．プロスタグランジンＥ１(Sigma, St. Louis, MO, カタログ番号P7527)
１３．ＥＧＦ(Sigma, St. Louis, MO, カタログ番号E9644)
１４．クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム(J T Baker, Phillipsburg, NJ, カタログ番号1980-01)
１５．トロポロン(Sigma, St. Louis, MO, カタログ番号T89702-5G)
１６．微量元素Ａ(Cellgro/Mediatech, Manassas, VA, カタログ番号99-182-cl)
１７．微量元素Ｂ(Cellgro/Mediatech, Manassas, VA, カタログ番号99-175-cl)
１８．微量元素Ｃ(Cellgro/Mediatech, Manassas, VA, カタログ番号99-176-cl)
１９．重炭酸ナトリウム(Invitrogen, Carlsbad, California, カタログ番号91425/87-5067)
２０．ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）ｐＨ−７．４(Invitrogen, Carlsbad, California, カタログ番号14190-367)）
２１．ＥＤＴＡ−ＤＰＢＳ溶液バッグ(Gibco カタログ番号14190-367)
２２．０．５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８(Gibco, Grand Island, NY, カタログ番号15575-038)
２３．０．２μｍ ｓｔｅｒｉ ｃｕｐフィルター(Millipore, Bedford, MA, カタログ番号SCGPU05RE)
２４．ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ(Gibco, Grand Island, NY, カタログ番号12563)
２５．リママメ阻害剤(Worthington, Lakewood, NJ, カタログ番号LS002829)
２６．Ｃｙｔｏｄｅｘ３(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, カタログ番号17-0485-03)
２７．スクロースリン酸(Hyclone, Logan, UT, カタログ番号SH3A1578-01)
２８．１０−２０Ｌ無菌バッグ(SAFC Biosciences JRH, Lenexa, Kansas, 1329B)
２９．回転瓶(Corning, Corning, NY, カタログ番号 3907)
３０．ＮａＯＨ １Ｍ溶液(EMD, Darmstadt, Germany, カタログ番号 1071)
３１．０．２μｍ無菌フィルター(Corning, Corning, NY, カタログ番号 430320, 430767)
３２．１ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、２５ｍＬ、５０ｍＬピペット(それぞれVWR, Brisbane, CA, カタログ番号53284-700, 53283-704, 708,710)
３３．５ｍＬ吸引ピペット(VWR, Brisbane, CA, カタログ番号 53392-044)
３４．１．８ｍＬエッペンドルフ管(USA Scientific, Ocala FL, カタログ番号 1415-5510)
３５．マイクロピぺットチップ(Art Molecular Bioproducts, San Diego CA, カタログ番号 20E, 200Eおよび1000E)
３６．スクロースリン酸１０×(Hyclone, Logan, UT, カタログ番号SH3A1578-01)
３７．Ａｐｐｌｉｋｏｎコントローラーユニット(Applikon Biotechnology, Foster City, CA Models: ADI 1010, ADI 1025)
３８．３Ｌガラス容器およびヘッドプレート(Biotechnology, Foster City, CA)
３９．２．５” Ａ３１０回転翼(Lightnin, Rochester, NY)
４０．６０ｍｍマリンインペラー(Applikon Biotechnology, Foster City, CA)
４１．４５ｍｍマリンインペラー(Applikon Biotechnology, Foster City, CA)
４２．蠕動ポンプ(Watson Marlow Bredel Pump, Wilmington, MA, Model 520S/R)
４３．バイオセーフティーキャビネット(The Baker Company, Sanford, ME, SG-600)
４４．回転瓶インキュベーター(Bellco Biotechnology, Vineland, NJ, Model 7630-80589)
４５．水浴(Boekel Grant, West Chester, PA, PB-1400)
４６．ヌクレオカウンター(New Brunswick Scientific, Edison, NJ, M1293-0000)
４７．Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ ４００(Nova Biomedical, Waltham, MA, Bioprofile 400)
４８．顕微鏡(Zeiss, Thornwood, NY, Axiovert 25)
４９．デジタルカメラ(Nikon, Melville, NY, Model E5400)
５０．マイクロピぺット(Labsystem, Boston, MA, 型番P2-20, P100, P200, P1000)
５１．ピペットエイド(Drummond, Broomall, PA, カタログ番号 4-000-100)
５２．ＣＯ_２振盪フラスコインキュベーター(ATR Biotech, Laurel, MD, Model AJ118)
細胞供給源： Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）由来の無血清ＭＤＣＫクローンＩＤ ９Ｂ９−１Ｅ４細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７９１０、ＷＯ０８／１０５９３１参照）を回転瓶にて、微量元素Ａ、ＢおよびＣまたはＭｅｄｉＶ ＳＦＭ１０９^４を含むＭｅｄｉＶ ＳＦＭ１０５を用いて培養した。微量元素Ａ、ＢおよびＣを含むＭｅｄｉＶ ＳＦＭ１０５の組成は、ＭｅｄｉＶ ＳＦＭ１０５は液体から作製され、ＭｅｄｉＶ ＳＦＭ１０９は粉末から作製されること以外は、ＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １０９培地と同様である。細胞を通常、２回のＤＰＢＳ洗浄を行わなかったこと以外はＳＯＰ Ｄ０２００^５通りに播種後３〜４日おきに継代培養した。

【0314】

ウイルスシード： このプロセスは２００８／２００９ ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）季節性株：ｃａ Ａ／ウルグアイ／７１６／２００７（ロット番号ｎｂ３９０３ｐｇ９４、１４１９００６７５Ａ）、ｃａ Ａ／Ｓｏｕｔｈ ｃａ Ｄａｋｏｔａ／６／２００７（ロット番号１４１９００６６６）、およびｃａ Ｂ／フロリダ／４／２００６（１４１９００６４１Ａ）を用いて開発した。これらのシードは全て卵で生産した。プラスミドレスキュー法（例えば、Wang and Duke; 2007 Oct 23, J. Virol., 4:102; Hoffmann, et al., 2000, PNAS, 97(11):6108-13;およびHoffmann, et al., 2002, PNAS, 99(17):11411-6参照）を用いた細胞培養物で生産されたシードウイルスでも同様の結果が得られている。

【0315】

培養培地： これらの実施では、１倍微量元素Ａ、ＢおよびＣおよび計４．５ｇ／ＬのＤ−グルコースを含むＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １０５または計４．５もしくは９．０ｇ／ＬのＤ−グルコースを含むＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １０９をそれぞれ回転瓶およびシードリアクター（ＳＲ）実施に関する全ての通常細胞継代培養に用いた。最終生産リアクター（ＦＰＲ）実施には計９．０ｇ／ＬのＤ−グルコースを含むＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １１０培地を用いた。播種条件および予想に応じて、Ｄ−グルコース濃度は約４．５〜約９．０ｇ／Ｌの間に調整すればよい。各培養培地の組成を表３に詳細に示す。

【表3】

【0316】

【0317】

【表4】

【表5】

【0318】

バイオリアクター条件および方法： 全ての実験で、シードリアクター（ＳＲ）からの１：８分割内容物を用い、ＦＰＲに接種し、２００８／２００９季節性ウイルスの合併結合体ｃａ Ａ／ウルグアイ、ｃａ Ａ／サウスダコタおよびｃａ Ｂ／フロリダに感染させた。プロセスのロバスト性を保証し、変動を取り込むため、同じ条件でいくつかのＦＰＲを実施した。最初に、培地交換（ＭＸ）と非培地交換（Ｎｏ−ＭＸ）プロセスを並行して比較するため、各実験に２００８／２００９ウイルスの１つを用いて３つの実験を行った。最初の３つの実験ではそれぞれ、２回の２Ｌ ＦＰＲを同じ条件で反復して行い、感染時に培地交換を行わず、プロセスの変動を取り込むために同じウイルス株に感染させた。このようにして、計６×２ＬのバイオリアクターにＳＲからの１：８分割細胞培養内容物を接種し、非培地交換プロセスで３種類の２００８／２００９季節性ウイルス株の全てに感染させた。

【0319】

最後の２つの実験は、０８／０９株での非培地交換プロセスの性能についてさらなるデータを作製するために行った。第４の実験では、１×２Ｌ ＳＲから３×２Ｌ ＦＰＲに接種し、３つ全ての季節性ウイルス合併結合型に感染させた。実験５は、同じ条件を用いて実験
を繰り返したものである。この実験は、非培地交換プロセスの性能評価を目的にプロセスの変動を取り込むために繰り返した。

【0320】

各実験で感染に用いたウイルス株およびＦＰＲの接種に用いた細胞供給源を表６に示す。

【表6】

【0321】

シードリアクター（ＳＲ）： 全ての実験で、細胞をシードバイオリアクターにて、微量元素Ａ、ＢおよびＣを含有するＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １０５培地（ＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １０５ ＋ ＴＥ）またはＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １０９培地中、２ｇ／ＬのＣｙｔｏｄｅｘ３微小担体を用い、２Ｌまたは５Ｌのいずれかで増殖させた。微量元素Ａ、ＢおよびＣを含むＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １０５の組成は、ＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １０５が液体から作製され、ＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １０９が粉末から作製され、含む亜セレン酸ナトリウムが少ないこと以外は、ＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １０９培地とほぼ同じである。グルコースおよびグルタミン濃度はそれぞれ９．０ｇ／Ｌおよび４ｍＭであった。これらの容器に実験１〜３では１．３５×１０^５細胞／ｍＬを、実験４および５では１．８×１０^５細胞／ｍＬを接種した。ＳＲの溶存酸素（Ｄ．Ｏ．）は、純粋な酸素とＮ_２の組合せを一定合計流０．０２ｖｖｍで用い、５０％に維持した。ｐＨ制御は、全てのＳＲについて、ＣＯ_２と１Ｎ ＮａＯＨの双方を用いて両側で行った。実験１および実験２では、ＳＲの作業容量はそれぞれ２Ｌおよび５Ｌであった。双方ともマリンインペラー１枚を備え、１７５ＲＰＭで攪拌した。実験３および４では、ＳＲの作業容量は２Ｌであった。双方ともライトニンインペラー２機を備え、１７５ＲＰＭで攪拌した。細胞増殖および代謝に対する回転翼および作業容量の影響はこの試験範囲では無視できるものである。最初の３つの実験では、ＳＲに２２．５細胞／ＭＣを接種した。より良い細胞増殖を達成するために、実験４および５のＳＲには３０細胞／ＭＣを接種した。各ＦＰＲをその個々のＳＲとともに示す実験計画を表７に示す。播種４日後、ＳＲの攪拌機、ガス流およびＤ．Ｏ．および温度制御をオフにし、微小担体を沈降させ、細胞を洗浄し、本質的に以下の第８．２節に示される実施例に詳説されているように、バイオリアクターの作業容量の２分の１に、１０×ＴｒｙｐＬＥ ｐＨ８を添加してトリプシン処理を施した。ＳＲの内容物に、表８に明示されているようなＢ２Ｂ移行プロトコールを用いてトリプシン処理を施した。

【0322】

最終生産リアクター（ＦＰＲ）： 次に、シードリアクター内容物をフィードボトルに汲み入れ、この細胞の１２５ｍＬを用いて、１：８分割にてＦＰＲに接種した。ＦＰＲ中の細胞は、９．０ｇ／Ｌグルコース濃度を含有するＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １１０培地で増殖させた。２Ｌ ＦＰＲガラス容器は２機のライトニンインペラーを備えており、１７５ＲＰＭで攪拌した。Ｄ．Ｏ．は、０．０２ｖｖｍの合計流方式で５０％空気飽和に制御した（Ｏ_２ガスとＣＯ_２ガスからＮ_２ガスの供給量を算出し（Ｎ_２＝４０−Ｏ_２−ＣＯ_２）、一定合計流４０ｍＬ／分を維持した）。ｐＨ制御は、全てのＦＰＲについて、ＣＯ_２と１Ｎ ＮａＯＨの双方を用いて両側で行った。増殖期および感染期の温度はそれぞれ３７℃および３３℃に制御した。ＦＰＲ用のウイルス株を表６に示し、ＦＰＲの増殖期および感染期のプロセス条件を表９に示す。

【表7】

【表8】

【表9】

【0323】

分析手順： 容器のサンプリングを毎日行った。ヌクレオカウンターを用いて細胞を数え、細胞の形態を調べるたまに顕微鏡を用いて１０倍で写真を撮影した。ｐＨ、ｐＯ２、ｐＣＯ２およびグルコース濃度、乳酸、グルタミンおよびアンモニウムを、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ ４００ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて毎日モニタリングした。オンライン値とオフライン値の差が０．０３ｐＨ単位よりも大きくなった場合には、バイオリアクターのｐＨ再較正を行った。感染したサンプルを１０倍スクロースリン酸（ＳＰ）で安定化させ、分析まで−８０℃で冷凍した。ウイルス複製の進行は、本質的に下記のように、フォーカル蛍光アッセイ（ＦＦＡ）によりウイルス感染度を測定することによって分析した。

【0324】

フォーカル蛍光アッセイ（ＦＦＡ）： ＭＤＣＫ細胞を９６ウェルプレートにて、ＭＥＭ／ＥＢＳＳ＋１倍非必須アミノ酸＋２ｍＭグルタミン＋ＰＥＮ／Ｓｔｒｅｐ（ＶＧＭ）中、３６±１℃、５±２％ＣＯ_２で密集するまで（〜４日）増殖させる。次に、ＶＧＭを除去し、細胞を新鮮なＶＧＭで洗浄した後、ＶＧＭで連続希釈した（例えば １０^−１、１０^−２…１０^−７）１００μＬのウイルス接種物（例えば、ｃａ Ａ／ウルグアイ、ｃａ Ａ／サウスダコタおよびｃａ Ｂ／フロリダ））に感染させ、３３±１℃、５±２％ＣＯ_２でおよそ１９〜２０時間インキュベートする。各ウイルス希釈液を３反復で細胞に接種する。３３±１℃、５±２％ＣＯ_２でおよそ１９〜２０時間インキュベートした後、以下の手順に従い、サンプルのウイルス力価を求めるため、細胞を抗インフルエンザ抗体で免疫染色する。ウイルスを含有する細胞培養培地を各プレートから除去し、２００μｌ／ウェルのＤＰＢＳで洗浄した後、１００μＬの冷４％パラホルムアルデヒド中、室温で１５±３分固定する。次に、これらのプレートを２５０μｌ／ウェルの１倍リン酸緩衝生理食塩水＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＰＢＳ）で２回洗浄した後、細胞をＡ株またはＢ株のいずれかに特異的な一次抗体とともにインキュベートする。一次抗体を１倍ＰＢＳ中、０．１％サポニン、１％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウム（ＳＢＳＡ）で所望の希釈率まで希釈する。３７±１℃で６０±５分インキュベートした後、一次抗体を除去する。細胞を２５０μＬ ＴＰＢＳで３回洗浄し、ＳＢＳＡで所望の希釈率に調製した蛍光色素コンジュゲート二次抗体（例えば、ＦＩＴＣで標識されたウサギ抗ヒツジ）をウェルに加える。３７±１℃で６０±５分インキュベートした後、二次抗体を除去し、プレートを上記のように２回、ナノウォーターで２回洗浄した後、ペーパータオルでブロットドライ(blot-drying)する。次に、暗所、室温で少なくとも１０分間、蓋を外してプレートを風乾する。倒立蛍光顕微鏡を用い、総倍率１００倍で蛍光シグナルを可視化する。ＳＰＯＴプログラムなどの画像ソフトウエアを用いて画像を採取する。一般に、各ウェルの中央バンドを調べ、全ての感染巣を数え、８〜１２０個の感染巣を持つウェルのみを数える。計数した各ウェルについてｌｏｇ_１０ ＦＦＵ／ｍＬを算出し、３つのウェルの平均値および標準偏差を算出する。

【0325】

８．１．２ 結果および考察
最初の３つの実験と後の２つの実験のシードバイオリアクターについてそれぞれ２２．５および３０細胞／微小担体（ＭＣ）を細胞に接種した。図１は、全ての実験のＳＲについて、生細胞密度（ＶＣＤ）と細胞生存率（Ｖ％）をプロットしたものである。播種４日後、シードリアクターの細胞密度は９４万〜１１４万細胞／ｍＬの範囲となった。この細胞密度の差はおそらく接種細胞濃度２２．５と３０細胞／ＭＣの差のためであった。２２．５および３０細胞／ＭＣを接種したＳＲにおける播種４日後（ｄｐｓ）の細胞密度はそれぞれ０．９５±０．０１および１．１２±０．０２４ １００万細胞／ｍＬであった。全てのバイオリアクターの細胞生存率は９０％を超えていた。培養４日後、シードリアクターにおいて１×０．５ｍＭ ＥＤＴＡ−ＤＰＢＳ洗浄および１０倍ＴｒｙｐＬＥ ｓｅｌｅｃｔを用いたビーズ間移動を行い、細胞をトリプシン処理した。トリプシン処理は、間にサンプリングして顕微鏡下で細胞の解離を観察しながら、３０＋／−１０分続けた。約３０〜４０分トリプシン処理を行った後、およそ９０％の細胞がＭＣから解離し、図２に示されるように単細胞として見られた。これらのトリプシン処理細胞を用い、全ての実験について分割比１：８で最終バイオリアクターに接種を行った。全てのＦＰＲの細胞増殖を図３にプロットした。実験２では全てのＦＰＲのＶＣＤが播種４日目に０．６×１０^６細胞／ｍＬ未満であり、これらのＦＰＲの細胞培養は遅滞期が長かったことから、これらの細胞は播種４日後ではなく播種５日後に感染させた。さらに、実験４のＦＰＲでは感染後のＶＣＤデータが得られなかった。最後に、実験５では、０．５×１０^６細胞／ｍＬ未満の低いＶＣＤであったにもかかわらず、播種４日後にＦＰＲを感染させた。ＦＰＲでは、細胞増殖期中、生存率は９０％を超えた。

【0326】

全てのＦＰＲについて感染時点の細胞密度を表１０に記録する。生細胞密度には大きなならつきが見られた。それは０．４４〜１．１２×１０^６細胞／ｍＬの範囲であった。この差は細胞計数の誤差に関連するものであった。ＳＲおよびＦＰＲ双方の平均ＶＣＤを表１１に記録する。播種４日後、ＳＲおよびＦＰＲの平均ＶＣＤはそれぞれ約１．１２×１０^６細胞／ｍＬおよび０．７３×１０^６細胞ｓ／ｍＬである。

【表10】

【表11】

【0327】

トリプシン処理後、ＦＰＲ内の細胞は播種０日後に微小担体ビーズに接着し、その後、微小担体ビーズの表面で増殖を始めた。微小担体の大部分が細胞で覆われ、播種４日後にはいくつかのビーズだけが空白で残った（細胞に覆われていないビーズ）。細胞の形態は全ての実験で同様であった。播種３日後と感染４日後の典型的な細胞形態を示す写真をそれぞれ図４および図５に示す。

【0328】

播種４日または５日後、実験１、２および３のＦＰＲをそれぞれｃａ Ａ／ウルグアイ、ｃａ Ａ／サウスダコタおよびｃａ Ｂ／フロリダに感染させた。感染前に、細胞培養培地に１０倍ＴｒｐＬＥ ｓｅｌｅｃｔの０．０３倍を加えた。実験４および５では、個々のＦＰＲを季節性株ｃａ Ａ／ウルグアイ、ｃａ Ａ／サウスダコタおよびｃａ Ｂ／フロリダの１つに２０ＦＦＵ／ｍＬで感染させた。図６は、感染６８時間後〜７４時間後（ｈｐｉ）の間にピークウイルス力価に達したことを示す。さらに、ウイルス力価はその後感染９２時間後まで高いままであった。

【0329】

各ウイルス株のタイプの平均ウイルス力価を表１２にまとめる。それらはｃａ Ａ／ウルグアイ、ｃａ Ａ／サウスダコタおよびｃａ Ｂ／フロリダに関してそれぞれ８．７、８．８および８．４５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬであった。これは６７％培地交換を用いた場合にこれらのウイルスで見られたものに一致するか、またはそれを超えるものである。

【0330】

６７％培地交換プロセス（本質的に国際特許公開ＷＯ０８／１０５９３１に記載のように実施、実施例１２参照）と非培地交換プロセス（本質的に上記のように実施）を用いて生産された４つの株（ｃａ Ａ／ウィスコンシン／６７／０５、Ａ ｃａ Ａ／ウルグアイ、ｃａ Ａ／サウスダコタおよびｃａ Ｂ／フロリダ）のウイルス力価を比較するためにさらなる実験を行った。各プロセスと株で少なくとも２回実施した。図７から、各株のピークウイルス力価は６７％培地交換プロセスと非培地交換プロセスとで匹敵するものであることが分かる。

