特許 5655233 Ｔ細胞レセプター及び該レセプターをコードする核酸

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5655233

(24)【登録日】2014年12月5日

(45)【発行日】2015年1月21日

(54)【発明の名称】Ｔ細胞レセプター及び該レセプターをコードする核酸

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20141225BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20141225BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20141225BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20141225BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C07K14/705

   A61K48/00

   A61P35/00

【請求項の数】6

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2012-285851(P2012-285851)

(22)【出願日】2012年12月27日

(62)【分割の表示】特願2007-535435(P2007-535435)の分割

【原出願日】2006年9月7日

(65)【公開番号】特開2013-126415(P2013-126415A)

(43)【公開日】2013年6月27日

【審査請求日】2013年1月25日

(31)【優先権主張番号】特願2005-266088(P2005-266088)

(32)【優先日】2005年9月13日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】304026696

【氏名又は名称】国立大学法人三重大学

(73)【特許権者】

【識別番号】302019245

【氏名又は名称】タカラバイオ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100095832

【弁理士】

【氏名又は名称】細田 芳徳

(72)【発明者】

【氏名】珠玖 洋

(72)【発明者】

【氏名】日浅 厚則

(72)【発明者】

【氏名】奥村 悟司

(72)【発明者】

【氏名】直田 浩明

(72)【発明者】

【氏名】宮原 慶裕

【審査官】 西村 亜希子

(56)【参考文献】

【文献】 Clin. Cancer Res.，２００５年 ８月 １日，Vol.11, No.15，pp.5581-5589

【文献】 Anticancer Res.，２０００年，Vol.20, No.3A，pp.1793-1799

【文献】 Int. Immunol.，１９９９年，Vol.11, No.5，pp.745-751

【文献】 Gene Ther.，２００５年 １月，Vol.12, No.2，pp.140-146

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ｃ０７Ｋ １４／７０５

Ｃ１２Ｎ ５／１０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（１）配列表の配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるα鎖可変領域ポリペプチド、又は該配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換がなされたアミノ酸配列からなるα鎖可変領域ポリペプチドと、α鎖定常領域ポリペプチドとからなるＴＣＲα鎖ポリペプチド、及び
（２）配列表の配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるβ鎖可変領域ポリペプチド、又は該配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換がなされたアミノ酸配列からなるβ鎖可変領域ポリペプチドと、β鎖定常領域ポリペプチドとからなるＴＣＲβ鎖ポリペプチド、
から構成される、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＭＡＧＥ−Ａ４_143-151特異的なＴ細胞レセプター。

【請求項2】

（１）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および該配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換がなされたポリペプチドから選択されるポリペプチド、並びに
（２）配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および該配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換がなされたポリペプチドから選択されるポリペプチド、
から構成される、請求項１記載のＴ細胞レセプター。

【請求項3】

（１）配列表の配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるα鎖可変領域ポリペプチド、又は該配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換がなされたアミノ酸配列からなるα鎖可変領域ポリペプチドと、α鎖定常領域ポリペプチドとからなるＴＣＲα鎖ポリペプチドをコードする核酸、及び
（２）配列表の配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるβ鎖可変領域ポリペプチド、又は該配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換がなされたアミノ酸配列からなるβ鎖可変領域ポリペプチドと、β鎖定常領域ポリペプチドとからなるＴＣＲβ鎖ポリペプチドをコードする核酸、
を組み合わせた、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＭＡＧＥ−Ａ４_143-151特異的なＴ細胞レセプターをコードする核酸。

【請求項4】

（１）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および該配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換がなされたポリペプチドから選択されるポリペプチドをコードする核酸、並びに
（２）配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および該配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換がなされたポリペプチドから選択されるポリペプチドをコードする核酸、
を組み合わせた、請求項３記載の核酸。

【請求項5】

請求項３又は４記載の核酸を含有する組換え核酸。

【請求項6】

請求項３又は４記載の核酸、又は請求項５記載の組換え核酸を有効成分として含有する制がん剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＭＡＧＥ−Ａ４_143-151ペプチドに特異的なＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）α鎖を構成するポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸、前記ＴＣＲのβ鎖を構成するポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸、前記α鎖を構成するポリペプチドとβ鎖を構成するポリペプチドで構成されるＴ細胞レセプター、前記核酸を含んでなる組換え核酸、該組換え核酸を含むベクター、前記核酸又はベクターを導入された細胞、並びに前記のベクター又は細胞を有効成分として含んでなる制がん剤に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）には、主要組織適合性抗原遺伝子複合体（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｇｅｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ；以下、ＭＨＣと略す）にコードされる主要組織適合性抗原分子（ＭＨＣ分子、ヒトの場合 ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎと呼ばれ、以下、ＨＬＡと略す）と抗原ペプチドとの結合物である複合体を特異的なＴ細胞レセプター（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；以下、ＴＣＲと略す）によって認識し、その複合体を細胞表面に提示している細胞を傷害することのできるものがある。したがって該細胞傷害反応が成立するためには、１）標的細胞のＨＬＡクラスＩのタイプに特異的なＴＣＲを持ったＣＴＬが存在すること、２）ＨＬＡ分子に結合して形成される複合体がＴＣＲによる認識を受けることができるような抗原ペプチドが存在すること、が必要である。

【0003】

このような抗原ペプチドは、例えば哺乳類細胞の細胞内で合成された抗原等が細胞質でプロセスされ、小さいペプチドに分解されることにより生じ、更にＨＬＡ分子と会合し、細胞表面に提示される。すなわち、多くのサブユニットよりなるプロテアソーム複合体の中で、タンパク質は８〜１５アミノ酸よりなるペプチドに分解され、そのうちのいくつかがＴＡＰトランスポーターにより細胞質から小胞体に運ばれる。これらのペプチドは小胞体でクラスＩ／β２ミクログロブリン（ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）のヘテロダイマーに結合できれば、３分子複合体として安定化され、ゴルジ装置を通って、細胞表面に輸送される。腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原タンパク質を発現している腫瘍細胞は、Ｔ細胞に認識されるＨＬＡ拘束性抗原ペプチドを細胞表面に提示できるはずである。

【0004】

ＨＬＡクラスＩ分子は主としてＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃがあり、これらに結合して提示される抗原ペプチドは、８〜１０個のアミノ酸よりなり、更に各々のＨＬＡ分子によって異なる一定の構造上の特徴があることが知られている。例えば、世界的に最も頻度の高いＨＬＡ−Ａ２．１分子に結合するペプチドとしてはＮ末端より２番目にＬｅｕ、且つＣ末端にＬｅｕ又はＶａｌを有する９〜１０個のアミノ酸よりなるペプチドが最も良く知られているものである。また、日本人を始めとするアジアの人種に多いＨＬＡ−Ａ２４分子に結合するペプチドはＮ末端より２番目にＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐのいずれか、且つＣ末端にＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅのいずれかを有する９〜１０個のアミノ酸よりなるものであるペプチドが最もよく知られている。

