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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5663089
(24)【登録日】2014年12月12日
(45)【発行日】2015年2月4日
(54)【発明の名称】顕微鏡画像からの自動全血試料分析のための方法および装置
(51)【国際特許分類】
G01N 33/48 20060101AFI20150115BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20150115BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20150115BHJP
G01N 1/28 20060101ALI20150115BHJP
G01N 1/30 20060101ALI20150115BHJP
【ＦＩ】
G01N33/48 M
G01N21/64 Z
G01N33/48 P
G01N33/48 Z
G01N33/50 K
G01N1/28 J
G01N1/30
【請求項の数】25
【全頁数】25
(21)【出願番号】特願2013-523365(P2013-523365)
(86)(22)【出願日】2011年8月5日
(65)【公表番号】特表2013-535686(P2013-535686A)
(43)【公表日】2013年9月12日
(86)【国際出願番号】US2011046787
(87)【国際公開番号】WO2012019118
(87)【国際公開日】20120209
【審査請求日】2013年3月27日
(31)【優先権主張番号】61/371,020
(32)【優先日】2010年8月5日
(33)【優先権主張国】US
(73)【特許権者】
【識別番号】501354521
【氏名又は名称】アボット ポイント オブ ケア インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100068021
【弁理士】
【氏名又は名称】絹谷 信雄
(72)【発明者】
【氏名】ハーゾグ，デイビッド
(72)【発明者】
【氏名】ワン，ジーズー
(72)【発明者】
【氏名】ワードロー，スティーヴン
(72)【発明者】
【氏名】シェ，ミン
【審査官】
草川 貴史
(56)【参考文献】
【文献】
特表２００２−５０６２０８（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２００９／１１７６８３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特表２００９−５２８０４３（ＪＰ，Ａ）
【文献】
Alfred R. J. Katz，Image Analysis and Supervised Learning in the Automated Differentiation of White Blood Cells from Microscopic Images (2000) ，Master thesis，２０００年
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８
Ｇ０１Ｎ １／２８
Ｇ０１Ｎ １／３０
Ｇ０１Ｎ ２１／６４
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
未希釈全血試料内の白血球の少なくとも１つのタイプを識別する方法であって、
前記未希釈全血試料に少なくとも１つの着色剤を加えて混合試料を作製する工程であって、前記着色剤が、白血球の少なくとも１つのタイプを別の白血球のタイプから差別的に識別するように機能する工程と、
前記混合試料を少なくとも１枚の透明パネルによって規定されたチャンバ内に配置する工程と、
前記チャンバ内に静止して存在する前記混合試料の少なくとも１つの画像を蛍光励起光源を用いて作成する工程と、
前記チャンバ内に静止して存在する前記混合試料の少なくとも１つの画像を透過光源を用いて作成する工程と、
前記画像の白血球に起因する部分をプログラム可能分析装置を用いて識別する工程と、
前記混合試料内の白血球の少なくとも１つのタイプを前記プログラム可能分析装置を用いて識別する工程であって、前記蛍光励起光源を用いて作成された前記画像の白血球に起因する部分と前記透過光源を用いて作成された前記画像の白血球に起因する部分とを１つ以上の規定の定量的に決定可能な特徴と比較して定量的に分析すると共に、前記１つ以上の規定の定量的に決定可能な特徴に基づいて前記混合試料内の白血球の少なくとも１つのタイプを識別する工程と、
を含む方法。
前記未希釈全血試料に少なくとも１つの着色剤を加えて混合試料を作製する工程であって、前記着色剤が、白血球の少なくとも１つのタイプを別の白血球のタイプから差別的に識別するように機能する工程と、
前記混合試料を少なくとも１枚の透明パネルによって規定されたチャンバ内に配置する工程と、
前記チャンバ内に静止して存在する前記混合試料の少なくとも１つの画像を蛍光励起光源を用いて作成する工程と、
前記チャンバ内に静止して存在する前記混合試料の少なくとも１つの画像を透過光源を用いて作成する工程と、
前記画像の白血球に起因する部分をプログラム可能分析装置を用いて識別する工程と、
前記混合試料内の白血球の少なくとも１つのタイプを前記プログラム可能分析装置を用いて識別する工程であって、前記蛍光励起光源を用いて作成された前記画像の白血球に起因する部分と前記透過光源を用いて作成された前記画像の白血球に起因する部分とを１つ以上の規定の定量的に決定可能な特徴と比較して定量的に分析すると共に、前記１つ以上の規定の定量的に決定可能な特徴に基づいて前記混合試料内の白血球の少なくとも１つのタイプを識別する工程と、
を含む方法。
【請求項2】
前記蛍光励起光源を用いて作成された前記画像の白血球に起因する部分と前記透過光源を用いて作成された前記画像の白血球に起因する部分とを１つ以上の規定の定量的に決定可能な特徴と比較して定量的に分析する工程が、光強度、光の色味、光学密度または幾何学的形状の少なくとも１つに基づいて定量的に分析する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記１つ以上の規定の定量的に決定可能な特徴が、極大部分の数、大型顆粒の比率、核の比率、赤色−緑色比、核の輝度または細胞質の輝度の少なくとも１つを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記１つ以上の規定の定量的に決定可能な特徴が、核の輝度であり、前記蛍光励起光源を用いて作成された前記画像の白血球に起因する部分と前記透過光源を用いて作成された前記画像の白血球に起因する部分とを１つ以上の規定の定量的に決定可能な特徴と比較して定量的に分析する工程が、核内の緑色蛍光強度値を決定すると共に平均緑色蛍光強度値を決定する工程を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記１つ以上の規定の定量的に決定可能な特徴が、細胞質の輝度であり、前記蛍光励起光源を用いて作成された前記画像の白血球に起因する部分と前記透過光源を用いて作成された前記画像の白血球に起因する部分とを１つ以上の規定の定量的に決定可能な特徴と比較して定量的に分析する工程が、白血球内の細胞質内の赤色蛍光強度値を決定すると共に平均赤色蛍光強度値を決定する工程を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項6】
前記蛍光励起光源を用いて作成された前記画像の白血球に起因する部分と前記透過光源を用いて作成された前記画像の白血球に起因する部分とを１つ以上の規定の定量的に決定可能な特徴と比較して定量的に分析する工程が、光学密度値を決定する工程を含み、前記１つ以上の規定の定量的に決定可能な特徴が、所定の波長での平均細胞吸光度または所定の波長での細胞吸光組織の少なくとも１つを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項7】
前記１つ以上の規定の定量的に決定可能な特徴が、所定の波長での細胞吸光組織であり、前記蛍光励起光源を用いて作成された前記画像の白血球に起因する部分と前記透過光源を用いて作成された前記画像の白血球に起因する部分とを１つ以上の規定の定量的に決定可能な特徴と比較して定量的に分析する工程が、４０５〜４２５ｎｍの波長範囲内にある前記混合試料への透過光と関連する光学密度値を決定すると共に平均光学密度値を決定する工程を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記１つ以上の規定の定量的に決定可能な特徴が、細胞領域および核領域の一方または両方を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項9】
前記１つ以上の規定の定量的に決定可能な特徴が、核の組織および細胞質の組織の一方または両方を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項10】
