特許 5654498 ベンダムスチン環状多糖組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5654498

(24)【登録日】2014年11月28日

(45)【発行日】2015年1月14日

(54)【発明の名称】ベンダムスチン環状多糖組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/4184 20060101AFI20141218BHJP

   A61K 47/40 20060101ALI20141218BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20141218BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20141218BHJP

   A61K 47/48 20060101ALI20141218BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/4184

   A61K47/40

   A61P35/02

   A61K9/08

   A61K47/48

【請求項の数】4

【全頁数】27

(21)【出願番号】特願2011-550669(P2011-550669)

(86)(22)【出願日】2010年2月24日

(65)【公表番号】特表2012-519657(P2012-519657A)

(43)【公表日】2012年8月30日

(86)【国際出願番号】IB2010000502

(87)【国際公開番号】WO2010097700

(87)【国際公開日】20100902

【審査請求日】2012年10月5日

(31)【優先権主張番号】61/271,364

(32)【優先日】2009年7月20日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/208,541

(32)【優先日】2009年2月25日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】12/711,979

(32)【優先日】2010年2月24日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/279,293

(32)【優先日】2009年10月19日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/269,944

(32)【優先日】2009年7月1日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】511205068

【氏名又は名称】スプラテック ファーマ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000671

【氏名又は名称】八田国際特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】ポペック，トマツ

(72)【発明者】

【氏名】パテル，キショア

(72)【発明者】

【氏名】アラコフ，バレリー

(72)【発明者】

【氏名】ピエトルチンスキー，グルゼゴルツ

【審査官】 六笠 紀子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００８−５２６９９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５２３０９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５１９０３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平１１−５０１６４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００８−１８４４６８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５０８３３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５０１７２０（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ９／００−９／７２

Ａ６１Ｋ ３１／３３−３３／４４

Ａ６１Ｋ ４７／００−４７／４８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）ベンダムスチン；および
（ｂ）硫酸エステル基およびスルホニル基から選択されるアニオン性基を有する荷電した環状多糖；
を含み、前記環状多糖がβ−シクロデキストリンである、組成物。

【請求項2】

前記環状多糖がスルホブチルエーテルβ−シクロデキストリン、スルホプロピル化β−シクロデキストリンまたはＯ−硫酸化−β−シクロデキストリンである、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記環状多糖がスルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンである、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

ベンダムスチンと環状多糖との重量比が１：１２５００〜１：２５である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は（ａ）ベンダムスチン、（ｂ）荷電した環状多糖、および（ｃ）安定化剤の組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

ベンダムスチン（４−［５−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］−１−メチルベンズイミダゾール−２−イル］ブタン酸）は、白血病および特定のリンパ腫の治療に使用される。しかしながら、この化合物は血漿中での化学的安定性に制限があり、治療効果を達成するために高い投与量または繰り返し投与が必要とされる。そのため、この薬物の安定性を増す製剤設計が必要とされている。

【0003】

高分子材料でそのような分子を複合化することによりベンダムスチンの安定性を増加させる試みがなされている。しかしながら、当該手法では、わずかな成功例があるのみである。例えば、Ｐｅｎｃｈｅｖａらは、“ＨＰＬＣ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｏｎｔｏ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈｏｅｓｔｅｒｓ； Ｊ． Ｐｈａｒｍａ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ａｎａｌ；（２００８）”において、ポリリン酸エステルを用いてベンダムスチンを複合化し、ベンダムスチンの安定性の改善が試みられている。しかしながら、該文献の図２には、最も安定な複合体であってもｐＨ７において約４５分で、完全対数（ｆｕｌｌ ｌｏｇ ｐｏｉｎｔ）（９０％）減少していることが示されている。

【0004】

同様に、Ｅｖｊｅｎらは、トロムソ大学の修士論文“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎ−Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ”（２００７）において、デュアル非対称遠心分離を用いてリポソームにベンダムスチンを組み込んでいる。７９頁の表１８によると、これらの製剤は遊離ベンダムスチンと比較して安定性をわずかに向上するのみであった（細胞培地に分散されたときの２０分半減期 対 遊離ベンダムスチンの１４分半減期）。

【0005】

したがって、水溶液、特に血漿中で高い安定性を提供しうる、改善されたベンダムスチン製剤が必要とされている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、（ａ）ベンダムスチン、（ｂ）荷電した環状多糖、および（ｃ）安定化剤（好ましくは、前記環状多糖と反対の荷電を帯びた安定化剤）を含む組成物に関する。そのような組成物は血漿のような反応性の高い環境において予想外の所望の安定性と共に、予想外の所望の抗癌活性を有する。そのような組成物はベンダムスチンを用いた治療を必要とする患者への注射または点滴に適している。

【発明を実施するための形態】

【0007】

本発明は、（ａ）ベンダムスチン、（ｂ）荷電した環状多糖、および（ｃ）前記環状多糖と反対の荷電を帯びた安定化剤を含む組成物に関する。

【0008】

好ましくは、環状多糖の活性成分の割合は、重量で、約１：１２，５００〜約１：２５であり、より好ましくは約１：５，０００〜約１：５０であり、さらにより好ましくは約１：２，５００〜約１：７５であり、最も好ましくは約１：１，５００〜約１：１００である。

【0009】

前記安定化剤は、一般的に、前記環状多糖に対する重量の割合で、約５：１〜約１：１０００で存在し、より好ましくは約２：１〜約１：２００で存在する。

【0010】

環状多糖
本発明の実施に用いられうる環状多糖は、シクロデキストリン、シクロマンニン（ｃｙｃｌｏｍａｎｎｉｎ）、シクロアルトリン（ｃｙｃｌｏａｌｔｒｉｎ）、シクロフルクチン（ｃｙｃｌｏｆｒｕｃｔｉｎ）および同類のものを含む。一般的に、六〜八糖単位を含む環状多糖が好ましい。

【0011】

前記環状多糖は、シクロデキストリンであるのが好ましい。

【0012】

シクロデキストリンは、少なくとも六糖単位を含む環状オリゴ−１−４−α−Ｄ−グルコピラノースである。もっとも広く知られたものは、六、七または八糖単位を含むシクロデキストリンである。六糖単位を含むシクロデキストリンはα−シクロデキストリンとして知られており、七糖単位を含むものはβ−シクロデキストリンとして知られており、八糖単位を含むものはγ−シクロデキストリンとして知られている。特に好ましい環状多糖はβ−シクロデキストリンである。

【0013】

用いられる環状多糖は１以上の荷電されうる基で修飾されている。そのような荷電されうる基はアニオン性であり得、その場合、前記安定化剤はカチオン性であり；またはそのような荷電されうる基はカチオン性であり得、その場合、前記安定化剤はアニオン性である。好ましいアニオン性基はカルボキシル、スルホニルおよび硫酸エステル基を含み；一方、好ましいカチオン性基は第四級アンモニウム基を含む。

【0014】

本明細書において用いられている「荷電された環状多糖」との語は、その１以上のヒドロキシル基が荷電されうる部分で置換されまたは置き換えられた環状多糖を意味する。そのような部分は、それ自体荷電されうる基（例えば、スルホニル基のようなもの）またはそれが１以上の荷電されうる部分で置換された有機部分（例えば、Ｃ１〜Ｃ６のアルキルまたはＣ１〜Ｃ６のアルキルエーテル部分）を含みうる。好ましい置換された環状多糖は、限定されないが、スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリン、２−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルプロパンアンモニウムで置換されたβ−シクロデキストリン、カルボキシメチル化−β−シクロデキストリン、Ｏ−リン酸化−β−シクロデキストリン、スクシニル−（２−ヒドロキシ）プロピル−β−シクロデキストリン、スルホプロピル化−β−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−アミノ―６−デオキシ）β−シクロデキストリン、Ｏ−硫酸化−β−シクロデキストリン、および６−モノデオキシ−６−モノ（３−ヒドロキシ）プロピルアミノ―ｂ−シクロデキストリンを含み；特に好ましいのはスルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンで置換されたものである。