【0005】

現在までに抗原ペプチドが同定されている腫瘍抗原としては、ＨＬＡ−Ａ１に対するＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＨＬＡ−Ａ２．１に対するＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＲＴ１、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＥＡ等、ＨＬＡ−Ｃｗ１に対するＭＡＧＥ−Ａ３、ＨＬＡ−Ｂ４４に対するＭＡＧＥ−Ａ３、ＨＬＡ−Ｂ３７に対するＭＡＧＥ−Ａ４、ＨＬＡ−Ａ２４に対するＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＥＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、チロシナーゼ、β−カテニン（ｃａｔｅｎｉｎ）等がある。これらの中の多くは、まず腫瘍細胞を認識するクラスＩ拘束性のＣＴＬを株化し、このＣＴＬの認識する腫瘍抗原を同定し、続いて遺伝子工学的方法により腫瘍抗原タンパク質中最小単位を見出し、更にＨＬＡクラスＩ分子への結合モチーフに関する情報を基に最小単位中のペプチドが見出されている。また、まず前記のＨＬＡクラスＩ分子結合ペプチドに共通したモチーフ構造を基に、腫瘍抗原タンパク質中のＨＬＡクラスＩ分子結合ペプチドを見出し、続いて抗原提示細胞を利用してＣＴＬを誘導可能なものを選択した後、最終的に腫瘍細胞に対して傷害性を有するＣＴＬが誘導できているかどうかにより抗原ペプチドが決定されている。

【0006】

一方、ＨＬＡクラスＩ分子はいくつかのサブタイプに分類されるが、その保有サブタイプの種類は人種間で大きく異なり、世界的にはＨＬＡ−Ａ２が最も多く、白色人種の４５％がＨＬＡ−Ａ２陽性である。そして、このＨＬＡ−Ａ２拘束性の抗原ペプチドの同定が最も進んでいる。日本人ではＨＬＡ−Ａ２陽性は４０％を占めるが、そのサブタイプを見ると白色人種と同じＨＬＡ−Ａ^*０２０１陽性は２０％で、残りの多くはＡ^*０２０６陽性である。これらのサブタイプへの結合ペプチドは異なり、主として研究されているＨＬＡ−Ａ２はＨＬＡ−Ａ^*０２０１である。一方、日本人ではＨＬＡ−Ａ２４陽性が６０％以上を占めており、アジア人種では他の人種に比べてＨＬＡ−Ａ２４陽性率が高い。従って、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の抗原ペプチドの発見はアジア人種、特に日本人において腫瘍細胞特異的に作用するＣＴＬを誘導する事による、腫瘍治療に有用なＣＴＬの提供に重要な役割を示す。

【0007】

同じ抗原でも、ＨＬＡの違いに基づいて抗原ペプチドが異なるため、抗原ペプチドを利用したＣＴＬの誘導は煩雑である。この問題を解決するために色々な工夫がなされているが、まだ満足できる成果は得られていない。工夫されていることの一つは、患者自身（自家）由来の抗原提示細胞に抗原遺伝子を形質導入し、これを利用したＴ細胞誘導方法である。抗原提示細胞として、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞が検討され、プロフェッショナル抗原提示細胞として知られている樹状細胞を中心として、ワクチンのアジュバント等として使用する臨床試験が実施されている。しかし、これらの抗原提示細胞は、免疫誘導に必要な量を準備するのに労力を要することが課題である。Ｂ細胞はＥＢウイルスによる不死化による大量調製が可能であるが、ウイルスを使用している点から安全性上問題がある。

【0008】

腫瘍抗原特異的ＴＣＲ遺伝子としては、例えばＨＬＡ−Ａ２拘束性のＭＡＲＴ１特異的ＴＣＲ〔非特許文献１〕、ＭＡＧＥ−Ａ３特異的ＴＣＲ〔非特許文献２〕、ＣＡＭＥＬ（ＣＴＬ−ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｎ ｍｅｌａｎｏｍａ）特異的ＴＣＲ〔非特許文献３〕、ｇｐ１００特異的ＴＣＲ〔非特許文献４〕、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＴＣＲ〔非特許文献５〕、ＨＬＡ−２４拘束性のＷＴ１（Ｗｉｌｍｓ ｔｕｍｏｒ １）特異的ＴＣＲ〔非特許文献６〕、ＨＬＡ−Ｃｗ１６拘束性のＭＡＧＥ−Ａ１特異的ＴＣＲ〔非特許文献７〕等の遺伝子がクローニングされている。

【0009】

ＴＣＲ遺伝子を任意のＣＴＬに導入することにより目的の抗原に特異的な細胞傷害活性を付与することが期待できる。これに基づき、ＭＡＲＴ１〔非特許文献８〕、ｇｐ１００〔非特許文献４〕及びｍＨＡＧ ＨＡ−２抗原〔非特許文献９〕を標的としたＴＣＲ遺伝子による遺伝子治療が試みられている。

【0010】

ＭＡＧＥ−Ａ４はがん精巣抗原ファミリーのＭＡＧＥサブファミリーに属する抗原であり、様々ながんにおいて発現している上に高い抗原性を有する（食道がんの６０％、頭頸部がんの５０％、非小細胞肺がんの２４％、胃がんの３３％及びホジキン病の２１％において陽性）ことから、がんワクチン療法の標的抗原として有望視されている。ＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＭＡＧＥ−Ａ４_143-151ペプチド特異的ＣＴＬクローンが取得されている〔非特許文献１０〕。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】カンサー リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）、第５４巻、第５２６５−５２６８頁（１９９４）

【非特許文献2】アンチカンサー リサーチ（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）、第２０巻、第１７９３−１７９９頁（２０００）

【非特許文献3】インターナショナル ジャーナル オブ カンサー（Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ）、第９９巻、第７−１３頁（２００２）

【非特許文献4】ジャーナル オブ イムノロジー、（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．）第１７０巻、第２１８６−２１９４頁（２００３）

【非特許文献5】ジャーナル オブ イムノロジー、第１７４巻、第４４１５−４４２３頁（２００５）

【非特許文献6】ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、第１０６巻、第４７０−４７６頁（２００５）

【非特許文献7】インターナショナル イムノロジー（Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第８巻、第１４６３−１４６６頁（１９９６）

【非特許文献8】ジャーナル オブ イムノロジー、第１６３巻、第５０７−５１３頁（１９９９）

【非特許文献9】ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、第１０３巻、第３５３０−３５４０頁（２００３）

【非特許文献10】クリニカル カンサー リサーチ（Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）、第１１巻、第５５８１−５５８９頁（２００５）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

腫瘍関連抗原に対するＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＴＣＲ遺伝子としては、ＷＴ１に対するものが知られているが、ＨＬＡ−Ａ２．１に比べると未だにその解析は遅れており、アジア人種、特に日本人の腫瘍治療に有用なＴＣＲ遺伝子の提供が不可能である。したがって、種々の腫瘍抗原に対するＨＬＡ−Ａ２４拘束性の新たなＴＣＲ遺伝子の発見が望まれる。

【0013】

生体内でＴＣＲを介した細胞傷害活性を担っているのは抗原特異的なＴＣＲを持つＣＴＬであるが、これを体外で増殖させてがん等の疾患の治療に使用するには、これらの細胞の取り扱い、例えば採取や拡大培養に問題を有している。したがって、所望の抗原特異性を有するＣＴＬを大量かつ容易に調製するための、腫瘍抗原等に特異的なＴＣＲの遺伝子を提供することが待ち望まれている。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本発明者らは、腫瘍抗原に対するＣＴＬについて鋭意研究した結果、腫瘍抗原であるＭＡＧＥ−Ａ４に対するＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＣＴＬからＴＣＲα鎖及びβ鎖をコードするｃＤＮＡをクローニングすることに成功した。さらに、ＨＬＡ−Ａ２４分子を発現するＣＴＬ等の細胞にこれらのｃＤＮＡから調製したＲＮＡを導入することにより、これらの細胞がＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＭＡＧＥ−Ａ４由来ペプチド特異的な細胞傷害性を示すことを見出し、本発明を完成した。

【0015】

本発明の第１の態様は、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の、ＭＡＧＥ−Ａ４_143-151特異的なＴ細胞レセプターを構成するポリペプチド、ならびに前記レセプターの可変領域のポリペプチドを有するポリペプチドに関する。

