特許 5655307 分娩時の頭皮血液における低酸素症を確認する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5655307

(24)【登録日】2014年12月5日

(45)【発行日】2015年1月21日

(54)【発明の名称】分娩時の頭皮血液における低酸素症を確認する方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/32 20060101AFI20141225BHJP

   G01N 33/48 20060101ALI20141225BHJP

   G01N 33/84 20060101ALI20141225BHJP

   G01N 1/10 20060101ALI20141225BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/32

   G01N33/48 H

   G01N33/84 Z

   G01N1/10 B

【請求項の数】8

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2009-532327(P2009-532327)

(86)(22)【出願日】2007年10月12日

(65)【公表番号】特表2010-505443(P2010-505443A)

(43)【公表日】2010年2月25日

(86)【国際出願番号】SE2007050738

(87)【国際公開番号】WO2008054303

(87)【国際公開日】20080508

【審査請求日】2010年7月20日

(31)【優先権主張番号】0602158-8

(32)【優先日】2006年10月13日

(33)【優先権主張国】SE

(73)【特許権者】

【識別番号】509198321

【氏名又は名称】カルマーク スウェーデン アクティエボラグ

(74)【代理人】

【識別番号】100091683

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼川 俊雄

(72)【発明者】

【氏名】カールッソン，マシアス

(72)【発明者】

【氏名】ヒオート アフ オーナス，ソフィア

【審査官】 小暮 道明

(56)【参考文献】

【文献】 特表平０９−５０４６０８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭６２−００６１６７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平０４−５０１７６８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００６／１２１５１０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 産科と婦人科, 71[12](2004) p.1845-1850

【文献】 J. Obstet. Gynaecol. Res., 26[1](2000) p.61-63

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ１／

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

血液試料採取部分(4, 21, 23)と、試料スプリッタ(24)と、血漿分離デバイス(25)と、少なくとも１つのプリント試薬(26)と、少なくとも１つの光検出セル(20)と、を含む使い捨てカード(2)；を有する血液分析システムであって、
全血(7)、又は前記血漿分離デバイス(25)によって分離された血漿（７’）又は血液細胞（７’’）を前記プリント試薬(26)と反応させた後、前記光検出セル(20)に移行し、
その後、前記光検出セル(20)において、
(a)胎児頭皮血液中のLDHの濃度；及び
(b)胎児頭皮血液中のAST, ALT, Mg, K, Ca, 乳酸からなる群より選択される少なくとも１種類の化学種の濃度；
を光学的に検知することによって胎児頭皮血液中の急性低酸素症を確認すること、を特徴とする血液分析システム。

【請求項2】

使用される血液試料(7)が、5 μＬ〜６０ μＬである、請求項１の血液分析システム。

【請求項3】

半透膜(11)を用いて、血液細胞（７’’）から血漿（７’）を分離することを含む、請求項1の血液分析システム。

【請求項4】

前記半透膜(11)の面積が、5 mm^２〜1000 mm^２である、請求項3の血液分析システム。

【請求項5】

前記血漿分離デバイス(25)が、
半透膜(11)によって閉鎖される上端開口部、及び、陰圧源に連結している、バルブ(16)を有する導管(15)によって形成される側壁開口部、を有するハウジングから形成されていることを特徴とする、請求項1に記載の血液分析システム。

【請求項6】

前記半透膜(11)の片面に前記血液試料(7)を負荷するステップと、前記半透膜(11)のもう1つの面に陰圧をかけるステップと、前記もう１つの面に面しているコンパートメント（13,14）中の血漿（７’）を採取するステップとを含む、請求項3〜請求項5のいずれか１つの血液分析システム。

【請求項7】

前記使い捨てカード(2)が、少なくとも１つのデバイス(30)を有する装置(3)に適合するよう形成されている、請求項1の血液分析システム。

【請求項8】

前記使い捨てカード(2)に固有のコード(22)が配置されていて、前記装置(3)が読み取り装置(34)を備えている、請求項7による血液分析システム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、胎児の臓器不全を示す分娩時の頭皮血液における低酸素症を確認する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

出生時または出生が迫っているときの新生児の急性周生期仮死、すなわち低酸素症（胎児血液の酸素飽和度が不十分な状態）は、低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）という形で依然として神経障害の重要な原因となっている。これは満期産児１０００例中２〜９例に認められ、その後脳性小児麻痺（ＣＰ）が起こり、重症例では死に至る病気である。世界的にみて、毎年約４００万人の新生児が死亡しており、約２５％は急性周生期仮死が原因である。資源不足のため、発展途上国では状況が悪化しているが、多くの人々が理解しているとおり、これは西欧諸国でも深刻な問題である。スウェーデンは、西欧世界の代表国と考えられており、仮死は満期出産１０００件中約７件に発生するため、１０００人中２人の子供が生れつきＨＩＥを有することになる。周生期仮死を起因とする持続性障害を予防するため、発症後、できる限り早く、胎児の低酸素症を発見することが重要である。迅速に発見することで、持続性障害が発生していない段階で、介入すべきかどうかを決定することができるようになる。介入とは、実質的には器械使用分娩によりできる限り早く新生児を外に出すこと、具体的には帝王切開をすることである。

【0003】

現在、急性周生期仮死は胎児の心拍モニタリングによって検知されており、胎児心拍数が好ましからざるパターンを示した場合は、膣から採取した胎児頭皮血液を用いてｐＨまたは乳酸値を測定する。

