特許 5669080 特定部位のアミノ酸を置換した緑色蛍光蛋白質またはそのホモログを用いたカルシウムセンサー蛋白質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5669080

(24)【登録日】2014年12月26日

(45)【発行日】2015年2月12日

(54)【発明の名称】特定部位のアミノ酸を置換した緑色蛍光蛋白質またはそのホモログを用いたカルシウムセンサー蛋白質

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20150122BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20150122BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 A

   C07K19/00ZNA

【請求項の数】3

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2009-289789(P2009-289789)

(22)【出願日】2009年12月21日

(65)【公開番号】特開2011-125318(P2011-125318A)

(43)【公開日】2011年6月30日

【審査請求日】2012年3月27日

(73)【特許権者】

【識別番号】504190548

【氏名又は名称】国立大学法人埼玉大学

(74)【代理人】

【識別番号】100137512

【弁理士】

【氏名又は名称】奥原 康司

(74)【代理人】

【識別番号】100149294

【弁理士】

【氏名又は名称】内田 直人

(72)【発明者】

【氏名】中井 淳一

(72)【発明者】

【氏名】大倉 正道

【審査官】 渡邉 潤也

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００２−１５３２７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2006 Mar 21,103(12),p.4753-8

【文献】 Nat.Methods,2009 Dec,6(12),p.875-81,Epub 2009 Nov 8

【文献】 Nat.Biotechnol.,2006 Jan,24(1),p.79-88

【文献】 Team:Cambridge/Improved GFP -2008.igem.org[online],revised on 30 Oct 2008,[retrived on 2 Dec 2013]，インターネット<URL:http://2008.igem.org/Team:Cambridge/Improved_GFP>

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記（ａ）〜（ｈ）の配列を、Ｎ末端から順に有することを特徴とするカルシウムセンサー蛋白質：
（ａ）配列番号４または配列番号５からなるアミノ酸配列（リンカーＸ）；
（ｂ）配列番号６からなるミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質の一部のアミノ酸配列；
（ｃ）Ｔｈｒ−Ｓｅｒ，Ｇｌｙ−Ｓｅｒ，Ｌｅｕ−Ｇｌｕ，Ｔｈｒ−Ｔｙｒ，Ｔｈｒ−Ａｓｐ，Ｔｈｒ−Ｃｙｓ，Ｔｈｒ−Ｐｈｅ，Ｔｈｒ−Ｍｅｔ，Ｔｈｒ−Ｔｈｒ，Ｔｈｒ−Ｇｌｕ，Ｔｈｒ−Ｈｉｓ，およびＴｈｒ−Ｌｅｕからなる群より選択される何れか一のアミノ酸配列（リンカーＹ）；
（ｄ）配列番号２で示される配列の１５０番目〜２３９番目までのアミノ酸配列であって、第２０７番目のアミノ酸をＶａｌに置換したアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号７からなるアミノ酸配列：
（ｆ）配列番号２で示される配列の１番目〜１４５番目までのアミノ酸配列であって、第３１番目のアミノ酸をＡｒｇに置換し、４０番目のアミノ酸をＡｓｎに置換し、及び１０６番目のアミノ酸をＴｈｒに置換したアミノ酸配列；
（ｇ）Ｔｈｒ（リンカーＺ）；
（ｈ）ラットのカルモジュリン蛋白質のアミノ酸配列中第２番目のアミノ酸〜第１４８番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列（配列番号８）、またはカルモジュリン蛋白質ミュータントＣａＭＣＮの第２番目〜第１４８番目のアミノ酸配列からなるアミノ酸配列（配列番号９）。

【請求項2】

下記（ａ）〜（ｈ）の配列を、Ｎ末端から順に有することを特徴とするカルシウムセンサー蛋白質：
（ａ）配列番号４または配列番号５からなるアミノ酸配列（リンカーＸ）；
（ｂ）配列番号６からなるミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質の一部のアミノ酸配列；
（ｃ）Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（リンカーＹ）；
（ｄ）配列番号２で示される配列の１５０番目〜２３９番目までのアミノ酸配列であって、第２０７番目のアミノ酸をＶａｌに置換したアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号７からなるアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号２で示される配列の１番目〜１４５番目までのアミノ酸配列であって、第３１番目のアミノ酸をＡｒｇに置換し、４０番目のアミノ酸をＡｓｎに置換し、及び１０６番目のアミノ酸をＴｈｒに置換したアミノ酸配列；
（ｇ）Ｔｈｒ（リンカーＺ）；
（ｈ）ラットのカルモジュリン蛋白質のアミノ酸配列中、第２番目のアミノ酸〜第１４８番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列（配列番号８）。

【請求項3】

請求項１または２に記載のカルシウムセンサー蛋白質をコードするカルシウムセンサー遺伝子。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、特定部位のアミノ酸を置換した緑色蛍光蛋白質（以下GFPとする）またはそのホモログを用いた、これまでのGFPまたはそのホモログを用いたカルシウムセンサー蛋白質よりも更に感度、反応量の優れたカルシウムセンサー蛋白質、および前記カルシウムセンサー蛋白質をコードするカルシウムセンサー遺伝子に関する。

【背景技術】

【0002】

カルシウムは生体にとって、構造の維持に必須である骨の主要な構成成分であると同時に、筋肉の収縮、神経興奮性やホルモン分泌、酵素活性の変化などの各種の細胞機能の調節因子として、生体機能の維持および調節に不可欠な役割を担っている。このため、生体内（細胞外および細胞内）のカルシウム変動を探知し、カルシウム濃度を測定するのに用いられるカルシウムセンサーの重要性が高まっている。

【0003】

カルシウムセンサーは大きく分けて4種類のものがこれまでに開発されている。以下にその概要を示す。

【0004】

１）カルシウム感受性の合成色素：カルシウムに感受性のある化学合成された色素であり、現在一般によく使用されている。細胞内において使用する場合は、外部から細胞に取り込ませる必要があるが、特定の細胞のみに色素を取り込ませることは難しく、ガラス針等により細胞に該色素を注入しなければならないという問題点を有する。

【0005】

２）エクオリン：カルシウムに反応して発光する蛋白質であり、細胞に直接注入するか、該蛋白質を賛成する遺伝子を細胞に導入して使用する。細胞内で機能するためには細胞に補酵素を供給する必要があり、また発光が極めて微弱であるという問題点を有する。