【0016】

本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様のポリペプチドにより構成されていることを特徴とする、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の、ＭＡＧＥ−Ａ４_143-151特異的なＴＣＲに関する。

【0017】

本発明の第３の態様は、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の、ＭＡＧＥ−Ａ４_143-151特異的なＴＣＲをコードする核酸、ならびに前記レセプターの可変領域のポリペプチドを有するポリペプチドをコードする核酸に関する。

【0018】

本発明の第４の態様は、本発明の第３の態様の核酸を含んでなる組換え核酸に関する。

【0019】

本発明の第５の態様は、本発明の第４の態様の組換え核酸が挿入されてなるベクターに関する。

【0020】

本発明の第６の態様は、本発明の第３の態様の核酸が導入されている、又は第５の態様のベクターで形質転換されていることを特徴とする、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＭＡＧＥ−Ａ４_143-151特異的なＴＣＲを発現する細胞に関する。

【0021】

本発明の第７の態様は、本発明の第６の態様の細胞又は第５の態様のベクターを有効成分として含有することを特徴とする制がん剤に関する。

【0022】

本発明の第８の態様は、本発明の第７の態様の制がん剤を投与する工程を包含する、癌の治療方法に関する

【発明の効果】

【0023】

本発明により、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＭＡＧＥ−Ａ４_143-151特異的なＴＣＲのα鎖及びβ鎖をコードする核酸が提供される。また、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ではない、またはＭＡＧＥ−Ａ４_143-151特異性を有しないＴ細胞をエフェクター細胞として使用する腫瘍細胞傷害方法が提供される。前記のエフェクター細胞は、例えばがんの治療において有用である。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】＃２−２８細胞、ＲＮＡ導入ｍｓ６９細胞およびｍｓ６９細胞のテトラマーアッセイの結果を示す図である。

【図2】＃２−２８細胞、ＲＮＡ導入ＣＤ８陽性細胞およびＣＤ８陽性細胞のテトラマーアッセイの結果を示す図である。

【図3】＃２−２８細胞、ＲＮＡ導入ｍｓ６９細胞およびｍｓ６９細胞のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す図である。

【図4】ＲＮＡ導入ＣＤ８陽性細胞およびＣＤ８陽性細胞のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す図である。

【図5】＃２−２８細胞、ＲＮＡ導入ｍｓ６９細胞およびｍｓ６９細胞の細胞傷害活性を示す図である。

【図6】＃２−２８細胞、ＲＮＡ導入ＣＤ８陽性細胞およびＣＤ８陽性細胞の細胞傷害活性を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0025】

本発明の第１の態様は、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の、ＭＡＧＥ−Ａ４_143-151特異的なＴ細胞レセプターを構成するポリペプチドであって、前記レセプターの可変領域のポリペプチドを有するものに関する。前記のポリペプチドには、ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖の２種があり、両鎖が組み合わされてＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＭＡＧＥ−Ａ４_143-151特異的なＴＣＲを構成する。

【0026】

前記α鎖ポリペプチドは、β鎖とともにＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＭＡＧＥ−Ａ４_143-151特異的なＴＣＲを形成しうるものであって、α鎖可変領域のポリペプチドとして、配列表の配列番号５に示されるアミノ酸配列のポリペプチド；配列表の配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換を有するポリペプチド；から選択されるものを有するものを意味する。本発明における、ＴＣＲのα鎖由来のポリペプチドは、前記のα鎖可変領域のアミノ酸配列もしくはこれに類似した配列を必須の構成成分として含有するものである。定常領域を含有する、α鎖全体のアミノ酸配列（配列番号１）もしくはこれに類似した配列、すなわち１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは本発明の好適な態様の一つである。

【0027】

また、前記β鎖ポリペプチドは、α鎖とともにＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＭＡＧＥ−Ａ４_143-151特異的なＴＣＲを形成しうるものであって、β鎖可変領域のポリペプチドとして、配列表の配列番号７に示されるアミノ酸配列のポリペプチド；配列表の配列番号７に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換を有するポリペプチド；から選択されるものを有するものを意味する。本発明における、ＴＣＲのβ鎖由来のポリペプチドは、前記のβ鎖可変領域のアミノ酸配列もしくはこれに類似した配列を必須の構成成分として含有するものである。定常領域を含有する、β鎖全体のアミノ酸配列（配列番号２）もしくはこれに類似した配列、すなわち１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは本発明の好適な態様の一つである。

【0028】

ここで、「ＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＭＡＧＥ−Ａ４_143-151特異的なＴＣＲ」とは、配列表の配列番号９に示されるアミノ酸配列を有するペプチド（ＭＡＧＥ−Ａ４_143-151、以下、Ｐ１４３と略す）とＨＬＡ−Ａ２４分子との複合体を特異的に認識し、かつ、該ＴＣＲがＴ細胞表面に存在するときに該Ｔ細胞に標的細胞に対するＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＰ１４３特異的な細胞傷害活性を付与しうるものである。上記複合体を特異的に認識することは公知の方法によって確認すればよく、好適な方法として、例えばＨＬＡ−Ａ２４分子とＰ１４３を用いたテトラマー解析およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイが挙げられる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行うことにより、該ＴＣＲを細胞表面に発現しているＴ細胞がＴＣＲにより標的細胞を認識し、そのシグナルが細胞内に伝達されたことを確認することができる。上記複合体がＴ細胞表面に存在するときに該Ｔ細胞に細胞傷害活性を付与しうることの確認も公知の方法によればよく、好適な方法として、例えばクロムリリースアッセイなどのＨＬＡ−Ａ２４陽性標的細胞に対する細胞傷害活性の測定が挙げられる。

【0029】

本発明のポリペプチドは、後述する本発明の核酸を使用して遺伝子工学的に生産することができる。例えば、前記のα鎖ポリペプチドをコードする核酸、β鎖ポリペプチドをコードする核酸の両方を細胞に導入してα鎖、β鎖ポリペプチド発現させることにより、当該細胞にＨＬＡ−Ａ２４拘束性の、ＭＡＧＥ−Ａ４_143-151特異的なＴＣＲを発現させることができる。

【0030】

本発明の第２の態様は、本発明のポリペプチドにより構成されていることを特徴とする、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の、ＭＡＧＥ−Ａ４_143-151特異的なＴＣＲに関する。前記のＴＣＲは、特に本発明を限定するものではないが、例えば後述の本発明の核酸を使用して、前記核酸にコードされているポリペプチドを人為的に発現させることにより、天然において付随している生体成分とは分離された形態で調製することができる。

【0031】

本発明の第３の態様は、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の、ＭＡＧＥ−Ａ４_143-151特異的なＴＣＲまたはその可変領域をコードする核酸に関する。

【0032】

本発明の核酸とは、ＴＣＲα鎖可変領域ポリペプチドを有するポリペプチドをコードする核酸またはＴＣＲβ鎖可変領域ポリペプチドを有するポリペプチドをコードする核酸であって、それぞれ、ＴＣＲβ鎖ポリペプチドをコードする核酸またはＴＣＲα鎖ポリペプチドをコードする核酸とともに細胞に導入した場合にＨＬＡ−Ａ２４／ＭＡＧＥ−Ａ４_143-151複合体特異的に結合する分子が前記の細胞で発現される。なお、ＴＣＲα鎖可変領域ポリペプチドを有するポリペプチドをコードする核酸にはＴＣＲα鎖ポリペプチドをコードする核酸、ＴＣＲα鎖可変領域ポリペプチドをコードする核酸が、ＴＣＲβ鎖可変領域ポリペプチドを有するポリペプチドをコードする核酸にはＴＣＲβ鎖ポリペプチドをコードする核酸、ＴＣＲβ鎖可変領域ポリペプチドをコードする核酸が含まれ、ＴＣＲα鎖ポリペプチドをコードする核酸とＴＣＲβ鎖ポリペプチドをコードする核酸、ＴＣＲα鎖可変領域ポリペプチドをコードする核酸とＴＣＲβ鎖可変領域ポリペプチドをコードする核酸、いずれの組み合わせを細胞に導入した場合にもＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＭＡＧＥ−Ａ４_143-151特異的なＴＣＲが前記の細胞で発現される。