【表12】

【0331】

培地交換は、現行の細胞培養に基づくインフルエンザワクチン製造プロセスにおける主要な操作工程である。培地交換をしなければ、微生物汚染の可能性が減り、操作上都合の良いプロセスが実施できることから、感染前の培地交換を無くすために多大な努力がされてきた。新たなワクチン生産プロセスの変動と、新たなビーズ間移動手順を用いてＳＲから直接採取した細胞をＦＰＲに接種することの実現可能性を評価するため、一連の１２のバイオリアクター実験から、培地交換を用いないプロセスの性能データ、より具体的には、細胞の解離／接着、細胞増殖およびウイルス力価を収集した。３つのウイルス株、すなわち、ｃａ Ａ／ウルグアイ、ｃａ Ａ／サウスダコタおよびｃａ Ｂ／フロリダはそれぞれ、感染前に培地交換をせずに４倍に生産された。 ＳＲにおいてＶＣＤは播種４日後では最大１×１０^６細胞／ｍＬに到達することができ、また、１×ＤＰＢＳ、ＴｒｙｐＬＥ ＳｅｌｅｃｔおよびＥＤＴＡを用いたＢ２Ｂ移動は、トリプシン処理３０〜４０分後のシードリアクターにおいて、有効（＞９０％）な細胞解離を伴って首尾よく達成できたことが確認された。ＦＰＲ内の細胞は微小担体ビーズの表面上で増殖し、感染時には平均ＶＣＤ約０．７３ ×１０^６細胞／ｍＬに達した。非ＭＸプロセスを用いた全てのＦＰＲ実施で、Ａ／ウルグアイ、ｃａ Ａ／サウスダコタおよびｃａ Ｂ／フロリダのピークウイルス力価は感染３日後にそれぞれ８．７±０．０５、８．８±０．０および８．４５±０．２５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬであった。これは６７％培地交換を用いた場合のウイルス株で一般に見られたものよりもよいかまたは同等であった（図８参照）。全てのウイルス型のピークウイルス力価は、８．４ｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬより高かった。これらの結果は明らかに、本明細書に記載されるＢ２Ｂ移動および非ＭＸプロセスが極めてロバストなプロセスであることを示した。それらはコスト的に培地試薬の使用を最小とし、汚染の可能性を軽減することができる。

【0332】

８．２ 交互タンジェントフロー（ＡＴＦ）プロセス
バイオリアクターにおけるin situ流体交換を助長するため、本発明者らは、ａ）微小担体をin situで洗浄し、 ｂ）培養容器内の細胞培養培地を交換し、ｃ）細胞培養により生産された生物製品、ワクチンおよびその他の材料から生産細胞を分離し、はるかにより効率的かつ制御された様式でバルク製品を回収するためのＡＴＦを用いた細胞培養物に基づく製造プロセスを開発した。図１８に示されるように、微小担体の除菌後または培地交換後には廃液バッグに微小担体は存在しない。さらには、表１３に示されるように、ウイルス回収中にダイレクトフロー濾過と組み合わせたＡＴＦを用いても、回収物または最終精製産物中に存在する宿主細胞タンパク質または宿主細胞ＤＮＡに増加は見られない。

【表13】

【0333】

この実施例では、ＡＴＦを用いたいくつかの生産シミュレーション実施と用いない対照実施に関して用いたプロセスおよびパラメーターを記載する。プロセスに使用可能な代表的な器具および試薬を表１４および表１５に詳細に示す。当然のことながら、本明細書において類似の性能を有する他の器具および試薬は置き換えが可能であり、器具および試薬の特定の銘柄またはタイプの具体的記載は、特に断りのない限り、限定として解釈されるべきではない。ＡＴＦシステムは、混合物または懸濁細胞、分子および他の粒子を分化するための効率的な手段を提供する。ＡＴＦプロセスは、迅速な低剪断タンジェントフローを作出するための手段を提供する。ＡＴＦシステムは、プロセスを封じ込めるための手段を提供する。プロセス全体が封じ込められているので、ＡＴＦシステムは、微小担体ビーズ洗浄の前後の除菌、感染前の培地交換および回収プロセス中に使用可能である。濾過システムは、中空繊維濾過モジュールまたは微小担体などのより大きな粒子の分画のためのスクリーンモジュールのいずれかを受け入れるハウジングアセンブリからなる。このハウジングは、一方の末端のプロセス容器またはバイオリアクターと他方の末端の膜ポンプの間に位置する。この容器は濾過される内容物のための貯蔵容器として働く。濾液ポンプは濾過流の制御された除去のために用いられる。濾過されていない材料はシステム内に残る。ＡＴＦはプロセス容器と膜ポンプの間の、正、逆の、拍動型の可逆的、液体流である。ポンプは柔軟な膜で２つのチャンバーに区切られている。ポンプチャンバーの１つは、スクリーンモジュールを介してプロセス容器に自記する液体貯蔵庫として働く。第二のポンプチャンバーは、ポンプ流制御システムに自記するエアチャンバーである。一般に、圧縮空気のエアチャンバーへの制御された添加が行われると、このチャンバーの圧力がプロセス容器よりも高まる。これは、ポンプからスクリーンモジュールを通ってプロセス容器へ液体内容物を送る過程において、エアチャンバーを膨張させ、逆に液体チャンバー内の容量を減じる。スクリーンモジュールの管腔を通る流れが一方向にタンジェントフローを作り出す。逆に、若干加圧された容器によってまたはエアチャンバーを排気管または真空に接続することにより、エアチャンバー内の圧力がプロセス容器よりも低くなり、液体流が容器からポンプの液体チャンバーへ向かい、もう一方の方向にタンジェントフローを作り出す。このサイクルが繰り返される。

【表14】

【表15】

【0334】

播種前調製物： ＡＴＦはバイオリアクターから流体が除去され、かつ／または交換されるいずれのプロセスにも使用可能である。例えば、ＡＴＦシステムは、容器の滅菌前に微小担体ビーズを水和した後、および／またはオートクレーブ工程後にＤＰＢＳ洗浄溶液を除去するために使用可能であり、ＡＴＦシステムは、ＤＰＢＳ洗浄溶液を除去するために使用し、完全増殖培地と置き換えることができる。表１６は、生産シミュレーション実施１〜３において流体交換の際に用いたＡＴＦ制御設定を示す。

【0335】

１．Ｃｙｔｏｄｅｘ３微小担体を調製し、所望の量のＣｙｔｏｄｅｘ３（２Ｌバイオリアクターでは４ｇ、５Ｌバイオリアクターでは１０ｇ）を秤量し、清浄な無菌バイオリアクターに移し、ビーズ１ｇ当たり５０〜１００ｍＬの１倍ＰＢＳ中で３時間以上または一晩水和し、新鮮なＰＢＳで洗浄する。洗浄工程は表１６に詳細に示した設定を用いて、ＡＴＦで行うことができる。

【0336】

２．空いている全てのヘッドプレイスポートに配管およびフィルターを取り付ける。

【0337】

３．分極を可能とするため、較正前にＤＯプローブを一晩接続する（注：最低６時間）
４．製造業者の説明書に従ってｐＨおよびＤＯプローブを較正し、リアクター容器にすでに存在しているＤＰＢＳ内にプローブチップが確実に浸漬されるように、組み立てたバイオリアクターに接続する。必要であれば、リアクター容器にさらなるＤＰＢＳを加える。

【0338】

５．ユニット全体を液体循環中で１５ｐｓｉにて１２１℃で３０分オートクレーブにかける。

【0339】

６．オートクレーブにかけ、冷却したところで、ＤＯプローブ、ｐＨプローブおよびスターラーモーターを接続する。

【0340】

７．１Ｎ ＮａＯＨを小さなフィードボトルに分注し、ベースラインを接続し、その個々のリアクター容器をプライミングする。

【0341】

８．接種１日前に培地バッチを作る（播種）
ａ．所望の量の細胞増殖培地（ＣＧＭ）ＭｅｄｉＶ １０５ ＳＦＭを３７℃の水浴で温める。

【0342】

ｂ．バイオリアクターからＤＰＢＳを、排液ポートから排出する。あるいは、ＡＴＦを用いてＤＰＢＳ洗浄溶液を排出し、表１６に詳細に示されている設定を用いてＣＧＭに置き換える。

【0343】

ｃ．以下の工程を用い、新鮮な温ＣＧＭで一度ビーズを洗浄する。

【0344】

ｉ）ＤＰＢＳを排出した後、所望の容量のＣＧＭを加える。

【0345】

ｉｉ）１０分間１２０ｒｐｍの攪拌制御をオンにする。

【0346】

ｉｉｉ）攪拌をオフにし、ビーズを沈降させ、上清を排出する。

【0347】

ｄ．所望の容量のＣＧＭをバイオリアクターに加える。

【0348】

９．曝気、温度制御およびスターラーをオンにする。細胞拡大のための設定点は次の通りである：ｐＨ＝７．４、温度＝３７℃、ＤＯ＝５０％空気飽和、およびスターラー＝約１３５〜約１７５ｒｐｍの間（一般に小さなバイオリアクターほど速い）。

【0349】

１０．グルコースを最終９ｇ／Ｌまで添加する。

【0350】

１１．サンプルを抜き取り、ＮＯＶＡにより測定し、ＤＯ較正およびｐＨ補正を行う（必要であれば）。

【0351】

１２．バイオリアクターコントローラーをオンにし、４０および３２０ｍＬ／分の間（作業容量が２〜１６Ｌの間の場合）の流速で実施する。

【表16】

【0352】

播種および増殖： 回転瓶またはシードリアクター当たりのおよび平均生細胞を算出し、適当量の細胞を新鮮な温培地が入ったガラスフィードボトルに移す。ビーズ間移動に使用可能な直線１：８分割、あるいはまた約１×１０^５〜約１．５×１０^５の間の播種密度を用いることができる。細胞は下記の実施例８．３または８．４に記載されているビーズ間移動方法のいずれかを用いて分割可能であることに留意されたい。図１７に示されるデータはＥＤＴＡ／トリプシンプロトコール（第８．３節に示される実施例）を用いた細胞分割から作成したものである。接種後、接種後のＮｏｖａおよび毎日の核計数のためにサンプルを抜き取る。培養後３〜４日で核総数が所望の細胞密度に達したところで、ウイルス感染を行う。細胞拡大のための設定点は次の通りである：ｐＨ＝７．４、温度＝３７℃、ＤＯ＝５０％空気飽和、およびスターラー＝約１３５〜約１７５ｒｐｍの間（作業容量が２〜１６Ｌの間の場合）。

【0353】

感染： 感染前に約６６％のＣＧＭを除去し、次のように完全感染培地（ＣＩＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、４５％グルコース、２００ｍＭ Ｌ−グルタミン、１：３３０希釈の１０倍ＴｒｙｐＬＥ）で置き換える：全ての制御ループをオフにし、微小担体ビーズを沈降させる。６６％に相当する所望の量の培地をバイオリアクターから除去し、新鮮な温ＣＩＭで置き換える。設定点を調整し、コントローラーループを再びオンにする。感染のための設定点発議の通りである：ｐＨ＝７．４、温度＝３３℃、ＤＯ＝５０％空気飽和、およびスターラー＝約１３５〜約１７５ｒｐｍの間（作業容量が２〜１６Ｌの間の場合）。表１６は、生産シミュレーションにおいて培地交換の際に用いるＡＴＦ制御設定を１〜３回行うことを示す。表１６に記載されている制御設定を用い、ＡＴＦシステムを用い、攪拌しながら、微小担体ビーズを沈降させずに、６６％に相当する所望の量の培地をバイオリアクターから除去し、等量の新鮮な温ＣＩＭで置き換える。設定点に達したところで、所望の量のウイルスを加える。所望により、感染前に核計数を行い、バイオリアクターを感染させるのに必要なウイルス量を算出する（例えば、季節性株では２０〜２００ＭＯＩ（ＦＦＵ／ｍＬ）、またはパンデミック株では２０００ＭＯＩ（ＦＦＵ／ｍＬ）を用いればよい）。あるいは、リアクターの作業容量に基づき、設定量のウイルスを既知濃度（ＦＦＵ／ｍＬ）で加える。例えば、ＷＯ０８／１０５９３１（特に、実施例１２）参照。

【0354】

回収： 所望の時点で（一般に、感染後４８〜７２時間の間）、制御ループをオフにし、微小担体ビーズを沈降させる。適当な無菌バッグ容器をバイオリアクターの排出口に取り付け、ウイルス回収物を蠕動ポンプまたはＡＴＦデバイスによって取り出す。蠕動ポンプを使用する場合には、微小担体ビーズを含まないように注意しなければならない。回収が完了したところで、１０倍ＳＰバッファー（２．１８Ｍスクロースおよび１１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７）をバッグに終濃度１倍まで加えればよい。ＡＴＦを用いる場合、下記の第８．６．３節に示される実施例に記載されているように、回収工程をダイレクトフロー濾過工程と直結してもよい。表１６は、生産シミュレーションにおいて回収の際に用いるＡＴＦ制御設定を１〜４回行うことを示す。

【0355】

８．３ 低濃度のプロテアーゼを用いる迅速ビーズ間移動プロセス
この実施例では、スピナーフラスコ、振盪フラスコまたは攪拌タンクバイオリアクターにてＤＰＢＳ／０．５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８洗浄溶液と低濃度のプロテアーゼ（例えば、０．０５倍ＴｒｙｐＬＥ）を用いるＭＤＣＫ細胞の迅速かつ効率的ビーズ間移動のためのプロセスおよびパラメーターを記載する。プロセスフローの全体像を図８Ａに示す。このプロセスに使用可能な代表的な器具および試薬を表１７、表１８および表１９に示す。当然のことながら、本発明では類似の性能を有する他の器具および試薬は所望により置き換えが可能であり、器具および試薬の特定の銘柄またはタイプの具体的記載は、特に断りのない限り、限定として解釈されるべきではない。

【0356】

このプロセスを上記の１２の実施に用いた。記載したように、ＥＤＴＡによる１回の１×ＤＰＢＳ洗浄を用いたビーズ間移動プロトコールおよびｐＨ８においてＴｒｙｐＬＥ ｓｅｌｅｃｔを用いるトリプシン処理を用いたところ、シードリアクターにおける適切な細胞解離およびＦＰＲにおける細胞の接着が見られた。よって、ビーズ間移動プロセスは迅速で効率的かつロバストである。

【表17】

【表18】

【表19】

【0357】

１０倍ＤＰＢＳ粉末からの１倍液体培地ＤＰＢＳの調製： 室温の水に穏やかに攪拌しながら粉末培地を加える（水を加熱しないこと）。容器内をすすいで全ての粉末痕跡を取り除く。水で所望の容量に希釈する。熔解するまで攪拌する（混ぜすぎないこと）。培地のｐＨを７．８±０．１に調整する（最終作業ｐＨは８．０）。ｐＨ単位は濾過すると通常０．１〜０．３上昇する。ｐＨを調整した後、培地が濾過されるまで容器を閉じたままにする。０．１ミクロン膜を用いてすぐに除菌する。

【0358】

０．５Ｍ ＥＤＴＡ保存液の調製： １８６．１ｇのＥＤＴＡ（二ナトリウム、二水和物）を８００ｍＬの脱イオン水に加える。約２０ｇのＮａＯＨペレットまたは１０Ｎ ＮａＯＨを攪拌しながら加え、ｐＨを８．０とする。注：ｐＨの超過を避けるため、最後の数グラムはゆっくり加える。ＥＤＴＡはｐＨが８前後になるまで溶解しない。容量を脱イオン水で１Ｌに調整する。０．１ミクロンフィルターで濾過する。より小さい容量に分注し（ボトルに２００ｍＬずつ）、室温で保存する。

【0359】

ＤＰＢＳ／０．５ Ｍ ＥＤＴＡ保存液の調製： ＤＰＢＳ１リットルにつき１ｍＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ保存液ｐＨ８を加える。必要であれば、培地のｐＨを７．８±０．１に調整する（最終作業ｐＨは８．０）。注：ｐＨ単位は濾過すると通常０．１〜０．３上昇する。０．１ミクロンフィルターで濾過する。

【0360】

１倍ＤＰＢＳ／０．５ｍＭ ＥＤＴＡ−ｐＨ８．０洗浄手順： 適用可能であれば、攪拌、ｐＨ、ＤＯ、温度制御を停止する。微小担体ビーズを１５±５分間沈降させる。排出口から８０±１０％の使用済み増殖培地を除去する。注：この手順は交互タンジェントフロー（ＡＴＦ）を用いて行うことができる。代わりに、培養容器に等量の１倍ＤＰＢＳ／０．５ｍＭ ＥＤＴＡ−ｐＨ８．０洗浄溶液を入れる。表２０参照。初期設定に対して攪拌を開始し、細胞を２５±５分間洗浄する。攪拌を停止し、微小担体ビーズを１５±５分沈降させる。排出口から８０±１０％の洗浄溶液を除去する。表２１参照。注：この手順はＡＴＦを用いて行うことができる。この容器に１倍ＤＰＢＳ／０．５ｍＭ ＥＤＴＡ−ｐＨ８．０洗浄溶液を作業培養容量の５０％まで加える。表２０参照。攪拌速度を所望のｒｐｍに設定する。表２１参照。攪拌、ｐＨ、ＤＯおよび温度制御を開始する。ｐＨ設定を８．０に調整する。表２１参照。

【表20】

【表21】

【0361】

細胞解離手順： 培養ｐＨが８±０．１に達した際に算出された容量の１０倍ＴｒｙｐＬＥを注入口または培地口から終濃度０．０５倍まで加える。表２２参照。注：所望の作業容量に対して１０倍ＴｒｙｐＬＥの１：２００希釈も行わなければならない。サンプリング口からサンプルアリコートを１５±２分ごとに、完全に解離するまで採取する。注：細胞解離は６０分以内に完了するべきである。培養容器の初期作業容量まで基本培地を加える。攪拌機およびｐＨ制御を除く全ての制御ループを停止する。

【0362】

ビーズ間手順： 所望の容量の解離細胞を最終生産リアクターに移す。表２３参照。

【表22】

【表23】

【0363】

８．４ プロテアーゼ不含ビーズ間移動プロセスとＡＴＦの使用
ワクチン、組換えタンパク質およびその他の生物治療薬を生産するための主要な挑戦の１つが、培養容器から接着生産細胞を再現性よく解離させ、その後、新たな培養容器に再接着させることである（このプロセスは通常細胞の継代培養として知られる）。この作業は大規模製造における微小担体に基づく生産では特に困難となる。細胞の適切な継代培養を保証するには、トリプシンまたはトリプシン様試薬（例えば、ＴｒｙｐＬＥ）が一般に用いられる。しかしながら、トリプシン処理プロセスは制御が難しい場合があり、トリプシン処理の過剰または不足のリスクが製造プロセスのロバスト性への悪影響、さらには生産性の低下をもたらし得る。ここで、本発明者らは、トリプシンまたはトリプシン様試薬を用いずに、哺乳類細胞、特に、接着性の強いＭＤＣＫ細胞の一連の継代培養を可能とする新規な方法を述べる。この方法では、トリプシンまたはトリプシン様試薬の代わりにＥＤＴＡを用いる。この方法は、バイオリアクターにおけるin situ流体交換を助けるために交互タンジェントフローデバイス（ＡＴＦ）と組み合わせることができる。

【0364】

新たに開発されたプロテアーゼ不含プロセスを用いて、本発明者らは、ＭＤＣＫ細胞を連続的かつ一貫して５回を超えて首尾よく継代培養し、高い細胞生存率（＞９０％）および高い細胞密度（＞１×１０^６細胞／ｍＬ）に到達させた（図１５参照）。本発明者らはまた、この方法により作製された細胞を用いて、いくつかの異なるサブタイプの低温適応型生弱毒インフルエンザウイルスを含む高力価ウイルスを生産した。ウイルス力価は、季節性ワクチン（Ａ／Ｈ１、Ａ／Ｈ３およびＢ株）からなる代表的な３つのウイルス株のそれぞれについて少なくとも８ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍＬであった（図１６、データは示されていない）。このプロセスはワクチンおよび細胞培養に基づく生物製品（モノクローナル抗体、組換えタンパク質など）の双方の生産に大規模および小規模で使用可能である。

【0365】

この実施例では、細胞を洗浄し、スピナーフラスコ、振盪フラスコまたは攪拌タンクバイオリアクターにてプロテアーゼの不在下、細胞をＥＤＴＡ ｐＨ８とともにインキュベートすることによるＭＤＣＫ細胞の迅速かつ効率的なビーズ間移動のためのプロセスおよびパラメーターを記載する。本プロセスに使用可能な代表的な器具および試薬は上記の表１７、表１８および表１９に詳細に示されている。当然のことながら、本明細書において類似の性能を有する他の器具および試薬は所望により置き換えが可能であり、器具および試薬の特定の銘柄またはタイプの具体的記載は、特に断りのない限り、限定として解釈されるべきではない。