前記１つ以上の規定の定量的に決定可能な特徴が、核の組織であり、前記蛍光励起光源を用いて作成された前記画像の白血球に起因する部分と前記透過光源を用いて作成された前記画像の白血球に起因する部分とを１つ以上の規定の定量的に決定可能な特徴と比較して定量的に分析する工程が、核内の緑色蛍光強度値を決定すると共に平均緑色蛍光強度値を決定する工程を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記１つ以上の規定の定量的に決定可能な特徴が、細胞質の組織であり、前記蛍光励起光源を用いて作成された前記画像の白血球に起因する部分と前記透過光源を用いて作成された前記画像の白血球に起因する部分とを１つ以上の規定の定量的に決定可能な特徴と比較して定量的に分析する工程が、白血球内の細胞質内の赤色蛍光強度値を決定すると共に平均赤色蛍光強度値を決定する工程を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項12】
前記１つ以上の規定の定量的に決定可能な特徴が、核の中空度および細胞質の中空度の一方または両方を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項13】
前記画像の白血球に起因する部分をプログラム可能分析装置を用いて識別する工程が、前記画像内の白血球を識別するためのセグメンテーション技術を使用する工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項14】
前記蛍光励起光源を用いて作成された前記画像の白血球に起因する部分と前記透過光源を用いて作成された前記画像の白血球に起因する部分とを１つ以上の規定の定量的に決定可能な特徴と比較して定量的に分析する工程が、前記画像の白血球に起因する部分の各々について前記１つ以上の規定の定量的に決定可能な特徴の各々についての定量値を決定する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記１つ以上の規定の定量的に決定可能な特徴の各々が、白血球のタイプと関連するトレーニング画像のセットに対して決定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記蛍光励起光源を用いて作成された前記画像の白血球に起因する部分と前記透過光源を用いて作成された前記画像の白血球に起因する部分とを１つ以上の規定の定量的に決定可能な特徴と比較して定量的に分析する工程が、前記定量値をルールベース分類器を用いて比較する工程をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項17】
前記蛍光励起光源を用いて作成された前記画像の白血球に起因する部分と前記透過光源を用いて作成された前記画像の白血球に起因する部分とを１つ以上の規定の定量的に決定可能な特徴と比較して定量的に分析する工程が、前記定量値を学習モデルベース分類器を用いて比較する工程をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項18】
前記学習モデルベース分類器が、ベイズ分類器である、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記学習モデルベース分類器が、サポートベクターマシン線形分類器である、請求項１７に記載の方法。
【請求項20】
前記学習モデルベース分類器が、神経回路網モデルである、請求項１７に記載の方法。
【請求項21】
前記混合試料内の白血球の少なくとも１つのタイプを前記プログラム可能分析装置を用いて識別する工程が、リンパ球、好中球、単球および好酸球の１つ以上を識別する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項22】
リンパ球が、極大部分の数、細胞領域、核の比率および核の形状からなる群からの１つ以上の特徴を使用して識別される、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
好中球が、極大部分の数、細胞領域、核の比率および核の形状からなる群からの１つ以上の特徴を使用して識別される、請求項２１に記載の方法。
【請求項24】
単球が、極大部分の数、細胞領域および核の比率からなる群からの１つ以上の特徴を使用して識別される、請求項２１に記載の方法。
【請求項25】
好酸球が、所定の波長での平均細胞吸光度および所定の波長での細胞吸光組織および大型顆粒の比率からなる群からの１つ以上の特徴を用いて識別される、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０１０年８月５日に出願された米国仮特許出願第６１／３７１，０２０号明細書に開示された対象物の利益を主張し、前記特許出願を本質的に参照することにより組み込むものである。
【0002】
本発明は、一般に顕微鏡画像から全血試料に関する分析を実施するための方法および装置、ならびに特に同一物の自動バージョンに関する。
【背景技術】
【0003】
医療診断法は、患者由来の全血試料の分析を含むことが多い。より一般的に行われる診断法の１つは全血球算定（「ＣＢＣ」と呼ばれる）であり、細胞成分の計数に加えて、赤血球計量、網状赤血球算定および血液試料中に存在する白血球（ＷＢＣ）のタイプの識別および計数である白血球分画（「ＬＤＣ」、時には「白血球百分率」と呼ばれる）を含むことができる一連の試験である。
【0004】
歴史的には、ＣＢＣの様々な態様は計数のために使用される方法とは別個の方法を用いて実施されてきた。例えば、ＣＢＣのＬＤＣ部分は、歴史的には少量の未希釈血液をスライド上に塗布し、乾燥させて固定した塗抹を染色し、該塗抹を顕微鏡下で検査することによって実施されてきた。そのような塗抹から合理的な結果を得ることはできるが、データの精度および信頼性は、技術者の経験および技術に大きく左右される。血液塗抹は、幾つかの理由のために問題が多い。例えば、細胞を死滅させて固定されなければならず、このプロセスはそれらの結果が生細胞に左右される多数のタイプの超生体染色および分析を除外し、そして血液塗抹は大きな労働力を必要とし、法外な費用がかかり、時間を消費する。少なくともこれらの理由のため、血液塗抹は一般に商業的用途のためには不都合である。
【0005】
全血試料の分析を自動化する試みは一部には成功を得てきたが、典型的には幾つかの欠点がある。ＬＤＣを実施するためには、例えば電気インピーダンスまたは光学的フローサイトメトリ機器を使用できる。フローサイトメトリは、希釈血液試料を小さな容器に通過させる工程を含み、電気インピーダンスまたは光センサはそれらが連続的に容器を通過するにつれて構成細胞を評価することができる。これらの機器は、典型的には流体操作装置を必要とし、試料の希釈を必要とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
そこで必要とされるのは、分析を実施するために必要とされる時間、分析を実施するために必要とされるオペレータの技術レベルを含む先行技術の制限を克服できる、ＬＤＣを含む全血試料上で自動分析を実施するための装置および方法であって、公知の先行技術の方法および装置より大きな多用途性を提供できる装置および方法である。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の１つの態様によると、全血試料内の白血球（ＷＢＣ）の少なくとも１つのタイプを識別する方法であって、ａ）該全血試料へ少なくとも１つの着色剤を加える工程であって、該着色剤は少なくとも１つのＷＢＣタイプを別のＷＢＣタイプから差別的に識別するために機能する工程と、ｂ）該血液試料を少なくとも１枚の透明パネルによって規定された１つのチャンバ内に配置する工程と、ｃ）該チャンバ内に静止して存在する該試料の少なくとも１つの画像を作成する工程と、ｄ）該試料画像内のＷＢＣを識別する工程と、ｅ）該画像内で識別されたＷＢＣの少なくとも一部を１つ以上の規定の定量的に決定可能な特徴と比較して定量的に分析する工程と、ｆ）ＷＢＣの少なくとも１つのタイプを該識別されたＷＢＣから該定量的に決定可能な特徴を用いて識別する工程と、を含む方法が提供される。
【0008】
本発明のまた別の態様によると、チャンバ内に静止して存在する全血試料を分析するための装置が提供される。この装置は、対物レンズ、試料照明装置、解像機構およびプログラム可能分析装置を含む。試料照明装置は、蛍光励起光および１つ以上の透過光を提供するために機能する。解像機構は、試料から発光された蛍光および該試料を通過した透過光の一方または両方を受け入れ、そのような光に代表的な信号を生成するために適合する。プログラム可能分析装置は、該光に代表的な信号を受け入れ、該チャンバ内に静止して存在する該試料の少なくとも１つの画像を作成するために適合する。プログラム可能分析装置は、該画像内のＷＢＣを識別するために該画像を定量的に分析し、１つ以上の規定の定量的に決定可能な特徴に比較して該画像内の識別されたＷＢＣの少なくとも一部を定量的に分析するためにさらに適合する。該プログラム可能分析装置は、ＷＢＣの少なくとも１つのタイプを該識別されたＷＢＣから該定量的に決定可能な特徴を使用して識別および計数するために機能する。
【0009】