【0015】

カチオン性安定化剤
本実施形態において、前記環状多糖がアニオン性基で修飾されている場合、前記安定化剤はカチオン性試薬から、またはポリカチオン性化合物から選択される。用いられうるカチオン性試薬は第一級アミン、第二級アミン、第三級アミンまたは第四級アンモニウム化合物を含み、例えば、Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン、Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン、Ｎ−アルキル−Ｎ−Ｎ−ジエタノールアミン、Ｎ−アルキルモルホリン、Ｎ−アルキルピペリジン、Ｎ−アルキルピロリジン、Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム、Ｎ−アルキル−Ｎ−ベンジル−ＮＮ−ジメチルアンモニウム、Ｎ−アルキル−ピリジニウム、Ｎ−アルキル−ピコリニウム、アルキルアミドメチルピリジニウム、カルバルコキシピリジニウム、Ｎ−アルキルキノリニウム、Ｎ−アルキルイソキノリニウム、Ｎ，Ｎ−アルキルメチルピロリジニウム、および１−アルキル−２，３−ジメチルイミダゾリウムなどである。

【0016】

特に好ましいカチオン性補助剤は、立体的に嵩高いＮ−アルキル−Ｎ−Ｎ−ジイソプロピルアミン、Ｎ−アルキルモルホリン、Ｎ−アルキルピペリジン、およびＮ−アルキルピロリジンのような第三級アミン、ならびに塩化セチルピリジニウム、塩化ベンジルジメチルドデシルアンモニウム、塩化ドデシルピリジニウム、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、および臭化ドミフェンのような第四級アンモニウム化合物を含む。

【0017】

オリゴ−もしくはポリアミン、またはペグ化オリゴ−もしくはポリアミンのようなポリカチオン性化合物もまた前記安定化剤として用いられうる。好ましいポリカチオン性化合物は、スペルミン、スペルミジン、プトレシン、およびカダベリンのようなオリゴアミン；ポリエチレンイミン、ポリスペルミン、ポリプトレシン、およびポリカダベリンのようなポリアミン；ならびに上記された群のペグ化オリゴアミンおよびポリアミンを含む。特に好ましくはＰＩ２０８０（ＰＥＧ８０００と共役するポリエチレンイミン２０００）である。

【0018】

一の好ましいカチオン安定化剤は約５〜約５０、より好ましくは約６〜約２０のアミノ酸を含むポリペプチドであり、当該アミノ酸の少なくとも約５０％は正電荷を含む。最も好ましくは、そのような荷電したアミノ酸はアルギニンである。このペプチドの中で特に好ましいものは、４つのアルギニンのブロック配列を少なくとも一つ含む、アルギニンの多いペプチドを含む。この種類のペプチドのうち、他の特に好ましいものはサーモリシン（以下、低分子量プロタミンまたは「ＬＭＷＰ」と称される）で分解されるプロタミンである。

【0019】

疎水的に改質されたオリゴ−またはポリアミンもまた用いられうる。この種の好ましい安定化剤は、アセチルスペルミン、アセチルポリスペルミン、アセチルポリエチレンイミン、ブチリルスペルミン、ブチリルポリスペルミン、ブチリルポリエチレンイミン、ラウロイルスペルミン、ラウロイルポリスペルミン、ラウロイルポリエチレンイミン、ステアロイルスペルミン、ステアロイルポリスペルミン、およびステアロイルポリエチレンイミンを含む。

【0020】

さらに、カチオン性多糖および合成ポリカチオン性ポリマーもまた用いられうる。そのようなカチオン性多糖としては、キトサン、脱アセチル化キトサン、四級化セルロース、四級化アミロース、四級化アミロペクチン、部分的に加水分解された四級化セルロース、部分的に加水分解された四級化アミロースおよび部分的に加水分解された四級化アミロペクチンが示される。前記合成カチオン性ポリマーとしてはポリクオタニウム２（ポリ［ビス（２−クロロエチル）エーテル−ａｌｔ−１，３−ビス［３−（ジメチルアミノ）プロピル］尿素］四級化体）；ポリクオタニウム１１（ポリ（１−ビニルピロリドン−ｃｏ−ジメチルアンモニオエチルメタクリレート）四級化体）；ポリクオタニウム１６および４４（ビニルピロリドンおよび四級化ビニルイミダゾールの共重合体）；ならびにポリクオタニウム４６（ビニルカプロラクタム、ビニルピロリドンおよび四級化ビニルイミダゾールの共重合体）が示される。

【0021】

アニオン性安定化剤
本実施形態において、前記環状多糖がカチオン性基で修飾されている場合、前記安定化剤はアニオン性試薬またはポリアニオン性高分子から選択される。好ましくは、前記アニオン性試薬はカルボキシ、硫酸、スルホノ、リン酸、またはホスホノ基を含む化合物から選択される。

【0022】

用いられうるアニオン性試薬の種類としては、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸ナトリウム、Ｎ−ラウロイルサルコシネートナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルベンジルスルホン酸ナトリウムなどである。

【0023】

カチオン性多糖は安定化剤としても用いられうる。そのような化合物としては、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、κ−カラギーナン、ι−カラギーナン、λ−カラギーナン、μ−カラギーナン、ξ−カラギーナン、ψ−カラギーナン、τ−カラギーナン、ファーセレラン、ヘパラン硫酸、ケラチン、フコイダン、ヒアルロン酸、アルギン酸、ポリ（スルホニルブチロ）セルロース、ポリ（スルホニルプロぴロ）セルロース、ポリ（スルホニルプロピロ）セルロース、ポリ（スルホニルプロピロ）デキストラン、ポリ（スルホニルブチロ）デキストラン、ポリ（スルホニルブチロ）アミラーゼおよびポリ（スルホニルプロピロ）アミラーゼが示される。

【0024】

前記安定化剤はポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、およびそれらの共重合体から選択されるポリアニオン性高分子でありうる。

【0025】

賦形剤
本発明の前記組成物はさらに糖、ポリアルコール、溶解性ポリマー、塩および脂質のような製薬上許容されうる賦形剤を含みうる。

【0026】

用いられうる糖およびポリアルコールは、限定されないが、ラクトース、スクロース、マンニトールおよびソルビトールを含む。

【0027】

用いられうる溶解性ポリマーの具体例としては、ポリオキシエチレン、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）、ポリビニルピロリドン、およびデキストランである。

【0028】

利用可能な塩は、限定されないが、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、および塩化カルシウムを含む。

【0029】

用いられうる脂質は、限定されないが、脂肪酸、グリセロール脂肪酸エステル、糖脂質およびリン脂質を含む。

【0030】

調製
本発明の組成物は前記環状多糖の水溶液に固形ベンダムスチンを溶解させることにより、または前記環状多糖の水溶液とベンダムスチンの水原液とを混合することにより調製されうる。得られた混合物は激しく混合され、任意に均一および平衡水溶液を得るため超音波にかけられる。前記環状多糖がシクロデキストリンであるとき、組成物を調製するのに使用されるシクロデキストリン水溶液が少なくとも４％のシクロデキストリンを含むのが好ましく；少なくとも１０％のシクロデキストリンを含む前述のような溶液であるのがより好ましい。

【0031】

前記安定化剤および賦形剤（もし存在すれば）は、好ましくは前もって調製された前記環状多糖を伴うベンダムスチンの均一および平衡水溶液にそれらを添加して前記組成物に導入される。そのような試薬は純粋な物質としてまたは水溶液として添加されてもよく、好ましくは撹拌を用いて混合される。

