特許 5663841 骨細胞への分化誘導培地及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5663841

(24)【登録日】2014年12月19日

(45)【発行日】2015年2月4日

(54)【発明の名称】骨細胞への分化誘導培地及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/077 20100101AFI20150115BHJP

   C12N 5/0775 20100101ALI20150115BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20150115BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/00 202G

   C12N5/00 202H

   !C12N15/00 AZNA

【請求項の数】9

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2009-38998(P2009-38998)

(22)【出願日】2009年2月23日

(65)【公開番号】特開2010-193723(P2010-193723A)

(43)【公開日】2010年9月9日

【審査請求日】2012年2月22日

(73)【特許権者】

【識別番号】306008724

【氏名又は名称】富士レビオ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110001656

【氏名又は名称】特許業務法人谷川国際特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100088546

【弁理士】

【氏名又は名称】谷川 英次郎

(72)【発明者】

【氏名】堀田 佳之

【審査官】 幸田 俊希

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００７／０８０９１９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００１−５１２３０４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−１９３７２１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 ATKINS,G.J. et al.，Human trabecular bone-derived osteoblasts support human osteoclast formation in vitro in a defined, serum-free medium.，J. Cell. Physiol.，２００５年 ６月，Vol.203, No.3，pp.573-82

【文献】 FREITAS,F. et al.，Fluoroaluminate stimulates phosphorylation of p130 Cas and Fak and increases attachment and spreading of preosteoblastic MC3T3-E1 cells.，Bone，２００２年 １月，Vol.30, No.1，pp.99-108

【文献】 GRAeLER,M.H. et al.，EDG6, a novel G-protein-coupled receptor related to receptors for bioactive lysophospholipids, is specifically expressed in lymphoid tissue.，Genomics，１９９８年１０月１５日，Vol.53, No.2，pp.164-9

【文献】 斎藤芳郎ら，必須微量元素セレンの細胞生存維持作用に関する研究，日本脂質生化学研究，２００３年 ５月１５日，Vol.45，p.262-5

【文献】 LEE,G.M. et al.，Development of a serum-free medium for the production of erythropoietin by suspension culture of recombinant Chinese hamster ovary cells using a statistical design.，J. Biotechnol.，１９９９年 ４月１５日，Vol.69, No.2-3，pp.85-93

【文献】 SANCHEZ-HIDALGO,M. et al.，Melatonin inhibits fatty acid-induced triglyceride accumulation in ROS17/2.8 cells: implications for osteoblast differentiation and osteoporosis.，Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol.，２００７年 ６月，Vol.292, No.6，pp.R2208-15

【文献】 YEUM,C.E. et al.，Effects of Vitamin K2 on Adipogenic and Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem Cells from Human Umbilical cord blood.，Key Eng. Mat.，２００７年，Vol.342-3，p.121-4

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００−７／０８

Ｃ１２Ｎ １５／０９

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

哺乳動物細胞培養用基本培地と、哺乳動物の間葉系幹細胞から骨細胞への分化誘導剤と、内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドと、セレンとを含み、無血清であり、前記分化誘導剤がβ−グリセロリン酸、デキサメタゾン及びビタミンＣを同時に含むものであり、グルタミン酸をさらに含む、哺乳動物の間葉系幹細胞から骨細胞への分化誘導培地。

【請求項2】

内皮細胞分化遺伝子ファミリーレセプターに対する前記リガンドの培地中の濃度が０．０１μＭ〜５０μＭ、セレン濃度が１ｎＭ〜1μＭである請求項１記載の培地。

【請求項3】

内皮細胞分化遺伝子ファミリーレセプターに対する前記リガンドがリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）及びその塩、スフィンゴシン１リン酸（Ｓ１Ｐ）並びに内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターのアゴニストから成る群より選択される少なくとも１種である請求項１又は２記載の培地。

【請求項4】

メラトニン、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＫおよび亜鉛から選択される少なくとも1種をさらに含む請求項１ないし３のいずれか１項に記載の培地。