【0033】

本発明を限定するものではないが、前記α鎖ポリペプチドをコードする核酸としては、配列表の配列番号３に示される塩基配列からなる核酸、ならびに前記塩基配列の核酸又はその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸が例示される。α鎖ポリペプチドの可変領域をコードする核酸としては、配列表の配列番号６に示される塩基配列からなる核酸、ならびに前記塩基配列の核酸又はその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸が例示される。また、前記β鎖ポリペプチドをコードする核酸としては、配列表の配列番号４に示される塩基配列からなる核酸、ならびに前記塩基配列の核酸又はその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸が例示される。β鎖ポリペプチドの可変領域をコードする核酸としては、配列表の配列番号８に示される塩基配列からなる核酸、ならびに前記塩基配列の核酸又はその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸が例示される。

【0034】

ここで、ストリンジェントな条件としては、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行、Ｊ．サムブルック（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編集、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．）等に記載された条件が例示される。具体的には、例えば０．５％ ＳＤＳ、５×デンハルツ溶液、０．０１％ 変性サケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ中、プローブとともに６５℃にて１２〜２０時間インキュベートする条件が挙げられる。プローブにハイブリダイズした核酸は、例えば０．５％ ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中、３７℃で洗浄して非特異的に結合したプローブを除去した後に検出することができる。

【0035】

本明細書における核酸とは、１本鎖あるいは２本鎖の、ＤＮＡ、ＲＮＡあるいはＤＮＡ−ＲＮＡキメラ、又はＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ２本鎖を意味する。核酸の全部又は一部がＲＮＡである場合は、ＲＮＡ部分の配列については、本願明細書に記載の配列表におけるＴをＵと読み替えることとする。本発明の好適な態様としては、本発明のＴＣＲα鎖ポリペプチドをコードする核酸またはＴＣＲα鎖可変領域ポリペプチドをコードする核酸と、ＴＣＲβ鎖ポリペプチドをコードする核酸またはＴＣＲβ鎖可変領域ポリペプチドをコードする核酸の、２種の核酸の組合せが例示される。前記の核酸の組み合わせは、細胞においてＨＬＡ−Ａ２４拘束性の、ＭＡＧＥ−Ａ４_143-151特異的なＴＣＲを発現させる目的に有用である。

【0036】

本発明の核酸は、例えば次のようにして得ることができる。ＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＭＡＧＥ−Ａ４_143-151特異的なＣＴＬ、例えば非特許文献１０に記載のクローン＃２−２８から常法によりＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成する。これを鋳型とし、ＴＣＲα鎖及びβ鎖の定常領域をコードする核酸に相補的なアンチセンスプライマーを用いて５’−ラピッド アンプリフィケーション オブ ｃＤＮＡ エンド（ＲＡＣＥ）を行う。５’−ＲＡＣＥは公知の方法により行えばよく、例えばＣａｐＦｉｓｈｉｎｇ Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ Ｐｒｅｍｉｘ Ｋｉｔ（シージーン社製）のような市販のキットを用いて行うことができる。前記手法により増幅されたＤＮＡをプラスミドベクターに組み込み、大腸菌を形質転換する。形質転換体からプラスミドを調製し、挿入されたＤＮＡの塩基配列を決定する。

【0037】

得られた塩基配列と既知のＴＣＲα鎖及びβ鎖の遺伝子の配列を比較することにより、５’−ＲＡＣＥにより増幅された、ＴＣＲ遺伝子とは無関係のＤＮＡを除外することができる。また、ＰＣＲの際に塩基配列に変異が生じたＤＮＡが増幅される可能性があるので、本発明では、複数の大腸菌クローンから配列を決定し、そのコンセンサス配列から推定される前記ＣＴＬが本来有するＴＣＲα鎖遺伝子及びβ鎖遺伝子の配列を使用することが好ましい。

【0038】

配列表の配列番号３で示される塩基配列を有する、配列番号１のアミノ酸配列のＴＣＲα鎖をコードする核酸、及び、配列表の配列番号４で示される塩基配列を有する、配列番号２のアミノ酸配列のＴＣＲβ鎖をコードする核酸は、上記の方法により得られたものである。

【0039】

本発明には、上記の方法により得られたＤＮＡを使用してもよいし、同じ配列を有する核酸を化学合成して使用してもよい。

【0040】

本発明の核酸のうち、ＴＣＲを構成する各鎖の可変領域に相当する部分をコードする核酸は、他の機能性分子、例えば抗体やレセプターをコードする核酸のうちの、定常領域や細胞内領域をコードする領域に接続させることができる。こうして構築された新規核酸は、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＭＡＧＥ−Ａ４_143-151特異的な結合活性が付与された、キメラ機能性分子の製造に有用である。

【0041】

本発明の第４の態様は、本発明の核酸を含んでなる組換え核酸である。前記の組換え核酸とは、特に本発明を限定するものではないが、本発明の核酸を細胞に導入した場合に前記核酸にコードされているポリペプチドの翻訳を可能とする種々の要素を付加された核酸が例示される。

【0042】

ＤＮＡからなる本発明の組換え核酸としては、プロモーター（例えば、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、Ｘｉｓｔプロモーター、β−アクチンプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター等の哺乳類由来プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター、各種レトロウイルスのＬＴＲプロモーター等のウイルス由来プロモーター）、ターミネーター、エンハンサーやそのほかの転写制御領域を有するものが例示される。さらに、第１の発明のポリペプチドの翻訳に寄与する配列（Ｋｏｚａｋ配列等）をコードしていてもよい。前記の各要素が本発明の核酸からのＲＮＡの転写、ポリペプチドの翻訳に適するよう、機能的に連携する位置に配置されることは当然である。なお、組換え核酸がＲＮＡである場合には転写の制御に関する要素は不要である。

【0043】

本発明の組換え核酸は後述するようにベクターに組み込んで使用する他、ＲＮＡである本発明の核酸を直接細胞に導入することによりＴＣＲの発現に使用することもできる。ＲＮＡの導入方法としては、公知の方法を用いれば良いが、例えば電気穿孔法が好適に使用できる。

【0044】

本発明の第５の態様は、本発明の組換え核酸が少なくとも１つ挿入されてなるベクターに関する。前記のベクターは所望の細胞にＨＬＡ−Ａ２４拘束性の、ＭＡＧＥ−Ａ４_143-151特異的なＴＣＲを発現させるうえで有用である。特に好適な態様としては、（１）本発明のＴＣＲα鎖ポリペプチド又はその可変領域ポリペプチドを有するポリペプチドをコードする核酸を含有する組換え核酸と本発明のＴＣＲβ鎖ポリペプチド又はその可変領域ポリペプチドを有するポリペプチドをコードする核酸を含有する組換え核酸の両方が挿入されてなるベクター、および（２）本発明のＴＣＲα鎖ポリペプチド又はその可変領域ポリペプチドを有するポリペプチドをコードする核酸を含有する組換え核酸が挿入されてなるベクターと本発明のＴＣＲβ鎖ポリペプチド又はその可変領域ポリペプチドを有するポリペプチドをコードする核酸を含有する組換え核酸が挿入されてなるベクターの組み合わせが例示される。前記の（１）の態様において、ＴＣＲα鎖ポリペプチドをコードする核酸とＴＣＲβ鎖ポリペプチドをコードする核酸はそれぞれ別のプロモーターにより転写、翻訳されてもよく、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）を使用して一つのプロモーターで転写、翻訳されてもよい。