【0366】

１倍ＤＰＢＳ／０．５ｍＭ ＥＤＴＡ−ｐＨ８．０洗浄およびインキュベーション手順： 適用可能であれば攪拌、ｐＨ、ＤＯ、温度制御を停止する。１）微小担体ビーズを沈降させ（一般に、１５±５分で十分である）、〜７０〜８０％またはそれを超える使用済み増殖培地を除去する。注：この手順は交互タンジェントフロー（ＡＴＦ）を用いて行うことができる。２）代わりに、所望の容量の１倍ＤＰＢＳ洗浄溶液を培養容器に入れる。一般に、効率的な洗浄のためには等量の洗浄バッファーが提案される。３）所望により工程（１）および（２）を繰り返す（一般に、計３回の洗浄が提案される）。４）必要に応じて所望の容量を残して洗浄溶液を除去する（例えば、初期容量の〜５０％）。注：この手順はＡＴＦを用いて行うことができる。５）０．５ｍＭ ＥＤＴＡ−ｐＨ８．０を終濃度０．５ｍＭまで加える。６）適用可能であれば、攪拌ならびにｐＨ、ＤＯおよび温度制御を開始する。攪拌は一般に、作業容量および／または回転翼に応じて１００〜２５０ｒｐｍの間である。数百ミリリットル以下の小規模移動には１００ｒｐｍを用いた。また、より大きな作業容量に使用可能な攪拌速度については、例えば表２１を参照。７）攪拌しながら６０±１０分間インキュベートする。サンプルアリコートを抜き取り、細胞解離が完全であるかどうかを確認することができる。表２４は、小規模ビーズ間移動に用いた条件を詳細に示す。

【0367】

細胞が解離したところで、次に分割を行う。一般に、増殖添加物を所望の作業容量（例えば、初期容量）まで加え、所望の容量の解離細胞を新しい容器に移す。あるいは、さらなる増殖培地および／または微小担体を初期容器に加える。スケールアッププロセスでは、１：５から１：８分割が有用であることが分かっている。表２３は、いくつかの最終作業容量に対する１：８分割に関して詳細に示す。所望により、初期フラスコを増殖培地ですすぎ、移行した材料と併せるが、スケールアップを行う場合には、細胞を希釈し過ぎないようにこの容量も考慮しなければならない。８）新たなフラスコを適当な温度（ここでは３７℃を用いた）で、攪拌でずに４０〜６０分間インキュベートする。９）適用可能であれば、細胞増殖のため、攪拌ならびにｐＨ、ＤＯおよび温度制御を開始する。１０）必要に応じて、感染のための一連の増殖およびスケールアップのために工程（１）〜（９）を繰り返す。

【0368】

表２４に本質的に詳細に示されているようなプロテアーゼ不含法（市販または自家調製のＥＤＴＡ）または本質的に第８．２節に示される実施例に詳細に示されているようなＥＴＤＡ／ＴｒｙｐＬＥを用い、並行培養物を継代培養５回以上連続的に増殖させる。対照細胞としては、新しい細胞をトリプシン処理し（細胞を洗浄し、１倍ＴｒｙｐＬＥとともに１５〜２０分間インキュベートし、新鮮増殖培地を加え、細胞を１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、新鮮増殖培地に再懸濁させる）、各継代ごとに細胞増殖／生存率および力価を比較するためにスピナーフラスコへの播種の用いた。培養中の経時的細胞総数および生存率が図１５にプロットされている。これらのプロットから分かるように、ＥＤＴＡ単独（プロテアーゼ不含）およびＥＴＤＡ／ＴｒｙｐＬＥを用いて増殖させた培養物の細胞総数および生存率は匹敵するものである。さらに、これらの方法は双方とも一般に、対照方法よりも高い密度の培養物を生産することが分かった。並行培養物の各継代培養からの細胞もインフルエンザウイルスの生産に用いた。ｃａ Ａ／ウィスコンシン／６７／０７およびｃａ Ｂ／マレーシア／２５０６／０４で得られたウイルス力価（図１６のそれぞれ上および下のパネル）は用いた増殖方法にかかわらず同等であった。

【表24】

【0369】

８．５ 洗浄を用いない迅速ビーズ間移動プロセス
増殖培地に二価陽イオンが存在すると、微小担体から細胞を解離させるために用いるプロテアーゼの作用が阻害される場合がある。上記で示したように、ＥＤＴＡはこれらの陽イオンをキレートして細胞の解離を助長するために使用することができる。細胞の形態および解離に対するＥＤＴＡ濃度の影響を調べるために一連の実験を行った。図２３Ａは、非処理細胞を示す。それらは扁平な形態を持ち、微小担体にしっかり接着している。図２３Ｂ〜Ｆは、漸増量のＥＤＴＡ、それぞれ０．５、１、２、５および１０ｍＭに６０分曝した後に見られた形態変化を示す。０．５および１ｍＭ処理ではやや丸くなっているのが見て取れる。２ｍＭ以上で処理すると、さらに丸くなり、解離する。最高濃度のＥＤＴＡでは、ほぼ全ての細胞が微小担体から解離した。これらの知見に基づき、１〜２ｍＭのＥＤＴＡが細胞が丸くなるのを助長し得る。

【0370】

１または２ｍＭのＥＤＴＡの存在下でのＴｒｙｐＬＥ濃度の影響を調べるために第二の一連の実験を行った。１または２ｍＭのＥＤＴＡで前処理した後、ＴｒｙｐＬＥを細胞培養物に終濃度０．０１２５倍、０．０２５倍および０．０５倍で加え、解離をモニタリングした。図２４は、種々の濃度のＴｒｙｐＬＥを用い、２ｍＭのＥＤＴＡで前処理した細胞に関して見られた解離を経時的に示す。ＴｒｙｐＬＥの添加後０時間では、細胞は球形の形態を示し（図２４Ａ、ＢおよびＣ、それぞれ０．０１２５倍、０．０２５倍および０．０５倍ＴｒｙｐＬＥ）、解離はほとんどない。ＴｒｙｐＬＥ添加後６０分では、全ての培養物がいくらかの解離を示した。低濃度のＴｒｙｐＬＥ（０．０１２５倍および０．０２５倍）では、全てではないが、細胞が解離し、クランプの形成が若干見られた（それぞれ図２４ＥおよびＥ）。０．０５倍ＴｒｙｐＬＥでは、ほぼ全ての細胞が解離し、クランプの形成はほとんどみられなかった（図２４Ｆ）。しかしながら、これらの細胞を、新鮮増殖培地を補給した新たな生産容器に移したところ、おそらく新鮮増殖培地中の二価陽イオンのキレート化のために、それらは古い微小担体にも新しい微小担体にも再接着できなかった。

【0371】

ＣａＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２、ＭｇＳＯ_４、ならびに微量元素Ａ、ＢおよびＣのマトリックスの増殖培地への添加が、接着および増殖に対するキレート化の影響を克服することができるかどうかを検討した。表２５は、ＭｅｄｉＶ １０５ ＳＦＭ増殖培地に．ＣａＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２およびＭｇＳＯ_４の濃度マトリックスを加えた場合の、播種４日後の細胞再接着および拡散の割合（％）を示す。表２６は、ＭｅｄｉＶ １０５ ＳＦＭ増殖培地にＣａＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２、ＭｇＳＯ_４、ならびに微量元素Ａ、ＢおよびＣの濃度マトリックスを加えた場合の、播種４日後の細胞総数を示す。表２６に示されるように、ＭｅｄｉＶ １０５ ＳＦＭに１．５ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．１５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．４ｍＭ ＭｇＳＯ_４、ならびに２倍の微量元素Ａ、ＢおよびＣを添加した場合、ＭＤＣＫ細胞は、ビーズ間移動４日後に１Ｅ６細胞／ｍＬ以上、９０％を超える細胞生存率に達した。これらの研究に基づき、これらの因子を至適化するため、例えば、さらなる細胞種（例えば、ＶＥＲＯ細胞）に対して最適な増殖条件を決定するため、および／またはこのプロセスをどんな規模のウイルス生産でもロバストなものとするために、さらなる実験を行うことができる。

【0372】

ＥＤＴＡ濃度の検討： ８５０ｃｍ^２の回転瓶で増殖させたＭＤＣＫ細胞を２Ｌのシードバイオリアクターに１．８×１０^５細胞／ｍＬの密度で播種した（ＭｅｄｉＶ １０５ＳＦＭ、２ｇ微小担体／Ｌ）。シードリアクターをｐＨ７．４（ＣＯ_２および１Ｎ ＮａＯＨで制御）；空気飽和５０％（２０ｍＬ／分の一定流）；温度３７℃；および攪拌１７５ｒｐｍに設定した。４日目に完全密集（１．２〜１．６Ｅ６細胞／ｍＬ）に達した際に、２５ｍＬの微小担体培養物を６×１００ｍＬフラスコに移し、その後、各フラスコにＥＤＴＡを加えて種々の終濃度０．５、１、２、５、１０、２０ｍＭとした。次に、フラスコをオービタルシェーカーにて３７℃、５％ＣＯ２、２００ｒｐｍで１時間インキュベートした。インキュベーション期間中、全てのフラスコを定期的に顕微鏡観察し、種々のＥＤＴＡ濃度で、形状が球形となる（丸くなる）細胞の程度を確認した。

【0373】

至適濃度のＥＤＴＡと組み合わせたＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ濃度： ８５０ｃｍ^２の回転瓶で増殖させたＭＤＣＫ細胞を、ＴＲ ＃３４８に従い、２×２Ｌシードリアクターに１．８×１０^５細胞／ｍＬの密度で播種した（ＭｅｄｉＶ １０５ ＳＦＭ、２ｇ微小担体／Ｌ）。シードリアクターを、上記と同じバイオリアクターパラメーターを用いて４日間作動した。４日目に、１ｍＭのＥＤＴＡを一方のバイオリアクターに加え、もう一方に２ｍＭ ＥＤＴＡを加えた。双方を１７５ｒｐｍで１時間攪拌した。次に、両バイオリアクターのｐＨを８に調整した後、細胞懸濁液を各バイオリアクターから３×５００ｍＬ振盪フラスコに移した。各培養セットから、１０倍ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを各フラスコに加えて０．０５倍、０．０２５倍および０．０１２５倍の終濃度とし、３７℃、５％ＣＯ_２、オービタルシェーカーにて１５０ｒｐｍで３０分間インキュベートした。インキュベーション期間中、微小担体からの細胞解離の程度を確認するために顕微鏡観察を行うために、各セットから定期的にサンプルを採取した。顕微鏡観察により、９０％以上の細胞が微小担体から解離した際に、等量のリママメトリプシン阻害剤（ＬＢＴＩ）を加えてトリプシン活性を停止させた。

【表25】

【表26】

【0374】

８．６ 細胞培養により生産されたインフルエンザの精製プロセス
細胞培養において生産されたインフルエンザのロバストな大規模精製プロセスの開発には、包括的な開発が必要であった。最初の段階では、プロセス ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｗｈｅｒｅ ｔｈｅウイルス回収物（感染６０〜６５時間後）をバッグに汲み取り、ウイルスを安定化させるために、このウイルス回収物（ＶＨ）バッグに１０倍スクロースリン酸（ＳＰ）バッファーを１／１０（ｖ／ｖ）希釈で加えた。安定化されたウイルス回収物（ＳＶＨ）をまず、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２とともに５０単位／ｍＬのベンゾナーゼで３２℃にて時間処理してＭＤＣＫ宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣＤ）を除去し、５ｍＭ ＥＤＴＡを加えることにより反応を停止させた。ベンゾナーゼは、マグネシウムイオンの存在下でＤＮＡをオリゴヌクレオチドへと分解する操作された組換えエンドヌクレアーゼである。次に、このベンゾナーゼで処理したウイルス回収物を１．２μｍポリプロピレン（ＰＰ）および０．４５μｍＰＶＤＦカプセルフィルターにより清澄化した。清澄化されたＶＨを、５００ｋＤａ分子量カットオフ中空繊維カートリッジでＳＰバッファーを用いた、５倍（５×）限外濾過および５倍ダイアフィルトレーションにより馴化した。ウイルス粒子は保持側に保持され、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣＤ）およびベンゾナーゼは中空繊維の透過側にダイアフィルトレーションされる。濃縮およびダイアフィルトレーションされたウイルスをセルファインサルフェイト（ＣＳ）クロマトグラフィーカラムを用いて精製し、ＨＣＤ、ＨＣＰおよびベンゾナーゼ不純物をさらに除去した。ＣＳは、カラム上でウイルスと結合するアフィニティー樹脂であり、結合したウイルスはＳＰ高塩バッファーを用いて溶出される。カラム溶出液からの精製ウイルスを５００ｋＤａ分子量カットオフ中空繊維カートリッジにて、５ダイアボリュームのＳＰ１００（２００ｍＭスクロースおよび１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．２）バッファーによりダイアフィルトレーションして高塩溶出バッファーを除去し、精製ウイルスを調製する。ダイアフィルトレーションされたウイルス産物を次に、１／９（ｖ／ｖ）希釈のＧＡＧを加えることにより安定化させ、０．２２μｍフィルターを用いて濾過除菌し、最終バルク製品を作製する。

【0375】

最初のプロセスにスケーラビリティー、プロセスの効率および最終製品の品質を改良した実質的な変更がなされた。プロセスになされた変更は回収率および不純物（ＨＣＤ、ＨＣＰおよびベンゾナーゼ）のレベルの評価に基づくものであり、元々確立されていたプロセスに付与されたものである。スケーラビリティーに取り組むため、また、プロセスの効率および最終製品の品質を高めるために、全部で５つのプロセス工程が付け加えられた。第一に、ウイルス投入量２０００ＦＦＵ／ｍＬを用いて感染させた細胞に関して、ウイルス回収が感染４８時間後（この時間はピークウイルス力価に相当する）に変更された。第二に、ＨＣＤ除去工程がバッチ形式のベンゾナーゼ処理からカラム上でのベンゾナーゼ処理に変更された。これらの２つの工程はともに、出発材料および最終バルクのＨＣＤレベルを有意に引き下げることによる最終製品の品質を向上させる。第三に、ＣＳ樹脂の添加濃度を９．０ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍＬから９．５ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍＬに引き上げ、これにより生産カラムサイズが４Ｌから１．４Ｌに縮小し、プロセス効率が向上する。第四に、第二のバッファー交換容量が、ベンゾナーゼクリアランスを高めるために．５から８ダイアボリュームに増やされた。第五に、最終フィルターフラックスがＣＴＭ実施の際の最終濾過中の目詰まりを回避するために、平均２５Ｌ／ｍ^２の半分まで引き下げられた。最終的な方法（以下に詳細に示される）は、平均総回収率４３．４％を与えるプロセスを提供し、０．７２ｎｇ／用量（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎによる）および０．１ｎｇ／用量（ＰＣＲによる）のＨＣＤ、０．２１μｇ／用量のＨＣＰ、および０．００３５ｎｇ／用量のベンゾナーゼを含み、その全てが規制機関により要求された明細を下回るものである。図１０は最初の精製プロセスと改良型の精製プロセスの概要を示す。

【0376】

８．６．１ 材料および方法
材料、試薬および器具： 類似の性能を有する他の材料、器具および試薬は容易に置き換えが可能である。

【0377】

１．１．２μｍ Ｐｏｌｙｇａｒｄ ＣＮ Ｏｐｔｉｃａｐ ＸＬ５フィルター(Millipore Corporation, Billerica, MA, カタログ番号KN12A05HH1)
２．０．４５μｍ Ｄｕｒａｐｏｒｅ Ｏｐｔｉｃａｐ ＸＬ４フィルター(Millipore Corporation, Billerica, MA, カタログ番号KPHLA04HH3)
３．５０Ｌバッグ(Hyclone, Ltd, Logan, UT, カタログ番号SH30712.04)
４．１０Ｌバッグ(Hyclone, Ltd, Logan, UT, カタログ番号SH30712.12)
５．中空繊維、５００ＫＤ、４，８００ｃｍ^２(GE Healthcare, Uppsala, Sweden, カタログ番号UFP-500-C-6A)
６．中空繊維、５００ＫＤ、２９０ｃｍ^２(GE Healthcare, Uppsala, Sweden, カタログ番号UFP-500-C-3X2MA)
７．セルファインサルフェイト樹脂(Chisso Corporation, Tokyo, Japan, カタログ番号19847)
８．フランジＯリング(GE Healthcare, Uppsala, Sweden, カタログ番号18-8494-01)
９．アダプターＯリング(GE Healthcare, Uppsala, Sweden, カタログ番号18-8475-01)
１０．ベッドサポート、２３μｍ、エンドピース(GE Healthcare, Uppsala, Sweden, カタログ番号18-9252-01)
１１．ベッドサポート、２３μｍ、アダプター(GE Healthcare, Uppsala, Sweden, カタログ番号18-1103-08)
１２．ガスケット２５ｍｍ ６ｍｍ径、ＥＰＤＭ(GE Healthcare, Uppsala, Sweden, カタログ番号18-0019-27)
１３．４ポート２方向バルブ(GE Healthcare, Uppsala, Sweden, カタログ番号18-5757-01)
１４．Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ２ ３００フィルターカプセル、０．４５μｍ／０．２２μｍ、３００ｃｍ^２(Satorius, MA, カタログ番号5441307H5--00--B)
１５．Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ２ １５０フィルターカプセル、０．４５μｍ／０．２２μｍ、１５０ｃｍ^２(Satorius, MA, カタログ番号5441307H4--00--B)
１６．１Ｌ ＰＥＴＧボトル(Nalgene, Rochester, NYU, カタログ番号2019-1000)
１７．２Ｌ ＰＥＴＧボトル(Nalgene, Rochester, NYU, カタログ番号2019-2000)
１８．ＭａｓｔｅｒＦｌｅｘ白金硬化シリコンチューブＬ／Ｓサイズ２４(Cole Parmer, Vernon Hills, IL, カタログ番号96410-24)
１９．ＭａｓｔｅｒＦｌｅｘ白金硬化シリコンチューブＬ／Ｓサイズ３６(Cole Parmer, Vernon Hills, IL, カタログ番号96410-36)
２０．１倍スクロースリン酸バッファー(Hyclone, Ltd, Logan, UT, カタログ番号SH3A1577)− ２１８ｍＭスクロースおよび１１ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７バッファー
２１．１倍ＳＰ／１Ｍ ＮａＣｌバッファー(Hyclone, Ltd, Logan, UT, カタログ番号SH3A2034)
２２．ＳＰ１００バッファー(Hyclone, Ltd, Logan, UT, カタログ番号SH3A1796)−２００ｍＭスクロースおよび１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．２バッファー
２３．ｃＧＡＧバッファー(Hyclone, Ltd, Logan, UT, カタログ番号SH3A1795)
２４．ベンゾナーゼ(EMD, Darmstadt, Germany, カタログ番号1.01697.0002)
２５．１Ｍ ＭｇＣｌ_２(Sigma, St. Louis, Missouri, カタログ番号M1028, lot # 085K8920)
２６．Ｑｕａｎｔ−ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡキット(Invitrogen, Eugene, Oregon, カタログ番号P11496, lot # 22987)
２７．０．５Ｎ ＮａＯＨ、１０Ｎ ＮａＯＨから希釈 (VWR, West Chester, Pennsylvania, カタログ番号VW3247-7)
２８．蠕動ポンプ(Watson Marlow Inc., Wilmington, MA, Models 520U, 520S and 520Di)
２９．ＷａｖｅＭｉｘｅｒ(GE Healthcare, Uppsala, Sweden, カタログ番号Mixer20/50EH)）
３０．ＡＫＴＡプロセスクロマトグラフィースキッド(GE Healthcare, Uppsala, Sweden, カタログ番号28409334)
３１．Ｕｎｉｆｌｕｘ１０濾過スキッド(GE Healthcare, Uppsala, Sweden, カタログ番号28920799)
３２．ＢＰＧ １００クロマトグラフィーカラム(GE Healthcare, Uppsala, Sweden, カタログ番号18-1103-01)）
３３．ＢＰＧ ２００クロマトグラフィーカラム(GE Healthcare, Uppsala, Sweden, カタログ番号18-1103-11)
３４．Ｆｌｅｘｓｔａｎｄ(GE Healthcare, Uppsala, Sweden, カタログ番号56-4107-54)

【表27】

【0378】

細胞培養ウイルス回収物（ＶＨ）： ＭＤＣＫ細胞増殖およびウイルス生産の詳細は国際特許公開ＷＯ０８／１０５９３１（特に、実施例１２参照）に示されている。ウイルス生産の実施は全て、１回使用バイオリアクター（ＳＵＢ）にて〜６７％培地交換プロセスを用いて行い、ウイルス投入量２０００ＦＦＵ／ｍＬを用いて細胞を感染させた。ＭＤＣＫ細胞の感染後およそ６０〜６５時間（実施１〜７）または４８時間（実施８〜９）にウイルスを回収した。ＳＵＢ中の微小担体はウイルス回収（ＶＨ）前に４５分以上沈降させた。およそ１８Ｌのウイルスを５０Ｌバッグにおよそ０．２Ｌ／分で汲み入れ、ウイルス回収物の安定化（ＳＶＨ）のために同じバッグに２Ｌの１０倍ＳＰバッファーを汲み入れた。混合後、ＦＦＡ、ＨＣＤおよびＨＣＰアッセイで感染度を調べるため、ＳＶＨ段階でサンプルを採取した。