本発明のまた別の態様によると、生体試料内の１つ以上の標的成分を識別するための方法が提供される。本方法は、ａ）該試料へ少なくとも１つ着色剤を加える工程であって、該着色剤は該試料内の標的成分を識別するために機能する工程と、ｂ）該試料を少なくとも１枚の透明パネルによって規定された１つのチャンバ内に配置する工程と、ｃ）該チャンバ内に静止して存在する該試料の少なくとも１つの画像を作成する工程と、ｄ）該試料画像内の標的成分を識別する工程と、ｅ）１つ以上の規定の定量的に決定可能な特徴と比較して該画像内で識別された標的成分の少なくとも一部を定量的に分析する工程と、ｆ）該識別された標的成分内の少なくとも１つのタイプの標的成分を該定量的に決定可能な特徴を使用して識別する工程と、を含む。
【0010】
本発明のこれらやその他の目的、特徴および利点は、以下に提供する本発明についての詳細な説明を参照すれば、添付の図面に例示したように明白になる。
【0011】
本発明の原理は、以下の図面を参照することによってさらに明確になる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図5】（ａ）はリンパ球の合成画像、（ｂ）は好中球の合成画像、（ｃ）は好酸球の合成画像、（ｄ）は単球の合成画像である。
【図6】（ａ）はリンパ球からの赤色蛍光の画像、（ｂ）は好中球からの赤色蛍光の画像、（ｃ）は好酸球からの赤色蛍光の画像、（ｄ）は単球からの赤色蛍光の画像である。
【図7】（ａ）はリンパ球からの緑色蛍光の画像、（ｂ）は好中球からの緑色蛍光の画像、（ｃ）は好酸球からの緑色蛍光の画像、（ｄ）は単球からの緑色蛍光の画像である。
【図8】（ａ）はリンパ球についての赤線によって表示された細胞境界を備える青色波長での光学密度の画像を示す図、（ｂ）は好中球についての赤線によって表示された細胞境界を備える青色波長での光学密度の画像を示す図、（ｃ）は好酸球についての赤線によって表示された細胞境界を備える青色波長での光学密度の画像を示す図、（ｄ）は単球についての赤線によって表示された細胞境界を備える青色波長での光学密度の画像を示す図である。
【図9】（ａ）は規定強度を超える赤色および緑色蛍光を描出する隣接ピクセルがリンパ球に対してマスキングされている細胞の画像、（ｂ）は規定強度を超える赤色および緑色蛍光を描出する隣接ピクセルが好中球に対してマスキングされている細胞の画像、（ｃ）は規定強度を超える赤色および緑色蛍光を描出する隣接ピクセルが好酸球に対してマスキングされている細胞の画像、（ｄ）は規定強度を超える赤色および緑色蛍光を描出する隣接ピクセルが単球に対してマスキングされている細胞の画像である。
【図10】（ａ）は規定強度を超える緑色蛍光を描出する隣接ピクセルがリンパ球に対してマスキングされている細胞の画像、（ｂ）は規定強度を超える緑色蛍光を描出する隣接ピクセルが好中球に対してマスキングされている細胞の画像、（ｃ）は規定強度を超える緑色蛍光を描出する隣接ピクセルが好酸球に対してマスキングされている細胞の画像、（ｄ）は規定強度を超える緑色蛍光を描出する隣接ピクセルが単球に対してマスキングされている細胞の画像である。
【図11】（ａ）はリンパ球のための緑色蛍光チャネル内の局所最高強度を描出している隣接ピクセルの１つ以上の群を含む画像、（ｂ）は好中球のための緑色蛍光チャネル内の局所最高強度を描出している隣接ピクセルの１つ以上の群を含む画像、（ｃ）は好酸球のための緑色蛍光チャネル内の局所最高強度を描出している隣接ピクセルの１つ以上の群を含む画像、（ｄ）は単球のための緑色蛍光チャネル内の局所最高強度を描出している隣接ピクセルの１つ以上の群を含む画像である。
【図12】（ａ）は規定閾値を超える青色ＯＤを有する隣接ピクセルがリンパ球に対してマスキングされている細胞の画像、（ｂ）は規定閾値を超える青色ＯＤを有する隣接ピクセルが好中球に対してマスキングされている細胞の画像、（ｃ）は規定閾値を超える青色ＯＤを有する隣接ピクセルが好酸球に対してマスキングされている細胞の画像、（ｄ）は規定閾値を超える青色ＯＤを有する隣接ピクセルが単球に対してマスキングされている細胞の画像である。
【図13】図１３は、極大部分（Lobe）の数と対比させた、リンパ球、好中球、好酸球および単球の各々についての試料画像のトレーニングセットから収集された経験的データ（ｐｄｆ（確率分布密度関数）の形態にある）を描出しているグラフである。用語「確率分布密度関数」は、１つの特徴が特定値を有する可能性を記載する。極大部分の数のような離散値を備える特徴については、ｐｄｆは、１つの特徴が特定値を有する頻度と同一である。例えば、図１３は、集団内のリンパ球の約８３％が１つだけの極大部分を有し、該リンパ球の１５％が２つの極大部分を有することを示している。この極大部分の数は試料画像から計算されるので、そこで画像の不完全度および画像分析アルゴリズムの限界に起因して実際の生体成分とは相違する数値を有する可能性があることに留意されたい。画像について計算された全ての特徴はそれらの対応する生物学的特徴の近似値であり、ある程度の不正確さが内在する。しかし本発明下では、これらの内在する不正確さは、分析（例えば、ＬＤＣ）中に複数の特徴を一緒に利用することによって大きく減少させることができ、それにより高度の精度を有する分析を生じさせることができる。
【図14】図１４は、上記のＷＢＣの各々について決定された細胞領域と対比させた、リンパ球、好中球、好酸球および単球の各々についてのトレーニングセットから収集された経験的データ（ｐｄｆ（確率分布密度関数）の形態にある）を描出しているグラフである。
【図16】図１６は、上記のＷＢＣの各々についての大型顆粒の比率と対比させた、リンパ球、好中球、好酸球および単球の各々についてのトレーニングセットから収集された経験的データ（ｐｄｆの形態にある）を描出しているグラフである。
【図17】図１７は、上記のＷＢＣの各々についての核の比率と対比させた、リンパ球、好中球、好酸球および単球の各々についてのトレーニングセットから収集された経験的データ（ｐｄｆの形態にある）を描出しているグラフである。
【図18】図１８は、上記のＷＢＣの各々についての赤色−緑色比と対比させた、リンパ球、好中球、好酸球および単球の各々についてのトレーニングセットから収集された経験的データ（ｐｄｆの形態にある）を描出しているグラフである。
【図20】図２０は、図１９に示した画像の、マスキング領域の境界にある（すなわち、核の境界にある）ピクセルだけを強調表示した、図心と関連境界ピクセルとの間に伸びる説明のための小数の位置決め線分を含む変形である。
【図21】図２１は、上記のＷＢＣの各々についての核の形状と対比させた、リンパ球、好中球、好酸球および単球の各々についてのトレーニングセットから収集された経験的データ（ｐｄｆの形態にある）を描出しているグラフである。
【図22】図２２は、上記のＷＢＣの各々についての細胞の形状と対比させた、リンパ球、好中球、好酸球および単球の各々についてのトレーニングセットから収集された経験的データ（ｐｄｆの形態にある）を描出しているグラフである。
【図23】図２３は、上記のＷＢＣの各々についての４１３ｎｍでの平均細胞吸光度と対比させた、リンパ球、好中球、好酸球および単球の各々についてのトレーニングセットから収集された経験的データ（ｐｄｆの形態にある）を描出しているグラフである。
【図24】図２４は、上記のＷＢＣの各々についての核の組織と対比させた、リンパ球、好中球、好酸球および単球の各々についてのトレーニングセットから収集された経験的データ（ｐｄｆの形態にある）を描出しているグラフである。
【図25B】図２５Ｂは、赤色および緑色蛍光画像の両方について、細胞の内側部分内に配置された１群のピクセルの強度と細胞の外側部分内に配置された１群のピクセルの強度との間の差を例示している画像である。図２５Ｂは、内側および外側部分の識別を促進するための環状線を含む、図２５Ａの画像に類似する画像を含む。
【図26】図２６は、上記のＷＢＣの各々についての核の中空度と対比させた、リンパ球、好中球、好酸球および単球の各々についてのトレーニングセットから収集された経験的データ（ｐｄｆの形態にある）を描出しているグラフである。
【図27】図２７は、上記のＷＢＣの各々についての細胞質の組織と対比させた、リンパ球、好中球、好酸球および単球の各々についてのトレーニングセットから収集された経験的データ（ｐｄｆの形態にある）を描出しているグラフである。
【図28】図２８は、上記のＷＢＣの各々について決定された細胞質の中空度と対比させた、リンパ球、好中球、好酸球および単球の各々についてのトレーニングセットから収集された経験的データ（ｐｄｆの形態にある）を描出しているグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0013】
ここで図１を参照すると、以下でより詳細に説明するように、本発明は分析チャンバ内に静止して存在する生体体液試料内の成分を識別するための方法および装置を含む。典型的には、試料内の１つの成分の別の成分からの識別を促進するために、少なくとも１つの着色剤が加えられる。該チャンバ内に静止して存在する試料がイメージングされ、該試料の画像内の成分の位置が決定される。該画像内で位置決定された成分の少なくとも一部は、分析される各特定成分の１つ以上の特徴の存在を決定するため（例えば、１つの成分が特定の特徴を有する程度を決定するため）に分析される。各特徴は、画像から定量的に評価することができる。少なくとも１つのタイプの成分は、位置決定された成分からこれらの特徴を使用して決定される。
【0014】
