特許 5666053 長寿遺伝子発現増強剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】5666053

(24)【登録日】2014年12月19日

(45)【発行日】2015年2月12日

(54)【発明の名称】長寿遺伝子発現増強剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/23 20060101AFI20150122BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20150122BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20150122BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20150122BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20150122BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20150122BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20150122BHJP

【ＦＩ】

   A61K35/78 N

   A61P9/00

   A61P11/00

   A61P17/06

   A61P21/04

   A61P25/00

   A61P43/00 111

【請求項の数】3

【全頁数】9

(21)【出願番号】特願2014-158163(P2014-158163)

(22)【出願日】2014年8月1日

【審査請求日】2014年8月1日

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】000001959

【氏名又は名称】株式会社 資生堂

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100077517

【弁理士】

【氏名又は名称】石田 敬

(74)【代理人】

【識別番号】100087871

【弁理士】

【氏名又は名称】福本 積

(74)【代理人】

【識別番号】100087413

【弁理士】

【氏名又は名称】古賀 哲次

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100195486

【弁理士】

【氏名又は名称】千野 櫻子

(72)【発明者】

【氏名】深田 楓子

(72)【発明者】

【氏名】長谷川 達也

(72)【発明者】

【氏名】森 浩

(72)【発明者】

【氏名】鈴木 良治

【審査官】 鶴見 秀紀

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００３−０２６６９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 大野木宏，屋久島ボタンボウフウの血管機能改善作用 ，食品と開発 ，２００９年，Vol.44,No.12，Page.38-40

【文献】 ANIYA Y et al ，Effect of antioxidants in Okinawan medicinal herbs on aldose reductase activity，J Toxicol Sci，２００２年，Vol.27,No.4，Page.384

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３６／００−３６／９０６８

Ａ６１Ｐ ９／００

Ａ６１Ｐ １１／００

Ａ６１Ｐ １７／０６

Ａ６１Ｐ ２１／０４

Ａ６１Ｐ ２５／００

Ａ６１Ｐ ４３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ボタンボウフウ（Peucedanum japonicum Thunb.）の植物体またはその溶媒抽出物からなることを特徴とするSirtuin-1活性化剤（ただし、糖尿病、糖尿病の合併症、動脈硬化若しくは心疾患の治療又は予防のために使用する場合、あるいは発がん抑制剤又は血小板凝集抑制剤として使用する場合を除く）。

【請求項2】

前記溶媒抽出物が含水エタノール抽出物であることを特徴とする請求項１に記載のSirtuin-1活性化剤。

【請求項3】

ボタンボウフウの植物体が、その葉、茎、または全草であることを特徴とする請求項１又は２に記載のSirtuin-1活性化剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はSirtuin-1活性化剤を提供する。

【背景技術】

【0002】

近年、長寿遺伝子として、NAD⁺依存性脱アセチル化酵素であるサーチュイン（Sirtuin）遺伝子が注目されている。最初に酵母においてSir2遺伝子が同定されており、酵母や線虫などの下等生物を使った実験系によりSir2を欠損させると寿命が短縮し、過剰発現させると寿命が延長することが報告されている（非特許文献１及び２）。Sir2遺伝子は、哺乳類においても保存されており、Sirtuin-1からSirtuin-7まで同定されている。中でも、酵母Sir2と構造や機能が最も類似していることから、Sirtuin-1に注目が集まっている。

【0003】

Sirtuin-1が標的とするタンパク質は同定されており、その研究から細胞内代謝、エネルギー消費、炎症及びストレス応答経路等に関与していると考えられている。また、Sirtuin-1遺伝子の活性化は、抗動脈硬化、抗糖尿病、心疾患、抗癌作用、糖尿病性合併症、神経障害痛、微小血管機能障害、寿命延長、ミトコンドリア性疾患、ミトコンドリア性筋障害、神経変性病（例えば、アルツハイマー病、筋委縮性硬化症、パーキンソン病）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及び乾癬の治療に有用であると考えられている（非特許文献３及び４）。

【0004】

これまでに、サーチュイン活性化物質としては、ブドウの果皮などにも含まれるレスベラトロール、イチゴ等やリンゴに含まれるフィセチンと言ったポリフェノール化合物や、ＳＲＴ１７２０等の非ポリフェノール化合物が知られている。英国の大手製薬会社であるグラクソ・スミソクライン社は、Sirtuin-1活性化物質の開発を精力的に行なっており、例えばＳＲＴ２１０４は、２型糖尿病、骨粗しょう症・サルコペニア、さらには骨格筋萎縮の予防に効果があると報告されており（引用文献５）、現在臨床試験が進められている。