【0006】

３）蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を応用したカルシウム感受性蛋白質：カルシウムに感受性のあるカルモジュリン（ＣａＭ）とそれに結合するミオシン軽鎖キナーゼの一部の配列、二つの色の異なるＧＦＰまたはそのホモログを結合した蛋白質であり、カルシウムがＣａＭに結合するとその構造が変化し、ＦＲＥＴを起こして二つのＧＦＰまたはそのホモログの発する蛍光強度が変化することを利用している。該蛋白質は、細胞に直接注入するか、該蛋白質をコードする遺伝子を細胞に取り込ませて使用する。ＦＲＥＴによる蛍光変化は軽微であり、さらに一般的に用いられているアルゴンレーザーを搭載したレーザー顕微鏡により測定することが出来ないという問題点がある。

【0007】

４）一つのＧＦＰからなるカルシウム感受性蛋白質：ＧＦＰのアミノ酸配列（配列番号２）の１４５番と１４７番の間にＣａＭを結合したカルシウム感受性蛋白質であり、カルシウムがＣａＭに結合すると蛋白質の構造が変化し、ＧＦＰの発する蛍光強度が変化することを利用している。該蛋白質も、細胞に直接注入するか、その他遺伝子を細胞に取り込ませて使用する。一般にカルシウムに対する感度が低く、実際の細胞では信号／雑音比が高いため、測定が困難であるという問題点を有する。

【0008】

本発明者らは、上記４）の応用として、ＧＦＰの蛍光特性を制御することが可能なカルシウムセンサー蛋白質を作成する方法、並びに該方法により作成されるカルシウムセンサー蛋白質、および該カルシウムセンサー蛋白質をコードするカルシウムセンサー遺伝子を提供し（特許文献１）、カルシウムに対する感度が従来のカルシウムセンサーに比して高く、かつ特定細胞への取り込みが容易であり、更に測定に特別な装置及び補酵素等を必要としないカルシウムセンサー蛋白質の作成に成功している。

【0009】

しかし、近年、生体内でのカルシウムの微少な変動を感知する必要性が以前にも増して高まっており、上記特許文献１のカルシウムセンサー蛋白質をもってしても、十分な成果が上げられない状況となっている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】特許第３６５０８１５号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

上記事情に鑑み、本発明は、従来のカルシウムセンサーよりも、さらに、感度及び反応性に優れたカルシウムセンサー蛋白質、及び、該蛋白質をコードする遺伝子の提供を目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

すなわち、本発明は以下に記載の手段[１]〜[５]を提供する。
[１] 下記（ａ）〜（ｈ）の配列を、Ｎ末端から順に有することを特徴とするカルシウムセンサー蛋白質：
（ａ）３つのアミノ酸からなる配列 Ｍｅｔ−Ｘａａ１−Ｘａａ２（ここでＸａａ１及びＸａａ２はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である）（リンカーＸ）（配列番号１）；
（ｂ）ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質、またはカルモジュリン結合部位を含むその部分アミノ酸配列；
（ｃ）前述の（ｂ）の配列と後述の（ｄ）の配列とを連結する、２つのアミノ酸からなる配列Ｘａａ３−Ｘａａ４（ここでＸａａ３はロイシン、トレオニン及びグリシンからなる群から選択される何れか一のアミノ酸であり、Ｘａａ４は任意のアミノ酸である）（リンカーＹ）；
（ｄ）配列番号２で示される配列のＸ番目〜２３９番目までのアミノ酸配列または該アミノ酸配列であって第２０７番目のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したもの（ここで、Ｘは１４９〜１５１の任意の位置である）；
（ｅ）前述の（ｄ）の配列と後述の（ｆ）の配列を連結する、６つのアミノ酸配列からなる配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ５−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ６（ここでＸａａ５及びＸａａ６はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である）（配列番号３）；
（ｆ）配列番号２で示される配列の１番目〜Ｙ番目までのアミノ酸配列であって、第３１番目及び／または４０番目及び／または１０６番目のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列（ここで、Ｙは１４１〜１４８の任意の位置である）；
（ｇ）前述の（ｆ）の配列と後述の（ｈ）の配列とを連結するアミノ酸配列Ｔｈｒ−Ａｒｇ又はＴｈｒ（リンカーＺ）；
（ｈ）カルモジュリン蛋白質、そのＣａ^２＋イオン結合部位およびミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質結合部位の両方を維持するように改変されたカルモジュリン蛋白質ミュータント、又はＣａ^２＋イオン結合部位及びミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質結合部位の両方を含むその部分アミノ酸配列。

【0013】

[２] 請求項１に記載のカルシウムセンサー蛋白質であって、前記（ｄ）に記載の第２０７番目のアミノ酸を疎水性アミノ酸のいずれかに置換し、及び／又は前記（ｆ）に記載の第３１番目のアミノ酸を塩基性アミノ酸のいずれかに置換し、及び／又は第４０番目のアミノ酸を官能基にアミド基を有するアミノ酸のいずれかに置換し、及び／又は第１０６番目のアミノ酸を官能基に水酸基を有するアミノ酸のいずれかに置換することを特徴とするカルシウムセンサー蛋白質。

【0014】

[３] 下記（ａ）〜（ｈ）の配列を、Ｎ末端から順に有することを特徴とするカルシウムセンサー蛋白質：
（ａ）配列番号４または配列番号５からなるアミノ酸配列（リンカーＸ）；
（ｂ）配列番号６からなるミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質の一部のアミノ酸配列；
（ｃ）Ｔｈｒ−Ｓｅｒ，Ｇｌｙ−Ｓｅｒ，Ｌｅｕ−Ｇｌｕ，Ｔｈｒ−Ｔｙｒ，Ｔｈｒ−Ａｓｐ，Ｔｈｒ−Ｃｙｓ，Ｔｈｒ−Ｐｈｅ，Ｔｈｒ−Ｍｅｔ，Ｔｈｒ−Ｔｈｒ，Ｔｈｒ−Ｇｌｕ，Ｔｈｒ−Ｈｉｓ，およびＴｈｒ−Ｌｅｕからなる群より選択される何れか一のアミノ酸配列（リンカーＹ）；
（ｄ）配列番号２で示される配列の１５０番目〜２３９番目までのアミノ酸配列であって、第２０７番目のアミノ酸をＶａｌに置換したアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号７からなるアミノ酸配列：
（ｆ）配列番号２で示される配列の１番目〜１４５番目までのアミノ酸配列であって、第３１番目のアミノ酸をＡｒｇに置換し、４０番目のアミノ酸をＡｓｎに置換し、及び１０６番目のアミノ酸をＴｈｒに置換したアミノ酸配列；
（ｇ）Ｔｈｒ−Ａｒｇ又はＴｈｒ（リンカーＺ）；
（ｈ）ラットのカルモジュリン蛋白質のアミノ酸配列中、第２番目のアミノ酸〜第１４８番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列（配列番号８）、またはカルモジュリン蛋白質ミュータントＣａＭＣＮの第２番目〜第１４８番目のアミノ酸配列からなるアミノ酸配列（配列番号９）。