【0004】

ｐＨおよび乳酸は、酸素供給不足時に嫌気性代謝へスイッチが切り替わることから生じる代謝性アシドーシスの指標である。酸素不足状態の胎児では、ピルビン酸が代謝されて乳酸とエネルギーになる。現時点では、ｐＨ値がもっとも信頼できる基準である。しかし、ｐＨを迅速に測定するには約３５ μｌの頭皮血液が必要であり、これは容易に得ることはできない。いくつかの試験で示されているとおり、１回目の測定に失敗することが非常に多い（２０％）。乳酸の測定に必要な血液はわずか５ μｌであるため、測定は容易で、ベッドサイドで分析できる。乳酸分析は１分以内に実施可能なため、十分迅速に行える。

【0005】

膣分泌液等、分泌液中の乳酸測定を含む出産をモニタリングする方法は、特許文献１にて開示されている。分娩時の胎児血液のｐＨおよび乳酸について最近行われたスウェーデン無作為化試験から得られた予備的結果によると、アシドーシスの指標として乳酸はｐＨと同程度優れている。乳酸とｐＨは、どちらも中等度／重度のＨＩＥの理想的な予測因子とは言えない。乳酸に対する感度はわずか６７％、ｐＨに対しては５０％であり、特異度は乳酸に対しては７６％、ｐＨに対しては７３％と同程度であった。また、新生児のアシドーシス予測における感度および特異度は、乳酸およびｐＨのどちらについても７０％未満である。最近のスウェーデンの報告は、胎児心拍陣痛図（ＣＴＧ）およびＳＴＡＮ（心電図ＳＴセグメントの分析）を併用して新生児モニタリングを行っても、脳症性障害を来すおそれのあるタイプの周生期仮死が検出できないリスクがあると結論付けている（ＳＢＵ Ａｌｅｒｔ‐ｒａｐｐｏｒｔ ｎｒ ２００６‐０４）。

【0006】

出生時に仮死状態に陥った新生児において高値であることがわかっている酵素はＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、およびＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）であり、これらは肝酵素としても知られている。ＬＤＨは身体のほとんどの細胞中に認められるため、非特異的な酵素と考えられている。したがって、臨床研究で使用されることは少ない。以前、ＬＤＨは心筋障害マーカーとして使用されていたが、現在ではより特異度の高い検査に取って代わられている。ＡＳＴおよび具体的にはＡＬＴは、肝障害に対してより特異的である。低リスクの中国人女性群の新生児を対象として、出産および分娩が血漿中肝酵素に対して及ぼす影響に関する試験において、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、ＧＧＴ（グルタミルトランスアミナーゼ）を測定し、母体および新生児特性と相関させた（非特許文献１）。

【0007】

出生時または出生が迫っているときに胎児が低酸素症となった場合、身体の血流は「重要度の低い臓器」（腎、肝、脂肪、腸）から脳、心臓、および副腎に優先的に再分布する。これは優先度の低い臓器の細胞にダメージを与える傾向がある。細胞が障害されると酵素が循環に漏れ出す。低酸素症が重度の場合、細胞は死滅し、血液の酵素濃度も上昇する。低酸素症は、胎児の体内電解質のバランスにも影響を及ぼす。１例を挙げると、低酸素症時には、血液中のカルシウムが細胞に流入する。新生児動物モデルでは、低酸素症になると血清中イオン化カルシウム濃度が上昇することが実証されている。ヒトの乳児では、カルシウムも転帰（脳損傷の有無）の予測因子となる。哺乳動物の新生児において、低酸素症時に変化する問題のその他の酵素および電解質は、カリウム（Ｋ^＋）、マグネシウム（Ｍｇ^２＋）、ナトリウム（Ｎａ^＋）、グルコース、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、およびＧＧＴである。

【0008】

したがって、分娩時の胎児の酸素供給状態を確認する方法を改善する必要がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】国際公開第２００５／０３４７６２Ａ１号パンフレット

【0010】

【非特許文献1】Ｍｏｎｇｒｅｌｌｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎａｅｃｏｌ Ｒｅｓｗ，２６（１）：６１‐６３，２０００

【0011】

本発明の目的は、先行技術では既知の方法の欠点の少なくとも一部が克服されている、分娩時の頭皮血液における低酸素症を確認する方法を提供することである。

【0012】

本発明の別の目的は、先行技術では既知の方法を補い、より堅固な根拠に基づいて低酸素症を測定する、分娩時の頭皮血液における低酸素症を確認する方法を提供することである。

【0013】

本発明の別の目的は、本発明についての以下の説明、その好適な実施形態、および添付の請求項に関する試験より明白である。

【発明の概要】

【0014】

本発明により、血漿中ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）の測定を含む、分娩時に採取した胎児頭皮血液における低酸素症を確認する方法が開示される。ＬＤＨのほか、胎児頭皮血液中のＫ、Ｍｇ、Ｃａ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、および乳酸の群から選択される１種類または数種類のマーカーを測定するのが好適である。特に好適は、ＬＤＨとＫ、Ｍｇ、Ｃａ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、および乳酸のいずれかとの組み合わせである。さらに好適は、ＬＤＨ、乳酸、Ｍｇ、およびＡＳＴおよび／またはＡＬＴとの組み合わせである。