【0032】

好ましくは、前記最終的な組成物は注射に使用される前に濾過される。

【0033】

前記組成物は、任意に凍結乾燥され、その使用前に注射剤に溶解するのに適した固体材料が製造される。安定化剤としてアミンを含む組成物は、そのような安定化剤の添加前に凍結乾燥しておき、使用直前に再溶解（reconstitution）した前記組成物にそのような試薬を導入するのが好ましい。

【0034】

本発明の一実施形態において、前記組成物は前記成分を混合し、インキュベートすることによって調製される。

【0035】

本発明の他の一実施形態において、前記組成物は前記成分を混合し、当該混合物に超音波をかけることにより調製される。

【0036】

本発明の他の一実施形態において、前記組成物は前記成分を混合し、インキュベートしおよび前記生成物を凍結乾燥することにより調製される。

【0037】

本発明の好ましい実施形態において、前記組成物は前記成分を混合し、前記混合物に超音波をかけ、および前記生成物を凍結乾燥することにより調製される。

【0038】

本発明の前記組成物は水溶液中でおよび血漿に導入されたとき、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）およびインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）の両方において安定性は高くなる。このように、そのような製剤の血漿中での半減期は、非製剤化ベンダムスチンの半減期より大きくなる；半減期は５０％以上、好ましくは１００％以上長くなる。

【0039】

さらに、本発明の組成物はベンダムスチンおよび環状多糖を含む組成物と比較して予想外に改善された抗腫瘍活性を示し、ベンダムスチンのみの場合と同様の活性を示す。

【実施例】

【0040】

実施例１ スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウムおよびコンドロイチンを含むベンダムスチン組成物の調製
ベンダムスチン塩酸塩 ６ｍｇをスルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム（２０％ｗ／ｗ）溶液 １ｍＬに溶解した。該溶液を超音波浴中、２０℃で１５分間インキュベートし、コンドロイチン硫酸（２５％）溶液 １ｍＬと混合した。

【0041】

実施例２ スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウムおよびポリ（スルホニルブチロ）セルロースを含むベンダムスチン組成物の調製
ベンダムスチン塩酸塩 ６ｍｇをスルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム（３０％ｗ／ｗ）溶液 １ｍＬに溶解した。該溶液を超音波浴中、１０℃で１５分間プレインキュベートした。その後、前記溶液をポリ（スルホニルブチロ）セルロースナトリウム塩（２％）溶液 １ｍＬと混合した。該試料を超音波浴中、１０℃で３０分間インキュベートした。

【0042】

実施例３ スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウムおよびヒアルロン酸を含むベンダムスチン組成物の調製
ベンダムスチン塩酸塩 ６ｍｇをスルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム（３０％ｗ／ｗ）溶液 １ｍＬに溶解した。該溶液を超音波浴中、１０℃で１５分間プレインキュベートした。その後、該溶液をヒアルロン酸ナトリウム塩（０．１％）溶液 １ｍＬと混合した。該試料を超音波浴中、１０℃で３０分間インキュベートした。

【0043】

実施例４ スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウムおよびデキストランを含むベンダムスチン組成物の調製
ベンダムスチン塩酸塩 ６ｍｇをスルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム（２０％ｗ／ｗ）溶液 １ｍＬに溶解した。該溶液を超音波浴中、２０℃で１５分間インキュベートし、デキストラン４０（分子量４００００）（５０％）溶液 １ｍＬと混合し、さらに１５分間超音波をかけた。

【0044】

実施例５ ２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよびデキストランを含むベンダムスチン組成物の調製
ベンダムスチン塩酸塩 ６ｍｇを２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（２０％ｗ／ｗ）溶液 １ｍＬに溶解した。該溶液を超音波浴中、２０℃で１５分間インキュベートし、デキストラン４０（分子量４００００）（５０％）溶液 １ｍＬと混合し、さらに１５分間超音波をかけた。

【0045】

実施例６ スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウムおよび四級化セルロースを含むベンダムスチン組成物の調製
四級化セルロース（塩酸塩） ２ｍｇを水 １ｍＬに溶解した。該溶液を超音波浴（室温）中、４時間プレインキュベートした後、スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム（２０％ｗ／ｗ）１ｍＬにベンダムスチン塩酸塩 ６ｍｇを含む溶液と混合した。該溶液を十分に混合し、１５分間超音波浴中インキュベートした。

【0046】

実施例７ スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウムおよびポリビニルピロリドンを含むベンダムスチン組成物の調製
ベンダムスチン塩酸塩 ６ｍｇをスルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム（３０％ｗ／ｗ）溶液 １ｍＬに溶解した。該溶液を超音波浴中、２０℃で１５分間インキュベートし、その後、ＰＶＰ（分子量＝１００００）（２０％）溶液 １ｍＬと混合し、２０分間超音波をかけた。

【0047】

実施例８ スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウムおよび塩化セチルピリジニウムを含むベンダムスチン組成物の調製
ベンダムスチン塩酸塩 ６ｍｇとマンニトール ８．５ｍｇとをスルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム（５０％ｗ／ｗ）溶液 ０．８ｍＬに溶解した。該溶液を超音波浴中、２０℃で１５分間インキュベートし、その後、塩化セチルピリジニウム（２．５％）溶液 ０．２ｍＬと混合した。

【0048】

実施例９ スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウムおよびＰＩ２０８０を含むベンダムスチン組成物の調製
ＰＩ２０８０の調製
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ，分子量２０００）をＡｌｄｒｉｃｈから購入した。ポリ（エチレングリコール）モノメチルエーテル（ＰＥＧ，分子量８５００）をＰｏｌｙｍｅｒ Ｓｏｕｒｃｅｓ Ｉｎｃから購入した。

【0049】

ＰＩ２０８０（ＰＥＧとＰＥＩの共役体）をＶｉｎｏｇｒａｄｏｖ Ｓ． Ｖ． ｅｔ ａｌ．のＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． １９９８， ９， ８０５−８１２に記載されている手順に従い調製した。ＰＥＧ ４ｇを１，１’−カルボニルジイミダゾールと無水アセトニトリル ２０ｍＬ中で反応させた。該反応生成物をＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ ３ ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＭＷＣＯ３５００を用いて水に対して２回透析し、凍結乾燥した。前記凍結乾燥した物質をメタノール ３２ｍＬに溶解し、ＰＥＩ２．９ｇと混合し、２５℃で２４時間インキュベートした。該生成物をＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ ３ ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＭＷＣＯ３５００を用いて水に対して２回透析し、生成物ＰＩ２０８０を凍結乾燥した。

【0050】

スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウムおよびＰＩ２０８０を含むベンダムスチン組成物の調製
ベンダムスチン塩酸塩 ２．５ｍｇとマンニトール ４．３ｍｇをスルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム（５０％ｗ／ｗ）溶液 ０．８ｇに溶解した。該溶液を超音波浴中、２０℃で１５分間インキュベートし、その後、ＰＩ２０８０（５％溶液）０．２ｍＬと混合した。

【0051】

実施例１０ スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウムおよび硫酸プロタミンを含むベンダムスチン組成物の調製
ベンダムスチン塩酸塩 ２．５ｍｇとマンニトール ４．３ｍｇをスルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム（５０％ｗ／ｗ）溶液 ０．８００ｇに溶解した。溶液を２０℃で９０分間振盪させ、その後超音波浴中、３０分間インキュベートした。その後、該混合物を水 ０．１６３ｇ中に硫酸プロタミン ３０ｍｇを含む懸濁液に加え、激しく１５分間混合した。