【0005】

一方、ボタンボウフウ（Peucedanum japonicum Thunb.)の植物体又はその抽出物には二糖類分解酵素を阻害する作用があり糖尿病の予防・治療や肥満の解消などに有効であること（特許文献１）、細胞賦活作用、抗酸化作用、メラニン産生抑制作用があること（特許文献２）、ヘペラナーゼ活性抑制作用があり、しわの防止、改善に有効であること（特許文献３）、セラミド合成促進作用があること（特許文献４）などが知られている。

【0006】

ボタンボウフウは、沖縄県では伝承的に「１株食べると１日長生きする」植物として、長命草と呼ばれている。また、サーチュイン（Sirtuin）遺伝子が長寿遺伝子として知られてから１５年以上経ている。しかしながら、ボタンボウフウの植物体又はその抽出物が、Sirtuin-1活性化作用を有することは、これまでに一切報告されておらず、本関連性を見出すことは容易ではなかったと言える。ボタンボウフウの長寿に関する伝承について科学的な根拠が示されていないことからも、本関連性を見出すことは容易でなかったと言える。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特開２００３−２６６９４号公報

【特許文献2】特開２００４−２６６９７号公報

【特許文献3】国際公開第２００９／１２３２１５号

【特許文献4】特開２００５−１９４２３９号公報

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Genes Dev., 13(19): 2570-80 (1999)

【非特許文献2】Nature, 410(6825): 227-30 (2001）

【非特許文献3】Nat. Rev. Drug Discov., 7(10): 841-853 (2008)

【非特許文献4】J. Invest. Dermatol., 129(1): 41-49 (2009)

【非特許文献5】Evi M. Mercken et.al., Aging Cell (2014)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明の課題は、Sirtuin-1活性化剤の提供にある。

【課題を解決するための手段】

【0010】

発明者らは、鋭意研究の結果、ボタンボウフウ（Peucedanum japonicum Thunb.）（別名「長命草」）の植物体またはその溶媒抽出物が、Sirtuin-1活性化剤として機能することを見出し、以下の発明を完成するに至った：
（１）ボタンボウフウ（Peucedanum japonicum Thunb.）の植物体またはその溶媒抽出物からなることを特徴とするSirtuin-1活性化剤。
（２）前記溶媒抽出物が含水エタノール抽出物であることを特徴とする（１）に記載のSirtuin-1活性化剤。
（３）ボタンボウフウの植物体が、その葉、茎、または全草であることを特徴とする（１）又は（２）に記載のSirtuin-1活性化剤。

【発明の効果】

【0011】

本発明のSirtuin-1活性化剤の投与により、Sirtuin-1を活性化することができる。本発明によれば、Sirtuin-1活性化剤を含有する経口摂取製剤を、提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】図１は、Sirtuin-1の発現量のウェスタンブロット法による評価を示す。

【図2】図２は、ボタンボウフウの酸化ストレスに対する細胞老化抑制作用を示す。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明のSirtuin-1活性化剤の投与により、Sirtuin-1を活性化することができる。Sirtuin-1遺伝子の活性化は、抗動脈硬化、抗糖尿病、心疾患、抗癌作用、糖尿病性合併症、神経障害痛、微小血管機能障害、寿命延長、ミトコンドリア性疾患、ミトコンドリア性筋障害、神経変性病（例えば、アルツハイマー病、筋委縮性硬化症、パーキンソン病）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及び乾癬の治療に有用である。

【0014】

本発明におけるSirtuin-1遺伝子の活性化とは、例えばSirtuin-1遺伝子の発現を亢進させること、例えば何も付与していない状態（コントロール）に比べて、Sirtuin-1活性化剤を付与した場合にSirtuin-1遺伝子の発現が、例えば有意水準を5%とした統計学的有意差（例えばスチューデントのｔ検定）をもって亢進していることを意味し得る。または、本発明におけるSirtuin-1遺伝子の活性化とは、例えば何も付与していない状態（コントロール）に比べて、Sirtuin-1活性化剤を付与した場合に、Sirtuin-1遺伝子の発現が、例えば10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以、70％以上、80％以上、90％以上、100％以上、200％以上、300％以上、400％以上、又は500％以上亢進していることを意味し得る。