【0015】

本出願では、「ＬＤＨ」および「乳酸脱水素酵素」は全乳酸脱水素酵素を示しており、そのアイソザイムのことではない。

【0016】

本発明の方法では、分娩時に、患者に近い環境において、膣から少量（好ましくは約５〜２５ μＬ）の胎児頭皮血液を採取する。試料中の血液細胞から、具体的には電解質から血漿（血清）を分離し、ＬＤＨおよび任意選択的にＫ、Ｍｇ、Ｃａ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、および乳酸のなかから１種類以上について分析し、数分以内に結果を提示する。その結果、帝王切開が必要かどうかを示す等、患児が急性仮死に陥っているかどうかは医療チームが直接結論付ける。本発明のおかげで、仮死関連の多くの苦痛が取り除かれ、多くの命が救われると考えられる。

【0017】

発明者が実施した試験では、小児から採取した血液試料中のＬＤＨ、ＡＳＴ、およびＡＬＴを２４時間以内に分析した。分析対象となった小児は１９３例であった。このうち１９例が仮死の徴候を示した。生後５分のアプガー指数は<７であった。ＲＯＣ曲線（図１参照）によると、ＬＤＨの感度および特異度は、カットオフ値１０００ Ｕ／Ｌで９６％であった。ＨＩＥの場合、同一のカットオフ値で感度１００％、特異度９６％である。言い換えれば、これは本発明の方法による主要マーカーにより、真の低酸素症である全小児の９５％（以上）が確認されると同時に全健康児の９５％が健康であると確認されることを意味している。ＡＳＴおよびＡＬＴは、カットオフ値５５ Ｕ／Ｌおよび１８ Ｕ／Ｌにて、それぞれ感度８６％および特異度９０％を示した。本試験が予備的試験であるという事実にも関わらず、現在の既存の方法と比べて驚くほどの改善が示された。

【0018】

費用の観点から、結果は驚くべきものである。現在の方法を用いた場合、不要な帝王切開約１０件あたりＨＩＥ状態の小児が１例認められることが分かっている。例えば、ＨＩＥの小児を１例発見するために計１１件の帝王切開が行われるが、このうち１０件は不要である。本発明の感度および特異度では転帰は反対であり、例えば不要な帝王切開は１０件中１件のみであることを示す。したがって、社会は多くの命を救い、より多くの小児が自然分娩で生まれるようになる。下表は、既知の方法と比べて、本発明による方法によって大幅な改善がみられることを示している。

【0019】

健康な人では、電解質中にはＬＤＨが血清の約１５０倍含まれていることがわかっている。したがって、電解質にダメージを与えない方法で試料を採取し、分離して、ＬＤＨの内容物が血漿中に流入しないようにすることが重要である。また、分析用に少量の頭皮血液を採取することも考慮することが重要である。本発明の方法では、血漿を多孔質マトリックス（本出願では、血液細胞を保持可能な固体支持体上の「膜」と呼ぶ）に通すことで、頭皮血液試料を血漿と血液細胞に分離する。血漿中のＬＤＨについて、従来の方法で分析する。血漿または血液中のＫ、Ｍｇ、Ｃａ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、および／または乳酸を分析する。血液で分析する場合、頭皮血液試料をＬＤＨ測定用の血漿を得る部分と、その他の仮死マーカーを分析するための１つまたは複数の部分とに分ける必要がある。先行技術では既知のその他の方法、例えばマイクロ遠心、マイクロ流体コンパクトディスク法、および磁気泳動を使用して、本発明の頭皮血液試料中の血液細胞から血漿を分離することは、本発明の範囲内である。

【0020】

血漿等の液体中のＬＤＨの分析方法は先行技術では既知であり、これを適用して胎児血液から得られた血清中のＬＤＨを測定することができる。例えば、Ｐｉｎｔｏ Ｐ Ｖ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １５：３３９‐３４９，１９６９を参照。本出願に組み込まれている米国特許第４，８０３，１５９号明細書にて開示されている方法は特に有用である。最後に述べた方法で使用するための装置は、市販されている（ＶｉｔｒｏｓＲＤＴ６０ＩＩ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｏｒｔｈｏ‐Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、米国）。血液中のＫ、Ｍｇ、Ｃａ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、および乳酸を分析する方法は、臨床化学で通常使用されているため、当業者は容易に入手できる。

【0021】

本発明によると、胎児が低酸素状態に陥っている場合、分娩時に膣から採取した胎児頭皮血液中のＬＤＨ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、および乳酸が高値となる。正常分娩では、基準値（ベースライン）は分娩中および／または分娩直後の値と一致している。具体的には、重度の仮死状態（胎児のＨＩＥ発症リスクを上昇させる）に陥っている胎児では、ＬＤＨ、ＡＬＴ、およびＡＳＴ値は、２種類の、具体的には3種類以上のよって上昇する。

【課題を解決するための手段】

【0022】

本発明の好適な態様により、急性仮死がさし迫っているかどうか数分以内に確認するため、少なくとも１種類の、好ましくは多数のマーカーを用いて、ポイント・オブ・ケア・デバイスを提供することを含む、分娩時の頭皮血液試料における低酸素症を確認する方法が開示される。

【0023】

さらに好適な変形形態によると、本デバイスはＫ、Ｍｇ、Ｃａ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、乳酸の中の１種類または数種類の分析手段とさらに連絡している。

【0024】

さらに好適な態様によると、本発明のデバイス／方法を簡便かつ直接使用するための血漿分離デバイスが開示される。

【0025】

ここで本発明について、ほとんどの図面にて例示されている好適であるが実施形態を制限しない説明によって詳細に説明する。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】感度および特異度を示すＲＯＣ曲線。

