特許 5669054 膵炎の予防・治療剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5669054

(24)【登録日】2014年12月26日

(45)【発行日】2015年2月12日

(54)【発明の名称】膵炎の予防・治療剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7008 20060101AFI20150122BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20150122BHJP

   A61P 1/18 20060101ALI20150122BHJP

   C07H 5/06 20060101ALN20150122BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/7008

   A61P43/00 111

   A61P1/18

   !C07H5/06

【請求項の数】8

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2009-156834(P2009-156834)

(22)【出願日】2009年7月1日

(65)【公開番号】特開2010-31002(P2010-31002A)

(43)【公開日】2010年2月12日

【審査請求日】2012年6月7日

(31)【優先権主張番号】特願2008-172162(P2008-172162)

(32)【優先日】2008年7月1日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】305013910

【氏名又は名称】国立大学法人お茶の水女子大学

(74)【代理人】

【識別番号】100107984

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 雅紀

(74)【代理人】

【識別番号】100102255

【弁理士】

【氏名又は名称】小澤 誠次

(74)【代理人】

【識別番号】100096482

【弁理士】

【氏名又は名称】東海 裕作

(74)【代理人】

【識別番号】100123168

【弁理士】

【氏名又は名称】大▲高▼ とし子

(74)【代理人】

【識別番号】100120086

【弁理士】

【氏名又は名称】▲高▼津 一也

(74)【代理人】

【識別番号】100131093

【弁理士】

【氏名又は名称】堀内 真

(72)【発明者】

【氏名】小川 温子

(72)【発明者】

【氏名】齊藤 泉

(72)【発明者】

【氏名】坂上 ひろみ

【審査官】 山村 祥子

(56)【参考文献】

【文献】 特表平０４−５００９６１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００８−１２０７１６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Ina, C et al，Comparison of the carbohydrate binding activities among major pancreatic proteinases, chymotrypsin, trypsin, and their zymogens.，生化学，２００５年，Vol.77,No.8，p.745の2P-030

【文献】 SURGERY FRONTIER，２００６年，Vol.13,No.4，p.445-453

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／７００８

Ａ６１Ｐ １／１８

Ａ６１Ｐ ４３／００

Ｃ０７Ｈ ５／０６

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ガラクトサミン又はその誘導体を含有することを特徴とするトリプシノーゲン活性化抑制用の製剤であって、
前記誘導体が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミンの１位のヒドロキシ基が、アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの２位のＮ−アセチル基がＮ−硫酸基、遊離アミノ基又はＮ−グリコリル基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が硫酸基、Ｏ−アセチル基、リン酸基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；メチルα−ガラクトサミニド；及び、メチルβ−ガラクトサミニド；並びに、これらの塩からなる群から選択される化合物である、トリプシノーゲン活性化抑制用の製剤。

【請求項2】

ガラクトサミンの誘導体が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミンの１位のヒドロキシ基が、アルコキシ基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの２位のＮ−アセチル基がＮ−硫酸基、遊離アミノ基又はＮ−グリコリル基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が硫酸基、Ｏ−アセチル基、リン酸基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；及び、ガラクトサミンの塩酸塩；から選択される化合物であることを特徴とする請求項１に記載のトリプシノーゲン活性化抑制用の製剤。

【請求項3】

ガラクトサミン誘導体を含有することを特徴とする膵炎の予防・治療剤であって、
前記誘導体が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミンの１位のヒドロキシ基が、アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの２位のＮ−アセチル基がＮ−硫酸基、遊離アミノ基又はＮ−グリコリル基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が硫酸基、Ｏ−アセチル基、リン酸基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；メチルα−ガラクトサミニド；及び、メチルβ−ガラクトサミニド；並びに、これらの塩からなる群から選択される化合物である、膵炎の予防・治療剤。

【請求項4】

ガラクトサミンの誘導体が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミンの１位のヒドロキシ基が、アルコキシ基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの２位のＮ−アセチル基がＮ−硫酸基、遊離アミノ基又はＮ−グリコリル基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が硫酸基、Ｏ−アセチル基、リン酸基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；及び、ガラクトサミンの塩酸塩；から選択される化合物であることを特徴とする請求項３に記載の膵炎の予防・治療剤。

【請求項5】

トリプシノーゲン活性化抑制用の製剤の製造におけるガラクトサミン又はその誘導体の使用であって、
前記誘導体が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミンの１位のヒドロキシ基が、アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの２位のＮ−アセチル基がＮ−硫酸基、遊離アミノ基又はＮ−グリコリル基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が硫酸基、Ｏ−アセチル基、リン酸基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；メチルα−ガラクトサミニド；及び、メチルβ−ガラクトサミニド；並びに、これらの塩からなる群から選択される化合物である、使用。

【請求項6】

膵炎の予防・治療剤の製造におけるガラクトサミン誘導体の使用であって、
前記誘導体が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミンの１位のヒドロキシ基が、アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの２位のＮ−アセチル基がＮ−硫酸基、遊離アミノ基又はＮ−グリコリル基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が硫酸基、Ｏ−アセチル基、リン酸基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；メチルα−ガラクトサミニド；及び、メチルβ−ガラクトサミニド；並びに、これらの塩からなる群から選択される化合物である、使用。

【請求項7】

ガラクトサミンの誘導体が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミンの１位のヒドロキシ基が、アルコキシ基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの２位のＮ−アセチル基がＮ−硫酸基、遊離アミノ基又はＮ−グリコリル基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が硫酸基、Ｏ−アセチル基、リン酸基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；及び、ガラクトサミンの塩酸塩；から選択される化合物であることを特徴とする請求項５に記載の使用。

【請求項8】

ガラクトサミンの誘導体が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミンの１位のヒドロキシ基が、アルコキシ基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの２位のＮ−アセチル基がＮ−硫酸基、遊離アミノ基又はＮ−グリコリル基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が硫酸基、Ｏ−アセチル基、リン酸基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；及び、ガラクトサミンの塩酸塩；から選択される化合物であることを特徴とする請求項６に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、トリプシノーゲン活性化抑制剤や、膵炎の予防・治療剤等に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、食文化の欧米化が進んだ結果、脂肪分や酒類の過剰摂取による急性及び慢性の膵炎の患者が増加している。膵炎の発症メカニズムは完全には判明していないが、膵液の消化酵素によって、膵臓自体が消化されて炎症を起こすという点では共通している。本来、膵臓トリプシンの不活性前駆体であるトリプシノーゲンは、膵液中に分泌され、膵管を通って十二指腸に達し、そこで発現されているエンテロキナーゼによって活性化される。ところが何らかの原因によりトリプシノーゲンが膵臓中で早期に活性化されてトリプシンに変化すると、そのトリプシンが膵臓中の他のプロテアーゼ前駆体（例えば、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、プロエラスターゼ、プロカルボキシペプチダーゼ、及び、プロテアーゼにより活性化されるレセプター等（非特許文献１及び２））を連鎖的に活性化し、活性化されたプロテイナーゼが膵臓細胞の破壊を誘導することによって、急性膵炎を発症する。また、このような炎症がより緩やかに繰り返し長期間にわたって起こると、膵臓の正常な細胞が徐々に破壊されていき、慢性膵炎を発症する。