【0015】

本発明のSirtuin-1活性化剤は、経口的に摂取することが可能なボタンボウフウ（Peucedanum japonicum Thunb.)抽出物を有効成分として含有する。

【0016】

本発明で用いられるボタンボウフウ（Peucedanum japonicum Thunb.）（別名「長命草」）はセリ科（Umbelliferae）カワラボウフウ属（Peucedanum L.）の植物であり、本州石川県、関東地方以西、四国、九州、沖縄及び朝鮮半島、中国、台湾、フィリピンに分布し、海辺の向陽地に生える多年草である（新訂原色牧野和漢薬草大図鑑 368頁 (2002)）。

【0017】

ボタンボウフウは生のままでも乾燥したものでも使用することができるが、使用性、製剤化等の観点から乾燥粉末あるいは抽出物として用いることが好ましい。

【0018】

乾燥粉末を得る方法としては、植物の全草あるいは各種部位（葉、花、根等）を細断又は粉砕し、その後に乾燥する方法や植物を乾燥した後に細断又は粉砕して乾燥粉末を得る方法がある。また、植物を細断又は粉砕し、発酵や酵素処理を施した後、乾燥し、更に必要に応じて所定の粒径にすべく粉砕する方法等を適宜採ることができる。

【0019】

本発明で用いる抽出物の抽出方法は溶媒抽出により行うことができる。溶媒抽出の場合には、植物の全草あるいは各種部位（葉、花、根等）を必要に応じて乾燥させ、更に必要に応じて細断又は粉砕した後、水性抽出剤、例えば冷水、温水、又は沸点若しくはそれより低温の熱水、あるいは含水有機溶媒、有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、１，３−ブタンジオール、エーテル等を常温で又は加熱して用いることにより抽出される。しかしながら、抽出方法は溶媒抽出に限定されず、当業界で知られている常用の手法によってもよい。上記抽出物の形態は、抽出液自体だけでなく、常用の手法により適宜希釈又は濃縮したものであってもよく、更に、抽出液を乾燥することによって得られる粉状あるいは塊状の固体であってもよい。

【0020】

本発明に用いられる抽出溶媒は、含水有機溶媒が好ましく、特に含水メタノール、含水エタノール又は含水１，３−ブタンジオール等の含水低級アルコールを選ぶことが好ましく、含水エタノールが最も好ましい。その場合の含水率は、例えば２０〜８０質量％である。

【0021】

本発明のSirtuin-1活性化剤は、経口摂取または外用で投与することができる。

【0022】

本発明のSirtuin-1活性化剤を経口摂取する場合、ボタンボウフウの植物体またはその溶媒抽出物の配合量は、それらの種類、目的、形態、利用方法などに応じて、適宜決めることができる。成人一日当たりの植物体またはその溶媒抽出物の摂取量が、約０．１６ｇ〜約１６ｇ（乾燥質量換算）程度になるように調製することが好ましい。より好ましくは約０．８〜約８ｇ（乾燥質量換算）程度になるように調製することが好ましい。また、経口摂取製剤として利用する場合には、本発明の有効成分をSirtuin-1活性化の効果が十分発揮されるような量で含有させることが好ましい。

【0023】

本発明のSirtuin-1活性化剤を経口摂取製剤に配合する場合には、必要に応じて添加剤を任意に選択し併用することができる。添加剤としては賦形剤等を含ませることができる。

【0024】

賦形剤としては、所望の剤型としたときに通常用いられるものであれば何でも良く、例えば、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、デキストリン、シクロデキストリンなどのでんぷん類、結晶セルロース類、乳糖、ブドウ糖、砂糖、還元麦芽糖、水飴、フラクトオリゴ糖、乳化オリゴ糖などの糖類、ソルビトール、エリスリトール、キシリトール、ラクチトール、マンニトールなどの糖アルコール類が挙げられる。これら賦形剤は、単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。

【0025】

その他の着色剤、保存剤、増粘剤、結合剤、崩壊剤、分散剤、安定化剤、ゲル化剤、酸化防止剤、界面活性剤、保存剤、ｐＨ調整剤等については、公知のものを適宜選択して使用できる。