【請求項5】

前記基本培地が、ＤＭＥＭ、ＭＥＭα、ＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２、ＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｗｉｌｌｉａｍｓ培地Ｅ、ＭＣＤＢ培地、１９９培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＭｃＣｏｙ改変培地から成る群より選ばれる請求項１ないし４のいずれか１項に記載の培地。

【請求項6】

内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドと、セレンとを含む、哺乳動物の間葉系幹細胞から骨細胞への分化誘導培地添加剤。

【請求項7】

間葉系幹細胞から骨細胞への分化誘導剤をさらに含み、該分化誘導剤がβ−グリセロリン酸、デキサメタゾン及びビタミンＣを同時に含むものである、請求項７記載の添加剤。

【請求項8】

水又は基本培地に溶解することにより請求項１ないし５のいずれか１項に記載の培地を与える組成を有する請求項６又は７記載の添加剤。

【請求項9】

請求項１ないし５のいずれか１項に記載の培地中で、骨細胞へ分化し得る間葉系幹細胞を培養することを含む、間葉系幹細胞から骨細胞への分化誘導方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、無血清培地条件下で哺乳類の体性幹細胞又は骨芽細胞から骨細胞へ分化誘導する培地組成および方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒトの体性幹細胞等を清潔な環境下の培養室などで培養し、これをヒトの体に移植することによって、損傷部位の再生や病気の治療をする再生医療や細胞移植等の研究開発が始まり、実用化も始まっている。

【0003】

治療に用いられるヒト体性幹細胞の維持培養および分化細胞（例えば、骨細胞、脂肪細胞、心筋細胞等）への誘導には、通常、動物血清（例えば、ウシ胎児血清、ヒト血清など）が用いられている。しかし、動物血清は、成分構成が完全にわかっていないことに加え、未知のウイルスやプリオン病への感染の危険性が知られている。

【0004】

さらに、動物血清の起源や製品ロットにより培養細胞の増殖性や分化誘導能力等の性能が異なることが知られている。そのため、高濃度の動物血清を含んだ培地での維持培養および分化誘導細胞の品質を一定にすることが難しいという問題点がある。

【0005】

そして、未知のウイルスやプリオン病への感染の危険性を回避するために、動物血清の代わりに細胞移植を必要とする患者自身の血清を使用して、体性幹細胞の増殖培養および目的の組織細胞への分化誘導が行われている。しかし、患者の血清を用いる場合、患者から比較的、多量の血液を採取しなければならないことから、患者の身体的な負担が大きいという問題がある。

【0006】

近年、動物血清の起源やロットの影響を可能な限り低減する手段として、使用する血清量を抑えた培地での分化誘導方法が報告されている。例えば、血清添加量を減らして間葉系幹細胞から骨細胞へ分化誘導する方法（非特許文献１）が報告されている。そして、特許文献１では、ヒト血清を含んだ培地でヒト骨髄由来の間葉系幹細胞を培養する発明であり、培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞をヒト血清が含まれた分化誘導培地で骨組織へ誘導する実施例を挙げている。

【0007】

従来から行われている間葉系幹細胞から骨細胞へ分化誘導する方法は、β−グリセロリン酸、デキサメタゾン、ビタミンＣおよび１０％の動物血清を添加している（非特許文献２）。

【0008】

また、特許文献２では、リゾリン脂質受容体、すなわち内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーのリガンド、例えばリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、スフィンゴシン１リン酸（Ｓ１Ｐ）などを含む、ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞を培養するための無血清培地が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】特開２００６−５５１０６号

【特許文献2】特表２００６−５０５２４８号

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ. ２００８ Ｆｅｂ ２６；９：２６

【非特許文献2】Ｊ. Ｃｅｌｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ. Ｖｏｌ.６４, ２９５−３１２（１９９７）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明は、無血清培地条件下で哺乳類の間葉系幹細胞から骨細胞の特徴を持った細胞へ分化誘導する分化誘導培地、添加剤および方法を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本願発明者は、鋭意研究の結果、従来から哺乳類の間葉系幹細胞から骨細胞への分化誘導に添加されている誘導剤の他に、内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドであるリゾホスファチジン酸、微量元素であるセレンを添加した無血清培地で、効果的に哺乳類の間葉系幹細胞から骨細胞へ分化させることができることを見出した。さらに、この無血清培地に、間葉系幹細胞から骨細胞への分化に関与するメラトニン、ビタミンＤ、ビタミンＡ、ビタミンＫおよび亜鉛を添加することも可能であることを見出し、本発明を完成した。