【図2】本発明の方法の実施形態を図示するブロック線図。

【図3】本発明の方法において、連続的な使用段階における分離デバイスの第１の実施形態の断面図。

【図4】本発明の方法において、連続的な使用段階における分離デバイスの第１の実施形態の断面図。

【図5】本発明の方法において、連続的な使用段階における分離デバイスの第１の実施形態の断面図。

【図6】頭皮血液の採取および検査に使用することを意図した、本発明によるキャピラリーデバイスの実施形態。

【図7】本発明の別の実施形態による迅速検査用分析システム。

【図8】本発明による迅速検査用の使い捨てカードデバイスの実施形態。

【図9】通常本発明とともに取られる措置。

【発明を実施するための形態】

【実施例1】

【0027】

血漿分離カード（Ｍｉｃｒｏｎｉｃｓ社、米国）の膜に健康成人（男性１例、女性１例）の指からキャピラリー採血した血液を入れた。次に膜の反対側を用手的に減圧した。チャンバーのカバーをメスで開け、カード内の血漿採取チャンバーに採取した血漿１０ μｌを電気ピペットで吸引した。３回の連続実験において、吸引した各血漿１０ μｌをＥＫＴＡＣＨＥＭ ＤＴ ６０ ＩＩスライドに入れ、それぞれＬＤＨ、ＡＳＴ、およびＭｇを分析した。ＬＤＨおよびＡＳＴはＶｉｔｒｏｓ ＤＴＳＣモジュール（Ｏｒｔｈｏ−Ｃｌｉｎｉａｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、米国）にて、Ｍｇは同社のＶｉｔｒｏｓ ＤＴ ６０モジュールにて分析した。

【0028】

本法における連続的な使用段階での本発明による血漿分離デバイスを図３〜図５に示す。本デバイス１は、概してポリ（テトラフルオロエチレン）等の疎水性ポリマー材料でできた円形のハウジングを備える。ハウジング内の血漿採取コンパートメント２は、ハウジングと同一または類似の材料でできたグリッド１２により支持される血漿分離膜１１によって閉鎖される上端開口部を有する。コンパートメント底部１３は広角円錐形をしていて、中央部に向かって傾斜している。コンパートメントの側壁１４は、バルブ１６を備えた導管１５へ伸びている。導管１５は、真空ポンプ（図なし）等の陰圧源まで伸びている。図３では、頭皮血液試料７ ４０ μＬは膜１１の外面に蓄積していて、バルブ１６は閉鎖位置にある。バルブ１６を開放するとコンパートメント１４に陰圧がかかる（図４）。それによって血漿７’がコンパートメント１４に吸引され、傾斜した底部１３に蓄積し、血液細胞７’’は膜１１により保持される。バルブ１６を閉じると図５で示される状態になり、膜から空気が吸引されてコンパートメント内の圧が周囲圧力と等しくなる。代替方法として、コンパートメント１４内の圧の等化は、陰圧発生停止後またはその他の適切な方法で、導管１５を介して達成され得る。図５は、吸引シリンジによって血漿試料７がコンパートメント１４から除去される様子を示す。膜１１からシリンジのカニューレ１０を挿入した。膜上の血液細胞によって血漿試料７が汚染されないように、デバイス１の上端または側壁の別の開口部に配置した分離挿入口（図なし）にゴム製隔壁を作成してもよい。図２のブロック線図は、本発明の方法の原理を例示する。

【0029】

コンパートメントは、その底部に蓄積した液体（血漿）の排出能を調節する第２のバルブ手段を備えた底部セクションと連絡するように配列される第２の導管をさらに備えることができる。代替方法として、コンパートメントは、蓄積した血漿中のＬＤＨおよびその他のマーカーを測定する手段を含むことができる。膜の面積は、５ ｍｍ^２〜１０００ ｍｍ^２、具体的には２０ ｍｍ^２〜３００ ｍｍ^２であるのが好適である。

【0030】

頭皮血液分析。ｐＨまたは乳酸を測定するため臨床検査で使用される標準機器を用いて、健康男性成人から採取した頭皮血液の反復分析に成功した。試料については、膣管（実際の状況で、羊水で汚染されないように）を使用する場合と使用しない場合があった。血液試料を血漿分離カードに入れてから結果が表示されるまでの時間は、平均７分であった。分析時間は、本法に適合した機器を使用することで、具体的には電気的手段を使用する等、膜の真空側にかける陰圧と時間が十分にコントロールされる分離カードを使用することで、３〜４分以下等まで、かなり短縮できることは明らかである。したがって、緊急時にベッドサイドで胎児頭皮血液を測定する際に、本発明の方法を使用できることは確実である。

【0031】

測定によると、ＬＤＨ値はキャピラリー中の指の血液より頭皮血液のほうがかなり高く、膣管使用時と非使用時の頭皮血液ではそれぞれ１０４４ Ｕ／Ｌおよび１１２７ Ｕ／Ｌ、指血液では４００ Ｕ／Ｌであった。胎児のグルコースおよびヘモグロビン濃度については、頭皮血液と臍帯血との間に差異が認められている。胎児頭皮血液中のＬＤＨの測定は、当業者にはわからないと考えられる。