本発明は、全血試料上で白血球百分率測定「ＬＤＣ」を実施するために適用されると特に有用である。上述したように、ＬＤＣは、様々なタイプのＷＢＣが識別および計数される分析である。これらの結果は、識別されたＷＢＣタイプの相対比率によって表示することができる。本発明は、特に、血液試料中の成分（例えば、ＷＢＣ）例えば、単球、好酸球、好中球およびリンパ球を識別するために使用できる。本発明の有用性を例示するために、単球、好酸球、好中球およびリンパ球を識別するためのＬＤＣ用途に関して本発明を説明する。しかし本発明はこの特定用途には限定されず、試料の画像から相互から定量的に決定可能である成分特徴を利用して、全血試料中の他のタイプの成分、または他のタイプの生体試料内の成分を識別するために使用できる。
【0015】
上記のように、本発明は、チャンバ内に静止して存在する全血試料上で分析を実施するために機能するが、該チャンバは少なくとも１枚の透明パネルを含む。本発明は、いずれかの特定チャンバ実施形態とともに使用することには限定されない。許容されるチャンバの例は、米国特許出願公開第２００７／０２４３１１７号明細書および米国仮特許出願第６１／２８７，９５５号明細書（以下では、‘９５５号出願」と呼ぶ）に記載されており、これらの出願の各々はこれにより全体として参照により組み込まれる。
【0016】
許容されるチャンバタイプの例を、図２および３に示す。チャンバ５０は、第１平面部材５２、第２平面部材５４および平面部材５２、５４の間に配置された少なくとも３つのセパレータ５６によって形成される。平面部材５２、５４の少なくとも１つは透明である。チャンバ５０を形成するために平面部材５２、５４を分離するセパレータ５６は、チャンバ５０の高さ５８を確立するために役立つ。平面部材５２、５４またはセパレータ５６の内の少なくとも１つは、部材間の平均チャンバ高さ５８がセパレータ５６の平均高さに密接に近似するのを許容するために十分に柔軟性である。
【0017】
上記に記載したチャンバ５０は、様々な相違する実施形態で実施できる。「‘９５５号出願」は、チャンバ５０が試料収集および分析カートリッジ６０内に配置された実施形態について記載している（図３を参照）。カートリッジ６０は、該試料の画像を制御、処理および分析するために、撮像機器および処理装置（例えば、プログラム可能分析装置）を有する自動分析装置６２（図４に概略図で示した）とともに使用するために適合する。
【0018】
図４を参照すると、上述のチャンバとともに使用するために機能する分析装置６２は、典型的には対物レンズ６４、カートリッジ保持および操作装置（例えば、モータ駆動ステージ）６６、試料照明装置６８、解像機構７０およびプログラム可能分析装置７２を含む。対物レンズ６４およびカートリッジ保持装置６６の一方または両方は、チャンバおよびその中に配置された試料に対して本装置の相対焦点位置を変化させるために相互に向けて、および相互から離れるように可動性である。
【0019】
試料照明装置６８は、規定波長にしたがった光線を使用して試料を照明する。例えば、試料照明装置は、落射蛍光源６８Ａおよび透過光源６８Ｂを含むことができる。以下で説明するようにアクリジンオレンジ（「ベーシックオレンジ１５」もしくは「ＡＣＯ」とも呼ばれる）およびアストラゾンオレンジ（「ＡＯ」もしくはベーシックオレンジ２１とも呼ばれる）などの着色剤は、全血と混合されて落射蛍光源からの励起波長に曝露させられると特定波長で発光するが、このとき該光源は、典型的には約４５０〜４９０ｎｍの範囲内の光線を生成する。約４７０ｎｍでの励起波長が特に有用である。透過光源は、赤色、緑色および青色光の１つ以上と関連する波長で光線を生成するように機能する。赤色光は、典型的には約６００〜７００ｎｍの範囲内で生成されるが、約６６０ｎｍでの赤色光が好ましい。緑色光は、典型的には約５１５〜５７０ｎｍの範囲内で生成されるが、約５４０ｎｍでの緑色光が好ましい。以下で考察するように、青色光は、典型的には約４０５〜４２５ｎｍの範囲内にあるが、約４１３ｎｍでの青色光が好ましい。試料を透過した光または試料から発生された蛍光は、解像機構を用いて捕捉され、捕捉された光に代表的な信号がプログラム可能分析装置に送信され、該プログラム可能分析装置で画像に処理される。この画像は、該画像内に捕捉された光透過率または蛍光強度を単位当たりベースで決定することを可能にする方法で生成される。例えば、「単位当たりベース」は、例えばピクセルのように試料の画像を細かく切り分けることのできる増分単位である。
【0020】
許容される解像機構７０の例は、試料を透過した（または試料から発光された）光を電子データフォーマット画像に変換する電荷結合素子（ＣＣＤ）タイプの画像センサである。相補型酸化金属半導体（「ＣＭＯＳ」）タイプの画像センサは、使用可能な画像センサのまた別の例である。解像機構からの信号は、画像の各ピクセルについて情報を提供し、この情報は、強度、波長および光学密度を含む、または含むように誘導することができる。例えば、強度値には、０単位〜４，０９５単位の任意の尺度（「ＩＶＵ」）が指定される。光学密度（「ＯＤ」）は、媒質を通して透過される光の量に比した吸収される光の量の尺度である。例えば、「ＯＤ」値が高いほど、透過中に吸収される光の量が多くなる。ＯＤは、光学密度単位（「ＯＤ」）またはその単位分数で定量的に記述することができる。例えば、ミリＯＤはＯＤの１，０００分の１である。１「ＯＤ」単位は、光強度を９０％減少させる。定量値としての「ＯＤ」もしくは「ミリＯＤ」は、透過光、例えば図８（ａ）〜（ｄ）に例示した青色透過光によって獲得もしくは導出された画像に対して使用できる。解像機構からの情報は、多数のチャネルに分離される。解像機構からの情報は、以下では３つのチャネルに分離されると説明するが、この数は４部ＬＤＣを決定するための特定の有用性を提供する。しかし本発明は、３チャネル実施形態には限定されない。３つのチャネルの第１は、第１波長で試料から発光された光（例えば、５４０ｎｍ、緑色に見える）に関する情報に向けられる。第２チャネルは、第２波長で試料から発光された光（例えば、６６０ｎｍ、赤色に見える）に関する情報に向けられる。第３チャネルは、第３波長で試料を透過した光（例えば、４１３ｎｍ、青色光学密度「ＯＤ」を決定するために使用される）に関する情報に向けられる。これらの波長値およびチャネル数は、ＬＤＣが全血試料上で実施される場合に特に有用性がある。本発明は、これらの特定波長またはチャネル数に限定されない。異なる波長および／または透過値で情報を集めるために、追加のチャネルを実施することができる。その情報は、順に、試料内の追加の成分を評価するため、および／または分析の精度を高めるために使用できる。例えば、試料内の好塩基球をさらに識別することが望ましい用途においては、第４および第５チャネルを加えることができる。第４チャネルは、緑色ＯＤを決定するために使用される第４波長（例えば、５４０ｎｍ）で試料を透過する光に関連する情報に向けることができ、第５チャネルは、赤色ＯＤを決定するために使用される第５波長（例えば、６６０ｎｍ）で試料を透過する光に関連する情報に向けることができる。これらのＯＤ値を使用すると、順に好塩基球を識別することができる。
【0021】
プログラム可能分析装置は中央処理装置（ＣＰＵ）を含み、カートリッジ保持および操作装置、試料照明装置および解像機構と連絡している。プログラム可能分析装置は、カートリッジ保持および操作装置、試料照明装置および解像機構の１つ以上との間で信号を送信および受信するために適合する（例えばプログラム化する）。例えば、分析装置は、１）光学機器、照明装置および解像機構の１つ以上に比してカートリッジおよびチャンバを位置決めするために該カートリッジ保持および操作装置との間で信号を送信および受信する、２）既定波長（または多数の波長）で光を発光させるために試料照明装置へ信号を送信する、および３）規定時間にわたり光を捕捉するために解像機構との間で信号を送信および受信するために適合する。プログラム可能分析装置の機能性は、ハードウエア、ソフトウエア、ファームウエアまたはそれらの組み合わせを使用して実施できることに留意されたい。当業者であれば、本明細書に記載した機能性を実施するために、過度の実験を行わずに処理装置をプログラムすることができる。
【0022】
プログラム可能分析装置は、１つ以上の既定アルゴリズムにしたがって解像機構から受信した信号を処理するためさらに適合する。特定のアルゴリズムの詳細は、目前の分析に依存することになる。上述のように、本発明は、全血試料上でＬＤＣを実施するために適用された場合に特定の有用性を有するので、本明細書では、本発明の有用性を例示するために、ＬＤＣを実施することについて説明する。しかし本発明は、特定の分析には限定されない。
【0023】
ＬＤＣを実施するために、本アルゴリズムは、その特徴の各々が他の特徴から識別可能であり、各々が試料の画像から定量的に決定できる１セットの識別特徴を利用する。各ＷＢＣは、所定の識別特徴の存在または非存在によって、および／または所定の特徴に関連する定量的情報によって特徴付けることができる。許可の与えられる開示を提供するために、本発明は、ＷＢＣを選択的に識別および区別するために使用できる識別特徴の典型的セットに関して記載する。このセットは可能性のある全ての特徴を含む訳ではないので、このため本発明はこの特定セットに限定されない。
【0024】