【0045】

本発明に使用されるベクターには特に限定はなく、プラスミドベクター、ウイルスベクターなど公知のベクターより目的に応じて適当なものを選択し、使用すればよい。たとえば、前記の組換え核酸をプラスミドベクターに組み込んだ場合には、細胞への導入にはリン酸カルシウム法、カチオニック・リピド法、リポソーム法、エレクトロポーレーション法等の遺伝子導入法を使用できる。

【0046】

細胞に感染して外来ＤＮＡを導入する能力を有するウイルスベクターは本発明に好適である。本発明には、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターやシュードタイプベクターを含む）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等の公知のウイルスベクターを使用することができる。本発明の組換え核酸を挿入されたウイルスベクターは、各ウイルスに適した条件で目的の細胞に感染させ、本発明の核酸を導入させることができる。挿入された外来の核酸を染色体上に組み込む能力を有するレトロウイルスベクターは本発明に好適である。

【0047】

本発明の第６の態様は、本発明の核酸が導入されていることを特徴とする、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＭＡＧＥ−Ａ４_143-151特異的なＴＣＲを発現する細胞に関する。ここで、本発明の核酸は、前記の本発明の組換え核酸もしくは本発明のベクターとして所望の細胞に導入されていてもよく、本発明の細胞の好適な態様としては、ＴＣＲα鎖ポリペプチド又はその可変領域ポリペプチドを有するポリペプチドをコードする核酸とＴＣＲβ鎖ポリペプチド又はその可変領域ポリペプチドを有するポリペプチドをコードする核酸の両方が導入されている細胞や本発明のベクターで形質転換されている細胞が例示される。さらに、前記の核酸が染色体ＤＮＡ上に組み込まれている細胞も本発明に包含される。

【0048】

ＴＣＲはＴ細胞の抗原の認識に重要な役割を示すことから、好適な本発明の態様は本発明の核酸が導入されたＴ細胞である。生体より採取されたＴ細胞に、前記の手法により本発明の核酸を導入することにより、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の、ＭＡＧＥ−Ａ４_143-151特異的なＴＣＲを発現するＴ細胞を得ることができる。さらに、本発明の好適な態様として、Ｔ細胞に分化しうる細胞に前記の核酸を導入し、その後に細胞をＴ細胞に分化させてもよい。Ｔ細胞に分化しうる細胞としては、例えば造血幹細胞、リンパ球系共通前駆細胞及びＴ細胞前駆細胞が例示される。なお、核酸が導入される導入対象細胞は単一の細胞種に分画されている必要はなく、前記の導入対象細胞を含有する細胞集団を核酸導入の対象とすることができる。

【0049】

前記の、導入対象細胞を含有する細胞集団は、ヒトもしくは非ヒト哺乳動物の例えば末梢血、骨髄および臍帯血より採取すればよい。必要に応じ、Ｔ細胞および／またはＴ細胞に分化しうる細胞を分画もしくは富化して本発明に使用することができる。本発明のＴＣＲ遺伝子導入細胞をがんなどの治療に用いる場合には、当該細胞集団は治療対象となる患者本人、あるいは患者のＨＬＡタイプと一致したドナーから採取することが好ましい。

【0050】

本発明の核酸を細胞に導入する方法に特に限定はなく、公知の方法を用いることができる。本発明の核酸または本発明の組換え核酸を導入する場合には、例えばエレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、カチオニック・リピド法、リポソーム法を使用する方法を用いることができる。市販のトランスフェクション試薬〔例えば、ＴｒａｎｓＩＴシリーズ（ミラス社製）、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（ノバジェン社製）、ＲｉｂｏＪｕｉｃｅ（ノバジェン社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（インビトロジェン社製）〕を用いることにより、簡便かつ高効率に核酸を導入できる。本発明のベクターを用いる場合には、ベクターがプラスミドベクターであれば前記の核酸と同様の方法により細胞に導入することができる。一方、ベクターがウイルスベクターであれば、各々のウイルスベクターに適した感染方法を選択すればよい。特に、レトロウイルスベクターを用いる場合には、組換えフィブロネクチンフラグメントであるＣＨ−２９６（タカラバイオ社製）を用いることにより、各種細胞、特にレトロウイルスベクターの感染効率が低い造血幹細胞に対して、高効率な遺伝子導入が可能となる。

【0051】

本発明の第７の態様は、本発明の第５の態様のベクターまたは第６の態様の細胞を有効成分として含有することを特徴とする制がん剤に関する。本発明の第６の態様により得られた、本発明の核酸を導入されたＴ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２４分子とＭＡＧＥ−Ａ４_143-151ペプチドを提示する細胞に対して細胞傷害活性を示す。したがって、前記の本発明のベクターおよび細胞はＭＡＧＥ−Ａ４を発現する癌に対する制がん剤として使用することができる。

【0052】

前記の、本発明の制がん剤は、本発明のベクターまたは細胞を有効成分として含有することを特徴とする。該制がん剤は、前記のベクターまたは細胞を医薬的に許容される希釈剤に懸濁した形で提供される。なお、ここで言う希釈剤とは例えば当該ベクターまたは細胞の保存に適した培地、生理食塩水、又はリン酸緩衝生理食塩水である。培地としては、特に限定するものではないが、ＲＰＭＩ、ＡＩＭ−Ｖ、Ｘ−ＶＩＶＯ１０などの培地が一般的に挙げられる。また該制がん剤には医薬的に許容される担体、保存剤等が安定化の目的で添加されていてもよい。なおここで言う担体とはヒト血清アルブミン等である。本発明の細胞を有効成分として含有する制がん剤には前記の細胞を好ましくは１×１０⁴〜１×１０⁸個／ｍＬ、より好ましくは５×１０⁵〜５×１０⁷個／ｍＬ含有させる。

【0053】

本発明の細胞を有効成分として含有する制がん剤をヒトに投与する場合には、例えば注射器で投与することができ、成人１人当たりの投与量としては、通常、前記の細胞数が好ましくは１×１０⁶〜１×１０¹⁰個となるようにする。なお、前記の値は目安であり、これに限定されるものではない。また、本発明のベクターを有効成分として含有する制がん剤の場合、投与経路やベクターの種類等により制がん剤中のベクター濃度および投与量は大きく異なる。

【0054】

以上のとおり、本発明により癌の治療方法が提供される。前記治療方法は、本発明の第５の態様のベクターを有効成分として使用する場合にはｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療である。一方、本発明の細胞を有効成分として使用する場合には、体外に摘出された細胞にＨＬＡ−Ａ２４拘束性の、ＭＡＧＥ−Ａ４_143-151特異的なＴＣＲをコードする核酸を導入した後にこれを患者に投与するｅｘ ｖｉｖｏ治療である。本発明の治療方法は、投与する個体（たとえばヒト）由来の細胞、もしくはＨＬＡのタイプが同一である個体由来の細胞に核酸を導入して使用することができるため、毒性は特に認められない。