【0015】

[４] 下記（ａ）〜（ｈ）の配列を、Ｎ末端から順に有することを特徴とするカルシウムセンサー蛋白質：
（ａ）配列番号４または配列番号５からなるアミノ酸配列（リンカーＸ）；
（ｂ）配列番号６からなるミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質の一部のアミノ酸配列；
（ｃ）Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（リンカーＹ）；
（ｄ）配列番号２で示される配列の１５０番目〜２３９番目までのアミノ酸配列であって、第２０７番目のアミノ酸をＶａｌに置換したアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号７からなるアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号２で示される配列の１番目〜１４５番目までのアミノ酸配列であって、第３１番目のアミノ酸をＡｒｇに置換し、４０番目のアミノ酸をＡｓｎに置換し、及び１０６番目のアミノ酸をＴｈｒに置換したアミノ酸配列；
（ｇ）Ｔｈｒ−Ａｒｇ又はＴｈｒ（リンカーＺ）；
（ｈ）ラットのカルモジュリン蛋白質のアミノ酸配列中、第２番目のアミノ酸〜第１４８番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列（配列番号８）。

【0016】

[５] 請求項１、２、３または４に記載のバイオセンサー蛋白質をコードするカルシウムセンサー遺伝子。

【発明の効果】

【0017】

本発明により、従来のカルシウムセンサーに比べ、蛍光強度の変化量が、より安定に、かつ高感度なカルシウムセンサー蛋白質の提供が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】本発明のカルシウムセンサー蛋白質の模式図。

【図2】Ａ）本発明におけるカルシウムセンサー蛋白質（Ｇ−ＣａＭＰ４）及びＢ）従来のカルシウムセンサー蛋白質（Ｇ−ＣａＭＰ２）のＤＮＡをトランスフェクション法により導入し発現させたヒト胎児性腎細胞（ＨＥＫ２９３細胞）の画像図。

【図3】Ａ）Ｇ−ＣａＭＰ４及びＢ）Ｇ−ＣａＭＰ２を発現させたＨＥＫ２９３細胞のカルバコール処理に対する蛍光強度の時間経過を示す図。

【図4】１００μＭカルバコールに対するＡ）Ｇ−ＣａＭＰ４及びＢ）Ｇ−ＣａＭＰ２を発現させたＨＥＫ２９３細胞の蛍光強度の変化量を示す図。

【図5】精製したＧ−ＣａＭＰ４のカルシウム濃度と蛍光量との関係を示すグラフ図。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本発明のカルシウムセンサー蛋白質は、下記（ａ）〜（ｈ）の配列を、Ｎ末端から順に有することを特徴とする蛋白質である。すなわち、
（ａ）３つのアミノ酸からなる配列 Ｍｅｔ−Ｘａａ１−Ｘａａ２（ここでＸａａ１及びＸａａ２はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である）（リンカーＸ）（配列番号１）；
（ｂ）ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質、またはカルモジュリン結合部位を含むその部分アミノ酸配列；
（ｃ）前述の（ｂ）の配列と後述の（ｄ）の配列とを連結する、２つのアミノ酸からなる配列Ｘａａ３−Ｘａａ４（ここでＸａａ３はロイシン、トレオニン及びグリシンからなる群から選択される何れか一のアミノ酸であり、Ｘａａ４は任意のアミノ酸である）（リンカーＹ）；
（ｄ）配列番号２で示される配列のＸ番目〜２３９番目までのアミノ酸配列または該アミノ酸配列であって第２０７番目のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したもの（ここで、Ｘは１４９〜１５１の任意の位置である）；
（ｅ）前述の（ｄ）の配列と後述の（ｆ）の配列を連結する、６つのアミノ酸配列からなる配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ５−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ６（ここでＸａａ５及びＸａａ６はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である）（配列番号３）；
（ｆ）配列番号２で示される配列の１番目〜Ｙ番目までのアミノ酸配列であって、第３１番目及び／または４０番目及び／または１０６番目のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列（ここで、Ｙは１４１〜１４８の任意の位置である）；
（ｇ）前述の（ｆ）の配列と後述の（ｈ）の配列とを連結するアミノ酸配列Ｔｈｒ−Ａｒｇ又はＴｈｒ（リンカーＺ）；
（ｈ）カルモジュリン蛋白質、そのＣａ^２＋イオン結合部位およびミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質結合部位の両方を維持するように改変されたカルモジュリン蛋白質ミュータント、又はＣａ^２＋イオン結合部位及びミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質結合部位の両方を含むその部分アミノ酸配列；
という８つのドメインを図１に示すようにＮ末端から順に連結した蛋白質を指す。

【0020】

上記のカルシウムセンサー蛋白質の８つの構成ドメインは、（１）改変ＧＦＰ（ｄ及びｆが該当）、（２）機能性分子（ｂ及びｈが該当）、（３）リンカー（ａ、ｃ、ｅ及びｇが該当）の何れかに属する。

【0021】

改変ＧＦＰとは、蛍光特性に影響を及ぼすホットスポットアミノ酸残基の近傍でＧＦＰのアミノ酸配列を切断して該蛋白質の構造を改変し、さらに特定部位のアミノ酸残基を置換したものである。

【0022】

本発明のＧＦＰは、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質である。また、本発明のＧＦＰのホモログとは、配列番号２で示されるアミノ酸と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質のことである。ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質」とは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、蛍光を発する蛋白質のことであり、例えば、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＧＦＰ、ＹＦＰ，ＲＦＰ等のＧＦＰ色変異体があげられる。

【0023】

あるいは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質としては、配列番号２で表わされるアミノ酸配列中の１又は数個（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、蛍光を発する蛋白質のことである。

【0024】

本発明において、ＧＦＰの蛍光特性に影響を及ぼす「ホットスポットアミノ酸残基」とは、改変ＧＦＰを作成する際に、その改変位置の指標となるＧＦＰ上のアミノ酸残基であり、該アミノ酸残基の近傍でＧＦＰの構造を改変することにより、所望の改変ＧＦＰを作成することを可能とするものである。本発明において推定されるＧＦＰのホットスポットアミノ酸残基はＧＦＰの第１４９番目のアミノ酸である。

【0025】

ＧＦＰの構造を改変するとは、好ましくは、推定されるホットスポットアミノ酸残基の近傍（好ましくは、ホットスポットアミノ酸残基の前後５アミノ酸の範囲内の各位置）でＧＦＰを切断し、さらに切断部位から適切な数のアミノ酸（好ましくは１−１０個のアミノ酸）を除去し、必要に応じてＧＦＰ本来のＮ末端と本来のＣ末端とを適切なアミノ酸配列で連結することをいう。