【0003】

これら膵炎の予防・治療剤として、様々なトリプシン阻害剤が開発されている。例えば特許文献１には、ウイッチヘーゼル、ローズマリー、レンギョウ、ムクゲ、チョウジ、バナバ、フウ、セイヨウヤマハッカ及びザクロから成る群より選ばれる少なくとも１種類の植物又はその抽出物を含有するトリプシン阻害剤が記載されており、また、特許文献２には、グアニジノ安息香酸誘導体からなるトリプシン阻害剤が記載されている。さらに、他のトリプシン阻害剤として、「フオイパン」（登録商標）としても知られ、慢性膵炎における急性症状の緩解や術後逆流性食道炎に対して主に用いられるカモスタットメシル酸塩や、「エフオーワイ」（登録商標）としても知られ、急性膵炎、汎発性血管内血液凝固症に対して主に用いられるガベキサートメシル酸塩が知られている。しかし、天然成分由来のトリプシン阻害剤では、未だ十分な効果が得られているとはいえず、また、フオイパン等の合成化合物からなるトリプシン阻害剤においては、副作用の問題があり、改善の余地があった。

【0004】

一方、本発明者らは、ウシの膵臓のトリプシン（ＢＰＴ）やブタのそれ（ＰＰＴ）と、糖タンパク質のＮ−グリカンとの結合性を調べた。非特許文献３には、その結果として、ＢＰＴ及びＰＰＴのいずれも、１７種類の糖−ビオチニルポリアクリルアミド（ＢＰ）プローブ（ポリアクリルアミド骨格の−ＣＯＮＨ_２基に、短いスペーサー（−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−）を介して糖をグリコシド結合で共有結合させたプローブ；例えばα−マンノースＢＰプローブについて図５参照）のうち、α−マンノース（α−Ｍａｎ）；α−マンノース−６−リン酸（α−Ｍａｎ−６Ｐ）；Ｎ−アセチルノイラミン酸α２，６ガラクトースβ１，４グルコース（Ｎｅｕ５Ａｃα２，６Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ）；α−ガラクトース（α−Ｇａｌ）；又は、β−グルコース（β−Ｇｌｃ）；のプローブには、高い結合力を示したが、ＢＰＴ及びＰＰＴのいずれもα−Ｎ−アセチルガラクトサミン（α−ＧａｌＮＡｃ）等には結合しなかった、と記載されている（非特許文献３の３２ページの“RESULTS”の第１段落）。

【0005】

以上のような非特許文献３の結果を考慮すると、ＢＰＴやＰＰＴのいずれにも結合しなかった「α-ＧａｌＮＡｃの１位にスペーサーが結合した化合物」（α−ＧａｌＮＡｃの１位のヒドロキシ基がブトキシ基に置換された化合物）をはじめとする、α−ＧａｌＮＡｃの１位のヒドロキシ基がアルコキシ基に置換された化合物等が、トリプシノーゲンやトリプシンの活性の阻害剤や促進剤として機能する可能性はきわめて低いと考えられた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開２００５−０５３８１８号公報

【特許文献2】特公昭６０−４９１８５号公報

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Pancreas, 21, 57-62 (2000)

【非特許文献2】Curr. Opin. Struct. Biol., 2, 713-720 (1992)

【非特許文献3】J. Biol. Chem., 281, 8528-8538 (2006)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明の課題は、生体に投与しても副作用の懸念がほとんどなく、かつ、十分なトリプシノーゲン活性化抑制作用（又はトリプシン阻害作用）を発揮するトリプシノーゲン活性化抑制剤、あるいは、膵炎の予防・治療剤等を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、ＢＰＴやＢＰＴＧ（ウシトリプシノーゲン）と、糖との結合性を調べるために、非特許文献３と同様に、糖−ＢＰプローブを用いたアッセイを行なった。この糖−ＢＰプローブとは、前述したように、ポリアクリルアミド骨格の−ＣＯＮＨ_２基に、短いスペーサー（−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−）を介して糖をグリコシド結合で共有結合させたプローブである。非特許文献３のアッセイでは糖としてα−ＧａｌＮＡｃを用いた糖−ＢＰプローブ（α−ＧａｌＮＡｃ ＢＰプローブ）はＢＰＴに結合しなかったが、今回の実験では、予想に反して、その糖ＢＰプローブが、ＢＰＴやＢＰＴＧに対して高い結合性、しかもα−Ｍａｎよりも高い結合性を有していることを見い出した。さらに、本発明者らは、ＢＰＴによるＢＰＴＧからＢＰＴへの分解（ＢＰＴＧの活性化）に対して、Ｍｅ-ＧａｌＮＡｃ、ＧａｌＮ（ガラクトサミン）、及びβ−ＧａｌＮＡｃが顕著な抑制効果を有していることを見い出し、本発明を完成するに至った。なお、α−ＧａｌＮＡｃ ＢＰプローブに関するアッセイの結果が、非特許文献３における結果と逆になった理由は定かではないが、非特許文献３で用いたα−ＧａｌＮＡｃＢＰプローブ（現在入手不可）に何らかの問題があった可能性が考えられる。また、非特許文献３で用いている糖はすべてＤ体であった。

【0010】

すなわち本発明は、（１）ガラクトサミン又はその誘導体を含有することを特徴とするトリプシノーゲン活性化抑制用の製剤であって、前記誘導体が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミンの１位のヒドロキシ基が、アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの２位のＮ−アセチル基がＮ−硫酸基、遊離アミノ基又はＮ−グリコリル基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が硫酸基、Ｏ−アセチル基、リン酸基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；メチルα−ガラクトサミニド；及び、メチルβ−ガラクトサミニド；並びに、これらの塩からなる群から選択される化合物である、トリプシノーゲン活性化抑制用の製剤や、（２）ガラクトサミンの誘導体が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミンの１位のヒドロキシ基が、アルコキシ基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの２位のＮ−アセチル基がＮ−硫酸基、遊離アミノ基又はＮ−グリコリル基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が硫酸基、Ｏ−アセチル基、リン酸基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；及び、ガラクトサミンの塩酸塩；から選択される化合物であることを特徴とする上記（１）に記載のトリプシノーゲン活性化抑制用の製剤に関する。

【0011】

また本発明は、（３）ガラクトサミン誘導体を含有することを特徴とする膵炎の予防・治療剤であって、前記誘導体が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミンの１位のヒドロキシ基が、アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの２位のＮ−アセチル基がＮ−硫酸基、遊離アミノ基又はＮ−グリコリル基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が硫酸基、Ｏ−アセチル基、リン酸基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；メチルα−ガラクトサミニド；及び、メチルβ−ガラクトサミニド；並びに、これらの塩からなる群から選択される化合物である、膵炎の予防・治療剤や、（４）ガラクトサミンの誘導体が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミンの１位のヒドロキシ基が、アルコキシ基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの２位のＮ−アセチル基がＮ−硫酸基、遊離アミノ基又はＮ−グリコリル基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が硫酸基、Ｏ−アセチル基、リン酸基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；及び、ガラクトサミンの塩酸塩；から選択される化合物であることを特徴とする上記（３）に記載の膵炎の予防・治療剤に関する。

【0012】

さらに本発明は、（５）トリプシノーゲン活性化抑制用の製剤の製造におけるガラクトサミン又はその誘導体の使用であって、前記誘導体が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミンの１位のヒドロキシ基が、アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの２位のＮ−アセチル基がＮ−硫酸基、遊離アミノ基又はＮ−グリコリル基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が硫酸基、Ｏ−アセチル基、リン酸基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；メチルα−ガラクトサミニド；及び、メチルβ−ガラクトサミニド；並びに、これらの塩からなる群から選択される化合物である、使用に関する。