ＷＢＣ分析のためには、識別特徴の例示的セットには、細胞（Cell）、核（Nucleus）、極大部分（Lobe）の数、細胞領域（Cell Area）、核領域（Nucleus Area）、大型顆粒の比率（Ratio of Large Granules）、核の比率（Ratio of Nucleus）、赤色−緑色比（Red-Green Ratio）、核の形状（Nucleus Shape）、細胞の形状（Cell Shape）、核の輝度（Nucleus Brightness）、細胞質の輝度（Cytoplasm Brightness）、所定の波長での平均細胞吸光度（Average Cell Absorption at a Given Wavelength）、核の組織（Nucleus Texture）、細胞質の組織（Cytoplasm Texture）、所定の波長での細胞吸光組織（Cell Absorption Texture at a Given Wavelength）、核の中空度（Nucleus Hollowness）および細胞質の中空度（Cytoplasm Hollowness）と題する識別特徴が含まれ、その各々については以下で説明する。
【0025】
一部の例では、所定の特徴は特定細胞についての情報（例えば、核の形状）を直接的に提供する。他の例では、１つの特徴（例えば、細胞領域）を使用すると特定細胞についての情報（例えば、核領域対細胞領域の比率−上記では「核の比率」と呼ばれている、など）を間接的に提供することができる。
【0026】
識別特徴は、定量可能な特徴、例えば光強度、光の色味、ＯＤ、面積および相対位置（例えば、形状）に基づく。上述したように、色は、励起されると特定の色と関連する特定波長で蛍光発光を生成する、試料と混合される１つ以上の着色剤によって作り出される。全血試料上でＬＤＣを実施する場合に使用され得る許容される着色剤の１つの例は、アクリジンオレンジ（「ＡＣＯ」）である。ＡＣＯは、全血試料と混合されると、試料内の成分、例えば白血球、血小板、網状赤血球および有核赤血球を選択的に染色する蛍光染料である。ＷＢＣに関して、ＡＣＯは各ＷＢＣを透過し、そのＤＮＡおよびＲＮＡを染色する。ＷＢＣ内で染料によって発光される色は、該染料内のＲＮＡおよびＤＮＡの量、該成分内の染料の濃度ならびに該成分のｐＨを含む多数の因子の関数である。本発明は、ＡＣＯを使用することに限定されず、他の染料（例えば、アストラゾンオレンジ）をＡＣＯに代えて、またはＡＣＯと組み合わせて使用することができる。１つの例としてＡＣＯおよび白血球を使用し、該試料を４７０ｎｍまたは約４７０ｎｍの波長の励起光に曝露させると、白血球の核内の物質（例えば、ＤＮＡ）に結合したＡＣＯは約５４０ｎｍで発光し（緑色に見える）、白血球の細胞質内の物質（例えば、ＲＮＡ）に結合したＡＣＯは約６６０ｎｍで発光する（赤色に見える）ことになる。
【0027】
上述したように、試料内のＯＤ値は細胞内で自然に発生する物質（例えば、ヘモグロビン）による既定波長での吸光度の関数である、および／または試料内の成分によって吸収された（または吸収されなかった）着色剤の関数である可能性がある。
【0028】
１つ以上の既定波長での特定のピクセル群の識別は、様々な相違する技術を用いて実施できる。例えば、セグメンテーション技術を使用すると、画像内の基準（例えば、強度および色）を満たすピクセルだけを描出するマスキング画像を生成することができる。画像の緑色光部分（例えば、核）または赤色光部分（例えば、細胞質）だけから、または両方からの情報を引き出す分析のために、試料画像は、緑色もしくは赤色または両方を示すピクセルだけを描出する部分画像を生成するためにマスキングし得る、およびさらに既定強度閾値によって区別することもし得る。本発明は、任意の特定セグメンテーション技術には限定されず、目前の用途を考慮して特定の技術を選択することができる。例えば、ピクセルが１つの対象に属する、または属さないかのいずれかであると指定されるハードセグメンテーション技術を使用できる。「ハード」セグメンテーション技術は、閾値化、領域拡張または流域型ルーチンを使用して実行できる。または、ソフトセグメンテーション技術、例えば、各ピクセルに０〜１の範囲内の数値が指定され、その数値は特定ピクセルが該対象に属する可能性を記述する「ファジー」セグメンテーションを利用できる。以下の識別特徴の各々についての説明は、定量的データ、例えば波長および強度に関連するデータが１つのＷＢＣを別のＷＢＣから区別するための根拠を提供できる方法についての明白な例を提供する。本発明はさらに、セグメンテーション技術を使用することには限定されず、ピクセルを選択する（つまり「選別する」）、またはさもなければ特定属性を有するピクセルを区別する他の技術を使用し得る。
【0029】
用語「細胞（Cell）」は、画像全体の強度と比較して高レベルの強度（すなわち、既定ＩＶＵ閾値またはその上方）での緑色発光および／または赤色発光を描出する画像内の１群の実質的隣接ピクセルを含む識別特徴を意味する。そこで、既定強度レベルまたはその上方で既定の色（例えば、赤色および緑色）を有するピクセルは、定量的に識別される。例えば、図５（ａ）〜（ｄ）は、緑色光および赤色光を示す試料画像内のＷＢＣを含有する領域を例示している。図９（ａ）〜（ｄ）は、閾値強度レベルまたはその上方の領域、すなわち細胞を規定する上記の画像内の１群の実質的隣接ピクセルを例示している。
【0030】
用語「核（Nucleus）」は、画像全体の強度に比較して高強度レベルで緑色発光を描出する画像内の１群の実質的隣接ピクセルを含む識別特徴を意味する。上述したように、セグメンテーション技術を使用して、既定強度閾値またはその上方での緑色発光の定量値基準を満たす画像内のピクセルだけを描出するマスキング画像を生成し得る。ＩＶＵ閾値またはその上方での緑色発光を描出する画像内の隣接ピクセルの各群は、これにより「核」特徴であると特徴付けられる。上述したように、図１０（ａ）〜（ｄ）は、核特徴を示すマスキング画像を例示している。
【0031】
用語「極大部分（Lobe）」は、緑色蛍光チャネル（例えば、５４０ｎｍ）内の局所的最大強度である画像内の隣接ピクセルの１群を含む識別特徴を意味する。用語「局所的最大強度」は、その数値が周囲のピクセルより顕著に大きい実質的に同一強度値（すなわち、定量可能値）を有する１群のピクセルを意味している。図１１（ａ）は、局所的最大発光強度を示すピクセルの単一群によって識別可能である単一極大部分を有するＷＢＣを例示している。図１１（ｃ）および（ｄ）は、１対の極大部分を有するＷＢＣを例示している。図１１（ｂ）は、３つの極大部分を有するＷＢＣを例示している。図１３は、リンパ球、好中球、単球および好酸球に関連する極大部分の数（すなわち、定量可能値）における差をグラフ表示している。例えば、好中球に関連する極大部分の数は、極大部分の数を、好中球を区別するために使用し得る識別特徴にする。
【0032】
図１３、１４、１６〜１８、２１〜２４および２６〜２９は、ＷＢＣ画像のトレーニングセットから収集された経験的データを描出しているグラフである。これらのグラフは、特定識別特徴についての関連する定量可能なデータとともに、水平軸と対比させて確率分布密度関数（「ｐｄｆ」）を備える垂直軸を含む。これらのグラフは、ＷＢＣと各特徴との関係を良好に例示しているが、本発明はこれらの特定タイプのグラフには限定されない。例えば、確率分布密度関数は、トレーニングセットからの経験的データの統計的表示である。または他の統計的表示を使用することができる。
【0033】
「細胞領域（Cell Area）」は、特定細胞であると識別される画像内の定量可能な領域を意味する識別特徴である。各ピクセルは画像の公知の領域を表すので、所定の細胞または他の成分もしくは要素の領域は、ピクセル数から決定できる。しかし本発明は、細胞領域値を決定する本方法には限定されない。図１４は、リンパ球、好中球、単球および好酸球に関連する細胞領域における差をグラフ表示している。例えば、リンパ球に関連する細胞領域は、細胞領域をリンパ球を区別するために使用できる識別特徴にさせる。
【0034】
「核領域（Nucleus Area）」は、特定の核であると識別される画像内の領域を意味する識別特徴である。例えば、核領域は、細胞領域を決定するために上述した方法で決定することができる。決定された核領域の数値は、核領域の定量可能値を提供する。
【0035】
「大型顆粒の比率（Ratio of Large Granules）」は、細胞領域全体にわたって、細胞内の高青色ＯＤ領域の合計の比率である識別特徴である。用語「高青色ＯＤ領域」−「大型顆粒」とも呼ぶ−は、既定閾値（すなわち定量可能値）より上方の青色ＯＤ値を有する画像内の隣接ピクセルの１群を意味する。青色ＯＤ値は、試料を通して約４１３ｎｍの波長で青色光を透過させることによって作り出される。青色ＯＤ値を決定するために使用される青色透過光は、約４０５〜４２５ｎｍの範囲内にあってよい。約４１３ｎｍでの青色透過光は、ヘモグロビン（ＨＧＢ）が４１３ｎｍまたは約４１３ｎｍでのピーク吸光を示すので有益である。各大型顆粒は該ＯＤ画像内で明るいピクセルの１群として見え、各々は、既定閾値を超えるＯＤ（例えば、＞３００ミリＯＤ）を有するピクセルを除く全てのピクセルをマスキングする、ＯＤ画像内でのセグメンテーション技術によって検出することができる。図１５は、細胞内の高青色ＯＤ領域（すなわち、好酸球内の大型顆粒）の１つの例を例示している。図１２（ａ）〜（ｄ）は、相違するタイプのＷＢＣ内の高青色ＯＤを伴うピクセルをさらに例示している。本発明者らの現在までの研究は、ＬＤＣ内で考察される細胞に比較して、好酸球だけが細胞内の高強度青色ＯＤの有意な領域を有することを示している。図１６は、リンパ球、好中球、単球および好酸球に関連する大型顆粒の比率における差をグラフ表示している。図１６から明らかなように、大型顆粒の比率は、ＬＤＣ内の他の成分から好酸球を容易に区別するために使用できる定量可能な識別特徴である。