【0026】

特定部位のアミノ酸残基を置換した改変ＧＦＰとは、ＧＦＰにおける特定部位のアミノ酸残基（好ましくは第３１番目及び／または第４０番目及び／または第１０６番目及び／または第２０７番目のアミノ酸残基）をいずれかのアミノ酸に置換した（好ましくは、第３１番目のアミノ酸を塩基性アミノ酸のいずれかに置換し、及び／又は第４０番目のアミノ酸を官能基にアミド基を有するアミノ酸のいずれかに置換し、及び／又は第１０６番目のアミノ酸を官能基に水酸基を有するアミノ酸のいずれかに置換し、及び／または第２０７番目のアミノ酸を疎水性アミノ酸のいずれかに置換した、さらに好ましくは、第３１番目においてはＡｒｇに置換し、及び／または第４０番目においてはＡｓｐに置換し、及び／または第１０６番目においてはＴｈｒに置換し、及び／または第２０７番目においてはＶａｌに置換した）ＧＦＰを用いて、上記にあるように構造を改変したＧＦＰをいう。

【0027】

改変ＧＦＰの好ましい例としては、配列番号２で示される配列の１５０番目〜２３９番目までのアミノ酸配列であって、第２０７番目のアミノ酸をＶａｌに置換したアミノ酸配列をＮ末端側とし、配列番号２で示される配列の１番目〜１４５番目までのアミノ酸配列であって、第３１番目のアミノ酸をＡｒｇに置換し、４０番目のアミノ酸をＡｓｎに置換し、及び１０６番目のアミノ酸をＴｈｒに置換したアミノ酸配列をＣ末端側として、適切なアミノ酸配列により連結したものが挙げられる。

【0028】

機能性分子とは、機能性分子自身が、該分子に作用する因子の結合等の作用により、立体構造に変化を起こし得る分子であって、改変ＧＦＰに連結することで、自身の立体構造の変化を該改変ＧＦＰに伝え得る分子のことである。この際、該機能性分子は、自身の立体構造の変化を前記改変ＧＦＰに伝えることにより、前記改変ＧＦＰの立体構造を変化させ、蛍光特性を変化させるように機能する。

【0029】

従って、機能性分子は、自身の立体構造の変化を改変ＧＦＰに伝達し改変ＧＦＰの構造に変化を及ぼし得る位置で、改変ＧＦＰに連結されている必要がある。従って機能性分子は、本来のＧＦＰ構造を改変した部分に近接して連結されていることが好ましい。具体的には、ＧＦＰを切断した位置にリンカー分子を介して連結されていることが好ましい。

【0030】

このような機能性分子は、一分子であってもよいし、二分子以上であってもよい。二分子の場合、機能性分子に作用する因子は、まず一方の機能性分子の立体構造に変化を及ぼし、次いでその立体構造が改変ＧＦＰの立体構造に変化を起こさせる。本発明における機能性分子としては、カルモジュリン蛋白質とミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質との組み合わせが挙げられる。

【0031】

また、改変ＧＦＰに連結する機能性分子は、その機能性分子が生体内で発現している通りの全構造を有する必要はなく、機能性分子に作用する因子が結合する部位のみを有する一部構造であってもよい。本発明における好ましい例としては、カルモジュリン蛋白質、および配列番号６に示すカルモジュリン結合機能を有するミオシン軽鎖キナーゼの一部を機能性分子として挙げられる。このような機能性分子を改変ＧＦＰに適式に連結することで、該融合蛋白質はカルシウムセンサーとして機能し得る。

【0032】

ここで機能性分子として使用したラットカルモジュリン蛋白質の第２番目のアミノ酸〜第１４８番目のアミノ酸配列を配列番号８に示す。また、同様に機能性分子として使用したカルモジュリン蛋白質ミュータントＣａＭＣＮの第２番目のアミノ酸〜第１４８番目のアミノ酸配列を配列番号９に示す。

【0033】

リンカーとは、上記改変ＧＦＰの切断部位、該改変ＧＦＰと上記機能性分子間の連結部位および改変ＧＦＰと機能性分子を連結してなる蛋白質のＮ末端に位置する数残基のアミノ酸からなるペプチドである。各リンカー分子を区別するべく、以下のような名称を付している。

【0034】

改変ＧＦＰと機能性分子からなる融合蛋白質全体のＮ末端に存在する開始コドン（Ｍｅｔ）を含むリンカーはリンカーＸと称し、Ｍｅｔを含む任意のアミノ酸配列であるが、好ましくは１〜１０残基のアミノ酸ペプチドであり、より好ましくは、３つのアミノ酸からなる配列Ｍｅｔ−Ｘａａ１−Ｘａａ２（ここでＸａａ１及びＸａａ２はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である；配列番号1）、さらに好ましくは、Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（配列番号４）またはＭｅｔ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（配列番号５）である。

【0035】

改変ＧＦＰのＮ末端側と機能性分子を連結するリンカーはリンカーＹと称し、任意のアミノ酸配列であるが、好ましくは０〜１０残基のアミノ酸ペプチドであり、より好ましくは、２つのアミノ酸からなる配列Ｘａａ３−Ｘａａ４（ここでＸａａ３はロイシン、トレオニン及びグリシンからなる群から選択される何れか一のアミノ酸であり、Ｘａａ４は任意のアミノ酸である）、さらに好ましくは、Ｔｈｒ−Ｓｅｒ，Ｇｌｙ−Ｓｅｒ，Ｌｅｕ−Ｇｌｕ，Ｔｈｒ−Ｔｙｒ，Ｔｈｒ−Ａｓｐ，Ｔｈｒ−Ｃｙｓ，Ｔｈｒ−Ｐｈｅ，Ｔｈｒ−Ｍｅｔ，Ｔｈｒ−Ｔｈｒ，Ｔｈｒ−Ｇｌｕ，Ｔｈｒ−Ｈｉｓ，およびＴｈｒ−Ｌｅｕからなる群より選択される何れか一のアミノ酸配列であり、特に好ましくは、Ｌｅｕ−Ｇｌｕである。

【0036】

改変ＧＦＰのＣ末端側と機能性分子を連結するリンカーはリンカーＺと称し、Ｔｈｒ−Ａｒｇ又はＴｈｒであることを特徴とする。

【0037】

なお、ＧＦＰの本来のＮ末端とＣ末端とを連結するアミノ酸ペプチドもリンカーであり、好ましくは、アミノ酸２〜１０残基からなるペプチドであり、Ｇｌｙを多く含むものが好ましく、さらに好ましくは、６つのアミノ酸配列からなる配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ５−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ６（ここでＸａａ５及びＸａａ６はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である；配列番号３）であり、特に好ましい例としては、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号７）が挙げられる。