【0013】

また本発明は、（６）膵炎の予防・治療剤の製造におけるガラクトサミン誘導体の使用であって、前記誘導体が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミンの１位のヒドロキシ基が、アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの２位のＮ−アセチル基がＮ−硫酸基、遊離アミノ基又はＮ−グリコリル基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が硫酸基、Ｏ−アセチル基、リン酸基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；メチルα−ガラクトサミニド；及び、メチルβ−ガラクトサミニド；並びに、これらの塩からなる群から選択される化合物である、使用や、（７）ガラクトサミンの誘導体が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミンの１位のヒドロキシ基が、アルコキシ基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの２位のＮ−アセチル基がＮ−硫酸基、遊離アミノ基又はＮ−グリコリル基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が硫酸基、Ｏ−アセチル基、リン酸基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；及び、ガラクトサミンの塩酸塩；から選択される化合物であることを特徴とする上記（５）に記載の使用や、（８）ガラクトサミンの誘導体が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミンの１位のヒドロキシ基が、アルコキシ基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの２位のＮ−アセチル基がＮ−硫酸基、遊離アミノ基又はＮ−グリコリル基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が硫酸基、Ｏ−アセチル基、リン酸基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；及び、ガラクトサミンの塩酸塩；から選択される化合物であることを特徴とする上記（６）に記載の使用に関する。

【発明の効果】

【0014】

本発明のトリプシノーゲン活性化抑制剤は、生体分子に基づく成分を有効成分としているため生体に投与しても副作用の懸念がほとんどなく、かつ、十分なトリプシノーゲン活性化抑制効果（及び／又はトリプシン阻害効果）を発揮することができる。また、本発明の膵炎の予防・治療剤は、副作用の懸念がほとんどなく、かつ、膵炎に対する十分な予防・治療効果を発揮することができると考えられる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】ＢＰＴＧからＢＰＴへの変化に対する糖の影響を調べるために行なったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。Ａ：Ｍｅ−α−Ｇａｌ、Ｂ：Ｍｅ−β−Ｇａｌ、Ｃ：Ｍｅ−α−Ｍａｎ、Ｄ：Ｍｅ−α−ＧｌｃＮＡｃ、Ｅ：Ｍｅ−α−ＧａｌＮＡｃ、Ｆ：ＧａｌＮ・ＨＣｌ、Ｇ：ＧａｌＮＡｃ、Ｈ：Ｌ−Ｆｕｃ、Ｉ：Ｄ−Ｆｕｃ、但し「＊」は０．１Ｍ Ｍｅ−α−ＧａｌＮＡｃ（２０ｍｉｎ）の結果を示す。

【図2】種々の糖存在下におけるＢＰＴＧ活性化率の推移を示す図である。

【図3】ＢＰＴＧ又はＢＰＴと、Ｄ−ＧａｌＮＡｃとのプレインキュベーションによる活性化抑制効果の比較を示す図である。

【図4】ロットの異なるＢＰＴＧおよびＢＰＴと、α−ＧａｌＮＡｃ−ＢＰ又はα−Ｍａｎ−ＢＰとの結合（ｐＨ７．５）を、ＥＬＩＳＡにより検出した結果を示す図である。

【図5】α−Ｍａｎを持つ糖−ＢＰ−プローブの構造を示す図である。

【図6】糖−ＢＰプローブを用いたＥＬＩＳＡによるＢＰＴＧの糖結合性（ｐＨ７．５とｐＨ５．５）の検出結果を示す図である。

【図7】ＳＰＲによるＢＰＴＧ固定化センサーチップへの糖の結合の検出結果を示す図である。

【図8】ＢＰＴのＢＡＰＡを基質とした酵素活性への糖の影響の結果を示す図である。

【図9】ＢＰＴＧ、ＢＰＴと、アプロチニン（ＢＰＴＩ）との結合に与える糖の影響を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本発明のトリプシノーゲン活性化抑制剤は、ガラクトサミン（以下、「ＧａｌＮ」ともいう。）又はその誘導体を含有する限り特に制限されず、本発明における「ＧａｌＮ」とは、Ｄ体のＧａｌＮ、Ｌ体のＧａｌＮのいずれであってもよいが、Ｄ体のＧａｌＮが好ましい。また、上記ＧａｌＮとしては、本発明におけるトリプシノーゲン活性化抑制効果（又はトリプシン阻害効果）を有している限り、α−ＧａｌＮ、β−ＧａｌＮのいずれであってもよい。さらに、上記のＧａｌＮの誘導体としては、本発明におけるトリプシノーゲン活性化抑制効果（又はトリプシン阻害効果）を有している限り特に制限されず、例えば、α−ＧａｌＮＡｃ；β−ＧａｌＮＡｃ；ＧａｌＮＡｃの１位のヒドロキシ基が、メトキシ基、エトキシ基、ブトキシ基、フェニルオキシ基、p−ニトロフェニルオキシ基等のアルコキシ基；ニトロ基；アミノ基; Ｆｍｏｃ基；種々の糖残基又はオリゴ糖鎖などに置換された化合物や、ＧａｌＮＡｃの２位のＮ−アセチル基が、遊離アミノ基；Ｎ−硫酸基；Ｎ−グリコリル基などに置換された化合物や、ＧａｌＮＡｃの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が、硫酸基；Ｏ−アセチル基；リン酸基；種々の糖残基又はオリゴ糖鎖などに置換された化合物や、メチルα−ガラクトサミニド、メチルβ−ガラクトサミニドなどの化合物や、これらの化合物の塩などを好適に例示することができる。上記の化合物の塩としては、例えば、化合物の塩酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の酸付加塩、及びナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の金属塩を例示することができ、中でも酸付加塩を好適に例示することができ、中でも塩酸塩をより好適に例示することができる。本発明において特に好ましいＧａｌＮ又はその誘導体としては、Ｄ体のＧａｌＮ及びその塩や、Ｄ体のα−ＧａｌＮＡｃの１位のヒドロキシ基がメトキシ基に置換された化合物（Ｍｅ−α−ＧａｌＮＡｃ）及びその塩や、Ｄ体のα−ＧａｌＮＡｃの１位のヒドロキシ基がフェニル基又はニトロフェニル基に置換された化合物及びその塩等を挙げることができ、さらに好ましいものとして、Ｄ体のＧａｌＮの塩酸塩（ＧａｌＮ・ＨＣｌ）や、Ｍｅ−α−ＧａｌＮＡｃを挙げることができる。

【0017】

また、本発明のトリプシノーゲン活性化抑制剤に含有されるＧａｌＮ又はその誘導体の形態としては、特に制限されず、ＧａｌＮ又はその誘導体自体であってもよいし、ＧａｌＮ又はその誘導体同士がα結合及び／又はβ結合により結合する糖鎖の形態であってもよいし、ＧａｌＮ又はその誘導体やその糖鎖が、ＧａｌＮ又はその誘導体以外の糖、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質等の他の生体分子と結合する生体分子複合体であってもよいが、特に優れたトリプシノーゲン活性化抑制効果が期待できる点で、ＧａｌＮ又はその誘導体同士がα結合により結合する糖鎖の形態や、該糖鎖を含む生体分子複合体、すなわちオリゴ糖鎖、糖タンパク質、糖脂質、または多糖鎖などの形態であることが好ましい。

【0018】

本発明において「トリプシノーゲン活性化抑制効果」とは、トリプシンによる、トリプシノーゲンからトリプシンへの分解（トリプシノーゲンの活性化）を抑制する効果を意味し、トリプシノーゲンに結合して保護作用を示すことによって、トリプシンへの分解を抑制する効果の他、トリプシンに結合することによって、トリプシノーゲンからトリプシンへの分解を抑制する効果も含まれる。あるＧａｌＮ又はその誘導体がトリプシノーゲン活性化抑制効果を有しているかどうかは、例えば、後述の実施例１記載の「糖によるトリプシノーゲン活性化抑制実験」と同様の実験によって容易に確認することができる。具体的には、後述の実施例１記載の実験と同様の実験において、トリプシン溶液の添加から２０分間経過後のサンプル中の「ＢＰＴ／ＢＰＴＧ＋ＢＰＴ」（以下、単に「ＢＰＴ／ＢＰＴＧ＋ＢＰＴ」ともいう。）が、そのＧａｌＮ又はその誘導体を添加した場合に、それを添加していない場合に比べて、低いときは、そのＧａｌＮ又はその誘導体はトリプシノーゲン活性化抑制効果を有しているといえる。本発明における「トリプシノーゲン活性化抑制効果」の好ましい程度としては、後述の実施例１記載の実験と同様の実験において、ＧａｌＮ又はその誘導体を添加した場合の「ＢＰＴ／ＢＰＴＧ＋ＢＰＴ」が、ＧａｌＮ又はその誘導体を添加していない場合の「ＢＰＴ／ＢＰＴＧ＋ＢＰＴ」に対する割合として６０％以下、より好ましくは５０％以下、さらに好ましくは４０％以下、最も好ましくは３０％以下である場合を例示することができる。