【0379】

ウイルス回収工程とダイレクトフロー濾過工程を直結させるには、以下のプロセスが使用可能である。適当な容量の１０倍ＳＰバッファーをバイオリアクターに加えて、終濃度約１倍のＳＰを含んでなる安定化されたウイルス回収物（ＳＶＨ）を得、微小担体を沈降させ、ＡＴＦを用いてウイルス回収をＤＦＦおよびＴＦＦ工程と組み合わせる。例えば、ＡＴＦ／ＤＦＦ／ＴＦＦ組合せ試験では、サンプルフィードポンプを介してバイオリアクターからＡＴＦシステムへ直接ＳＶＨを送り込む。次に、ＡＴＦの透過液をライン内のＤＦＦカプセルを経て、最終的にはＵｎｉｆｌｕｘプロセスタンクに送られる。ＡＴＦシステムの操作はＡＴＦ操作マニュアルに詳細に示されている。バイオリアクターの高さとヘッド圧に特異的な加圧サイクルおよび排出サイクル時のＡＴＦシステムの設定点は、１０Ｌおよび２０Ｌのバイオリアクターでそれぞれ３Ｌ／分および１．８Ｌ／分であった。Ｕｎｉｆｌｕｘサンプルフィードポンプの流速（ＡＴＦ透過液流速）は、各実験について特定のＴＦＦ透過液フラックスに適合するように設定した。５ＸＵＦ５ＸＤＦプロセスは以下に詳細に示す。全ての５ＸＵＦ５ＸＤＦ材料を、以下に詳細に示すように、ＣＳクロマトグラフィー工程までにさらに精製した。

【0380】

ダイレクト・フロー・フィルトレーション１（ＤＦＦ１）： フィルターリグを準備し、ウイルス回収の前日にオートクレーブにかける。１．２μｍのＰｏｌｙｇａｒｄ ＣＮポリプロピレンフィルターカプセルおよび０．４５μｍのＤｕｒａｐｏｒｅ ＰＶＤＦフィルターカプセルを示すフィルターリグの図を図９Ａの一番上のパネルに詳細に示す。およそ２０ＬのＳＶＨを閉じられたリグアセンブリを経て１．５リットル／分（ＬＰＭ）で送り、ＳＶＨがそれらを通過した際にフィルターがプライミングされた。全膜表面積は、１．２μｍのＰｏｌｙｇａｒｄ ＣＮポリプロピレンフィルターカプセルでは１８００ｃｍ^２、０．４５μｍのＤｕｒａｐｏｒｅ ＰＶＤＦフィルターカプセルでは１９００ｃｍ^２であった。１．５ＬＰＭの濾過流速では、１．２μｍおよび０．４５μｍフィルターのフラックスはそれぞれ５００リットル／面積ｍ^２／時間（ＬＭＨ）および４７４ＬＭＨであった。１．２μｍおよび０．４５μｍフィルターの実際の負荷量はそれぞれ１１１および１０５Ｌ／ｍ^２であった。清澄化された濾液はＤＦＦ１として２０Ｌバッグに収集した。ＤＦＦ１濾液をサンプリングし、ＦＦＡにより感染度を、また残留ＨＣＤおよびＨＣＰを調べた。

【0381】

タンジェントフロー濾過１、５倍限外濾過（ＵＦ）／５倍ダイアフィルトレーション（ＤＦ）（ＴＦＦ１）： Ｕｎｉｆｌｕｘスキッドにチュービングリグを準備し、ウイルス回収の前日にオートクレーブにかえる。全チュービングリグの図を図９Ａの下のパネルに詳細に示す。Ｕｎｉｆｌｕｘ（商標）スキッドを用い、以下の操作パラメーターを用いてＴＦＦ１工程を行った。Ｕｎｉｆｌｕｘスキッドは、中空繊維カートリッジを作動させるために構成された自動膜分離濾過システムである。管腔サイズ０．５ｍｍ、全膜表面積４，８００ｃｍ^２および流路長６０ｃｍの５００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）中空繊維を用いた。このプロセスにより最終ＤＦＦ１負荷量４１．７Ｌ／ｍ^２膜表面積が得られたが、これは従前に評価されているように、ＴＦＦ１プロセスの最適範囲４０〜１５０Ｌ／ｍ^２内である。実施１〜６では、同じ中空繊維カートリッジをプロセス後に洗浄し、再利用した。実施７〜９では、実施ごとに新しい中空繊維を準備して用いた。新しい中空繊維カートリッジは、脱イオン（ＤＩ）水で９０分間すすいでグリセロール保存剤を除去し、０．５Ｎ ＮａＯＨで１時間殺菌し、各実施前におよびｐＨが７．０となるまで１倍ＳＰバッファーで平衡化することにより準備した。全５ＸＵＦ／５ＸＤＦプロセスは、１６０００／秒の一定剪断速度および２０ｐｓｉの一定ＴＭＰでプログラムされたＵｎｉｆｌｕｘスキッドを用いて作動させた。

【0382】

全容量のＤＦＦ１をＵｎｉｆｌｕｘスキッドで処理した。まず、およそ５ＬのＤＦＦ１をＵｎｉｆｌｕｘプロセスタンクに汲み取った。最初に透過液ラインを閉じて、８．６Ｌ／分の再循環（保持液）流速を確立した（１６，０００／秒の剪断速度に相当する）。再循環５分後に、５ＸＵＦプロセスを開始した。透過液ラインを開けて、ＨＣＰおよびＤＮＡなどの５００ｋＤａより小さい不純物に膜を通過させ、一方、保持液制御バルブを段階的に閉じ、膜間差圧（ＴＭＰ）を１．４バール（２０．３ｐｓｉ）の設定点に到達させた。残りのＤＦＦ１濾液を絶えずプロセスタンクに送り込み、全容量のＤＦＦ１がタンクに供給されるまで、５±０．１Ｌの一定タンクレベルに維持した。全てのＤＦＦ１材料が供給された後に、フィードポンプを停止し、最終保持液容量が４Ｌとなるか、または１６Ｌの透過液が収集されるまで保持液を濃縮し続けた。５倍ダイアボリュームの１倍ＳＰバッファー（２０Ｌ）でバッファー交換を行うことにより４Ｌの保持液（５ＸＵＦ）をダイアフィルトレーションし、プロセスを上記の場合と同じ剪断速度およびＴＭＰで作動させた。ダイアフィルトレーションバッファーラインを開け、フィードポンプを再開し、１倍ＳＰバッファー中に送り込んだ。５ＸＤＦプロセスは、２０Ｌのダイアフィルトレーション透過液が収集された後に終了した。５ＸＤＦの終了時に、保持液制御バルブを全開し、透過液ラインを再び閉じて、プロセス中に中空繊維膜の表面に弱く結合した回収可能なウイルスをシステムの再循環に一掃させる。濃縮およびおよびダイアフィルトレーションされたウイルス産物を含んだ保持液を排出し、１０Ｌの製品バッグに収集する。最後の２つの精製実施（８および９）では、保持液収集の後にさらなるバッファーすすぎ工程を導入した。およそ１．５Ｌの１倍ＳＰをプロセスタンクに送り込み、透過液ラインを閉じた状態でさらに５分間再循環させた。このバッファーすすぎ液もまた同じ１０Ｌ製品バッグに収集し、このバッグに５ＸＵＦ ５ＸＤＦ ＴＦＦ１製品のラベル表示をし、全容量はおよそ５．５Ｌであった。このＴＦＦ１製品をＦＦＡによる感染度、ならびにＨＣＤおよびＨＣＰに関して調べるためにサンプリングした。各プロセス実施の後に、中空繊維カートリッジおよびＵｎｉｆｌｕｘシステムを０．５Ｎ ＮａＯＨを用い、 ８．６Ｌ／分の再循環流速で１時間洗浄した。

【0383】

ＢＰＧ １００ ／２００ セルファインサルフェイト（ＣＳ）カラムの充填およびカラム評価： ＣＳ樹脂は２０％エタノール中、およそ５０％スラリーで保存した。ＢＰＧ １００またはＢＰＧ ２００カラムの充填に必要な樹脂の量を、圧縮比１．１を用いて計算した。ＢＰＧ１００およびＢＰＧ２００カラムは双方とも、目標ベッド高１７．５ｃｍまたは目標ベッド容量それぞれ１．３７Ｌおよび５．５０Ｌまで充填した。計算されたような樹脂の量を、１倍ＳＰバッファーでバッファー交換を２回行った後に、１倍ＳＰ／１Ｍ ＮａＣｌバッファーでバッファー交換を１回行うことにより準備した。

【0384】

ＢＰＧ １００およびＢＰＧ ２００カラムを生産者の説明書に従って組み立てた。空のカラムを準備し、０．５Ｎ ＮａＯＨで殺菌し、使用前にＤＩ水ですすいだ。ＡＫＴＡプロセス（商標）スキッドを用い、１倍ＳＰバッファーを用いてＣＳ樹脂をＢＰＧ １００カラムに５００ｃｍ／時で流動充填し、カラムベッド高を１５〜２０ｃｍ（目標１７．５ｃｍ）とした。ＡＫＴＡプロセスは自動液体クロマトグラフィーシステムである。

【0385】

１倍ＳＰ／１Ｍ ＮａＣｌバッファーで準備した樹脂スラリーを空のカラムに側壁に沿って注ぎ、壁面に残った残留樹脂を水で噴射ボトル(squirt bottle)にすすぎ落とした。樹脂を、樹脂ベッド高が液体レベルより少なくとも１０ｃｍ低くなるように沈降させた。上部のアダプターを樹脂ベッドを乱さないようにカラム内に挿入した後、ネジとナットで固定した。４ポート２方向バルブ（４−２バルブ）をカラムの入口に取り付けた。この４つの異なるポートは次のように接続した。

【0386】

１ ＡＫＴＡプロセスシステムカラムの入口
２ カラムマニュアルパージ（廃棄ラインまたは再循環ラインに接続）
３ スパイクテストコネクター（ＨＥＴＰ試験のための高塩溶液を注入するために用いる雌型ルアーロック）
４ ＢＰＧ １００／２００カラムの入口
次に、ＢＰＧ１００カラムの下の出口をＡＫＴＡシステムカラムの出口に接続した。カラムアダプターを下げる前に、４−２バルブの接続部のポート３および４を確認した。上のアダプターを樹脂ベッド中へゆっくり降ろし、少量のバッファーを４−２バルブのポート３からパージした。これにより、上のアダプターの入口が確実にバッファーでパージされるようにした。

【0387】

次に、４−２バルブを切り換え、ポート１と２を接続した。１倍ＳＰバッファーをＡＫＴＡシステムの入口に接続し、まず、５００ｃｍ／時で流し始め、この地点でカラムパージポート（４−２バルブのポート２）を介してカラムをバイパスした。流速がフローメーターで５００ｃｍ／時に達した際に、すぐにポート１と４が接続されるように４−２バルブを調節した。樹脂ベッドが目標ベッド高に達したところで、アダプタークローザーを樹脂ベッドへ降ろす。これらの工程を、樹脂ベッド高に変化が無くなり、アダプターが樹脂ベッドに達するまで繰り返した。アダプターと樹脂ベッドの間のヘッドスペースが無くなるよう、アダプターをさらに１〜３ｍｍ降ろして樹脂ベッドを圧縮した。

【0388】

充填評価を行う前に、ＣＳカラムを１倍ＳＰで平衡化し、安定な導電率ベースラインを確立した。カラム充填は、スパイクテストコネクター（４−２バルブのポート３〜４）を用い、１倍ＳＰ／１Ｍ ＮａＣｌをカラム容量（ＣＶ）の２％注入することにより評価した。カラムを、１倍ＳＰを用い、流速５０ｃｍ／時で平衡化した（４−２バルブのポート１〜４）。導電率ピークはおよそ１／２ＣＶで見られた。Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウエアにて得られた導電率ピークを用い、カラムプレート高（ＨＥＴＰ）およびピークの対称性を評価した。所望のカラムＨＥＴＰが達成されたところで、カラムを殺菌し、０．５Ｎ ＮａＯＨ中で使用まで保存した。

【0389】

セルファインサルフェイトクロマトグラフィー（ＣＳ）： ＡＫＴＡプロセススキッド用のチュービングリグを準備し、ウイルス回収前にオートクレーブにかけた。全チュービングリグの図を図９Ｂの上のパネルに詳細に示す。全クロマトグラフィープロセスはプログラムされた方法により自動であった。

【0390】

ＡＫＴＡプロセススキッドの全流路を、各実施の前に手作業で１倍ＳＰを用いて平衡化した。プロセスの開始時、カラムをまず、３カラム容量（ＣＶ）の１倍ＳＰを用い、ｌｉｎｅａｒ直線流速１５０ｃｍ／時で平衡化した。次に、全容量の５ＸＵＦ ５ＸＤＦ ＴＦＦ１をカラムにローディングし、結合していないを流出液として収集した。ローディング後、カラムを１ＣＶの１倍ＳＰを用いて１５０ｃｍ／時、次いで、カラム上ベンゾナーゼ処理のために５０Ｕ／ｍＬベンゾナーゼおよび２ｍＭ ＭｇＣｌ_２（１倍ＳＰＢ）を含有する２．５ＣＶの１倍ＳＰを用いて５０ｃｍ／時で洗浄した。直線的流速を引き下げ、１倍ＳＰＢ洗浄容量を計算することで、カラム 樹脂のベンゾナーゼ接触時間を５０分とした。次に、カラムを１ＣＶの１倍ＳＰを用いて５０ｃｍ／時で洗浄して、前のＣＶの１倍ＳＰＢ カラム上ベンゾナーゼ処理を置換し、さらに１ＣＶの１倍ＳＰを用いて１５０ｃｍ／時で洗浄した。結合したウイルスを、３ＣＶの１倍ＳＰ／１Ｍ ＮａＣｌバッファーを用いてカラムから溶出させた。このＣＳ溶出液を１０Ｌバッグに収集し、この溶出ピークの収集は、ＵＶ吸光度（５ｍｍ光路長のＵＶフローセルを用いた５０ｍＡＵ〜５０ｍＡＵ（０．１ Ｏ．Ｄ．〜０．１ Ｏ．Ｄ．）までのＡ_２８０読み取り）に基づいた。ＢＰＧ １００カラムからのＣＳ溶出容量はおよそ０．６〜０．９Ｌである。各プロセス実施の後にカラムおよびＡＫＴＡプロセスシステムを０．５Ｎ ＮａＯＨで殺菌した。カラムロード、流出液、洗浄液および溶出液をサンプリングしてＦＦＡによる感染度、ベンゾナーゼ、ＨＣＤおよびＨＣＰを調べた。

【0391】

タンジェントフロー濾過２、８倍ＤＦ（ＴＦＦ２）： Ｆｌｅｘｓｔａｎｄのセットアップおよび使用は生産者の説明書に従って行った。管腔サイズ０．５ｍｍ、流路長６０ｃｍおよび全膜表面積２９０ｃｍ^２の５００ｋＤａ ＭＷＣＯ中空繊維を用いた。このサイズの膜面積および上記のＣＳ溶出量では、最終ローディングは２０〜５０Ｌ／ｍ^２膜表面積の範囲となり、従前に評価したＴＦＦ２プロセスの最適範囲である。ウイルス回収の前日に新しい中空繊維をＦｌｅｘｓｔａｎｄでセットアップした。中空繊維をＤＩ水で９０分間すすいでグリセロール保存剤を除去し、０．５Ｎ ＮａＯＨで１時間殺菌し、ｐＨが７．２となるまでＳＰ １００バッファーで平衡化した。

【0392】

ＣＳ溶出液の全容量をＦｌｅｘｓｔａｎｄシステムで処理した。まず、透過流ラインを閉じ、 供給流速０．５Ｌ／分でＣＳ溶出液を再循環させ、１６，０００／秒の剪断速度とした。５分間再循環させた後、透過流ラインを開けてダイアフィルトレーションを開始した。同時に、ＳＰ１００バッファーをダイアフィルトレーションラインから送り出し、保持液制御バルブを段階的に閉じ、膜間差圧（ＴＭＰ）を２０〜２１ｐｓｉとした。プロセス全体で、ＳＰ１００ダイアフィルトレーションラインのポンプ流速を制御することにより、保持液リザーバーの容量を、ＣＳ溶出容量（０．４〜０．８Ｌの範囲）に相当する容量で一定に維持した。実施８の前に、ＣＳ溶出液を５倍ダイアボリュームのＳＰ １００バッファーでダイアフィルトレーションした。精製実施８〜９では、このＣＳ溶出液を８倍ダイアボリュームのＳＰ１００バッファーでバッファー交換した。ダイアフィルトレーションの終了時、製品回収前に、保持液バルブを全開し、透過流ラインを再び閉じ、システムを５分間再循環させた。ダイアフィルトレーション製品を１０Ｌ製品バッグへと排出した。このダイアフィルトレーション製品をサンプリングして、ＦＦＡによる感染度、ベンゾナーゼ、ＨＣＤおよびＨＣＰを調べた。中空繊維カートリッジおよびシステムを、０．５Ｎ ＮａＯＨを用い、再循環流速０．５Ｌ／分で１時間洗浄した。

【0393】

ダイレクト・フロー・フィルトレーション２（ＤＦＦ２）： フィルターリグを準備し、ウイルス回収前にオートクレーブにかけた。フィルターリグの図を図９Ｂの下のパネルに詳細に示す。用いた０．２２μｍポリエーテルスルホン膜カプセルの全表面積は、実施１〜５では１５０ｃｍ^２、実施６〜９では３００ｃｍ^２であった。最終無菌濾過ＤＦＦ２工程はバイオセーフティーキャビネットで行った。

【0394】

濃Ｇｌｕｔａｍａｔｅアルギニンゼラチン（ｃＧＡＧ）を８倍ＤＦ製品に１：９（ｖ／ｖ）希釈で加え、精製ウイルスの最終的な処方物を作製した。処方されたウイルスを、３００ｃｍ^２カプセルではおよそ０．３８ＬＰＭで閉系リグアセンブリを経て送り、最終製品を用いてフィルターをプライミングした。濾液を無菌の２Ｌボトルに最終バルク製品として収集した。濾過流速０．３８ＬＰＭで、３００ｃｍ^２フィルターのフラックスは７６０ＬＭＨであった。膜面積に対する処方さバルク負荷は２０〜１５０Ｌ／ｍ^２の範囲であった。０．２２μｍで濾過された最終バルク製品をサンプリングし、ＦＦＡによる感染性、ベンゾナーゼ、ＨＣＤおよびＨＣＰレベルを調べた。最終バルク製品を１ｍＬ、１０ｍＬおよび１００ｍＬの数アリコートに分注し、急速冷凍し、−８０℃で保存した。

【0395】

サンプル分析および計算： 分析に送った全てのサンプルを急速冷凍し、−８０℃で保存した。ＨＣＰアッセイは本質的に下記のように行った。ＨＣＤアッセイは、本質的に下記のように、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎおよびＰＣＲ法を用いて行った。ＨＣＤサイジングは、プソラレン−ビオチンの直接標識法（ブロット）およびアガロースゲルにおける直接染色により分析した。ベンゾナーゼ定量アッセイは本質的に下記のように行った。用量当たりのｎｇまたはμｇで計算された全ての値は、力価、すなわち、用量当たりの７ｌｏｇ_１０ＦＦＵ（１用量はまた一般に１０^７ＦＦＵとも呼ぶ）に基づく。

【0396】

残留宿主細胞ＤＮＡの測定： 残留ＭＤＣＫ宿主細胞ＤＮＡを、マイクロウェル形式のリアルタイムＰＣＲ法を用いて定量する。アッセイの対象は、イヌのシトクロムオキシダーゼサブユニットＩ（ＣｏｘＩ）遺伝子内の特異な配列である。至適化されたオリゴヌクレオチドプライマーセットを用い、ＭＤＣＫ ＣｏｘＩ特異的ＰＣＲ産物を鋳型から生成し、ＳＹＢＲ（登録商標）緑色色素で検出する。マイクロウェル形式は、広い動的範囲（１０００〜０．１ｎｇ／ｍｌ）のＤＮＡ較正品に便宜である。各アッセイには適当な陽性対照および陰性対照を含める。試験サンプルＤＮＡを、ＤＮＡ抽出キットを用いて誘導する。定量下限０．１ｎｇ／ｍｌを超えるサンプルＤＮＡ量が標準曲線から算出される。精度は、スパイクコントロールの回収に基づき７５〜１２５％内である。報告される結果は、５０〜１５０％のスパイク回収率が得られるサンプル抽出反復の平均ＤＮＡ量である。これらの分析はＱｕａｎｔ−ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎキット(Invitrogen, Eugene, Oregon, カタログ番号P11496)などの市販のキットを用い、キットに記載されている手順に従って行えばよい。