【0032】

図６では、患者に近い環境等において、検査結果が７分以内に、好ましくは２分以内に、より好ましくは数秒以内に提示され得る使い捨てカード２およびポイント・オブ・ケア検査用分析装置３を含む本発明によるシステムを示す。図７と合わせて詳細に説明されるとおり、使い捨てカード２には、好ましくは複数の検出セル２０Ａ〜２０Ｅが配置されるが、実際には、用途によってはＬＤＨを検査するカード（ＬＤＨ＋ＡＳＴの場合は２つのセル等）のみで十分と考えられる。

【0033】

図６では、本発明の方法による連続的なステップが提示される。左上に第１ステップが示されており、約１０ μＬ等の量の全血を充填したガラス製キャピラリーデバイス３を用いて新しいカード２に試験血液７が供給される。図７と合わせて詳細に説明されるとおり、連続的なステップでガラス製キャピラリーデバイス４をカード２のコンパートメント２１に挿入し、カード２で血液試料７を遮る。使い捨てカード２を装置３にはめて血液試料７を直接分析した。カードはデバイス（例えば、血漿／血清分布用のマイクロ流体チャネル）を備えており、血液試料７由来の血漿７’が少なくとも１つの検出セル２０Ａ〜２０Ｅに入れるようになり、好ましくは少なくとも１つのその他のセル中の血液細胞およびより好適な全血が少なくとも１つのその他のセルに入れるようになる。検出セルに入る前に、血漿／血清／全血は、試薬（好ましくは乾燥状態）が蓄積している反応チャンバー（２６Ａ〜２６Ｅ）に入る。したがって、反応が生じてから検出される。装置３には、光計測を行う光デバイス（例えば、（参照用に紹介されている）米国特許第４９３５３４号明細書に記載されている）が配置されている。光計測（例えば、米国特許第４８０３１５９号明細書に記載されている吸光度測定法等）は、装置３のプロセッサ３１によって処理され、ディスプレイ３２に表示されるおよび／またはデータ出力３３（例、印刷された紙）として示される。さらに、分析装置３は、好ましくは使い捨てカード２固有のコードを用いてバーコード２２を読み取り・処理可能なバーコード読み取り装置３４を備える。好ましくは、分析装置３はハウジング３５内に収納され、携帯可能である。接続（図なし）によって装置３に必要なサプライ用品、例えば電源（バッテリーで動作するのでなければ）を供給する。代替の実施形態では、例えば装置をラップトップに接続可能にする外部プロセッサを用いて、例えばＵＳＢケーブルを用いて、装置を小型化することができる。

【0034】

図７では、本発明による典型的な使い捨てカード２の実施形態を示す。カード２には、５つの検出セル２０Ａ〜２０Ｅが配置されており、これらはいずれも光学的検出セルである。第１検出セル２０Ａは、ＡＬＴ用である。第２検出セル２０Ｂは、ＡＳＴ用である。第３検出セル２０Ｃは、全ＬＤＨ用である。第４および第５検出セル２０Ｄ、２０Ｅは、それぞれ乳酸およびＭｇ^２＋用である。図示されている実施形態によるカードは円筒形本体２３を有し、扱いやすい直径を有する（例えば、直径２０〜１２０ ｍｍ以内、好ましくは４０〜１００ ｍｍｍ）。本体２３材料は、例えばポリ（テトラフルオロ）エチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン等、幅広い範囲から選択される。図７で図示されるとおり、カード２は、血液試料７を供給するガラス製キャピラリーデバイス４を取り付けるために適合させたチャンバー２１を備えている。チャンバー２１とその底部には、既知の方法にて、例えば血漿分離装置２５（膜２５Ｂおよび血漿採取コンパートメント２５Ａを含む。図３〜図５に示した膜１１と比較する）への血液試料のさらなる輸送を保護するインターフェース２３がある。血漿分離膜２５とインターフェース２３の間には任意選択的に試料スプリッタ２４（点線にて示す）があり、例えばプリント試薬２６Ａ、Ｂを介して全血を一部の検出セルに供給し、それぞれＡＬＴおよびＡＳＴを検出可能にする。次に、より大量の全血試料を血漿分離装置２５に供給し、例えばプリント試薬２６Ｃ、Ｄを介して、それぞれ血漿７’中の全ＬＤＨおよび乳酸が検出可能になる。分離後に得られた血液細胞７’’については、光セル２０Ｅに対応するプリント試薬２６Ｄと混合後に処理し、Ｍｇ^２＋を検出することができる。

【0035】

以下で、検査結果について説明する。本発明による典型的な使い捨てカードには、さまざまな組み合わせのマーカーが使用されている。

【0036】

乳酸脱水素酵素は低酸素状態時には増加を続け、身体の全細胞に存在する。血流にＬＤＨが認められるということは、重度の低酸素症により末梢臓器への血流が減少していることを示している。これは、これらの細胞からのＬＤＨの漏れの始まりである。ＬＤＨが検出されても、どの臓器が低酸素状態であるか判断することはできない。溶血が生じた場合（低酸素症によるものでない場合でも、赤血球破裂がＬＤＨ増加の原因である可能性もある）。溶血は、２つのグループに分けられる。（１）ｉｎ ｖｉｔｒｏ溶血は、採取時または試験管にて貯蔵する際に生じる溶血を意味し、（２）ｉｎ ｖｉｖｏ溶血は、病気を起因として患者体内の赤血球が破裂していることを意味する。低酸素症だけでなく、溶血が続いても誤ってＬＤＨが高値になる。ＬＤＨの半減期（Ｔ_１／２）は、血中に漏れ出すＬＤＨの異性体が５種類のなかのどのタイプかによって異なる。主に心臓、脳、および赤血球中に存在するＬＤＨ１のＴ_１／２は１２０時間で、主に肝臓および筋に認められるＬＤＨ５のＴ_１／２は１０時間である。