【0019】

上記のトリプシノーゲンとしては、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等の哺乳類由来のトリプシノーゲンやそれらのアイソフォームを好適に例示することができ、中でもヒト由来のトリプシノーゲンやそのアイソフォームをより好適に例示することができ、上記のトリプシンとしては、前述の哺乳類由来のトリプシンやそれらのアイソフォームを好適に例示することができ、中でもヒト由来のトリプシンやそのアイソフォームをより好適に例示することができる。なお、本発明におけるＧａｌＮ又はその誘導体は、いずれか１種類のトリプシノーゲンに対して、その活性化抑制効果を有していればよい。

【0020】

上記のＧａｌＮの入手方法としては、市販のものを用いてもよいし、ガラクトースから公知の方法で誘導してもよい。また、ＧａｌＮの誘導体についても、導入する置換基の部位や置換基の種類等に応じて適宜製造することができる。また、ＧａｌＮ又はその誘導体が結合した糖鎖や、ＧａｌＮ又はその誘導体を含む生体高分子複合体などについても、同様に適宜製造することができる。

【0021】

本発明の膵炎の予防・治療剤は、ＧａｌＮ又はその誘導体を含有する限り特に制限がされず、このＧａｌＮ又はその誘導体や、その好ましい態様については前述したとおりである。なお、本明細書の背景技術においても述べたように、膵炎は、膵液の消化酵素によって、膵臓自体が消化されて炎症を生じるものであるので、トリプシノーゲン活性化抑制効果を有しているＧａｌＮ又はその誘導体を用いれば、膵炎の予防効果や治療効果を得ることができる可能性が極めて高い。本発明における「膵炎の予防効果」とは、本発明におけるＧａｌＮ又はその誘導体を投与しない場合に比べて、それを投与した場合に、膵炎の発症の程度が軽減又は抑止される効果を意味し、本発明における「膵炎の治療効果」とは、本発明におけるＧａｌＮ又はその誘導体を投与しない場合に比べて、それを投与した場合に、膵炎の程度が改善又は治癒する効果を意味する。膵炎の発症の程度や膵炎の程度は、膵臓の組織の状態や血中のアミラーゼの濃度等を基準に適宜評価することができる。

【0022】

上記の本発明のトリプシノーゲン活性化抑制剤や膵炎の予防・治療剤（以下、両剤を併せて「本発明の剤」ともいう。）は、ＧａｌＮ又はその誘導体による、トリプシノーゲンからトリプシンへの活性化抑制効果や膵炎の予防・治療効果が得られる限り、ＧａｌＮ又はその誘導体の他に、他のトリプシノーゲン活性化抑制剤や、アプロチニン等のトリプシン阻害剤や、他の膵炎の予防・治療剤などの任意成分を含んでいてもよい。

【0023】

本発明の剤に含有されるＧａｌＮ又はその誘導体は、常法によって適宜の製剤とすることができる。製剤としては散剤、顆粒剤などの固形製剤であってもよいが、特にインビボにおける膵炎の予防・治療効果を得る観点からは、溶液剤、乳剤、懸濁剤などの注射用の液剤や、注射用のゲル剤とすることが好ましい。前述の液剤の製造方法としては、例えばＧａｌＮ又はその誘導体を溶剤と混合する方法や、さらに懸濁化剤や乳化剤を混合する方法を好適に例示することができ、前述のゲル剤の製造方法としては、例えばＧａｌＮ又はその誘導体をゼラチンと混和する方法を好適に例示することができる。以上のように、本発明におけるＧａｌＮ又はその誘導体を製剤とする場合には、製剤上の必要に応じて、適宜の薬学的に許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤などの任意成分を配合することができる。

【0024】

前述の溶剤としては、精製水、生理的食塩水、リンゲル液、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、ポリエチレングリコール、マクロゴールなどの親水性溶剤や、オリーブ油、ラッカセイ油、ゴマ油、ツバキ油、ナタネ油、脂肪酸モノグリセリド、脂肪酸ジグリセリド、高級脂肪酸エステル、流動パラフィンなどの油性溶剤を例示することができ、また、前述の懸濁化剤としては、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、アラビアゴム、ベントナイトなどを例示することができ、さらに、前述の乳化剤としては、アラビアゴム、ゼラチン、レシチン、コレステロール，卵黄、ベントナイト、ビーガム、セタノール、モノステアリン酸グリセリン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ステアリン酸などを例示することができる。

【0025】

前述の溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどを例示することができ、また、前述の賦形剤としては、乳糖、白糖、Ｄ−ソルビトール、デンプン、α化デンプン、コーンスターチ、Ｄ−マンニトール、デキストリン、結晶セルロース、アラビアゴム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、血清アルブミンなどを例示することができ、さらに、前述の結合剤としては、α化デンプン、ショ糖、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、トレハロース、デキストリン、プルラン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどを例示することができる。

【0026】

前述の等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グルコース、フルクトース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、サッカロース、グリセリン、尿素などを例示することができ、また、前述の緩衝剤としては、クエン酸ナトリウム、グリセリンなどを例示することができ、さらに、前述の防腐剤としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などを例示することができる。前述の安定化剤としては、ポリエチレングリコール、デキストラン硫酸ナトリウム、アミノ酸、ヒト血清アルブミンなどを例示することができ、また、前述の無痛化剤としては、ブドウ糖、グルコン酸カルシウム、塩酸プロカインなどを例示することができ、さらに、前述の抗酸化剤としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸などを例示することができる。また、前述の着色剤としては、タール系色素、カラメル、ベンガラ、二酸化チタン、エリス・アンド・エベラールド社のＦＤ＆Ｃブルー２号ならびにＦＤ＆Ｃレッド４０号などのＦＤ＆Ｃ染料などを例示することができる。

【0027】

本発明の剤を膵炎の予防や治療に用いる場合における、本発明の剤の投与方法としては、膵炎の予防・治療効果が得られる限り特に制限されず、静脈内投与や膵臓の炎症部位への直接投与、経口投与、腹腔内投与を例示することができる。また、本発明の剤の投与量や投与回数や投与濃度は、膵炎の状態や患者の体重等に応じて、適宜調節することができる。

【0028】

本発明の膵炎の予防・治療剤の対象となる膵炎としては、膵液の消化酵素によって、膵臓自体が消化される炎症に関連している限り、急性膵炎であっても慢性膵炎であってもよいが、急性膵炎を特に好適に例示することができる。また、膵炎に対して予防・治療効果を発揮する結果として、敗血症、膵臓の周囲の臓器（腎臓、大腸、胃など）の炎症、膵仮性嚢胞、膵壊死、感染性膵壊死などの、膵炎の合併症に対しても、予防・治療効果を発揮する。