【0052】

実施例１１ スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウムおよび塩化セチルピリジニウムを含む組成物におけるラットへ投与されたベンダムスチンの薬物動態
試験組成物：
コントロール： ベンダムスチン塩酸塩 ６ｍｇ／ｍＬ、０．９％ＮａＣｌ中マンニトール １０．２ｍｇ／ｍＬ；投与量 ２０ｍｇ／ｋｇ
発明組成物： ベンダムスチン塩酸塩 ５ｍｇ／ｍＬ、スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリン ４０％ｗ／ｗ、塩化セチルピリジニウム ０．５％、水中マンニトール ８．５ｍｇ／ｇ（実施例８の手順に従って製造した）；投与量 ２０ｍｇ／ｋｇ
動物：
雌性ＳＤラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット）（２５０−３５０ｇ）。該動物をエアフィルターカバーの付いた籠に３匹づついれ、光（光／暗闇サイクル １２時間、光 ６時間）および温度 ２２℃±１℃に調整した。該動物の取り扱いは滅菌された層流フード下で行った。該動物はピュリナ餌および水を自由摂取した。投与する前、該動物を一晩絶食させおよび麻酔した。

【0053】

投与およびサンプリング：
本発明のベンダムスチン組成物およびコントロールをラットの尾静脈に静注した。注射後５、１５、３０、４５分、１、１．５、２および３時間間隔をあけて、血液サンプルを採取した。該ラットをイソフルランの一般吸入により麻酔した。血液サンプルを頸静脈からヘパリン管を用いて採取し、氷上に保持した。血液を速やかに遠心分離し、血漿を分離した。該血漿サンプルを速やかに抽出した。

【0054】

サンプル抽出および分析：
血漿サンプル ０．１００ｍＬをプラスチック管に移動した。該サンプルをＨＣｌ １００ｍＭを含むアセトニトリル溶液 ０．４００ｍＬ中、３０秒間激しく振盪して抽出した。前記サンプルを１００００ＲＰＭで５分間遠心分離した。上清を分離した。該サンプルをドライアイスで凍結し、ＨＰＬＣ分析まで−８０℃に保持した。２０μＬ分割量を分析用ＨＰＬＣに注入した。

【0055】

ＨＰＬＣ条件：
Ｃ１８逆相カラム ５０×４．６ｍｍ、Ｓｙｍｍｅｔｒｙ／Ｓｈｉｅｌｄ ３．５μｍ
カラム温度 ３０℃
流速 １．５ｍＬ／分
注入量 ２０μＬ
蛍光検出波長： 励起 ３２７ｎｍ、発光 ４２０ｎｍ
移動相： バッファーＡ： ５％ アセトニトリル ０．１％ ＴＦＡ
バッファーＢ： ９０％ アセトニトリル ０．１％ ＴＦＡ
ランタイム： １０分
前記コントロールに対する、試験組成物のベンダムスチンの改善薬物動態分析結果を以下の表１に示す。

【0056】

【表1】

【0057】

上記データは、血漿中のベンダムスチンの安定性が本発明の組成物において大きく増加していることを示している。

【0058】

実施例１２ スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウムおよびＰＩ２０８０を含む組成物におけるラットへ投薬されたベンダムスチンの薬物動態
試験組成物：
コントロール： ベンダムスチン塩酸塩 ２．５ｍｇ／ｍＬ、０．９％ＮａＣｌ中マンニトール ４．２５ｍｇ／ｍＬ；投与量 １０ｍｇ／ｋｇ
発明組成物： ベンダムスチン塩酸塩 ２．５ｍｇ／ｍＬ、スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム ４０％ｗ／ｗ、ＰＩ２０８０ １％、水中マンニトール ４．３ｍｇ／ｇ（実施例９に記載の手順に従って調製した）；投与量 １０ｍｇ／ｋｇ。

【0059】

動物：
雌性ＳＤラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット）（２５０−３５０ｇ）。該動物をエアフィルターカバーの付いた籠に３匹づついれ、光（光／暗闇サイクル １２時間、光 ６時間）および温度 ２２℃±１℃に調整した。該動物の取り扱いは滅菌された層流フード下で行った。該動物はピュリナ餌および水を自由摂取した。投与する前、該動物を一晩絶食させおよび麻酔した。

【0060】

投与およびサンプリング：
本発明のベンダムスチン組成物およびコントロールをラットの尾静脈に静注した。注射後５、１５、３０、４５分、１、１．５、２および３時間間隔をあけて、血液サンプルを採取した。該ラットをイソフルランの一般吸入により麻酔した。血液サンプルを頸静脈からヘパリン管を用いて採取し、氷上に保持した。血液を速やかに遠心分離し、および血漿を分離した。該血漿サンプルを速やかに抽出した。

【0061】

サンプル抽出および分析：
血漿サンプル ０．１００ｍＬをプラスチック管に移動した。該サンプルをＨＣｌ １００ｍＭを含むアセトニトリル溶液 ４００ｍＬ中、３０秒間激しく振盪して抽出した。前記サンプルを１００００ＲＰＭで５分間遠心分離した。上清を分離した。該サンプルをドライアイスで凍結し、ＨＰＬＣ分析まで−８０℃に保持した。２０μＬ分割量を分析用ＨＰＬＣに注入した。

【0062】

ＨＰＬＣ条件：
Ｃ１８逆相カラム５０×４．６ｍｍ、Ｓｙｍｍｅｔｒｙ／Ｓｈｉｅｌｄ ３．５μｍ
カラム温度 ３０℃
流速 １．５ｍＬ／分
注入量 ２０μＬ
蛍光検出波長： 励起 ３２７ｎｍ、発光 ４２０ｎｍ
移動相： バッファーＡ： ５％ アセトニトリル ０．１％ ＴＦＡ
バッファーＢ： ９０％ アセトニトリル ０．１％ ＴＦＡ
ランタイム： １０分。

【0063】

前記コントロールに対する、試験組成物のベンダムスチンの改善薬物動態分析結果を以下の表２に示す。

【0064】

【表2】

【0065】

上記データは、血漿中のベンダムスチンの安定性が本発明の組成物において大きく増加していることを示している。

【0066】

実施例１３ スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウムおよび硫酸プロタミンを含む組成物におけるラットへ投薬されたベンダムスチンの薬物動態
試験組成物：
コントロール： ベンダムスチン塩酸塩 ２．５ｍｇ／ｍＬ、０．９％ＮａＣｌ中マンニトール ４．２５ｍｇ／ｍＬ；投与量 １０ｍｇ／ｋｇ
発明組成物： ベンダムスチン塩酸塩 ２．５ｍｇ／ｍＬ、スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム ４０％ｗ／ｗ、硫酸プロタミン ３％、水中マンニトール ４．３ｍｇ／ｇ（実施例１０に記載の手順に従って調製された）；投与量 １０ｍｇ／ｋｇ。

【0067】

動物：
雌性ＳＤラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット）（２５０−３５０ｇ）。該動物をエアフィルターカバーの付いた籠に３匹づついれ、光（光／暗闇サイクル １２時間、光 ６時間）および温度 ２２℃±１℃に調整した。該動物の取り扱いは滅菌された層流フード下で行った。該動物はピュリナ餌および水を自由摂取した。投与する前、該動物を一晩絶食させおよび麻酔した。

【0068】

投与およびサンプリング：
本発明のベンダムスチン組成物およびコントロールをラットの尾静脈に静注した。注射後５、１５、３０、４５分、１、１．５、２および３時間間隔をあけて、血液サンプルを採取した。該ラットをイソフルランの一般吸入により麻酔した。血液サンプルを頸静脈からヘパリン管を用いて採取し、氷上に保持した。血液を速やかに遠心分離し、および血漿を分離した。該血漿サンプルを速やかに抽出した。