【0013】

すなわち、本発明は、哺乳動物細胞培養用基本培地と、哺乳動物の間葉系幹細胞から骨細胞への分化誘導剤と、内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドと、セレンとを含み、無血清であり、前記分化誘導剤がβ−グリセロリン酸、デキサメタゾン及びビタミンＣを同時に含むものであり、グルタミン酸をさらに含む、哺乳動物の間葉系幹細胞から骨細胞への分化誘導培地を提供する。また、本発明は、内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドと、セレンとを含む、哺乳動物の間葉系幹細胞から骨細胞への分化誘導培地添加剤を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の培地中で、骨細胞へ分化し得る間葉系幹細胞を培養することを含む、間葉系幹細胞から骨細胞への分化誘導方法を提供する。

【発明の効果】

【0014】

本発明の培地および培地添加剤は、哺乳類の体性幹細胞から骨細胞への分化誘導する際に従来の分化誘導培地に添加されていた動物血清を用いない条件下、すなわち、無血清条件下で哺乳類の体性幹細胞から効率的に骨細胞へ分化誘導させることを可能にする。さらに、血清を用いることにより発生していた問題（血清の起源、ロットによる分化誘導への影響、未知・既知の感染性病原体の混入など）を解決することができる。その結果、安定した品質の骨細胞を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】実施例１、比較例１〜３で得られた各培地で、２１日間、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞から骨細胞へ分化誘導した細胞をアリザリンレッドＳで染色した図である。

【図2】実施例１、比較例１〜３で得られた各培地中で７〜２１日間、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞から骨細胞へ分化誘導した細胞のＡＬＰ活性の変化を示したグラフである。

【図3】実施例１、比較例１〜３で得られた各培地中で７〜２１日間、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞から骨細胞へ分化誘導した細胞のＡＬＰのｍＲＮＡ発現変化を示したグラフである。

【図4】実施例２、比較例４〜６で得られた各培地で、１４日間、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞から骨細胞へ分化誘導した細胞をアリザリンレッドＳで染色した図である。

【図5】実施例３、比較例７〜９で得られた各培地で、１４日間、ヒト骨芽細胞から骨細胞へ分化誘導した細胞をアリザリンレッドＳで染色した図である。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本発明において、「体性幹細胞」とは、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、皮膚細胞、神経細胞、筋肉細胞、血液系細胞、繊維芽細胞、肝臓細胞など生体内の各器官を形成する１種類以上の組織細胞に分化転換することができる細胞である。そして、「体性幹細胞」は、何種類かの異なった機能を持つ細胞に分化する能力を有する幹細胞および前駆細胞のうち、胚性幹細胞を除く細胞であり、誘導多機能幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞などを含む。

【0017】

本発明の培地中で分化誘導可能な細胞としては、哺乳類の骨細胞へ分化可能な間葉系幹細胞であれば何ら限定されず、好ましい例として、骨髄由来間葉系間幹細胞、脂肪組織由来幹細胞等の間葉系幹細胞を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。

【0018】

本発明の培地には、内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドが必須成分として含まれる。ここで、Ｅｄｇファミリーレセプターは、その遺伝子配列の相同性が高いＧタンパク質共役型のレセプターの一群であり、現在までにヒト、マウス、ヒツジなどの哺乳類でＥｄｇ−１からＥｄｇ−８までが同定されている。これらのうち、Ｅｄｇ−２、Ｅｄｇ−４及びＥｄｇ−７はＬＰＡレセプターとして機能し、Ｅｄｇ−１、Ｅｄｇ−３、Ｅｄｇ−５、Ｅｄｇ−６及びＥｄｇ−８はＳ１Ｐレセプターとして機能することが知られている。また、「レセプターに対するリガンド」とは、該レセプターと特異的に結合する物質であり、生体内に存在する天然のリガンドのみならず、アゴニストやアンタゴニストとして知られる天然又は合成された他の化合物をも包含する。