【0397】

残留宿主細胞タンパク質の測定： 残留宿主細胞（ＭＤＣＫ）タンパク質（ＨＣＰ）は、ＨＣＰ（非感染ＭＤＣＫ培養から）に対して作製された一次ビオチン化ウサギ抗体およびストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）コンジュゲートを用いて、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定する。ＭＤＣＫ細胞溶解液に対する抗体をポリスチレンマイクロプレートに吸着させる。ウシ血清アルブミンを含有するブロッキング溶液を加えて、余分な結合部位を飽和させる。試験品サンプルの希釈液をコーティングプレートに加えると、ＭＤＣＫＨＣＰが存在すれば、コーティング抗体と結合する。ウサギで作製されたＭＤＣＫ溶解液に対する、一次ビオチン標識抗体、次いで、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）標識ストレプトアビジンコンジュゲートをプレートに加える。最後に、ＨＲＰＯ基質を加え、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて、形成された有色の最終産物の強度を測定する。発色強度は試験品に存在するＭＤＣＫ ＨＣＰに比例する。既知のタンパク質濃度のＭＤＣＫ細胞溶解液較正品から標準曲線を作成する。標準曲線から、ＭＤＣＫ細胞溶解液のタンパク質濃度を決定する。

【0398】

残留ベンゾナーゼの測定： ベンゾナーゼ活性は、そのニシン精子ＤＮＡを切断する能力により測定する。試験品を二反復でベンゾナーゼ標準曲線と比較する（読み取りは分光光度計にて２６０ｎｍで行う）。スパイク回収率％（ベンゾナーゼ活性）を算出し、正味のベンゾナーゼＵ／ｍｌを決定する。スパイク参照標準の正味のベンゾナーゼ活性は１．１〜１．９Ｕ／ｍｌの間になければならず、相関係数は≧０．９９５でなければならず、定量可能な活性については、非スパイクサンプル希釈液の活性が≧０．７Ｕ／ｍｌでなければならず、スパイク回収率％は８０〜１２０％の間になければならない。

【0399】

８．６．２ 結果および考察
ＳＵＢ実施は全て、８．０〜８．６ｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬの範囲の回収力価を示した。各精製実施の性能を評価するために用いた回収率、ＨＣＤおよびＨＣＰの結果を表２８、表２９および表３０にまとめる。以下の節では、プロセス効率および最終製品の品質を向上させるために行った変更についてまとめ、考察する。最初の精製スキームと最終の精製 スキームのプロセス開発を図１０にまとめ、最初の精製実施から最後の精製実施への主な変更を示す。

【表28】

【表29】

【表30】

【表31】

【表32】

【表33】

【0400】

ＳＶＨ−ＳＶＨからカラム上ベンゾナーゼ処理へのベンゾナーゼ処理の変更： 最初のプロセスでは、ベンゾナーゼ処理は、宿主細胞ＤＮＡを除去するためにＳＶＨ工程で行われた。このプロセス工程には、ＤＦＦ１工程の実施前に２０ＬのＳＶＨと５０Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼを３２℃で３時間混合することを含む。精製実施１〜４では、ＳＶＨ工程にベンゾナーゼを加えたが、精製実施５〜９では、ＳＶＨ工程からベンゾナーゼ処理を除き、５０Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼを含んだクロマトグラフィーバッファーおよび樹脂接触時間５０分を用い、ＣＳクロマトグラフィー工程中のカラム上ベンゾナーゼ処理プロセスとして行った。表２９に示されるように、精製実施２〜４のＨＣＤレベルはＳＶＨとＤＦＦ１の間で用量当たりのｎｇとして顕著には減少しなかったが、精製実施５〜９では、ベンゾナーゼ−カラム上ＣＳクロマトグラフィー工程の後のＨＣＤレベルは目に見えて減少した。ＰＣＲおよびＰｉｃｏＧｒｅｅｎの双方により分析された最終バルク製品のＨＣＤレベルは、精製実施５〜９（０．８４〜１．４２ｎｇ／用量）では、精製実施１〜４（３．２５〜４０．４９ｎｇ／用量）に比べてはるかに低いことが分かった。この変更は、最終バルクＨＣＤを１ｎｇ／用量以下に引き下げることにより最終製品の品質を改良しただけでなく、ベンゾナーゼ処理時間および必要なベンゾナーゼ総量を低減することによりプロセス効率を高めた。カラム上ベンゾナーゼ処理の効果は、ＣＳクロマトグラフィーの節でさらに考察する。

【0401】

ＤＦＦ１：表２８に示されるように、ＤＦＦ１工程は実施４（５２．７％）を除いて良好な回収率（７８．３〜１５４．６％）を示した。ＤＦＦ１工程は細胞と細胞残渣を除去し、通常力価の損失を示さなかった。この工程は、若干のＨＣＤ（表２９）も除去したがＨＣＰ（表３０）は除去しなかった。２０ＬのＳＶＨを濾過するために使用される両方のフィルター（１．２および０．４５μｍ）膜面積は、両方のフィルターの能力に基づき、スケールダウンＶｍａｘ／Ｐｍａｘ研究からそれぞれ安全係数２．６および１．５を用いて予め決定された。濾過流速１．５ＬＰＭでは、１．２μｍおよび０．４５μｍフィルターのフラックスはそれぞれ５００ＬＭＨおよび４７４ＬＭＨであった。１．２μｍおよび０．４５μｍフィルターの実際のＳＶＨローディングはそれぞれ１１１および１０５Ｌ／ｍ^２であった。

【0402】

ＴＦＦ１−ＴＦＦ１の工程回収率を高めるための装備および回収方法の変更：最初の６精製ランは、各ランのＴＦＦ１工程における効力回収率において１０７．２％から３０．３％への緩やかな低下を示した（表２８）。精製実施１〜６では、ＴＦＦ１中空繊維カートリッジを０．５Ｎ ＮａＯＨで洗浄し、そのプロセス後に再使用した。中空繊維カートリッジの洗浄効率が、各実施後にゲル層を完全除去するのに十分であるかどうかは分からないが、これによりこのプロセス工程後のウイルス回収率が低下する可能性がある。より一貫した工程回収率を得るために、精製実施７から始まる既存のプロトコールに対して３つの主要な変更を行った。第一に、中空繊維の洗浄不足の可能性を排除するために、各実施に対して新しい中空繊維を使用した。第二に、ＴＦＦ１産物を収集する前に保持液バルブを開け透過液バルブを閉じて濃縮保持液を中空繊維カートリッジ中で５分間再循環させた。これにより、濃縮およびダイアフィルトレーションプロセス中に膜の表面に形成した可能性があるゲル層が除去され、回収が可能となった。第三に、中空繊維カートリッジ中の残留ウイルスを回収するために、同じ再循環流速および時間（５分）を用いて追加のバッファー洗い流し工程を実施し、そのバッファー洗い流し液を産物と一緒に収集した。これらの変更を行った後、精製実施７〜９ではＴＦＦ１の工程回収率は一貫して高いままであった、およそ７５〜８０％（表２８）。図１１は、１６０００／秒の剪断速度および２０ｐｓｉでの一定のＴＭＰで実施したＴＦＦ１プロセスの典型的なフラックス曲線を示している（精製実施８）。ウイルス溶液がより濃縮される（５ＸＵＦ）につれてフラックスは減少した、フラックスは、ダイアフィルトレーション工程開始時には減少し続けたがダイアフィルトレーション工程（５ＸＤＦ）の終わり頃にわずかに増加した。フラックスは、精製実施全てで、７０〜１００ＬＭＨの範囲に及び、ウイルス力価およびＤＦＦ１濾液の濁度と関係があるように思われた。ダイアフィルトレーション工程終了時のフラックスのわずかな増加は、５ＸＤＦ終了時のＨＣＰおよびＨＣＤ不純物の追加除去が理由であると思われる。表３０に示されるように、ＨＣＰ不純物の大部分（８０〜９０％）は第１回目のＴＦＦ（ＴＦＦ１）工程で除去された。これは、５００ｋＤａより小さいＨＣＰが透過液で除去されているはずであるためである。ウイルス回収物の１Ｘ ＳＰへのバッファー交換の完了は、５ＸＤＦプロセス終了時に１２．５ｍＳ／ｃｍから１ｍＳ／ｃｍへと減少した導電率トレースにより示された（図１１）。

【0403】

ＨＣＤ除去を増加させるためのＣＳオンカラムベンゾナーゼ処理：初期実験は、小規模ＣＳカラム（ベッド高さ１０ｃｍおよびウイルス負荷濃度 樹脂１ｍＬ当たりおよそ９．０ｌｏｇ_１０ＦＦＵを用いる）を使用して設計された。プロセスが改善されたため、樹脂１ｍＬ当たりのウイルス負荷濃度、線流速およびカラムベッド高さは直線的にスケーリングした。負荷力価 樹脂１ｍＬ当たり９．０ｌｏｇ_１０ＦＦＵにおいて、２０Ｌの安定化したウイルス回収物（回収物力価は８．３ｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬである）を処理するには、ＣＳベッド容量４Ｌが必要である。展開実施１〜５では、４ＬのＣＳ樹脂をＢＰＧ ２００カラム（２０ｃｍ内径（ｉ．ｄ．））に最終ベッド高さ１２．５ｃｍまで充填した。ＢＰＧ ２００カラムへの２００ｃｍ／時間での充填中に、背圧が推奨充填圧２．５バール圧を超えた（図１２）。動的結合能研究を実施し、それによりＣＳ樹脂は実際には、上記の充填条件下では樹脂１ｍＬ当たりおよそ９．７ｌｏｇ_１０ＦＦＵまで結合することができることが示された。そのようなものとして、ウイルス負荷 樹脂１ｍＬ当たり９．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵにおいて、２０Ｌの安定化したウイルス回収物（回収物力価は８．３ｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬである）を処理するのにＣＳ樹脂は１．３Ｌしか必要でない。

【0404】

１．３ＬのＣＳ樹脂が充填されたＢＰＧ ２００カラムは最終カラムベッド高さ４．５ｃｍとなる。カラムベッド高さの大幅な減少により、ベッド高さ１５〜２０ｃｍの充填カラム（大規模プロセスに典型的）と比べてより低い分解能となる。精製実施６から、ＢＰＧ １００カラムに目標のベッド高さ１７．５ｃｍ＋／−２．５ｃｍまで充填してＣＳカラム容量を１．４Ｌにした。ＢＰＧ １００カラムでは、充填流速５００ｃｍ／時間を用い、結果として生じた充填圧は樹脂の推奨充填圧限界を超えなかった。この充填圧は、ＢＰＧ ２００カラムの場合の充填圧とは異なる（図１２）。

【0405】

精製実施６〜９（ＢＰＧ １００）と精製実施２〜５（ＢＰＧ ２００）との比較、実負荷を樹脂１ｍＬ当たり８．４から８．９ｌｏｇ_１０ＦＦＵへ（ＢＰＧ ２００カラム）および樹脂１ｍＬ当たり９から９．３ｌｏｇ_１０ＦＦＵへ（ＢＰＧ １００カラム）と増加した場合、それぞれ平均して５４％および５９％になる類似のＣＳ溶出液工程回収率（表２８）。オンカラムベンゾナーゼ処理を用いて実施したＨＣＤ除去についてのカラム性能に関し、精製実施６〜９（ＢＰＧ １００）は、精製実施５（ＢＰＧ ２００）でのＣＳ溶出液ＨＣＤレベル（１．２ｎｇ／用量）と同程度のＣＳ溶出液ＨＣＤレベル（０．３〜１．５ｎｇ／用量）を示した（表２９）。カラム性能は類似していたが、カラムサイズの減少は、ＣＳ溶出液およびバッファー調製物の容量が減少することによりプロセス効率が高まったため、より大規模の生産へと移行する際に重要になるであろう。図１３は、ＣＳ ＢＰＧ １００カラム（実施９）から溶出された単一ウイルスピークに典型的なクロマトグラムを示している。

【0406】

表３１に示されるように、オンカラムベンゾナーゼ処理（実施５〜９）での総ＨＣＤクリアランスは、バッチ式ベンゾナーゼ処理（実施２〜４）よりも良好であった。ベンゾナーゼ処理でのウイルス精製後に残留するＨＣＤの割合は、０．１５〜３．４％の範囲に及んだ（実施２〜４）が、オンカラムベンゾナーゼ処理でのウイルス精製後に残留するＨＣＤの割合は、０．０２〜０．１５％の範囲に及んだ（実施５〜９）。ＣＳ工程でのオンカラムベンゾナーゼ処理は、ＳＶＨ工程でのバッチ式ベンゾナーゼ処理よりも総ＨＣＤ除去が高率であり、そのため、最終バルクのＤＮＡレベルがより低いことが示された。

【0407】

オンカラムベンゾナーゼ処理の利用には、バッチ式ベンゾナーゼ処理と比べていくつかの利点がある。第一に、２つのプロセス工程を組み合わせて１つにし、ＳＶＨ工程でのベンゾナーゼ処理の３時間をＣＳオンカラム工程での１時間のベンゾナーゼ処理に置き換えることによりプロセス効率が増加する。第二に、精製プロセスに必要なベンゾナーゼの総量が減少する。バッチ式ベンゾナーゼ処理は２０−Ｌウイルス回収物に対して１００万単位のベンゾナーゼが必要であるが、一方、オンカラムベンゾナーゼ処理は２０万単位のベンゾナーゼしか必要でない。よって、オンカラムベンゾナーゼ処理では、必要なベンゾナーゼ総量が５倍減少する。

【0408】

ＴＦＦ２−ベンゾナーゼクリアランスを増加させるためにＴＦＦ２におけるダイアフィルトレーション容量を増加させる：表２８に示されるように、全９精製実施でのＴＦＦ２の工程回収率は一貫して６４％を上回った（６４〜１５０．８％）。実施３では、ＣＳ溶出容量は３．２Ｌであった。２９０ｃｍ^２中空繊維を使用し、中空繊維膜にローディングするＣＳ溶出液は１１０Ｌ／ｍ^２まで増加し、総プロセス時間は６時間であった。その後の２連続実施では、長いプロセス時間を避けるためおよびローディング濃度を、小規模研究で立証されたおよそ２０〜５０Ｌ／ｍ^２に維持するために１４００ｃｍ^２中空繊維膜を使用した。しかしながら、実施６から、カラムサイズを４Ｌから１．４Ｌへと変更し、溶出容量も０．９Ｌ以下まで減少した。溶出液容量のこの減少はカラムサイズに正比例した。実施６〜９では、ＣＳ溶出液ローディング濃度を２０〜５０Ｌ／ｍ^２に維持するために２９０ｃｍ^２中空繊維カートリッジを使用した。図１４は、１６０００／秒の剪断速度および２１ｐｓｉの一定のＴＭＰで実施した、精製実施８でのＴＦＦ２プロセスの典型的なフラックストレース曲線を示している。ＴＦＦ２フラックスはダイアフィルトレーションプロセスを通して適度に安定し、作業条件により汚損が生じなかったことが分かる。フラックスは、精製実施全てで、８０〜１１０ＬＭＨの範囲に及んだ。

【0409】

ベンゾナーゼのクリアランスを向上させるために、ＴＦＦ２バッファー交換容量も５ダイアボリュームから８ダイアボリュームへと増加させた。表３２に示されるように、プロセスをオンカラムベンゾナーゼ処理工程へと変更した場合（実施５）、ＣＳ溶出液のベンゾナーゼレベルは＞７５ｎｇ／ｍＬであり、ベンゾナーゼはＣＳカラムと結合しウイルス産物と共溶出されることが分かる。また、１Ｘ ＳＰＢ後の１ＣＶ〜４ＣＶの通過サンプルを評価することによりＣＳカラムへのベンゾナーゼ結合も確認された。通過サンプルはベンゾナーゼレベルが低いことが分かった（表３２）。よって、精製実施８および９では、検出限界（ＬＯＤ）を下回るレベルまでベンゾナーゼクリアランスを増加させるためにＴＦＦ２バッファー交換容量を５ダイアボリュームから８ダイアボリュームへと増加させた。結果として、ベンゾナーゼレベルは、ダイアフィルトレーションを５ＸＤＦから８ＸＤＦへと増加させることによりさらに４〜５倍低下した。この変更により最終バルクのベンゾナーゼレベルはＬＯＤを下回るまで低下した（０．１ｎｇ／用量未満）（表３２）。

【0410】

ＤＦＦ２−最終バルクの最終無菌濾過のためにフィルターサイズを増大する：表２８に示されるように、１５０ｃｍ^２および３００ｃｍ^２の０．２２μｍ最終フィルターを使用した平均工程回収率はそれぞれ８８．３〜１１１．１％および６５．８〜１０８％である。ＣＴＭキャンペーン実施での最終無菌濾過中の供給流の閉塞を避けるために最終フィルターサイズとして３００ｃｍ^２のフィルターを選択した。０．６〜１Ｌの最終バルクを濾過するために使用した膜面積は、ローディングが２０〜１５０Ｌ／ｍ２の範囲であることを事前に立証した小規模研究に基づいた。３００ｃｍ^２フィルターでは濾過流速は０．３８ＬＰＭであり、そのフィルターでのフラックスは７６０ＬＭＨであった。そのフィルターでの実ローディングは２０〜３３Ｌ／ｍ^２であった（小規模研究から決定された範囲内である）。

【0411】

３ｄｐｉから２ｄｐｉへの上流（ＳＵＢ）プロセス回収時間の変更：精製実施８から、ウイルス回収時間を３ｄｐｉ（６０〜６５時間回収）から２ｄｐｉ（４８時間回収）へと変更した。ウイルス投入量０．００１〜０．００３ＦＦＵ／細胞を用いた場合、ピークウイルス力価は４８時間ｄｐｉの時点において観察された。回収時間を変更することにより、精製実施８および９でのＳＶＨ工程に示されるように（表２９および表３０）出発ＨＣＤおよびＨＣＰレベルが低下した。また、この変更により最終バルク製品（表２９および表３０）中のＨＣＤおよびＨＣＰの不純物レベルも低下し、そのため、最終製品の品質も向上した。

【0412】

精製プロセスの実施により良好なウイルス回収率および純度を得た：精製実施８および９において全実施プロセスを実証した。これらの２つの実施の平均総力価回収率は４３．４％であり、平均ＨＣＤ不純物レベルは０．７２ｎｇ／用量（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎによる）および０．１ｎｇ／用量（ＰＣＲによる）であり、ＨＣＰ不純物レベルは０．２１μｇ／用量であり、ベンゾナーゼ不純物レベルは０．００３５ｎｇ／用量であった。これらは全て精製バルク仕様を下回る。

【0413】

要するに、プロセス効率および最終製品品質を向上させるために初期精製プロセスに対して以下を含むいくつかの変更を行った、１）ＳＶＨ中のＨＣＤおよびＨＣＰ不純物レベルを低下させるためにウイルス回収を３ｄｐｉから２ｄｐｉへと変更し、２）総ＨＣＤ分解および除去を増進するためにＨＣＤ処理工程をＳＶＨでのバッチ式ベンゾナーゼ処理からＣＳオンカラムベンゾナーゼ処理へと変更し、３）ＣＳ樹脂の目標ローディング濃度を９．０ｌｏｇ_１０ＦＦＡ／ｍＬから９．５ｌｏｇ_１０ＦＦＡ／ｍＬへと高め（それによりカラムサイズを４Ｌから１．４Ｌへと減少する）、４）ベンゾナーゼ除去増進するためにＴＦＦ２での最終調剤バッファー交換容量を５ダイアボリュームから８ダイアボリュームへと増加させ、５）ＣＴＭ実施での最終濾過中の閉塞を避けるために最終無菌濾過ローディングを平均２５Ｌ／ｍ^２の半分減少させた。

【0414】

最終精製プロセスを図１０に示し、精製実施全てのデータを表３３に要約する。改良型の精製プロセスでの力価に基づく平均総ウイルス回収率は４３．４％であり、平均不純物レベルはベンゾナーゼについては０．００３５ｎｇ／用量であり、ＨＣＤについては０．７２ｎｇ／用量（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ）および０．１ｎｇ／用量（ＰＣＲ）であり、ＨＣＰについては０．１９μｇ／用量であった。これらの不純物レベルは仕様を下回る。精製実施６〜９での最終バルクを、直接標識式（ソラレン−ビオチン）ブロットおよび直接染色法（アガロースゲル）を用いたＤＮＡサイズ分析により分析した。これらの分析での主要なシグナルはＤＮＡサイズ分布は５００ｂｐ以下を示した（データは示されていない）。

【0415】

８．６．３ 細胞培養生産したインフルエンザの改良精製プロセス
第８．６節に示す実施例において記載するロバストな大規模精製プロセスに対して行うことができるさらなる改良を図１０ｂに概略を示し、下に詳細に記載する。特に、回収タンクの必要をなくし、操作数を減らし、総処理時間を改善するために、回収工程、清澄化工程およびＴＦＦ１工程を結合してよい。よりスムーズな結合作業のために、ＴＦＦ１作業を一定のＴＭＰから一定のフラックスへと変更してよい。加えてまたはあるいは、より低いＴＭＰを利用する（２０ｐｓｉ未満、例えば、約１０ｐｓｉ（１２，０００／秒）〜約１４．５ｐｓｉ（１６，０００／秒）の間）。バルク容量を減少させるために、ＴＦＦ２工程に２Ｘ ＵＦ工程を加えてよい。所望により、その後の全ての精製工程におけるローディングを潜在的に２倍にするために、ＴＦＦ１に１０ＸＵＦを用いる。