【0037】

新生児を対象とする本試験では、ＨＩＥを有する患児全員および健康児１８４例中１７８例について、マーカーとしてＬＤＨを用いて確認した。これは低酸素症例の見落としがなく、６例が受けた帝王切開および器械使用分娩が不要であったことを意味する。

【0038】

ＬＤＨ高値は、現在または最近、身体のどこかの部位が低酸素症に陥っている、あるいは溶血が生じていることを示す。

【0039】

ＡＳＴは身体の多くの臓器に存在する酵素であるが、ＬＤＨよりも臓器に対する特異性が高い。ＡＳＴは主に肝臓、筋、および赤血球に存在する。ＡＳＴおよびＬＤＨは溶血に感受性を示すが、程度は異なる。新生児のＡＳＴのＴ_１／２は、１２〜１５時間である。

【0040】

新生児を対象とする本試験では、ＨＩＥを有する患児全員および健康児２３６例中２１０例について、マーカーとしてＡＳＴを用いて確認した。これは低酸素症例の見落としがなく、２６例が受けた帝王切開および器械使用分娩が不要であったことを意味する。

【0041】

ＡＳＴ高値は、現在または最近、肝臓または筋が低酸素症に陥っている、あるいは溶血が生じていることを示す。

【0042】

ＡＬＴは肝臓に特異的な酵素であり、溶血の影響はほとんど受けない。ＡＬＴのＴ_１／２は３６時間である。

【0043】

本試験では、ＡＬＴを単一マーカーとして使用した場合、脳損傷症例の見落としはないが、健康児２４０例中２８例が受けた帝王切開および器械使用分娩が不要であったと考えられる。

【0044】

ＡＬＴ高値は、現在または以前に肝臓が低酸素症に陥ったことを示している。

【0045】

体内のマグネシウムは骨格に最大５０％、細胞内に最大５０％存在する。例えば、低酸素症時にアシドーシスが生じた場合（ｐＨ低下）、水素イオンが細胞内に移動する。同時にＭｇが細胞内から血中へ輸送され、血中Ｍｇ濃度が上昇する。ＨＩＥを有する新生児の場合、Ｍｇ濃度は健康児より低い。Ｍｇは、細胞障害よりも優れたアシドーシス・マーカーである。

【0046】

Ｍｇ高値は、低酸素症の症状であるアシドーシスの指標である。Ｍｇ低値は、脳損傷を来した低酸素症歴の指標である。

【0047】

現段階では、分娩時のＭｇに関するデータはない。しかし、われわれはブタ新生児に関する動物試験で確認されたＭｇ高値を信頼している。

【0048】

下表は、マーカーとしてＬＤＨ＋ＡＳＴを使用した結果を示す。

【0049】

これらの知見から、健康新生児はいずれもＡＳＴおよび／またはＬＤＨ低値であることが示されている。ＨＩＥを有する新生児１０例全員が、ＡＳＴおよびＬＤＨのどちらも高値であった。ＡＳＴおよびＬＤＨ高値の新生児でＨＩＥを発症しなかったのは３例であった。ＡＳＴは、新生児が健康である時期を確認するためのＬＤＨの利用効果を増大させる。

【0050】

ＬＤＨおよびＡＳＴが高値の場合、低酸素症および溶血である。

【0051】

下表は、マーカーとしてＬＤＨ＋ＡＬＴを使用した結果を示す。

【0052】

上表は、ＬＤＨおよびＡＬＴを同時に分析した場合、健康新生児全員のＡＬＴおよび／またはＬＤＨが低値であることを示している。ＨＩＥを有する新生児１０例全員が、ＡＬＴおよびＬＤＨのどちらも高値であった。ＡＳＴおよびＬＤＨ高値の新生児でＨＩＥを発症しなかったのは１例であった。ＡＬＴは、新生児が健康である時期を確認するためのＬＤＨの利用効果を増大させる。

【0053】

ＡＬＴは長時間（Ｔ_１／２は３６時間）血中に残るため、早期（胎内で）に新生児が低酸素症を発症していたかどうかが理論的にわかることから、重要である。

【0054】

ＬＤＨおよびＡＬＴ高値は、肝臓（その他の臓器のなかで）に影響を及ぼす低酸素症を示す。

【0055】

下表は、マーカーとしてＬＤＨ＋ＡＬＴ＋ＡＳＴを使用した結果を示す。

【0056】

ＬＤＨ、ＡＳＴ、およびＡＬＴを一緒に分析し、すべての酵素が低値であった場合、ＨＩＥを有する新生児は認められないと考えられる。この３種類のマーカーが高値のときに、ＨＩＥを有する新生児全員が確認される。ＨＩＥが認められない、不要な分娩にて生まれた新生児は１例である。

【0057】

ＬＤＨ＋ＡＬＴ＋ＡＳＴ高値は現在の低酸素症または過去数時間における低酸素症を示している。ＡＬＴの半減期が２４時間で、ＡＳＴやＬＤＨより長いという事実から、この組み合わせによって低酸素症の時間態様が得られる可能性もある。例えば、ＬＤＨ＋ＡＬＴ＋ＡＳＴがすべて高値であり、なおかつ出生後も２４時間にわたって上昇している場合、分娩直近に低酸素症が発症したことを示している。