【0029】

また、本発明には、トリプシノーゲン活性化抑制剤の製造におけるＧａｌＮ又はその誘導体の使用や、ＧａｌＮ又はその誘導体をトリプシノーゲン活性化抑制剤として使用する方法や、トリプシノーゲンの活性化抑制におけるＧａｌＮ又はその誘導体の使用や、膵炎の予防・治療剤の製造におけるＧａｌＮ又はその誘導体の使用や、ＧａｌＮ又はその誘導体を膵炎の予防・治療剤に使用する方法や、膵炎の予防・治療におけるＧａｌＮ又はその誘導体の使用や、ＧａｌＮ又はその誘導体を哺乳動物（特にヒト）に投与することを特徴とする膵炎の予防・治療方法も含まれる。これらの使用や方法における文言の内容やその好ましい態様は、前述したとおりである。

【0030】

本発明のトリプシノーゲン活性化抑制剤は、膵炎の予防や治療の他に、腸内での消化抑制剤、腸管細胞の増殖・分化の調節剤、組織溶解抑制剤等として用いることができる。なお、本発明におけるＧａｌＮ又はその誘導体のトリプシノーゲン活性化抑制効果が、ＧａｌＮ又はその誘導体がトリプシンに結合することによって、トリプシノーゲンからトリプシンへの分解を抑制（すなわち、トリプシンのセリンプロテアーゼ活性を抑制）することにより発揮される場合は、また、本発明のトリプシノーゲン活性化抑制剤は、トリプシノーゲンが存在しない条件下でもトリプシン阻害剤として利用することができる他、キモトリプシン、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、トロンビン、プラスミン、プラスミノーゲンアクチベーター、トリプターゼ、マトリプターゼ及びプロテアーゼにより活性化されるレセプター、の活性化抑制剤としても利用することができる。

【0031】

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

【実施例1】

【0032】

１．［糖によるトリプシノーゲン活性化抑制実験］
（１）材料
本実験には以下の材料を用いた。なお、カッコ内にはコード番号を示す。
ウシ膵臓トリプシノーゲン（ＢＰＴＧ）は、MP Biomedicals, Inc.製のもの（101195）を用い、ウシ膵臓トリプシン（ＢＰＴ）は、和光純薬株式会社製のもの（204-13951）を用い、Phenylmethylsulfonyl Fluoride（ＰＭＳＦ）は、Nacalai Tesque, INC.製のもの（27327-52）を用い、Methyl-α-D-galactopyranoside（Ｍｅ−α−Ｇａｌ）は、Sigma-Aldrich Corporation製のもの（M1379-25MG）を用い、1-O-Methyl-β-D-galactopyranoside（Ｍｅ−β−Ｇａｌ）は、Nacalai Tesque, INC.製のもの（22526-34）を用い、Methyl-α-D-Mannopyranoside（Ｍｅ−α−Ｍａｎ）は、和光純薬株式会社製のもの（131-08021）を用い、Methyl-N-acetyl-2-deoxy-α-D-glucosaminide（Ｍｅ−α−ＧｌｃＮＡｃ）は、Sigma-Aldrich Corporation製のもの（M0257-100MG）を用い、Methyl-N-acetyl-2-deoxy-α-D-galactosaminide（Ｍｅ−α−ＧａｌＮＡｃ）は、Toronto Research Chemicals, Inc.製のもの（M275310）を用い、Ｄ−ガラクトサミン塩酸塩（ＧａｌＮ・ＨＣｌ）は、生化学工業製のもの（Lot.S6701）を用い、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）は、Toronto Research Chemicals Inc.製のもの（A17700）を用い、Ｌ−フコース（Ｌ−Ｆｕｃ）は、Fluka AG, Chem. Fabrik製のものを用い、Ｄ−フコース（Ｄ−Ｆｕｃ）は、和光純薬株式会社製のものを用いた。

【0033】

（２）方法及び結果
トリプシンによるトリプシノーゲンからトリプシンへの分解（トリプシノーゲンの活性化）に対して、糖がどのような影響を与えるかを調べるために、ＢＰＴＧをＢＰＴ及び糖存在下でアッセイした場合の、ＢＰＴＧ量やＢＰＴ量の変化を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量の変化によって確認した。具体的には、以下の方法で行なった。
ＢＰＴＧ、ＢＰＴ、及び上記１．（１）記載の９種類の各糖を、それぞれ別のエッペンチューブに分取し、さらにそれぞれのエッペンチューブにＴＢＳ溶液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ ＮａＣｌ］を添加して、５．０ｍｇ／ｍｌのＢＰＴＧ溶液、３．７ｍｇ／ｍｌのＢＰＴ溶液、及び０．３Ｍの各糖溶液を調製した。

【0034】

１種類の糖溶液に関して、新たな５００μｌエッペンチューブを１２本用意し、１２本すべてに前述のＢＰＴＧ溶液を１６０μｌずつ分取した後、さらに、その１２本のうち６本のエッペンチューブには前述のＴＢＳを１１０μｌずつ添加し、残りの６本のエッペンチューブにその１種類の糖溶液を１１０μｌずつ添加して撹拌した。その後、氷上で２０〜３０分間インキュベートした。その後、これら１２本のエッペンチューブにＢＰＴ溶液を３０μｌずつ添加して攪拌し、３７℃で反応させた。この状態での反応液はいずれもｐＨ ４．６となるように調整した。ＢＰＴ溶液の添加から０分後、２分後、５分後、１０分後、１５分後、２０分後の各時点で、糖溶液を含むエッペンチューブ（ＢＰＴＧ＋糖溶液＋ＢＰＴ）と、糖溶液を含まないエッペンチューブ（ＢＰＴＧ＋ＴＢＳ＋ＢＰＴ）をそれぞれ１本ずつ氷上に移すとともに、５０ｍＭ ＰＭＳＦ（トリプシン阻害剤）を含むＴＢＳ溶液を３．２μｌ加え混合し、反応を停止させた。これらの一連の操作を、他の８種類の糖溶液に関しても行なった。

【0035】

このようにして得られた各サンプルから、１サンプルあたり４０μｌずつ分取し、そこにサンプルバッファー（５ｘ）を１０μｌずつ添加した後、１００℃で５分ボイルして泳動用サンプルを調製した。それらの泳動用の各サンプル（７μｇ）について、ポリアクリルアミドゲル（濃縮ゲルにおいてはＰＡＧ濃度３％、泳動ゲルにおいてはＰＡＧ濃度１２％）を用い、２５ｍＡ／ｇｅｌで１．５時間、Laaemmli法により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動後のポリアクリルアミドゲルをCoomassie brilliant blue染色液中で約１０分間染色した後、脱色液中で過剰な色素を脱染した。その後、その泳動ゲルをスキャナーで読み取り、各糖における各時間のサンプル中のＢＰＴＧやＢＰＴ量の推移を調べた。その結果を図１に示す。図１の各パネルにおける「＋」は、その糖を添加したサンプル（その糖の存在下におけるサンプル）であることを意味し、「−」は、その糖を添加していないサンプル（その糖の非存在下におけるサンプル）を意味する。また、図１のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるＢＰＴＧやＢＰＴのバンドの染色強度は、各タンパク質の量に比例するので、図１のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるＢＰＴＧやＢＰＴのバンドの染色強度を、Image J (1.37v, National Institutes of Health)のソフトウエアを利用して数値化し、ＢＰＴＧがＢＰＴに変化した割合を算出した。具体的には、図１の各糖における各時間のサンプル中のＢＰＴＧとＢＰＴの量の和に対するＢＰＴの割合（ＢＰＴ／ＢＰＴＧ＋ＢＰＴ；以下、「ＢＰＴＧの活性化率」ともいう。）を算出し、その「ＢＰＴＧの活性化率」の推移をグラフ化した。その結果を図２に示す。