【0069】

サンプル抽出および分析：
血漿サンプル ０．１００ｍＬをプラスチック管に移動した。該サンプルをＨＣｌ １００ｍＭを含むアセトニトリル溶液 ４００ｍＬ中、３０秒間激しく振盪して抽出した。前記サンプルを１００００ＲＰＭで５分間遠心分離した。上清を分離した。該サンプルをドライアイスで凍結し、ＨＰＬＣ分析まで−８０℃に保持した。２０μＬ分割量を分析用ＨＰＬＣに注入した。

【0070】

ＨＰＬＣ条件：
Ｃ１８逆相カラム５０×４．６ｍｍ、Ｓｙｍｍｅｔｒｙ／Ｓｈｉｅｌｄ ３．５μｍ
カラム温度 ３０℃
流速 １．５ｍＬ／分
注入量 ２０μＬ
蛍光検出波長： 励起 ３２７ｎｍ、発光 ４２０ｎｍ
移動相： バッファーＡ： ５％ アセトニトリル ０．１％ ＴＦＡ
バッファーＢ： ９０％ アセトニトリル ０．１％ ＴＦＡ
ランタイム： １０分。

【0071】

前記コントロールに対する、試験組成物のベンダムスチンの改善薬物動態分析結果を以下の表３に示す。

【0072】

【表3】

【0073】

上記データは、環状多糖組成物の安定性がベンダムスチンのみの安定性と比較して大きく増加していることを示している。

【0074】

実施例１４ スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウムおよびルビクアットＦＣ３７０を含むベンダムスチン組成物の調製
ベンダムスチン塩酸塩 ６ｍｇをスルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム（３０％ｗ／ｗ）溶液 １ｍＬに溶解した。該溶液を超音波浴中、１０℃で１５分間プレインキュベートし；その後、ルビクアットＦＣ３７０（０．１％）溶液 １ｍＬと混合した。ルビクアットＦＣ３７０（ポリクオタニウム−１６）はビニルピロリドンおよび四級化ビニルイミダゾール（ＣＡＳ ＮＯ．９５１４４−２４−４（ＢＡＳＦ））の共重合体である。該サンプルを超音波浴中、１０℃で３０分間インキュベートした。

【0075】

実施例１５ スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウムおよびルビクアットＨＯＬＤを含むベンダムスチン組成物の調製
ベンダムスチン塩酸塩 ６ｍｇをスルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム（３０％ｗ／ｗ）溶液 １ｍＬに溶解した。該溶液を超音波浴中、１０℃で２０分間プレインキュベートし；その後、ルビクアットＨＯＬＤ（０．１５％）溶液 １ｍＬと混合した。ルビクアットＨＯＬＤ（ポリクオタニウム−４６）は１Ｈ−イミダゾリウム、１−エテニル−３−メチル―メチル硫酸高分子と１−エテニルヘキサヒドロ−２Ｈ−アゼピン−２−オンおよび１−エテニル−２−ピロリジノン（ＣＡＳ Ｎｏ．１７４７６１−１６−１、（ＢＡＳＦ））である。該サンプルを超音波浴中、１０℃で３０分間インキュベートした。

【0076】

実施例１６ スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウムおよび四級化ポリ（ビニルピロリドン−ｃｏ−２−ジメチルアミノエチルメタクリル酸）を含むベンダムスチン組成物の調製
ベンダムスチン塩酸塩 ６ｍｇをスルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム（３０％ｗ／ｗ）溶液 １ｍＬに溶解した。該溶液を超音波浴中、１０℃で１５分間プレインキュベートした。その後、該溶液を四級化ポリ（ビニルピロリドン−ｃｏ−２−ジメチルアミノエチルメタクリル酸）（０．１％）溶液 １ｍＬと混合した。該サンプルを超音波浴中、１０℃で３０分間インキュベートした。

【0077】

実施例１７ スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウムおよび四級化ポリ（ビニルピロリドン−ｃｏ−２−ジメチルアミノエチルメタクリル酸）を含むベンダムスチン組成物の調製
ベンダムスチン塩酸塩 ６ｍｇをスルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム（３０％ｗ／ｗ）溶液 １ｍＬに溶解した。該溶液を超音波浴中、１０℃で１５分間前インキュベートした。その後、該溶液を四級化ポリ（ビニルピロリドン−ｃｏ−２−ジメチルアミノエチルメタクリル酸）（０．１％）溶液 １ｍＬと混合した。該サンプルを超音波浴中、１０℃で３０分間インキュベートした。

【0078】

実施例１８ スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウムおよびキトサンを含むベンダムスチン組成物の調製
低重量キトサン ５ｍｇを０．２Ｍの塩酸 ５ｍＬに懸濁し、一晩撹拌した。該バイアルの成分を０．４５μｍのガラスファイバーフィルターを用いて濾過し、凍結乾燥した。スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム（３０％ｗ／ｗ）溶液 ２ｍＬを前記凍結乾燥したものに加えた。該混合物を２０℃で２４時間インキュベートし、０．４５μｍのガラスファイバーフィルターを用いて濾過した。該溶液 １ｍＬをベンダムスチン塩酸塩 ６ｍｇを溶解するのに用いた。該溶液を超音波浴中、１０℃で２０分間インキュベートした。

【0079】

実施例１９ スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウムおよび四級化ポリ（ビス（２−クロロエチル）エーテル−ａｌｔ−１，３−ビス［３−ジメチルアミノ］プロピル）尿素を含むベンダムスチン組成物の調製
ベンダムスチン塩酸塩 ６ｍｇをスルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム（３０％ｗ／ｗ）溶液 １ｍＬに溶解した。該溶液を超音波浴中、１０℃で１５分間プレインキュベートした。その後、該溶液を四級化ポリ（ビス（２−クロロエチル）エーテル−ａｌｔ−１，３−ビス［３−ジメチルアミノ］プロピル）尿素（０．０５％）溶液 １ｍＬと混合した。該サンプルを超音波浴中、１０℃で３０分間インキュベートした。

【0080】

実施例２０
ａ．低分子量プロタミン（ＬＭＷＰ）の調製
硫酸プロタミン ２ｇを０．１Ｍ 酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７） ７０ｍＬに溶解し、硫酸プロタミン溶液を調製した。サーモリシン ２０ｍｇを５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．４） １０ｍＬに溶解し、サーモリシン溶液を調製した。該サーモリシン溶液を前記硫酸プロタミン溶液に添加し、続けて、１Ｍ 塩化カルシウム水溶液 ７０μＬを添加した。該混合物を室温で３０分間インキュベートした。該混合物に、０．７Ｍ ＥＤＴＡ溶液を０．７ｍＬ添加した。該混合物を凍結乾燥した。該乾燥物を酢酸水溶液（０．２％） １ｍＬにつき１００ｍｇを再溶解し、フィルター（０．２２μｍ）を用いて濾過した。前記溶液 ５ｍＬをＲＰ−ＨＰＬＣカラム（Ｖａｙｄａｃ ２１８ＴＰ１５２０５０，５×２５ ｃｍ）に注入した。該サンプルを酢酸水溶液（０．２％）中、グラジエントエタノールで溶出した。該生成物を含む画分を収集し凍結乾燥した。

【0081】

ｂ．スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム（「ＳＢＥＣＤ」）および低分子量プロタミン（「ＬＭＷＰ」）を含むベンダムスチン組成物の調製
スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム ４００ｍｇを水 ０．６００ｍＬと混合し、完全に溶解するまで振盪した。ベンダムスチン塩酸塩 １６ｍｇおよびマンニトール ２７．３ｍｇをこの溶液に添加し、９０分間振盪した。ＬＭＷＰ ２０ｍｇを水 ９３６．８ｍｇに溶解し、前記ベンダムスチン溶液と混合した。該生成物を４℃で保存した。該生成物を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィーを用いて、以下のようにベンダムスチン成分を評価した。Ｗａｔｅｒｓ ＳｙｍｍｅｔｒｙＳｈｉｅｌｄ ＲＰ−１８ ３．５μｍカラム （４．６×５０ｍｍ）を用いて、ＴＦＡ（０．１％）を含むアセトニトリル−水勾配 流速１．５ｍＬ／ｍｉｎでサンプル１０μＬを分離した。ピーク検出をＵＶ吸収検出（２６０ｎｍ）で行った。ベンダムスチンのピーク領域を３つの薬物安定性の割合を評価するために使用した。２４時間後のベンダムスチンのピーク下領域ははじめの１０１．８％だった（標準偏差 ２％）。

