特許 5671475 方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5671475

(24)【登録日】2014年12月26日

(45)【発行日】2015年2月18日

(54)【発明の名称】方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/574 20060101AFI20150129BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALI20150129BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20150129BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/574 A

   G01N33/574 Z

   C12Q1/68 AZNA

   !C12N15/00 A

【請求項の数】14

【全頁数】36

(21)【出願番号】特願2011-540202(P2011-540202)

(86)(22)【出願日】2009年12月15日

(65)【公表番号】特表2012-512389(P2012-512389A)

(43)【公表日】2012年5月31日

(86)【国際出願番号】GB2009002885

(87)【国際公開番号】WO2010070276

(87)【国際公開日】20100624

【審査請求日】2012年9月26日

(31)【優先権主張番号】0822836.3

(32)【優先日】2008年12月15日

(33)【優先権主張国】GB

(73)【特許権者】

【識別番号】511143379

【氏名又は名称】オックスフォード バイオメディカ （ユーケー） リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100062409

【弁理士】

【氏名又は名称】安村 高明

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】クレイトン， アレッド

【審査官】 草川 貴史

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００７−５２７００１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００６／１２５５８０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第８９／００７９４７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００８−５１２４８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５０３４９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１２−５０８５７７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５４５６３４（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

被験体から得られた尿サンプルにおける５Ｔ４陽性癌を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）該被験体由来の該サンプルにおけるエキソソームを同定する工程および／または該被験体由来の該サンプルからエキソソームを精製する工程：ならびに
（ｉｉ）エキソソームに結合した５Ｔ４を検出する工程
を包含する、方法。

【請求項2】

５Ｔ４ペプチド、５Ｔ４ポリペプチド、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドをコードする核酸を検出する工程を包含する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

尿生殖路の癌の検出のための、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前立腺癌の検出のための、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の方法であって、該方法はまた、１つまたはそれより多くの：
（ｉ）５Ｔ４に加えて、前記癌についてのバイオマーカー；および／または
（ｉｉ）エキソソームマーカー
の検出を包含する方法。

【請求項6】

１つまたはそれより多くの前立腺マーカーの検出を包含する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

ＰＳＡおよび／またはＰＳＭＡの検出を包含する、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

被験体から得られたサンプルにおける５Ｔ４の存在を、５Ｔ４陽性癌の指標とする方法であって、請求項１〜７のうちのいずれか１項に記載の検出方法を包含する方法。

【請求項9】

被験体における癌を処置するための組成物であって、該組成物は、５Ｔ４の認識に基づく治療剤を含み、
該被験体は、請求項８に記載の方法によって５Ｔ４陽性癌を有すると判定されている、組成物。

【請求項10】

被験体から得られたサンプルにおける５Ｔ４陽性癌の存在を、所定の被験体が５Ｔ４認識に基づく治療剤による処置に適しているかどうかの指標とする方法であって、該方法は、請求項１〜７のうちのいずれか１項に記載の方法を包含する方法。

【請求項11】

複数の時点で被験体から取得されたサンプルにおけるエキソソームに結合した５Ｔ４のレベルを５Ｔ４陽性癌の進行の指標とする方法であって、該方法は、請求項１〜７のうちのいずれか１項に記載の検出方法を包含し、エキソソームに結合した５Ｔ４のレベルの増加は、該５Ｔ４陽性癌の悪化を示し、エキソソームに結合した５Ｔ４のレベルの減少は、該５Ｔ４陽性癌の改善を示す方法。

【請求項12】

処置の間の５Ｔ４陽性癌の前記進行をモニタリングするための請求項１１に記載の方法であって、サンプルは処置の間の複数の時点で前記被験体から得られたサンプルである方法。

【請求項13】

請求項１〜８、および１０〜１２のうちのいずれか１項に記載の方法であって、５Ｔ４は、以下の方法：
（ｉ）抗５Ｔ４抗体への結合；
（ｉｉ）５Ｔ４ペプチドについて特異的なＴ細胞レセプターへの結合；
（ｉｉｉ）５Ｔ４をコードする核酸配列の全てまたは一部の相補体に対して高度の同一性を示す核酸配列への結合；および
（ｉｖ）５Ｔ４特異的プライマーを用いる５Ｔ４核酸の増幅
のうちの１つまたはそれより多くを用いて検出される、方法。

【請求項14】

請求項９に記載の組成物であって、５Ｔ４は、以下の方法：
（ｉ）抗５Ｔ４抗体への結合；
（ｉｉ）５Ｔ４ペプチドについて特異的なＴ細胞レセプターへの結合；
（ｉｉｉ）５Ｔ４をコードする核酸配列の全てまたは一部の相補体に対して高度の同一性を示す核酸配列への結合；および
（ｉｖ）５Ｔ４特異的プライマーを用いる５Ｔ４核酸の増幅
のうちの１つまたはそれより多くを用いて検出されたものである、組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、被験体における癌（特に、５Ｔ４陽性癌）を検出するための方法に関する。本発明はまた、癌の進行および／または処置を診断およびモニターするための、そのような方法の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

前立腺癌（ＰＣａ）は、相変わらず西半球で最も優勢な男性の癌であり、アメリカ合衆国で１８６，０００人と見積もられる新症例、および２８，０００人と見積もられる死亡者が２００８年に予想される（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ａｔｌａｎｔ、Ｇｅｏｒｇｉａ ２００８）。この疾患を引き起こす生物学を理解することに関して、およびその処置における多くの点で、進歩を遂げているが、ＰＣａの診断およびモニタリングのための、よりよいツールの必要性が残っている。

【0003】

本発明は、癌（例えば、前立腺癌、または膀胱癌）の検出についての新規のバイオマーカーを基礎とするアプローチに関する。そのアプローチは、早期の疾患検出のため、特定の療法に適する患者を同定するため、および療法／疾患の進行をモニタリングするための、非侵襲的な技術を提供する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

本発明者らは、驚くべきことに、癌関連バイオマーカー５Ｔ４が、癌患者由来のエキソソーム（例えば、尿エキソソーム）において発現され、かつ検出可能であることを見出している。

【0005】

５Ｔ４の発現は、正常細胞の中／上よりも、エキソソームの中／上で高いようである。

【0006】

従って、第一の局面において、本発明は、被験体における５Ｔ４陽性癌を検出するための方法を提供し、この方法は、以下の工程：
（ｉ）その被験体由来のサンプル中のエキソソームを同定する工程、および／またはその被験体由来のサンプルからエキソソームを精製する工程；および
（ｉｉ）エキソソームに結合した５Ｔ４を検出する工程
を包含する。

【0007】

上記方法は、例えば、５Ｔ４ペプチド、５Ｔ４ポリペプチド、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドをコードする核酸の検出を包含し得る。

【0008】

上記５Ｔ４陽性癌は、尿生殖路の癌（例えば、前立腺癌、または膀胱癌）であり得る。

【0009】

上記サンプルは、例えば、尿サンプル、血液サンプル、またはそれらに由来し得るサンプル（例えば、血清サンプル）であり得る。尿のエキソソームにおける５Ｔ４の検出には、尿のサンプルが非侵襲的に入手可能であるという利点がある。そのサンプルは、代わりに肺の胸水由来、または組織サンプル由来であり得る。

【0010】

その結果を立証するおよび／または定量するために、上記方法はまた、１つまたはそれより多くの：
（ｉ）５Ｔ４に加えて、上記癌についてのバイオマーカー；
（ｉｉ）エキソソームマーカー；および／または
（ｉｉｉ）特定の組織もしくは細胞型についてのマーカー
の検出を包含し得る。

【0011】

前立腺癌検出のために、例えば、上記方法は、１つまたはそれより多くの前立腺マーカー（例えば、ＰＳＡ、ＰＳＣＡおよび／またはＰＳＭＡ）の検出を包含し得る。

【0012】

第二の局面において、本発明は、被験体における所定の癌が５Ｔ４陽性癌かどうかを、本発明の第一の局面に従う検出方法を用いることにより決定するための方法を提供する。この方法において、５Ｔ４の検出により、上記癌は５Ｔ４陽性であることが確かめられる。

【0013】

第三の局面において、本発明は、被験体における癌を処置するための方法を提供し、この方法は、以下の工程：
（ｉ）本発明の第二の局面に従う方法により、上記癌が５Ｔ４陽性かどうかを決定する工程；および
（ｉｉ）工程（ｉ）から、陽性であると評価される被験体に対して、５Ｔ４ベースの治療剤を投与する工程
を包含する。

【0014】

第四の局面において、本発明は、所定の被験体が５Ｔ４ベースの治療剤による処置に適しているかどうかを決定するための方法を提供する。その方法は、本発明の第一の局面に従う方法により、被験体における５Ｔ４陽性癌を検出する工程を包含する。

【0015】

第五の局面において、本発明は、本発明の第一の局面に従う検出方法を用いて５Ｔ４陽性癌の進行をモニタリングするための方法を提供する。その方法は、複数の時点で被験体から取得されたサンプルにおけるエキソソームに結合した５Ｔ４のレベルを比較する工程を包含し、増加は、上記５Ｔ４陽性癌の悪化を示し、減少は、上記５Ｔ４陽性癌の改善を示す。

【0016】

本発明の第五の局面の方法は、処置の間の５Ｔ４陽性癌の進行をモニタリングするために使用され得る。その方法において、サンプルは処置の間の複数の時点で上記被験体から取得される。

【0017】

上記癌の処置は５Ｔ４の認識または発現に基づく治療剤の投与を包含し得る。

【0018】

第六の局面において、本発明は、被験体における５Ｔ４陽性癌を検出するためのキットを提供し、このキットは：
（ｉ）エキソソームの検出、収集および／または精製のシステム；ならびに
（ｉｉ）５Ｔ４についての検出システム
を包含する。

【0019】

上記検出システムは、例えば、５Ｔ４ペプチド、５Ｔ４ポリペプチド、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドをコードする核酸を検出し得る。上記検出システムはまた、５Ｔ４のレベルを定量し得る。

【0020】

本発明に関連して、５Ｔ４は、以下の方法：
（ｉ）抗５Ｔ４抗体への結合；
（ｉｉ）ＭＨＣ分子によって提示される５Ｔ４ペプチドについて特異的なＴ細胞レセプターへの結合；
（ｉｉｉ）５Ｔ４をコードする核酸配列の全てまたは一部の相補体に対して高度の同一性を示す核酸配列への結合；および
（ｉｖ）５Ｔ４特異的プライマーを用いる５Ｔ４核酸の増幅
のうちの１つまたはそれより多くを用いて検出され得る。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
被験体における５Ｔ４陽性癌を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）該被験体由来のサンプルにおけるエキソソームを同定する工程および／または該被験体由来のサンプルからエキソソームを精製する工程：ならびに
（ｉｉ）エキソソームに結合した５Ｔ４を検出する工程
を包含する、方法。
（項目２）
５Ｔ４ペプチド、５Ｔ４ポリペプチド、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドをコードする核酸を検出する工程を包含する、項目１に記載の方法。
（項目３）
尿生殖路の癌の検出のための、項目１〜２のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目４）
前立腺癌の検出のための、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記サンプルが尿サンプルである、項目１〜４のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記サンプルが血液サンプルであるかまたは血液サンプルに由来する、項目１〜４のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記サンプルが血清サンプルである、項目６に記載の方法。
（項目８）
項目１〜７のうちのいずれか１項に記載の方法であって、該方法はまた、１つまたはそれより多くの：
（ｉ）５Ｔ４に加えて、前記癌についてのバイオマーカー
（ｉｉ）エキソソームマーカー；および／または
（ｉｉｉ）特定の組織もしくは細胞型についてのマーカー
の検出を包含する方法。
（項目９）
１つまたはそれより多くの前立腺マーカーの検出を包含する、項目８に記載の方法。
（項目１０）
ＰＳＡおよび／またはＰＳＭＡの検出を包含する、項目９に記載の方法。
（項目１１）
被験体における所定の癌が５Ｔ４陽性癌かどうかを、項目１〜１０のうちのいずれか１項に記載の検出方法を用いることにより決定するための方法であって、５Ｔ４の検出により、該癌は５Ｔ４陽性であることが確かめられる方法。
（項目１２）
被験体における癌を処置するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）項目１１に記載の方法により、該癌が５Ｔ４陽性かどうかを決定する工程；および
（ｉｉ）工程（ｉ）から、陽性であると評価される被験体に対して、５Ｔ４ベースの治療剤を投与する工程
を包含する方法。
（項目１３）
所定の被験体が５Ｔ４ベースの治療剤による処置に適しているかどうかを決定するための方法であって、該方法は、項目１〜１０のうちのいずれか１項に記載の方法により、該被験体における５Ｔ４陽性癌を検出する工程を包含する方法。
（項目１４）
項目１〜１０のうちのいずれか１項に記載の検出方法を用いて５Ｔ４陽性癌の進行をモニタリングするための方法であって、該方法は、複数の時点で被験体から取得されたサンプルにおけるエキソソームに結合した５Ｔ４のレベルを比較する工程を包含し、増加は、該５Ｔ４陽性癌の悪化を示し、減少は、該５Ｔ４陽性癌の改善を示す方法。
（項目１５）
処置の間の５Ｔ４陽性癌の前記進行をモニタリングするための項目１４に記載の方法であって、サンプルは処置の間の複数の時点で前記被験体から取得される方法。
（項目１６）
前記処置が５Ｔ４ベースの治療剤の投与を包含する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
被験体における５Ｔ４陽性癌を検出するためのキットであって、該キットは：
（ｉ）エキソソームの検出、収集および／または精製のシステム；ならびに
（ｉｉ）５Ｔ４についての検出システム
を包含するキット。
（項目１８）
前記検出システムが５Ｔ４ペプチド、５Ｔ４ポリペプチド、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドをコードする核酸を検出する、項目１７に記載のキット。
（項目１９）
前記検出システムがまた、５Ｔ４のレベルを定量する、項目１７または１８に記載のキット。
（項目２０）
項目１〜１６のうちのいずれか１項に記載の方法、または項目１７〜１９のうちのいずれか１項に記載のキットであって、５Ｔ４は、以下の方法：
（ｉ）抗５Ｔ４抗体への結合；
（ｉｉ）５Ｔ４ペプチドについて特異的なＴ細胞レセプターへの結合；
（ｉｉｉ）５Ｔ４をコードする核酸配列の全てまたは一部の相補体に対して高度の同一性を示す核酸配列への結合；および
（ｉｖ）５Ｔ４特異的プライマーを用いる５Ｔ４核酸の増幅
のうちの１つまたはそれより多くを用いて検出される、方法またはキット。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】図１は、尿由来のエキソソームの精製である。健康なドナーの尿をエキソソーム精製に供し、それぞれの工程において１０μｌのサンプルを電気泳動分析（４％〜２０％勾配のポリアクリルアミドゲル、銀染色）（Ａ）のために取りおいた。これにより、最終エキソソーム産物における、主な非エキソソームタンパク質のバンド（例えば、約８０Ｋｄにおけるバンド）の効果的な除去、および多様なタンパク質種の顕著な濃縮が実証された（Ａ）。示されたように典型的なエキソソームタンパク質に対する抗体を用いて、並行ゲル（ｐａｒａｌｌｅｌ ｇｅｌ）が免疫ブロット法分析のために流された（Ｂ）。スクロースクッション法とＰｉｓｉｔｋｕｎらのより単純な方法との比較。細胞培養培地（Ｃ）または新鮮な尿（Ｄ）を１７，０００ｇで遠心分離に供し、その後、２００，０００ｇでペレットにした。（スクロース法からの）エキソソームおよび上記２００，０００ｇのペレットは、タンパク質差異について正規化し、示したようにマーカーについて２．５μｇ／ウェルをウエスタンブロットによって分析した。