【0036】

図１及び図２の結果から、Ｍｅ−α−ＧａｌとＭｅ−α−ＧｌｃＮＡｃ、Ｌ−ＦｕｃならびにＤ−Ｆｕｃにおいては、糖の添加の有無にかかわらず、時間の経過と共にＢＰＴＧが分解されて、ＢＰＴへと変化していることが示され、また、Ｍｅ−β−ＧａｌやＭｅ−α−ＭａｎやＧａｌＮＡｃにおいては、時間の経過と共にＢＰＴＧが分解されてはいるものの、糖の添加によって、わずかではあるが、ＢＰＴＧからＢＰＴへの分解が抑制されていることが示され、さらに、ＧａｌＮ・ＨＣｌでは糖の添加によって、ＢＰＴＧからＢＰＴへの分解がかなり抑制されていることが示され、また、Ｍｅ−α−ＧａｌＮＡｃにおいては、糖の添加により、２０分経過後でもＢＰＴＧはほとんど分解せず、ＢＰＴＧからＢＰＴへの分解が顕著に抑制されていることが示された。Ｍｅ−α−ＧａｌＮＡｃやＧａｌＮ・ＨＣｌによるトリプシノーゲンの分解抑制（活性化抑制）のメカニズムの詳細は未だ明らかではないが、トリプシノーゲンに結合した糖がトリプシノーゲンの不活性構造を保護する可能性、又は、トリプシンに結合した糖がトリプシンのタンパク質分解活性を阻害する可能性が考えられる。なお、０．１Ｍ Ｍｅ−α−ＧａｌＮＡｃでは、糖とＢＰＴＧを氷上で２０分間プレインキュベートした直後の０ｍｉｎにおいて、ＢＰＴＧのバンドが常に薄くなったが、その後３７℃の保温でバンドの濃さは復活した。この原因は不明であるが、ＢＰＴＧの構造変化により、０℃付近での溶解度が変化した可能性も考えられる。また、ＧａｌＮ・ＨＣｌは、溶液中ではＧａｌＮのα体とβ体が生じ、ＧａｌＮＡｃは、溶液中ではＧａｌＮＡｃのα体とβ体が生じる。

【0037】

さらに、前述の[糖によるトリプシノーゲン活性化抑制実験]において、ＢＰＴＧを０．１Ｍ Ｄ−ＧａｌＮＡｃの存在下、氷上で２０分間プレインキュベーションする過程を行わず、代わりに３０μｌのＢＰＴ溶液に１１０μｌの０．３Ｍ Ｄ−ＧａｌＮＡｃ(終濃度０．２４Ｍとなる)又は１１０μｌの糖を含まないＴＢＳ溶液を加えて混合し、氷上で２０分間プレインキュベーションしてから、糖とプレインキュベーションしていないＢＰＴＧ溶液１６０μＬを加え、同様に活性化実験を行った。同時に実施例１の条件でも活性化実験を行い、両者の結果を比較した。その結果を図３に示す。図３の結果から、ＢＰＴを０．１Ｍ Ｄ−ＧａｌＮＡｃとプレインキュベーションした場合、ＢＰＴＧはコントロール（糖非存在下）と同様に活性化され、活性化抑制が起こらなかった。すなわち糖による阻害作用はＢＰＴＧとのプレインキュベーションによってのみ起こることが示された。したがってＤ−ＧａｌＮＡｃによる活性化抑制効果は、ＢＰＴＧと糖の結合によって、トリプノーゲンの不活性構造が安定化され、ＢＰＴＧのＮ末端にある活性化ペプチドが切断されにくくなるためと考えられ、トリプシンと糖の結合によるものではないことが示された。すなわち、トリプシン活性阻害剤を基本とするこれまでの膵炎抑制剤とは異なり、本薬剤はトリプシノーゲンに作用して活性化を抑制するという新規なメカニズムに基づいてトリプシノーゲン等のプロ酵素の活性化を抑制することがわかった。本化合物は特にトリプシン阻害剤が効かないような場合の新規な膵炎の治療・予防方法に用い得る可能性が高い。

【実施例2】

【0038】

２．［ＥＬＩＳＡ法による糖結合性分析］
（１）材料
本実験には以下の材料を用いた。
ＢＰＴＧ、ＢＰＴ及びＰＭＳＦは、実施例１で用いたものと同様のものを用い、糖-biotinylated polyacrylamide probes（糖−ＢＰ プローブ）は、GlycoTech Co.（Gaithersburg, Maryland 20879）製のもの（ポリアクリルアミド骨格の−ＣＯＮＨ_２基に、短いスペーサー（−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−）を介して糖をグリコシド結合で共有結合させたプローブ；例えばα−マンノースＢＰプローブについて図４参照）を用い、avidin-biotin-horseradish peroxidase complex（ＡＢＣ−ＨＲＰ）は、ＳＩＧＭＡ社製のもの（S5512）を用い、o-phenylene diamine（ＯＰＤ）は、和光純薬株式会社製のもの（161-11851）を用いた。

【0039】

（２）方法及び結果
実施例１で示された、トリプシノーゲンからトリプシンへの分解（トリプシノーゲンの活性化）に対する糖の抑制効果が、ＢＰＴＧやＢＰＴの糖結合性と関連があるかどうかを調べるために、以下のようなＥＬＩＳＡ法による糖結合性分析を行なった。
ＢＰＴＧ、ＢＰＴをそれぞれ３ｍｇ計り取り、２．９４ｍｌの１０ｍＭ ＴＢＳ（ｐＨ７．５）と６０μｌの０．２Ｍ ＰＭＳＦ溶液を加えて溶解し、４℃で１時間、プレインキュベーションして、１ｍｇ／ｍｌのＢＰＴＧ溶液、及び、ＢＰＴ溶液を調製した。これらの溶液を１０ｍＭ ＴＢＳ（ｐＨ７．５）で０．１〜１５μｇ／ｍｌに希釈し、マイクロタイタープレート（Immulon 1B，Thermo Scientific社製）の各ウエルにそれぞれ１００μｌずつ添加した。４℃、２時間インキュベーションすることによりＢＰＴＧ及びＢＰＴをプレートに固定化した。各３００μｌの１０ｍＭ ＴＢＳ（ｐＨ７．５）で各ウエルを３回洗浄した後、各３００μｌの３％ ＢＳＡ（１０ｍＭ ＴＢＳ，ｐＨ７．５）を添加して、４℃で一晩ブロッキングした。１０ｍＭ ＴＢＳ（ｐＨ７．５）に、各糖（α−Ｍａｎ、α−Ｍａｎ−６−リン酸、α−Ｇａｌ、α−ＧａｌＮＡｃ、α−ＮｅｕＡｃ、β−Ｇａｌ又はＬａｃ）−ＢＰ プローブ又は糖を持たないＰＡＡプローブを１０μｇ／ｍｌとなるように加えた溶液を１００μｌずつ各ウエルに添加して、１時間室温で反応させた。各３００μｌの１０ｍＭ ＴＢＳ（ｐＨ７．５）で各ウエルを３回洗浄した後、各１００μｌの０．７μｇ／ｍｌ ＡＢＣ−ＨＲＰを添加して、室温で１時間結合反応させた後、各３００μｌの１０ｍＭ ＴＢＳ（ｐＨ７．５）で各ウエルを３回洗浄した。次に、各２００μｌの発色液［ＯＰＤ ８ｍｇ，５０ｍＭクエン酸リン酸バッファー（ｐＨ５．０）２０ｍｌ，３０％Ｈ_２Ｏ_２ ８μｌ］を各ウエルに添加して、室温で２５分間発色させた後、各５０μｌの２．５Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を各ウエルに添加して発色を停止させた。マイクロプレートリーダー（ＭＰＲ−８０，Bio-Rad社製）を用いて、４９０ｎｍの吸光度を測定した。以上の結合実験を、ＴＢＳの代わりに１０ｍＭ 酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を用いても、全く同様の手順で行った。