【0026】

経口摂取の形態としては、例えば、液体状、固形状、顆粒状、粒状、ペースト状、ゲル状など任意に選択することができる。

【実施例】

【0027】

次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。

【0028】

実験１：試料の調製
ボタンボウフウ乾燥粉末を70％エタノールに浸漬し、室温にて一晩撹拌した。濾過液を減圧濃縮して回収し、実験時にDMSO液に溶解して評価した。

【0029】

実験２：Sirtuin-1発現に対するボタンボウフウの作用
ウェスタンブロット法による評価
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)(LONZA, MD)をCollagen-Coated Microplate 6wellに播種し、サブコンフルエントになるまで培養した。その後、ボタンボウフウエキス (最終濃度：10 μg/mL)、又はレスベラトロール（5μM）を含んだ培地 (EBM2) にて48時間インキュベートし、Phospho Safe Extraction Reagent (EMD chemicals, CA) にてタンパクを回収し、BCA kit (Pierce Biotechnology, Rockford, IL)を用いてタンパク濃度を測定した。サンプルのタンパク濃度が等量になるように調整し、1次抗体はanti-Sirtuin-1 (Santa Cruz Biotechnology, CA)、anti-βactin (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) 、2次抗体はそれぞれanti-rabbit (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) anti-mouse (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) を用いてウェスタンブロット法にて評価した。統計的有意差検定には、ステューデントのｔ検定を用いた。

【0030】

結果を図１に示す。ボタンボウフウエキスを（10μg/mL）を添加してインキュベートした場合、コントロール及び既知のSirtuin-1活性化剤であるレスベラトロール（5μM）を添加してインキュベートした場合に比べてSirtuin-1発現が増加した（p＜0.05）。

【0031】

なお、ボタンボウフウには、クロロゲン酸、ルチン及びヘスペリジンが含まれていることが知られているが、クロロゲン酸にはSirtuin-1の活性化作用はないことが報告されており（PLoS One, 2014, 9(2), e89166）、ルチンについては、生体内でルチンから変換されて生じるケルセチンがSirtuin-1の発現抑制作用を有することが報告されている(J. Pharmacol. Sci.，2008，108，364-71）。一方、ボタンボウフウの植物体中に微量で存在するヘスペリジンは、5μMでSirtuin-1活性化作用を有することが報告されている（Biosci. Biotechnol. Biochem., 2012, 76(4), 640-645 ）。しかしながら、試験サンプルエキスの調製に用いた粉末をHPLCにより測定したところ、ヘスペリジン含量は0.62％重量であった。効果濃度（エキス10μg/mL）のエキス中に含まれるヘスペリジン（分子量610）濃度は最大でも0.102μMに過ぎないことから、ボタンボウフウの優れたSirtuin-1活性化作用は、既知の含有成分によっては説明することはできない。

【0032】

実験３．酸化ストレスに対する細胞老化の抑制作用
H₂O₂の添加による酸化ストレスに対するボタンボウフウの細胞老化抑制作用を、老化マーカーであるSA β-Gal（Senescence-associated β-galactosidase）の活性増加により評価した。細胞老化をおこした細胞は、SA β-Gal活性が増加し、基質を加えると青色に染色される。
HUVECを100 mm/Collagen-Coated Dishに培地(EBM2) (Lonza, Basal, Switzerland) にてサブコンフルエントになるまで培養した。その後、H₂O₂ (最終濃度：0, 100 μM) を添加し、1時間インキュベートし(37℃, 0.5 % CO₂)、ボタンボウフウエキス(最終濃度：10 μg/mL)を含んだ培地 (EBM2) を用いて5×10⁴ cells/dishになるように再播種した。その後5日間培養し、Cellular Senescence Assay Kit (MILLIPORE, MA) を用いて評価した。統計的有意差検定には、ステューデントのｔ検定を用いた。

【0033】

結果を図２に示す。ボタンボウフウエキスを含まない培地でインキュベートした細胞は、H₂O₂の添加によりSA β-Gal活性が増加し、細胞は青色に染色された。これに対し、ボタンボウフウエキス（10μg/mL）を含んだ培地でインキュベートした細胞は、その青色の染色性は減弱されていた（p＜0.05）。これは、ボタンボウフウエキスによりSA β-Galの活性が抑制され、ひいては細胞老化が抑制されたことを示す。

【要約】

【課題】新規Sirtuin-1活性化剤の提供。
【解決手段】本発明は、ボタンボウフウ（Peucedanum japonicum Thunb.）の植物体またはその溶媒抽出物からなることを特徴とするSirtuin-1活性化剤を提供する。
【選択図】図１

【図1】

【図2】