【0019】

Ｅｄｇファミリーレセプターに対するリガンド（以下、便宜的に「Ｅｄｇリガンド」と呼ぶことがある）としては、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）およびその塩などのアゴニストからなる群より選択される１又は複数種の化合物が好ましい。

【0020】

Ｅｄｇファミリーレセプターに対するアゴニストとは、Ｅｄｇファミリーと結合してＬＰＡ同様に作用する物質であり、例えば、スフィンゴシン１リン酸（Ｓ１Ｐ）、ジヒドロスフィンゴシン１リン酸、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、スフィンゴシルホスホリルコリン、アルキルＬＰＡアナログ、ＦＴＹ７２０などが挙げられる。

【0021】

ＬＰＡとは、下記の一般式（Ｉ）：
Ｒ−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２ＰＯ_４Ｈ_２ （Ｉ）
（式中、Ｒは、炭素数１０〜３０のアルキル基、炭素数１０〜３０のアルケニル基又は炭素数１０〜３０のアシル基である）
で表される化合物である。なお、上記の式（Ｉ）のＲ基についてのアシル基の炭素数は、カルボニル基の炭素数を含まない。

【0022】

ＬＰＡの塩としては、従来公知の塩を用いることができ、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、アンモニウム塩などが挙げられる。ＬＰＡ又はＬＰＡの塩としては、例えば１−オレオイルリゾホスファチジン酸ナトリウム塩、ＬＰＡカリウム塩などが挙げられる。

【0023】

Ｅｄｇリガンドは、単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。

【0024】

本発明の培地には、微量元素であるセレンが含まれる。セレンは、細胞内で発生した過酸化水素を水と酸素に分解するグルタチオン・ペルオキシダーゼの活性に重要な役割を果たすことが知られている。

【0025】

セレンは、通常、例えばセレン酸、亜セレン酸ナトリウムなどの化合物の形態で培地中に含まれる。

【0026】

このようなセレン含有化合物は、単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。

【0027】

本発明の培地中のＥｄｇリガンドの濃度は、０．０１μＭ〜５０μＭが好ましく、さらに好ましくは０．１μＭ〜１０μＭである。また、セレン濃度は１ｎＭ〜1μＭが好ましく、さらに好ましくは１ｎＭ〜５００ｎＭである。

【0028】

本発明の培地に、さらに、脂溶性ビタミンであるビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＫ、松果体ホルモンであるメラトニンおよび微量元素である亜鉛から成る群より選ばれる少なくとも１種を添加することができる。ビタミンＡは、胚性幹細胞から神経系細胞への分化誘導を制御することが知られている。そして、ビタミンＫは、血液凝固作用および骨へのカルシウム定着作用が知られている。そして、メラトニンは、体性幹細胞から脂肪細胞への分化を抑制する効果および松果体ホルモンとしてサーカディアン・リズムを示し睡眠に関係していることが知られている。そして、亜鉛は、微量必須元素であり、多くの酵素の活性に必要な元素であることが知られている。

【0029】

ビタミンＡとしては、例えば、レチノイン酸およびその誘導体などが挙げられる。ビタミンＡは、単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。ビタミンＡが培地中に含まれる場合、その濃度は、特に限定されないが、通常、０．１〜１００μＭ程度、好ましくは、１〜１０μＭ程度である。

【0030】

ビタミンＤとしては、例えばエルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール、その誘導体（例えば７−デヒドロコレステロール等）およびその代謝物（例えば、カルシトリオール等）などが挙げられる。ビタミンＤは、単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。ビタミンＤが培地中に含まれる場合、その濃度は、特に限定されないが、通常、０．１〜５００ｎＭ程度、好ましくは、１〜１００ｎＭ程度である。