【0040】

その結果を図４ならびに図６に示す。
図４からわかるように、ＢＰＴＧとＢＰＴは、α‐Ｍａｎを持つ糖ＢＰ−プローブには糖を持たないＰＡＡプローブより高い結合性を示し、α−ＧａｌＮＡｃを持つ糖−ＢＰプローブには、顕著に高い結合性を示した。また、ＢＰＴＧについて別ロットの製品を用いて同様の実験を行なったが、同様の結果であった。

【0041】

また、図６に示すように、十二指腸内のｐＨであるｐＨ７．５において、ＢＰＴＧについて、ＧａｌＮＡｃを含む糖鎖を中心に、他の糖ＢＰ−プローブとの結合活性を調べたところ、ＢＰＴＧがα−ＧａｌＮＡｃ−ＢＰに対してだけでなく、β−ＧａｌＮＡｃ−ＢＰに対する結合活性を持っていることが新たに明らかになった。ｐＨ７．５において、α−ＮｅｕＡｃ，β−Ｇａｌ，又はＬａｃを持つ糖−ＢＰプローブには、糖を持たないＰＡＡプローブと同程度以下の低い結合性しか示さなかった。したがって、ｐＨ７．５においてもＢＰＴＧへのＧａｌＮ及びその誘導体の結合と、ＢＰＴＧ活性化抑制効果があると考えられ、実際にｐＨ５．５および実施例１のｐＨ ４．６と同様に、ｐＨ７．５においてもＢＰＴＧ活性化抑制効果が観測されている(データ示さず)。一方、チモーゲン顆粒内のｐＨであるｐＨ５．５において、ＢＰＴＧのα−ＧａｌＮＡｃ−ＢＰに対する結合量は、ｐＨ７．５の結果と同様に、ＢＰＴＧ濃度に依存して増強した。図６の結果から、ｐＨ５．５においては、ｐＨ７．５の場合と比べてα−Ｍａｎ−６−Ｐ及びα−Ｇａｌ−ＢＰに対する結合活性がほとんど消失し、対照的にα−ＮｅｕＡｃ−ＢＰに対する結合活性がｐＨ７．５の時と比べて著しく増強した。それ以外の結合する糖の種類にはほとんど差がみられなかった。ＢＰＴＧやＢＰＴの糖結合性の高低に関するこれらの結果（ＢＰＴＧに関する図４Ａ、Ｂおよび図６）の傾向は、実施例１における糖（Ｍｅ−α−ＧａｌＮＡｃ、Ｍｅ−α−Ｍａｎ、Ｍｅ−α−Ｇａｌ、Ｍｅ−β−Ｇａｌ）のＢＰＴＧ活性化抑制効果の高低の結果の傾向と一致していた。

【実施例3】

【0042】

３．［ＳＰＲによるＢＰＴＧと糖との相互作用解析］
ＳＰＲを用いて、ＢＰＴＧと糖との相互作用解析を行なった。操作は全てBIACORE2000（GE Healthcare Bio-Sciences KK）を用い、付属のマニュアルに従って操作を行った。リガンドの固定化はアミンカップリング法を用いて、１０μｌ／ｍｉｎで各ステップを１４分間ずつ行った。ランニング緩衝液には、ＨＢＳ−ＥＰ ｂｕｆｆｅｒに終濃度０．２ｍＭになるように０．２Ｍ ＰＭＳＦ−エタノール溶液を加えて使用した。ＣＭ５センサーチップをランニング緩衝液で平衡化した後、アミンカップリングキットにより、チップ表面をＥＤＣ／ＮＨＳで活性化した。リガンドに用いたＢＰＴＧやＢＰＴは、あらかじめ２ｍｇ秤りとった後、９６０μｌの１０ｍＭ ＣＨ_３ＣＯＯＨ−ＣＨ_３ＣＯＯＮａ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）に溶解し、０．２Ｍ ＰＭＳＦ−エタノール溶液を４０μｌ加え（終濃度８ｍＭ）、４℃、１時間振盪した（プレインキュベーション）。これを１０ｍＭ ＣＨ_３ＣＯＯＨ−ＣＨ_３ＣＯＯＮａ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）に、保護糖としてＭｅ−α−Ｍａｎ、Ｍｅ−α−Ｇａｌ又はＤ−ＧａｌＮＡｃを終濃度が各０．２ Ｍになるように加えた緩衝液を用いて１０μｇ／ｍｌに希釈した後、センサーチップにインジェクトして固定化を行った。残っているN-hydroxysuccinimide esterを１．０Ｍ エタノールアミン・ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）でブロックした後、１０ｍＭ ＨＣｌで１分間洗浄してから測定に使用した。固定化されたＢＰＴＧは３７４３．６ＲＵ、ＢＰＴは８０１４．９ＲＵであった。リファレンスセル（対照セル）には、タンパク質溶液を固定化せずに、同様のＥＤＣ／ＮＨＳ活性化と１．０Ｍ エタノールアミン・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）によるブロッキングを行ったフローセルを用いた。アナライトには、Ｍｅ−α−Ｍａｎ，Ｌａｃ，Ｍｅ−α−ＧａｌＮＡｃ，Ｍｅ−β−Ｇａｌを、それぞれ０．０５，０．１，０．１５，０．２，０．２５，０．３Ｍの濃度になるように、ランニング緩衝液を用いて調製した。アナライトの糖類を含むランニング緩衝液をＢＰＴＧ固定化センサーチップ上に２０μＬ／ｍｉｎの流速で９０秒間インジェクトし、次にＴＢＳで溶出を行った。この実験の結果を図７に示す。

【0043】

図７に示すように、Ｍｅ−α−Ｍａｎ，Ｌａｃ，Ｍｅ−β−Ｇａｌをアナライトとして添加した際には、インジェクト終了とともに全てのアナライトが解離していた。一方、Ｍｅ−α−ＧａｌＮＡｃをアナライトとして添加したところ、フローセルに固定化したＢＰＴＧおよびＢＰＴ（ＢＰＴについては結果を示していない）とＭｅ−α−ＧａｌＮＡｃの結合は、インジェクト終了後もほとんど解離せず、濃度依存的にＢＰＴＧやＢＰＴとの結合が示された。ＢＰＴＧやＢＰＴの最大結合量をもとに速度論的解析を行ったところ、ＢＰＴＧとＭｅ−α−ＧａｌＮＡｃとのＫ_Ａは１×１０^６（Ｍ^−１）、ＢＰＴとＭｅ−α−ＧａｌＮＡｃとのＫ_Ａは２×１０^６（Ｍ^−１）と算出された。これは、多くのレクチンと特異的な単糖とのＫ_Ａが１０^４〜５（Ｍ^−１）の範囲であることを考慮すると、ＢＰＴＧとＭｅ−α−ＧａｌＮＡｃとの間の結合や、ＢＰＴとＭｅ−α−ＧａｌＮＡｃとの間の結合はかなり強力で有意なものであると考えられる。

【実施例4】

【0044】

４．［トリプシン酵素活性への影響］
（１）材料
本実験には以下の材料を用いた。
ＢＰＴ（Bovine pancreatic trypsin）は、Sigma-Aldorich社製のT1426を用い、ＢＡＰＡ（N-α-Benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide hydrochloride）は、株式会社ペプチド研究所製のものを用い、Ｍｅ−α−Ｍａｎ（Methyl-α-mannoside）は、Sigma-Aldorich社製のものを用い、ＧａｌＮ・ＨＣｌ（D-Galactosamine hydrochloride）は、生化学工業株式会社製のものを用い、ＧａｌＮＡｃ（N-Acethyl-D-galactosamine）は、和光純薬工業株式会社製の013-12821を用い、Ｍｅ−α−ＧａｌＮＡｃ（o-Methyl-N-Acetyl-2-deoxy-D-galactosamine）は、Tronto Research Chemicals Inc.社製のM275310を用いた。