【図2】図２は、健康なドナーおよび前立腺癌患者における尿由来のエキソソームの定量である。それぞれの調製物に存在するエキソソームの量をＢＣＡタンパク質アッセイを用いて測定した。尿標本の体積に対して値を補正した。その値を尿１ｍｌにつきｎｇのエキソソームとして表す。１０人の健康なドナーおよび標準的な治療を受けている１０人のＰＣａ患者から得た調製物をＡＤＴ_４（４週間のＡＤＴ後）、ＡＤＴ_１２（ＡＤＴの３ヵ月後）、ならびにＲＴ_２０（２０回分割分の放射線療法の後）で比較する。バーは、平均±標準誤差（ＳＥ）を表す。^＊Ｗｉｌｃｏｘｏｎマッチドペア検定を用いてｐ＜０．５を示す。

【図3】図３は、ＬＮＣａＰ（前立腺癌細胞系統）によって産生されるエキソソームの特徴付けである。示したように、前立腺癌細胞系統（ＬＮＣａＰおよびＤＵ１４５）を（続く分析のために）ポジティブコントロールの前立腺癌エキソソームの供給源として培養状態で維持した。全細胞溶解物（ＣＬ）またはエキソソーム（Ｅｘｏ）を、示したような一群の抗体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５μｇ／ウェル）によって分析した。

【図4】図４は、健康なドナーの尿由来のエキソソームの特徴付けである。（表３において詳述された）６人の健康なドナーは、尿標本を提供し、エキソソームが精製された。ウエスタンブロットを、５μｇの尿由来のエキソソーム／ウェルまたは５μｇのＬＮＣａＰ由来のエキソソーム（Ｅｘｏ）もしくは５μｇのＬＮＣａＰ全細胞溶解物（ＣＬ）で行った。示したように、ブロットを、ＰＳＡに対する抗体、ＴＳＧ１０１に対する抗体、５Ｔ４に対する抗体、ＣＤ９に対する抗体およびＧＡＰＤＨに対する抗体でプローブした。

【図5】図５は、ＰＣａ患者由来のエキソソームの特徴付けである。８人のＰＣａ患者から（ＡＤＴ_４、ＡＤＴ_１２またはＲＴ_２０において）、単離した尿のエキソソーム（５μｇ／ウェル）を、示したような一群の抗体を用いてウエスタンブロット分析に供した。ＬＮＣａＰの全細胞溶解物（ＣＬ）（５μｇ／ウェル）またはＬＮＣａＰのエキソソーム（Ｅｘｏ）（５μｇ／ウェル）を、ポジティブコントロールとしてそれぞれのゲル上に含んだ。

【図6】図６は、患者のウエスタンブロットデータの要約である。

【図7-1】図７は、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、および電子顕微鏡検査法を用いたＨＴ１３７６由来のエキソソームの特徴付けである。細胞溶解物（ＣＬ）（５μｇ／ウェル）またはエキソソーム溶解物（Ｅｘｏ）（５μｇ／ウェル）を、示したような一連の抗体を用いてウエスタンブロットにより比較した。これにより、エキソソームにおける数個のタンパク質について相対的な濃縮が実証された。いくつかのマーカー（例えば、ｇｐ９６）は、エキソソームに存在しなかった。これにより、これらの調製物についての、細胞残屑による混入が無視できるほどであったことが示された（これは３つの実験を表す）（Ａ）。ラテックスビーズに連結したエキソソームを、フローサイトメトリーによって分析した。これにより、そのエキソソーム表面におけるテトラスパニン分子の陽性発現が示された。メジアン蛍光強度の値（ＭＦＩ）を示す（５つより多くの実験を表す）（Ｂ）。ラテックスビーズに連結する前の漸増量のＦＢＳによる精製エキソソームの意図的な混入により、ＣＤ９についてのシグナル強度の減少が示される（平均±標準誤差、ｎ＝６、^＊＊ｐ＜０．００１、Ｔｕｋｅｙのポストテスト（Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｐｏｓｔ ｔｅｓｔ）による一元配置ＡＮＯＶＡ）（Ｂ 線グラフ）。細胞馴化培地から７０，０００ｇでペレットにされた物質をリニアなスクロース勾配（０．２Ｍ〜２．０２Ｍ）に重層し、２１０，０００ｇで１８時間、超遠心分離した。収集した画分を、屈折率測定法により分析して画分の密度を確かめ、その後、エキソソームマーカーであるＴＳＧ１０１に対する抗体を用いたウエスタンブロットにより分析した。ＴＳＧ１０１は、典型的なエキソソーム密度（１．１ｇ／ｍｌと１．２ｇ／ｍｌとの間）で浮遊する（４つの実験を表す）（Ｃ）。典型的なエキソソーム調製物の透過電子顕微鏡写真。これにより、直径３０ｎｍと１００ｎｍとの間の不均一な小胞が示される（Ｄ）。

【図7-2】図７は、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、および電子顕微鏡検査法を用いたＨＴ１３７６由来のエキソソームの特徴付けである。細胞溶解物（ＣＬ）（５μｇ／ウェル）またはエキソソーム溶解物（Ｅｘｏ）（５μｇ／ウェル）を、示したような一連の抗体を用いてウエスタンブロットにより比較した。これにより、エキソソームにおける数個のタンパク質について相対的な濃縮が実証された。いくつかのマーカー（例えば、ｇｐ９６）は、エキソソームに存在しなかった。これにより、これらの調製物についての、細胞残屑による混入が無視できるほどであったことが示された（これは３つの実験を表す）（Ａ）。ラテックスビーズに連結したエキソソームを、フローサイトメトリーによって分析した。これにより、そのエキソソーム表面におけるテトラスパニン分子の陽性発現が示された。メジアン蛍光強度の値（ＭＦＩ）を示す（５つより多くの実験を表す）（Ｂ）。ラテックスビーズに連結する前の漸増量のＦＢＳによる精製エキソソームの意図的な混入により、ＣＤ９についてのシグナル強度の減少が示される（平均±標準誤差、ｎ＝６、^＊＊ｐ＜０．００１、Ｔｕｋｅｙのポストテスト（Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｐｏｓｔ ｔｅｓｔ）による一元配置ＡＮＯＶＡ）（Ｂ 線グラフ）。細胞馴化培地から７０，０００ｇでペレットにされた物質をリニアなスクロース勾配（０．２Ｍ〜２．０２Ｍ）に重層し、２１０，０００ｇで１８時間、超遠心分離した。収集した画分を、屈折率測定法により分析して画分の密度を確かめ、その後、エキソソームマーカーであるＴＳＧ１０１に対する抗体を用いたウエスタンブロットにより分析した。ＴＳＧ１０１は、典型的なエキソソーム密度（１．１ｇ／ｍｌと１．２ｇ／ｍｌとの間）で浮遊する（４つの実験を表す）（Ｃ）。典型的なエキソソーム調製物の透過電子顕微鏡写真。これにより、直径３０ｎｍと１００ｎｍとの間の不均一な小胞が示される（Ｄ）。

【図8-1】図８は、ＥｘｏＣａｒｔａおよびＧｅｎｅＧＯ由来の遺伝子セットに対するナノＬＣ／ＭＳ由来のタンパク質同定物についてのオーバーリプレゼンテーション分析（Ｏｖｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）の要約である。Ｅｘｏｃａｒｔａ遺伝子セットとの比較を容易にするために、本発明者らのタンパク質リストを最初にＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ同定遺伝子リストへと変換した。この変換は、超幾何学分布を用いたＯＲＡに着手する前に行った。結果を分別して、ＭＳベースの研究のみとの比較、および１０個またはそれより多くの適合する遺伝子を報告している研究との比較を含むように分離した。これにより、本発明者らのＭＳデータが、特定された細胞型由来のエキソソームタンパク質プロフィールとどのくらい同等であるかが実証される。このデータは、−ｌｏｇ（ｐ値）と表示され、フォルスディテクションレート（ｆａｌｓｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ）について補正されている（Ａ）。ＭｅｔａＣｏｒｅを用いたＯＲＡ分析は、同定されたタンパク質リストについてＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ＩＤを利用した。明瞭にするために、本発明者らは、疾患バイオマーカー（Ｂ）、疾患（Ｃ）、生物学的プロセス（Ｄ）および細胞画分（Ｅ）という、項目群のそれぞれに含まれる上位１０位のオーバーリプレゼンテーションされた遺伝子を報告する。点線はｐ＝０．０５を示し、従って、これより左側の棒は、統計的に有意ではない。

【図8-2】図８は、ＥｘｏＣａｒｔａおよびＧｅｎｅＧＯ由来の遺伝子セットに対するナノＬＣ／ＭＳ由来のタンパク質同定物についてのオーバーリプレゼンテーション分析（Ｏｖｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）の要約である。Ｅｘｏｃａｒｔａ遺伝子セットとの比較を容易にするために、本発明者らのタンパク質リストを最初にＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ同定遺伝子リストへと変換した。この変換は、超幾何学分布を用いたＯＲＡに着手する前に行った。結果を分別して、ＭＳベースの研究のみとの比較、および１０個またはそれより多くの適合する遺伝子を報告している研究との比較を含むように分離した。これにより、本発明者らのＭＳデータが、特定された細胞型由来のエキソソームタンパク質プロフィールとどのくらい同等であるかが実証される。このデータは、−ｌｏｇ（ｐ値）と表示され、フォルスディテクションレート（ｆａｌｓｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ）について補正されている（Ａ）。ＭｅｔａＣｏｒｅを用いたＯＲＡ分析は、同定されたタンパク質リストについてＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ＩＤを利用した。明瞭にするために、本発明者らは、疾患バイオマーカー（Ｂ）、疾患（Ｃ）、生物学的プロセス（Ｄ）および細胞画分（Ｅ）という、項目群のそれぞれに含まれる上位１０位のオーバーリプレゼンテーションされた遺伝子を報告する。点線はｐ＝０．０５を示し、従って、これより左側の棒は、統計的に有意ではない。

【図9-1】図９は、ウエスタンブロットおよびフローサイトメトリー分析による、いくつかのＭＳにより同定したタンパク質の確認である。上記の標準的なスクロースクッション法により精製されたＨＴ１３７６エキソソーム（５μｇ／ウェル〜２０μｇ／ウェル）を、示したような一連のＭＳにより同定したタンパク質発現についてのウエスタンブロットにより分析した（Ａ）。ＨＴ１３７６細胞馴化培地から得られた７０，０００ｇのペレットを、リニアなスクロース勾配（０．２Ｍ〜２．５Ｍ）における遠心分離による分画に供した。全部で１５個の画分を収集し、その密度を屈折率測定法により測定した。その後、各画分の３分の１をラテックスビーズに連結し、引き続いて、示したように、エキソソーム表面の発現についてのフローサイトメトリー分析を行った（Ｂ）。並行して、各画分の残りの２／３を、示したようなタンパク質についてのウエスタンブロットに供した（Ｃ）。そのデータは、認識されているエキソソームの密度範囲（１．１２ｇ／ｍｌ〜１．２ｇ／ｍｌ）で浮遊するタンパク質を示す。（そのデータは、２つの実験を表す）。

【図9-2】図９は、ウエスタンブロットおよびフローサイトメトリー分析による、いくつかのＭＳにより同定したタンパク質の確認である。上記の標準的なスクロースクッション法により精製されたＨＴ１３７６エキソソーム（５μｇ／ウェル〜２０μｇ／ウェル）を、示したような一連のＭＳにより同定したタンパク質発現についてのウエスタンブロットにより分析した（Ａ）。ＨＴ１３７６細胞馴化培地から得られた７０，０００ｇのペレットを、リニアなスクロース勾配（０．２Ｍ〜２．５Ｍ）における遠心分離による分画に供した。全部で１５個の画分を収集し、その密度を屈折率測定法により測定した。その後、各画分の３分の１をラテックスビーズに連結し、引き続いて、示したように、エキソソーム表面の発現についてのフローサイトメトリー分析を行った（Ｂ）。並行して、各画分の残りの２／３を、示したようなタンパク質についてのウエスタンブロットに供した（Ｃ）。そのデータは、認識されているエキソソームの密度範囲（１．１２ｇ／ｍｌ〜１．２ｇ／ｍｌ）で浮遊するタンパク質を示す。（そのデータは、２つの実験を表す）。