【0058】

実際にこれらの計算で使用される資料では、低酸素症の指標（ＨＩＥ、アシドーシス、アプガースコア低値）が認められないグループに対し、帝王切開２３件および器械使用分娩２２件が施行された。新生児に害を与えることが疑われたため、本明細書では帝王切開のみを対象とする。

【0059】

上の実施例では、ＬＤＨとＡＬＴを併用することによって、不要な分娩にて生まれるのが４５例ではなく、１例のみで済んでいる。これによって帝王切開のみにかかる費用が８８００００ＳＥＫ（スウェーデンクローナ）削減される。吸引分娩費用は含まれない。吸引分娩は母子ともに損傷リスクが高くなり、ヘルスケア費が発生するとともに患者の負担も増える。

【0060】

上述のとおり、新生児が低酸素症を発症しているかどうか確認する際、本法ではＡＳＴからはさほど情報を得られない。ＡＳＴは半減期が１２時間であるため、依然として情報源となる。ＡＬＴとともに、出生後の試料を繰り返し採取した場合、この２つの酵素から低酸素症がいつ発症したかに関する情報が得られる。今日の産科医には、低酸素症を見逃したのかどうか、あるいは分娩のため女性が病院に到着した時点で、すでに患児が低酸素症を発症していたのかどうか、証明すべき問題を抱えているため、これは法律的に価値が高い。

【0061】

科学文献から得られた情報に基づく結論によると、マグネシウムよって低酸素症が存在しているのか、あるいは過去に発症したのかに関する知識が得られる。

【0062】

ＬＤＨ＋ＡＬＴ＋ＡＳＴ＋Ｍｇ高値は、末梢臓器に影響を及ぼし、アシドーシスを引き起こすほど重度の低酸素症が続いていることを示す。ＬＤＨ＋ＡＬＴ＋ＡＳＴは高値であるが、Ｍｇは低値の場合、臓器損傷を引き起こし、おそらく脳に影響を及ぼすおそれのある低酸素症を最近発症したことが示される。Ｍｇは溶血には感受性を示さないため、ＡＬＴと一緒にＬＤＨ高値が溶血ではなく、臓器損傷を起因とするものであることを強調する。

【0063】

以下で、本発明の方法およびデバイスを実際に使用したときの実施例について説明する。アンナという名の患者が分娩室に到着し、分娩すると仮定する。スタッフが、女性の胃の上に装着した機器を用いて心拍数を測定することにより、胎児の状態コントロールを開始する（胎児心拍数パターン、ＣＴＧ）。一定間隔でＣＴＧをコントロールし、考え得る変化を観察する。陣痛が開始して８時間後、子宮口が８ ｃｍ開いていた。新たなＣＴＧコントロール時に、心拍数が増加していることが示された。助産婦は、産科医を呼ぶ。産科医は、病気の徴候が認められるかどうか確認するため、新生児の頭皮から引き続き試料を採取しようと考えている。

【0064】

側臥位を取っていたアンナに内診の体位になるよう指示し、産科医は金属管を膣に通し、胎児の頭皮に押し付ける。羊水を洗い流し、胎児の頭皮に小さな切れ込みを入れる（頭皮試料）。少量の血液７を確認すると、キャピラリー管４を持って、血液約１０ μｌを採取する。（細管から採血しながら清潔かつ迅速に作業することは容易なことではない。このような場合、３０〜４０ μｌという量はかなり多めである。これは頭皮試料でｐＨを測定する際に必要とされる量である）。

【0065】

助産婦は産科医の傍らで使い捨てカード２を持ち、そこに医師がキャピラリー管４を挿入する。血液７の入ったカード２を横に配置された検出装置３に入れる。ここで分光計４によってＬＤＨ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、およびマグネシウム濃度が分析される。カード２上で赤血球７’’が分離されると分析が始まり、残存する血漿７’がカード上の試薬２０Ａ〜２０Ｄと反応する。２分後、装置のディスプレイ上に結果が表示される。表示が「正常―正常―正常―正常」であると、マーカーであるＬＤＨ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、およびマグネシウムは、いずれも高値ではないことが産科医にわかる。アンナは自然な手段で分娩を続け、その後、健康児を出産する。

【0066】

その後、同夜、産科医は、ヘレナが第一児を出産している部屋に呼ばれる。ここでもＣＴＧは満足のいくものではないため、頭皮試料を採取する。このとき、表示が「高―高―高―高」であると、全マーカーが高値であることが産科医にわかる。これは、胎児が現在低酸素症に陥っていて、緊急帝王切開を決断しなければならないことを意味しているにすぎない。手術を知らせるアラームが鳴り、ヘレナはベッドに寝たまま手術室へ急いで連れてこられる。迅速麻酔を行ない、産科医は手を洗って手術着に着替える。次に皮膚を切開し、アラームが鳴ってわずか数分後に胎児を取り出す。

【0067】

上述のとおり、溶血に感受性を示すマーカーもある。溶血が本法に及ぼす影響については、現段階では完全には検討されていないが、転帰がさほど変わらない症例もある。しかし、試料採取中に溶血が頻繁に生じる場合は、カードに溶血用マーカーを統合する。もっとも考えられるシナリオは、第１選択マーカーとして遊離型ヘモグロビンを使用することである。血漿中のＨｂ値を測定することで溶血に関する情報が得られ、その情報があれば、溶血の重症度もつかめると考えられる。溶血の程度によっては、酵素値を考慮に入れて、再計算することもできる。