【0036】
「核の比率（Ratio of Nucleus）」は、上記で規定した特徴と同様に、細胞領域全体にわたる核領域の比である識別特徴である。図１７は、リンパ球、好中球、単球および好酸球に関連する核の比率（すなわち、定量可能値）における差をグラフ表示している。例えば、リンパ球に関連する核の比率は、核の比率をリンパ球を区別するために使用できる識別特徴にさせる。
【0037】
「赤色−緑色比（Red-Green Ratio）」は、緑色蛍光を描出する識別された細胞内のピクセル（もしくは領域）の平均強度値と比較した、赤色蛍光を描出する識別された細胞内のピクセル（もしくは領域）の平均強度値の比率である識別特徴である。図６（ａ）および７（ａ）（または６（ｂ）および７（ｂ）、または６（ｃ）および７（ｃ）、または６（ｄ）および７（ｄ））は、特定タイプの細胞の結合された赤色蛍光および緑色蛍光を例示している。図６（ａ）（または６（ｂ）、６（ｃ）もしくは６（ｄ））に示した画像は、赤色蛍光からの成分だけを描出している部分画像であり、図７（ａ）（または７（ｂ）、７（ｃ）もしくは７（ｄ））は、緑色蛍光からの成分だけを描出している同一細胞の部分画像である。赤色−緑色比は、各色の平均強度値の比率である。図１８は、リンパ球、好中球、単球および好酸球に関連する赤色−緑色比における差をグラフ表示している。例えば、リンパ球に関連する赤色−緑色比は、赤色−緑色比を、リンパ球を区別するために使用できる識別特徴にする。
【0038】
「核の形状（Nucleus Shape）」は、核の真円度を記載する識別特徴である。様々な幾何学的技術を使用すると、その核が画像内で二次元物体として見える試料画像内の核の真円度を決定することができる。例えば、単一細胞に関して、セグメンテーション技術を使用して、細胞の核と関連するピクセル（すなわち、緑色を示すピクセル）を識別し得る。核ピクセルが識別されると、核の境界に所在するピクセルが識別される。核の重心（すなわち、核によって被覆された領域の重心）は、境界ピクセルの全部の位置を平均化することによって規定できる。ピクセル既定体に近似する、および該重心を中心とする円が該ピクセル体に適用される。図１９は、マスキング画像内のピクセルによって規定された核および該ピクセル体に適用された円の例を例示している。図２０は、対応する境界ピクセルを例示している。境界ピクセルの位置は、核の真円度、例えば、境界ピクセルのほぼ完全な円からの偏差値（すなわち、定量可能値）を決定するために集合的に使用される。例えば、各境界ピクセルの位置は、円の半径（ｒc）未満の境界ピクセルの半径（ｒBP）の差を円の半径で割ることによって、正規化項で記述することができる：
【0039】
【数1】
【0040】
境界ピクセルが円上に存在する場合は、分子（ｒBP−ｒc）はゼロに等しく、偏差はゼロである。真円度からの偏差（ｒＮｏｒｍａｌｉｚｅｄ）は次に、形状の真円度、例えば核の真円度の尺度として使用できる。図２１は、リンパ球、好中球、単球および好酸球の統計的に有意な集団についての核の真円度を比較したグラフである。このグラフは、リンパ球内の核の真円度が好中球、単球および好酸球の真円度とは顕著に相違し、それにより核の形状を、リンパ球を区別するために使用できる識別特徴にさせることを明白に示している。核の真円度を決定するための上述した技術は許容できる技術の例であって実施可能のために提供されるが、本発明は特定の技術には限定されない。
【0041】
「細胞の形状（Cell Shape）」は、細胞の境界の形状、すなわち該画像の二次元平面内の細胞の境界ピクセルの分布を評価する識別特徴である。核の真円度を決定するための上述の技術を使用すると、該細胞の細胞の形状（例えば、楕円形、長円形など）を決定することができる。細胞の形状に関して、この技術を使用すると、好ましくは細胞の形状、例えば天然型細胞の形状のより密接な近似である楕円形からの偏差（すなわち、定量可能値）を決定することができる。本発明は、上述の技術、または近似としての楕円形を使用することには限定されない。図２２は、リンパ球、好中球、単球および好酸球に関連する細胞の形状における差をグラフ表示している。好中球に関連する細胞の形状は、例えば細胞の形状を、好中球を区別するために使用できる識別特徴にさせる。
【0042】
「核の輝度（Nucleus Brightness）」は、核内の平均緑色蛍光強度を定量する識別特徴である。図７（ａ）〜（ｃ）は、リンパ球、好中球および好酸球の核が単球の核（図７（ｄ））より大きな強度を有する（すなわち、より明るく見える）ことを示している。強度における上記の差は、単球核の内側のクロマチンの希薄な分布と対比させた、リンパ球、好中球および好酸球の核の内側のクロマチンの相当に密な分布に起因する。本発明の一部の実施形態では、核の輝度は、核内の平均緑色蛍光強度値の正規化値と比較して決定される。正規化値は、試料内の変動性、例えば試料内の不均一な染色を説明するために役立つ。強度値を正規化するために使用される正確な技術は、目前の用途に適合するように変動させることができ、本発明は、いかなる特定の正規化技術にも限定されない。例えば、一部の場合には、核内の平均緑色蛍光強度値の強度値は、隣接細胞の強度値と比較して、または試料全体の細胞に比較して正規化することができる。
【0043】
「細胞質の輝度（Cytoplasm Brightness）」は、細胞質内の平均赤色蛍光強度を定量する識別特徴である。図６（ａ）〜（ｄ）は、所定の細胞の細胞質領域からの赤色蛍光発光の強度を示している。リンパ球の細胞質から発光された赤色光の強度は、単球の細胞質から発光された赤色光の強度に比較して低い。単球の細胞質から発光された赤色光の強度は、順に好中球および好酸球の細胞質から発光された赤色光の強度に比較して低い。上述したように、本発明の一部の実施形態では、輝度値は、正規化値、例えば細胞内の正規化平均赤色蛍光高強度と比較して決定される。強度値を正規化するために使用される正確な技術は、目前の用途に適合するように変動させることができ、本発明は、いずれか特定の正規化技術に限定されない。
【0044】
「所定の波長での平均細胞吸光度（Average Average Cell Absorption at a Given Wavelength）」は、細胞を透過した所定の波長での青色に関連する細胞の平均ＯＤ（例えば、「平均青色ＯＤ強度」）を定量する識別特徴である。上述したように、青色透過光は約４０５〜４２５ｎｍの範囲内にある可能性があり、約４１３ｎｍでの青色透過光は、ヘモグロビンがピーク吸光度を有するのは４１３ｎｍまたは約４１３ｎｍであるので有益である。細胞の平均青色ＯＤ強度を定量するために、約４１３ｎｍの波長での青色光が各細胞を透過させられる。青色光と関連するＯＤは、１ピクセルベースで決定される。図９（ａ）〜（ｄ）は各々、既定閾値より大きい赤色蛍光または緑色蛍光強度値を有するピクセル以外の全てがマスキングされている各細胞のマスキングバージョンを示している。各細胞のマスキングされた部分内のＯＤ（すなわち、波長４１３ｎｍと関連しているＯＤ）の平均値が決定される。図８（ａ）〜（ｄ）は、各細胞を透過させられている上記の光の結果として生じた青色ＯＤの画像を示している。図８（ａ）〜（ｄ）の評価を促進するために、各画像内に平均細胞吸光度が決定される外側領域と内側領域との間の境界を示している環状線が引かれている。図２３は、リンパ球、好中球、単球および好酸球に関連する４１３ｎｍでの平均細胞吸光度における差をグラフ表示している。例えば、好酸球と関連する４１３ｎｍでの平均細胞吸光度は、同様に図８（ａ）〜（ｄ）からも明らかである、４１３ｎｍでの平均細胞吸光度を好酸球を区別するために使用できる識別特徴にする。
【0045】
「核の組織（Nucleus Texture）」は、細胞核領域内で発光される緑色蛍光の「組織」を定量する識別特徴である。用語「組織」は、典型的には１ピクセルベースで細胞核内の緑色蛍光の変動性を意味するために使用される。核の組織を定量するために、数種の異なる技術を使用できる。例えば、１ピクセル当たりの平均正規化緑色光強度値の標準偏差を使用すると、核の組織を定量することができる。正規化緑色蛍光強度値は、緑色蛍光を発光する細胞内のピクセル全てを識別し、最低強度を備えるピクセルにゼロの任意値を指定し、最高強度のピクセルに１の値を指定することによって決定できる。強度値（すなわち、定量可能値）の標準偏差は、公知の技術を用いてそれらの数値から計算できる。図２４は、リンパ球、好中球、単球および好酸球に関連する核の組織における差をグラフ表示している。リンパ球に関連する核の組織は、例えば核の組織をリンパ球を区別するために使用できる識別特徴にする。
【0046】