【0038】

本発明でのカルシウムセンサー蛋白質とは、当該蛋白質に含まれる機能性分子の立体構造に影響を及ぼす因子であるカルシウムを作用させることで該機能性分子の立体構造に影響を与え、該立体構造の変化がカルシウムセンサー蛋白質に含まれる改変ＧＦＰの立体構造に影響を与えることで、該改変ＧＦＰの蛍光特性を可逆的に変化させる蛋白質をいう。この変化は、蛍光顕微鏡もしくはレーザー顕微鏡等で捉えることが出来る程度の変化をいい、好ましくは肉眼で捉えることが出来る程度の変化をいう。蛍光特性の変化が蛍光強度の変化である場合、蛍光の変化量ΔＦ／Ｆが、好ましくは、少なくとも０．１以上変化すること、より好ましくは１以上の範囲で変化することをいう。

【0039】

本発明において蛍光特性とは、蛍光強度、蛍光波長、蛍光強度比、吸光度、吸光波長などの蛍光特性を指す。本発明では蛍光特性の一例として、蛍光強度を使用する。

【0040】

本発明において、蛍光特性が蛍光強度である場合、カルシウムセンサー蛋白質は、蛍光を発する状態と蛍光を発しない状態の臨界状態にある。この臨界状態においてカルシウムセンサー蛋白質は、蛍光を発しない状態にあってもよいし、蛍光強度の低い状態にあってもよい。あるいは蛍光強度の高い状態にあってもよい。ここで、蛍光を発しないとは、光学機器を使用して蛍光を確認できないことをいう。蛍光強度が低いとは、カルシウムの存在により、上記の変化量（ΔＦ／Ｆが少なくとも０．１以上変化する量）を示して、蛍光強度が高い状態に変化し得る程度に低いことをいう。同様に、蛍光強度が高いとは、カルシウムの存在により、上記の変化量（ΔＦ／Ｆが少なくとも０．１以上変化する量）を示して、蛍光強度が低い状態に変化し得る程度に高いことをいう。

【0041】

本発明におけるカルシウムセンサー蛋白質は、従来の該蛋白質に比べ、上記のように改変ＧＦＰの特定部位のアミノ酸残基を置換し、上記のような特定のＺリンカーを用いることにより、カルシウム作用時に、より大きな蛍光特性の変化を引き起こすことを特徴とする。ここでより大きな蛍光特性変化とは、蛍光特性の変化が蛍光強度の変化である場合、蛍光の変化量ΔＦ／Ｆが、従来のカルシウムセンサー蛋白質よりも大きく、好ましくは、２倍以上増強されることをいう（図４）。

【0042】

融合蛋白質の作成は、公知の遺伝子工学的手法を用いて行うことができる。例えば、融合したい各蛋白質部分をコードする遺伝子（即ち、特定アミノ酸部位の弛緩を伴う改変ＧＦＰ及び機能性分子をコードする遺伝子）の断片をそれぞれＰＣＲにより作成し、これら断片を繋ぎ合わせることにより融合遺伝子を作成し、次いで、該融合遺伝子を含むプラスミドを所望の細胞に導入して発現させることにより、融合蛋白質は作られる。

【0043】

また、本発明においてカルシウムセンサー遺伝子は、本発明のカルシウムセンサー蛋白質をコードする遺伝子のことをいう。該カルシウムセンサー遺伝子は、上記にあるように、作成したいカルシウムセンサー蛋白質を構成する各構成部分をコードする遺伝子断片をそれぞれＰＣＲにより作成し、次いで、これら各遺伝子断片を連結させることにより、融合遺伝子の形で作成され得る。

【0044】

本発明において作成されたカルシウムセンサー蛋白質は、細胞内および細胞外でカルシウム濃度をより安定に、かつ高感度に測定することが出来る。

【0045】

例えば、本発明のカルシウムセンサー遺伝子を大腸菌などに導入して予め産生されたカルシウムセンサー蛋白質と検体とを混合することによりカルシウム濃度を測定することが可能である。また、大腸菌などを使用して産生させた蛋白質を、カルシウム濃度を測定したい細胞に直接注入することにより、細胞内のカルシウム濃度を測定することも可能である。あるいは、本発明のカルシウムセンサー遺伝子を、カルシウム濃度を測定したい細胞に導入して細胞に蛋白質を産生させることにより、細胞内のカルシウム濃度を測定することも可能である。

【0046】

カルシウム濃度の測定は、ある特定の波長の光（例えば、４８８ｎｍの励起光）をカルシウムセンサー蛋白質に当てることにより、該蛋白質の発する蛍光特性を光学機器（例えば、レーザー顕微鏡）で検出することにより行う。なお、濃度測定に使用するカルシウムセンサー蛋白質が、どのくらいのカルシウム濃度でどのような蛍光特性を示すのか、予め調べておくことが必要である。具体的には、例えば、大腸菌により産生したカルシウムセンサー蛋白質により、蛍光分光光度計を用いて種々のカルシウム濃度に対する蛍光強度変化を測定しておくことが必要である（例えば、図５を参照のこと）。本測定により、Ｋｄ１３３ｎＭ、Ｈｉｌｌ係数３．７、最大蛍光変化量５．５という結果を得た。

【0047】

本発明のカルシウムセンサー蛋白質は、カルシウムセンサーとしての性能を実験的に確認しておくことが必要である。

【0048】

以下に本発明の実施例を示すが、これらの実施例はあくまでも例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。

【実施例】

【0049】

本発明において開発したカルシウムセンサー蛋白質（Ｇ−ＣａＭＰ４）及び従来からあるカルシウムセンサー蛋白質（Ｇ−ＣａＭＰ２）は、培養細胞ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｉｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ（ＨＥＫ）２９３細胞に該蛋白質にかかる遺伝子を導入して、カルシウムセンサーとしての性能評価を行った（図２）。

【0050】

Ｇ−ＣａＭＰ２及びＧ−ＣａＭＰ４をそれぞれＨＥＫ２９３細胞内にて発現させ、次いで細胞内カルシウムイオン濃度を増大させることが既知である因子として、カルバコール（０．１ｍＭ）を作用させた。その時の反応例を図３に示す。従来のカルシウムセンサー蛋白質であるＧ−ＣａＭＰ２よりも本発明のカルシウムセンサー蛋白質であるＧ−ＣａＭＰ４の方が、より安定に蛍光強度が上昇することがわかる。