【図9-3】図９は、ウエスタンブロットおよびフローサイトメトリー分析による、いくつかのＭＳにより同定したタンパク質の確認である。上記の標準的なスクロースクッション法により精製されたＨＴ１３７６エキソソーム（５μｇ／ウェル〜２０μｇ／ウェル）を、示したような一連のＭＳにより同定したタンパク質発現についてのウエスタンブロットにより分析した（Ａ）。ＨＴ１３７６細胞馴化培地から得られた７０，０００ｇのペレットを、リニアなスクロース勾配（０．２Ｍ〜２．５Ｍ）における遠心分離による分画に供した。全部で１５個の画分を収集し、その密度を屈折率測定法により測定した。その後、各画分の３分の１をラテックスビーズに連結し、引き続いて、示したように、エキソソーム表面の発現についてのフローサイトメトリー分析を行った（Ｂ）。並行して、各画分の残りの２／３を、示したようなタンパク質についてのウエスタンブロットに供した（Ｃ）。そのデータは、認識されているエキソソームの密度範囲（１．１２ｇ／ｍｌ〜１．２ｇ／ｍｌ）で浮遊するタンパク質を示す。（そのデータは、２つの実験を表す）。

【図10-1】図１０は、２次元電気泳動（２ＤＥ）およびＭＳを用いた、ＨＴ１３７６由来のエキソソームの分析である。ＨＴ１３７６エキソソーム由来のタンパク質抽出物を、ｐＨ３〜１０のリニアではない勾配における２次元電気泳動（２ＤＥ）により分離した。タンパク質を銀染色により可視化した（Ａ）。３２個のスポットをランダムに選び、ゲルプラグを切り出し、トリプシン消化後にペプチドを回収した。これらのうち、（Ａに示す）１７個のスポットについて、首尾よく同定物を得、そのＭＳ同定物の詳細を列挙した（Ｂ）。そのデータセットからの代表的なＭＳ／ＭＳ分析を（Ｃ）に示す。このペプチドはインテグリンα６、スポット１０由来である。上記ペプチドは、前駆体質量１１９１．９を有し、由来するペプチド配列を示すように、このペプチドに注釈を付ける。

【図10-2】図１０は、２次元電気泳動（２ＤＥ）およびＭＳを用いた、ＨＴ１３７６由来のエキソソームの分析である。ＨＴ１３７６エキソソーム由来のタンパク質抽出物を、ｐＨ３〜１０のリニアではない勾配における２次元電気泳動（２ＤＥ）により分離した。タンパク質を銀染色により可視化した（Ａ）。３２個のスポットをランダムに選び、ゲルプラグを切り出し、トリプシン消化後にペプチドを回収した。これらのうち、（Ａに示す）１７個のスポットについて、首尾よく同定物を得、そのＭＳ同定物の詳細を列挙した（Ｂ）。そのデータセットからの代表的なＭＳ／ＭＳ分析を（Ｃ）に示す。このペプチドはインテグリンα６、スポット１０由来である。上記ペプチドは、前駆体質量１１９１．９を有し、由来するペプチド配列を示すように、このペプチドに注釈を付ける。

【図11】図１１Ａおよび図１１Ｂは、エキソソームが表面５Ｔ４を発現し、これがマイクロプレートアッセイにより検出されたことを示す。

【発明を実施するための形態】

【0022】

本発明は、被験体における５Ｔ４陽性癌を検出するための方法に関する。

【0023】

５Ｔ４は、広く癌腫において発現される７２ｋＤａの膜貫通糖タンパク質であるが、正常な成人組織において高度に限定された発現パターンを有する（表１を参照のこと）。結腸直腸癌および胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）における転移に強く相関関係があるようである。ヒト５Ｔ４の完全核酸配列が、公知である（Ｍｙｅｒｓら、１９９４ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １６９：９３１９−２４）。

【0024】

【表1】

５Ｔ４の発現は、多くの癌に関連している。その癌としては、中皮腫、腎癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、肝癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌、膵癌、膀胱癌、子宮内膜癌、脳癌および食道癌が挙げられるが、これらに限定されない。

【0025】

本発明に関連して、「５Ｔ４陽性」癌は５Ｔ４の発現に関連する癌である：「５Ｔ４陽性」癌は５Ｔ４が腫瘍関連抗原である癌である。

【0026】

５Ｔ４の過剰発現は、高い転移の可能性およびより悪い予後を有する癌と特に関連があるので、本発明の検出方法はまた、予後判定指標として使用され得る。

【0027】

（エキソソーム）
エキソソームは、いくらかの体液（例えば、血清および尿）中に見出されるナノメートルサイズ（４０ｎｍ〜１００ｎｍ）の小胞である。エキソソームは、細胞における多小胞体（ＭＶＢ）の内部小胞として生じる。それらは、循環している血球（例えば、赤血球およびリンパ球）の生成物として最初に記載された。腎臓において、エキソソームはＭＶＢの外膜と頂端側の形質膜との融合によって尿に放出される。

【0028】

タンデム質量分析法を用いた尿のエキソソームのプロテオーム解析は、尿腔に面している各細胞型由来の膜タンパク質を示した。さらに、エキソソームの内腔は、その起源となる細胞由来の細胞質ゾルのタンパク質およびｍＲＮＡを含み、これらはエキソソームがＭＶＢにおいて形成される場合に伴われる。

【0029】

エキソソームは、エキソソームによるエキソソームマーカー（例えば、腫瘍感受性遺伝子（ＴＳＧ１０１）、アクアポリン−２（ＡＱＰ２）、ニューロン特異性エノラーゼ（ＮＥＳ）、アネキシンＶ、ポドカリキシン（ＰＯＤＸＬ）およびＣＤ９）の発現に基づき、検出および／または精製され得る。

【0030】

（エキソソームの単離）
エキソソームは、当該分野において公知の方法（例えば、超遠心分離（Ｐｉｓｉｔｋｕｎら（２００４）ＰＮＡＳ １０１：１３３６８−１３３７３）または限外濾過（Ｃｈｅｒｕｖａｎｋｙら（２００７）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９２：Ｆ１６５７−Ｆ１６６１））により単離または精製され得る。連続フロー電気泳動およびクロマトグラフィーの手順を包含する方法もまた知られており、この手順は、遠心分離（ＴａｙｌｏｒおよびＧｅｒｃｅｌ−Ｔａｙｌｏｒ（２００５）Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ９２：３０５−３１１）に先行し得る。クロスフロー限外濾過はまた、エキソソーム精製方法（Ｌａｍｐａｒｓｋｉら（２００２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２７０：２１１−２２６）の部分として使用され得る。

【0031】

エキソソームを単離または精製せずにそのエキソソームを同定すること（従って、エキソソームに結合した５Ｔ４を検出すること）により本発明の方法を行うこともまた可能である。例えば、エキソソームが（例えば、免疫親和性捕捉により）マイクロプレート上へ捕捉され得、その後、５Ｔ４の検出が続き得る。

【0032】

流体相におけるエキソソームに結合した５Ｔ４を（例えば、エキソソームおよび／または５Ｔ４に対する抗体を用いて、エキソソームおよび５Ｔ４の両方または２色の免疫蛍光を検出することが可能な、二機能性の分子を用いることにより）検出することもまた可能である。

【0033】

（５Ｔ４の検出方法）
本発明の検出方法は、５Ｔ４ペプチド、５Ｔ４ポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードする核酸の検出を包含し得る。

【0034】

本明細書中で用いられる場合、用語「ポリペプチド」とは、ポリマーを指し、このポリマーにおいて、そのモノマーは、アミノ酸であり、かつペプチド結合またはジスルフィド結合を介して共につながっている。「ポリペプチド」とは、天然に存在する全長アミノ酸鎖またはそのフラグメント（例えば、結合相互作用について関心がある、そのポリペプチドの選択された領域）を指す。５Ｔ４のフラグメントを含むポリペプチドは、長さが少なくとも１００アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸または少なくとも４００アミノ酸であり得る。全長のヒト５Ｔ４は、長さが４２０アミノ酸である。

【0035】

従って、「ペプチド」とは、全長５Ｔ４の部分またはフラグメントであるアミノ酸配列を指し、長さが約８アミノ酸と約１００アミノ酸との間であり得る。

【0036】

上記ペプチドは、５Ｔ４のＴ細胞エピトープであっても、または５Ｔ４のＴ細胞エピトープを含んでもよい。

【0037】

Ｔ細胞エピトープは、タンパク質抗原に由来する短いペプチドである。抗原提示細胞は、抗原を内在化し得、それを短いフラグメントへと処理し得る。そのフラグメントは、ＭＨＣ分子に結合することが可能である。ＭＨＣに結合するペプチドの特異性は、そのペプチドと特定のＭＨＣ分子のペプチド結合溝との間の特異的な相互作用に依存する。

【0038】

ＭＨＣクラスＩ分子に結合する（かつＣＤ８＋Ｔ細胞により認識される）ペプチドは、通常、長さが、６アミノ酸と１５アミノ酸との間（例えば、８アミノ酸と１２アミノ酸との間）である。ペプチドのアミノ末端のアミン基は、そのペプチドの溝の一方の端で一定の部位と接触し、カルボキシル末端にあるカルボキシレート基は、その溝のもう一方の端で一定の部位と結合する。そのペプチドは、伸ばされたコンフォメーションで溝に沿って位置し、主鎖の原子と、溝に沿って並ぶ保存されたアミノ酸側鎖との間でのさらなる接触を伴う。ペプチドの長さのばらつきは、そのペプチドの骨格における（しばしば、プロリン残基またはグリシン残基での）よじれにより適合する。

【0039】

ＷＯ０３／０６８８１６号は、５Ｔ４の種々のＭＨＣクラスＩエピトープ（ＰＬＡＤＬＳＰＦＡ、ＬＨＬＥＤＮＡＬＫＶ、ＬＥＤＮＡＬＫＶＬＨ、ＨＬＥＤＮＡＬＫＶ、ＬＥＤＮＥＬＫＶＬおよびＬＡＤＮＡＬＫＶが挙げられる）を記載する。

【0040】

ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドは、通常、長さが、少なくとも１０アミノ酸（例えば、１０アミノ酸と５０アミノ酸との間、１０アミノ酸と３０アミノ酸との間、または１５アミノ酸と２５アミノ酸との間）である。これらのペプチドは、両方の端で開いているＭＨＣＩＩペプチド結合溝に沿って、伸ばされたコンフォメーションで位置する。そのペプチドは、主に、主鎖の原子と、ペプチド結合溝に並ぶ保存された残基との接触により、適所に保持される。

【0041】

ＷＯ０３／０６８８１５号は、５Ｔ４の種々のＭＨＣクラスＩＩエピトープ（ＹＲＹＥＩＮＡＤＰＲＬＴＮＬＳＳＮＳＳＤＶおよびＱＴＳＹＶＦＬＧＩＶＬＡＬＩＧＡＩＦＬＬが挙げられる）を記載する。ＷＯ２００６／１２０４７３号およびＷＯ２００８／０５９２５２号は、５Ｔ４のさらなるペプチドエピトープを記載する。

【0042】

ヒト５Ｔ４は、Ｍｙｅｒｓら（上記のような）により特徴付けられた通りであり、その配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号Ｚ２９０８３に存在する。獣医学への適用のために、適切なホモログもまた考慮される。イヌおよびネコの５Ｔ４の配列が、ＷＯ０１／３６４８６号およびＷＯ０２／３８６１２号において記載されている。

【0043】

本発明の方法を用いて検出可能な５Ｔ４ペプチドは、抗体結合部位を含み得る。Ｍｙｅｒｓら（上記のような）は、５Ｔ４コアタンパク質に結合するマウスポリクローナル抗５Ｔ４抗血清を記載する。

【0044】

５Ｔ４ポリペプチドまたは５Ｔ４ペプチドは、当該分野において公知の方法のいずれかを用いて検出され得、その方法としては、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ分析、免疫沈降、インサイチュハイブリダイゼーションおよび質量分析法が挙げられる。

【0045】

抗５Ｔ４抗体が、当該分野において公知である。Ｍｙｅｒｓら（（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９３１９−９３２４）は、マウスポリクローナル抗５Ｔ４抗血清を記載する。もっと最近には、抗５Ｔ４抗体Ｈ８が記載されている（Ｂｏｇｈａｅｒｔら（２００８）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．３２：２２１−２３４）。

【0046】

５Ｔ４の検出に関連する用語「抗体」とは、機能的な抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆｖ、ｓｃＦｖおよびドメイン抗体（ｄＡｂ）、ならびにそれらの融合体および模倣体（例えば、アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）、ダルピン（ＤＡＲＰｉｎ）、アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）およびバーサボディ（Ｖｅｒｓａｂｏｄｙ））を包含する。

【0047】

ＷＯ０３／０２０７６３号およびＷＯ９９／１８１２９号は、可溶性Ｔ細胞レセプターの形式の設計および生産を概説し、その形式は、５Ｔ４の検出に適している。

【0048】

本明細書中で用いられる場合、用語「核酸」とは、ヌクレオチド配列を指し、この配列は、一本鎖または二本鎖の、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。この配列は、５Ｔ４ペプチドもしくは５Ｔ４ポリペプチドをコードすることが可能であるか、または５Ｔ４ペプチドもしくは５Ｔ４ポリペプチドをコードすることが可能な配列に相補的である。