【0031】

ビタミンＫとしては、例えば、フィロキノン、メナキノン、メナジオンおよびメナジオール二リン酸ナトリウム等が挙げられる。ビタミンＫは、単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。ビタミンＫが培地中に含まれる場合、その濃度は、特に限定されないが、通常、０．１〜１００μＭ程度、好ましくは、１〜１０μＭ程度である。

【0032】

メラトニンが培地中に含まれる場合、その濃度は、特に限定されないが、通常、０．１〜１００ｎＭ程度、好ましくは、１〜５０ｎＭ程度である。

【0033】

亜鉛は、亜鉛化合物の形態で培地に添加することができる。このような亜鉛化合物としては、例えば、塩化亜鉛（ＺｎＣｌ_２） 、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、硫化亜鉛（ＺｎＳ）および硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４）などの化合物が挙げられる。これらの亜鉛化合物は、単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。亜鉛が培地中に含まれる場合、その濃度は、特に限定されないが、通常、０．１ｎＭ〜１００μＭ程度、好ましくは、１ｎＭ〜１０μＭ程度である。

【0034】

本発明の培地は、哺乳動物の間葉系幹細胞から骨細胞への分化誘導剤を含む。間葉系幹細胞から骨細胞への分化誘導剤自体は公知であり、本発明において用いられる分化誘導剤は、β−グリセロリン酸、デキサメタゾン及びビタミンＣを同時に含むものである。

【0035】

ビタミンＣは、水溶性ビタミンとして知られ、アミノ酸の生合成に利用されるほか、副腎からのホルモンの分泌、脂肪酸をミトコンドリアに運ぶための担体であるL-カルニチンの合成、結合組織でコラーゲンを生成など、体内で進行するヒドロキシル化反応に重要な役割を果たすことが知られている。ビタミンＣは、アスコルビン酸若しくはアスコルビン酸２リン酸又はその塩でよく、これらの混合物でもよい。

【0036】

上記分化誘導剤の濃度は、用いる分化誘導剤の種類や細胞の種類等に応じて適宜設定されるが、分化誘導剤がβ−グリセロリン酸、デキサメタゾン及びビタミンＣを同時に含むものである場合、β−グリセロリン酸濃度は好ましくは１ｍＭ〜１００ｍＭ、さらに好ましくは５ｍＭ〜５０ｍＭであり、デキサメタゾン濃度は好ましくは１ｎＭ〜１μＭ、さらに好ましくは１０ｎＭ〜５００ｎＭであり、ビタミンＣ濃度は好ましくは１０μＭ〜１０ｍＭ、さらに好ましくは２００μＭ〜２ｍＭである。

【0037】

本発明の培地は、上記した２種類の必須成分および上記分化誘導物質を含むことを除き、公知の哺乳動物細胞用培地と同様でよい。従って、公知の基本培地に、上記した２種類の必須成分および従来から骨胞への分化誘導に使用されている分化誘導剤を添加することにより、本発明の培地を得ることができる。

【0038】

本発明の培地に用いることができる、好ましい公知の無血清基本培地としては、イーグル培地のような最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地α（ＭＥＭ−α）、間葉系細胞基礎培地（ＭＳＣＢＭ）、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２及びＦ−１０培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｗｉｌｌｉａｍｓ培地Ｅ、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＣＤＢ培地、１９９培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＭｃＣｏｙ改変培地などが挙げられる。これらの培地は、いずれもこの分野において周知の培地である。

【0039】

本発明の培地は、さらに、哺乳動物細胞用培地に含ませることが周知である種々の添加剤を含んでいてもよい。このような周知の添加剤として、アミノ酸類、無機塩類、ビタミン類、及び炭素源や抗生物質等の他の添加剤を挙げることができる。

【0040】

アミノ酸類としては、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン及びＬ−バリンを挙げることができる。

【0041】

無機塩類としては、塩化カルシウム、硫酸銅、硝酸鉄（III）、硫酸鉄、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム及び硫酸亜鉛を挙げることができる。

【0042】

ビタミン類としては、コリン、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ４、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ１３、ビタミンＢ１５、ビタミンＢ１７、ビタミンＢｈ、ビタミンＢｔ、ビタミンＢｘ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＦ、ビタミンＫ、ビタミンＭ及びビタミンＰを挙げることができる。