【0416】

表３４に、いくつかの精製実施についてのパラメーターの変更、回収率、およびＨＣＤを要約している。これらの実施では、本質的には上記のように培地交換を行わないＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １１０において生産されたウイルスを利用した（第８．１節に示す実施例参照）。精製実施全てを、下に示す場合を除き、本質的には１ｂプロセスについて記載されるように実施した（第８．６節に示す実施例参照）。実施番号２５番、２７番および３０番は、回収工程、ＤＦＦ工程およびＴＦＦ１工程を結合することにより実施した。これらの実施では、ＴＦＦ１を一定のフラックス（５０ＬＭＨ、剪断速度１２，０００／秒）で行った。実施番号２４番、２６番および３１番は、回収工程、ＤＦＦ工程およびＴＦＦ１工程を結合しないで実施した。これらの実施では、ＴＦＦ１をより低いＴＭＰ（１０ｐｓｉ、剪断速度１６，０００／秒）で行った。馴化ウイルス負荷物をＣＳ工程用に分割し、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２または１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２のいずれかで処理した。ＤＮＡ分析では、ＭｇＣｌ_２濃度を高めることによってＤＮＡサイズが減少しないことが示された（データは示されていない）。しかしながら、収率が低下した例もある（表３４参照）。

【0417】

表３５に、培地交換を行うＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １０５において生産されたウイルスのいくつかの精製実施についてのパラメーターの変更、回収率、およびＨＣＤを要約している。これらの実施では、本質的には国際特許公報ＷＯ ０８／１０５９３１に記載されるように生産されたウイルスを利用した（特に、実施例１２参照）。精製実施全てを、下に示す場合を除き、本質的には１ｂプロセスについて記載されるように実施した（第８．６節に示す実施例参照）。実施番号４０番、４１番および４２番は、回収工程、ＤＦＦ工程およびＴＦＦ１工程を結合することにより実施した。これらの実施では、ＴＦＦ１を一定のフラックス（３５ＬＭＨ、剪断速度１２，０００／秒）または一定のＴＭＰ（１０ｐｓｉ、剪断速度１２，０００／秒）のいずれかで行った。一定のフラックスを用いた実施は小規模で実施し、ＣＳ工程のためだけに処理した。実施番号４３番は、回収工程、ＤＦＦ工程およびＴＦＦ１工程を結合しないで実施した。

【0418】

総合して、これらの研究は、ＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １１０（ＭＸを行わない）およびＭｅｄｉＶ ＳＦＭ １０５（ＭＸを行う）プロセスからの材料は類似のフラックス／ＴＭＰの特徴を示すことを示している。より低い剪断（１２，０００／秒）、より低いＴＭＰ（１０ｐｓｉ）、およびより低いフラックス（３５ＬＭＨ）を用いることにより工程ＴＦＦプロセス時間は長くなるが、回収工程、ＤＦＦ工程およびＴＦＦ工程の結合を行う場合には総プロセス時間が短くなる可能性がある。これらの精製実施でのＨＣＤの終濃度は０．０１〜０．６ｎｇ／用量の間であると思われた（上記の１ｂプロセスで得られたものと同程度である）。総収率は一般に３０％を上回った。

【表34】

【表35】

【0419】

８．７ インフルエンザウイルス精製のための樹脂の評価
セルファインサルフェイト（ＣＳ）は、ウイルスと結合する親和性ゲルであり、ウイルスは高塩スクロースリン酸（ＳＰ）バッファーを使用してカラムから溶出させる。上記のように、宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣＤ）、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）不純物および臨床試験に好適なワクチン材料の生産中の宿主細胞ＤＮＡの分解のためのカラム洗浄工程（オンカラムベンゾナーゼ処理）中に取り込まれたベンゾナーゼ（登録商標）汚染物質をさらに除去するために、カラムクロマトグラフィー工程にセルファインサルフェイトゲルを使用してよい。ＣＳゲルの結合能は、ｃａ Ｂ／マレーシア／２５０６／０４ウイルス株を用いた動的結合能研究により決定されたゲル１ｍＬ当たり９．７２ｌｏｇ_１０ＦＦＵである（データは示されていない）。ゲルの結合能に基づき、４００−Ｌおよび１６００−Ｌ三価ワクチン細胞培養物に基づくプロセスの算出カラム容量はそれぞれ２５Ｌ（４０ｃｍ×２０ｃｍ）および１００Ｌ（８０ｃｍ×２０ｃｍ）である。ＣＳカラムローディング前の第一のダイレクトフロー濾過（ＤＦＦ１）工程およびタンジェントフロー濾過（ＴＦＦ１）工程にける感染性粒子総数の２０〜３０％損失を考慮し、各プロセススケールにおける各目標カラムサイズにより、ＣＳゲルの能力の範囲内で、ウイルス回収物力価を８．７ｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬまで精製することが可能となる。しかしながら、より高いウイルス結合能を有する代替クロマトグラフィーゲルの同定によって、さらに精製をスケールアップする必要なく総生産能力の増大がもたらされる。

【0420】

以下の実施例により、本質的には上に詳述されるように精製プロセスを用い６つの追加の親和性樹脂（樹脂Ａ〜Ｆと呼ぶ）の評価を詳述する（第８．６節に示す実施例参照）。要するに、ｃａ Ｂ／マレーシア ２５０６／０４をモデル株として使用し、スクロース−リン酸（ＳＰ）バッファーにより安定化させたウイルス回収物（ＶＨ）を１．２μｍポリプロピレン（ＰＰ）カプセルフィルターおよび０．４５μｍポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）カプセルフィルターにより清澄化した。清澄化されたＶＨを、５重（５Ｘ）限外濾過（ＵＦ）および５００ｋＤａ分子量カットオフ中空繊維カートリッジを使用したスクロース−リン酸（ＳＰ）バッファーでの５重（５Ｘ）ダイアフィルトレーション（ＤＦ）により馴化した。次いで、濃縮されおよびダイアフィルトレーションされたウイルスを試験クロマトグラフィーカラムで精製し、宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣＤ）、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）不純物および宿主細胞ＤＮＡの分解のためのカラム洗浄工程（オンカラムベンゾナーゼ処理）中に取り込まれたベンゾナーゼ（登録商標）汚染物質をさらに除去した。また、最高性能の新規樹脂と現在利用されているＣＳゲルの間で直接比較も実施した。要するに、異なるウイルス回収物ロットを用い、セルファインサルフェイトと比べて試験樹脂ＣおよびＤの精製性能を評価した。評価には、工程収率、結合能、および不純物レベル（例えば、ＨＣＤ、ＨＣＰ、およびベンゾナーゼ（登録商標））が含まれる。このタイプの評価を用い、新規樹脂の性能を効率的に評価することができた。

【0421】

８．７．１ 材料および方法
材料、試薬および装置：同様に機能する他の材料、装置および試薬を容易に代用し得る。

【0422】

１．これらの研究に用いたウイルス回収物ロット（ｃａ Ｂ／マレーシア ２５０６／０４、ｃａ Ａ／ウィスコンシン ６７／０５、ｃａ Ａ／ソロモン諸島 ０３／０６、ｃａ Ａ／ウィスコンシン６７／０５、ｃａ Ａ／サウスダコタ／６／２００７）を感染の４８〜６８時間後に回収し、回収物力価は８．７〜８．９ｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬの間であった。清澄化されたウイルス回収物を、タンジェントフロー濾過（ＴＦＦ１）により５Ｘ限外濾過（ＵＦ）および５Ｘダイアフィルトレーション（ＤＦ）材料で処理し（本質的には上に第８．６節において詳述されるように全てを実施した）、最終力価８．６〜９．４ｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬをカラムローディング量とした。

【0423】

２．Ｑｕａｎｔ−ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ ｋｉｔｓ(Invitrogen, Eugene, Oregon、カタログ番号Ｐ１１４９６)
３．１Ｘ ＳＰバッファー、ｐＨ７．０(Hyclone, Ltd, Logan, UT、カタログ番号ＳＨ３Ａ１５７７．０３)または６．５ｍＭリン酸水素二カリウム、４．５ｍＭリン酸二水素カリウム、および２１８ｍＭスクロースで調製した。１Ｌの１Ｘ ＳＰの場合、６．５ｍＬの１Ｍリン酸水素二カリウム溶液、４．５ｍＬの１Ｍリン酸二水素カリウム溶液、７４．６２ｇのスクロースを混合しＨ_２Ｏに溶解させ最終容量１Ｌにした。必要に応じて１Ｎ Ｈ_３ＰＯ_４または１Ｎ ＫＯＨを用いてｐＨを７．０に調整した
４．１Ｘ ＳＰ、１Ｍ ＮａＣｌバッファーは、９．５ｍＭリン酸水素二カリウム、１．５ｍＭリン酸二水素カリウム、２１８ｍＭスクロース、および１Ｍ ＮａＣｌで調製した。１Ｌの１Ｘ ＳＰ、１Ｍ ＮａＣｌバッファーの場合、９．５ｍＬの１Ｍリン酸水素二カリウム溶液、１．５ｍＬの１Ｍリン酸二水素カリウム溶液、７４．６２ｇのスクロース、および５８．４４ｇの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を混合しＨ_２Ｏに溶解させ最終容量１Ｌにした。必要に応じて、１Ｎ １Ｎ Ｈ_３ＰＯ_４または１ Ｎ ＫＯＨを用いてｐＨを７．０に調整した
５．１Ｘ ＳＰＢ溶液は、２ｍＭ ＭｇＣｌ２および５０Ｕ／ｍＬベンゾナーゼを含有する。５０ｍＬの１Ｘ ＳＰＢを調製するために、４９．９ｍＬの１Ｘ ＳＰ中に１００μＬの１Ｍ ＭｇＣｌ２および７．６５μＬのベンゾナーゼ（３２７Ｕ／ｍＬ）を添加した
６．リン酸水素二カリウム、Ｋ_２ＨＰＯ_４(Sigma, St. Louis, Missouri、カタログ番号Ｐ３７８６）
７．リン酸二水素カリウム、ＫＨ_２ＰＯ_４(Sigma, St. Louis, Missouri、カタログ番号Ｐ５３７９)
８．１Ｍ Ｋ_２ＨＰＯ_４ リン酸水素二カリウム（１７４．１８ｇ）をＨ_２Ｏに溶解させ最終容量１Ｌにした
９．１Ｍ ＫＨ_２ＰＯ_４ リン酸二水素カリウム（１３６．０９ｇ）をＨ_２Ｏに溶解させ最終容量１Ｌにした
１０．スクロース(EMD, Gibbstown, New Jersey、カタログ番号１．０７６５３．９０１２）
１１．ＮａＣｌ(EMD, Gibbstown, New Jersey、カタログ番号７７６０）
１２．１Ｍ ＭｇＣｌ_２(Sigma, St. Louis, Missouri、カタログ番号Ｍ１０２８)
１３．ベンゾナーゼ（登録商標）(EMD, Darmstadt, Germany、カタログ番号１．０７６５３．９０１２、３５３Ｕ／μｌ)
１４．０．５Ｎ ＮａＯＨ、１０Ｎ ＮａＯＨ(VWR, West Chester, Pennsylvania、カタログ番号ＶＷ３２４７−７)から希釈した
１５．０．２２μＭフィルター(Millipore, Billerica, Massachusetts、カタログ番号ＳＣＧＰＵ１１ＲＥ)
１６．ポリエチレンテレフタレート共重合体（ＰＥＴＧ）ボトル(Nalgene, Rochester, New York)：１Ｌ（カタログ番号２０１９−１０００）；２Ｌ（カタログ番号２０１９−２０００）；１２５ｍＬ（カタログ番号２０１９−０１２５）；２５０ｍＬ（カタログ番号２０１９−０２５０）
１７．コニカルチューブ(Corning, Corning, New York)：１５ｍＬ（カタログ番号４３００５２）；５０ｍＬ（カタログ番号６３０８２９）；
１８．１．２μｍポリガードＣＮオプティキャップＸＬ５フィルター(Millipore Corporation, Billerica, Massachusetts、カタログ番号ＫＮ１２Ａ０５ＨＨ１)
１９．０．４５μｍデュラポアオプティキャップＸＬ４フィルター(Millipore Corporation, Billerica, Massachusetts、カタログ番号ＫＰＨＬＡ０４ＨＨ３)
２０．２０Ｌバッグ(Hyclone, Ltd, Logan, UT、カタログ番号ＳＨ３０７１２．０３)
２１．５０Ｌバッグ(Hyclone, Ltd, Logan, UT、カタログ番号ＳＨ３０７１２．０４)
２２．中空繊維、５００ｋＤａ、４，８００ｃｍ^２(GE Healthcare, Uppsala, Sweden, 型番ＵＦＰ−５００−Ｃ−６Ａ)
２３．中空繊維、５００ｋＤａ、１，４００ｃｍ^２(GE Healthcare, Uppsala, Sweden, 型番ＵＦＰ−５００−Ｃ−３ｘ２ ＭＡ)
２４．オムニフィットカラム（０．６６ｃｍ×２０ｃｍおよび１ｃｍ×２０ｃｍ）(Bio-Chem Valve Inc. Coldhams Lane, Cambridge)
２５．ＸＫ−１６カラム １６ｍｍ×２０ｃｍ(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)
２６．Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)
２７．ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ＧＥＭＩＮＩ ＥＭマイクロプレートリーダー(SpectraMax GEMINI EM microplater reader)(Molecular Devices, Sunnyvale, California)
２８．Ｔｈｅｒｍｏ Ｏｒｉｏｎ ｐＨ計(Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts)
２９．ＣＤＭ２１０導電率計(Radiometer Analytical, Lyon, France)
試験樹脂の調製：樹脂を２０％エタノール中に保存した。所望の量（例えば、４２ｍＬ）の５０％樹脂スラリーを５０ｍＬ コニカルチューブ中にピペットで移し１０００ｒｐｍで１０分間を回転させた。その液体を除去し、２１ｍＬの充填バッファー（１Ｘ ＳＰ＋１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）を用いて樹脂を再懸濁した。樹脂の充填バッファーとの交換を３回繰り返した。

【0424】

ＸＫ−１６（１６ｍｍ×１０ｃｍ）試験樹脂カラムまたはＣＳ樹脂カラムの調製：空のカラムの部品全てを水で洗浄し、充填前に乾燥させた。そのカラムを製造業者の使用説明書に従って組み立てた。そのカラムの底にカラムアダプターを挿入し、アダプターチューブを３０ｍＬのシリンジと連結した。そのカラムを垂直に配置し、スタンド上に固定した。そのカラムに１０ｍＬの充填バッファーを満たし、カラム中に２ｃｍバッファーが残るまで下部のシリンジを引いた。調製した試験樹脂を、気泡を入れないようにカラムに注ぎ入れ、重力によって沈降させた。樹脂が沈降したら、カラムに充填バッファーを満たした。上部アダプターを、カラムに気泡を入れないように慎重に挿入した。次いで、そのカラムをＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステムに連結し、カラムベッド高さが変わらないように充填バッファーを５００ｃｍ／時間（１６．７ｍＬ／分）でおよそ２０分間充填した。上部アダプターをゲルの上部まで１〜２ｍｍ調整した。最終充填カラムベッド高さは１０ｃｍであった（これは２０ｍＬカラム容量に等しい）。試験樹脂およびＣＳゲルを用いた動的結合能研究では、より小さいサイズのオムニフィットカラム（０．６６ｃｍ×１７ｃｍ）（これは、充填した場合の５．８ｍＬのゲルに等しい）を使用した。充填した試験樹脂カラムは、１Ｎ ＮａＯＨで１時間消毒し、１Ｘ ＳＰ ｐＨ７．０バッファーで再び平衡化した。充填したＣＳカラムは、０．５Ｎ ＮａＯＨで１時間消毒し、１Ｘ ＳＰ ｐＨ７．０バッファーで再び平衡化した。

【0425】

試験樹脂カラムおよびセルファインサルフェイトカラムに対する５Ｘ限外濾過および５Ｘダイアフィルトレーション（５Ｘ ＵＦ／５Ｘ ＤＦ）馴化ウイルス負荷物の調製：１５Ｌまたは２０Ｌの１Ｘ ＳＰにより安定化させた、１５Ｌバイオリアクターまたは３０Ｌ ＳＵＢバイオリアクターからのウイルス回収物（ＭＤＣＫ細胞増殖およびウイルス生産についての詳細は、国際特許公報ＷＯ ０８／１０５９３１に記載されている、特に、実施例１２参照）を、１８００ｃｍ^２の１．２μｍプレフィルターカプセルおよび１９００ｃｍ^２の０．４５μｍフィルターカプセルにより流速１．５Ｌ／分で濾過し、２０−Ｌ Hyclone社製バッグに収集した。次いで、ダイレクトフロー濾過（ＤＦＦ１）濾液を、本質的には上に改良型のプロセスについて記載されるように、５重限外濾過（５Ｘ ＵＦ）およびフレックススタンドシステムを使用する１Ｘ ＳＰバッファーを用いた５重ダイアフィルトレーション（５Ｘ ＤＦ）によるタンジェントフロー濾過（ＴＦＦ１）を用いて精製した（第８．６節に示す実施例参照）。ＴＦＦ１工程は、ロットの大部分で、１４００ｃｍ^２または４８００ｃｍ^２の５００−ｋＤａ分子量カットオフ中空繊維カートリッジを使用し、一定の剪断速度１６０００／秒および２０ｐｓｉのＴＭＰで実施した。ｃａ Ｂ／マレーシアウイルス回収物ロット番号１番は、一定の剪断速度１２０００／秒および１４．５ｐｓｉのＴＭＰでで実施し、ｃａ Ｂ／マレーシアウイルス回収物ロット番号２番は、一定の剪断速度１２，０００／秒および一定のフラックス７０ＬＭＨで実施した。５Ｘ ＵＦ／５Ｘ ＤＦウイルス溶液は１ボトル当たり１００ｍＬに等分した。ボトル全てをドライアイスで凍結させ、試験樹脂カラムおよびＣＳカラムのローディング材料として−８０℃で保存した。

【0426】

試験樹脂カラムおよびセルファインサルフェイトカラム運転条件：試験樹脂カラム（１６ｍｍ×１０ｃｍ）実施の作業パラメーターは、ＢＰＧ １００カラムについて上に詳述されるのと本質的に同じであった。要するに、カラムをまず、３カラム容量（ＣＶ）の１Ｘ ＳＰで平衡化し、そのカラムに所望の量の５Ｘ ＵＦ／５Ｘ ＤＦウイルス溶液を流速１５０ｃｍ／時間（１．６ｃｍ×１０ｃｍ ＸＫ−１６カラムの場合には５ｍＬ／分、０．６６ｃｍ×１７ｃｍオムニフィットカラムの場合には０．８５ｍＬ／分）でローディングした。１ＣＶの１Ｘ ＳＰバッファーでの洗浄後、接触時間５０分でのオンカラムベンゾナーゼ処理のためにそのカラムに１Ｘ ＳＰＢを５０ｃｍ／時間で（１．６ｃｍ×１０ｃｍ ＸＫ−１６カラムの場合には８５ｍＬの１Ｘ ＳＰＢを１．７ｍＬ／分で、０．６６ｃｍ×１７ｃｍオムニフィットカラムの場合には１５ｍＬの１Ｘ ＳＰＢを０．３ｍＬ／分で）ローディングした。次いで、そのカラムを第一の１ＣＶの１Ｘ ＳＰで５０ｃｍ／時間でおよび第二の１ＣＶの１Ｘ ＳＰで１５０ｃｍ／時間の線流速で洗浄した。結合したウイルスを３ＣＶの１Ｍ ＮａＣｌ含有１Ｘ ＳＰ、ｐＨ７．０バッファーで線流速１５０ｃｍ／時間で溶出させた。Ａ_２８０ｎｍで２０ｍＡＵから２０ｍＡＵまで（０．１Ｏ．Ｄ．〜０．１Ｏ．Ｄ．）溶出ピークを収集した。試験樹脂ローディング、通過、ベンゾナーゼ洗浄、および溶出液について画分を収集した。サンプル全てを等分し、ドライアイスで凍結させ、ＦＦＡ（蛍光フォーカスアッセイ）による感染性分析およびＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイによるＤＮＡ分析のために−８０℃で保存した。

【0427】

試験樹脂カラム精製評価：充填した試験樹脂カラム（１６ｍｍ×１０ｃｍ）に、ｃａ Ｂ／マレーシアウイルス株５ＸＵＦ／５ＸＤＦ ＴＦＦ１材料をローディング濃度９．０ｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬで個別にローディングした。少容量のローディングを避けるため、ローディング前に５ＸＵＦ／５ＸＤＦウイルスローディング溶液を１Ｘ ＳＰバッファーで力価９．４ｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬから９．０ｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬへ２．５倍に予備希釈した。各カラムでの実施では５０ｍＬのウイルス溶液をゲル１ｍＬ当たり９．４ｌｏｇ_１０ＦＦＵで対象にローディングした。計算は、ローディングウイルス力価×ローディング容量÷ＣＳカラム容量に基づいた、ｌｏｇ（１０＾（９．０ＦＦＵ／ｍＬ）×５０ｍＬ／２０ｍＬカラム容量）＝ゲル１ｍＬ当たり９．４ｌｏｇ_１０ＦＦＵ。各実施では、ウイルスローディング画分、通過画分、ベンゾナーゼ洗浄画分および溶出液画分を収集した。サンプル全てを等分し、ドライアイスで凍結させ、ＦＦＡによる感染性分析のためおよびＨＣＤ、ＨＣＰおよびベンゾナーゼ定量分析のために−８０℃で保存した。