【0045】

（２）方法および結果
各種の糖について、基質濃度を変化させてＢＰＴの酵素反応速度を測定し、Lineweaver-Burk plotにより解析して、各種の糖のトリプシン酵素活性に与える影響について調べた。
トリプシンの酵素活性測定には、基質としてＢＡＰＡを用いた。ＢＡＰＡを１４．２ｍｇ秤量し、１０６５μｌのＤＭＳＯに完全に溶解した後、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．９）−２０ｍＭ ＣａＣｌ_２−３０ｍＭ ＮａＣｌ（ＴＢＳ−Ｃａ）を２２００μｌ加えて、あらかじめ１０ｍＭ ＢＡＰＡ溶液を調製した。次いで、このＢＡＰＡ溶液をさらに希釈して０ｍＭから３ｍＭの各濃度の基質ＢＡＰＡ溶液を調製した。ＢＰＴは２．４ｍｇを秤量し、酸性で安定であるため、１ｍＭ ＨＣｌ−２０ｍＭ ＣａＣｌ_２溶液０．５ｍｌに溶解し、２００μＭのＢＰＴ溶液を調製した。このＢＰＴ溶液からさらに希釈して６μＭのトリプシン酵素溶液を調製した。Ｍｅ−α−Ｍａｎ、ＧａｌＮ・ＨＣｌ、ＧａｌＮＡｃ、Ｍｅ−α−ＧａｌＮＡｃ についてＴＢＳ−Ｃａを加えて、１ｍＭ から０．２Ｍの各糖溶液を数段階調製した。糖溶液１４０μｌと６μＭ トリプシン溶液１０μｌをあらかじめ混合して１５分間３７℃でプレインキュベートした。マイクロプレートに、３７℃でプレインキュベートした各濃度の基質ＢＡＰＡ溶液を１ウエルあたり１５０μｌ加え、次に、３７℃でプレインキュベートした糖−トリプシン混合溶液を１ウエルあたり１５０μｌずつ加えた。素早く撹拌後、マイクロプレートリーダーVient X（DS Pharma Biomedical）を用いて、３０秒おきに５分間４１０ｎｍで吸光度を測定した。基質濃度の逆数１／［Ｓ］を横軸に、反応速度の逆数１／［ｖ］を縦軸にとり、Lineweaver Burk Plotにより解析して、各種の糖のＢＰＴ酵素活性に与える影響について考察した。その結果を図８に示す。

【0046】

図８の結果から分かるように、ＧａｌＮ・ＨＣｌ濃度を０ｍＭから１００ｍＭに上げると、わずかながらＫｍは増加し、Ｖｍａｘが８２％（（６．８×１００）／８．３）に減少した。この変化は非拮抗型の活性阻害に近い変化である（図８Ａ）。一方、０−１００ｍＭの範囲のＧａｌＮＡｃ存在下では、ＢＰＴの酵素活性はＶｍａｘで８％（１００−［（７．７×１００）／８．４］）の減少にすぎず、Ｋｍはほとんど変化がなかった（図８Ｂ）。対照的にＭｅ−α−Ｍａｎの存在下ではＫｍの減少傾向が示された。Ｍｅ−α−ＧａｌＮＡｃについては、５ｍＭ以下までの濃度範囲でしか実験できなかったが、Ｋｍの増加（１３％）と、僅かなＶｍａｘの増加が示唆された。以上、結合性の高い糖によるＢＰＴ酵素活性への影響はいずれも小さく、トリプシノーゲンの活性化抑制効果を完全に説明することはできないと考えられた。また、最も影響のあったＧａｌＮ・ＨＣｌの結果をDixon plotにより解析すると、非拮抗型（または非拮抗・不拮抗混合型）の阻害形式が示された。参考値として、阻害定数Ｋｉは約３００ｍＭと求められた。これはＧａｌＮ・ＨＣｌのＢＰＴＧ活性化抑制作用が、ＢＰＴに対する阻害によるものではなく、ＢＰＴＧに結合してタンパク質分解から保護する効果が主であることと矛盾しない結果であると考えられる。

【実施例5】

【0047】

５．［ＥＬＩＳＡ法によるＢＰＴＧとアプロチニンの結合分析と糖の影響］
（１）材料
本実験には以下の材料を用いた。
ＢＰＴＧ、ＢＰＴ、糖及びＰＭＳＦは、実施例１と同様の物を用い、アプロチニンはウシ膵臓由来の物をSIGMA社から購入して用い、ＮＨＳ−ビオチン（PIERCE社製）を用いてマニュアル通りにビオチン標識して使用した。ＥＬＩＳＡに必要な試薬は実施例２と同様の物を用いた。

【0048】

（２）方法及び結果
膵臓由来の内在性トリプシン阻害剤として知られているアプロチニン（ＢＰＴＩ）との結合が、ＢＰＴＧやＢＰＴの糖結合性に影響があるかどうかを調べるために、ＥＬＩＳＡ法による結合性分析を行なった。
実施例２と同様にして、ＰＭＳＦ処理を行ったＢＰＴＧ溶液、及び、ＢＰＴ溶液を調製し、これらの溶液を１０ｍＭ ＴＢＳ（ｐＨ７．５）で希釈し、マイクロタイタープレート（Immulon 1B，Thermo Scientific社製）の各ウエルに添加して、ＢＰＴＧ及びＢＰＴをプレートに固定化した。実施例２と同様にしてＴＢＳ（ｐＨ７．５）を緩衝液に用いて洗浄した後、ＢＳＡによるブロッキングを行った。０．１Ｍの各糖（Ｍｅ−α−Ｍａｎ、Ｍｅ−β−Ｇａｌ又はＧａｌＮ・ＨＣｌ）のＴＢＳ（ｐＨ７．５）溶液を１００μｌずつ各ウエルに添加して、１時間室温で反応させた。各３００μｌの緩衝液で各ウエルを３回洗浄した後、各１００μｌのビオチン化アプロチニン１０μｇ／ｍｌを添加して、室温で１時間結合反応させた。その後、各３００μｌの緩衝液で３回洗浄した後、各１００μｌの０．７μｇ／ｍｌのＡＢＣ−ＨＲＰを添加して、室温で１時間結合反応させた後、各３００μｌの緩衝液で３回洗浄した。次に、各２００μｌの発色液［ＯＰＤ ８ｍｇ，５０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）２０ｍｌ，３０％Ｈ_２Ｏ_２ ８μｌ］を各ウエルに添加して、室温で２５分間発色させた後、５０μｌの２．５Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を添加して発色を停止させた。各ウエル中の液体について、マイクロプレートリーダー（MPR-80，Bio-Rad社製）を用いて、４９０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を図９に示す。

【0049】

図９の結果から分かるように、ＧａｌＮ・ＨＣｌが存在することによって、ＢＰＴＧとアプロチニンとの結合が増強することが示された。一方、ＢＰＴＧと結合しないＭｅ−β−Ｇａｌや、結合するが活性化阻害をほとんど示さないＭｅ−α−Ｍａｎでは、糖を含まないコントロールと差が無い結果であった。これらの結果から、ＧａｌＮ誘導体は、上記実施例１〜４で示されたトリプシノーゲンを安定化してトリプシンによる分解から保護する効果に加えて、アプロチニン（トリプシンに対する膵臓の内在性阻害剤）とトリプシノーゲンとの結合を増強することにより、活性トリプシンを阻害することによってもトリプシノーゲンを保護する機構が膵細胞内で起こることが予測される。すなわち膵臓内のアプロチニン存在下では、ＧａｌＮ誘導体による膵炎抑制効果はさらに高まることが推測される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】