【0051】

Ｇ−ＣａＭＰ４を発現させたＨＥＫ２９３細胞でのカルバコールに対する蛍光強度の変化量は、Ｇ−ＣａＭＰ２のそれに比して、２．７倍大きな蛍光変化を確認した（図４）。

【0052】

このように本発明のカルシウムセンサー蛋白質は、従来のものに比して、より安定かつ高感度であることが証明されている。

【0053】

カルシウムセンサー蛋白質の製法及び測定法
次に本発明を具体例によって説明するがこれらの例によって本発明が限定されるものではない。

【0054】

（Ａ）Ｇ−ＣａＭＰ４の製法
（Ａ−１）細菌発現用および哺乳動物発現用のプラスミド構築
Ｇ−ＣａＭＰ４の細菌発現用であるｐＲＳＥＴ_Ｂ−ＧＣａＭＰ４および哺乳動物発現用プラスミドであるｐＮ１−ＧＣａＭＰ４は、参考文献１（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｕ．Ｓ．Ａ．, １０３, ４７５３−４７５８ (２００６)）に記載のｐＲＳＥＴ_Ｂ−ＧＣａＭＰ２およびｐＮ１−ＧＣａＭＰ２を後述のように改変することによって構築した。すなわち、配列番号２で示されるＧＣａＭＰ２の配列においてＳｅｒ−３１→Ａｒｇ、Ｔｙｒ−４０→Ａｓｎ、Ａｓｎ−１０６→Ｔｈｒ、およびＬｙｓ−２０７→Ｖａｌにアミノ酸置換されるよう、そのｃＤＮＡ配列中でＳｅｒ−３１をコードしている５’−ＴＣＣ−３’を５’−ＣＧＣ−３’に、Ｔｙｒ−４０をコードしている５’−ＴＡＣ−３’を５’−ＡＡＣ−３’に、Ａｓｎ−１０６をコードしている５’−ＡＡＣ−３’を５’−ＡＣＣ−３’に、およびＬｙｓ−２０７をコードしている５’−ＡＡＡ−３’を５’−ＧＴＡ−３’に各々変異させて構築した。

【0055】

まず、ｐＮ１−ＧＣａＭＰ２をテンプレートとして以下の合成プライマー（Ｏｐｅｒｏｎ）
５’−AAGTTCAGCGTGCGCGGCGAGGGTGAG−３’（ＥＧＦＰ−１２７；配列番号１０）
５’−GGCGATGCCACCAACGGCAAGCTGAC−３’（ＥＧＦＰ−１２８；配列番号１１）
５’−TGAGCACCCAGTCCGTACTTTCGAAAGACCC−３’（ＥＧＦＰ−１２９；配列番号１２）
５’−AGGACGACGGCACCTACAAGACCCG−３’（ＥＧＦＰ−１３０；配列番号１３）
を用いてＰＣＲによる同時多点変異導入を後述の方法で行い、ｐＮ１−ＧＣａＭＰ２．２を作成した。

【0056】

次に、ｐＮ１−ＧＣａＭＰ２．２をＳａｌＩとＭｌｕＩで消化後１％アガロースゲル電気泳動により分離し、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒにて回収した０．８ｋｂの断片と、ｐＲＳＥＴ_Ｂ−ＧＣａＭＰ２をＳａｌＩとＭｌｕＩで消化後１％アガロースゲル電気泳動により分離し、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒにて回収した６．８６ｋｂの断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて結合させて、ｐＲＳＥＴ_Ｂ−ＧＣａＭＰ２．２を作成した。

【0057】

さらに、ｐＲＳＥＴ_Ｂ−ＧＣａＭＰ２．２をテンプレートとして以下の合成プライマー（Ｏｐｅｒｏｎ）
５’−CAACACGGACCAACTGACTGAAGAG−３’（ＥＧＦＰ−１６６；配列番号１４）
５’−AGTTGGTCCGTGTTGTACTCCAGCTT−３’（ＥＧＦＰ−１６７；配列番号１５）
を用いてＰＣＲによる点変異導入を後述の方法で行い、ｐＲＳＥＴ_Ｂ−ＧＣａＭＰ４を作成した。

【0058】

最後に、ｐＲＳＥＴ_Ｂ−ＧＣａＭＰ４をXｈｏＩとＣｌａＩで消化後１％アガロースゲル電気泳動により分離し、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒにて回収した１．１２ｋｂの断片と、ｐＲＳＥＴ_Ｂ−ＧＣａＭＰ２をXｈｏＩとＣｌａＩで消化後１％アガロースゲル電気泳動により分離し、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒにて回収した４．１９ｋｂの断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて結合させて、ｐＮ１−ＧＣａＭＰ４を作成した。

【0059】

ＰＣＲによる同時多点変異導入にはＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、操作はそのマニュアルに従って行った。詳細には、１００ｎｇ／μｌのｐＮ１−ＧＣａＭＰ２プラスミドを１μｌ、１０ｘバッファーを２．５μｌ、２．５ｍＭのｄＮＴＰを１μｌ、各１０μＭのＥＧＦＰ−１２７プライマー、ＥＧＦＰ−１２８プライマー、ＥＧＦＰ−１２９プライマー、およびＥＧＦＰ−１３０プライマーを各０．６μｌずつ、Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１μｌ、水を１７μｌの混合液を下記の条件に付した。

ステップ１
摂氏９５度 １分
ステップ２
摂氏９５度 １分
摂氏５５度 １分
摂氏６５度 １２分
上記を３０サイクル

【0060】

多点変異を含むプラスミドの上記混合液の全量に２０Ｕ／μｌのＤｐｎＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を１μｌ加えて摂氏３７度で１．５時間処理し、この処理後の多点変異を含むプラスミドは後述のようにＸＬ−１０Ｇｏｌｄに形質転換して出現したカナマイシン耐性の大腸菌より回収した。

【0061】

ＰＣＲによる点変異導入は、３３ｎｇ／μｌのｐＲＳＥＴ_Ｂ−ＧＣａＭＰ２．２プラスミド０．６μｌをテンプレートとして、１０μＭのＥＧＦＰ−１６６プライマーと１０μＭのＥＧＦＰ−１６７プライマーを各０．２μｌずつ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ）を５μｌ、水を４μｌの混合液を下記の条件に付した。

ステップ１
摂氏９８度 １０秒
ステップ２
摂氏９８度 １０秒
摂氏５５度 １０秒
摂氏７２度 ２５秒
上記を３０サイクル
ステップ３
摂氏７２度 ３０秒

【0062】

上記混合液に２０Ｕ／μｌのＤｐｎＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を０．４μｌ加えて摂氏３７度で１時間処理し、ＫＲＸに形質転換して出現したアンピシリン耐性の大腸菌より回収した。