「核の中空度（Nucleus Hollowness）」は、核の組織に加えて、または核の組織の代わりに使用できる識別特徴である。核の中空度は、緑色蛍光画像内の細胞の外側部分上に配置された１群のピクセルの強度（すなわち、定量可能値）と対比した細胞の内側部分内に配置された１群のピクセルの強度（すなわち、定量可能値）の比率である。何が「外側部分」であり何が「内側部分」であるかの定義は、目前の用途に、例えば経験的データに基づいて適合させるために変動させることができる。例えば、外側部分は細胞の境界に存在する少数ピクセルのバンド、例えば、ピクセルサイズがおよそ０．５μｍである場合の細胞の境界での３ピクセルのバンドであると規定できる。そこで内側部分は、外側部分以外の細胞内の領域である。図２５Ａは、核の内側部分と外側部分との間の強度における差を例示するための緑色チャネル内の細胞核を含む。図２５Ｂは、類似の画像を含有しており、内側および外側部分の識別を促進するための環状線を含む。内側群と外側群のピクセルの相対強度は、典型的に好中球の一部における内側ピクセルの強度が外側ピクセルの強度よりは定量可能に低いような強度である。図２５Ａおよび図２５Ｂは緑色チャネルおよび赤色チャネル画像を示しているが、このとき図２５Ａは穴のように見える核内の薄暗い部分を示している。図２６は、リンパ球、好中球、単球および好酸球に関連する「核の中空度」における差をグラフ表示している。例えば、好中球に関連する「核の中空度」は、細胞の他のタイプより大きな数値を有し、好中球を区別するために使用できる識別特徴にする。
【0047】
「細胞質の組織（Cytoplasm Texture）」は、細胞の細胞質内で発光される赤色蛍光の「組織」を定量する識別特徴である。用語「組織」は、典型的には１ピクセルベースで細胞の細胞質内の赤色蛍光の変動性を意味するために使用される。細胞質の組織を定量するために、数種の異なる技術を使用できる。例えば、１ピクセル当たりの平均正規化赤色光強度値の標準偏差を使用すると、細胞質の組織を定量することができる。正規化赤色蛍光強度値は、赤色蛍光を発光する細胞内のピクセル全てを識別し、最低強度を備えるピクセルにゼロの任意値を指定し、最高強度のピクセルに１の値を指定することによって決定し得る。強度値の標準偏差は、公知の技術を用いてそれらの数値から計算できる。図２７は、リンパ球、好中球、単球および好酸球に関連する細胞質の組織における差をグラフ表示している。好中球に関連する細胞質の組織は、例えば細胞質の組織を好中球を区別するために使用できる識別特徴にさせる。
【0048】
上記の核の組織および核の中空度に関して記載した方法に類似する方法で、「細胞質の中空度」は、細胞質の組織に加えて、または細胞質の組織の代わりに使用できる識別特徴である。細胞質の中空度は、赤色蛍光画像内の細胞質の外側部分上に配置された１群のピクセルの強度と対比させた、胞質の内側部分内に配置された１群のピクセルの強度（すなわち、定量可能値）の比率である。内側群と外側群のピクセルの相対強度は、典型的には内側ピクセルの強度が好中球および好酸球内の外側ピクセルの強度より定量可能に低いような強度である。図２８は、リンパ球、好中球、単球および好酸球に関連する「細胞質の中空度」における差をグラフ表示している。好中球に関連する「細胞質の中空度」は、例えばリンパ球および単球に関連する細胞質の中空度より大きいが、好酸球に関連する細胞質の中空度より小さいので、このため細胞質の中空度を好中球を区別するために使用できる識別特徴にする。
【0049】
「所定の波長での細胞吸光組織（Average Cell Absorption at a Given Wavelength）」は、そのＯＤが１ピクセルベースで検知される、細胞を透過する所定波長での青色光に関連する細胞のＯＤ値の組織を定量する識別特徴である。上述したように、青色透過光は約４０５〜４２５ｎｍの範囲内であり得、約４１３ｎｍでの青色透過光は、ヘモグロビンがピーク吸光度を有するのは４１３ｎｍまたは約４１３ｎｍであるので有益である。「組織」は、細胞内のＯＤ値の変動性を意味する。上述したように、その組織を定量するためには幾つかの相違する技術、例えば、４１３ｎｍでの青色光と関連するＯＤ値の標準偏差を使用できる。図２９は、リンパ球、好中球、単球および好酸球に関連する４１３ｎｍでの細胞吸光組織における差をグラフ表示している。例えば、好酸球と関連する４１３ｎｍでの細胞吸光組織は、４１３ｎｍでの細胞吸光組織を、好酸球を区別するために使用できる識別特徴にする。
【0050】
該特徴の各々についての上記の説明は、それを用いると細胞の特徴を評価できる定量可能値を示している。本発明は、定量可能値の特異的に識別された形態には限定されない。例えば、赤色−緑色比は、識別された細胞内の緑色蛍光を描出するピクセル（もしくは領域）の平均強度値に比較した識別された細胞内の赤色蛍光を描出するピクセル（もしくは領域）の平均強度値の比率であると記載されている。括弧内に「もしくは領域」と指示されているように、赤色−緑色比は領域によって、またはその領域内の各光の強度値が既定閾値を満たす（各々が試料画像内の領域を表す）ピクセル比によって説明することができる。
【0051】
上述のように、プログラム可能分析装置は、ＬＤＣを実施するためのアルゴリズム内で、上記の特徴などの識別特徴を利用するために適合する。上記の特徴によって提供される定量的情報は、ＬＤＣと関連する情報を提供するための多数の様々な方法で処理できる。
【0052】
一部の実施形態では、例えば、プログラム可能分析装置は、１つ以上の特徴に比較して試料画像を評価し、該試料内の細胞を分類するためにそのような評価を使用するルールベース分類器を含むために適合する。上記のように、各特徴は、定量値によって記述することができる。試料画像内の細胞の一部または全部は、特徴によって評価される。すなわち、その特徴についての定量値は、試料画像から決定される。決定された定量値は、次にその細胞がＷＢＣの特定タイプであるか否かを決定する目的で、その特徴についての参照値に対して（例えば、比較して）評価される。定量値を決定し、それを参照値と比較する工程が、考察下の特徴の各タイプについて（例えば、目前の分析に依存して、一部の分析は特徴の全部を考察することができない）行われる。例えば、特定の細胞画像を評価するためには、分類器は、最初に細胞領域特徴を考察できる。決定された細胞領域が規定細胞領域値（例えば、６０）より小さい場合は、分類器によって適用されるルールは、所定のＷＢＣタイプが除外され、その他が含まれることを規定できる。例えばリンパ球がｐｄｆにおいて６０未満の領域を示しており、好酸球、単球、好中球各々が６０を超える領域を有する図１４を参照されたい。用語「除外される」は、本明細書では可能性が統計的に低いことを意味し、用語「含まれる」は、その逆である可能性が統計的に高いことを意味するために使用される。次に、ルールベース分類器は、極大部分の数を決定するために細胞画像を評価することができる。決定された極大部分の数が規定値（例えば、２）以上である場合は、次に該分類器によって適用されたルールが、所定のＷＢＣタイプを除外し、その他を依然として含むことを規定することになる。細胞が２つ以上の極大部分を有する確率がリンパ球についてより単球および好中球についての方が高いが、好酸球については依然として実質的に高いことを示している図１３を参照されたい。次に、ルールベース分類器は、細胞画像を評価して所定の波長で平均細胞吸光度についての定量値を決定することができる。所定の波長（例えば、４１３ｎｍ）で決定された平均細胞吸光度値が規定閾値（例えば、約２１５）より大きい場合は、次に分類器によって適用されるルールは、所定のＷＢＣタイプを除外し、その他を依然として含むことを規定することになる。例えば、約２１５の数値より上方では好中球、単球およびリンパ球を排除することができ、好酸球だけを含めることができることを例示している図２３を参照されたい。そこで、考察下の各特徴についての定量値を決定し、引き続いて所定のルールを使用してそれらの数値を評価することによって、ルールベース分類器は、該ＷＢＣタイプ、すなわち好酸球に関する定量を基礎とする決定を行う。
【0053】
ＷＢＣの１つのタイプについての各識別特徴の定量値は、特定の被験者（subject）からの試料集団内である程度変動する可能性が高く、さらに被験者間で変動する可能性がある。本発明は、この変動性を、例えば、細胞画像を評価するために複数の特徴を利用することによって取り扱う。細胞を評価および識別するために２つ以上の特徴を使用することによって、本発明の方法は、任意の特定特徴が評価の精度に有害な影響を及ぼす可能性を減少させる。図３０に提供した表は、特定タイプのＷＢＣと関連する主要な識別特徴群を例示している。これらの特徴群の分類は、４部ＬＤＣ内で１つのＷＢＣを別のＷＢＣから有意に区別するために使用できる群の例である。変動性は、また、各特徴と関連する定量的参照値の大きさを選択的に調整することによって取り扱うこともできる。
【0054】
一部の実施形態では、プログラム可能分析装置は、学習モデルベース分類器を含めるために適合する。図３１は、学習モデルベース分類器と関連する工程の例を例示するフローチャートである。チャートから明らかなように、トレーニング試料画像は、分類器をトレーニングするために使用され、トレーニングされた分類器は、順に学習モデルを構築する。学習モデルが開発されると、そのモデルは次に、試料から細胞画像と関連する特徴（例えば、上述したような特徴）を評価するために、およびそれらの特徴に基づいて細胞をＷＢＣの特定タイプであると分類するために利用される。
【0055】