【0068】

分析法が比色定量法（試薬の色の変化）である場合、状況次第では、ＬＤＨ単独またはＬＤＨと乳酸、ＡＬＴ、ＡＳＴ、またはマグネシウム等との併用によって、胎児の状態を判断することができる。

【0069】

図８では、固相化学を用いて分析を行う、代替の試験装置の実施形態を示す。図８に示される検査デバイス５の利点は、電源が不要である点である。検査デバイス５には、本体／ケーシングに形成される細長い管が配置される。長形の本体５０内部には、ハウジング５０の前端近くに配置される前チャンバー５２へと開通するチャネル５１がある。チャネル５１のもう１つの端部、ハウジング５０の後端近くには、ポンプデバイス５３がある。弾性の中空体の形状をしたポンプデバイス５３には、そのアウトレット端部にチェックバルブ５４が配置される。アウトレットは、（チェックバルブ５４から）使い捨てコンパートメント５５へと開通する。ハウジング５０の前端にはカラーデバイス５６が配置され、中央部にはフィルタ５８を介して前チャンバー５２と連絡する穴５７がある。フィルタは、濾過して血液細胞を取り除く。前端より一定の距離を置いて、チャネル５１の一部を形成している、固相化学手段８が配置されるさらなるチャンバー５９がある。また、ポンプデバイス５３に隣接するチャネル５１の一部として、バッファーを生じるさらなるチャンバー５０１が配置され、チャネル５１内の血液７量に関する指標となる。

【0070】

図８に示される検査デバイスは、分娩時の使用に適応している。図８で図示されるとおり、小児の頭皮６に穿刺しして少量の血液７を採取する（それ自体が衆知される）。その後、血液受け７周囲にカラー５６を配置することで、検査デバイス５を膣から入れ、血液試料にあてる。次のステップでは、弾性ポンプデバイス５３の中空内部から空気を逃がすようにチェックバルブ５４が開くポンプ機構５３を作動させる。チャネル５１を介して血液受け７と連絡するポンプデバイス５３開放時に真空が生じ（弾力性のおかげで）、それによって血液はフィルタ５８を介してチャネル５１に吸引される。したがって、血漿７’は分析チャンバー５９に入る。ポンプ機構を何度も適用して十分な検査用血液を確保する。バッファー用チャンバー５０１中で血液が確認されると、血液量が測定される。その後、検査デバイス５を除去し、分析チャンバー５９において化学手段の色を観察することで胎児が低酸素症に陥っているかどうかを確認できる。それ自体が衆知されているように、固相化学手段８を用いて、提示されている色に応じて講じるべき様々な措置を示すことができる。例えば、以下の色を用いて、どの措置を取るべきか示す。緑色が示された場合、取るべき措置はない。赤色が提示された場合、可能な限り迅速に胎児を取り出す。黄色が示された場合、２０分以内に新たに試料を採取する。

【0071】

臨床的に、検査デバイス５から上述のような同様の指標が得られる。胎児頭皮から採血するためのキャピラリー管を若干改良した検査デバイス５を併用できることは明らかであるが、好ましくは、採血の際にデバイス５内部に閉鎖システムが生じるようなデザインにする。これは例えばシリコンカラー（図）で胎児の頭部にあてた上端を押すまたはデバイス５を除去して上端に厳封した蓋を装着する（図なし）など、さまざまな方法で実現可能である。

【0072】

われわれは、現在使用されている乳酸検査は、本発明の方法と組み合わせて分析できる。

【0073】

図９において、好ましくは本発明による方法およびデバイスを使用するタイミングに関するフローチャートを示す。フローチャートで示されるとおり、ＣＴＧは、好ましくは主要指標として使用すべきである。ＣＴＧが正常である場合、通常の措置を取る。しかし、ＣＴＧが異常である場合、本発明により胎児の頭皮から直接採血する、あるいは胎児の心臓をＳＴ解析することで進めることもできる。

【0074】

本発明は、上述の内容によって制限されるものではないが、添付の請求項の適用範囲内で異なる場合がある。例えば、「胎児血液」、あるいは身体のその他の部位から採取した血液試料の定義は、時に本発明による利益を得るために機能することは、当業者にとって明らかである。本発明と合わせて使用する試料は全血、血漿、および血清である。

【0075】

さらに当業者は、例えばプラスチック等の代わりにガラスまたはその他の適切な材料を使用する等、上の記述から逸脱し、発明の技術を使用せずにさまざまな変更形態を実行可能であることを理解している。

【符号の説明】

【0076】

１デバイス
２使い捨てカード
３検査用分析装置
４ガラス製キャピラリー
５（代替）検査デバイス
６頭皮
７血液試料
７‘血漿
７‘’血液細胞
８固相化学手段
１０カニューレ
１１膜
１２グリッド
１３コンパートメントの底部
１４コンパートメントの側壁
１５導管
１６バルブ
２０検出セル
２１チャンバー
２２バーコード
２３インターフェース
２４試料スプリッタ
２５血漿分離デバイス
２６プリント試薬
３０デバイス
３１プロセッサ
３２ディスプレイ
３３データ出力
３４バーコード読み取り装置
３５ハウジング
５１チャネル
５２前チャンバー
５３ポンプデバイス
５４チェックバルブ
５５使い捨てコンパートメント
５６カラーデバイス
５７穴
５８フィルタ
５９分析チャンバー
５０１バッファー用チャンバー

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】