【0049】

以前に記載されたノーザン分析は、２．５ｋｂのｍＲＮＡが５Ｔ４の発現に関連することを実証している。

【0050】

５Ｔ４ポリペプチドをコードする核酸配列は、１２６０塩基区間であっても、または１２６０塩基区間を含んでもよく、全長のタンパク質をコードすることが可能であり得る。５Ｔ４のフラグメントをコードする核酸配列は、３００塩基と１２００塩基との間（例えば、５００塩基と１０００塩基との間）であり得る。５Ｔ４のペプチドをコードする核酸配列は、長さが、２４塩基と５００塩基との間（例えば、５０塩基と３００塩基との間）であり得る。５Ｔ４ヌクレオチド配列の増幅のためのプライマーは、以前に記載されている（上記のようなＭｙｅｒｓら（１９９４））。

【0051】

５Ｔ４ヌクレオチド配列を検出するためのプローブが使用され得、そのプローブは、上記配列の相補体に対して高度の相同性を示す。適切なプローブは、ヌクレオチド配列を有する一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであり得、その配列は、１０個と５０個との間の連続する塩基（例えば、１５個と３０個との間の連続する塩基および／または少なくとも約２０個の連続する塩基）を含み、その連続する塩基は、５Ｔ４コード配列の同数またはそれより多数の連続する塩基と同一（または、その相補体）である。プローブとして選択される核酸配列は、偽陽性結果が最小限に抑えられるのに十分な長さかつ十分に確かであるべきである。偽陽性を最小限に抑えるために、そのプローブは、概ね５Ｔ４に特有の配列の部分に基づき得る（すなわち、他のどの配列に対しても高度の同一性を示さない）。

【0052】

核酸プローブは、ハイブリダイゼーションの際の即座の検出のために標識され得る。例えば、そのプローブは、放射性同位元素標識され得る。ＤＮＡフラグメントを標識する好ましい方法は、当該分野において周知のように、α３２Ｐ ｄＡＴＰを、ランダムなプライマー反応においてＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントを用いて組み込むことによる。オリゴヌクレオチドは、通常、γ３２Ｐ標識ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼを用いて末端が標識される。しかしながら、他の（例えば、非放射性の）方法もまた、上記フラグメントまたはオリゴヌクレオチドを標識するために使用され得る。その方法としては、例えば、酵素標識、適切なフルオロフォアを用いた蛍光標識およびビオチン化が挙げられる。

【0053】

５Ｔ４核酸は、当該分野において公知の方法のいずれかを用いて検出され得、その方法としては、ノーザンブロット、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および定量ＰＣＲが挙げられる。ＷＯ０２／１８６４５号は、５Ｔ４ＲＮＡの検出のための種々の方法を記載する。その方法は、逆転写ＰＣＲによるインビトロ増幅、リガーゼ連鎖反応、ＤＮＡシグナル増幅、増幅可能なＲＮＡレポーター、Ｑ−β複製、転写ベースの増幅、等温性の核酸配列ベースの増幅、自己持続配列複製アッセイ、ブーメランＤＮＡ増幅、鎖置換活性、サイクリングプローブ技術）、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、従来の酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）などの後に、特定の標識プローブを用いた核酸ハイブリダイゼーション、サザンブロット分析、ノーザンブロット分析、電気化学発光、レーザー励起蛍光、逆ドットブロット検出および高性能液体クロマトグラフィーなどの方法による検出へと続く方法を含む。

【0054】

ウエスタンブロットを用いる場合、エキソソームの５Ｔ４発現は、健康な個体において検出されていない。他の検出方法は、微量の５Ｔ４を検出することが可能であり得る。エキソソームの５Ｔ４の発現は、５Ｔ４関連癌を有する個体において、健康な個体においてよりも１０倍、５０倍、１００倍、５００倍または１０００倍大きいものであり得る。

【0055】

本発明の方法は、被験体におけるエキソソームの５Ｔ４を健康な個体から取得された同等のサンプルと比較する工程を包含し得る。これは、得られた値をそのサンプル中でのエキソソームの数を用いて正規化することを包含し得る。

【0056】

５Ｔ４の他に、その検出方法は、１つまたはそれより多くの他のバイオマーカーの検出を包含し得る。

【0057】

これらのさらなるバイオマーカーは、例えば、癌（またはその特定の型）、エキソソーム、または特定の組織もしくは細胞型に特徴的であり得る。

【0058】

（５Ｔ４の発現または認識に基づく治療剤）
５Ｔ４の認識に基づく種々の治療剤が、記載されてきた（例えば、カリケアマイシンと抗５Ｔ４抗体との結合体（上記のようなＢｏｇｈａｅｒｔら（２００８））、および５Ｔ４を認識するＦａｂとスーパー抗原ブドウ球菌エンテロトキシンＡとの融合体（Ｓｈａｗら（２００７）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２６：５６７−５７４）の使用）。

【0059】

被験体における５Ｔ４の発現を誘導および／または増加することにより、癌治療において有用な免疫応答を刺激することもまた可能である。

【0060】

（被験体）
本発明の第一の局面の方法において、サンプルが取得された被験体は、哺乳動物被験体（例えば、ヒト）であり得る。

【0061】

その被験体は、妊娠していない哺乳動物であり得る。妊娠の間に、胎盤のエキソソームは、母体循環において見出され得、そのエキソソームは５Ｔ４を発現し得る（Ｔａｙｌｏｒら（２００６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７６：１５３４−１５４２）。従って、その腫瘍検出方法の複雑化を避けるために、妊娠している哺乳動物にとって、その検出システムから胎盤のエキソソームを取り除くことが必要であり得る。そのような除去は、物理的であっても、または概念的であってもよく、その除去により、胎盤のエキソソームは、例えば、胎盤マーカーを用いた陰性選択または別の組織（例えば、５Ｔ４ベースの癌に関連する可能性のある組織）に関連するマーカーを用いた陽性選択によって、その検出プロセスから度外視される。

【0062】

（キット）
本発明の第六の局面は、被験体における５Ｔ４陽性癌を検出するためのキットを提供し、このキットは、
（ｉ）エキソソームの検出、収集および／または精製のシステム；ならびに
（ｉｉ）５Ｔ４についての検出システム
を包含する。

【0063】

上記エキソソームの検出、収集および／または精製のシステムは、上記に言及された公知の超遠心分離または限外濾過のシステムとの使用に適し得る。あるいは、上記エキソソーム検出システムは、エキソソームの捕捉に適した基材（例えば、エキソソームマーカーに対する抗体でコートされたマイクロタイタープレート）であり得る。

【0064】

上記検出システムは、上記に言及された方法のうちのいずれか１つによる、５Ｔ４ペプチド、５Ｔ４ポリペプチドまたは５Ｔ４核酸の検出に適し得る。上記検出システムは、抗５Ｔ４抗体を包み得る。

【0065】

そのキットはまた、上記エキソソームの検出、収集もしくは精製のシステム、および／または上記５Ｔ４検出システムを用いるための指示書を含み得る。

【0066】

本発明は、次に、実施例としてさらに記載され、この実施例は、本発明を実施する際に当業者を助けるために役立つものであり、どんな様式においても本発明の範囲を限定することを意図されない。

【実施例】

【0067】

（実施例１−尿のエキソソームの精製）
標準化された方法を、使用し、細胞培養物の上清からのエキソソーム精製のために設計し、そしてエキソソーム供給源としての新鮮な尿に適用した。この方法を用いて、エキソソームをその浮力特性に基づいて単離する（Ｒａｐｏｓｏら（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：１１６１−１１７２）。精製を通しての複数の工程における、尿のタンパク質含有量の分析により、この方法は、主な非エキソソーム混入物を除去し（図１ａ）、（例えば、８０Ｋｄにおけるバンド）、他方、分子量スペクトル全体にわたって別個のタンパク質レパートリーを有する小胞を顕著に濃縮するのにこの方法が効果的であることが、示された（図１ａ）。並行ゲル（ｐａｒａｌｌｅｌ ｇｅｌ）上で免疫ブロット法分析を行うことにより、エキソソームの典型的なタンパク質が最終エキソソーム産物においてのみ検出されることが示された（図１ｂ）。

【0068】

この方法をまた、細胞培養物の上清（図１ｃ）または健康なドナーの尿（図１ｄ）を供給源物質として用いて、Ｐｉｓｉｔｋｕｎら（（２００４）ＰＮＡＳ １０１：１３３６９−１３３７３）の方法と直接比較した。後者のこの方法は、１７，０００ｇで残屑をペレットにすること、その後、上清を２００，０００ｇで回転してエキソソームをペレットにすることを含む。本発明者らのスクロース法は、エキソソームがより濃縮されたペレットを生じる。このことは、ＣＤ９、ＴＳＧ１０１およびＬＡＭＰ−１などのエキソソームマーカーについての強いバンド強度によって明白である。重要なことには、このスクロース法は、腫瘍関連抗原（この場合は５Ｔ４）の良好な濃縮を生じた（図１ｃ）。このことは、ペレットにした沈殿物に対するエキソソームの分析における重要な利点を示した。多くのマーカーが上記の比較対象（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）調製法において検出されたが、これらは、より低いレベルであった。カルネキシン（エキソソームにおいて発現されないマーカー）についてのより強いバンドは、上記の比較対象（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）方法を用いた場合の、より多い非エキソソーム混入物を直接実証するものである（図１ｃ）。上記のスクロース−クッション法を用いることの同様の利点が、供給源物質として新鮮尿を用いて（図１ｄ）、より高いレベルの、エキソソームにより発現されるタンパク質群と、タム・ホースフォール（Ｈｏｒｆｓａｌｌ）タンパク質（ＴＨＰ）の混入の減少とが示されたことにより、明白であった。このデータは、新鮮な尿標本からエキソソームを濃縮するためのこのアプローチを支持する；そしてこのアプローチは、以前に公開された尿−エキソソームプロトコールを超えるいくつかの利点を与える。

【0069】

（実施例２−ＰＣａ療法の間の尿エキソソーム量における変化）
それぞれの調製物に存在するエキソソームの量を測定し、開始時の尿体積に対する補正を行った。健康なドナー群および患者群の間で比較した値を図２に示す。前立腺癌患者は（ＡＤＴ_４において）、健康な男性と比較して平均で１．２倍の高さのレベルの尿エキソソームを有した（図２Ａ）。エキソソーム含有量において、健康なドナー（３６６．８±９２．５６、ｎ＝１０ 平均±標準誤差（ＳＥ））および患者（４４３．２±１０９．７、ｎ＝１０、ＡＤＴ_４）の両方の間で、広いばらつきがあった。従って、この差は、有意には達しなかった。エキソソームレベルを、３ヶ月間のアンドロゲン除去療法（ａｎｄｒｏｇｅｎ ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）の後（ＡＤＴ_１２）（２２４．９±８２．７、ｎ＝１０）、そして２０回分割分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）の放射線療法（ＲＴ_２０）（４９９．６±２２５．６、ｎ＝９）の後にもまた測定した。１２週間のホルモンに対する処置の後、エキソソームの平均のレベルは半分に減少し、１０人中８人の患者が尿のエキソソーム量の減少を示した。放射線処置に関しては、ＡＤＴ_４またはＡＤＴ_１２と比較して有意差はなかった。これは、９人中３人の患者がエキソソームレベルのさらなる減少を実証し、他方、９人中６人が増加した尿のエキソソームレベルを有したからである。血清のＰＳＡレベルを前立腺癌の転帰についての代用マーカー（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｍａｒｋｅｒ）として用いることによって、１０人中９人の患者において、ＡＤＴおよびＲＴの上記標準的な治療によって腫瘍の体積の減少に成功したことが示された。

【0070】

結論として、局所的に進行したＰＣａと、尿中に存在するエキソソームの量との間に相関関係を実証し得ず、そして血清のＰＳＡと、尿のエキソソームレベルとの間に相関関係はない。しかしながら、上記データセットから、ＡＤＴ_１２において、存在するエキソソーム量の減少が存在するという示唆がいくらか存在する。

【0071】

（実施例３−前立腺癌細胞系統は、前立腺関連抗原および癌関連抗原について陽性である、典型的なエキソソームを産生する）
２つの十分に特徴付けされた前立腺癌細胞系統をＰＣａのエキソソームの供給源として培養状態で維持し、そして典型的なエキソソームマーカー（例えば、テトラスパニン（ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ）ＣＤ９）およびいくつかの公知の前立腺マーカー（ＰＳＡおよびＰＳＭＡ）の発現を試験した。ＬＮＣａＰ細胞（全細胞溶解物）をＬＮＣａＰのエキソソームと、免疫ブロット法により直接比較した。これによって、ＰＳＡおよびＰＳＭＡの、エキソソームによる発現が陽性であることが示された。ＬＮＣａＰエキソソームによる、５Ｔ４のエキソソームによる発現もまた、明らかな陽性であった。ＰＳＡおよび５Ｔ４の両方は、上記の親細胞と比較して、エキソソームにおいて特に濃縮されていた（図３Ａ）。ＰＳＡもＰＳＭＡも発現しないＤＵ１４５細胞系統を、特異的な染色を実証する対照として役立たせた。ＧＡＰＤＨについて染色すると、ウェル群の等しい充填が示された。ＰＣａ細胞から単離されたエキソソームは、他の細胞供給源由来のエキソソームに典型的な分子を、前立腺マーカーおよび（複数の）腫瘍関連抗原とともに発現すると結論付けられた。それゆえに、単純なこの免疫ブロット法のパネルは、以下の研究における尿のエキソソームの分析に適切である考えられた。