【0082】

実施例２１ スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウムおよび低分子量プロタミンを含む凍結乾燥ベンダムスチン組成物の調製
実施例２０の組成物を凍結乾燥した。該生成物は非晶質の白色固体であり、水溶性であった。該生成物を使用する前に水 １．５３６ｍＬで再溶解した。

【0083】

実施例２２ ベンダムスチン組成物の細胞毒性
Ｈ４６０、ＲＰＭＩ８２２６およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ） １０％および抗生物質を含む適当な培地中保持した。培養２４時間後、ベンダムスチン（ＢＭ）；スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム（ＳＢＥＣＤ） ０．１％存在下のＢＭ；およびＳＢＥＣＤ ０．１％および低分子量プロタミン（ＬＭＷＰ） ０．００２−０．００５％存在下のＢＭを異なる濃度で細胞培地に添加し、３日間細胞を増殖させた。該薬剤細胞毒性をＷＳＴ−１法を使用して評価した。ＩＣ５０値はベンダムスチン、ＳＢＥＣＤで製剤化されているベンダムスチン、およびＳＢＥＣＤ／ＬＭＷＰで製剤化されているベンダムスチンについて評価した。表４にＳＢＥＣＤまたはＳＢＥＣＤ／ＬＭＷＰで製剤化されているＢＭ効力の増加を示している。ＢＭ細胞毒性活性における変化の測定として、ＢＭ ＩＣ５０に対するＳＢＥＣＤまたはＳＢＥＣＤ／ＬＭＷＰにおけるＢＭのＩＣ５０の比率を計算した。それぞれの細胞株において、これらの比率は３〜１２の実験における平均値を表している。

【0084】

【表4】

【0085】

ＳＢＥＣＤ製剤はＢＭ効力を増加し、そのＩＣ５０を減少させた。ＳＢＥＣＤ製剤にＬＭＷＰを添加することで、ＢＭ ＩＣ５０をさらに実質的に減少させた。Ｈ４６０およびＲＰＭＩ８２２６の二つの細胞株において、ＬＭＷＰの効果は、統計的に有意なものであり、それぞれｐ＝０．０３６および０．０１８であった。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において、両方の製剤の効果にあまり差異はなかった。これらの三つの細胞株において、ＢＭ ＩＣ５０の平均減少はＳＢＥＣＤおよびＳＢＥＣＤ／ＬＭＷＰのそれぞれにおいて１．５および２．２倍であった。

【0086】

実施例２３ 培地を用いてプレインキュベートされたベンダムスチン組成物の細胞毒性
ＢＭおよびＳＢＥＣＤ／ＬＭＷＰ製剤（ＳＢＥＣＤ２０％、ＬＭＷＰ１％中、４０ｍｇ／ｍｌ ＢＭ）をＦＢＳ １０％含むＤＭＥＭ培地中、０、１または４時間インキュベートし、ＲＰＭＩ８２２６細胞に濃度を変化させて添加した。ＢＭを扱っている間、ＳＢＥＣＤおよびＬＭＷＰの濃度を培地中０．１および０．０５％にそれぞれ保持した。細胞を７２時間増殖させた。該薬剤細胞毒性をＷＳＴ−１法を用いて評価した。結果を、以下の表５および６に示す。

【0087】

【表5】

【0088】

【表6】

【0089】

【表7】

【0090】

ＩＣ５０、ＴＧＩおよびＬＣ５０パラメータをプレインキュベートの時間に対し計算した。

【0091】

【表8】

【0092】

表中：
ＩＣ５０−５０％細胞増殖阻害される薬物濃度
ＴＧＩ−全細胞増殖阻害される薬物濃度
ＬＣ５０−５０％細胞死する薬物濃度
である。

【0093】

該結果は、ＢＭ、ＳＢＥＣＤおよびＬＭＷＰ組成物がＢＭのみよりも効能が長いことを示す。

【0094】

実施例２４ ＳＢＥＣＤおよびＬＭＷＰを含むベンダムスチン組成物の細胞毒性
ＲＰＭＩ８２２６、Ｈ６９、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＨ４６０細胞を１０％ ＦＢＳおよび抗生物質を含む適当な培地中保持した。平板培養して２４時間後、ベンダムスチンおよびＳＢＥＣＤ／ＬＭＷＰ（ＳＢＥＣＤ ２０％、ＬＭＷＰ １％中、ＢＭ ４０ｍｇ／ｍｌ）で製剤化されたベンダムスチンを細胞培地に異なる濃度で添加し、細胞を３日間増殖させた。該薬剤細胞毒性をＷＳＴ−１法を用いて評価した。結果を以下の表８に示す。

【0095】

【表9】

【0096】

上記データは本発明の組成物が増強した細胞毒性を有することを示している。

【0097】

実施例２５ スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンおよび低分子量プロタミン（ＬＭＷＰ）を含む組成物におけるラットへ投与されたベンダムスチンの薬物動態
以下の試験組成物を調製した：
コントロール： ベンダムスチン塩酸塩 ５ｍｇ／ｍＬ、０．９％ＮａＣｌ中マンニトール １０．２ｍｇ／ｍＬ；投与量 １０ｍｇ／ｋｇ
組成物２５Ａ
−ベンダムスチン塩酸塩 ５ｍｇ／ｍＬ、スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム ２０％ｗ／ｗ、水中マンニトール １０．２ｍｇ／ｇ；投与量 １０ｍｇ／ｋｇ、
組成物２５Ｂ
−ベンダムスチン塩酸塩 ５ｍｇ／ｍＬ、スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム ２０％ｗ／ｗ、ＬＭＷＰ １％、水中マンニトール １０．２ｍｇ／ｇ；投与量 １０ｍｇ／ｋｇ。

【0098】

動物：
雌性ＳＤラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット）（２５０−３５０ｇ）。該動物をエアフィルターカバーの付いた籠に３匹づついれ、光（光／暗闇サイクル １２時間、光 ６時間）および温度 ２２℃±１℃を調整した。該動物の取り扱いを、すべて滅菌された層流フード下で行った。該動物はピュリナ餌および水を自由摂取した。該動物に投与する前、一晩絶食および麻酔した。

【0099】

投与およびサンプリング：
本発明のベンダムスチン組成物およびコントロールをラットの尾静脈に静注した。注射後５、１５、３０、４５分、１、１．５、２、３および４時間間隔をあけて、血液サンプルを採取した。該ラットをイソフルランの一般吸入により麻酔した。血液サンプルを頸静脈からヘパリン管を用いて採取し、氷上に保持した。血液を速やかに遠心分離し、血漿を分離した。該血漿サンプルを速やかに抽出した。

【0100】

サンプル抽出および分析：
血漿サンプル０．１００ｍＬをプラスチック管に移動した。該サンプルをＨＣｌ １００ｍＭを含むアセトニトリル溶液 ４００ｍＬ中、３０秒間激しく振盪して抽出した。前記サンプルを１００００ＲＰＭで５分間遠心分離した。上清を分離した。該サンプルをドライアイスで凍結しＨＰＬＣ分析まで−８０℃に保持した。２０μＬ分割量を分析するためＨＰＬＣに注入した。