【0063】

制限酵素によるＤＮＡの切断はＳａｌＩ、ＭｌｕＩ、XｈｏＩ、ＣｌａＩ（ＮＥＢ）のいずれか、および添付バッファーと添付Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（１００ｘＢＳＡ）を用いて行った。反応は、１〜２μｇのＤＮＡに添付バッファー（３μｌ）、添付１００ｘＢＳＡ（０．３μｌ）および各制限酵素（１０〜２０ユニット）を加えて全量を３０μｌとした中で、摂氏３７度で１〜３時間行った。

【0064】

アガロースゲル（Ａｇａｒｏｓｅ ＬＥ、ナカライテスク）は、ＴＡＥバッファー（４．９８ｇ／ｌ Ｔｒｉｓ ｂａｓｅ（ナカライテスク）、１．１４２ｍｌ／ｌ氷酢酸（ナカライテスク）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）（Ｄｏｊｉｎｄｏ））にて加熱溶解し、１％または２％となるように調製した。λＨｉｎｄＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（Ｔｏｙｏｂｏ）または１００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（Ｔｏｙｏｂｏ）をＤＮＡサイズマーカーとして、ＤＮＡ試料は制限酵素に添付されている１０ｘサンプルバッファーを１／１０量と、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）にて１００倍希釈したＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１／１０量加えたものを、ＴＡＥバッファーを用いて１００Vにて電気泳動を行い、Ｓａｆｅ Ｉｍａｇｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて検出した。

【0065】

ゲルからのＤＮＡの回収にはＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用い、操作はそのマニュアルに従って行った。詳細には、まずアガロースゲル電気泳動後Ｓａｆｅ Ｉｍａｇｅｒ上で目的のバンドをなるべく小さくなるようにメスで切り出し、吸着液を４００μｌ加えて室温に放置してゲルを完全に溶解させた。次に磁性ビーズを３０μｌ加えて時々撹拌しながら室温に２分放置した。ＤＮＡを吸着した磁性ビーズはマグネットスタンドを用いて吸着し、上清は捨てた。回収した磁気ビーズに洗浄液を６００μｌ加えてボルテックスミキサーで１０秒撹拌し、マグネットスタンドを用いてＤＮＡを吸着した磁性ビーズを同様の手法で回収した。これに７５％エタノールを１ｍｌ加えてボルテックスミキサーで１０秒撹拌し、ＤＮＡを吸着した磁性ビーズはマグネットスタンドを用いて回収した。これをスピンダウンして完全に上清捨て、５５度で２分間乾燥させた後、水またはＴＥを２５〜１００μｌ加えて時々撹拌しながら、室温で２分間放置した。ＤＮＡを解離させた後の磁性ビーズはマグネットスタンドを用いて分離し、ＤＮＡを含む上清を回収した。

【0066】

Ｌｉｇａｔｉｏｎ反応にはＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ）を用い、操作はそのマニュアルに従って行った。詳細には、約２５ｆｍｏｌのプラスミドベクターおよび約２５〜２５０ｆｍｏｌのインサートＤＮＡの混合溶液に等量のＬｉｇａｔｉｏｎ Ｍｉｘを添加して混和した後、摂氏１６度℃で３０分間反応させた。

【0067】

形質転換はＥ．ｃｏｌｉコンピテントセルＤＨ５a（Ｔａｋａｒａ）、ＸＬ−１０Ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＫＲＸ（Ｔａｋａｒａ）、またはＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｔａｋａｒａ）を用いて行った。詳細には、１００μｌのコンピテントセルを氷上にて溶解し、ＤＮＡ溶液１μｌまたはＬｉｇａｔｉｏｎ反応液１μｌを加えて氷上で３０分間放置した後、摂氏４２度で４５秒間加熱した。その後さらに氷上で５分間放置し、ＬＢ培地５００μｌを加えて摂氏３７度で１時間培養後、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンまたは５０μｇ／ｍｌのカナマイシン（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含む選択培地（ＬＢ培地）に植えて、摂氏３７度にて一晩培養した。翌日、コロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンまたは５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む１〜５ｍｌの液体培地（ＬＢ培地）に植えつぎ、摂氏３７度にて１６時間培養した。

【0068】

大腸菌からのプラスミドの回収にはＱｕｉｃｋＬｙｓｅ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、操作はそのマニュアルに従って行った。詳細には、まず１〜３ｍｌの大腸菌培養液を約１７０００ｘｇ、１分の遠心に付し、上清をデカンテーションまたはピペティングで除去して大腸菌の沈殿を得た。これに氷冷したＬｙｓｉｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎを４００μｌ加えて激しく３０秒ボルテックスで撹拌し、室温に３分放置して菌体を破砕した。その菌体破砕液をＱｕｉｃｋＬｙｓｅ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎに移し、約１７０００ｘｇ、３０秒〜１分の遠心に付してプラスミドをカラムに吸着させた。カラムを通り抜けたサンプルはデカンテーションまたはピペッティングにて除去した。次にカラムにＱＬＷバッファーを４００μｌ加えて約１７０００ｘｇ、３０秒〜１分の遠心に付してカラムを洗浄した。カラムを通り抜けたバファーはデカンテーションにて除去した。さらにバッファーを加えずにもう一度約１７０００ｘｇ、３０秒〜１分の遠心に付してカラムに残った液滴を完全に除去した。カラムを新しい回収用マイクロチューブにとりつけ、カラムにＱＬＥバッファーを５０μｌ加えて約１７０００ｘｇ、３０秒〜１分の遠心に付してカラムからプラスミドを溶出し回収した。

ＬＢ培地の組成
１０ｇ／ｌ Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ（ナカライテスク）、５ｇ／ｌ Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（ナカライテスク）、５ｇ／ｌ ＮａＣｌ（ナカライテスク）、１ｇ／ｌ ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。オートクレーブにて滅菌する。

ＬＢ寒天培地の組成
１０ｇ／ｌ Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ（ナカライテスク）、５ｇ／ｌ Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（ナカライテスク）、５ｇ／ｌ ＮａＣｌ（ナカライテスク）、１ｇ／ｌ ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、１５ｇ／ｌ Ａｇａｒ（ナカライテスク）。オートクレーブにて滅菌後、温度が45度程度まで下がったところで抗生物質（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンまたは５０μｇ／ｍｌのカナマイシン（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））を加え、プラスチックディシュに流し込む。

ＴＥ（ｐＨ８）（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １ｍＭ ＥＤＴA）（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）