【0072】

（実施例４−健康なドナーの尿のエキソソームの表現型）
健康なドナー（ＨＤ）由来の尿のエキソソームについて類似の分析を行い、そして、これらの分子についての発現レベルをＬＮＣａＰ由来のエキソソームの発現レベルと比較した。ＬＮＣａＰ標準物と比較して低いレベルではあったが、ＴＳＧ１０１およびＣＤ９などのマーカーが、ウエスタンブロットによってほとんどのＨＤ標本において検出された。前立腺マーカー（ＰＳＡおよびＰＳＭＡ）は、ドナーの年齢とは関係なく、どの健康なドナーの標本においても発現されていなかった。このことは、健康なドナーの尿中のエキソソームは、もしあるとしてもほとんど前立腺から生じないことを示している。腫瘍抗原である５Ｔ４は、上記ＨＤ標本のどれにおいても見つからなかった（図４）。

【0073】

結論として、異なるドナーから得られた尿エキソソームをこの方法によって試験することによって、上記サンプル群の間でエキソソームの質におけるばらつきが示される。エキソソームの質が中程度であった／良好であった（すなわち、ＬＮＣａＰのエキソソームに匹敵した）場合、健康なドナーの尿エキソソームはＰＳＡ、ＰＳＭＡ、および５Ｔ４について陰性であることが確証され得た。

【0074】

（実施例５−ＰＣａ患者の尿のエキソソームの表現型、および処置に伴う変化の評価）
ＰＣａ患者由来のエキソソームを、類似の方法でウエスタンブロットによって試験した。８人の個々の患者からのデータを示す（図５）。全体としては、サンプルシリーズの間で（複数のマーカーについての）バンドの強度が変動し、ほとんどの場合において、ＬＮＣａＰエキソソームと比べて弱い染色であった。弱かったが、２４サンプルのうち２０サンプルにおいて、エキソソームマーカーについての陽性の証拠（例えば、ＣＤ９）が存在した。上記患者コホートの間でのばらつき、および個体のサンプルシリーズ（ＡＤＴ_４、ＡＤＴ_１２、およびＲＴ_２０）の範囲内でのばらつきが存在した。１ウェルにつき５μｇのサンプルを充填することに対して大きな注意を払ったので、本発明者らは、上記結果が、サンプルの充填についての技術的問題よりむしろ、そのサンプルの可変的なエキソソームの含有量を反映している可能性が高いと考える。

【0075】

前立腺が尿のエキソソームプール全体にいくらかでもエキソソームを与え得ることは、以前には公知でなかった。健康なドナーにおいて、前立腺マーカーであるＰＳＡまたはＰＳＭＡについて陽性の染色は全く存在せず、そして腫瘍マーカーである５Ｔ４もまた陰性であった。上記患者コホートにおいて、ＰＳＡは２０個中８個の標本において明白であり、そしてＰＳＭＡは２０個中９個の標本において存在した（ここで、２４個中２０個の標本が、１つまたはそれより多いエキソソームマーカーについて陽性であった；すなわち、エキソソーム−陽性として評価し得た）。５Ｔ４についての染色は、２０個中１４個のサンプルにおいて陽性を示した。総合して、このことは、尿のエキソソームによる、前立腺関連マーカーおよび癌関連マーカーの発現を初めて実証する。

【0076】

１人の特定の患者（ｐ８）は、上記３つの時点のそれぞれにおける同等のエキソソームの存在、および治療に応じてのエキソソームのＰＳＡの明瞭な減少を示した。このことは、ＡＤＴ_４におけるＰＳＡについての強いバンドが処置に伴って減少し、ＲＴ_２０において検出することができなくなったことを示している。しかしながら、思いがけなく、５Ｔ４は、２０回分割分の放射線療法の後でさえ強く発現されたままであった。このことは、これが、アンドロゲン除去または放射線療法の効果に応じて治りにくい、残存の悪性の細胞の存在を評価するための候補マーカーであり得ることを示唆している。データを図６において要約する。

【0077】

（実施例１から実施例５のための材料および方法）
（前立腺癌患者および健康なドナー）
実地で第２相臨床試験に参加した１０人のＰＣａ患者を、１０人の健康な男性ボランティアと一緒に勧誘した。これらの患者は、生体組織検査によってＰＣａについて陽性であると確認された。そして腫瘍の病期、グリソンスコア、血清ＰＳＡ、および年齢を表２において要約する。患者に、根治的放射線療法（ＲＴ）の前に３−６ヶ月の術前補助アンドロゲン除去療法（ＡＤＴ）を受けさせた。このＲＴは、前立腺に５５Ｇｙを２０分割にして送達し、そして骨盤の節（ｎｏｄｅ）に４４Ｇｙを２０分割にして送達する、単一の段階からなった。患者に臨床の必要性に応じて補助ＡＤＴを継続させた。上記試験は、Ｓｏｕｔｈ Ｅａｓｔ Ｗａｌｅｓ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。そして、インフォームド・コンセントを、本研究に参加する患者およびボランティアから得た。

【0078】

健康なドナーから収集された尿標本の詳細を表３において提供する。

【0079】

【表2】

【0080】

【表3】

（尿サンプルの収集）
２００ｍｌの体積までの尿標本を、無菌のプラスチック容器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の中に収集し、３０分以内に処理するために研究室に持っていった。サンプルを午前の真中から終わりごろに収集した。これらは朝一番の尿ではなかった。尿を血液、タンパク質、グルコース、およびケトンについて試験し、そしてｐＨを測定した；（Ｃｏｍｂｕｒ^５ Ｔｅｓｔ（登録商標）Ｄ、ディップスティック（Ｒｏｃｈｅ）による）。この結果を表４において示す。ＰＣａ患者の尿を以下の３つの時点において収集した：「ＡＤＴ_４」（ＡＤＴの開始後０〜４週間）、「ＡＤＴ_１２」（ＡＤＴの３ヶ月後）、および「ＲＴ_２０」（２０回分割分の放射線療法の後）。処置（ＡＤＴ_４、ＡＤＴ_１２、および放射線療法後の４週間目）の間、間隔を空けて、血清ＰＳＡレベルを測定した。

【0081】

【表4】

（エキソソームの精製）
新鮮な尿を連続的な遠心分離に供し、細胞を除去し（３００ｇ、１０分間）、非細胞残屑を除去した（例えば、円柱（ｃａｓｔ）、結晶、膜断片など）（２０００ｇ、１５分間、目に見えるペレットが全く存在しなくなるまで反復した）。その次に、３０％のスクロース／Ｄ２Ｏクッションを上清の下に置き、１００，０００ｇで２時間、超遠心分離に供した（ＳＷ３２ローター、Ｏｐｔｉｍａ ＬＥ８０Ｋ超遠心分離機、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）。上記クッションを収集し、少なくとも７倍容量のＰＢＳ中に希釈し、そしてエキソソームを、７０Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた２時間の１００，０００ｇでのさらなる超遠心分離工程によって、ペレットにした。エキソソームのペレットを１００μｌ〜１５０μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、そして−８０℃で凍結した。それぞれのペレット中に存在するエキソソームの量を微量ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって決定した。

【0082】

（細胞培養）
ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞系統およびＤＵ１４５前立腺癌細胞系統（ＡＴＣＣから得た）をバイオリアクターフラスコ（Ｉｎｔｅｇｒａから得た）の中に播き、そしてエキソソーム産生のために高密度培養で維持した。このバイオリアクターフラスコに、７日毎に、上記のようなエキソソーム精製のために保たれた馴化培地を供給した。

【0083】

（電気泳動および免疫ブロット法）
細胞溶解物を免疫ブロット法によってエキソソームと比較した。手短に言えば、等しい量のタンパク質（１ウェルにつき５μｇ）を、６Ｍ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２％ＳＤＳ、および０．００２％ｗ／ｖブロモフェノールブルーを３０％容量添加することによって可溶化した。サンプルを１０％のポリアクリルアミドゲルに通して電気泳動し、そしてポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜へと転写し、この膜を、ＰＢＳ中の３％ｗ／ｖの無脂肪乳、０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）の中で一晩ブロックした。一次抗体を、ＰＢＳ−Ｔ中での５回の洗浄の後、１時間インキュベートし、そしてＳａｎｔａ Ｃｒｕｚからのヤギ抗マウス−Ｉｇ−ＨＲＰ複合体を（１：３５，０００希釈で）３０分間添加した。ＰＢＳ−Ｔ中での５回の洗浄の後、バンドをＥＣＬ＋システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ／ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて検出した。一次モノクローナル抗体は、マウス抗ヒトＰＳＡ（Ａｔｉｌｌａ Ｔｕｒｋｅｓ博士（Ｃａｒｄｉｆｆ ａｎｄ Ｖａｌｅ ＮＨＳ Ｔｒｕｓｔ、カーディフ）からの寄贈物）、抗ＴＳＧ１０１、抗ＬＡＭＰ−１、抗ＨＳＰ９０、抗カルネキシン、抗ＣＤ８１、および抗ＰＳＭＡ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから）、抗ＧＡＰＤＨ（ＢｉｏＣｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｉｎｃから）、抗ＣＤ９（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから）を含んだ。抗５Ｔ４はＲ Ｈａｒｒｏｐ博士（Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａ ＵＫ Ｌｔｄ）からの寄贈物であった。ヤギポリクローナル抗タム・ホースフォールタンパク質（ＴＨＰ）はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚから得た。バンドを抗ヤギＨＲＰ（Ｄａｋｏ）を用いて検出した。膜をＲｅｓｔｏｒｅ Ｐｌｕｓ（商標）ウエスタンブロットのストリップ（ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ）緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてストリップし、一晩ブロックし、そしてリプローブ（ｒｅ−ｐｒｏｂｅ）した。

【0084】

（エキソソーム膜の完全性の試験）
尿がエキソソーム膜に損傷を与えるかどうかを調査するために、Ｂ細胞系統から単離されたエキソソームを、抗ＭＨＣクラスＩＩでコーティングされたｄｙｎａｌビーズ（Ｄｙｎａｌ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で固定した。エキソソーム−ビーズ複合体を２５ｍＭカルセイン−ＡＭ中で３７℃で一晩インキュベートした。カルセインを負荷されたエキソソーム−ビーズ複合体を、１時間室温で、種々の塩溶液に曝露するか、または新鮮な尿に曝露した。蛍光を、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ）を実行するフローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ、ＢＤ）によって分析した。カルセインの蛍光を、並列したチューブ中で、抗クラスＩ（ＲＰＥ）で染色されたエキソソーム−ビーズの蛍光と比較した（エキソソームがビーズ表面に付着したままであるかどうかの尺度）。結果を、カルセイン：クラスＩの蛍光の比として表す。

【0085】

（尿によるエキソソームのタンパク質分解性損傷の試験）
ＬＮＣａＰ細胞から精製されたエキソソームを、プロテアーゼ阻害薬（ＥＤＴＡ、ペプスタチン−Ａ、ロイペプチン、およびＰＭＳＦを含む）の存在下または非存在下で、新鮮な尿で処理した。２時間または１８時間後、サンプルを、ＣＤ９、ＰＳＡ、およびＴＳＧ１０１の発現についてウエスタンブロットにより試験した。タンパク質分解についての陽性対照として、エキソソームをトリプシン（Ｃａｍｂｒｅｘ）で処理した。

【0086】

（実施例６−膀胱癌のエキソソームのプロテオーム解析）
（６．１ ＨＴ１３７６エキソソームの特徴付け）
培養されたＨＴ１３７６細胞（典型的なそして十分に特徴付けされた、移行上皮癌（ＴＣＣ）系統）が、本研究のためのエキソソームの供給源であった。本発明者らは、分画超遠心分離すると、３０％のスクロース／Ｄ２Ｏクッション上で浮遊することを利用する、以前に開発された方法を使用して、細胞馴化培地からエキソソームを単離した（Ｌａｍｐａｒｓｋｉら（２００２）Ｉ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２７０、２１１−２２６）およびＡｎｄｒｅ（２００２） Ｌａｎｃｅｔ ３６０、２９５−３０５）。この方法によって、以前に定義されたエキソソーム浮遊特性に基づいて、非エキソソーム物質からエキソソームを分離する（上記のようなＲａｐｏｓｏら（１９９６））。この方法で精製されたエキソソームを、プロテオームワークフローを用いた分析の前に、いくつかの形態の分析に供してサンプルの質／純度を評価した。最初に、ウエスタンブロットを行って、エキソソームと全細胞溶解物を比較して、（他のエキソソームの型を記載している公開された報告（Ｔｈeｒｙら（２００６）Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、ＵＮＩＴ ３．２２）に従って）予期されたエキソソームマーカーの発現を試験し、そして全体としての親細胞と比較したこれらのマーカーの相対的発現を評価した。予期されたように、多小胞体マーカーであるＴＳＧ１０１は、細胞溶解物と比較して、エキソソーム調製物において強く濃縮されていた（図７Ａ）。