【0043】

これらの添加剤を哺乳動物細胞用の培地に添加すること自体は公知であり、各添加剤の添加量も公知の培地と同様でよく、また、ルーチンな試験により適宜設定することもできる。例えば、アミノ酸類の添加量は、通常、各アミノ酸毎に５ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／Ｌ程度、好ましくは１０ｍｇ／Ｌ〜４００ｍｇ／Ｌ程度であり、無機塩類の添加量は、通常、０ｍｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌ程度、好ましくは、０．０１ｍｇ／Ｌ〜７ｇ／Ｌ程度であり、ビタミン類の添加量は、各ビタミン毎に０．０１ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／Ｌ程度、好ましくは０．０５ｍｇ／Ｌ〜３００ｍｇ／Ｌ程度である。

【0044】

他の添加剤としては、（１）繊維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)、内皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、及び血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）等の増殖因子、（２）ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン及びカナマイシン等の抗生物質、（３）グルコース、ガラクトース、フルクトース及びスクロース等の炭素源、（４）マグネシウム、鉄、亜鉛、カルシウム、カリウム、ナトリウム、銅、セレン、コバルト、スズ、モリブデン、ニッケル及びケイ素等の微量金属）、（５） ２−メルカプトエタノール、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ及びＮ-アセチルシステイン等の抗酸化剤、並びにアデノシン ５‘−一りん酸、コルチコステロン、エタノールアミン、インスリン、還元型グルタチオン、リポ酸、ヒポキサンチン、フェノールレッド、プロゲステロン、プトレシン、ピルビン酸、チミジン、トリヨードチロニン、トランスフェリン及びラクトフェリン等の他の添加剤を挙げることができる。これらの添加剤の添加量も従来と同様でよく、また、各添加剤の目的に応じ、ルーチンな試験により適宜設定することもできる。通常、０．００１ｍｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌ、特に０．１〜３ｇ／Ｌ程度である。

【0045】

本発明の培地は、上記した各種添加剤の１種又は複数種を含むことができ、通常、複数の添加剤を組み合わせて含む。

【0046】

なお、これらの他の添加剤のうち、グルタミン酸は、培地に添加した場合に細胞の生存および骨細胞への分化に効果を発揮すると思われるので、本発明の培地はグルタミン酸を含む。グルタミン酸の場合、培地中の好ましい濃度は１μＭ〜１ｍＭ、さらに好ましくは２５μＭ〜２５０μＭ程度である。

【0047】

本発明の培地は、無血清である。

【0048】

本発明の培地中での哺乳動物体細胞の培養自体は、従来と同様な方法で行なうことができ、通常、３０〜３７℃の温度、及び５％ＣＯ_２環境下、及び５〜２１％Ｏ_２環境下で行なわれる。また、分化誘導に必要な培養時間は、用いる分化誘導剤や細胞の種類等により適宜設定され、また、細胞の様子を観察しながら適宜選択することができるが、通常、１０日〜３０日程度である。

【0049】

本発明は、上記した本発明の培地を構成するための添加剤をも提供する。従って、本発明の添加剤は、上記したＥｄｇリガンド及びセレンを含む。また、これらにさらに上記分化誘導剤を含むものであってもよい。さらに、上記した各種添加剤の１種又は複数種を含んでいてもよい。さらに、基本培地の成分を含ませ、水に溶解するだけで、本発明の培地を与えるものとすることもできる。本発明の添加剤は、水又は基本培地に溶解することにより、上記した本発明の培地を与える組成を有するものが簡便で好ましい。この場合には、添加剤に含まれる各種成分の配合比率は、培地における各成分の含有量の比率と同じになる。なお、基本培地としては、従来から哺乳動物細胞の培養に用いられている、上記した各種培地が挙げられる。

【0050】

以下、本発明を実施例及び比較例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、各例に記載されている濃度は、培地中の終濃度である。また、用いたリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）は、いずれも１−オレオイルリゾホスファチジン酸ナトリウムであり、セレン化合物は、いずれも亜セレン酸ナトリウムであった。