トレーニング試料画像は、ＬＤＣ内で識別可能なＷＢＣの各タイプについて経験的に（例えば、熟練の技術者によって）収集することができる。例えば、図３２はトレーニングセットからの１２枚のリンパ球画像を例示し、また図３３、３４および３５は単球、好酸球および好中球各々についてのトレーニングセットにおける例を例示している。各セット内の細胞画像の数は、トレーニング目的で各ＷＢＣタイプについての十分なデータ、つまり、分類器が分析タイプのための許容できる精度レベルでトレーニングされることを可能にするために十分なデータを提供するために選択される。この実施形態内で使用される学習モデルは、いかなる特定サイズのトレーニングセットにも限定されない。トレーニングセットは、相違する人での、相違するイメージング条件間などの変動性を忠実に表すために、数百〜数千の各タイプのＷＢＣを含有できることが多い。
【0056】
分類器は、各細胞についての各特徴についての定量的参照値を決定し、次にトレーニングセットのための各特徴についての集合的定量参照値（または参照値の統計的表示、例えば、確率分布密度関数）を決定するために、トレーニングセット内の各細胞画像を定量的に評価することによってトレーニングできる（および学習モデルを開発することができる）。集合的参照値（またはその統計的表示）を次に使用すると、学習モデルを構築できる。図１３、１４、１６〜１８、２１〜２４および２６〜２９は、その特徴に比較してリンパ球、単球、好酸球および好中球について、トレーニングセットに基づく各特徴と関連する確率分布密度関数をグラフ表示している。学習モデルは、本用途が実際画像データおよびその画像データの自動解釈に基づいて調整できることを許容し、それにより所望の精度レベルを提供する。
【0057】
本発明は、いかなる特定タイプの学習モデルにも限定されない。許容できるタイプの学習モデルの例には、統計的モデル、例えばベイズ分類器（Bayesian classifier）、線形モデル、例えばサポートベクターマシン（Support Vector Machine：ＳＶＭ）および神経回路網モデル、例えば多層パーセプトロンが含まれる。ベイズ分類器モデルによって、ベイズモデルは、ＷＢＣタイプの各々についての事後分布を計算するために各特徴についての上述した確率分布密度関数を利用して実行することができる。各事後分布は、関連証拠（例えば、計算された特徴）が考慮に入れられた後に１つの事象（例えば、特定ＷＢＣの発生）の条件付き確率について記述する。ベイズモデルは、次にどのＷＢＣが最大事後分布を有するのかを決定するために事後分布を評価する。評価下の細胞画像は、次に最大事後分布を有するＷＢＣと同一タイプであると標識される。ベイズ確率モデリングは周知であり、本発明は、ベイズモデリングに関連するいずれかの特定の数学的手法には限定されない。ベイズモデリングを詳細に記載しているテキストの１つの例は、参照により全体として本明細書に組み込まれるR.O.Duda,P.E.Hart,and D.G.Storkによる「Pattern Classification」,John Wiley & Sons,2001に記載されている。
【0058】
サポートベクターマシン（「ＳＶＭ」）は、特徴について開発されたトレーニング試料を利用し、データがｎ次元空間内で線形分離可能であるかどうかを決定するためにそれらを組織化する線形分離器である。データが特徴データ群間に伸長する（ｎ−１）次元超平面によって線形分離可能である場合は、そのデータは超平面と比較したその位置によって分類することができる。超平面の最適位置は、各データ群からのデータポイントとアライメントされたサポートベクターを使用することによって該データと比較して選択することができる。最適超平面位置（すなわち、超平面と最も近いデータポイント／サポートベクターとの間の境界が最大である位置）が決定されると、次に超平面の位置はＷＢＣ間を識別するための機構になる。すなわち、超平面の片側に存在するデータポイントは特定タイプのＷＢＣと関連し、超平面の他方の側に存在するデータポイントは別のタイプのＷＢＣと関連している。ＳＶＭによって、超平面は２次元、３次元またはより高次元の「参照値」であると考えてもよい。確率情報が線形分離可能ではない所定の場合には、時にはデータを非線形関数（例えば、多項式もしくはＲＢＦカーネル関数）を使用して認識できるデータ操作技術（典型的には「カーネルトリック」と呼ばれる）を使用することが可能である。認識されたデータは、超平面の位置決め、および結果としてＷＢＣタイプの決定を許容する。ＳＶＭタイプ分類器は周知であり、本発明はそのいかなる特定実施形態にも限定されない。ＳＶＭタイプの分類器について詳細に記載しているテキストの例は、各々が全体として参照により本明細書に組み込まれる「A Training Algorithm for Optimal Margin Classifiers」,B.E.Boser,I.M.Guyon,and V.N.Vapnik,In D.Haussler,editor,5th Annual ACM Worshop on COLT,pgs.144-152,Pittsburgh,PA,1992,ACM Pressおよび「A Tutorial on Support Vector Machines for Pattern Recognition」,C.J.C.Burges,Data Mining and Data Knowledge Discovery 2:121-167,1998である。
【0059】
上述したように、本発明は、任意の特定の学習モデルを使用することに限定されない。一部の場合には、モデルの組み合わせを使用し得る。例えば、ルールベース分類器は、所定の用途ではデータの初期組織化を行うために実行できる。残りのデータは、学習モデル、例えば上記のＳＶＭモデルを使用して分析してもよい。
【0060】
本発明の操作においては、全血の未希釈試料を図３に例示したカートリッジのようなディスポーザブルカートリッジ内に収集する。１つ以上の着色剤（例えば、ＡＣＯ）を含む試薬および抗凝固剤（例えば、ＥＤＴＡ）が、ＬＤＣ分析を促進するために試料に加えられる。試薬と混合した試料はカートリッジの分析チャンバ部分内に配置され、該チャンバ内でイメージングプロセス中は静止して存在する。カートリッジを分析装置内に挿入し（さもなければ係合し）、そこで対物レンズ、試料照明装置および解像機構に対してカートリッジ保持および操作器具によって適切に位置決めをし、引き続いてイメージングする。
【0061】
ほとんどの場合に、分析装置は、チャンバ内に静止して存在する試料の全体をイメージングするようにプログラミングされる。しかし一部の用途では、試料の一部分をイメージングし得る。イメージング工程は、目前の用途に依存して変動させ得る。上述の４部ＬＤＣのためには、イメージング工程は、該試料を蛍光励起光源（例えば、落射蛍光光源からの約４７０ｎｍでの光）および透過光源（例えば、４１３ｎｍまたは約４１３ｎｍでの青色光）に曝露させる工程を含む。励起光源は、該試料内に配置された要素と結合された着色剤が２つの相違する波長（例えば、赤色約６６０ｎｍおよび緑色約５４０ｎｍ）で蛍光を発光することを誘発する。透過光の一部の量は試料を通過し、残りは試料／着色剤によって吸収される。解像機構は、試料を透過した光および試料からの蛍光を捕捉し、捕捉された光の強度および色を表現する信号を提供する。信号はプログラム可能分析装置が信号に基づいて試料の画像を形成することを許容する形態に処理され、その画像は、４部ＬＤＣを実施するために定量的に分析することができる。
【0062】
上述したように、本発明の一部の実施形態では、プログラム可能分析装置は、学習モデルを含むアルゴリズムと適合する。このモデルは、トレーニングセットを用いて開発され、開発されると、試料内のＷＢＣを正確に識別し、ＷＢＣをリンパ球、単球、好酸球および好中球であると分類するために使用できる。特定分析装置内のアルゴリズム（学習モデルを利用するアルゴリズムを含む）は、マスターコピーから提供することができ、その特定分析装置のプログラム可能分析装置内にダウンロードすることができる。
【0063】
図３０および３１を参照すると、試料画像の定量的分析中に、該アルゴリズムは該画像内のＷＢＣを識別する。分析を促進および／または効率化するために、試料画像を、細胞であると識別されたそれらの部分を除く全試料画像を排除するために（例えば、セグメンテーションによって）マスキングし得る。細胞であると識別された画像部分は、次に１つ以上の特徴によって、および典型的には実質的に全部の特徴によって定量的に評価することができる（例えば、図３０に開示した特徴群分類を参照されたい）。細胞の各々について特徴の各々についての定量値（または確率分布密度関数）は、次に細胞を分類するためにアルゴリズム（例えば、学習モデル部分）内で利用される。細胞が分類および計数されると、データはＬＤＣデータを提供するために組織化される。
【0064】
本発明の方法および装置の精度に関する予備調査は、高度の精度を示している。この予備調査は、被験者６２例の集団からの試料を利用し、試料の各々について本発明を使用して決定されたＷＢＣ識別結果を手作業で試料を試験する経験のある血液学者によって作成された試料分析結果と対比して比較した。１セット５００〜１，０００個の細胞が各試料から評価された。試料の２回の分析の線形回帰分析は、好中球、リンパ球、単球および好酸球について、Ｒ2値が手作業分析結果と本発明による分析装置からの結果との緊密な一致を示すことを証明している。
【0065】
本発明をその詳細な実施形態を参照して示して記載してきたが、当業者には形態およびその詳細における様々な変更を本発明の精神および範囲から逸脱せずに加えられることが理解される。