【0101】

ＨＰＬＣ条件：
Ｃ１８逆相カラム５０×４．６ｍｍ、Ｓｙｍｍｅｔｒｙ／Ｓｈｉｅｌｄ ３．５μｍ
カラム温度 ３０℃
流速 １．５ｍＬ／分
注入量 ２０μＬ
蛍光検出 波長： 励起 ３２７ｎｍ、発光 ４２０ｎｍ
移動相： バッファーＡ： ５％ アセトニトリル ０．１％ ＴＦＡ
バッファーＢ： ９０％ アセトニトリル ０．１％ ＴＦＡ
ランタイム： １０分。

【0102】

前記コントロールに対して試験された組成物のため改善したベンダムスチンの薬物動態分析結果を以下の表９に示す。

【0103】

【表10】

【0104】

該実施例はＳＢＥＣＤを含むベンダムスチン組成物中ＬＭＷＰの存在が血漿中ＢＭの半減期を大幅に増加させることを示している。

【0105】

実施例２６ マウス実験の肺転移モデルにおけるベンダムスチン組成物の効果
動物：
Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓ Ｃ５７Ｂ１／６マウス（雌、５〜６週齢）をチャールズリバーカナダ社（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ）から購入した。該動物をエアフィルターカバーの付いた籠に５匹づついれ、光（光／暗闇サイクル １２時間、光 ６時間）および温度（２２℃±１℃）を調整した環境に置いた。該動物の取り扱いを、すべて滅菌された層流フード下で行った。該動物はピュリナマウス餌（Ｐｒｏ Ｌａｂ ＰＭＨ ４０１８、商標 アグウェイ（Ａｇｗａｙ）、シラキュース、ニューヨーク州）および水を自由摂取した。これらの動物実験は“実験動物の管理と使用に関するガイドライン（Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍａｌｓ）”に従って行った。

【0106】

腫瘍細胞培養：
ルイス肺癌３ＬＬ細胞を適当な培地中培養した。該細胞を腫瘍移植の調製のため対数増殖期に採取した。

【0107】

腫瘍移植：
ルイス肺癌３ＬＬ細胞（ＰＢＳ ２００μｌ中２．０〜５．０×１０^５細胞）を尾静脈より静注し、実験的肺転移癌モデルを構築した。

【0108】

処置：
処置を腫瘍移植後、その日のうちに行った。該動物に以下の投与溶液を投与した。

【0109】

コントロール：（０．９％、ＮａＣｌ）
組成物：
−非製剤化ベンダムスチン（ＢＭ）、（５０ｍｇ／ｋｇ）
−ＳＢＥＣＯ ２０％、ＬＭＷＰ １％中、ベンダムスチン（５０ｍｇ／ｋｇ）
有効性評価：
転移形成を肺表面の転移点の数を数えることで評価した。所定の転移実験を前記調査の最後に全臓器において行った。

【0110】

該有効性評価結果を以下の表１０に示す。

【0111】

【表11】

【0112】

前記結果はＳＢＥＣＤおよびＬＭＷＰを含む組成物 対 非製剤化薬物の効能の統計的に有意な改善を示す。

【0113】

実施例２７ ヌードマウス中におけるヒト乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）皮下（ｓ．ｃ．）固形腫瘍に対するベンダムスチン組成物の効能
動物：
ｂａｌｂ／ｃマウス（５〜６週齢）をチャールズリバーカナダ社から購入した。該動物をエアフィルターカバーの付いた籠に５匹づついれ、光（光／暗闇サイクル １２時間、光 ６時間）および温度（２２℃±１℃）調整した環境においた。動物の取り扱いを、すべて滅菌された層流フード下で行った。該動物はピュリナマウス餌（Ｐｒｏ Ｌａｂ ＰＭＨ ４０１８、商標 アグウェイ（Ａｇｗａｙ）、シラキュース、ニューヨーク州）および水を自由摂取した。これらの動物の研究は“実験動物の管理と使用に関するガイドライン（Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍａｌｓ）”に従って行った。

【0114】

腫瘍細胞培養：
ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を適当な培地中培養した。該細胞を腫瘍移植の調製のため対数増殖期に採取した。

【0115】

腫瘍移植：
マトリゲル培養 ３０％を含む培地 ０．２００ｍＬ中、ヒト腫瘍または骨髄腫細胞（２．５〜５．０×１０^６細胞）を、１〜２ｃｍ長の２０ゲージ針を用いて、ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスの２つの脇腹に皮下移植した。

【0116】

処置：
腫瘍細胞移植後２〜３週間後に、皮下固形腫瘍の成長した動物をいくつかの同種の群（群または投与ごとにｎ＝５の動物）に腫瘍サイズ（直径０．５〜０．８ｃｍ）をもって選別した。前記処置を翌日行った。該動物に以下の投与溶液を投与した。

【0117】

コントロール：（０．９％、ＮａＣｌ）
組成物：
−非製剤化ベンダムスチン、（３５ｍｇ／ｋｇ）
−ＳＢＥＣＤ ４０％、硫酸プロタミン １％中、ベンダムスチン３５ ｍｇ／ｋｇ（製剤化ＢＭ）
効能評価
皮下固形腫瘍測定を最初の注射日、およびその３〜４日間隔開けて行った。それぞれの腫瘍の最も大きい垂直直径をノギスを用いて測定し、腫瘍サイズを式： ＴＶ ＝ Ｌ × Ｗ ／ ２ （式中、ＴＶ：腫瘍容積； Ｌ：長さ； Ｗ：幅） を用いて見積もった。

【0118】

動物の体重も書き留めた。

【0119】

該結果を以下の表１１に示した。

【0120】

【表12】

【0121】

表１２は腫瘍の成長におけるＢＭおよびその組成物の効果を示す。

【0122】

【表13】

【0123】

前記結果はＳＢＥＣＤおよび硫酸プロタミンを含む組成物の予想外の毒性および良い効能を示す。

【0124】

実施例２８ ヌードマウスにおけるヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１皮下固形腫瘍におけるベンダムスチン組成物の効能
該実験を、処置のため以下の組成物を使用して、実施例２７に記載されるように行った。

【0125】

コントロール： （０．９％， ＮａＣｌ）
組成物：
−非製剤化ベンダムスチン、（３０ｍｇ／ｋｇ）
−ＳＢＥＣＤ ４０％中、ベンダムスチン（３０ ｍｇ／ｋｇ）（製剤化ＢＭ）
前記処置を１、２、９および１０日目に行った。

【0126】

該結果を表１３に示す。

【0127】

【表14】

【0128】

表１４に腫瘍の成長におけるＢＭおよびその組成物の効果を示す。

【0129】

【表15】

【0130】

上記データは、ベンダムスチンおよび荷電したシクロデキストリン（逆荷電した安定化剤なし）を含む２つの組成物形態はベンダムスチンのみの形態よりも低いことを示す。

【0131】

実施例２９ ヌードマウスにおけるヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１皮下固形腫瘍におけるベンダムスチン組成物の効能
該実験を、以下の処置用組成物を使用して、実施例２８に記載する方法を用いて行った：
コントロール： （０．９％， ＮａＣｌ）
組成物：
−非製剤化ベンダムスチン、（３０ｍｇ／ｋｇ）
−ＳＢＥＣＤ ２０％、ＬＭＷＰ １％中、ベンダムスチン（３０ ｍｇ／ｋｇ）（製剤化ＢＭ）
前記処置を、１、２、９および１０日目に行った。

【0132】

結果を表１５に示す。

【0133】

【表16】

【0134】

注釈：前記左脇腹に移植された腫瘍は、接種した腫瘍細胞数が少なかったため右脇腹に移植された腫瘍よりもはるかに小さかった。これらの腫瘍容積は前記データに含まれていない。