【実施例】

【0051】

実施例１、比較例１〜３ 無血清条件下でのヒト骨髄由来間葉系幹細胞から骨細胞への分化誘導１

【0052】

基本培地（ＤＭＥＭ）に５μＭのリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、１ｍＭのアスコルビン酸２−リン酸および６０ｎＭのセレンを添加して無血清コントロール培地（比較例１）を製造した。

【0053】

ＤＭＥＭに最終濃度が１０ｍＭのβ−グリセロリン酸、１００ｎＭのデキサメダゾン、２００μＭアスコルビン酸リン酸を添加して、骨細胞分化誘導基本培地（分化基本培地）を調製した。この骨細胞分化誘導基本培地に５μＭのＬＰＡ、１ｍＭのアスコルビン酸２−リン酸、６０ｎＭのセレンおよび９０μＭのグルタミン酸を添加して本発明の無血清分化培地（実施例１）を製造した。

【0054】

ＤＭＥＭおよび分化基本培地のそれぞれに１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加して、従来培地（比較例２）および従来分化培地（比較例３）を製造した。

【0055】

ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（株名：正常ヒト間葉系幹細胞（Ｃｒｙｏ ｈＭＳＣ）、入手先：ＬＯＮＺＡ）を１００００細胞／ｃｍ^２の細胞密度となるように１２穴培養プレートのウェルに播種し、上記各培地中で、３７℃、５％ＣＯ_２で７〜２１日間培養することにより、骨細胞への分化誘導を行った。

【0056】

骨細胞の確認は、アリザリンレッドＳ染色により確認した。そして、細胞のアルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性は、ＴＲＡＣＰ＆ＡＬＰ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）により確認した。さらに、ＡＬＰのｍＲＮＡの発現量は、リアルタイムＰＣＲ法にて確認をした。プライマーは、ＡＬＰ：フォワード（cgtatttctccagacccagagg（配列番号１））、リバース（ggccttgtcctgaggagaaaga（配列番号２））を使用した。結果を、図１〜図３に示す。

【0057】

図１〜図３に示されるように、そして、アリザリンレッドＳ染色の結果からも、本発明の培地中で培養することにより、骨髄由来間葉系幹細胞から骨細胞へ分化したことが確認され、誘導された骨細胞の割合は、血清を含有する従来分化培地（比較例３）と同程度であった。

【0058】

実施例２、比較例４〜９ 無血清条件下でのヒト骨髄由来間葉系幹細胞から骨細胞への分化誘導２

【0059】

実施例１と同様、基本培地（ＤＭＥＭ）に５μＭのＬＰＡ、１ｍＭのアスコルビン酸２−リン酸および１００ｎＭのセレンを添加して無血清コントロール培地Ａ（比較例４）を製造した。

【0060】

実施例１と同様、ＤＭＥＭに最終濃度が１０ｍＭのβ−グリセロリン酸、１００ｎＭのデキサメダゾン、２００μＭアスコルビン酸２−リン酸を添加して、骨細胞分化誘導基本培地（分化基本培地）を調製した。この分化基本培地に、実施例１と同様、５μＭのＬＰＡ、１ｍＭのアスコルビン酸２−リン酸、１００ｎＭのセレンおよび９０μＭのグルタミン酸を添加して本発明の無血清分化培地Ａ（実施例２−１）を製造した。

【0061】

ＤＭＥＭに５μＭのＬＰＡ、１ｍＭのアスコルビン酸２−リン酸、１００ｎＭのセレン、５０ｎＭのコレカルシフェロールおよび５ｎＭのメラトニンを添加して無血清コントロール培地Ｂ（比較例５）、ＤＭＥＭに５μＭのＬＰＡ、１ｍＭのアスコルビン酸２−リン酸、１００ｎＭのセレン、５０ｎＭのコレカルシフェロールおよび２．５μＭのビタミンＡアセテートを添加して無血清コントロール培地Ｃ（比較例６）、ＤＭＥＭに５μＭのＬＰＡ、１ｍＭのアスコルビン酸２−リン酸、１００ｎＭのセレン、５０ｎＭのコレカルシフェロールおよび１μＭのビタミンＫ３を添加して無血清コントロール培地Ｄ（比較例７）を製造した。