【0428】

試験樹脂カラム結合能研究：試験樹脂カラム（１６ｍｍ×１０ｃｍ）に、ｃａ Ｂ／マレーシアウイルス株５ＸＵＦ／５ＸＤＦ ＴＦＦ１材料をローディング濃度９．０ｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬでローディングした。ローディング前に５ＸＵＦ／５ＸＤＦウイルスローディング溶液を１Ｘ ＳＰバッファーで力価９．４ｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬから９．０ｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬへ予備希釈した。試験樹脂の結合能を評価するために、ゲル１ｍＬ当たり９．４ｌｏｇ_１０ＦＦＵ、９．９ｌｏｇ_１０ＦＦＵ、１０．２ｌｏｇ_１０ＦＦＵおよび１０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵの４つの異なる総ウイルスローディング量範囲を実施した。各実施では、ウイルスローディングサンプル、通過サンプルおよび溶出液サンプルを収集し、本質的には上記のように蛍光フォーカスアッセイ（ＦＦＡ）により感染性力価について（第８．１節に示す実施例参照）および本質的にはキットに記載される手順に従いＱｕａｎｔ−ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎキットを使用して宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣＤ）分析について分析した。カラム溶出液ＨＣＤレベル（１０^７力価用量当たりのｎｇ数を単位として）は、ＨＣＤ（ｎｇ／ｍＬ）／（１０＾（ＣＳ溶出液力価ｌｏｇ_{１０ＦＦＵ}／ｍＬ−７．０ｌｏｇ_１０ＦＦＵ／用量））＝ＨＣＤ（ｎｇ／用量）として計算した。宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびベンゾナーゼ（商標）のレベルも、本質的には上記のように決定した（第８．６節に示す実施例参照）。

【0429】

セルファインサルフェイトおよび試験樹脂の動的結合能研究：ＣＳゲルとの比較により試験樹脂の性能および結合能に対するロット材料の効果を調査するために、ｃａ Ｂ／マレーシア株およびｃａ Ａ／ウィスコンシン株の異なるロットのＴＦＦ１（５Ｘ ＵＦ／５Ｘ ＤＦ）材料を用いてカラム動的結合能研究を実施した。ＴＦＦ１（５Ｘ ＵＦ／５Ｘ ＤＦ）ウイルス溶液をＣＳカラムおよび試験樹脂カラムに１５０ｃｍ／時間でローディングした。ウイルスローディング量をゲル１ｍＬ当たり１０．５〜１０．７ｌｏｇ_１０ＦＦＵに定めた。計算は、ローディングウイルス力価×ローディング容量÷ＣＳカラム容量に基づいた、ｌｏｇ（１０＾（ＴＦＦ１ローディング力価（ｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬ））×ローディング容量（ｍＬ）／カラム容量（ｍＬ））＝目標ローディング量（ゲル１ｍＬ当たりのｌｏｇ_１０ＦＦＵ）。通過物を各画分チューブに１カラム容量（ＣＶ）として収集した。それらの通過画分をＦＦＡにより力価について分析した。ＣＳゲルの破過曲線を、通過容量とローディング力価濃度に対する通過物におけるウイルス力価濃度の割合としてプロットした。動的結合能は、通過物においてローディングウイルス濃度の１０％に達するまでゲルと結合することができるウイルスの最大量として決定した。次いで、１０％ウイルス破過における容量（Ｘ）を用いてゲルの結合能（Ｙ）を計算した。これはローディングウイルス力価×１０％破過における容量÷カラム容量、ｌｏｇ（１０＾（ローディング力価（ｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬ））×（ｍＬ）／カラム容量（ｍＬ））＝Ｙ（ゲル１ｍＬ当たりのｌｏｇ_１０ＦＦＵ）である。

【0430】

ローディング範囲研究：ＣＳゲルとの比較により試験樹脂ＣおよびＤの性能に対するロット材料の効果を比較するために、ｃａ Ｂ／マレーシア ＴＦＦ１（５Ｘ ＵＦ／５Ｘ ＤＦ）材料の３つの異なるロットを用いてローディング範囲研究を実施した。各個別ロットについておよび各カラムゲルについての目標ローディング範囲を表３４に記載する。各実施でのカラムローディング物、通過物およびカラム溶出液を収集し、ＦＦＡアッセイおよびＨＣＤアッセイを用いて分析した。

【0431】

精製工程収率：カラム精製工程収率を、溶出ウイルス力価×溶出容量÷ローディングウイルス力価×びローディング容量、１０＾（ＣＳ溶出液力価ＦＦＵ／ｍＬ）×溶出容量／（１０＾（ＣＳローディング力価ＦＦＵ／ｍＬ）×ローディング容量）から計算した。

【表36】

【0432】

８．７．２ 結果および考察
試験樹脂Ａ〜Ｄについての精製実施では、各カラムにｃａ Ｂ／マレーシアウイルス株５ＸＵＦ／５ＸＤＦ ＴＦＦ１材料をローディング濃度９．０ｌｏｇ_１０ＦＦＵ／ｍＬでローディングした。各実施に対して目標ウイルスローディング量はゲル１ｍＬ当たり９．４ｌｏｇ_１０ＦＦＵであった。ウイルスは、３カラム容量（ＣＶ）の１Ｍ ＮａＣｌ含有ＳＰバッファーを用いてカラムから溶出させた。試験樹脂Ａ〜Ｄカラム実施の溶出クロマトグラムを図１９に示している、それぞれパネルＡ〜Ｄ。図１９に示されるように、試験樹脂ＡおよびＢは分離した複数の溶出ピークを示すように思われたが、一方、試験樹脂ＣおよびＤはピークショルダー特性および不均一性を有する単一ピークを示した。

【0433】

表３７に、工程収率、カラム溶出液不純物ＨＣＤレベル、ＨＣＰレベルおよびベンゾナーゼ汚染物質レベルを比較する４つの精製実施の結果を要約している。試験樹脂ＣおよびＤは、試験樹脂ＡおよびＢと比べて工程収率が高く（１０３．５％および７６．５％）、試験樹脂Ｂの工程収率が最も低かった（１４．５％）。不純物ＨＣＤレベルに関しては、試験樹脂ＣおよびＤで精製したｃａ Ｂ／マレーシアは、試験樹脂ＡおよびＢ（０．１４ｎｇ／用量および０．６７ｎｇ／用量）と比べてＨＣＤレベルが低かった（０．０７ｎｇ／用量および０．０８ｎｇ／用量）。試験樹脂Ｃ（０．２７ｎｇ／用量）および試験樹脂Ｄ（０．２１ｎｇ／用量）で精製したｃａ Ｂ／マレーシアのＨＣＰレベルは、試験樹脂Ａ（０．２６ｎｇ／用量）と類似していたが、試験樹脂Ｂ（０．８７ｎｇ／用量）よりも低かった。試験樹脂ＣおよびＤで精製したｃａ Ｂ／マレーシアのベンゾナーゼレベル（０．２５ｎｇ／用量および０．３１ｎｇ／用量）は、試験樹脂ＡおよびＢ（１．７８ｎｇ／用量および２．６０ｎｇ／用量）の場合よりも低かった。

【表37】

【0434】

表３８では、４つの試験樹脂実施での通過物におけるウイルス力価は、非常に低い（試験樹脂Ｃではローディング量に対して感染性粒子総数２．２％）かまたは検出限界（ＬＯＤ）を示し、これによりウイルスは大部分がゲル１ｍＬ当たり９．４ｌｏｇ_１０ＦＦＵのローディングにおいてゲルへと結合されたことが分かる。試験樹脂Ｃは、通過物におけるウイルス量がより多く、これにより試験樹脂Ｃは他の３つの試験樹脂と比べて結合能が低い可能性があることが示唆される。これらの４つの実施のベンゾナーゼ洗浄画分も検出できないかまたはウイルスの割合が非常に低かった（試験樹脂Ｃでは１．２％および試験樹脂Ｄでは０．９％）。試験樹脂での４つの精製実施の初期スクリーニングの結果より、試験樹脂ＣおよびＤは、工程収率ならびに溶出液不純物レベルおよび汚染物質レベルに関して、他の２つのゲルと比べて優れた機能を示すことがわかった。

【表38】

【0435】

ゲル１ｍＬ当たり９．４ｌｏｇ_１０ＦＦＵのローディングでの試験樹脂Ａ〜Ｄのスクリーニング結果より、ウイルスは大部分が結合されたことが分かったため、これらの樹脂の結合能を評価するために、ゲル１ｍＬ当たり９．４ｌｏｇ_１０ＦＦＵ、９．９ｌｏｇ_１０ＦＦＵ、１０．２ｌｏｇ_１０ＦＦＵおよび１０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵのローディングレベルのより多いウイルスローディング量を選択した。加えて、試験樹脂ＥおよびＦも評価した。これらのローディングレベルでの工程収率およびＨＣＤ不純物レベルに対する影響も評価した。結合能研究結果は下に要約している。表３９には、試験樹脂ＣおよびＤの結合能結果を記載している。表４０には、試験樹脂Ａ、Ｂ、ＥおよびＦの結合能結果を記載している。

【表39】

【表40】

【0436】

表３９では、試験樹脂ＣおよびＤでのゲル１ｍＬ当たり９．４ｌｏｇ_{１０ＦＦＵ}／ｍＬのローディングにおける実施結果をＳＰバッファー １Ｍ ＮａＣｌおよび２Ｍ ＮａＣｌ溶出それぞれに関して比較した。試験樹脂ＣおよびＤ溶出ピークが、１Ｍ ＮａＣｌ溶出の場合に見られるピークに対し、単一ピークとなるかどうか評価するために、２Ｍ ＮａＣｌ溶出を実施した。図２０に示されるように、２Ｍ ＮａＣｌ溶出の場合、溶出ピークは両方のゲルでシャープであり不均一性はなかった（図１９Ｂと図２０Ａおよび図１９Ｄと図２０Ｂを比較）。表３９に示されるように、力価に基づく回収率が試験樹脂Ｃでは１０３．５％から９０．２％、試験樹脂Ｄでは７６．５％から５９．７％となることを考えると、２Ｍ ＮａＣｌ溶出は、試験樹脂ＣおよびＤのいずれにおいても工程収率に重大な影響を及ぼさない。溶出液のＨＣＤレベル（用量当たりのｎｇ数を単位として）は、２Ｍ ＮａＣｌで溶出した場合には両方のゲルでわずかに増加し；試験樹脂Ｃでは０．０７ｎｇ／用量から０．２ｎｇ／用量へ、試験樹脂Ｄでは０．０８ｎｇ／用量から０．１１ｎｇ／用量へと増加した。ウイルスローディング量をより多くした場合のＨＣＤレベルに対する影響の評価では、ローディング量をゲル１ｍＬ当たり９．４ｌｏｇ_１０ＦＦＵから９．９ｌｏｇ_１０ＦＦＵへと増加させると、試験樹脂Ｃでの溶出液ＨＣＤレベルは０．２ｎｇ／用量から１．２６ｎｇ／用量へと増加したが工程収率には影響はなかった（９０．２％対９４．４％）。試験樹脂Ｃでは、ローディング量をゲル１ｍＬ当たり１０．２ｌｏｇ_１０ＦＦＵへとさらに増加させると通過画分におけるウイルス破過量が増加を示し（１４．４％）、その結果、収率が低下し（７９．４％）、溶出液のＨＣＤレベルが増加した（２．１９ｎｇ／用量）。各ゲルについて破過曲線をまだ評価していないため、結合能は、通過物中に認められたウイルスが２％以下である場合に対応するウイルスローディング量として推定した。よって、ゲル１ｍＬ当たり９．９ｌｏｇ_１０ＦＦＵを試験樹脂Ｃの結合能と推定した。表３９に示されるように、試験樹脂Ｄでは、ウイルスローディング量をゲル１ｍＬ当たり９．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵから１０．２ｌｏｇ_１０ＦＦＵへと増加させると、ＨＣＤレベルが０．１１ｎｇ／用量から０．９８ｎｇ／用量へと増加したが工程収率に対して大きな効果はなかった（５９．７％から７９．７％へ）。これは、ゲル１ｍＬ当たり１０．２ｌｏｇ_１０ＦＦＵのローディング量でも通過物で検出されたウイルスはほんのわずかであった（１．４％）ことが理由である。よって、ゲル１ｍＬ当たり１０．２ｌｏｇ_１０ＦＦＵが試験樹脂Ｄの結合能であると推定した。

【0437】

要するに、試験樹脂ＣおよびＤの推定結合能はそれぞれゲル１ｍＬ当たり９．９ｌｏｇ_１０ＦＦＵおよび１０．２ｌｏｇ_１０ＦＦＵであった。ｃａ Ｂ／マレーシア株を用いた一連の研究において、試験樹脂Ｄは、試験樹脂Ｃよりおよそ２倍高い結合能を有していた。ウイルスローディング量を増加させると、溶出液ＨＣＤレベルも、試験樹脂ＣおよびＤの両方で増加した。同じローディングレベル ゲル１ｍＬ当たり１０．２ｌｏｇ_１０ＦＦＵのゲルを比較すると、試験樹脂Ｃの用量当たりのレベルＨＣＤ値（２．１９ｎｇ／用量）は試験樹脂Ｄより高かった（０．９８ｎｇ／用量）ため、ウイルスローディング量をより多くした場合、試験樹脂ＣでのＨＣＤレベルに対する影響は試験樹脂Ｄより顕著であった。工程収率の観点で種々のウイルスローディング量を比較すると、試験樹脂Ｃは試験樹脂Ｄよりわずかに高い工程収率を与えた。

【0438】

初期スクリーニングの結果より、ゲル１ｍＬ当たり９．４ｌｏｇ_１０ＦＦＵのローディング量で研究を実施した場合に試験樹脂ＣおよびＤは試験樹脂ＡおよびＢよりも良い精製結果を与えることがわかった。試験樹脂ＡおよびＢならびに２つの追加の試験樹脂（ＥおよびＦ）が試験樹脂ＣおよびＤよりもさらに高い結合能を与え得るかどうかを評価するために、試験樹脂Ａ、Ｂ、ＥおよびＦを用いて結合能研究を実施し、工程収率について評価した。それらの結果を表４０に要約する。この一連の精製実施では、結合したウイルスをＳＰバッファー １Ｍ ＮａＣｌで溶出させた（これは第８．６節に示す実施例に記載されるＣＳクロマトグラフィー工程について用いた溶出バッファー条件である）。

【0439】

表４０に示されるように、試験樹脂Ｅの推定結合能はゲル１ｍＬ当たり９．９ｌｏｇ_１０ＦＦＵ〜１０．２ｌｏｇ_１０ＦＦＵの間であり、これはこれらの２つのローディング範囲で通過物中のウイルスの割合が未検出から８．３％へと増加したためである。試験樹脂Ａでは、推定結合能はゲル１ｍＬ当たり１０．２ｌｏｇ_１０ＦＦＵ〜１０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵの間であり、これはこれらの２つのローディング範囲で通過物中のウイルスの割合が未検出から６．３％へと増加したためである。試験樹脂ＢおよびＥ両方の結合能はゲル１ｍＬ当たり少なくとも≧９．９ｌｏｇ_１０ＦＦＵであると推定され、これはより多いローディング範囲で行った実施がなかったためである。

【0440】

ウイルスローディング量をより多くした場合のＨＣＤレベルに対する影響を評価した場合、試験樹脂Ａ、Ｂ、Ｅ、およびＦでのＨＣＤレベルは、ウイルスローディング量をゲル１ｍＬ当たり９．４ｌｏｇ_１０ＦＦＵから９．９ｌｏｇ_１０ＦＦＵへと増加させたときに増加した。試験樹脂ＡおよびＥではローディング量をゲル１ｍＬ当たり１０．２ｌｏｇ_１０ＦＦＵおよび１０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵまで増加させたときにさらに高いＨＣＤレベルが観察された。試験樹脂ＣおよびＤと同じウイルスローディング量（ゲル１ｍＬ当たり９．９ｌｏｇ_１０ＦＦＵ）において、試験樹脂の一部の溶出画分においてより高いＨＣＤレベルが観察された（試験樹脂Ａでは３．４３ｎｇ／用量、試験樹脂Ｂでは２．９ｎｇ／用量、試験樹脂Ｅでは５．３１ｎｇ／用量、試験樹脂Ｆでは１．２４ｎｇ／用量）（表４０）。よって、試験樹脂Ａ、Ｂ、ＥおよびＦではウイルスローディング量をより多くした場合のＨＣＤレベルに対する影響が試験樹脂ＣおよびＤの場合よりも著しかった。

【0441】

ウイルスローディングをゲル１ｍＬ当たり９．４ｌｏｇ_１０ＦＦＵから１０．２ｌｏｇ_１０ＦＦＵへと増加させると試験樹脂Ｅでは工程収率が８２％から４７．８％へと低下した（表４０）。試験樹脂Ａでも、ウイルスローディングをゲル１ｍＬ当たり９．４ｌｏｇ_１０ＦＦＵから１０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵへと増加させると工程収率が低下した（６９．４％から５１．５％へ）。試験樹脂ＢおよびＦは両方とも、同じウイルスローディング量（ゲル１ｍＬ当たり９．９ｌｏｇ_１０ＦＦＵ）での試験樹脂ＥおよびＡ（５２．０％および６１．５％）と比べて相対的に低い工程収率（１１．７％および３４．９％）を示した。ウイルスローディング ゲル１ｍＬ当たり９．４ｌｏｇ_１０ＦＦＵでは同じ傾向が観察され、試験樹脂Ｅ（８２％）および試験樹脂Ａ（６９．４％）では試験樹脂Ｂ（１４．５％）と比べて工程収率が高かった。試験樹脂を比較すると、試験樹脂ＣおよびＤは種々のウイルスローディング範囲において試験樹脂Ａ、Ｂ、ＥおよびＦよりも高い工程収率を与えた。性能を現行のＣＳゲルと比較するために、種々のウイルス株および回収ロットを用いて試験樹脂ＣおよびＤをさらに評価した。

【0442】

試験樹脂Ｃを使用し他のウイルス株の精製を評価した。図２１ＡおよびＢはそれぞれ、試験樹脂Ｃカラムを使用したｃａ Ａ／ウィスコンシンおよびｃａ Ａ／ソロモン諸島の精製実施についての溶出ピーククロマトグラムを示している。それらのピークプロフィールはかなり類似しており、ｃａ Ｂ／マレーシア株の場合の精製実施と一致した（図２１Ｃ）。表４１には、ｃａ Ｂ／マレーシア株、ｃａ Ａ／ソロモン諸島株およびｃａ Ａ／ウィスコンシン株の精製についての工程収率および溶出液におけるＨＣＤレベルを記載している。ゲル１ｍＬ当たり９．４〜１０．０ＦＦＵのローディング条件下では、通過物において、カラムに結合されたウイルス全てが観察され、感染性ウイルス粒子総数はローディング量に対して１％未満であった。３株の工程収率は７８．９％〜１１２．５％の範囲に及び、３株全てで比較的同程度であり試験樹脂Ｃゲルでの先の高収率と同程度であった。宿主細胞ＤＮＡレベルは、ゲル１ｍＬ当たり９．８ｌｏｇ_１０ＦＦＵ未満のローディングではまだ低かったが、高ウイルスローディング量（ゲル１ｍＬ当たり１０ｌｏｇ_１０ＦＦＵ）を用いた場合には溶出液におけるＤＮＡレベルは、１．３４ｎｇ／用量まで増加した。先行研究におけるｃａ Ｂ／マレーシア株を用いた試験樹脂Ｃゲルを使用する結合能研究でもＨＣＤレベルの類似した増加が観察された。それらの結果より異なる株で精製した場合も試験樹脂は類似した性能を与えることが分かった。

【表41】

【表42】

【0443】

ｃａ Ｂ／マレーシアおよびｃａ Ａ／ウィスコンシン、ならびにｃａ Ｂ／マレーシアの３つの異なるロットのＴＦＦ１（５ＸＵＦ ５ＸＤＦ）材料について目標ウイルスローディング総量 ゲル１ｍＬ当たり１０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵ〜１０．７ｌｏｇ_１０ＦＦＵで動的結合能研究を実施した。Ａ_２８０ｎｍトレースの初期ではウイルス量は比較的横ばい状態である。特定のローディング容量を超えると、Ａ_２８０は大幅に増加し、次第にプラトーに達した。これは、カラムがカラムの能力を超え、その結果ウイルス破過が起こったことを示している。通過物中のウイルスの割合は、各通過画分のウイルス力価をローディング力価で割り１００をかけることにより計算した。通過物におけるウイルス濃度の割合とローディング容量により破過曲線をプロットした。ゲルの動的結合能は、通過画分がローディング濃度に対してウイルス濃度１０％破過に達したときのゲル１ｍＬ当たりの結合能として定義される。