【0069】

（Ａ−２）蛋白質の精製
Ｇ−ＣａＭＰ４蛋白質の精製にはこれらの蛋白質が６ｘＨｉｓタグを持っていることを利用して、６ｘＨｉｓタグに特異的に結合するＮｉ−ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、操作はそのマニュアルに従って行った。詳細には、ｐＲＳＥＴ_Ｂ−ＧＣａＭＰ４をＥ．ｃｏｌｉコンピテントセルＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ選択培地に植え、摂氏３７度で一晩培養した。コロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌの液体培地（ＬＢ培地）に植えつぎ、摂氏３７度にて１６時間培養した。培養液１０ｍｌをさらに１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２００ｍｌの液体培地（ＬＢ培地）に植えつぎ、吸光度ＯＤ６００で０．５〜１となるまで摂氏３７度で培養した後、最終濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧ（ナカライテスク）を加えて、摂氏２７〜２８度で４〜５時間さらに培養した。
３０００回転１５分遠心して（６２００遠心機、Kubota）、大腸菌を回収した。１ｍｌのＬＢ培地で大腸菌を懸濁した。摂氏−２０度で３０分凍らせたのち、室温で３０分解凍した。もう１度凍結、解凍を繰り返した。氷上で冷やした４０ｍｌのｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭ ２−メルカプトエタノール（ナカライテスク）、１〜５μｇ／ｍｌの蛋白分解酵素阻害剤（ペプスタチンＡ、アプロチニン（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））を加え、よく混ぜて大腸菌を懸濁した。摂氏４度にて１００,０００ｘｇで１５分間遠心し、上清を得た。５Ｍ ＮａＣｌを最終濃度が０．３Ｍとなるように加え、２ｍｌの５０％ Ｎｉ−ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ；蛋白質結合能５〜１０ｍｇ／ｍｌレジン）をさらに加えて１時間室温でおだやかに混ぜて反応させた。反応液を空のカラム（エコノカラム；カラムサイズ 〜２０ｍｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））に移し、余分の液がカラムから滴下してなくなるのを待った。１０ｍｌの洗浄液（５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８）（ナカライテスク）、０．３Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ（ナカライテスク））で2回洗浄した後、３〜４ｍｌの回収液（５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８）（ナカライテスク）、０．３Ｍ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ（ナカライテスク））にて溶出し、Ｈｉｓタグ付きの蛋白質をカラムから回収した。次に、回収した液を透析チューブ（Ｓａｎｋｏｕｊｕｎｙａｋｕ）に入れて１２５ｍｌまたはそれ以上のＫＭバッファー（０．１Ｍ ＫＣｌ（ナカライテスク）、２０ｍＭ ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）（Ｄｏｊｉｎｄｏ））で摂氏４度にて透析した。ＫＭバッファーは４〜５時間ごとに交換し、液交換を３回以上行った後、透析チューブから蛋白質の溶液を回収した。

【0070】

蛋白質の濃度測定にはプロテインアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用い、操作はそのマニュアルに従ってＢｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ． Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７６，７２，２４８−２５４．）で測定した。まず、１０〜２００μｇ／ｍｌとなるように水で希釈した蛋白質の溶液５０μｌにＢｒａｄｆｏｒｄ試薬を１ｍｌ加えて３０分後に５９５ｎｍの吸光度を測定した。蛋白質の基準濃度は牛血清アルブミンを基準蛋白質として用いて測定して求めた。測定は室温にて行った。

【0071】

（Ｂ）Ｇ−ＣａＭＰ４を用いた測定法
（Ｂ−１）カルシウム結合能の測定
Ｇ−ＣａＭＰ４蛋白質のカルシウム結合能はさまざまなカルシウム濃度溶液中における蛍光強度を測定して得られたカルシウム濃度―蛍光強度の容量反応曲線に基づいて算出した。既述のように精製したＧ−ＣａＭＰ４蛋白質はＫＭバッファーで最終濃度が０．３μＭとなるように希釈した。蛍光強度測定には、蛍光分光光度計Ｆ−２５００（Ｈｉｔａｃｈｉ）を用い４７０ｎｍで励起し５１０ｎｍで蛍光を記録した。まず測定標品に２０ｍＭ ＢＡＰＴＡ（（Ｄｏｊｉｎｄｏ））を添加してカルシウム非存在下における測定を行った後、逐次ＣａＣｌ_２をさまざまな濃度になるように添加して測定した。測定は室温にて行った。

【0072】

（Ｂ−２）ＨＥＫ２９３細胞の培養とプラスミドの導入
炭酸ガス培養器を用いて、培地（ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）、１ｘペニシリン・ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ））にてＨＥＫ２９３細胞を摂氏３７度で培養し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて培養細胞にｐＮ１−ＧＣａＭＰ４のプラスミドを導入した。導入操作は試薬のマニュアルに従って行った。まず、血清を含まないＤＭＥＭ５０μｌでプラスミド０．８μｇを希釈した。次に２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を血清を含まないＤＭＥＭ５０μｌに加え室温で５分放置した。その後両希釈液を混合して室温で２０分放置した。この混合液の全量を２４穴培養シャーレ中のＨＥＫ２９３細胞に投与してプラスミドを導入した。プラスミドを導入した後細胞は摂氏３７度で１〜３日培養した。

【0073】

（Ｂ−３）ＨＥＫ２９３細胞での蛍光測定
蛍光測定にはコンピューターにて制御（アクアコスモス（浜松ホトニクス））されたＣＣＤカメラ（ＯＲＣＡ−ＥＲ、浜松ホトニクス）を搭載した倒立蛍光顕微鏡（ＩＸ７０（オリンパス）、ＮＩＢＡフィルターセット（オリンパス）、対物レンズ２０ｘまたは４０ｘ（オリンパス））を用いた。プラスミドを導入した細胞を顕微鏡にセットし、ＨＢＳバッファー（１０７ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ_４（ナカライテスク）、２ｍＭ ＣａＣｌ_２、１．２ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４（ナカライテスク）、１１．５ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｄｏｊｉｎｄｏ）（ｐＨ７．４））を細胞外液として還流し、１００μＭ Ｃａｒｂａｃｈｏｌ（Ｓｉｇｍａ）を細胞外に投与して細胞を刺激し、その際に起こる細胞内カルシウム濃度変化を蛍光強度変化として検出した。測定は室温にて行った。

【産業上の利用可能性】

【0074】

本発明は、筋肉の収縮、神経興奮性やホルモン分泌、酵素活性の変化などの各種の細胞機能の調節因子として、生体機能の維持および調節に不可欠な役割を担っているカルシウム濃度の生体内での変動を、従来のものに比べ極めて高感度で測定するカルシウムセンサー蛋白質を提供するもので、その利用価値は高く、生体機序の解明や医学・創薬といった分野に大きく貢献するものである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

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