【0135】

該結果は、ＳＢＥＣＤ ２０％およびＬＭＷＰ １％を含むベンダムスチン組成物が、非製剤化薬物よりも高活性であり、上記実施例２８で得られた結果から予想できない結果であった。

【0136】

【表17】

【0137】

実施例３０ リン酸緩衝液中、スルホブチルβ−シクロデキストリン（ＳＢＥＣＤ）および低分子量プロタミン（ＬＭＷＰ）を含む組成物におけるベンダムスチンの化学的安定性
５ｍＭ リン酸緩衝液にＳＢＥＣＤを溶解し、ｐＨを７．２に調整して、ＳＢＥＣＤ４％のリン酸緩衝液（ｗ／ｗ）（ＳＢＥＣＤ／ＰＢ）を調製した。

【0138】

以下の組成物を調製し試験した：
コントロール： 水中のベンダムスチン塩酸塩（ＢＭ）０．６ ｍｇ／ｍＬ（５ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢ）ｐＨ７．２中ＢＭを溶解することにより調製した）
組成物３０−１： ＳＢＥＣＤ ４％中、ＢＭ ０．６ｍｇ／ｍＬ（ＳＢＥＣＤ／ＰＢ中ＢＭに溶解することにより調製した）
組成物３０−２： ＳＢＥＣＤ ４％およびＬＭＷＰ ０．２％中、ＢＭ ０．６ｍｇ／ｍＬ（ＳＢＥＣＤ／ＰＢ中ＢＭに溶解し、ＬＭＷＰを加え調製した）
組成物３０−３： ＳＢＥＣＤ ４％およびＬＭＷＰ １％中、ＢＭ ０．６ｍｇ／ｍＬ（ＳＢＥＣＤ／ＰＢ中ＢＭを溶解し、ＬＭＷＰを加え調製した）
組成物３０−４： ＳＢＥＣＤ ４％およびＬＭＷＰ ０．２％中、ＢＭ ０．６ｍｇ／ｍＬ（ＳＢＥＣＤ／ＰＢ中ＬＭＷＰを溶解し、ＢＭを加え調製した）
組成物３０−５： ＳＢＥＣＤ ４％およびＬＭＷＰ ０．２％中、ＢＭ ０．６ｍｇ／ｍＬ（ＳＢＥＣＤ／ＰＢ中ＬＭＷＰを溶解し、ＢＭを加え調製した）
前記組成物を２５℃でインキュベートし、以下のように定期的にＨＰＬＣにより分析した。１０μＬサンプルをＷａｔｅｒｓ ＳｙｍｍｅｔｒｙＳｈｉｅｌｄ ＲＰ−１８ ３．５μｍカラム（４．６×５０ｍｍ）を用い、ＴＦＡ ０．１％を含むアセトニトリル−水勾配 流速１．５ｍＬ／ｍｉｎで分離した。ピーク検出をＵＶ吸収検出（２６０ｎｍ）で行った。ベンダムスチンのピーク領域を一次反応速度モデルで薬物の分解速度を評価するために用いた。該結果を以下の表１７に分解半減期（Ｔ１／２）として示す。

【0139】

【表18】

【0140】

該結果は、ＬＭＷＰがＢＭとＳＢＥＣＤの溶液中、ＢＭの安定性を増加することを示す。また、前もって調製されたＢＭとＳＢＥＣＤの混合物にＬＭＷＰを加えた場合、ＬＭＷＰの安定化効果は大きいことを示す（組成物３０−３ 対 ３０−５、および組成物３０−２ 対 ３０−４）。

【0141】

実施例３１ 血漿中におけるベンダムスチンの化学的安定性
ヘパリン化されたヒト血漿２０μＬを血漿７８０μＬに、以下のベンダムスチン（ＢＭ）組成物と共に混合した：
コントロール： 水中のベンダムスチン塩酸塩（ＢＭ）０．６ ｍｇ／ｍＬ（水中にＢＭを溶解することにより調製した）。

【0142】

組成物３１−Ａ： ＳＢＥＣＤ ４％中、ＢＭ ０．６ｍｇ／ｍＬ（ＳＢＥＣＤ水溶液４％（ｗ／ｗ）中、ＢＭを溶解することにより調製した）
組成物３１−Ｂ： ＳＢＥＣＤ ８％中、ＢＭ ０．６ｍｇ／ｍＬ（ＳＢＥＣＤ水溶液８％（ｗ／ｗ）中、ＢＭを溶解することにより調製した）
組成物３１−Ｃ： ＳＢＥＣＤ ２０％中、ＢＭ ０．６ｍｇ／ｍＬ（ＳＢＥＣＤ水溶液２０％（ｗ／ｗ）中、ＢＭを溶解することにより調製した）
組成物３１−Ｄ： ＳＢＥＣＤ ４０％中、ＢＭ ０．６ｍｇ／ｍＬ（ＳＢＥＣＤ水溶液４０％（ｗ／ｗ）中、ＢＭを溶解することにより調製した）
組成物３１−１： ＳＢＥＣＤ ４％およびＰＩ２０８０ ３％中、ＢＭ ０．６ｍｇ／ｍＬ（ＳＢＥＣＤ水溶液 ４％（ｗ／ｗ）中、ＢＭを溶解し、ＰＩ２０８０を添加することにより調製した）
組成物３１−２： ＳＢＥＣＤ ８％およびＰＩ２０８０ ３％中、ＢＭ ０．６ｍｇ／ｍＬ（ＳＢＥＣＤ水溶液 ８％（ｗ／ｗ）中、ＢＭを溶解し、ＰＩ２０８０を添加することにより調製した）
組成物３１−３： ＳＢＥＣＤ ２０％およびＰＩ２０８０ ３％中、ＢＭ ０．６ｍｇ／ｍＬ（ＳＢＥＣＤ水溶液２０％（ｗ／ｗ）中、ＢＭを溶解し、ＰＩ２０８０を添加することにより調製した）
組成物３１−４： ＳＢＥＣＤ ４０％およびＰＩ２０８０ ３％中、ＢＭ ０．６ｍｇ／ｍＬ（ＳＢＥＣＤ水溶液４０％（ｗ／ｗ）中、ＢＭを溶解し、ＰＩ２０８０を添加することにより調製した）
急増した血漿中のベンダムスチン濃度は初期において０．０１５ｍｇ／ｍＬであった。該急増した血漿サンプルを３７℃でインキュベートした。５０μＬのサンプルを急増した血漿から定期的に取り出し、ＨＣｌ １００ｍＭを含むアセトニトリル溶液 ２００μＬに移し、混合し、遠心分離した。該上清５０μＬを９５％アセトニトリルを用いて２０倍に希釈し、希釈サンプル ２０μＬをＷａｔｅｒｓ ＳｙｍｍｅｔｒｙＳｈｉｅｌｄ ＲＰ−１８ ３．５μｍカラム（４．６×５０ｍｍ）を用い、水中（ＴＦＡ ０．１％）アセトニトリル（ＴＦＡ ０．１％）勾配、流速１．５ｍＬ／ｍｉｎで分離した。ピーク検出を蛍光検出（励起 ３２７ｎｍおよび発光 ４２０ｎｍ）により行った。ベンダムスチンのピーク領域を一次反応速度モデルで薬物の分解速度を評価するため使用した。該結果を以下の表１８に分解半減期（Ｔ１／２）として示す。

【0143】

【表19】

【0144】

該結果は、ＰＩ２０８０は血漿中でのＢＭの安定性を増加させることを示す。

【0145】

本明細書に記載されている前記実施例および本明細書の記載は説明のためのものであり、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本願に記載された発明を前述する記載から変更および改良して、様々な使用および条件を選択して行いうる。そのような実施形態もまた、以下の特許請求の範囲内の技術的範囲に含まれる。