【実施例】

【0055】

以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

【0056】

実施例１ ＭＡＧＥ−Ａ４特異的ＣＴＬクローン＃２−２８のＴＣＲα鎖及びβ鎖遺伝子のクローニングと配列決定
（１）＃２−２８からのＲＮＡ調製、５’−ＲＡＣＥ、クローニング
非特許文献１０記載の、ＭＡＧＥ−Ａ４_143-151ペプチド（配列表の配列番号９、以下Ｐ１４３と略す）をパルスした標的細胞にＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性に細胞傷害活性を示すＣＴＬクローンである＃２−２８細胞を培養し、２×１０⁵個の細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＲＮＡを抽出した。このＲＮＡのうち２００ｎｇを鋳型に、ＣａｐＦｉｓｈｉｎｇ Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ Ｐｒｅｍｉｘ Ｋｉｔ（シージーン社製）を用いて、キットの取扱説明書に従ってｃＤＮＡを合成した。なお、配列表の配列番号１０に示すオリゴｄＴアダプター、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｍ−ＭＬＶ（ＲＮａｓｅＨ ｆｒｅｅ）（タカラバイオ社製）及び前記酵素に添付の反応用緩衝液を用いて逆転写反応を行った。

【0057】

こうして得られた１本鎖ｃＤＮＡを鋳型に、上記キットを用いてＰＣＲを行った。５’側プライマーとしてはキット添付の５’−ＲＡＣＥプライマー（配列番号１１）を、３’側プライマーとしてはＴＣＲα鎖Ｃ領域に特異的な３−ＴＲα−Ｃプライマー（配列番号１２）、ＴＣＲβ鎖Ｃ１領域に特異的な３−ＴＲβ−Ｃ１プライマー（配列番号１３）又はＴＣＲβ鎖Ｃ２領域に特異的な３−ＴＲβ−Ｃ２プライマー（配列番号１４）を使用した。これらの反応を、順にＰＣＲ−α、ＰＣＲ−β１及びＰＣＲ−β２と呼ぶ。各反応液を９４℃で３分間保持したあと、９４℃で４０秒間、５８℃で４０秒間、７２℃で１分間のサイクルを３０回繰り返し、７２℃で５分間保持した。各反応産物の一部をアガロースゲル電気泳動により分析したところ、ＰＣＲ−α及びＰＣＲ−β２において約１ｋｂのＤＮＡが増幅していた。

【0058】

ＰＣＲ−α及びＰＣＲ−β２の残りの反応産物をアガロースゲル電気泳動によって分離し、約１ｋｂのＤＮＡをゲルから回収した。これらをｐＴ７ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（ノバジェン社製）とライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。

【0059】

（２）配列の決定、クラスタリング、クローンの選択
こうして得られたＰＣＲ−α及びＰＣＲ−β２に由来する形質転換体からそれぞれ９６個を選択してそのそれぞれからプラスミドを調製し、自動シークエンサーを用いてＤＮＡ塩基配列を決定した。配列データからｐＴ７ｂｌｕｅの配列を除去した後にクラスタリングを行ったところ、最も大きいコンティグのコンセンサス配列に含まれる最も長いオープンリーディングフレームの配列は配列表の配列番号３及び配列番号４に示すとおりであった。これらの配列は順に、＃２−２８細胞のＴＣＲ α鎖遺伝子及びβ鎖遺伝子のｃＤＮＡ配列である。ｃＤＮＡ塩基配列から推定されるＴＣＲ α鎖及びβ鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号１及び配列番号２に示す。上記のプラスミドの中からＴＣＲ α鎖遺伝子及びβ鎖遺伝子ｃＤＮＡのコンセンサス配列をｐＴ７ｂｌｕｅのＴ７プロモーターと同じ向きに持つプラスミドを選択し、それぞれｐＢＳ ＭＡＧＥ ＴＣＲα及びｐＢＳ ＭＡＧＥ ＴＣＲβと命名した。

【0060】

実施例２ ｍＲＮＡトランスフェクションによるＭＡＧＥ−Ａ４特異的ＴＣＲの発現
（１）ｍＲＮＡの調製
制限酵素ＥｃｏＲＩで消化することによりｐＢＳ ＭＡＧＥ ＴＣＲα及びｐＢＳ ＭＡＧＥ ＴＣＲβを直鎖化した。これらを鋳型とし、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ Ｋｉｔ（アンビオン社製）を用いて、キットの取扱説明書に従ってインビトロ転写を行った。その後、Ｐｏｌｙ（Ａ） Ｔａｉｌｉｎｇ Ｋｉｔ（アンビオン社製）を用いて、キットの取扱説明書に従って、前記転写されたＲＮＡにポリ（Ａ）鎖を付加した。こうしてＭＡＧＥ−Ａ４ ＴＣＲα ｍＲＮＡ及びＭＡＧＥ−Ａ４ ＴＣＲβ ｍＲＮＡを得た。これらをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、使用時まで−８０℃で保存した。

【0061】

（２）ｍＲＮＡトランスフェクション
ｍｓ６９細胞はＳＡＧＥ７１５−７２３ペプチド（配列表の配列番号１５、以下Ｐ７１５と略す）をパルスした標的細胞にＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性に細胞傷害活性を示すＣＴＬクローンであり、非特許文献１０記載の＃２２細胞と同様の方法により得られた、＃２２とは別のクローンである。１×１０⁷個のｍｓ６９細胞をＸ−ＶＩＶＯ２０培地（キャンブレックス社製）で２回洗浄した。実施例２−（１）で調製したＭＡＧＥ−Ａ４ ＴＣＲα ｍＲＮＡ及びＭＡＧＥ−Ａ４ ＴＣＲβ ｍＲＮＡの各８０μｇと上記細胞をＸ−ＶＩＶＯ２０培地中、１５０μＬとなるように混合し、ＥＣＭ８３０遺伝子導入装置（ＢＴＸ社製）を用いて電気穿孔法によりＲＮＡの細胞への導入を行った。ｍＲＮＡ導入後の細胞は、Ｘ−ＶＩＶＯ２０培地中、５％ＣＯ₂存在下３７℃で１日培養した。以下、こうして得られた細胞をＲＮＡ導入ｍｓ６９細胞と記載する。

【0062】

ヒト末梢血からＦｉｃｏｌｌ遠心法により末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離し、０．５％ ＡＢ型血清添加ＰＢＳで２回洗浄した。これに、抗ＣＤ８抗体を固相化した磁気ビーズであるＭＡＣＳ ＣＤ８ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（ミルテニー社製）を添加して４℃で１５分間反応させた後、ビーズを０．５％ ＡＢ型血清添加ＰＢＳで１回洗浄した。マグネットを装着したカラムでトラップした磁気ビーズから回収したＣＤ８陽性細胞を１０％ ＡＢ血清及び１００Ｕ／ｍＬインターロイキン２（ＩＬ−２）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地に１×１０⁶個／ｍＬとなるように懸濁した。２４ウェルプレートの各ウェルにＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈した抗ＣＤ３抗体（オルソクローンＯＫＴ３、ヤンセンファーマ社製）を３００μＬずつ加え、４℃で１晩静置したあと上清を捨て、各ウェルに上記のＣＤ８陽性細胞懸濁液を１ｍＬずつ分注した。培養開始４日後、７日後及び１０日後に培地を半量ずつ交換しながら５％ＣＯ₂存在下３７℃で培養した。培養開始１２日後のＣＤ８陽性細胞１×１０⁷個をＸ−ＶＩＶＯ２０培地（キャンブレックス社製）で２回洗浄した。ｍｓ６９細胞と同様の方法により、この細胞にＭＡＧＥ−Ａ４ ＴＣＲα ｍＲＮＡ及びＭＡＧＥ−Ａ４ ＴＣＲβ ｍＲＮＡを導入した。ｍＲＮＡ導入後の細胞はＸ−ＶＩＶＯ２０培地中、５％ＣＯ₂存在下３７℃で１日培養した。以下、こうして得られた細胞をＲＮＡ導入ＣＤ８陽性細胞と記載する。