【0087】

その上、ＭＨＣクラスＩ、テトラスパニンＣＤ９、テトラスパニンＣＤ８１、リソソームタンパク質ＬＡＭＰ−１、および、（ある程度までは）ＧＡＰＤＨを含むいくつかの他の分子は、同じように濃縮された。そのような特徴は、種々の細胞の型によって産生されるエキソソームについて典型的である（上記のようなＴｈeｒｙら（２００６））。熱ショックタンパク質ｈｓｐ９０はエキソソームにおいて濃縮されなかった。このことは、細胞ストレス条件下にない細胞について典型的である（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら（２００８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３３５、９８−１０５、Ｃｌａｙｔｏｎら（２００５）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １１８．３６３１−３６３８、およびＤａｉら（２００５）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １１、７５５４−７５６３）。サイトケラチン１８についての染色は、細胞溶解物において強いバンドを示したが、エキソソームにおいては、ほとんど検出できないかまたは全く検出できないバンドを示した。同様に、小胞体に内在するｇｐ９６が、細胞溶解物において容易に検出されたが、エキソソームにおいては検出されなかった。これは、そのエキソソーム調製物中に混入している細胞残屑がもしあるとしてもほとんど存在しないことを示した。エキソソーム表面の表現型をまた、ラテックスビーズに連結後に、フローサイトメトリーによって試験した（図７Ｂ）。これは、エキソソーム表面での正しく方向付けたタンパク質の発現を実証するために行った。テトラスパニンは、このために選択されたマーカー（ｃｈｏｉｃｅ ｍａｒｋｅｒ）であった。それは、テトラスパニンの発現が複数の細胞型由来のエキソソームについての十分に記録された特徴であるからである。これらの分析は、細胞系統および他の癌細胞系統について典型的なＣＤ９＞ＣＤ８１＞ＣＤ６３の順での、テトラスパニンの非常に強い発現を示した（公開されていない観察記録）（図７Ｂ）。さらに、このアッセイはまた、上記調製物中での顕著な混入タンパク質の存在を強調し得る。ここで、エキソソームよりもむしろ混入物が、上記連結の反応の間にビーズ表面に結合し、続いて、ＣＤ９のようなエキソソームマーカーについての低い蛍光シグナルをもたらす（図７Ｂ 線グラフ）。精製されたエキソソームについての（本システムにおける混入物の最も可能性が高い供給源である）ＦＢＳによる意図的な混入により、０．０１％のＦＢＳを添加することがＣＤ９特異的な染色を約３０％減少させるのに十分であることが示される。（ＣＤ９染色について）５０００メジアン蛍光単位より低く染色しているエキソソーム調製物を、低い質と見なし、これ以上利用しなかった。典型的なエキソソーム分子プロファイルの発現およびエキソソームの別の重要な特徴もまた調査した；つまりエキソソームの密度特性である。７０，０００×ｇでペレットにされたＨＴ１３７６エキソソームをリニアなスクロース勾配に重層し、１８時間、超遠心分離に供した。１５個の画分を収集した。ウエスタンブロットによる分析により、約１．１ｇ／ｍｌ〜約１．１９ｇ／ｍｌの密度範囲で浮遊するＴＳＧ１０１の存在が示された（図７Ｃ）。このような分析により、ＨＴ１３７６細胞が他の細胞型由来のエキソソームについて記載された密度と類似する典型的な密度のエキソソームを産生することが実証される（上記のようなＲａｐｏｓｏら（１９９６））。（上記の）ラテックスマイクロビーズアッセイと組み合わせた、この方法をまた、本明細書の後半のセクションにおいてＭＳタンパク質同定を有効にするためのツールとして使用した。調製物についての電子顕微鏡検査法もまた、行った（図７Ｄ）。それは、エキソソームとしての定義について一致する大きさの範囲（３０ｎｍ〜１００ｎｍ）内にナノ小胞構造を示した。総合すると、このデータにより、ＨＴ１３７６膀胱癌細胞が、他の細胞型のエキソソームと類似する、分子特性および生物物理学特性を有するエキソソームを産生すること、ならびにこの供給源由来の本エキソソーム調製物が、高品質であり、かつ混入している細胞残屑が少ない／存在しないことが、示される。

【0088】

（８．２ ナノＬＣ−ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦによるエキソソームタンパク質の同定）
ナノＬＣについて、エキソソーム由来のトリプシン消化ペプチドを得るために、本発明者らは、膜タンパク質を可溶化するための１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ抽出を含む標準プロトコールのバージョンを改変した（Ｔａｎら（２００８）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ８，３９２４−３９３２）。この改変型プロトコールは、前もって調製されたＨＴ１３７６エキソソームを超遠心分離によりペレットにすること、ならびにこのペレットを１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳおよび２０ｍＭ ＤＴＴを含むＴＥＡＢ緩衝液中で沸騰することを、包含した。ここで、可溶化を高めるためにＤＴＴを含むことを追加した。この後、残留するあらゆる不溶性物質および／または不溶性凝集物を取り除くために追加的な超遠心分離工程（１１８，０００ｇ／４５分での回転）をまた、含んだ。その上清を溶媒ベースの沈殿法に供し、ＳＤＳ、塩、および脂質を取り除いた（２Ｄ ｃｌｅａｎｕｐ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。結果として生じるエキソソームタンパク質ペレットを、トリプシン消化の前のタンパク質アッセイ、およびナノＬＣにより、定量した。このプロセスは、３５３個のタンパク質（２個のペプチドまたはそれより多くのペプチド）の同定という結果になった。同定物の全セットを表６に列挙する。確実性の高いタンパク質同定（高品質のＭＳ／ＭＳデータによる、２個のペプチドまたはそれより多くのペプチド）のみが報告されていることに注意のこと。これらの選択基準に起因して、このＦＤＲは０％であった。他の多くのプロテオミクス研究所と共通して、その単一ペプチドは、同定を報告されていないが、これらの割り当てのいくつかは必ず有効である。上記ナノＬＣ／ＭＳ同定を調べることにより、エキソソーム生合成と一致する数個のタンパク質が示された。例えば、ユビキチン依存性複合体ＥＳＣＲＴ（輸送に必要とされるエンドソームの選別（ｓｏｒｔｉｎｇ）複合体）のメンバーが存在した。そのメンバーとしては、液胞タンパク質選別（ｓｏｒｔｉｎｇ）関連タンパク質２８のホモログ（ｖｓｐ−２８）ならびに液胞タンパク質選別（ｓｏｒｔｉｎｇ）関連タンパク質４Ｂ（ｖｓｐ−４Ｂ）、ユビキチン様修飾因子活性化酵素およびユビキチンが挙げられる。これらの同定により、分析されたサンプルについての多小胞体由来であることが示唆される。膜輸送プロセスおよび膜融合プロセスに関わるタンパク質もまた、明らかであった（クラスリン重鎖１、Ｒａｂ−１１Ｂ、Ｒａｂ−５Ａ、Ｒａｂ−６ａ、Ｒａｂ−７ａ、Ｒａｂ ＧＤＰ解離抑制因子β、アネキシンＡｌ、アネキシンＡ２、アネキシンＡ３、アネキシンＡ４、アネキシンＡ５、アネキシンＡ６、アネキシンＡ７、アネキシンＡ８様タンパク質およびアネキシンＡｌｌ）。エンドソーム／リソソームのマーカー（ＥＨドメイン含有タンパク質１および２、リソソーム膜タンパク質２、リソソーム関連膜タンパク質−２、トリペプチジルペプチダーゼ１、カテプシン−Ｄ、シークエストソーム（ｓｅｑｕｅｓｔｏｓｏｍｅ）−１）もまた、存在した。そして、シャペロン機能を有する数個のタンパク質（ｈｓｐ７０、ｈｓｃ７０、ｈｓｐ９０、ストレス誘導性リンタンパク質１、Ｔ−複合体タンパク質１、エンドプラスミン）を同定した。細胞質ゾルの構成要素がエキソソーム内腔内で見出されることがまた予期される。これは、多小胞体形成の間の膜の出芽プロセスについての自然な結果である。そして、ここではまた、多様な類別の細胞質ゾル酵素（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、細胞質ゾルアミノペプチダーゼ、細胞質ゾルアセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ニコチネートホスホリボシルトランスフェラーゼ）および細胞骨格の構成成分（アクチン、α−アクチン−４、サイトケラチン、エズリン、チューブリン、ミオシン）が見出された。（複数のインテグリン（β１、β４、α３、α６、αｖ）、ＭＨＣ分子、ＣＤ９、ＥＧＦレセプター、ＭＵＣＩＮ−１、ＣＤ４４、シンデカン−１を含む）多様な膜貫通タンパク質および種々の膜輸送体（溶質キャリアファミリー２および３、４Ｆ２細胞表面抗原重鎖、コリン輸送体様タンパク質、ナトリウム／カリウム−１４トランスポーティングＡＴＰアーゼサブユニットβ−３）もまた、豊富であった。従って、ここで同定されたプロテオームは、エキソソームについて予期されたプロテオームと広く一致する。そして、他の細胞供給源または他の生理学的供給源由来のエキソソームを調査している他の研究者によって強調されるプロテオームの同定物と同等である（図８Ａ）（Ｓｉｍｐｓｏｎら（２００９）Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ６、２６７−２８３）。

【0089】

（８．３ Ｅｘｏｃａｒｔａおよび遺伝子オントロジーの分析）
タンパク質同定セット全体の解釈を援助するために、本ＭＳデータについての簡単なバイオインフォマティクス分析に着手した。まず第一に同定物をＥｘｏｃａｒｔａデータベース（エキソソームについての先行するプロテオーム研究に関する情報庫）と比較し、第二に上記データにおける重要な生物学的テーマをＧｅｎｅＧｏ Ｍｅｔａｃｏｒｅ（Ｖｅｒｓｉｏｎ５．４）を用いて同定した。Ｅｘｏｃａｒｔａデータベースは、エキソソーム研究の刊行物から抜粋されてきたＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ ＩＤのリストを照合する。Ｅｘｏｃａｒｔａ遺伝子セットと重複する遺伝子が偶然に予期され得るよりも多く存在するかどうかを調べるために、超幾何学分布（ｈｙｐｅｒｇｅｏｍｅｔｉｃ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を用いるオーバーリプレゼンテーション分析（ＯＲＡ；Ｏｖｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）を適用した。複数の試験について管理するために、本発明者らは、その比較を、ＭＳベースのプロテオミクスアプローチを利用する研究ならびに少なくとも１０個の適合する（Ｗｕｂｂｏｌｔｓら（２００３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８、１０９６３−１０９７２）同定物および結果を補正されたＦＤＲを有する研究との比較に限定した。その研究結果についての要約プロットを含んだ（図８Ａ）。これらの結果は、このデータセットが他のエキソソーム研究と一致するものであると示す。しかしながら、重要なことには、本データを結腸直腸癌細胞から単離されたエキソソームと比較した場合に非常に顕著なデータ適合が見られた。従って、上記データセットにおいて、癌腫に関連するタンパク質は、大いに特徴となるべきである。それは、新生物性上皮を非新生物性上皮と区別することができるタンパク質同定物を含む。バイアスをかけていない同様のオーバーリプレゼンテーション分析（ｏｖｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）をまた、遺伝子オントロジーおよびＧｅｎｅＧｏ Ｍｅｔａｃｏｒｅ内での私有のキュレーテッド遺伝子セット（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ ｃｕｒａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｓｅｔ）の両方を用いて行った。それは、疾患バイオマーカー、疾患全般、生物学的プロセスおよび細胞区画という４つのカテゴリーの下で問い合わせ（ｑｕｅｒｙ）を行った。疾患バイオマーカーについて、本データは、膀胱癌との最も顕著な関連性を示した。従って、このことは、エキソソーム分析が疾患特異的なバイオマーカーの同定のための有用なツールであり得るという前提を支持する。他のバイオマーカーの関連性は、結腸癌および乳癌を含んだ（図８Ｂ）。同様に、全般的な疾患の関連性を試験する問い合わせ（ｑｕｅｒｙ）は、胃腸管の癌、転移性の癌、（肺癌を含む）気道の疾患、および癌腫に関連する特徴を示した（図８Ｃ）。上位４０位の顕著な関連性において尿生殖路（膀胱新生物を含む）との顕著な関係が存在したが、（示された）上位１０位内で特徴をなしている泌尿器科の管に関連する疾患が見られないことは、驚くべきことであった。従って、上記ＯＲＡ分析により、ＨＴ１３７６エキソソームが新生物性疾患全般および特に癌腫に強く関連するタンパク質を発現することが、示される（図８Ｂおよび図８Ｃ）。このプロテオームに関連する生物学的プロセスを試験することにより、細胞骨格の制御、細胞間接着、マトリックス接着プロセス、およびタンパク質のフォールディングに関連プロセスとの顕著な関連性が示された（図８Ｄ）。細胞区画に関して、上記プロテオームは、細胞質内の膜小胞、細胞質および細胞骨格に強く関連した。しかしながら、上記上位の関連性は、メラノソーム区画および色素顆粒区画を特定した（図８Ｅ）。核、小胞体およびミトコンドリアは、顕著に関連する区画としての特徴をなさなかった。結論として、ここで提示された、統計を基にしたバイアスのない分析により、他の供給源由来のエキソソームに類似する、膀胱癌のエキソソームプロテオームの局面が実証され、さらに、特に癌腫に関与するプロテオームが強調される。

【0090】

（８．４ ２次元電気泳動（２ＤＥ）を用いたナノＬＣアプローチの確認）
本発明者らは、ＭＳ同定物についてのランダムスポットを選択する目的で２次元電気泳動（２ＤＥ）を行った。そして、主要な同定物リスト（表６）におけるこれらのタンパク質の非存在／存在を確かめた。約１００μｇの精製されたエキソソームを用いて、そのようなゲルを試みたが、スポット選択物はほとんど物質を含まなかったので確実なタンパク質同定は得られず、試みたうちの１０％未満しか成功しなかった。しかしながら、１ゲルにつき約５００μｇのエキソソームを用いてこのプロセスのスケールを大きくすることにより、５３％より高い同定ヒット率という結果になった。（銀染色された）中程度の染色強度の１７個のスポットが、ＭＳ分析により首尾よく同定された。これらは、インテグリンα３およびインテグリンα６、ゲルソリン（Ｇｅｌｓｏｎｉｎ）、細胞質ゾル酵素ＬＤＨおよびＧＡＰＤＨ、細胞骨格タンパク質アクチンおよびサイトケラチン、エズリンなどを含んだ。このゲルベースのアプローチによる２１個の同定物中１９個をまた、ナノＬＣ法により同定した。これにより、エキソソームタンパク質／ペプチドを解析するためのこれらの異なる方法の間での優れた一致（９０％）が実証された（図１０においてデータを要約する）。