【0062】

分化基本培地に５μＭのＬＰＡ、１ｍＭのアスコルビン酸２−リン酸、１００ｎＭのセレン、５０ｎＭのコレカルシフェロールおよび５ｎＭのメラトニンを添加して無血清分化培地Ｂ（実施例２−２）、ＤＭＥＭに５μＭのＬＰＡ、１ｍＭのアスコルビン酸２−リン酸、１００ｎＭのセレン、５０ｎＭのコレカルシフェロールおよび２．５μＭのビタミンＡアセテートを添加して無血清分化培地Ｃ（実施例２−３）、ＤＭＥＭに５μＭのＬＰＡ、１ｍＭのアスコルビン酸２−リン酸、１００ｎＭのセレン、５０ｎＭのコレカルシフェロールおよび１μＭのビタミンＫ３を添加して無血清分化培地Ｄ（実施例２−４）を製造した。

【0063】

ＤＭＥＭおよび分化基本培地のそれぞれに１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加して、従来培地（比較例８）および従来分化培地（比較例９）を製造した。

【0064】

実施例１と同様、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を３０００細胞／ｃｍ^２の細胞密度となるように１２穴培養プレートのウェルに播種し、これらの培地で、３７℃、５％ＣＯ_２で２１日間培養することにより、骨細胞への分化誘導を行った。骨細胞の確認は、アリザリンレッドＳ染色により確認した。

【0065】

結果を図４に示す。図４に示されるように、無血清分化培地Ａに、さらにコレカルシフェロール、メラトニン、ビタミンＡアセテート、ビタミンＫ３を、組合せて添加した無血清分化培地Ｂ〜Ｄにおいても、血清を含む従来分化培地（比較例９）と同程度に、骨細胞へ分化されることが確認された。従来培地（比較例８）や、無血清コントロール培地Ａ〜Ｄ（比較例４〜７）では、骨細胞に分化していないことを確認した。

【0066】

実施例３、比較例１０〜１２ 無血清条件下でのヒト骨芽細胞から骨細胞への分化誘導
実施例１同様にグルタミン酸を含んだ基礎培地（ＤＭＥＭ）に５μＭのＬＰＡ、１ｍＭのアスコルビン酸２−リン酸、６０ｎＭのセレンおよび９０μＭのグルタミン酸を添加して無血清コントロール培地（比較例１０）を製造した。

【0067】

実施例１同様にＤＭＥＭに最終濃度が１０ｍＭのβ−グリセロリン酸、１００ｎＭのデキサメダゾン、２００μＭアスコルビン酸２−リン酸を添加して、骨細胞分化基本培地（分化基本培地）を調製した。分化基本培地に５μＭのＬＰＡ、１ｍＭのアスコルビン酸２−リン酸、６０ｎＭのセレンおよび９０μＭのグルタミン酸を添加して本発明の無血清分化培地（実施例３）を製造した。

【0068】

実施例１同様に基本培地および分化基本培地それぞれに１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加して、従来培地（比較例１１）および従来分化培地（比較例１２）を製造した。

【0069】

ヒト骨芽細胞（株名：正常ヒト骨芽細胞（ＮＨＯｓｔ）、入手先：ＬＯＮＺＡ）を１００００細胞／ｃｍ^２の細胞密度となるように１２穴培養プレートのウェルに播種し、これらの培地で、３７℃、５％ＣＯ_２で１４日間培養することにより、骨細胞への分化誘導を行った。骨細胞の確認は、アリザリンレッドＳ染色で確認した。

【0070】

結果を図５に示す。図５に示されるように、本発明の無血清分化培地（実施例３）では、血清を含む従来分化培地（比較例１１）を用いた場合と同程度に骨細胞が増殖していた。一方、無血清コントロール培地（比較例１０）及び従来培地（比較例１１）では、骨細胞は誘導されなかった。

【図2】

【図3】

【図1】

【図4】

【図5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]