【0063】

（３）テトラマーアッセイ
ＨＬＡ−Ａ２４０２重鎖のＣ末端にビオチンプロテインリガーゼＢｉｒＡの基質となる配列を付加したポリペプチド及びβ２−ミクログロブリンを不溶性封入体として大腸菌に発現させた。前記の封入体をＰ１４３ペプチド存在下、インビトロでリフォールディングさせることにより、ＨＬＡ−Ａ２４０２／β２−ミクログロブリン／Ｐ１４３複合体を形成させた。得られた複合体にビオチンプロテインリガーゼ（アビディティー社製）を作用させ、フィコエリスリン標識ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＰＥ、インビトロジェン社製）を用いてテトラマーを調製した。

【0064】

上記ＲＮＡ導入ｍｓ６９細胞及びＲＮＡ導入ＣＤ８陽性細胞を２０μｇ／ｍＬテトラマーと３７℃で３０分間反応させた後、Ｔｒｉｃｏｌｏｒ標識マウス抗ヒトＣＤ８抗体（カルタグ社製）と氷上で１５分間反応させた。細胞を洗浄後、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ社製）を用いてフローサイトメトリー解析を行った。ｍｓ６９細胞及びＣＤ８陽性細胞を陰性対象、＃２−２８細胞を陽性対象として使用した。

【0065】

その結果、テトラマー陽性率は、陰性対照のｍｓ６９細胞では０．６０％であったのに対してＲＮＡ導入ｍｓ６９細胞では６６．６５％であり、また、陰性対照のＣＤ８陽性細胞では２３．１％であったのに対してＲＮＡ導入ＣＤ８陽性細胞では３４．４％であった。ＲＮＡを導入したｍｓ６９細胞及びＣＤ８陽性細胞のテトラマーアッセイの結果を図１及び図２に示す。この結果から、＃２−２８細胞からクローニングしたＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖の遺伝子産物は、Ｐ１４３とＨＬＡ−Ａ２４０２の複合体を認識することが明らかになった。

【0066】

（４）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
標的細胞は次のようにして調製した。Ｂ×Ｔハイブリッド細胞株１７４ＣＥＭ．Ｔ２（以下、Ｔ２細胞と略す）にＨＬＡ−２４０２遺伝子をトランスフェクトして作製されたＴ２−Ａ２４細胞（Ｉｋｕｔａ Ｙ．ら、Ｂｌｏｏｄ、第９９巻、第３７１７−３７２４頁、２００２年）を１０％ ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、遠心分離のあと上清を捨てた。その後、ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、遠心分離のあと上清を捨てることにより細胞を洗浄した。このようにして細胞の洗浄を合計３回行ったあと、１ｍＬの１０μＭ Ｐ１４３あるいはＰ７１５含有又はペプチド不含ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁して、５％ＣＯ₂存在下、３７℃で１時間インキュベートした。遠心分離により細胞を回収し、ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁したあと遠心分離を行って細胞を洗浄した。５×１０⁴個／１００μＬとなるように細胞をＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの標的細胞として使用した。

【0067】

マルチスクリーン ＨＡ ９６ウェル濾過およびアッセイプレート（ミリポア社製）の各ウェルに２μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した抗ヒトインターフェロンγ抗体（１−Ｄ１Ｋ、マブテック社製）を１００μＬずつ分注し、４℃で１晩放置した。ウェル内の液を捨てた後、各ウェルに１００μＬのＲＰＭＩ１６４０培地を加え、１５分間放置し、液を捨ててプレートを洗浄した。この洗浄を更に１回行った後、１０％ ＡＢ型血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地を各ウェルに加え、３７℃で１時間放置し、ブロッキングを行った。ブロッキング後、上清を吸引したあと各ウェルに１００μＬのＲＰＭＩ１６４０培地を添加してプレートを洗浄した。この洗浄操作を合計３回行った。

【0068】

実施例２−（２）で調製した（ａ）ＲＮＡ導入ｍｓ６９細胞、（ｂ）陰性対照のｍｓ６９細胞及び（ｃ）陽性対象の＃２−２８細胞並びに実施例２−（２）で調製した（ｄ）ＲＮＡ導入ＣＤ８陽性細胞及び（ｅ）陰性対照のＣＤ８陽性細胞を遠心分離により回収し、ＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄した。（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は２０００個、１０００個又は５００個／１００μＬとなるように、（ｄ）及び（ｅ）は２×１０⁴個／１００μＬになるようにＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、実施例２−（４）で調製した洗浄済みプレートのウェルに１００μＬずつ分注した。これに１００μＬの上記標的細胞懸濁液を添加し、５％ＣＯ₂存在下、３７℃で２０時間培養した。

【0069】

プレートの各ウェルから液を除去し、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で６回洗浄した。ビオチン化抗ヒトインターフェロンγ抗体（マブテック社製、クローン名：７−Ｂ６−１）を０．２μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳで希釈し、各ウェルに１００μＬずつ分注したあと、４℃で１晩放置した。

【0070】

プレートの各ウェルから液を除去し、ＰＢＳ−Ｔで６回洗浄した。１μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳで希釈したアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（バイオラッド社製）を各ウェルに１００μＬずつ分注し、室温で１時間反応させた。プレートの各ウェルから液を除去し、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、ＡＰ発色キット（バイオラッド社製、１７０−６４３２）の取扱説明書に従い調製した発色液を各ウェルに１００μＬずつ分注し、遮光して発色反応を行った。蒸留水で発色を停止した後、プレートの写真を撮影した。

【0071】

その結果、ｍｓ６９細胞及びＣＤ８陽性細胞に比べてＲＮＡを導入したｍｓ６９細胞及びＣＤ８陽性細胞は、標的細胞がＰ１４３をパルスされている場合により多数のインターフェロンγ陽性スポットを形成した。この結果を図３及び図４に示す。図３はＣＴＬクローンをエフェクター細胞として使用したときのＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果であり、ｍｓ６９細胞はＰ７１５をパルスした標的細胞に対して、＃２−２８細胞はＰ１４３をパルスした標的細胞に対して、ＲＮＡ導入ｍｓ６９細胞はいずれの標的細胞に対しても多数のインターフェロンγ陽性スポットを形成した。図４はＣＤ８陽性細胞をエフェクター細胞として使用したときのＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果であり、ＲＮＡ導入ＣＤ８陽性細胞はＰ１４３をパルスされた標的細胞に特異的にインターフェロンγ陽性スポットを形成した。

【0072】

（５）細胞傷害活性
Ｔ２細胞、Ｔ２−Ａ２４細胞及び、Ｔ２細胞にＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子をトランスフェクトして作製されたＴ２−Ａ２細胞をＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、５×１０⁶個／ｍＬになるようにＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。これらの細胞懸濁液１ｍＬに終濃度１０μＭのＰ１４３又はＰ７１５を加え、室温で１５分間静置した後、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地１ｍＬを添加して３７℃で１時間インキュベートした。細胞をＦＣＳ不含ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、１×１０⁶個の細胞を１００μＬの１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。これに５０μＬのＮａ₂⁵¹ＣｒＯ₄水溶液（３．７ＭＢｑ）を添加し、３７℃で２時間標識した。これを標的細胞として細胞傷害活性の測定に使用した。