【0091】

（８．５ 同定されたタンパク質の確認：異常なＭＨＣクラスＩ同定物）
そのようなあらゆるプロテオームデータセットの場合と同様に、あらゆる、予期しないＭＳ同定物または説明できないＭＳ同定物についてそのリストを人力により評価すること、およびそのデータ中に発見されるあらゆる異常の妥当性を問うことが重要である。上記分析において、そのナノＬＣ／ＭＳデータは、１６個のＨＬＡ分子についての複数の同定物を含んだ。それは、本発明者らの品質基準（期待値＜０．０５、および１個より多くのペプチドに基づくＩＤ）を通過した。しかしながら、これらの同定物は、生理学的に可能ではなかった。これらは、５つのＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子および５つのＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子を含んだ（表５）。このことについての説明としては、供給源細胞系統への異なる（複数の）ドナー由来の他の細胞による混入、研究者による標本の不注意なコンタミネーション、またはＭＳから生み出されるペプチド配列に基づいて、どのようにＭＡＳＣＯＴがＨＬＡ−ハプロタイプの命名法を指定したかに関連する問題が挙げられ得る。これらの可能性に取り組むために、臨床診断サービス（Ｗｅｌｓｈ Ｂｌｏｏｄ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｌｌａｎｔｒｉｓａｎｔ、Ｗａｌｅｓ、ＵＫ）を用いて、上記研究者およびＨＴ１３７６細胞系統をハプロタイプに関して特徴付けた。その研究者は、ＭＳリストにおけるＨＬＡ対立遺伝子に対応するＨＬＡ対立遺伝子を有さなかったが、ＨＴ１３７６は、ＨＬＡ−Ａ＊２４；Ｂ＊１５（６２）；Ｃｗ＊０３（９）としてハプロタイプに関して特徴付けられた。従って、ＨＴ１３７６は、相同細胞系統であると確かめられる。これにより、本発明者らは、得られたペプチド配列をより詳細に試験し、ＭＡＳＣＯＴによってどのようにこれらが所定のＨＬＡ命名法に割り当てられたかを評価した（表５）。数個のペプチド配列が複数のＨＬＡ型に割り当てられたことは明白であった。例えば、配列ＦＤＳＤＡＡＳＰＲは、ＨＬＡ−Ｂ１５、ＨＬＡ−Ｂ５２、ＨＬＡ−Ｂ５４、ＨＬＡ−Ｂ５９ならびにＨＬＡ−Ｃ０１、ＨＬＡ−Ｃ１２、ＨＬＡ−Ｃ１７およびＨＬＡ−Ｃ０３に指定された。しかしながら、対照的に、単一の指定にのみ現れる数個のペプチドが存在した。これらの特有な配列は、ＨＬＡ−Ａ２４（ＡＰＷＩＥＱＥＧＰＥＹＷＤＥＥＴＧＫ、ＡＹＬＥＧＴＣＶＤＧＬＲおよびＷＥＡＡＨＶＡＥＱＱＲ）、ＨＬＡ−Ｃ０３（ＧＥＰＨＦＩＡＶＧＹＶＤＤＴＱＦＶＲ）およびＨＬＡ−Ｇ（ＡＰＷＶＥＱＥＧＰＥＹＷＥＥＥＴＲ、ＦＩＡＭＧＹＶＤＤＴＱＦＶＲおよびＴＨＶＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲ）に割り当てられた。いかなるＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子に対して特有なペプチドも存在しなかったが、同定されたＨＬＡ−Ｂサブタイプのうち、ＨＬＡ−Ｂ１５に最も多くのペプチドが割り当てられた。結論として、そのようなＭＡＳＣＯＴ結果から生じる潜在的な混乱を明らかにするための、ＭＨＣクラスＩ同定物として指定されたペプチドについての人力による分析が薦められる。

【0092】

（８．６ 同定されたタンパク質のエキソソームによる発現の確認）
ＭＳにより同定された数個のタンパク質の妥当性を、他の技術を用いてサンプル中にそのタンパク質の存在を同定することにより、決定することもまた、重要である。３５３個ものタンパク質の大きなリストなので、大規模にこれを行うことが可能ではなかったので、本発明者らは、生物学的に関心があり得るタンパク質セットにそのような確認を限定した。一連のウエスタンブロットパネルを行い、１ウェルにつき２０μｇまでのＨＴ１３７６エキソソームを分析し、ＭＳにより同定されたいくつかのタンパク質が本発明者らのエキソソーム調製物中で検出できるかどうかを決定した。本発明者らは、多小胞体（従って、エキソソーム）についての選択されたマーカー（ｃｈｏｉｃｅ ｍａｒｋｅｒ）としてＴＳＧ１０１について染色した。これは、単一のペプチド配列のみによるＭＳにより偶然検出され、それゆえにこのことを基に本発明者らのデータから除外されたタンパク質である。エキソソーム中に存在することが予期された分子であるリソソーム関連膜タンパク質−２（ＬＡＭＰ２）がＭＳによりサンプル中に検出され、ウエスタンブロットにより強く陽性であることがここで確かめられた（図８Ａ）。ＭＳ同定物の中には、数多くのサイトケラチン同定物（Ｉ型の細胞骨格のケラチン１、７、１３、１４、１６、１７、１８、１９）が存在した。他のエキソソームプロテオームの研究において見出されたが、エキソソームへのそのような細胞骨格の成分の積み荷は、エキソソームの生物学的特性として特に強調されてこなかった局面である。本発明者らは、上記調製物中におけるサイトケラチン１７およびサイトケラチン１８の発現を確かめた。この発現は、エキソソームによるサイトケラチン１７の豊富な発現を示した。しかしながら、サイトケラチン１８は、１ウェルにつき２０μｇのエキソソームで検出できただけであった。このことは、エキソソームが複数の細胞骨格構成成分を本当に発現すること、およびこのナノＬＣ／ＭＳアプローチが伝統的なウエスタンブロット法では示すことが難しいＣＫ１８などの分子を検出するのに十分に感度がよいことを示唆する。ＭＨＣ同定物を取り巻く異常な問題が原因で、ＨＬＡ−Ｇが実際にＨＴ１３７６エキソソームによって発現されるか否かを決定することが重要であった。これは、ＨＬＡ−Ｇが、ＨＴ１３７６細胞についてのＰＣＲハプロタイプ決定に含まれていなかったからである。ＨＬＡ−Ｇは、ウエスタンブロットにより、疑う余地なく陽性であることがここで確かめられた。癌生物学の種々の局面において記録された関連性を有する、他の膜関連分子（ガレクチン−３、ＢａｓｉｇｉｎおよびＣＤ７３）または可溶性分子（ｈｎＲＮＰＫ、β−カテニン）は、ＨＴ１３７６エキソソームにより陽性に発現されることが確かめられる。ここで用いられる標準のエキソソーム精製方法は、確固不動であるが、いくらかの非エキソソーム混入物質が上記調製物中に存在すること、およびこれらのＭＳ同定物のいくつかが、本当にエキソソームにおいて発現されるタンパク質ではないことの可能性が依然としてある。この問題に取り組もうと試みるために、ＨＴ１３７６細胞馴化培地由来の、リニアなスクロース勾配の調製物を、同定されたタンパク質がエキソソームの密度で浮遊する能力を決定するために行った。１５個の収集された画分のそれぞれを、その１／３は（エキソソームでコートされたビーズの）フローサイトメトリーによる分析用に、２／３はウエスタンブロット用に分けた。前者の方法は、エキソソーム表面での候補タンパク質についての可能性のある発現を示し、他方、ウエスタンブロットのためにエキソソームを可溶化することにより、表面の構成成分および腔内の構成成分が明らかにされた。フローサイトメトリーアッセイにおいて、ＨＴ１３７６エキソソームの表面上で発現されることが知られるテトラスパニンＣＤ９およびテトラスパニンＣＤ８１ならびにＭＨＣクラスＩについての強い染色によりエキソソームを含む画分が同定され、１．１２ｇ／ｍｌの密度で明らかな（および主な）ピークを示した（図９Ｂ）。これは、予期されるエキソソームの密度の範囲内である（図７Ｃ）。従って、上記エキソソームのほとんどを含むこの画分はまた、ＭＳで同定されたタンパク質であるβ１インテグリンおよびα６インテグリン、ＣＤ３６、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１０、ＭＵＣ１、栄養芽層糖タンパク質（５Ｔ４）ならびにＢａｓｉｇｉｎについて陽性の表面染色を示した。同じ画分はまた、カルネキシン特異的抗体により染色され、大部分はそのエキソソームを含む画分よりも高い密度で低いレベルの発現を示し、試験された他のマーカーに関しての陽性染色について特異性を強調し、エキソソームを含む画分において、予期したようにこのタンパク質の非存在を示した（図８Ｂ）。ウエスタンブロットパネルにおいて関連する画分を明らかにするために、本発明者らはＴＳＧ１０１について染色した。エキソソームを含む画分として１．１２ｇ／ｍｌ〜１．２ｇ／ｍｌの密度が強調された。過剰密度の画分（＞１．２ｇ／ｍｌ）において、いくらかの陽性染色が存在したが、これは比較的弱く、これは、エキソソーム凝集物またはタンパク質凝集物に起因し得る。タンパク質５Ｔ４、ＣＤ４４、Ｂａｓｉｇｉｎ、ガレクチン−３、およびβ−カテニンは、同じ密度範囲で全て共局在した。これは、それらのタンパク質のエキソソームによる発現に一致する。これらのデータは、本研究において達成されたＭＳ同定物がＨＴ１３７６エキソソームによって発現されること、および可溶化し、ＭＳアプローチにより同定することがしばしば難しい膜関連分子が、エキソソーム膜に局在するとして首尾よく同定され、かつ確認されていたことを示す。要約すると、本発明者らは、非常に純粋なエキソソーム調製物、正確な標本の品質管理、厳しいＭＳの基準および実質的な確認を用いて、膀胱癌細胞由来のエキソソームについての初めての高品質なプロテオームの解説を達成した。このシステムを用いて集められた情報は、結局、この疾患の診断およびモニタリングに現在利用されている非常に侵襲的な手順を、完全に非侵襲的な尿のエキソソームを基にした技術で置き換えるために使用し得る。

【0093】

（実施例６のための材料および方法）
（細胞培養）−ＨＴ１３７６は、膀胱の原発性移行上皮癌（ＴＣＣ）に由来する細胞系統である（ステージ Ｔ２、グレードＧ４）（Ｇａｒｄｎｅｒら（１９９７）Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ５８、８８１−８９０）。これらの細胞を、本研究のためのエキソソームの供給源として使用した。それは、これらが以前に広く特徴付けられており、ＴＣＣ（上記のようなＧａｒｄｎｅｒら（１９９７）；およびＭａｓｔｅｒｓら １９８６ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４６、３６３０−３６３６）の挙動および表現型をよく表すものであるからである。上記細胞をＤＭＥＭ（ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）および（１００，０００ｇで一晩、超遠心分離し、その後、０．２μｍのバキュームフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過し、次に０．１μｍのバキュームフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過することによりエキソソームを除去させてある）５％のＦＢＳを補充した）中で維持した。記載された（ＭｉｔｃｈｅｌｌらＩｍｍｕｎｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３３５、９８−１０５）ように、上記細胞をバイオリアクターフラスコ（Ｉｎｔｅｇｒａから得た）の中に播き、そしてエキソソーム産生のために高密度培養で維持した。毎月のスクリーニングにより、細胞がマイコプラズマ混入について陰性であることを確かめた（ｍｙｃｏａｌｅｒｔ、Ｌｏｎｚａ）。

【0094】

（エキソソームの精製）−細胞培養培地を連続的な遠心分離に供し、細胞を除去し（３００ｇ、１０分間）、細胞残屑を除去した（２０００ｇ、１５分間）。その上清を次に１０，０００ｇで３０分間遠心分離し、そしてその上清を保持した。３０％のスクロース／Ｄ２Ｏクッションをこれの下に置き、１００，０００ｇで２時間、超遠心分離に供した。記載された（Ｌａｍｐａｒｓｋｉら（２００２）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ 、２７０、２１１−２２６；Ａｎｄｒｅら（２００２）Ｌａｎｃｅｔ ３６０、２９５−３０５；およびＣｌａｙｔｏｎら（２００７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６７、７４５８−７４６６）ように、上記クッションを収集し、エキソソームをＰＢＳ中で洗浄した。エキソソームのペレットを１００μｌ〜１５０μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、そして−８０℃で凍結した。エキソソームの量を微量ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって決定した。記載された（上記のようなＣｌａｙｔｏｎら（２００７））ように、調製物についての透過電子顕微鏡検査法を行った。

【0095】

（エキソソーム密度の決定）−ＨＴ１３７６により産生されるエキソソームの密度を定量するために、リニアなスクロース勾配における超遠心分離に基づき、以前に記載されたプロトコールと同様のプロトコールを用いた（Ｒａｐｏｓｏら（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３、１１６１−１１７２およびＴｈeｒｙら（２００６）Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、ＵＮＩＴ ３．２２）。手短に言えば、細胞培養上清を分画遠心分離に供し、７０，０００ｇでペレットにされたペレットをリニアなスクロース勾配（０．２Ｍ〜２．５Ｍまでのスクロース）に重層した。標本を、Ｏｐｔｉｍａ−Ｍａｘ超遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）においてＭＬＳ−５０ローターを用いて４℃で、２１０，０００ｇで一晩遠心分離した。収集された画分の屈折率を自動屈折計（Ｊ５７ＷＲ−ＳＶ、Ｒｕｄｏｌｐｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて（２０℃で）測定し、これから、記載された（上記のようなＲａｐｏｓｏら（１９９６））ように、密度を計算した。画分を緩衝液（下記で論じられるＰＢＳまたはＭＥＳ緩衝液）中で、（ＴＬＡ−１１０ローター、Ｏｐｔｉｍａ−Ｍａｘ超遠心分離機において）１５０，０００ｇで超遠心分離により洗浄し、ペレットを、マイクロビーズに連結するためにＭＥＳ緩衝液中に再懸濁するか、またはウエスタンブロットによる分析のためにＳＤＳサンプル緩衝液中に再懸濁した。