【0444】

ＣＳカラムでは、１８ｍＬのウイルスをローディングした場合、通過画分にウイルスの５％が認められた。１０％破過での結合能に達したときには、およそ１９ｍＬのウイルス溶液がローディングされた。これは、ゲル１ｍＬ当たり９．８ｌｏｇ_１０ＦＦＵのローディング（ｌｏｇ_１０（１０＾（９．３）×１９ｍＬ／５．８ｍＬ）＝ゲル１ｍＬ当たり９．８ｌｏｇ_１０ＦＦＵ）を示している。よって、ｃａ Ｂ／マレーシア／２５０６／０４株ロット番号２番の場合、ＣＳゲルの動的結合能はゲル１ｍＬ当たり９．７２ｌｏｇ_１０ＦＦＵであると決定された。同様に、試験樹脂Ｃカラムに２７ｍＬのウイルスをローディングし、試験樹脂Ｄカラムに２４ｍＬのウイルスをローディングした場合、通過画分にウイルスの１０％が認められた。同じロットのｃａ Ｂ／マレーシアの場合、試験樹脂ＣおよびＤの動的結合能はそれぞれゲル１ｍＬ当たり９．９６ｌｏｇ_１０ＦＦＵおよび９．９２ｌｏｇ_１０ＦＦＵであると決定された。いくつかのロットのｃａ Ｂ／マレーシアおよび株の場合の試験樹脂Ｃ、ＤカラムおよびＣＳカラムの動的結合能を表４３に要約する。表４３に示されるように、動的結合能は様々であり、ローディング材料中のＨＣＤおよびＨＣＰのレベルに依存するように思われた。ＣＳカラムおよび試験樹脂ＣおよびＤカラムの動的結合能はローディング材料のＨＣＤレベルによって影響を受け；ローディング材料のＨＣＤレベルか高くなるほど、ゲルの動的結合能は低くなる。ゲルの動的結合能は、ローディング材料のＨＣＰレベルによってあまり影響を受けないように思われる。一部の宿主細胞ＤＮＡがウイルスと結合することから、ウイルスとゲル表面リガンドとの動力学的結合が妨げられ、その結果としてウイルスロットで観察される結合能が低下しＤＮＡレベルが高くなると仮定された。表４３に示す４つのロットでは、ＣＳゲルの動的結合能はゲル１ｍＬ当たり９．７ｌｏｇ_１０ＦＦＵから１０．４ｌｏｇ_１０ＦＦＵまで変化し、試験樹脂Ｃの結合能は、樹脂１ｍＬ当たり９．９ｌｏｇ_１０ＦＦＵ〜１０．７ｌｏｇ_１０ＦＦＵの範囲に及び、試験樹脂Ｄの結合能は、ゲル１ｍＬ当たり９．９ｌｏｇ_１０ＦＦＵから＞１０．７ｌｏｇ_１０ＦＦＵの範囲に及んだ。全体的には、評価した条件下では試験樹脂ＣおよびＤゲルの動的結合能はＣＳゲルより高かった（約２倍）。試験樹脂Ｄゲルの動的結合能は一部のロットではより高い場合もあったが、試験樹脂Ｃゲルと少なくとも同程度であった。

【表43】

【0445】

ＣＳと試験樹脂ＣおよびＤとの動的結合能の比較後、ｃａ Ｂ／マレーシアの３つのロットを用いて個別の実施を行い、同じローディング条件を用いＣＳおよびＴｅｓ樹脂での工程収率およびＨＣＤの除去を評価した。ロットの動的結合能に応じて研究のために各ロットでの目標ローディング力価範囲を選択した。表４４に、ｃａ Ｂ／マレーシアロット１番でのＣＳカラム、試験樹脂Ｃおよび試験樹脂Ｄカラム精製での種々のウイルスローディング範囲における精製工程収率およびＨＣＤレベルを要約している。試験樹脂ＣおよびＤでの推定結合能はそれぞれゲル１ｍＬ当たり９．９ｌｏｇ_１０ＦＦＵおよび１０．２ｌｏｇ_１０ＦＦＵであった。これらの研究において、試験樹脂Ｄは、試験樹脂Ｃよりおよそ２倍高い結合能を有していた。ＣＳでの結合能は、材料の同じロットを用いてゲル１ｍＬ当たり９．７ｌｏｇ_１０ＦＦＵであった。試験樹脂ＣおよびＤは両方ともＣＳより高い（２倍および４倍）結合能を有していた。ウイルスローディング量を増加させると、試験樹脂ＣおよびＤの両方で溶出液ＨＣＤレベルも増加した。同じローディングレベル ゲル１ｍＬ当たり１０．２ｌｏｇ_１０ＦＦＵのゲルを比較すると、試験樹脂Ｃの用量当たりのＨＣＤレベル（２．１９ｎｇ／用量）は試験樹脂Ｄより高かった（０．９８ｎｇ／用量）。よって、ウイルスローディング量を増加させた場合、試験樹脂ＤおよびＣＳゲルでの溶出液ＨＣＤレベルの増加は類似していた。しかしながら、試験樹脂Ｃゲルでは、ＨＣＤレベルの増加はＣＳゲルよりも顕著であった。種々のウイルスローディング量での工程収率は、試験樹脂Ｃでは試験樹脂Ｄと比べて同程度であるかまたはわずかに であった。ウイルス精製をより多いウイルスローディング量条件で実施した場合には、試験樹脂ＣおよびＤカラムはＣＳカラムより高い工程収率を与えた。全体的には、試験樹脂Ｄは、ＣＳおよび試験樹脂Ｃと比べて、より高い結合能とより優れた精製性能を有していた。

【表44】

【0446】

表４５に、ｃａ Ｂ／マレーシアロット２番でのＣＳ、試験樹脂Ｃおよび試験樹脂Ｄを使用したカラム精製での種々のウイルスローディング範囲における精製工程収率およびＨＣＤレベルを要約している。試験樹脂ＣおよびＤおよびＣＳでの結合能はそれぞれゲル１ｍＬ当たり９．９６ｌｏｇ_１０ＦＦＵ、９．９２ｌｏｇ_１０ＦＦＵおよび９．８０ｌｏｇ_１０ＦＦＵであった。試験樹脂ＣおよびＤは、ＣＳゲルよりわずかに高い結合能を有していた。ウイルスローディングが動的結合能、ゲル１ｍＬ当たり９．８ｌｏｇ_１０ＦＦＵ〜９．９ｌｏｇ_１０ＦＦＵに近い場合、３つのゲル全ての工程収率は同程度で４７．５％〜６２．８％であった。ウイルスローディングがより多い、ゲル１ｍＬ当たり１０．１ｌｏｇ_１０ＦＦＵでは、ＣＳでの工程収率は２５．２％まで劇的に低下し試験樹脂Ｃでは５０．２％まで低下したが、一方試験樹脂Ｄの収率は６３．２％で同様のままであった。ローディングをゲル１ｍＬ当たり１０．４ｌｏｇ_１０ＦＦＵまで増加させると、ＣＳの工程収率は１２．６％までさらに低下し、一方試験樹脂ＣおよびＤの収率はそれぞれ４９．８％および３９．５％まで低下した。試験樹脂ＣおよびＤの工程収率はＣＳゲルよりもかなり高かった。

【表45】

【0447】

ウイルスローディング量を増加させると、ＣＳゲル、試験樹脂ＣおよびＤゲルでの溶出液ＨＣＤレベルも増加した。同じウイルスローディング量 ゲル１ｍＬ当たり９．８ｌｏｇ_１０ＦＦＵ〜１０．４ｌｏｇ_１０ＦＦＵでのゲルの比較、試験樹脂Ｃの用量当たりのＨＣＤレベル（０．９７ｎｇ／用量、２．５１ｎｇ／用量、２．９３ｎｇ／用量）はＣＳ（０．５ｎｇ／用量、１．９１ｎｇ／用量、２．４３ｎｇ／用量）より高く、試験樹脂ＤでのＨＣＤ値が最も低かった（ＬＯＤ、１．６７ｎｇ／用量、１．２１ｎｇ／用量）。試験樹脂Ｃを使用して精製したウイルスにおけるＨＣＤレベルの増加はＣＳゲルの場合よりも大きかった。溶出液ＨＣＤレベルの増加は試験樹脂ＤゲルおよびＣＳゲルでは類似していたが、試験樹脂Ｄではその増加はより小さかった。全体的には、試験樹脂Ｄは、特に、より多いウイルスローディング量条件で評価した場合に、ＣＳおよび試験樹脂Ｃと比べて、より高い結合能とより優れた精製性能（工程収率およびＨＣＤレベル）を有していた。

【0448】

ｃａ Ｂ／マレーシアの先の２ロットでの試験樹脂ＣおよびＤカラムとＣＳカラムの総合的精製性能の評価後、Ｂ／マレーシア ロット番号３番を用いてＣＳゲルをさらに比較するために、精製研究に試験樹脂Ｄを選択した。それらの結果を表４６に要約する。このロットでは、ＣＳおよび試験樹脂Ｄの動的結合能は同程度であり、ＣＳではゲル１ｍＬ当たり１０．２ｌｏｇ_１０ＦＦＵ、試験樹脂Ｄではゲル１ｍＬ当たり１０．１ｌｏｇ_１０ＦＦＵであった。種々のウイルスローディング量での性能を比較すると、ＨＣＤレベルはＣＳゲルと試験樹脂Ｄゲルの間では同程度であった（全て１．１ｎｇ／用量未満）。工程収率については、特に、ウイルスローディング量がより多い、ゲル１ｍＬ当たり１０．２ｌｏｇ_１０ＦＦＵおよび１０．５ｌｏｇ_１０ＦＦＵにおいて、試験樹脂ＤはＣＳゲル（４６．２％および５５．２％）よりもわずかに優れた工程収率（５２．８％および６５．８％）を与えた。

【表46】

【0449】

精製のスケーラビリティーを評価するために、ＸＫ−５０カラム（５ｃｍ×１７ｃｍ）に試験樹脂Ｄゲルを充填しおよそ２５倍スケールアップした。１０−Ｌバイオリアクターウイルス回収物、ＴＶＣＣ−２ ロット番号３２番ｃａ Ａ／サウスダコタ株を、カラムローディング材料についての方法に記載されるように、ＳＰ安定化、ＤＦＦ１およびＴＦＦ１（５Ｘ ＵＦおよび５Ｘ ＤＦ）後に処理した。試験樹脂ＤおよびＣＳ ＸＫ−５０カラム（５ｃｍ×１７ｃｍ）それぞれにＴＦＦ１（５ＸＵＦ ５ＸＤＦ）材料をローディングした。カラム運転条件および作業パラメーター（ローディングおよび洗浄の線流速を含む）、オンカラムベンゾナーゼ処理および溶出工程は、方法の節に記載されるＴＶＣＣ−１プロセス（２０−Ｌスケール）および小規模実施と同じであった。図２２Ｃは、ＸＫ−５０カラムスケールで試験樹脂Ｄの溶出ピーククロマトグラムを示している。溶出ピークは、溶出初期での小さなプレピーク、続いての主要な単一ピークを示し、小規模溶出クロマトグラムで観察されるような溶出ピークの複数の特徴はなかった（図２２ＡおよびＢ）。表４７に、試験樹脂Ｄカラム実施およびＣＳカラム実施での精製工程収率および溶出液ＨＣＤレベルを要約している。総ウイルスローディング量 ゲル１ｍＬ当たり１０．０ｌｏｇ_１０ＦＦＵでは、試験樹脂Ｄパイロットスケールアップ精製実施は同程度の工程収率（７５．６％）および低ＨＣＤレベル（０．１５ｎｇ／用量）を与え、試験樹脂Ｄゲルのスケーラビリティーを立証した。ＣＳ ＸＫ−５０カラム実施と比べた際、これらの結果は、試験樹脂Ｄカラム溶出液のＨＣＤレベルがＣＳカラム溶出液よりも２倍低いことを示した。

【表47】

【0450】

合計６つの試験樹脂をスクリーニングし、ウイルス精製について評価した。これらの評価には、工程収率、結合能、および不純物レベルの評価が含まれた。試験樹脂ＣおよびＤは、他の４つの試験樹脂と比べてより優れた結合能、より高い工程収率、より低い不純物ＨＣＤレベルを示した。試験樹脂ＢおよびＦの工程収率は低すぎて工業規模の調製には考えられなかった。試験樹脂ＡおよびＥの結合能は、試験樹脂ＣおよびＤと比べてわずかに高いかまたは同程度であった；しかしながら、ウイルスローディング量をより多くした場合には、工程収率はそれほど高くなく不純物ＨＣＤはかなり高いレベルまで増加した。試験樹脂ＣおよびＤを比較すると、試験樹脂Ｃでわずかに優れた工程収率が観察されたが、試験樹脂Ｄは、より多くのウイルス量をローディングした場合に、より高い結合能を有しＨＣＤレベル量に対する影響がより少ないように思われた。これにより、試験樹脂ＣおよびＤが、工業規模の精製における使用に考えることができるクロマトグラフィーゲルであることが示唆された。試験樹脂ＣおよびＤの結合能、工程収率およびカラム溶出液中の宿主細胞ＤＮＡレベルを含むさらなる性能評価では、セルファインサルフェイトゲルとの比較により、試験樹脂Ｄゲルが試験樹脂Ｃより優れておりそのためさらなるスケールアップ評価にＣＳの代替として選択されることが示された。４つの異なるウイルスロットの評価では、試験樹脂ＣおよびＤの動的結合能はセルファインサルフェイトに対しておよそ２倍高く（一部のロット）または少なくとも同程度であった。試験樹脂Ｄは、試験樹脂Ｃと類似したまたは試験樹脂Ｃより高い結合能を有していた。工程収率および宿主細胞ＤＮＡレベルに関しては、試験樹脂Ｄは、より多いウイルスローディング量条件では、試験樹脂Ｃと比べて類似した収率を示したが、ＣＳより一般に高い収率を示した。ウイルスローディング量を増加させた場合、溶出液ＨＣＤレベルの増加に対する影響は、試験樹脂ＤゲルおよびＣＳゲルで類似していたが溶出液ＨＣＤレベルの増加に対する影響は試験樹脂Ｃでより顕著であった。試験樹脂Ｄ溶出液のＨＣＤレベルは評価したロット全てでＣＳと同程度であった。最後に、試験樹脂Ｄ ＸＫ−５０カラム実施のパイロットスケールアップ評価では、精製収率および溶出液中の宿主ＤＮＡレベルが低いことが示され、これによりスケーラビリティーおよび細胞培養に基づくＦｌｕプロセス製造の代替クロマトグラフィーゲルとして用いられる可能性が立証された。

【0451】

８．８ ＲＳＶの精製
フィルターおよびカートリッジ
１）８μｍ Ｓａｒｔｏｐｕｒｅ ＰＰ２公称フィルター
２）３μｍ Ｓａｒｔｏｐｕｒｅ ＰＰ２公称フィルター
３）０．６５μｍ Ｓａｒｔｏｐｕｒｅ ＰＰ２公称フィルター
４）３．０／０．８μｍ Ｓａｒｔｏｃｌｅａｎ ＣＡ膜フィルター
５）０．４５μｍ Ｍｉｌｌｉｐａｋ １００ ＰＶＤＦフィルター
６）ＵＦ／ＤＦ中空繊維カートリッジ、５００ＫＤａ膜孔径、ルーメンｉ．ｄ．は０．５ｍｍまたは１．０ｍｍいずれかであってよく、路長は３０ｃｍから６０ｃｍまで変動してよい
化学製品
１）スクロース
２）Ｔｒｉｓ．Ｃｌ
３）ＫＣｌ
４）ＫＨ_２ＰＯ_４
５）Ｋ_２ＨＰＯ_４
６）ＮａＣｌ
７）ＫＣｌ
８）ＥＤＴＡ
９）トレハロース
１０）ＳＦＭ４ＭｅｇａＶｉｒ
１１）クエン酸ナトリウム
１２）クエン酸カリウム
１３）ベンゾナーゼ
１４）ＮａＯＨ
１５）ＮａＯＣｌ
装置
１）加熱装置を備えたウェーブミキサー（Wave Biotech 型番２０／５０ＥＨ
２）１０Ｌ Stedim社製バッグ（カタログ番号ＦＢＰ１０３８１）
３）カルボイ
４）ピペット
５）ボトル（２５０ｍＬ、１Ｌ Nalgene）
６）ＧＥフレックススタンド
７）ポンプ（Watson Marlow ５２０ Ｓ、６２０Ｄｉ）、
８）天秤（Sartorius、型番ＥＢ６０ＥＤＥ−１；Sartorius 型番ＣＰ４２０２Ｓ）

【0452】

方法論
１）ＲＳＶ（例えば、ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨ）ウイルスをベロ細胞で増殖させる。現行の生産プラットフォームは１０−Ｌバイオリアクターを使用する。ウイルス回収物（ＶＨ）はＳＦＭ４ＭｅｇａＶｉｒ感染培地（Hyclone）を含む。

【0453】

２）ウイルス回収ウイルスを１０−Ｌ Stedim社製バッグにプールし、８−または３μｍフィルターによりフィード圧１５ｐｓｉでおよび３μｍフィルターの場合、有効濾過面積（ＥＦＡ）１ｃｍ^２当たり４〜５ｍＬ ＶＨまたは８μｍフィルターの場合、ＥＦＡ１ｃｍ^２当たり２７ｍＬ ＶＨのローディング量で濾過する。その濾液を収集し、１０−Ｌ Stedim社製バッグで計量する。

【0454】

３）清澄化されたウイルス回収物を５０Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼにより３２±３℃で３時間処理する。その回収物を３０回／分（ｒｐｍ）および角度３°で揺動させる。

【0455】

４）清澄化されベンゾナーゼ処理されたＶＨを０．６５μｍ Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｐｕｒｅ ＰＰ２フィルターによりフィルターのＥＦＡ １ｃｍ^２当たり１６〜１８ｍＬの清澄化されベンゾナーゼ処理されたＶＨのローディング量で濾過する。

【0456】

ａ．次いで、０．６５μｍ濾液を、３６ｍＭ ＴｒｉｓＣｌ、２１４ｍＭスクロースおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌまたはＫＣｌを含む安定化バッファーにより安定化させる。

【0457】

５）安定化させた濾液を一晩（１６±３時間）保存し、限外濾過（濃度）工程で供給材料として用いる。

【0458】

６）GE Healthcare社製５００−ｋＤａ中空繊維カートリッジ（ルーメンｉ．ｄ． ０．５〜１ｍｍ）を使用して限外濾過工程を実施する。カートリッジへの安定化させた０．６５μｍ濾液ローディング量は膜面積１ｃｍ^２当たり１０ｍＬである。運転中の膜間差圧（ＴＭＰ）１５ｐｓｉおよび剪断速度１２０００秒^−１を用いて供給物を５倍濃縮する。

【0459】

７）濃縮された材料をダイアフィルトレーションバッファーでダイアフィルトレーションする（濃縮物の容量に基づき８〜１０倍バッファー交換）。交換バッファーは、、Ｔｒｉｓ（５ｍＭ）；スクロース（２５％ｗ／ｖ）；ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）；ｐＨ７．２．を含む
８）ダイアフィルトレーションされた材料をローディング量４〜５ｍＬ／ｃｍ^２の最終フィルター（０．４５μｍ Ｍｉｌｌｉｐａｋフィルター）に通す。その濾液は最終バルク（原薬）であり、ボトルに等分する。ＲＳＶウイルス原体アリコートの全てをメタノール−ドライアイス浴中でまたは制御速度フリーザーを使用して急速冷凍する。

【0460】

明瞭にし理解するために上述の発明を多少詳しく記載してきたが、この開示を読むことにより本発明の真の範囲を逸脱することなく、形式および細部における種々の変更を行うことができることは当業者には明らかであろう。例えば、上記の全ての技術および装置は種々の組合せで用いてよい。本願において引用される全ての刊行物、特許、特許出願または他の文書は、各個別の刊行物、特許、特許出願または他の文書があらゆる目的のために参照により組み入れられることが個別に示されたのと同じようにあらゆる目的のために参照によりそれらの全体が組み入れられる。加えて、次の米国仮特許：２００６年９月１６日出願の第６０／８４５，１２１号；２００６年１２月２２日出願の第６０／８７１，７２１号；２００７年５月９日出願の第６０／９１７，００８号；２００７年７月２５日出願の第６０／９５１，８１３号；２００８年９月２４日出願の第６１／０９９，７４９号；２００８年１０月１３日出願の第６１／１０４，９３３号；２００８年１２月１５日出願の第６１／１２２，４５６号；２００９年６月１７日出願の第６１／１８７７２１号、および２００７年９月１４日出願の米国特許出願第１１／８５５，７６９号は、参照によりそれらの全体が組み入れられる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】