【0073】

ｍｓ６９細胞、ＲＮＡ導入ｍｓ６９細胞、＃２−２８細胞、ＣＤ８陽性細胞及びＲＮＡ導入ＣＤ８細胞をＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄し、２×１０⁶個／ｍＬ、１×１０⁶個／ｍＬ、５×１０⁵個／ｍＬ、２．５×１０⁵個／ｍＬ、１．２５×１０⁵個／ｍＬ及び、６．２５×１０⁴個／ｍＬとなるように１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し（エフェクター細胞）、その１００μＬを９６穴Ｖ底プレートのウェルに入れた。１×１０⁶個／ｍＬとなるように標的細胞を１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、エフェクター細胞の入ったウェルに１００μＬずつ添加した。３７℃で４時間反応させた後、遠心分離により上清を回収し、１００μＬの上清に遊離された⁵¹Ｃｒ量をガンマカウンターを用いて測定した。放射活性の測定値から、次の式により特異的細胞傷害活性を計算した。

【0074】

【数1】

【0075】

上式において、最小放出値とはエフェクター細胞を加えないウェルにおける⁵¹Ｃｒ遊離量であり、標的細胞からの⁵¹Ｃｒの自然遊離量を示す。また、最大放出値とはトリトンＸ−１００を標的細胞に加えて破壊したときの⁵¹Ｃｒ遊離量を示す。

【0076】

この結果を図５及び図６に示す。図５はＰ７１５でパルスしたＴ２−Ａ２４細胞（ａ）、Ｐ１４３でパルスしたＴ２−Ａ２４細胞（ｂ）及びＰ１４３でパルスしたＴ２−Ａ２細胞（ｃ）に対するＣＴＬクローンの細胞傷害活性を示す図であり、横軸はエフェクター細胞数／標的細胞数比（Ｅ／Ｔ比）を、縦軸は特異的細胞傷害活性（％）を示す。ｍｓ６９細胞はＰ７１５でパルスしたＴ２−Ａ２４細胞にだけ、＃２−２８細胞はＰ１４３でパルスしたＴ２−Ａ２４細胞にだけ細胞傷害活性を示したのに対して、ＲＮＡを導入したｍｓ６９細胞は両方の標的細胞に対して細胞傷害活性を示した。Ｐ１４３でパルスしたＴ２−Ａ２細胞に対してはどのエフェクター細胞も細胞傷害活性を示さなかった。図６はＰ１４３でパルスしたＴ２細胞（ａ）、ペプチドパルスしていないＴ２−Ａ２４細胞（ｂ）及びＰ１４３でパルスしたＴ２−Ａ２４細胞（ｃ）に対するＣＤ８細胞の細胞傷害活性を示す図であり、横軸はＥ／Ｔ比を、縦軸は特異的細胞傷害活性（％）を示す。陰性対照のＣＤ８陽性細胞はいずれの細胞に対しても細胞傷害活性を示さなかったのに対して、ＲＮＡを導入したＣＤ８陽性細胞及び陽性対象の＃２−２８細胞はＰ１４３でパルスしたＴ２−Ａ２４細胞に対して細胞傷害活性を示した。

【0077】

以上の結果から、＃２−２８細胞のＴＣＲ α鎖及びβ鎖をコードする遺伝子は、Ｐ１４３特異的なＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性の細胞傷害活性を、ＣＴＬクローン及び末梢血由来ＣＤ８細胞に付与することが明らかになった。

【0078】

なお、本発明の態様として、以下のものが挙げられる。
[１]配列表の配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は該配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチドを有し、かつ配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとともにＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＭＡＧＥ−Ａ４_143-151特異的なＴ細胞レセプターを構成しうるポリペプチド。
[２]配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および該配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換がなされたポリペプチドから選択されるポリペプチドであって、かつ配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとともにＨＬＡ−Ａ２４／ＭＡＧＥ−Ａ４_143-151複合体特異的に結合する分子を構成しうる、前記[１]記載のポリペプチド。
[３]配列表の配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は該配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチドを有し、かつ配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとともにＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＭＡＧＥ−Ａ４_143-151特異的なＴ細胞レセプターを構成しうるポリペプチド。

【0079】

[４]配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および該配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換がなされたポリペプチドから選択されるポリペプチドであって、かつ配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとともにＨＬＡ−Ａ２４／ＭＡＧＥ−Ａ４_143-151複合体特異的に結合する分子を構成しうる、前記[３]記載のポリペプチド。
[５]前記[１]記載のポリペプチドおよび前記[３]記載のポリペプチドで構成されてなるＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＭＡＧＥ−Ａ４_143-151特異的なＴ細胞レセプター。
[６]前記[１]記載のポリペプチドをコードする核酸。
[７]配列表の配列番号３で示される塩基配列からなる核酸、又は前記の核酸もしくはその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸である前記[６]記載の核酸。

【0080】

[８]配列表の配列番号６で示される塩基配列からなる核酸、又は前記の核酸もしくはその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸である前記[６]記載の核酸。
[９]前記[３]記載のポリペプチドをコードする核酸。
[１０]配列表の配列番号４で示される塩基配列からなる核酸、又は前記の核酸もしくはその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸である前記[９]記載の核酸。
[１１]配列表の配列番号８で示される塩基配列からなる核酸、又は前記の核酸もしくはその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸である前記[９]記載の核酸。
[１２]前記[６]〜[１１]いずれか記載の核酸を含有する組換え核酸。
[１３]前記[１２]記載の組換え核酸が少なくとも１つ挿入されてなるベクター。

【0081】

[１４]（１）前記[６]〜[８]いずれか記載の核酸を含有する組換え核酸と前記[９]〜[１１]いずれか記載の核酸を含有する組換え核酸の両方が挿入されてなるベクター、および（２）前記[６]〜[８]いずれか記載の核酸を含有する組換え核酸が挿入されてなるベクターと前記[９]〜[１１]いずれか記載の核酸を含有する組換え核酸が挿入されてなるベクターの組み合わせ、から選択される前記[１３]記載のベクター。
[１５]前記[６]〜[１１]いずれか記載の核酸が導入された、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＭＡＧＥ−Ａ４_143-151特異的なＴ細胞レセプターを発現する細胞。
[１６]前記[６]〜[８]いずれか記載の核酸と前記[９]〜[１１]いずれか記載の核酸の両方が導入された前記[１５]記載の細胞。

【0082】

[１７]前記[１３]又は[１４]記載のベクターで形質転換された、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＭＡＧＥ−Ａ４_143-151特異的なＴ細胞レセプターを発現する細胞。
[１８]Ｔ細胞もしくはＴ細胞に分化しうる細胞である前記[１５]〜[１７]いずれか記載の細胞。
[１９]前記[１３]又は[１４]記載のベクターを有効成分として含有する制がん剤。
[２０]前記[１５]〜[１８]いずれか記載の細胞を有効成分として含有する制がん剤。
[２１]前記[１８]または[１９]記載の制がん剤を投与する工程を包含する、癌の治療方法。

【産業上の利用可能性】

【0083】

本発明によりＭＡＧＥ−Ａ４に対するＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＣＴＬ由来のＴＣＲα鎖及びβ鎖のポリペプチド、ならびに該ポリペプチドをコードする核酸が提供される。前記の核酸はＨＬＡ−Ａ２４分子とＭＡＧＥ−Ａ４_143-151ペプチドを提示する細胞に対する細胞傷害活性をＴ細胞に付与できることから、ＭＡＧＥ−Ａ４を発現する癌の治療に有用である。

【配列表フリーテキスト】

【0084】

SEQ ID NO:10; Oligo dT adaptor.
SEQ ID NO:11; 5'-RACE primer.
SEQ ID NO:12; Synthetic primer 3-TRalpha-C to amplify a DNA fragment encoding TCR alpha chain.
SEQ ID NO:13; Synthetic primer 3-TRbeta-C1 to amplify a DNA fragment encoding TCR beta chain.
SEQ ID NO:14; Synthetic primer 3-TRbeta-C2 to amplify a DNA fragment encoding TCR beta chain.

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]