【0096】

（エキソソームでコートされたビーズのフローサイトメトリー分析）−ＭＥＳ緩衝液（０．０２５Ｍ ＭＥＳ、０．１５４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６）中で２回洗浄した精製エキソソーム１μｇを１μｌのラテックスビーズ（界面活性剤を含まない、アルデヒド−サルフェート３．９μｍビーズ、Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｏｒｅｇｏｎ）とともにインキュベートした。スクロース勾配画分の分析のために、各画分の３０％を０．５μｌのストックビーズに連結した。エキソソーム−ビーズを最終容積１００μｌのＭＥＳ緩衝液中で、室温で１時間、振とうする台の上でインキュベートし、その後、４℃で一晩回転した。ビーズを、１％のＢＳＡ／ＭＥＳ緩衝液とともに室温で２時間インキュベートすることによりブロックした。ブロッキング緩衝液を洗い流し、ビーズを０．１％のＢＳＡ／ＭＥＳ緩衝液中に再懸濁した。４℃で１時間、（２μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌで）一次抗体を添加した。１回の洗浄後、０．１％のＢＳＡ／ＭＥＳ緩衝液中のヤギ抗マウスＡｌｅｘａ−４８８結合体化抗体（２００：１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１時間添加した。洗浄後、ビーズを、高スループットサンプリングモジュールで設定され、ＦＡＣＳＤｉｖａ ｖ６．１．２ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を実行するＦＡＣＳＣａｎｔｏ装置を用いて、フローサイトメトリーによって分析した。

【0097】

（１次元（１Ｄ）電気泳動および免疫ブロット法）−細胞溶解物を、記載された（Ｃｌａｙｔｏｎら（２００３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ３３、５５２−５３１）ように、免疫ブロット法によってエキソソーム溶解物と比較した。ここで、タンパク質（１ウェルにつき２０μｇまで）を、６Ｍ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２％ＳＤＳ、２０ｍＭ ＤＴＴおよび０．００２％ｗ／ｖブロモフェノールブルーを３０％容量添加することによって可溶化した。サンプルを４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に通して電気泳動し、そしてポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜へと転写し、この膜を、Ｑｄｏｔ（登録商標）システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてブロックし、抗体でプローブした。ＭｉｎｉＢＩＳ Ｐｒｏイメージングシステム（ＤＮＲ Ｂｉｏ−Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、バンドを可視化した。ＴＳＧ１０１、ＬＡＭＰ−１、ＨＳＰ９０、カルネキシン、ＨＬＡ−Ｇ、ガレクチン−３、Ｂａｓｉｇｉｎ、ｈｎＲＮＰＫ、サイトケラチン１８およびサイトケラチン１７ならびにＣＤ４４に対して特異的な一次モノクローナル抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから得た。抗ＧＡＰＤＨ（ＢｉｏＣｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｉｎｃから）、抗ＣＤ９（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから）および抗ＣＤ８１（Ｓｅｒｏｔｅｃから）。抗５Ｔ４はＲ Ｈａｒｒｏｐ博士（Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａ ＵＫ Ｌｔｄ）からの寄贈物であった。

【0098】

（２次元（２Ｄ）電気泳動およびＭＳ）−ゲルベースのアプローチを使用し、標準２次元電気泳動（２ＤＥ）プロトコールを用いてエキソソームタンパク質プロフィールを試験した。手短に言えば、エキソソーム（７５０μｇ）を、１５０μｌの溶解緩衝液（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、２０ｍＭ ＤＴＴ、４％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ、０．００５％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルーおよび０．５％（ｖ／ｖ）固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）緩衝液ｐＨ３〜１０ＮＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））中で１時間、室温で可溶化した。抽出されたタンパク質を、次に、溶解緩衝液中にそのペレットを再懸濁する前に２Ｄ−Ｃｌｅａｎ Ｕｐキット（ＧＥ Ｈｅａｔｈｃａｒｅ）を用いて溶媒沈殿した。１８ｃｍ ｐＨ３〜１０ＮＬ ＩＰＧ再水和済みストリップ、Ｅｔｔａｎ ＩＰＧｐｈｏｒ ＩＩＩ ＩＥＦシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および推奨電圧を用いて、そのサンプルの等電点電気泳動を行った。続いて、そのＩＰＧストリップを１５分間、１％（ｗ／ｖ） ＤＴＴを含む平衡緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８、６Ｍ尿素、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、３０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．００２％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー）中で平衡化し、その後、２．５％（ｗ／ｖ）ヨードアセトアミドを含む平衡緩衝液中で１５分間、平衡化した。平衡化されたＩＰＧストリップを、Ｅｔｔａｎ（商標）ＤＡＬＴｓｉｘシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、２次元分離に供した。以前に記載された（Ｂｒｅｎｎａｎら（２００９）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ−Ｃｌｉｎ Ａｐｐｓ ３、３５９−３６９）ように、銀染色を行い、ランダムに選択されたゲルスポットを切り出し、トリプシン消化およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析法の分析に供した。使用したデータベース検索設定は、５０ｐｐｍの前駆体質量許容誤差（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｍａｓｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を使用したことを除き、ＬＣ−ＭＡＬＤＩタンパク質同定のために記載されたものと同じであった。

【0099】

（ナノＬＣのためのエキソソーム由来のペプチドの調製）−ＨＴ１３７６由来のエキソソーム調製物をＴＬＡ−１１０ローター、Ｏｐｔｉｍａ−Ｍａｘ超遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）において、１１８，０００ｇで４５分間、４℃で再びペレットにした。そのペレットを、２０ｍＭ ＤＴＴおよび１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１００μｌのトリエチルアンモニウムバイカーボネート（ＴＥＡＢ）溶解緩衝液（２０ｍＭ ＴＥＡＢ）中で、室温で１０分間、その後、９５℃で１０分間可溶化し、さらに１０分間、室温で放置した。そのサンプルを、追加の超遠心分離工程（室温で、１１８，０００ｇで４５分間）に供し、（今では不溶性物質を含まない）上清を（２Ｄ ｃｌｅａｎ−ｕｐ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅを用いて）溶媒沈殿に供し、塩、脂質および界面活性剤を取り除いた。そのペレットを、２０ｍＭ ＴＥＡＢ中に再懸濁し、４℃で一晩放置した。そのタンパク質含有量を、次に、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｓｉｇｍａ）を用いて決定した。サンプルを、次に、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｉＴＲＡＱ標識キットおよび標準プロトコールを用いて還元し、変性し、そしてアルキル化した。そのタンパク質を、１サンプルにつき０．８μｇのトリプシンを用いる消化に供し、３７℃で１２時間〜１６時間インキュベートした。そのサンプルを、次に、乾燥し、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡを含む水に再懸濁した。

【0100】

（ＬＣ−ＭＡＬＤＩおよびタンパク質同定）−消化されたペプチドを、以前に記載された（Ｂｒｅｎｎａｎら（２００９）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ−Ｃｌｉｎ Ａｐｐｓ ３、３５９−３６９）ように、２次元塩プラグ法を用いて、ナノＬＣシステム（ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００、Ｄｉｏｎｅｘ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＵＳＡ）で分離した。Ｂｒｅｎｎａｎら（２００９）に記載されたように、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４８００ ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計を用いて質量分析法を行った。そのＭＳ／ＭＳデータを使用し、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベース（Ｖｅｒｓｉｏｎ ５７．１；公開日２００９年４月１４日；４６２７６４配列；ヒト分類学）を検索した。その検索には、ＧＰＳ Ｅｘｐｌｏｒｅｒソフトウェアｖ３．６ Ｂｕｉｌｄ ３２７（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に組み込まれたＭＡＳＣＯＴ Ｄａｔａｂａｓｅ検索エンジンｖ２．１．０４（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）（デフォルトＧＰＳパラメーター、１つの許容されるｍｉｓｓｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ、ＭＭＴＳ（Ｃ）の固定された改変、酸化（Ｍ）、ピログルタミン酸（Ｎ末端Ｅ）およびピログルタミン酸（Ｎ末端Ｑ）の可変性の改変、ＭＳにおける１５０ｐｐｍの質量許容誤差およびＭＳ／ＭＳについての０．３Ｄａの質量許容誤差）を用いた。タンパク質を同定するために、０．０５未満のＭＳＣＯＴのｅ値を伴う、最小限２個のペプチドを必要とした。配列全体をランダムにした同じＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースを用いて決定された０％のフォルスディスカバリレート（ＦＤＲ）が存在した。２つの生物学的反復を用いてその分析を行い、それぞれは技術的反復を含んだ。

【0101】

（ＭＳデータ分析）−その結果として生じるタンパク質のリストを、Ｍｅｔａｃｏｒｅ ＧｅｎｅＧＯ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．４）を用いて、選択されたＥｘｏＣａｒｔａサブミッション（１０またはそれより多くの適合する遺伝子識別名を含むＭＳベースのデータ）から定義されたリストに対してのあらゆる生物学的濃縮について分析した。Ｅｘｏｃａｒｔａ遺伝子セットを用いた分析のために、本発明者らのタンパク質リストを、ＢｉｏＭａｒｔを用いてＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ＡｃｃｅｓｓｉｏｎからＥｎｔｅｚＧｅｎｅ ＩＤへと変換した。この変換は、ＥｎｔｅｚＧｅｎｅ ＩＤを有する全ヒト遺伝子のバックグラウンドに対する、Ｒにおける超幾何学分布（ｈｙｐｅｒｇｅｏｍｅｔｉｃ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を用いたオーバーリプレゼンテーション分析（ＯＲＡ；ｏｖｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）の前に行った。ＭｅｔａＣｏｒｅにおけるＯＲＡのために、分析前にデータを最初にＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ＩＤ（ＢｉｏＭａｒｔを用いて）へと変換した。ここでまた、超幾何学（ｈｙｐｅｒｇｅｏｍｅｔｉｃ）試験を用いた。

【0102】

（実施例７−エキソソームによる５Ｔ４発現のＥＬＩＳＡによる検出）
捕捉抗体ＣＤ９（（クローン２０９３０６−ＩｇＧ２ｂ）精製されたマウス抗ヒト（キャリアタンパク質を含まない）抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳ））を１０μｇ／ｍｌの有効濃度までｄＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ、ＵＫ）に希釈し、それぞれのウェルに１００μｌ添加し、使用する（１μｇ／ウェル）。捕捉抗体をＥＬＩＳＡプレート（９６ウェル平底Ｆ−ストリップ型、高結合ＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ９−ｏｉｎｅ Ｌｔｄ、ＵＫ））上で、４℃で１８時間インキュベートする。そのプレートのウェルを次に、３００μｌ／ウェルのＤＥＬＦＩＡ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）洗浄溶液で３回洗浄する。

【0103】

非特異的結合をブロックするために、試薬希釈剤（１０ｘ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ２（１０％ ＢＳＡ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳ））を、ｄＰＢＳ（１０％）で１０倍希釈し、１％ＢＳＡを生成する。次に、それぞれのウェルに３００μｌを添加し、ブロックし、２時間室温でインキュベートする。そのプレートのウェルを次に、３００μｌ／ウェルのＤＥＬＦＩＡ洗浄溶液で３回洗浄する。

【0104】

エキソソームを捕捉するために、１００μｌ〜２００μｌのエキソソーム含有サンプル（例えば、生物学的流体または細胞馴化培地）をそれぞれのウェルに添加し、室温で２時間インキュベートする。そのプレートのウェルを３００μｌ／ウェルのＤＥＬＦＩＡ洗浄溶液で３回洗浄する。

【0105】

検出は、５Ｔ４抗体（５Ｔ４（クローンＨ８）−ビオチン結合体化抗体（Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａ、Ｏｘｆｏｒｄ ＵＫ））を用いて、５Ｔ４抗体をＤＥＬＦＩＡアッセイ緩衝液で０．１μｇ／ｍｌの有効濃度まで希釈すること、検出のためにそれぞれのウェルに１００μｌ添加すること（０．０１μｇ／ウェルまたは１０ｎｇ／ウェル）、室温で２時間インキュベートすること、その後、そのプレートのウェルを３００μｌ／ウェルのＤＥＬＦＩＡ洗浄溶液で洗浄することにより、行い得る。

【0106】

５Ｔ４−ビオチン抗体を、ユーロピウム−ストレプトアビジンをＤＥＬＦＩＡアッセイ緩衝液で１／１０００希釈すること、それぞれのウェルに１００μｌ添加すること、室温で４５分間インキュベートすること、そして、そのプレートのウェルを３００μｌ／ウェルのＤＥＬＦＩＡ洗浄溶液で６回洗浄することにより、ユーロピウム−ストレプトアビジン標識し得る。

【0107】

そのユーロピウムのシグナルを、１００μｌのＤＥＬＦＩＡ濃縮溶液をそれぞれのウェルに添加すること、プレートを混合し、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ ２ Ｍｕｌｔｉ−ｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上でそのプレートを読み取りながら室温で５分間インキュベートすることにより、取得する。その結果を図１１に示す。

【0108】

上記の明細書において言及された全ての刊行物は、本明細書中において、参考として援用される。本発明の記載された方法およびシステムの種々の改変および変更は、本発明の範囲および趣旨からはずれることなく、当業者に明らかである。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して記載されてきたが、特許請求される本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際に、本発明を実施するための、記載された様式の種々の改変は、フローサイトメトリーを用いた細胞研究または関連する分野における当業者に明らかであり、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図8-1】

【図8-2】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【図10-1】

【図10-2】

【図11】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]